ES2646598T3 - Diagnóstico y tratamiento de los trastornos de la motilidad del intestino y la vejiga, y de la fibromialgia - Google Patents

Diagnóstico y tratamiento de los trastornos de la motilidad del intestino y la vejiga, y de la fibromialgia Download PDF

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Abstract

Un método, que comprende: proporcionar una muestra biológica de un sujeto que requiere el diagnóstico de un trastorno de la motilidad gastrointestinal, trastorno de la motilidad de la vejiga o fibromialgia; detectar en la muestra biológica, una presencia o un nivel de un anticuerpo anti-vinculina; y determinar una presencia o probable presencia del síndrome de intestino irritable (IBS) si se detecta la presencia del anticuerpo anti-vinculina, si el nivel del anticuerpo anti-vinculina es más alto que un nivel del control establecido, o si el nivel del anticuerpo anti-vinculina es significativamente más alto que un nivel del control establecido, o determinar una ausencia o probable ausencia del síndrome de intestino irritable (IBS) si se detecta una ausencia del anticuerpo anti-vinculina, si el nivel del anticuerpo anti-vinculina es igual o inferior al nivel del control establecido, o si el nivel del anticuerpo anti-vinculina no es significativamente más alto que un nivel del control establecido.

Description

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DESCRIPCION
Diagnostico y tratamiento de los trastornos de la motilidad del intestino y la vejiga, y de la fibromialgia Antecedentes
El smdrome del intestino irritable (IBS) es el trastorno gastrointestinal mas frecuente. Aunque la patogenesis historicamente se enfoco en la hiperalgesia visceral (1), un trabajo reciente enfatiza en que la fisiopatologfa del IBS se debe a aberraciones en la flora del intestino. Estas hipotesis emergieron de dos areas de investigacion diferentes. La primera hipotesis de la flora intestinal postula que, el sobrecrecimiento de las bacterias del intestino (SIBO) puede contribuir al IBS y sus smtomas. En un artmulo reciente (2), los postulados de Koch sugieren que la evidencia sustenta este concepto. Esto se sustenta, ademas, por el exito de un estudio fase III reciente, que evaluo el uso de antibioticos en el tratamiento del IBS (3) y en estudios de cultivo del intestino delgado proximal (estudios de Posserud y Pyleris). La otra hipotesis de la flora intestinal se fundamenta en el desarrollo del IBS despues de un episodio agudo de gastroenteritis. Ahora existen dos metaanalisis, cualquiera de los cuales revela hallazgos similares acerca de que, aproximadamente el 10 % de los sujetos que presentan gastroenteritis aguda desarrollaran IBS a largo plazo (4, 5).
Diversos metodos de tratamiento de la tecnica previa se enfocan en el alivio de los smtomas. Por consiguiente, existe una necesidad en la tecnica de metodos adicionales para el diagnostico y el tratamiento del IBS, espedficamente para tratar la causa del IBS, asf como tambien para tratar los trastornos de la motilidad del intestino y de la vejiga.
Resumen de la invencion
Las siguientes modalidades y aspectos de esta se describen y se ilustran junto con las composiciones y los metodos que se destinan a ser representativos e ilustrativos, pero no limitativos en el alcance.
Diversas modalidades de la presente invencion proporcionan un metodo, que comprende: proporcionar una muestra biologica de un sujeto que requiere el diagnostico de un trastorno de la motilidad gastrointestinal, trastorno de la motilidad de la vejiga, o fibromialgia; que detecte en la muestra biologica, una presencia o un nivel de un anticuerpo anti- vinculina; y que determine una presencia o probable presencia del trastorno de la motilidad gastrointestinal, trastorno de la motilidad de la vejiga o fibromialgia si se detecta la presencia de un anticuerpo anti-vinculina, si el nivel del anticuerpo anti-vinculina es mayor que el nivel de un control establecido, o si el nivel del anticuerpo anti-vinculina es significativamente mayor que el nivel de un control establecido, o que determine una ausencia o probable ausencia de un trastorno de la motilidad gastrointestinal, trastorno de la motilidad de la vejiga o fibromialgia si se detecta una ausencia de un anticuerpo anti-vinculina, o si el nivel del anticuerpo anti-vinculina es igual o mas bajo que el nivel de un control establecido, o si el nivel del anticuerpo anti-vinculina no es significativamente mas alto que el nivel de un control establecido.
En diversas modalidades, los metodos pueden comprender, ademas, seleccionar una terapia para los trastornos de la motilidad gastrointestinal, trastornos de la motilidad de la vejiga, o fibromialgia si se determina la presencia o probable presencia de un trastorno de la motilidad gastrointestinal, trastorno de la motilidad de la vejiga, o fibromialgia.
En diversas modalidades, la terapia puede ser un curso de terapia con antibiotico. En diversas modalidades, la terapia puede comprender un agente neutralizante de los anticuerpos anti-vinculina o un agente que inhibe los anticuerpos anti- vinculina. En diversas modalidades, la terapia puede comprender un agente para cambiar la vinculina de un estado inactivo a un estado activo. En diversas modalidades, la terapia puede comprender un agonista de vinculina. En diversas modalidades, el agonista de vinculina puede ser un peptido activador de vinculina. En diversas modalidades, la terapia puede comprender un activador de vinculina. En diversas modalidades, el activador de vinculina puede ser talina, f-actina, a-catenina o una combinacion de estos.
En diversas modalidades, el metodo puede comprender, ademas, la administracion de la terapia.
Diversas modalidades de la presente invencion proporcionan un sistema, que comprende: una muestra biologica aislada de un sujeto que requiere el diagnostico de un trastorno de la motilidad gastrointestinal, trastorno de la motilidad de la vejiga, o fibromialgia; y un ensayo para detectar en la muestra biologica, una presencia de un anticuerpo anti-vinculina.
En diversas modalidades, el ensayo puede ser un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), en donde el ELISA comprende el uso de vinculina, sec. con num. de ident.:1 o un fragmento de esta como un sustrato o reactivo para unirse al anticuerpo anti-vinculina.
Diversas modalidades de la presente invencion proporcionan un metodo, que comprende: proporcionar una muestra biologica de un sujeto que requiere un diagnostico de un trastorno de la motilidad gastrointestinal, trastorno de la motilidad de la vejiga, o fibromialgia; que detecte en la misma muestra biologica, una presencia o un nivel de un anticuerpo anti-vinculina; y que determine una presencia o probable presencia del smdrome del intestino irritable (IBS) si se detecta la presencia del anticuerpo anti-vinculina, si el nivel del anticuerpo anti-vinculina es mas alto que el nivel de un control establecido, o si el nivel del anticuerpo anti-vinculina es significativamente mas alto que el nivel de un control
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establecido, o que determine una presencia o probable presencia de la enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) si se detecta una ausencia del anticuerpo anti-vinculina, si el nivel del anticuerpo anti-vinculina es igual o mas bajo que el nivel de un control establecido, o si el nivel del anticuerpo anti-vinculina no es significativamente mas alto que el nivel de un control establecido.
En diversas modalidades, el metodo puede comprender, ademas, seleccionar una terapia para el IBS si se diagnostica el IBS, o seleccionar una terapia para la IBD si se diagnostica la IBD. En diversas modalidades la terapia del IBS puede ser un curso de una terapia con antibioticos. En diversas modalidades la terapia del IBS puede comprender un agente neutralizante de los anticuerpos anti-vinculina, o un agente inhibidor de los anticuerpos anti-vinculina. En diversas modalidades la terapia del IBS puede comprender un agente para cambiar la vinculina desde el estado inactivo a un estado activo. En diversas modalidades, la terapia del IBS puede comprender un agonista de vinculina. En diversas modalidades, el agonista de vinculina puede ser un peptido activador de vinculina. En diversas modalidades, la terapia del IBS puede comprender un activador de vinculina. En diversas modalidades, el activador de vinculina puede ser talina, f-actina, a-catenina o una combinacion de estas.
En diversas modalidades, el metodo puede comprender, ademas, administrar la terapia del IBS o la terapia de la IBD.
Diversas modalidades de la presente invencion proporcionan un sistema que comprende: una muestra biologica aislada de un sujeto que requiere un diagnostico para diferenciar entre el smdrome de intestino irritable (IBS) y la enfermedad inflamatoria del intestino (IBD); y un ensayo para detectar en la muestra biologica, una presencia de un anticuerpo anti- vinculina.
En diversas modalidades, el ensayo puede ser un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), en donde el ELISA comprende el uso de vinculina, sec. con num. de ident.:1 o un fragmento de esta como un sustrato o reactivo para unirse al anticuerpo anti-vinculina.
Diversas modalidades de la presente invencion proporcionan un metodo que comprende: proporcionar un agente de terapia seleccionado del grupo que consiste en: un agente neutralizante de anticuerpos anti-vinculina, un agente inhibidor de anticuerpos anti-vinculina, un agente capaz de cambiar la vinculina de un estado inactivo a un estado activo, un agonista de vinculina, un activador de vinculina y combinaciones de estos; y administrar el agente de terapia a un sujeto que requiere el tratamiento de un trastorno de la motilidad gastrointestinal, trastorno de la motilidad de la vejiga o fibromialgia para tratar el trastorno de la motilidad gastrointestinal, el trastorno de la motilidad de la vejiga o fibromialgia.
En diversas modalidades, el agonista de vinculina puede ser un peptido activador de vinculina. En diversas modalidades, el activador de vinculina puede ser talina, f-actina, a-catenina o una combinacion de estos.
Breve descripcion de las figuras
Las modalidades representativas se ilustran en las figuras enumeradas. Se pretende que las modalidades y figuras descritas en la presente descripcion deben considerarse representativas en lugar de restrictivas.
La Figura 1 representa la transferencia Western de protema versus anticuerpo de acuerdo con diversas modalidades de la presente invencion.
La Figura 2 representa la transferencia Western de lisados C. versus anticuerpo de acuerdo con diversas modalidades de la presente invencion.
La Figura 3 representa la inmunohistoqmmica de muestras de ratas agudas, dfa 2, de acuerdo con diversas modalidades de la presente invencion.
La Figura 4 representa imagenes confocales de muestras de ratas agudas, dfa 2; preinmune versus Campylobacter jejuni de acuerdo con diversas modalidades de la presente invencion.
La Figura 5 representa la inmunohistoqmmica de la muestra control de acuerdo con diversas modalidades de la presente invencion.
La Figura 6 representa imagenes confocales de la muestra control; suero preinmune versus Campylobacter jejuni de acuerdo con diversas modalidades de la presente invencion.
La Figura 7 representa la inmunohistoqmmica de muestras humanas de acuerdo con diversas modalidades de la presente invencion.
La Figura 8 representa imagenes confocales de la muestra control, de ckit y de la colocalizacion de acuerdo con diversas modalidades de la presente invencion.
La Figura 9 representa imagenes confocales de la muestra control, de s100, y de la colocalizacion de acuerdo con diversas modalidades de la presente invencion.
La Figura 10 representa imagenes confocales de muestras de humanos, de S100 y de la colocalizacion de acuerdo con diversas modalidades de la presente invencion.
La Figura 11 representa imagenes confocales de muestras de humanos, de PGP 9.5 y de la colocalizacion de acuerdo con diversas modalidades de la presente invencion.
La Figura 12 representa la transferencia Western del fraccionamiento subcelular y del bloqueo de acuerdo con diversas modalidades de la presente invencion.
La Figura 13 representa imagenes confocales de muestras humanas, de vinculina y de la colocalizacion de acuerdo con diversas modalidades de la presente invencion.
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La Figura 14 representa una diferencia entre los recuentos de bacterias altos y bajos en el intestino delgado de ratas de acuerdo con diversas modalidades de la presente invencion.
La Figura 15 representa una comparacion entre los tftulos de anticuerpos y los niveles SIBO (r=0.3, P=0.04) de acuerdo con diversas modalidades de la presente invencion.
La Figura 16 representa los anticuerpos cdtB en suero humano de acuerdo con diversas modalidades de la presente invencion.
La Figura 17 representa los sueros cdtB y preinmune frente a la protema vinculina de acuerdo con diversas modalidades de la presente invencion.
La Figura 18 representa los anticuerpos anti-vinculina en suero humano de acuerdo con diversas modalidades de la presente invencion.
La Figura 19 representa los tftulos de anticuerpos que se midieron en IBS, IBD y controles sanos. Los sujetos con IBS teman el nivel de anticuerpos mas alto de acuerdo con diversas modalidades de la presente invencion. El eje y representa la densidad optica (OD) de la prueba ELISA.
Descripcion detallada de la invencion
A menos que se defina lo contrario, los terminos tecnicos y cientfticos que se usan en la presente descripcion tienen el mismo significado que entiende comunmente un experto en la tecnica a la que pertenece esta invencion. Singleton y otros, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3ra ed., J. Wiley & Sons (Nueva York, NY 2001); March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 5ta ed., J. Wiley & Sons (Nueva York, NY 2001); y Sambrook y Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3ra ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY 2001), proporciona a un experto en la tecnica una grna general para muchos de los terminos que se usan en la presente solicitud. Para referencias sobre como preparar esos anticuerpos, ver D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor NY, 1988); Kohler y Milstein, (1976) Eur. J. Immunol. 6: 511; Queen y otros. Patente de los Estados Unidos num. 5.585.089; y Riechmann y otros, Nature 332: 323 (1988).
Un experto en la tecnica reconocera muchos metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente descripcion, los que podnan usarse en la practica de la presente invencion. Ciertamente, la presente invencion no se limita de ninguna manera a los metodos y materiales descritos.
El termino "unirse espedficamente" como se usa en la presente descripcion se refiere al acto de un anticuerpo que se une a su anftgeno y se destina a excluir la union no espedfica de bajo nivel que puede ocurrir aleatoriamente entre las protemas. El termino "unirse espedficamente" como se usa en la presente descripcion, no pretende y no implica que el anticuerpo no se unira a ninguna protema distinta a las protemas o polipeptidos como se describen en la presente descripcion ya que los anticuerpos pueden reaccionar de forma cruzada con cualquier protema que incluya el epftopo relevante.
El termino "significativamente mas alto" como se usa en la presente descripcion, en relacion con las cantidades de referencia, se refiere a una cantidad estadfsticamente significativa mayor que la cantidad de referencia.
Nuestro descubrimiento de la reactividad cruzada de los anticuerpos CdtB con factores endogenos en tejido del fteon de rata no infectada, mediante inmunohistoqmmica, condujo al estudio de la susceptibilidad al desarrollo del IBS a traves de mimetismo molecular de CdtB como un mecanismo en el desarrollo del sobrecrecimiento bacteriano. En este estudio, investigamos la respuesta inmunitaria asociada con CdtB en sistemas humanos y animales mediante el seguimiento de los anticuerpos que se unen a CdtB durante la infeccion aguda, y el desarrollo de anticuerpos asociados con CdtB como un predictor del IBS tanto en ratas como en humanos.
Despues de una gastroenteritis aguda los anticuerpos contra cdtB, a traves del mimetismo molecular, producen un autoanticuerpo contra la vinculina en el IBS. La deteccion de este anticuerpo es predictiva del IBS, con respecto a la IBD y controles sanos. En animales, demostramos que los tftulos de anti-cdtB se correlacionan con el grado de sobrecrecimiento bacteriano, y sin desear estar sujetos a ninguna teona particular, creemos que una neuropatfa inducida por estos anticuerpos es una causa de SIBO.
Demostramos por primera vez que, el mimetismo molecular a traves de la autoinmunidad puede tener un papel importante en la fisiopatologfa del IBS posinfeccioso, tanto en ratas como en humanos. Los anticuerpos contra la subunidad B de la toxina de distencion citoletal de C. jejuni reaccionan de manera cruzada con los elementos del sistema nervioso enterico y espedficamente de la ICC y los ganglios mientericos. Esta interaccion parece crear un grado de inflamacion celular y quizas, a traves de efectos sobre la actividad motora intestinal, el sobrecrecimiento bacteriano en el intestino delgado, ya que los mayores tftulos de anticuerpos son predictivos de anormalidades mayores en la flora del intestino delgado. Ademas, la deteccion de estos anticuerpos en el suero de humanos y ratas tiene un valor diagnostico importante.
Se ha hecho evidente que la gastroenteritis aguda es una causa del smdrome del intestino irritable. A partir de dos metaanalisis recientes, la incidencia del IBS despues de un brote de gastroenteritis bacteriana es de aproximadamente del 10 % (estudios de Thabane y Halvorsson). Los dos brotes importantes mas estudiados, incluyen el brote de Walkerton en Canada y el brote en Espana (Mearin y otros). Con anterioridad a estos estudios, los investigadores
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sugenan que el IBS posinfeccioso era, o bien una entidad separada, o un pequeno subconjunto de la poblacion total con el IBS. Sin embargo, un modelo reciente que usa datos militares y los datos prospectivos conocidos sobre el IBS posinfeccioso, combinados con datos del cDc, sobre la incidencia de gastroenteritis en los EE.UU., ahora sugiere que mas del 9 % de toda la poblacion estadounidense tendna IBS a partir de esta causa. Si bien el modelado puede ser diffcil, este al menos sugiere que la gastroenteritis aguda podna ser responsable de una gran parte del IBS en la comunidad y puede ser la causa principal.
Se han realizado varias observaciones fisiologicas en sujetos con IBS. Estas incluyen la demostracion de hipersensibilidad visceral. Aunque muchos sugieren que la sensibilidad visceral es la base de los criterios de Roma en el IBS, ironicamente, la hinchazon se observa a menudo como el smtoma mas molesto en el examen del paciente. En base a este smtoma, hace mas de una decada, los estudios comenzaron a sugerir que el sobrecrecimiento bacteriano del intestino delgado (SIBO) puede ser una caractenstica del IBS. Si bien este concepto inicialmente fue controvertido, dos estudios recientes a gran escala confirmaron un exceso de bacterias coliformes en el intestino delgado del IBS en comparacion con controles sanos (Posserud) e incluso en comparacion con sujetos con otra enfermedad del intestino anterior (Pyleris). De hecho, en sujetos que padecen IBS con diarrea predominante, el 60 % de los sujetos teman SIBO comprobado por cultivo (Pyleris).
Se han creado numerosos modelos animales para estudiar el IBS posinfeccioso. Sin embargo, algunos de los modelos publicados mas prominentemente usan patogenos que son un patogeno poco comun en el IBS y el enfoque de estos modelos es el desarrollo de hiperalgesia visceral. La causa mas comun de gastroenteritis bacteriana en los EE.UU. es Campylobacter jejuniy, por tanto, es probablemente el mayor contribuyente a la incidencia global del IBS posinfeccioso en los EE.UU. Mediante el uso de este patogeno, se demostro en un modelo reciente de roedor el desarrollo de la forma intestinal alterada, SIBO, ICC reducido y aumento de linfocitos intrarrectal. Estos hallazgos imitan los hallazgos en humanos con IBS e IBS posinfeccioso.
Si bien el C. jejuni es una causa comun de gastroenteritis y una causa importante del IBS posinfeccioso, en el desarrollo del IBS se involucran multiples patogenos bacterianos. Esto sugiere o bien una respuesta comun del hospedero a esta infeccion, o una toxina comun. La toxina de distencion citoletal es comun a casi todas las causas de gastroenteritis bacterianas agudas. Esta toxina tiene tres componentes (Cdt A, B y C). Sin embargo, se cree que la toxina activa es Cdt B en base a estudios in vitro del efecto sobre las celulas HeLa. En el modelo de roedor descrito anteriormente, la infeccion de ratas con C. jejuni 81-176 con una delecion de insercion de CdtB no resulto en el fenotipo completo del IBS posinfeccioso. Aunque los estudios en humanos sugieren que la intensidad de la gastroenteritis aguda es importante en el desarrollo del IBS, en dos estudios de infeccion aguda en roedores, la lesion intestinal solo se altero marginalmente por la presencia o la ausencia de CdtB intacta. Por tanto, Cdt B parece tener otro papel in vivo en el desarrollo de IBS.
En la presente descripcion demostramos, mediante el uso de un enfoque inmunohistoqmmico, que CdtB produce un efecto en el hospedero a traves de la produccion de autoanticuerpos. Los anticuerpos contra CdtB se unen a las neuronas mientericas y a las celulas intersticiales de Cajal. Estos autoanticuerpos son detectables tanto en ratas como en humanos con IBS posinfeccioso. De hecho, el anticuerpo tiene un valor diagnostico significativo tanto para identificar el IBS posinfeccioso (incluso en contraste con la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerativa) y para predecir las consecuencias de una neuropatfa del intestino delgado (sobrecrecimiento bacteriano del intestino delgado) en ratas. Estos datos sugieren que el IBS es una enfermedad autoinmune.
Basado en la evidencia actual, parece que el IBS posinfeccioso podna ser la causa de la mayona del IBS en la poblacion de EE.UU. y la evidencia reciente respalda que SIBO es comun en el IBS (Posserud y Pyleris) y puede deberse a una alteracion neuromuscular del intestino delgado. Sin embargo, este estudio sugiere una secuencia de eventos que conducen a esta alteracion que comienza con la exposicion a un patogeno bacteriano que contiene CdtB. La respuesta inmunitaria resultante a CdtB produce anticuerpos que reconocen, ademas, a una protema citosolica del nervio enterico del hospedero. El autoanticuerpo resultante y su tftulo parecen correlacionarse con el grado de SIBO que podna ser una medida indirecta del deterioro neuronal del intestino delgado. El grado y la presencia de SIBO parecen determinar la alteracion intestinal en este modelo (la primera validacion del modelo de rata) y en estudios humanos (Blanco 1 y 2).
En conclusion, aunque no deseamos estar sujetos a ninguna teona en particular, creemos que la gastroenteritis aguda es una causa importante del IBS. En la presente descripcion, demostramos que la toxina de distencion citoletal es determinante en el desarrollo del IBS a traves de la induccion de un anticuerpo y a traves del mimetismo molecular, un anticuerpo que es autoinmune a una protema del nervio enterico y predictivo de SIBO. Este estudio puede ser un gran avance en la comprension de la fisiopatologfa del IBS.
En consecuencia, varias modalidades de la presente invencion se basan, al menos en parte, en estos hallazgos. Diagnostico
Diversas modalidades proporcionan un metodo y un sistema para diagnosticar un trastorno de la motilidad gastrointestinal, un trastorno de la motilidad de la vejiga o fibromialgia.
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En diversas modalidades, el metodo comprende: proporcionar una muestra biologica de un sujeto que requiere el diagnostico de un trastorno de la motilidad gastrointestinal, trastorno de la motilidad de la vejiga, o fibromialgia, que detecte en la muestra biologica, una presencia de anticuerpos anti-vinculina, y que determine una presencia o probable presencia del trastorno de la motilidad gastrointestinal, trastorno de la motilidad de la vejiga o fibromialgia si se detecta la presencia de anticuerpos anti-vinculina, o que determine una ausencia o probable ausencia de un trastorno de la motilidad gastrointestinal, trastorno de la motilidad de la vejiga o fibromialgia si se detecta la ausencia de anticuerpos anti-vinculina. En ciertas modalidades, el metodo comprende, ademas, analizar la muestra biologica para la presencia o ausencia de anticuerpos anti-vinculina.
En diversas modalidades, el metodo comprende: proporcionar una muestra biologica de un sujeto que requiere el diagnostico de un trastorno de la motilidad gastrointestinal, trastorno de la motilidad de la vejiga, o fibromialgia, que detecte en la muestra biologica, un nivel de anticuerpos anti-vinculina, y que determine una presencia o probable presencia del trastorno de la motilidad gastrointestinal, trastorno de la motilidad de la vejiga o fibromialgia si el nivel de un anticuerpo anti-vinculina es mas alto que el nivel de un control establecido, o que determine la ausencia o probable ausencia de un trastorno de la motilidad gastrointestinal, trastorno de la motilidad de la vejiga o fibromialgia si el nivel de un anticuerpo anti-vinculina es igual o mas bajo que el nivel de un control establecido. En diversas modalidades, el nivel del control establecido es un nivel de anticuerpos anti-vinculina dentro de dos desviaciones estandar de los niveles de anticuerpos anti-vinculina de sujetos sin el trastorno de motilidad gastrointestinal, trastorno de motilidad de vejiga o fibromialgia. En ciertas modalidades, el metodo comprende, ademas, analizar la muestra biologica para un nivel de anticuerpos anti-vinculina.
En diversas modalidades, el metodo comprende: proporcionar una muestra biologica de un sujeto que requiere el diagnostico de un trastorno de la motilidad gastrointestinal, trastorno de la motilidad de la vejiga, o fibromialgia, que detecte en la muestra biologica, un nivel de anticuerpos anti-vinculina, y que determine una presencia o probable presencia del trastorno de la motilidad gastrointestinal, trastorno de la motilidad de la vejiga o fibromialgia si el nivel de los anticuerpos anti-vinculina es significativamente mas alto que el nivel de un control establecido, o que determine la ausencia o probable ausencia de un trastorno de la motilidad gastrointestinal, trastorno de la motilidad de la vejiga o fibromialgia si el nivel de los anticuerpos anti-vinculina no es significativamente mas alto que el nivel de un control establecido. En diversas modalidades, el nivel del control establecido es un nivel de anticuerpos anti-vinculina en sujetos sin el trastorno de la motilidad gastrointestinal, el trastorno de la motilidad de la vejiga o fibromialgia. En ciertas modalidades, el metodo comprende, ademas, analizar la muestra biologica para un nivel de anticuerpos anti-vinculina.
En diversas modalidades, el sistema comprende: una muestra biologica aislada de un sujeto que requiere el diagnostico del trastorno de la motilidad gastrointestinal, trastorno de la motilidad de la vejiga o fibromialgia, y un ensayo para detectar en la muestra biologica, una presencia o el nivel de un anticuerpo anti-vinculina.
En diversas modalidades, el ensayo es un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), que incluye, pero no se limita a, ELISA indirecto, ELISA tipo sandwich, ELISA competitivo, ELISA multiple y portatil.
En diversas modalidades, el ensayo comprende un primer reactivo que reacciona con la muestra biologica, un segundo reactivo (por ejemplo, un anticuerpo secundario) para reaccionar con el anticuerpo anti-vinculina y un sustrato. En diversas modalidades, el primer reactivo es vinculina o un fragmento de esta, que reaccionara con el anticuerpo anti- vinculina si esta presente en la muestra biologica. En diversas modalidades, el segundo reactivo comprende un marcador para producir una senal que indica la presencia del anticuerpo anti-vinculina. En diversas modalidades, el marcador es un radiomarcador, un cromoforo, un fluoroforo, un punto cuantico, una enzima, peroxidasa de rabano picante (HRP), una fosfatasa alcalina (AP), biotina o una combinacion de estos. En diversas modalidades, el marcador es una enzima que reaccionara con el sustrato. En diversas modalidades, el primer reactivo esta en una fase solida (por ejemplo, placa, placa de multiples pocillos).
En diversas modalidades, el ensayo comprende un primer reactivo para reaccionar con el anticuerpo anti-vinculina. En diversas modalidades, el primer reactivo comprende un marcador para producir una senal para indicar la presencia del anticuerpo anti-vinculina. En diversas modalidades, el marcador es un radiomarcador, un cromoforo, un fluoroforo, un punto cuantico, una enzima, peroxidasa de rabano picante (HRP), una fosfatasa alcalina (AP), biotina o una combinacion de estos. En diversas modalidades, el reactivo esta en una fase solida (por ejemplo, placa, placa de multiples pocillos).
En diversas modalidades, el sistema comprende, ademas, una maquina para determinar una presencia o probable presencia del trastorno de la motilidad gastrointestinal, trastorno de la motilidad de la vejiga o fibromialgia si se detecta la presencia de anticuerpos anti-vinculina, o determinar una ausencia o probable ausencia del trastorno de la motilidad gastrointestinal, trastorno de la motilidad de la vejiga o fibromialgia si se detecta la ausencia de anticuerpos anti- vinculina. En diversas modalidades, la maquina es una computadora. En diversas modalidades, la computadora comprende un elemento de visualizacion para visualizar si hay una presencia o ausencia del trastorno de la motilidad gastrointestinal, trastorno de la motilidad de la vejiga o fibromialgia.
En diversas modalidades, el sistema comprende, ademas, una maquina para determinar una presencia o probable presencia del trastorno de la motilidad gastrointestinal, trastorno de la motilidad de la vejiga o fibromialgia si el nivel de
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anticuerpos anti-vinculina es mayor que un nivel del control establecido, o determinar una ausencia o probable ausencia del trastorno de la motilidad gastrointestinal, trastorno de la motilidad de la vejiga o fibromialgia si el nivel de anticuerpos anti-vinculina es igual o menor que el nivel del control establecido. En diversas modalidades, el nivel del control establecido es un nivel de anticuerpos anti-vinculina dentro de dos desviaciones estandar de los niveles de anticuerpos anti-vinculina de sujetos sin el trastorno de motilidad gastrointestinal, trastorno de motilidad de vejiga o fibromialgia. En ciertas modalidades, el metodo comprende, ademas, analizar la muestra biologica para un nivel de anticuerpos anti- vinculina.
En diversas modalidades, el sistema comprende, ademas, una maquina para determinar una presencia o probable presencia del trastorno de la motilidad gastrointestinal, trastorno de la motilidad de la vejiga o fibromialgia si el nivel de anticuerpos anti-vinculina es significativamente mayor que un nivel del control establecido, o determinar una ausencia o probable ausencia del trastorno de la motilidad gastrointestinal, trastorno de la motilidad de la vejiga o fibromialgia si el nivel de anticuerpos anti-vinculina no es significativamente mas alto que el nivel del control establecido. En diversas modalidades, el nivel del control establecido es un nivel de anticuerpos anti-vinculina en sujetos sin el trastorno de la motilidad gastrointestinal, el trastorno de la motilidad de la vejiga o fibromialgia. En ciertas modalidades, el metodo comprende, ademas, analizar la muestra biologica para un nivel de anticuerpos anti-vinculina.
En diversas modalidades, el trastorno de la motilidad gastrointestinal, el trastorno de la motilidad de la vejiga o fibromialgia detectada por el metodo o sistema es el smdrome del intestino irritable (IBS), IBS con constipacion predominante (C-IBS), IBS con diarrea predominante (D-IBS), IBS alternante (A-IBS) (rebautizado mas recientemente como mixto (M-IBS)), enfermedad por reflujo gastroesofagico (GERD), dispepsia funcional, smdrome de intestino irritable posinfeccioso (PI-IBS), sobrecrecimiento bacteriano del intestino delgado (SIBO), enfermedad por reflujo gastroesofagico (GERD), gastroparesia, gastroenteritis alergica/eosinofflica, constipacion, constipacion cronica, pseudoobstruccion, cistitis intersticial, smdrome del intestino permeable, o fibromialgia. Sin estar ligados a ninguna teona en particular, creemos que debido a que la vinculina ayuda a las celulas a migrar y adherirse entre sf y las celulas epiteliales tienen vinculina, la vinculina danada puede permitir que el intestino tenga "fugas". En el caso del sistema nervioso enterico, la vinculina danada puede afectar la red nerviosa enterica. En diversas modalidades, el trastorno de la motilidad gastrointestinal es IBS. En diversas modalidades, el trastorno de la motilidad gastrointestinal es GERD. En diversas modalidades, el trastorno de la motilidad gastrointestinal es dispepsia funcional.
En ciertas modalidades, el sujeto que requiere el diagnostico del trastorno de la motilidad gastrointestinal, trastorno de la motilidad de la vejiga o fibromialgia de acuerdo con los metodos y sistemas de la presente invencion puede tener uno o mas smtomas indicativos del trastorno de la motilidad gastrointestinal, trastorno de la motilidad de la vejiga o fibromialgia; porejemplo, hinchazon, diarrea, constipacion, dolor abdominal, fatiga, dolor de fibromialgia.
Diversas modalidades de la presente invencion proporcionan un metodo y un sistema de diferenciacion entre IBS e IBD.
El metodo puede comprender proporcionar una muestra biologica de un sujeto que requiere un diagnostico para diferenciar entre IBS e IBD, detectar en la muestra biologica, una presencia de anticuerpos anti-vinculina, y hacer un diagnostico de IBS si se detecta la presencia de anticuerpos anti-vinculina, o hacer un diagnostico de IBD si se detecta la ausencia de anticuerpos anti-vinculina. En ciertas modalidades, el metodo comprende, ademas, analizar la muestra biologica para la presencia o ausencia de anticuerpos anti-vinculina. En ciertas modalidades, el metodo comprende, ademas, seleccionar un tratamiento de IBS si se diagnostica IBS, o seleccionar un tratamiento de IBD si se diagnostica IBD.
En diversas modalidades, el metodo puede comprender proporcionar una muestra biologica de un sujeto que requiere un diagnostico para diferenciar entre IBS e IBD, detectar en la muestra biologica, un nivel de anticuerpos anti-vinculina, y hacer un diagnostico de IBS si el nivel de anticuerpos anti-vinculina es mayor que un nivel del control establecido, o hacer un diagnostico de IBD si el nivel de anticuerpos anti-vinculina es igual o menor que el nivel del control establecido. En diversas modalidades, el nivel del control establecido es un nivel de anticuerpos anti-vinculina dentro de dos desviaciones estandar de los niveles de anticuerpos anti-vinculina de sujetos sanos sin IBS, IBD, o ambos. En ciertas modalidades, el metodo comprende, ademas, analizar la muestra biologica para un nivel de anticuerpos anti-vinculina.
En diversas modalidades, el metodo puede comprender proporcionar una muestra biologica de un sujeto que requiere un diagnostico para diferenciar entre IBS e IBD, detectar en la muestra biologica, un nivel de anticuerpos anti-vinculina, y hacer un diagnostico de IBS si el nivel de anticuerpos anti-vinculina es significativamente mayor que un nivel del control establecido, o hacer un diagnostico de IBD si el nivel de anticuerpos anti-vinculina no es significativamente mayor que el nivel del control establecido. En diversas modalidades, el nivel del control establecido es un nivel de anticuerpos anti-vinculina de sujetos sin IBS, IBD o ambos. En ciertas modalidades, el metodo comprende, ademas, analizar la muestra biologica para un nivel de anticuerpos anti-vinculina.
En diversas modalidades, el sistema puede comprender una muestra biologica aislada de un sujeto que desee diferenciar entre IBS e IBD, y un ensayo para detectar en la muestra biologica, una presencia de un anticuerpo anti- vinculina o un nivel de anticuerpo anti-vinculina para diferenciar entre el IBS y la IBD.
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En diversas modalidades, el ensayo es un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), que incluye, pero no se limita a, ELISA indirecto, ELISA tipo sandwich, ELISA competitivo, ELISA multiple y portatil.
En diversas modalidades, el ensayo comprende un primer reactivo para reaccionar con la muestra biologica si la muestra biologica comprende el anticuerpo anti-vinculina (si los anticuerpos anti-vinculina no estan presentes, entonces el primer reactivo no reaccionara con la muestra biologica, pero el primer reactivo aun esta presente en el ensayo), un segundo reactivo (por ejemplo, anticuerpo secundario) para reaccionar con el anticuerpo anti-vinculina o un segundo reactivo para reaccionar con el primer reactivo, y un sustrato. En diversas modalidades, el primer reactivo es vinculina o un fragmento de esta. En diversas modalidades, el segundo reactivo comprende un marcador para producir una senal que indica la presencia del anticuerpo anti-vinculina. En diversas modalidades, el marcador es un radiomarcador, un cromoforo, un fluoroforo, un punto cuantico, una enzima, peroxidasa de rabano picante (HRP), una fosfatasa alcalina (AP), biotina o una combinacion de estos. En diversas modalidades, el marcador es una enzima que reaccionara con el sustrato. En diversas modalidades, el primer reactivo esta en una fase solida (por ejemplo, placa, placa de multiples pocillos).
En diversas modalidades, el ensayo comprende un primer reactivo para reaccionar con el anticuerpo anti-vinculina. En diversas modalidades, el primer reactivo comprende un marcador para producir una senal para indicar la presencia del anticuerpo anti-vinculina. En diversas modalidades, el marcador es un radiomarcador, un cromoforo, un fluoroforo, un punto cuantico, una enzima, peroxidasa de rabano picante (HRP), una fosfatasa alcalina (AP), biotina o una combinacion de estos. En diversas modalidades, el reactivo esta en una fase solida (por ejemplo, placa, placa de multiples pocillos).
En diversas modalidades, el sistema comprende, ademas, una maquina para determinar la presencia o probable presencia de IBS si se detecta la presencia de anticuerpos anti-vinculina, o determinar la presencia o probable presencia de IBD si se detecta la ausencia de anticuerpos anti-vinculina. En diversas modalidades, la maquina es una computadora. En diversas modalidades, la computadora comprende un elemento de visualizacion para visualizar si el paciente probablemente tiene IBS o IBD.
En diversas modalidades, el sistema comprende, ademas, una maquina para determinar una presencia o probable presencia de IBS si el nivel de anticuerpos anti-vinculina es mayor que un nivel del control establecido o determinar la presencia o probable presencia de IBD si el nivel de anticuerpos anti-vinculina es igual o menor que el nivel de control establecido. En diversas modalidades, el nivel del control establecido es un nivel de anticuerpos anti-vinculina dentro de dos desviaciones estandar de los niveles de anticuerpos anti-vinculina de sujetos sanos sin IBS, IBD, o ambos. En ciertas modalidades, el metodo comprende, ademas, analizar la muestra biologica para un nivel de anticuerpos anti- vinculina.
En diversas modalidades, el sistema comprende, ademas, una maquina para determinar una presencia o probable presencia de IBS si el nivel de anticuerpos anti-vinculina es significativamente mayor que un nivel del control establecido, o determinar una presencia o probable presencia de IBD si el nivel de anticuerpos anti-vinculina no es significativamente mas alto que el nivel del control establecido. En diversas modalidades, el nivel del control establecido es un nivel de anticuerpos anti-vinculina de sujetos sanos sin IBS, IBD o ambos. En ciertas modalidades, el metodo comprende, ademas, analizar la muestra biologica para un nivel de anticuerpos anti-vinculina.
En diversas modalidades, la maquina es una computadora. En diversas modalidades, la computadora comprende un elemento de visualizacion para visualizar si el paciente probablemente tiene IBS o IBD.
En diversas modalidades, el anticuerpo anti-vinculina detectado en estos metodos o sistemas es un anticuerpo que se une espedficamente a vinculina.
En diversas modalidades, el anticuerpo anti-vinculina es un anticuerpo que se une espedficamente a un peptido de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, o 22 residuos que tiene al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de homologfa con 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, o 22 residuos contiguos de vinculina.
En otra modalidad, el anticuerpo anti-vinculina se une espedficamente a un polipeptido que comprende 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, o 22 residuos que tiene al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de homologfa con 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, o 22 residuos contiguos de vinculina.
En otra modalidad, el anticuerpo anti-vinculina se une espedficamente a un polipeptido que comprende 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, o 22 residuos contiguos de vinculina.
En diversas modalidades, el anticuerpo anti-vinculina es un anticuerpo que se une espedficamente a la sec. con num. de ident.:1.
En diversas modalidades, el anticuerpo anti-vinculina es un anticuerpo que se une espedficamente a un peptido de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, o 22 residuos que tiene al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o
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En otra modalidad, el anticuerpo anti-vinculina se une espedficamente a un polipeptido que comprende 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, o 22 residuos, que tiene al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de homologfa con 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, o 22 residuos contiguos de la sec. con num. de ident.:1.
En otra modalidad, el anticuerpo anti-vinculina se une espedficamente a un polipeptido que comprende 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, o 22 residuos contiguos de la sec. con num. de ident.:1.
Los residuos contiguos de la vinculina o de la sec. con num. de ident.:1 incluyen aquellos que comienzan en cualquier amino acido y terminan en cualquier amino acido de la vinculina o de la sec. con num. de ident.:1.
Secuencia de protema de la Vinculina (sec. con num. de ident.:1):
MPVFHTRTIESILEPVAQQISHLVIMHEEGEVDGKAIPDLTAPVAAVQAAVSNLVRVG
KETVQTTEDQILKRDMPPAFIKVENACTKLVQAAQMLQSDPYSVPARDYLIDGSRGI
LSGTSDLLLTFDEAEVRKIIRVCKGILEYLTVAEVVETMEDLVTYTKNLGPGMTKMA
KMIDERQQELTHQEHRVMLVNSMNTVKELLP VLIS AMKIF VTTKN SKNQGIEEALKN
RNFTVEKMSAEINEIIRVLQLTSWDEDAWASKDTEAMKRALASIDSKLNQAKGWLR
DPSASPGDAGEQAIRQILDEAGKVGELCAGKERREILGTCKMLGQMTDQVADLRAR
GQGSSPVAMQKAQQVSQGLDVLTAKVENAARKLEAMTNSKQSIAKKIDAAQNWLA
DPNGGPEGEEQIRGALAEARKIAELCDDPKERDDILRSLGEISALTSKLADLRRQGKG
DSPEARALAKQVATALQNLQTKTNRAVANSRPAKAAVHLEGKIEQAQRWIDNPTVD
DRGVGQAAIRGLVAEGHRLANVMMGPYRQDLLAKCDRVDQLTAQLADLAARGEG
ESPQARALASQLQDSLKDLKARMQEAMTQEVSDYFSDTTTPIKLLAVAATAPPDAP
NREEVFDERAANFENHSGKLGATAEKAAAVGTANKSTVEGIQASVKTARELTPQVV
SAARILLRNPGNQAAYEHFETMKNQWIDNVEKMTGLVDEAIDTKSLLDASEEAIKK
DLDKCKVAMANIQPQMLVAGATSIARRANRILLVAKREVENSEDPKFREAVKAASD
ELSKTISPMVMDAKAVAGNISDPGLQKSFLDSGYRILGAVAKVREAFQPQEPDFPPPP
PDLEQLRLTDELAPPKPPLPEGEVPPPRPPPPEEKDEEFPEQKAGEVINQPMMMAARQ
LHDEARKWSSKGNDIIAAAKRMALLMAEMSRLVRGGSGTKRALIQCAKDIAKASDE
VTRLAKEVAKQCTDKRIRTNLLQVCERIPTISTQLKILSTVKATMLGRTNISDEESEQA
TEMLVHNAQNLMQSVKETVREAEAASIKIRTDAGFTLRWVRKTPWYQ
En diversas modalidades, detectar la presencia o ausencia del anticuerpo se realiza en una muestra biologica que se obtiene del sujeto. En otra modalidad, la deteccion de la presencia o ausencia del anticuerpo se realiza en una muestra de sangre, suero o heces que se obtiene del sujeto. Un experto en la tecnica apreciara facilmente los metodos y sistemas que pueden usarse para detectar la presencia o ausencia de un anticuerpo que se une espedficamente a vinculina, sec. con num. de ident.: 1 o un fragmento de esta. Estos metodos y sistemas incluyen, pero no se limitan a, ELISA, inmunohistoqdmica, citometna de flujo, hibridacion con fluorescencia in situ (FISH), radioinmunoensayos y purification por afinidad.
En diversas modalidades, la vinculina, sec. con num. de ident.: 1 o un fragmento de estas (como se describe anteriormente) se usa como sustrato o reactivo (por ejemplo, colector, trampa) para unir anticuerpos anti-vinculina (si estan presentes).
En ciertas modalidades, detectar la presencia o ausencia de un anticuerpo que se une espedficamente a la vinculina, sec. con num. de ident.: 1 o un fragmento de estas puede realizarse mediante la puesta en contacto de la vinculina, sec. con num. de ident.: 1 o un fragmento de esta con una muestra biologica que se obtiene del sujeto, con el proposito de aislar el anticuerpo que se une especficamente a la vinculina, sec. con num. de ident.: 1 o un fragmento de esta, en donde el aislamiento del anticuerpo que se une especficamente a la vinculina, sec. con num. de ident.: 1 o un fragmento de esta, indica la presencia del anticuerpo y la falta del aislamiento del anticuerpo que se une especficamente a la vinculina, sec. con num. de ident.: 1 o un fragmento de esta, indica la falta del anticuerpo. En
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diversas modalidades, el fragmento de vinculina o sec. con num. de ident.: 1 pueden ser los fragmentos como se describio en la presente descripcion. A modo de ejemplo, una matriz de afinidad que comprende vinculina, sec. con num. de ident.: 1 o un fragmento de esta, puede unirse a un soporte solido; la muestra biologica puede contactar la matriz de afinidad para producir un complejo de afinidad entre el anticuerpo y la matriz (si el anticuerpo esta presente); el complejo de afinidad entre el anticuerpo y la matriz puede separarse del resto de la muestra biologica; y el anticuerpo puede liberarse de la matriz de afinidad. En otro ejemplo, un marcador (por ejemplo, un marcador de fluorescencia) puede colocarse sobre la vinculina, sec. con num. de ident.: 1 o un fragmento de esta; la vinculina marcada, sec. con num. de ident.: 1 o un fragmento de esta, puede ponerse en contacto con la muestra biologica para permitir que el anticuerpo (si esta presente) se una espedficamente a la vinculina marcada, sec. con num. de ident.: 1 o un fragmento de esta. En diversas modalidades, la vinculina marcada, sec. con num. de ident.: 1 o un fragmento de esta puede separarse y analizarse por su union al anticuerpo.
Terapia
Diversas modalidades proporcionan un metodo para seleccionar una terapia para un trastorno de la motilidad gastrointestinal, trastorno de la motilidad de la vejiga o fibromialgia para un sujeto que lo necesita. En diversas modalidades, el metodo comprende: detectar la presencia de anticuerpos anti-vinculina; y seleccionar una terapia para tratar el trastorno de la motilidad gastrointestinal, el trastorno de la motilidad de la vejiga o fibromialgia. La seleccion de una terapia como se usa en la presente descripcion incluye, pero no se limita a seleccionar, elegir, prescribir, aconsejar, recomendar, instruir o asesorar al sujeto con respecto al tratamiento. En diversas modalidades, el metodo comprende, ademas, administrar la terapia para tratar el trastorno de la motilidad gastrointestinal, el trastorno de la motilidad de la vejiga o fibromialgia. En diversas modalidades, la terapia es una terapia como se describe en la presente descripcion. En diversas modalidades, la terapia disponible comprende administrar un curso de terapia con antibioticos para tratar el trastorno de la motilidad gastrointestinal, el trastorno de la motilidad de la vejiga o fibromialgia. En diversas modalidades, la terapia es una terapia disponible en la tecnica anterior.
En diversas modalidades, detectar la presencia de anticuerpos anti-vinculina puede realizarse como se describe por los metodos o sistemas de la presente invencion.
En diversas modalidades, el sujeto puede ser un sujeto que presente uno o mas smtomas del trastorno de la motilidad gastrointestinal, trastorno de la motilidad de la vejiga o fibromialgia; por ejemplo, como se discute en la presente descripcion.
En diversas modalidades, el metodo comprende: detectar la presencia de anticuerpos anti-vinculina; y seleccionar un curso de terapia con antibioticos para tratar el trastorno de la motilidad gastrointestinal, el trastorno de la motilidad de la vejiga o fibromialgia. En diversas modalidades, el metodo comprende, ademas, administrar el curso de la terapia con antibioticos para tratar el trastorno de la motilidad gastrointestinal, el trastorno de la motilidad de la vejiga o fibromialgia.
En diversas modalidades, el trastorno de la motilidad gastrointestinal, el trastorno de la motilidad de la vejiga o fibromialgia puede ser parte del smdrome del intestino irritable (IBS), C-IBS, D-IBS, A-IBS (tambien conocido como M- IBS), enfermedad por reflujo gastroesofagico (GERD), dispepsia funcional, smdrome de intestino irritable posinfeccioso (PI-IBS), sobrecrecimiento bacteriano del intestino delgado (SIBO), enfermedad por reflujo gastroesofagico (GERD), gastroparesia, gastroenteritis alergica/eosinofflica, constipacion, constipacion cronica, pseudoobstruccion, cistitis intersticial, smdrome del intestino permeable, o fibromialgia. En diversas modalidades, el trastorno de la motilidad gastrointestinal es IBS. En ciertas modalidades, el trastorno de la motilidad gastrointestinal es GERD. En ciertas modalidades, el trastorno de la motilidad gastrointestinal es dispepsia funcional.
Los ejemplos de antibioticos incluyen, pero no se limitan a los aminoglucosidos (por ejemplo, amikacina, gentamicina, kanamicina, neomicina, netilmicina, estreptomicina, tobramicina, paromomicina), ansamicinas (por ejemplo, geldanamicina, herbimicina), carbacefem (por ejemplo, loracarbef), carbapenem (por ejemplo, ertapenem, doripenem, imipenem, cilastatin, meropenem), cefalosporinas (por ejemplo, de primera generacion: cefadroxil, cefazolin, cefalotin o cefalotin, cefalexin; de segunda generacion: cefaclor, cefamandol, cefoxitin, cefprozil, cefuroxima; detercera generacion: cefixima, cefdinir, cefditoren, cefoperazona, cefotaxima, cefpodoxima, ceftazidima, ceftibuten, ceftizoxima, ceftriaxona; de cuarta generacion: cefepima; de quinta generacion: ceftobiprol), glicopeptidos (por ejemplo, teicoplanin, vancomicina), macrolidos (por ejemplo, azitromicina, claritromicina, diritromicina, eritromicina, roxitromicina, troleandomicina, telitromicina, espectinomicina), monobactamas (por ejemplo, aztreonam), penicilinas (por ejemplo, amoxicilina, ampicilina, azlocilina, carbenicilina, cloxacilina, dicloxacilina, flucloxacilina, mezlocilina, meticilina, nafcilina, oxacilina, penicilina, piperacilina, ticarcilina), polipeptidos antibioticos (por ejemplo, bacitracina, colistina, polimixin B), quinolonas (por ejemplo, ciprofloxacina, enoxacina, gatifloxacina, levofloxacina, lomefloxacina, moxifloxacina, norfloxacina, ofloxacina, trovafloxacina), rifamicinas (por ejemplo, rifampicina o rifampin, rifabutina, rifapentina, rifaximina), sulfonamidas (por ejemplo, mafenida, prontosil, sulfacetamida, sulfametizol, sulfanilamida, sulfasalazina, sulfisoxazol, trimetoprim, trimetoprim-sulfametoxazol (co-trimoxazol, "tmp-smx"), y tetraciclinas (por ejemplo, demeclociclina, doxiciclina, minociclina, oxitetraciclina, tetraciclina) asf como tambien arsfenamina, cloramfenicol, clindamicina, lincomicina, etambutol, fosfomicina, acido fusfdico, furazolidona, isoniazida, linezolid, metronidazol, mupirocin, nitrofurantoina, platensimicina, pirazinamida, combinacion quinupristin/dalfopristin, y tinidazol, o una combinacion de estos. En diversas modalidades, los antibioticos son una combinacion de rifaximina y neomicina. En
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diversas modalidades, los antibioticos son una combinacion de rifaximina y doxiciclina. En diversas modalidades, los antibioticos son una combinacion de rifaximina y metronidazol.
En diversas modalidades, los antibioticos son antibioticos no absorbibles. Los ejemplos de antibioticos no absorbibles incluyen, pero no se limitan a rifaximina, neomicina, bacitracina, vancomicina, teicoplanina, ramoplanina y paramomicina.
Diversas modalidades proporcionan metodos para tratar un trastorno de la motilidad gastrointestinal, trastorno de la motilidad de la vejiga o fibromialgia. En diversas modalidades, el trastorno de la motilidad gastrointestinal, el trastorno de la motilidad de la vejiga o fibromialgia tratados pueden ser el smdrome del intestino irritable (IBS), C-IBS, D-IBS, A-IBS (tambien conocido como M-IBS), enfermedad por reflujo gastroesofagico (GERD), dispepsia funcional, smdrome de intestino irritable posinfeccioso (PI-IBS), sobrecrecimiento bacteriano del intestino delgado (SIBO), enfermedad por reflujo gastroesofagico (GERD), gastroparesia, gastroenteritis alergica/eosinofflica, constipacion, constipacion cronica, pseudoobstruccion, cistitis intersticial, smdrome del intestino permeable, o fibromialgia. En diversas modalidades, el trastorno de la motilidad gastrointestinal es IBS. En ciertas modalidades, el trastorno de la motilidad gastrointestinal es GERD. En ciertas modalidades, el trastorno de la motilidad gastrointestinal es dispepsia funcional.
En diversas modalidades, el metodo puede comprender proporcionar un agente neutralizante o inhibidor del anticuerpo anti-vinculina y administrar el agente neutralizante o inhibidor del anticuerpo anti-vinculina a un sujeto que lo necesite para neutralizar o inhibir el anticuerpo anti-vinculina.
En diversas modalidades, el agente neutralizante o inhibidor del anticuerpo anti-vinculina es un polipeptido capaz de unirse al anticuerpo anti-vinculina y neutralizar o inhibir su funcion.
En diversas modalidades, el agente neutralizante o inhibidor del anticuerpo anti-vinculina es un polipeptido capaz de unirse a un sitio de union con el antfgeno del anticuerpo anti-vinculina. Si desear adherirse a ninguna teona particular, los inventores creen que estos polipeptidos pueden servir como senuelo para el anticuerpo anti-vinculina. En diversas modalidades, los polipeptidos son pentapeptidos CDT como se describe por Lucchese y Delfinoen (Developing an anti- Campylobacter jejuni vaccine. Immunopharmacology and Immunotoxicology, 2012; Early Online: 1-6).
En diversas modalidades, el agente neutralizante o inhibidor del anticuerpo anti-vinculina es una molecula pequena capaz de unirse al anticuerpo anti-vinculina y neutralizar o inhibir su funcion.
En diversas modalidades, el agente neutralizante o inhibidor del anticuerpo anti-vinculina es una molecula pequena capaz de unirse a un sitio de union con el antfgeno del anticuerpo anti-vinculina.
En diversas modalidades, el metodo puede comprender proporcionar un agente para cambiar la vinculina de un estado inactivo a un estado activo; y administrar el agente a un sujeto que lo necesite para tratar el trastorno de la motilidad gastrointestinal, el trastorno de la motilidad de la vejiga o fibromialgia.
En diversas modalidades, el agente para cambiar la vinculina de un estado inactivo a un estado activo es una molecula pequena capaz de activar la vinculina.
En diversas modalidades, el metodo puede comprender proporcionar un agonista de vinculina; y administrar el agonista de vinculina a un sujeto que lo necesita para tratar el trastorno de la motilidad gastrointestinal, el trastorno de la motilidad de la vejiga o fibromialgia. En ciertas modalidades, el agonista de vinculina puede ser un peptido activador de vinculina (VAP) como se describe por Nelson y otros, en Vinculin Activators Target Integrins from Within the Cell to Increase Melanoma Sensitivity to Chemotherapy, MOL CANCER RES 9 dejunio de 2011; 712 (publicado en lmea el 1 de abril, 2011). En diversas modalidades, el VAP puede ser los residuos 500-633 de la protema invasina IpaA de Shigella.
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La secuencia de la proteha IpaA de Shigella:
MHNVNNTQAP TFLYKATSPS STEYSELKSK ISDIHSSQTS ENFATSFNQK CLDFLFSSSG KEDVLRSIYS NSMNAYAKSE LYHQNGLNFE NEKGLQKIVA QYSELIIKDK LSQDSAFGPW RQNIEHRLAL LAQQHTSGEA LSLGQKLLNT EVSSFIKNNI VSSLKLDDLV DAQAKLAFDS LRNQRKNTID SKGFGIGKLS ELLRKVLNDI LEDIKDSHPI QDGLPTPPED MPDGGPTPGA YHINNDNRTY DNRVFDNRVY DN S YHENPEN DAQSPTSQTN LNPQRALVQK VTSVLPHSIS DTVQTFANNS ALEKVFNHTP LTTSSQERSA NNSLSRGHRP LNIQNSSTTP PLHPEGVTSS SASLSHRVAS QINKFNSNTD SKVLQTDFLS RNGDTYLTRE NSLSNLISLI GTKSGTQERE LQEKSKDITK STTEHRINNK YYTETNADTI DKNHAIYEKA KEVSSALSKV LSKIDDTSAE NNNDITAENN NIYKAAKDVT TSLSKVLKNINKD (SEQ ID NO:6)
LKTPASVSEK
ILEFSNVLYS
SAKNKKLHQL
LAELKLSNET
RDLNTVAVFP
NEKTSQPVIH
DLLSRNGNSL
DNSDGIGSDL
NDNSSDTTKS
TIFEASKKVT
LKVTDANIRN
LLTDDISDLK
En diversas modalidades, el metodo puede comprender proporcionar un activador de vinculina; y administrar el activador de vinculina a un sujeto que lo necesite para tratar el trastorno de la motilidad gastrointestinal, el trastorno de la motilidad de la vejiga o fibromialgia. En ciertas modalidades, el activador de vinculina puede ser talina, f-actina, a- catenina o combinaciones de estos.
Diversas modalidades proporcionan un metodo para tratar o inhibir la progresion de los polipos en el colon o la malignidad. Se ha visto que hay menos polipos en pacientes con IBS. Como tal, los anticuerpos anti-vinculina o los agentes que bloquean la vinculina pueden disminuir la progresion de los polipos en el colon o la malignidad.
En diversas modalidades, el metodo puede comprender proporcionar un agente para cambiar la vinculina de un estado activo a un estado inactivo; y administrar el agente a un sujeto que lo necesita para tratar o inhibir la progresion de los polipos en el colon o la malignidad.
En diversas modalidades, el agente para cambiar la vinculina de un estado activo a un estado inactivo es una molecula pequena capaz de inactivar la vinculina.

En diversas modalidades, el metodo puede comprender proporcionar un antagonista de vinculina; y administrar el

antagonista de vinculina a un sujeto que lo necesite para tratar o inhibir la progresion de los polipos en el colon o la
malignidad.

En diversas modalidades, el metodo puede comprender proporcionar un inactivador de vinculina; y administrar el

inactivador de vinculina a un sujeto que lo necesita para tratar o inhibir la progresion de los polipos en el colon o la
malignidad.
En diversas modalidades, el metodo puede comprender proporcionar un anticuerpo anti-vinculina capaz de inhibir la funcion de la vinculina; y administrar el anticuerpo anti-vinculina al sujeto para tratar o inhibir la progresion de los polipos en el colon o la malignidad.
En diversas modalidades, la presente invencion proporciona composiciones farmaceuticas que incluyen un excipiente farmaceuticamente aceptable junto con una cantidad con eficacia terapeutica de los agentes descritos en la presente descripcion. El termino "excipiente farmaceuticamente aceptable” significa un excipiente que es util para preparar una composicion farmaceutica que es generalmente segura, no toxica, y deseable, y que incluye excipientes que son aceptables para uso veterinario, asf como tambien para el uso farmaceutico humano. Tales excipientes pueden ser solidos, lfquidos, semisolidos, o, en el caso de una composicion en aerosol, gaseosos.
En diversas modalidades, las composiciones farmaceuticas de acuerdo con la invencion pueden formularse para administrarse a traves de cualquier ruta de administracion. El termino "ruta de administration" puede referirse a cualquier vfa de administracion conocida en la tecnica, que incluye pero no se limitan a aerosol, nasal, oral, transmucosal, transdermica o parenteral. La administracion "transdermica" puede lograrse mediante el uso de una crema topica o unguento o por medios de un parche transdermal. Por la vfa de la ruta topica, las composiciones farmaceuticas basadas en los compuestos de acuerdo a la invencion pueden formularse para tratar la piel y las membranas mucosas y estan en la forma de unguentos, cremas, leches, sales, polvos, almohadillas impregnadas, soluciones, geles, aerosoles, lociones o suspensiones. Ellas pueden estar, ademas, en la forma de microesferas o nanoesferas o vesfculas lipfdicas o vesfculas de polfmeros o parches de polfmeros e hidrogeles que permiten la liberation controlada. Estas composiciones de ruta topica pueden estar tanto en formas anhidras o en formas acuosas
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en dependencia de la indicacion clmica. El termino "parenteral" se refiere a la ruta de administracion que se asocia generalmente con una inyeccion, que incluye inyeccion intraorbital, infusion, intraarterial, intracapsular, intracardiaca, intradermica, intramuscular, intraperitoneal, intrapulmonar, intraespinal, intraesternal, intratecal, intrauterina, intravenosa, subaracnoidea, subcapsular, subcutanea, transmucosal, o transtraqueal. Por la via de la ruta parenteral, las composiciones pueden estar en la forma de soluciones o suspensiones para infusion o para inyeccion, o como polvos liofilizados. Por la via de la ruta enteral, las composiciones farmaceuticas pueden estar en la forma de tabletas, capsulas de gel, tabletas recubiertas de azucar, jarabes, suspensiones, soluciones, polvos, granulos, emulsiones, microesferas o nanoesferas o vesfculas lipfdicas o vesfculas de polfmeros que permiten la liberacion controlada. Por la via de la ruta parenteral, las composiciones pueden estar en la forma de soluciones o suspensiones para infusion o para inyeccion.
Las composiciones farmaceuticas de acuerdo con la invencion pueden contener, ademas, cualquier portador farmaceuticamente aceptable. El termino "portador farmaceuticamente aceptable", como se usa en la presente descripcion, se refiere a un material, composicion, o vetnculo farmaceuticamente aceptable que se encarga de llevar o transportar un compuesto de interes a partir de un tejido, organo, o porcion del cuerpo hasta otro tejido, organo, o porcion del cuerpo. Por ejemplo, el portador puede ser un lfquido o solido de relleno, diluyente, excipiente, solvente, o material encapsulante, o una combinacion de estos. Cada componente del portador debe ser "farmaceuticamente aceptable" en el hecho de que debe ser compatible con los otros ingredientes de la formulacion. Este debe ser, ademas, adecuado para usar en contacto con cualquier tejido u organo con el cual puede ponerse en contacto, lo que significa que no debe portar un riesgo de toxicidad, irritacion, respuesta alergica, inmunogenicidad, o cualquier otra complicacion que excesivamente pese mas que sus beneficios terapeuticos.
Las composiciones farmaceuticas de acuerdo con la invencion pueden ser, ademas, encapsuladas, llevadas a tabletas o preparadas en una emulsion de jarabe para la administracion oral. Pueden anadirse los portadores solidos o lfquidos farmaceuticamente aceptables para incrementar o estabilizar la composicion, o para facilitar la preparacion de la composicion. Los portadores lfquidos incluyen jarabes, aceite de mam, aceite de oliva, glicerina, solucion salina, alcoholes y agua. Los portadores solidos incluyen almidon, lactosa, sulfato de calcio dihidratado, terra alba, estearato de magnesio o acido estearico, talco, pectina, acacia, agar o gelatina. El portador puede incluir, ademas, un material de liberacion sostenida, tal como gliceril monoestearato o gliceril diestearato, solo o con una cera.
Las preparaciones farmaceuticas se hacen mediante las regulaciones de las tecnicas convencionales de farmacia que involucran la molienda, mezclado, granulacion, y compresion, cuando son necesarias, para las formas de tabletas; o molienda, mezclado y relleno para las formas de capsula de gelatina dura. Cuando se usa un portador lfquido, la preparacion estara en forma de jarabe, elixir, emulsion o una suspension acuosa o no acuosa. Tal formulacion lfquida puede administrarse directamente p.o., o como relleno dentro de una capsula de gelatina blanda.
Las composiciones farmaceuticas de acuerdo con la invencion pueden suministrarse en una cantidad con eficacia terapeutica. La cantidad con eficacia terapeutica precisa es aquella cantidad de la composicion que producira los resultados mas eficaces en terminos de eficacia del tratamiento en un sujeto dado. Esta cantidad variara en dependencia de una variedad de factores, que incluyen pero no se limitan a las caractensticas del compuesto terapeutico (que incluyen actividad, farmacocinetica, farmacodinamia, y biodisponibilidad), la condicion fisiologica del sujeto (que incluyen edad, sexo, estadio y tipo de enfermedad, condicion ffsica general, capacidad de respuesta a una dosis dada, y tipo de medicacion), la naturaleza del portador o portadores farmaceuticamente aceptables en la formulacion, y la ruta de administracion. Un experto en las tecnicas clmicas y farmacologicas sera capaz de determinar la cantidad con eficacia terapeutica a traves de la rutina de experimentacion, por ejemplo, mediante el monitoreo de la respuesta del sujeto a la administracion de un compuesto y el ajuste de la dosificacion en consecuencia. Para una grna adicional, ver Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Gennaro ed. 20ma. Edicion, Williams Wilkins PA, USA) (2000).
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar mejor la invencion reivindicada y no se deben interpretar como limitante del alcance de la invencion. Hasta el punto que se mencionan los materiales espedficos, es solo para fines de ilustracion y no se pretende limitar la invencion. Un experto en la tecnica puede desarrollar medios o reactivos equivalentes sin el ejercicio de la capacidad inventiva y sin apartarse del alcance de la invencion.
Ejemplo 1
Metodos
Se reclutaron sujetos controles sanos, sujetos con IBS y sujetos con la enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) y se les recolecto suero. El ELISA se preparo mediante el recubrimiento de las placas de 96 pocillos con cdtB recombinante y vinculina humana. Despues del recubrimiento, se realizo una curva de calibracion para cdtB y vinculina mediante el uso del anticuerpo comercial purificado anti-cdtB y el anticuerpo anti-vinculina humana. El suero de los sujetos controles sanos, con IBS e IBD se anadio a los pocillos y se examino. Los pocillos se incubaron durante 60 minutos antes del lavado y de la aplicacion de los anticuerpos secundarios.
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Anticuerpos anti-CdtB
Para determinar el papel de CdtB en el desarrollo del IBS, se desarrollaron dos anticuerpos para CdtB de C. jejuni 81176. El primero fue a traves de la inmunizacion de conejos con un residuo de 18 aminoacidos identificado como altamente antigenico (haAB) mediante el modelado de protema (AnaSpec, San Jose, CA). El segundo se desarrollo a traves de la inmunizacion de conejos con el peptido CdtB casi completo (wAb). Para confirmar la selectividad del suero de conejo a CdtB, se corrieron lisados de C. jejuni 81-176, en un gel para western con y sin bloqueo con la protema CdtB para verificar una banda a la altura de 28kDa. Con esta validacion, el wAb se uso a traves de los experimentos restantes.
Ejemplo 3
Exposicion aguda a C. jejuni y CdtB en ratas con infeccion aguda por C. jejuni
Para determinar el papel de CdtB en nuestro modelo animal, examinamos el tejido del fleon en ratas con infeccion aguda por C. jejuni. Las ratas se inocularon mediante sonda oral con 108cfu/mL de C. jejuni 81-176. El dfa 2, se sacrificaron las ratas y se resecaron secciones de Aeon, se fijaron en formalina al 10 % (VWR, Radnor, PA) y se prepararon las secciones para inmunohistoqmmica. Como una comparacion, los fleon de ratas vfrgenes a C. jejuni se prepararon de manera similar. A estas secciones se aplicaron wAb y suero de conejo preinmune (control negativo) en secciones contiguas.
Ejemplo 4
Seguimiento de anticuerpos anti-CdtB en el fleon humano
Basado en la busqueda de la actividad de wAb en la mucosa y en los elementos neurales de ambas ratas, controles e infectadas por C. jejuni, el estudio se repitio mediante el uso de secciones de fleon humano. Se identificaron humanos que se sometieron a ileocectoirna por malignidades de colon, se monto una porcion del fleon y se incubaron secciones con wAb y con suero preinmune para determinar, mediante el uso de la inmunohistoqmmica, si habfa sustento para el mimetismo molecular.
Ejemplo 5
Identificacion de la protema neuronal enterica responsable del mimetismo molecular
Dado que el sistema nervioso enterico y en particular los ganglios y las neuronas entericas son sitios de localizacion para los anticuerpos contra CdtB (wAb), se obtuvieron lisados de celulas madre neuronales entericas. Los lisados se corrieron en gel para western con y sin bloqueo con la protema CdtB mediante el uso de wAb y haAB para identificar una protema potencial a la que se adhiere wAb. Esta se identifico a la altura de 117 kDa y posteriormente se uso inmunoprecipitacion mediante el uso de wAb aplicado a perlas para extraer la protema de interes. Esto se realizo mediante la union — de las protemas a las perlas, despues, se unieron los lisados de celulas madres de neuronas entericas a 2.5x108. El efluente se corrio en un gel y la banda nuevamente identifico una protema a la altura de 117 kDa. Esta banda se corto y se uso espectroscopfa de masas para analizar el contenido de protema.
Despues de la identificacion de la protema de interes, se uso microscopfa confocal para determinar la colocalizacion de los anticuerpos con esta protema en los tejidos en comparacion con la afinidad tisular con CdtBwAb, tanto en ratas como en humanos.
Ejemplo 6
Deteccion de anticuerpos contra CdtB y vinculina en ratas expuestas a C. jejuni
En nuestro modelo animal de IBS posinfeccioso validado, las ratas macho Sprague Dawley expuestas a C. jejuni 81-176 desarrollan sobrecrecimiento bacteriano en el intestino delgado, basado en conteos bacterianos totales por qPCR. Este fenotipo se aumenta por la exposicion repetida a C. jejuni. En este experimento, se compararon 3 grupos de ratas. El primer grupo incluye ratas de control que nunca se expusieron a C. jejuni (n=20). En el segundo grupo de ratas, a los animales se les administro por sonda oral el vehmulo en el penodo juvenil, y 2 meses mas tarde recibieron por sonda oral 108 cfu/mL de C. jejuni 81-176 como adultos (J-/A+) (n=50). Al tercer grupo de animales se les administro por sonda oral 108 cfu/mL de C. jejuni 81-176 en el penodo juvenil y dos meses mas tarde, como adultos se volvieron a exponer, mediante sonda oral, a 108 cfu/mL de C. jejuni 81-176 (J+/A+) (n=50). Despues de la exposicion en el periodo adulto, la eliminacion de C. jejuni a partir del cultivo de las heces, se logro a los 30 dfas. Las ratas se sacrificaron mediante eutanasia 90 dfas despues de la eliminacion de C. jejuni para garantizar que fueran realmente posinfecciosas como se informo anteriormente. Durante la diseccion, las secciones de duodeno, yeyuno e fleon se fijaron con formalina y se resecaron por histologfa y la cuantificacion bacteriana luminal se realizo mediante qPCR como se informo
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anteriormente. En el momento de la eutanasia, se uso puncion intracardiaca para recolectar sangre y el suero se separo y almaceno.
Ejemplo 7
Metodologfa del ELISA
Los antigenos (CdtB completa o vinculina (Novo, Short Hills, NJ)) se unieron a placas de 96 pocillos bajo condiciones de humedad durante toda la noche a 4°C mediante el uso de 100 pL/pocillo a 0.125 pg/mL de protema en BBS (Pierce). Los pocillos se lavaron con PBS-T 0.05 % y se bloquearon con BSA al 0.5 % en PBS, 120 pL/pocillo, durante 1 hora a temperatura ambiente en camara humeda. Se anadieron las muestras (suero de rata, suero humano) as^ como tambien los controles: wAB, Ac vinculina (Santa Cruz, Santa Cruz, CA) a una dilucion 1:100 en BSA/PBS al 0.5 % durante 2 horas a temperatura ambiente en camara humeda. Se anadieron 100 pL/pocillo del anticuerpo secundario, IgG humana, de rata o de cabra conjugado con HRP (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), a una dilucion de 1:1000 en BSA/PBS 0.5 % durante 30 minutos a temperatura ambiente en camara humeda. Las placas se lavaron con PBS-T 0.05 % antes de anadir 100 pL/pocillo de la solucion de sustrato (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) y se leyeron en un lector de placas despues de la aplicacion de suero de rata o humano como se indica mas abajo (BioTek Synergy HT)
Ejemplo 8
ELISA en ratas con y sin infeccion por Campylobacter y sobrecrecimiento,
Se analizo el suero de cada uno de los 3 grupos de ratas: no infectado, exposicion unica a campilobacter como adulto, y doble infeccion, juvenil y como adultos. Se compararon las OD resultantes entre los 3 grupos, asf como tambien las ratas segregadas con y sin sobrecrecimiento bacteriano en el intestino delgado (definidas como >2 SD sobre la media), como se publico previamente. Finalmente, se creo una curva de correlacion que compara el nivel de anticuerpos en suero con el grado de bacterias en el Aeon.
Ejemplo 9
ELISA en humanos con IBS
Se usaron tres grupos de humanos para evaluar el tftulo de los anticuerpos anti-CdtB y anti-vinculina. El primer grupo fue un grupo de controles sanos. Los sujetos controles sanos se definieron como sujetos, que segun el cuestionario, no informaron alteracion de la funcion intestinal, ni hinchazon ni dolor abdominal (cada uno menos de 10 mm en una escala VAS de 100 mm para el smtoma espedfico). El segundo grupo fue un grupo de sujetos de IBS con diarrea predominante, segun los criterios de Roma III. El tercer grupo estuvo compuesto por 10 sujetos con la enfermedad de Crohn y 10 sujetos con colitis ulcerativa. El ELISA se establecio de manera similar al estudio de ratas. Los tttulos de los anticuerpos anti-CdtB y anti-vinculina se compararon entre los 3 grupos. Ademas, se realizo una correlacion entre anti- CdtB y anti-vinculina. Finalmente, en el ELISA se usaron dos protemas no relacionadas, c-kit y latrofilina, para determinar el control de union no espedfica en humanos con IBS.
Ejemplo 10
Inmunofluorescencia, Imagenes confocales de anticuerpos anti-cdtB, marcadores neurales y vinculina
Dado que habfa evidencia por inmunohistoqmmica de la union neuronal por wAb, particularmente en las regiones periganglionar y en las celulas intersticiales del plexo muscular profundo de Cajal (DMP-ICC), se realizaron experimentos de colocalizacion para comparar la localizacion de wAb con respecto a anti-c-kit (R&D Systems, Minneapolis, MN), S-100 (neuronal) (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) y PGP 9.5 (ganglio) (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) y anti-vinculina (Santa Cruz, Santa Cruz, CA) todos generados en cabra. Para la comparacion se tomaron imagenes microscopicas confocales de secciones contiguas de fleon de ratas y humanos.
Brevemente, las secciones de fleon de ratas infectadas de manera aguda y no infectadas por C. Jejuni se desparafinaron y se lavaron secuencialmente en xilenos y etanol antes de recuperar el antfgeno y de bloquear con suero. Se anadieron los anticuerpos primarios (1:200 wAb generados en conejo mas los anticuerpos c-kit, S100, PGP 9.5, o vinculina generados en cabras a una dilucion de 1:100) y se incubaron a temperatura ambiente en condiciones de humedad. Las secciones tratados con anticuerpos primarios se lavaron en PBS y se incubaron con DAPI 1:30 (Invitrogen, Grand Island, NY) y anticuerpos secundarios: Alexa rojo 568 anti-cabra (Invitrogen, Grand Island, NY) para los anticuerpos c-kit, S100, pGp 9.5 o vinculina (1:300) y Alexa verde 488 anti-conejo (Invitrogen, Grand Island, NY) para wAB (1:300). Despues de la incubacion en condiciones oscuras y humedas, se agrego Prolong Gold (Invitrogen, Grand Island, NY) y la seccion se cubrio con cubre objeto de vidrio para su visualizacion bajo Microscopio Confocal (microscopio Leica TCS SP5 X, escaner digital de portaobjetos Leica SCN400 F).
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Expresion genica de vinculina en ratas con y sin SIBO
Se extrajo ARN de tejido del Aeon de ratas (Qiagen) a partir de 3 meses despues de la infeccion por C. jejuni y del control de animales no infectados y se convirtio en cDNA mediante transcripcion inversa iScript (Bio Rad, Hercules, CA). Se realizo el PCR cuantitativo con cebadores espedficos para vinculina de rata y se normalizo respecto a expresion del gen de beta actina.
Cebadores
beta actina1
FW: GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA (sec. con num. de ident.:2) Amp: 150bp
REV: GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG (sec. con num. de ident.:3)
Vinculina 2
FW: GCCAAGCAGTGCACAGATAA (sec. con num. de ident.:4) Amp: 273bp
REV: TCTTTCTAACCCAGCGCAGT (sec. con num. de ident.:5)
1 Referencia: Qian-Qian Liang y otros, (2010) Herb Formula "Fufangqishe-Pill" Prevents Upright Posture- Induced Intervertebral Disc Degeneration at the Lumbar in Rats. J PharmacolSci 113: 23-31) 2 Referencia: Zhang y otros, Proteome Science 2010 8:12 (doi:10.1186/1477-5956-8-12)
Ejemplo 12 Analisis estadfstico
La comparacion de los niveles de anti-CdtB y anti-vinculina entre los grupos se realizo mediante la prueba no parametrica U de Mann-Whitney. Las curvas de correlacion entre los recuentos de bacterias y los tttulos de anticuerpos se compararon mediante la correlacion de Pearson. La correlacion de Pearson se uso, ademas, para comparar anti- CdtB y anti-vinculina en humanos. Para la determinacion de un ELISA positivo y negativo se realizo Chi-cuadrado. Para la comparacion de ELISA con respecto a los recuentos de colonias de la flora del intestino delgado, se uso una correlacion por rangos de Pearson. Finalmente, los umbrales para anti-CdtB (>2.0 OD) y anti-vinculina (>1.2 OD) como un metodo de diagnostico de IBS comparo a los controles y a los sujetos con enfermedad inflamatoria intestinal. Las caractensticas de la prueba, tales como la sensibilidad y la especificidad, se determinaron en base a estos umbrales. Se determino que las diferencias entre los grupos eran significativas si P<0.05, y los datos se expresaron como la media ± SD.
Ejemplo 13 Resultados
En el estudio participaron 19 controles sanos, 20 sujetos con IBD y 42 sujetos con IBS. Los datos demograficos fueron similares entre los grupos. Para la deteccion de anti-cdtB, se establecio como positiva una densidad optica de >2.0 y para la deteccion de anticuerpos anti-vinculina humana se establecio una OD de >1.2. Basado en estos puntos de corte, mediante el uso de anti-vinculina o anti-cdtB, el diagnostico diferencial de IBS respecto a la IBD o a los controles sanos fue exitoso (Tabla 1a). Como el anti-cdtB es anti-vinculina, se esperana que los tftulos de anti-cdtB en suero en todos los sujetos correspondenan a anti-vinculina humana, y esto se encontro que era cierto (R = 0.58, P<0,001).
Tabla 1a
IBS versus todos los grupos IBS versus Sanos IBS versus IBD
Sensibilidad Especificidad Sensibilidad Especificidad Sensibilidad Especificidad
Anti vinculina
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Validacion de los anticuerpos Anti CdtB
Para validar los anticuerpos anti-CdtB, se prepararon transferencias Western con CdtB purificado. Mediante el uso de ambos anticuerpos generados para CdtB completa (wAb) (figura 1a) y el anticuerpo generado para la secuencia de 18 residuos altamente antigenica de CdtB (haAb) (figura 1b) ambos reconocieron el CdtB como una banda activa a la altura de 27kDa (el peso molecular de CdtB). El suero de conejo preinmune no reconoce a CdtB y cuando se bloqueo el haAb con el peptido no resulto en una banda visible (figura 1c).
Para validar que el anticuerpo reconocio CdtB en C. jejuni, se preparo otra transferencia western y se corrio con un lisado de C. jejuni 81-176. Esto demostro que wAb (figura 2a) y haAb (figura 2b) reconocieron el CdtB como una banda activa a la altura de 27 kDa (el peso molecular de CdtB). El bloqueo del haAb con el peptido elimino la deteccion de una banda a la altura de 27 kDa (figura 2c).
Ejemplo 15
wAb en ratas expuestas y no expuestas a C. jejuni
En este estudio se compararon dos grupos de ratas mediante el uso de la tincion inmunoespedfica. En las figuras 3a y b, se examina el fleon de rata 2 dfas despues de la administracion, mediante sonda oral, de C. jejuni 81-176 vivos. El suero preinmune no produjo tincion. Las ratas expuestas a C. jejuni 81-176 con infeccion activa demostraron una tincion extensa para el wAb, que incluye la superficie mucosal y las criptas. Los componentes profundos de los tejidos mas identificados fueron los ganglios mientericos, las celulas intersticiales de Cajal y otras estructuras neurales. Una localizacion identica se observo con la tecnica de inmunofluorescencia (figuras 4a y b). Sin embargo, el mismo patron se observo tanto con inmunohistoqmmica (figuras 5a y b) e inmunofluorescencia (figuras 6a y b) para las ratas que nunca se expusieron a C. jejuni. Esto sugiere que el anticuerpo para CdtB reacciona de manera cruzada con una protema natural de rata, localizada de manera mas prominente en el area de los elementos neurales del intestino, lo que sugiere mimetismo molecular.
Ejemplo 16
Localizacion inmunohistoqmmica de anti-CdtB en fleon humano
Mediante el uso del tejido del fleon humano de grosor total para la inmunohistoqmmica, nuevamente el wAb aparece localizado en los elementos neurales del plexo mienterico (figuras 7a y b). Como estos sujetos no eran sujetos con IBS, se asumio que el anticuerpo contra CdtB se une a una protema natural.
Ejemplo 17
Colocalizacion de anti-CdtB con otros marcadores neuronales.
Para demostrar la especificidad para el mimetismo de los componentes del sistema nervioso enterico, 3 anticuerpos marcadores (S-100 para las neuronas entericas, PGP 9.5 para ganglios y anti-c-kit para ICC) se compararon con el anticuerpo wAb anti-CdtB. A partir de los estudios en todos los grupos de ratas, que incluyen las ratas control, el anti- CdtB se colocalizo tanto en ICC (con c-kit) (figuras 8a-c), como en neuronas (con S-100) (figuras 9a-c). Aunque se colocalizaron, la tincion para c-kit es una tincion de membrana celular y S-100 una tincion nuclear. El anti-CdtBwAb aparece localizado en los componentes citosolicos de las celulas neuronales entericas (ambas, ICC y neuronas).
Ejemplo 18
Validacion del mimetismo molecular en humanos
Para evaluar el potencial del anti-CdtBwAb para demostrar el mimetismo molecular en el intestino delgado humano, se montaron y tineron secciones de grosor completo del fleon de muestras de hemicolectoirna derecha como anteriormente, en las ratas. Similar a las ratas, se observo la colocalizacion con c-kit, S-100 (figuras 10a-c) y PGP 9.5 (figuras 11a-c).
Ejemplo 19
Mimetismo molecular hacia una protema citosolica de neuronas entericas
Mediante el uso de lisados de celulas madres de neuronas entericas, los anticuerpos wAb anti-CdtB demostraron una banda a la altura de 117kDa (figura 12 a y c). Mediante el fraccionamiento de los lisados, la banda de 117 kDa se localizo en la fraccion citosolica del lisado (figura 12a). En los experimentos de bloqueo que usan el CdtB completo para bloquear el anticuerpo, se bloquea la union a esta protema de 117 kDa (figura 12a). La espectroscopfa de masas
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identifico la protema candidata en esta banda como la vinculina. En el tejido humano, la microscopfa confocal demuestra la colocalizacion de vinculina y wAb (figuras 13a-c).
Ejemplo 20
Demostracion de anti-CdtB in vivo en el modelo de IBS en ratas
Para demostrar el papel de los anticuerpos contra CdtB en el fenotipo del IBS posinfeccioso, se desarrollo un ELISA mediante el uso de anti-CdtB C. jejuni. En este estudio, ratas controles, ratas con una exposicion unica a C. jejuni y ratas con dos exposiciones a C. jejuni, con intervalo de 2 meses, se evaluaron y se compararon con respecto al resultado del sobrecrecimiento bacteriano en el intestino delgado, mediante el PCR de la flora enterica del intestino delgado. En la figura 14, es evidente que el anti-CdtB no solo depende de la infeccion previa con C. jejuni, sino ademas, del desarrollo de sobrecrecimiento bacteriano en el intestino delgado. Entre las ratas que recibieron C. jejuni, aquellas con sobrecrecimiento bacteriano tuvieron tttulos mas altos de anti-CdtB que aquellas sin sobrecrecimiento bacteriano, independientemente del numero de infecciones con C. jejuni. Esto se demuestra, ademas, por la correlacion significativa entre el anti-CdtB circulante y el mayor grado de sobrecrecimiento bacteriano en el intestino delgado basado en qPCR de bacterias totales (figura l5).
Ejemplo 21
Demostracion de anti-CdtB y anti-vinculina en humanos con IBS posinfeccioso
En este experimento final, se recolecto suero de 43 humanos con IBS, 20 sujetos sanos y 20 sujetos con enfermedad inflamatoria intestinal (10 sujetos con enfermedad de Crohn y 10 sujetos con colitis ulcerativa). Mediante el uso de los valores absolutos, los sujetos con IBS teman el mayor titulo de anticuerpos anti-CdtB en comparacion con la IBD o con los controles (figura 16). Mediante la referencia de una OD>2 como un diagnostico del IBS y del IBS posinfeccioso, este umbral fue capaz de identificar el IBS con una sensibilidad del 85.7 % y una especificidad del 67.2 % en comparacion con la enfermedad inflamatoria intestinal (Tabla 1b).
Tabla 1b. Prueba dinamica de anti-CdtB para el diagnostico del IBS
ELISA Positivo
Si No
IBS versus IBD
IBS 18 20
IBD
3 17
Caractensticas de la prueba
Sensibilidad 85.7 %
Especificidad
67.2 %
Mediante el uso de la vinculina como el sustrato del ELISA, la aplicacion del suero preinmune en los pocillos produjo una respuesta muy baja. Sin embargo, la aplicacion dewAb en los pocillos produjo una respuesta vigorosa. Esto sugiere que el anti-CdtAb reacciona fuertemente con la vinculina en el ELISA (figura 17). Cuando las pruebas de ELISA para vinculina se llevaron a cabo mediante el uso del suero de los tres grupos humanos, nuevamente hubo tftulos significativamente mas altos de anti-vinculina en sujetos con IBS.
Finalmente, el ELISA que usa latrofilina o c-kit no demostro ninguna diferencia entre IBS, controles y sujetos con enfermedad inflamatoria intestinal, lo que sugiere que las diferencias no se debieron a una union inespedfica (datos no mostrados).
Ejemplo 22
Los anticuerpos circulantes contra a la toxina de distencion citoletal B se correlacionan con el desarrollo de sobrecrecimiento bacteriano en el intestino delgado en un modelo de IBS posinfeccioso en ratas.
El nivel de anticuerpos anti-CdtB en suero en el modelo de IBS posinfeccioso en ratas se examino y se correlaciono con el desarrollo de SIBO.
Metodos: Se obtuvieron ratas macho Sprague-Dawley (n = 100) como bebes y se asignaron al azar a tres grupos. El primer grupo se le administro, mediante sonda oral, C. jejuni 81-176 (108 cfu/mL) en el penodo juvenil y dos meses mas tarde como adultos (J+/A+). Al segundo grupo se le administro, mediante sonda oral, C. jejuni solamente como adultos (J-/A+). El tercer grupo no se expuso nunca a C. jejuni (controles). Tres meses despues de la infeccion en el penodo adulto todas las ratas se sacrificaron mediante eutanasia. Despues de la eutanasia, se ligaron los segmentos de Aeon, yeyuno y duodeno y se eliminaron como se describio previamente (Chatterjee, y otros). Para cada segmento intestinal, se extrajo el DNA del contenido luminal y se uso el qPCR mediante el uso de los cebadores bacterianos universales
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para determinar la presencia o ausencia de SIBO. SIBO se define como recuentos bacterianos por encima de 2 desviaciones estandar sobre la media de los controles para cada segmento. Durante la eutanasia, se tomo sangre y se aislo el suero. Se recubrio una placa de 96 pocillos con CdtB a la que se anadio suero de rata y se incubo durante 90 minutos. Los pocillos se lavaron e incubaron con un anticuerpo secundario fluorescente y se leyeron en un lector de placas.
Resultados: El ELISA para la deteccion de anti-CdtB en el suero de las ratas controles demostro una densidad optica (OD) de 1.27±0.15. Todas las ratas expuestas a C. jejuni tuvieron una OD mayor que 1.73±0.12 (P<0.05). En el grupo J- /A+, la unica exposicion a C. jejuni resulto en SIBO en el 26 % de las ratas. En el grupo J+/A+ de ratas con doble exposicion, se observo SIBO en el 46 % (P<0.05). Los tttulos anti-CdtB fueron mayores si las ratas teman SIBO, independientemente de que ellas hubiesen tenido una exposicion unica (1.79±0.31) o doble (2.02±0.22) a C. jejuni. Las ratas que no teman SIBO tuvieron tftulos <1.7. El grafico que relaciona el nivel de bacterias en el fleon contra los resultados del ELISA demostro una correlacion entre los niveles de bacteria y los anti-CdtB (R=0.3, P<0.05).
Conclusiones: Los anticuerpos contra CdtB se desarrollan despues de la exposicion a C. jejuni pero parecen desarrollarse en un patron que se relaciona mas con el desarrollo de SIBO que con el numero de exposiciones a C. jejuni. En base a la afinidad por la ICC y los ganglios, los inventores creen que estos anticuerpos son importantes para la fisiopatologfa del IBS quizas porque afectan la funcion motora del intestino que conduce a SIBO.
Ejemplo 23
Los anticuerpos contra la toxina de distencion citoletal B y los autoanticuerpos contra la vinculina humana estan aumentados en los sujetos con IBS.
En un modelo animal de IBS posinfeccioso, los anticuerpos contra CdtB se unen a los elementos neurologicos en la pared intestinal, que incluye las celulas intersticiales de Cajal (ICC) y los ganglios, a traves de un proceso de mimetismo molecular/autoinmunidad. La protema sobre estos nervios a la cual se produce este mimetismo se descubrio que era la vinculina, y en las ratas los anticuerpos contra vinculina predicen SIBO. Los inventores extrapolan estas pruebas de anticuerpos a humanos para determinar los tftulos de anticuerpos anti-CdtB y anti-vinculina en el suero de sujetos con IBS y enfermedad inflamatoria del intestino (IBD).
Metodos: Los sujetos consecutivos del IBS que cumplfan los criterios de Roma III se reclutaron en una clmica de Motilidad GI (n=45). Ademas, se reclutaron 30 sujetos con IBD de una clmica de atencion terciaria para IBD. Finalmente, se identificaron 20 controles sanos basados en un cuestionario de smtomas negativos. Todos los sujetos dieron su consentimiento y se obtuvieron muestras de suero. Se realizo un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) mediante el recubrimiento de placas de 96 pocillos tanto con 0.4 |jg de vinculina recombinante, o con CdtB purificada a
0.4 jg/mL por pocillo. El suero de cada sujeto se anadio a los pocillos y se incubo durante 90 minutos. Los pocillos se lavaron y luego se anadieron los anticuerpos secundarios a cada pocillo. Las medidas de densidad optica (OD) se determinaron mediante el uso de un lector de placas.
Resultados: En placas recubiertas con CdtB, la OD media para el suero del IBS fue 1.89±0.12. Esto fue significativamente mayor con respecto a los sujetos con IBD (1.35±0.22) (P<0,05) o los controles sanos (1.46±0.20) (P<0.05). En las placas recubiertas con vinculina, la OD media para el suero del IBS fue de 0.53±0.07. Esto fue significativamente mayor con respecto a los sujetos con IBD (0.2l±0.09) (P<0.05). Hubo una tendencia hacia una diferencia con respecto a los controles sanos (0.31±0.10) (P= 0.11). No hubo diferencias entre IBS-C o IBS-D para ambos anticuerpos.
Conclusiones: Ambos anticuerpos, los anti-CdtB y los anticuerpos autoinmunes anti-vinculina, se detectan en sujetos con IBS y se consideran elevados en IBS en comparacion con los controles y la IBD. La deteccion de anti-CdtB y anti- vinculina sugiere indicios nuevos para el diagnostico y la fisiopatologfa del IBS. Este es el primer estudio que relaciona la gastroenteritis aguda con un proceso autoinmune en el IBS.
Ejemplo 24
El mimetismo molecular conduce a la autoinmunidad contra la vinculina en humanos: el eslabon perdido en la fisiopatologfa del IBS
Los inventores investigan el antfgeno humano al que se une el anti-CdtB.
Metodos: Primeramente, se obtuvo tejido del fleon de grosor completo a partir de humanos que no padecen del IBS (a partir de hemicolectoirna derecha). Las secciones del fleon se incubaron con anticuerpos purificados de conejo para CdtB, se lavaron e incubaron con anticuerpos secundarios fluorescentes. Los estudios de colocalizacion se realizaron con anti-c-kit (espedfico para ICC), S-100 (espedfico para neuronas) y PGP 9.5 (espedfico para ganglios). A continuacion, se realizo la inmunoprecipitacion mediante la generacion de una columna con anti-CdtB a traves de la cual se paso un lisado de celulas neuronales entericas humanas (Emory University). La protema adherente al anti-CdtB se eluyo y se realizaron dos transferencias Western. Una se incubo con anti-CdtB y la otra con anti-CdtB preincubado con
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la protema CdtB (peptido de bloqueo). Se identifico una banda a la altura de 117 kDa, que se purifico y se identifico mediante espectroscop^a de masa como vinculina humana. Con una alrouota de 0.4 ug de vinculina comercial se recubrio cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Se anadio anti-CdtB a una serie de pocillos y en otra serie de pocillos se combino anti-CdtB con protema CdtB completa (peptido bloqueante).
Resultados: Mediante el uso del tejido del fleon humano de grosor completo, el anti-CdtB fue espedfico para ICC y ganglios. Esto se baso en la colocalizacion de anti-CdtB con anti-c-kit, PGP 9.5 y S-100 (ver figura). Por tanto, parece que el anti-CdtB se relaciona con una protema humana en ICC y ganglios. En base a la inmunoprecipitacion, se identifico una banda de protema a la altura de 117 kDa. Mediante el uso de espectroscopfa de masas, esta protema se identifico como vinculina humana. Posteriormente, la vinculina humana se obtuvo comercialmente y mediante ELISA, se demostro que el anti-CdtB terna una alta afinidad por la vinculina humana, pero no por el peptido de control. La union a vinculina se bloqueo por el peptido CdtB.
Conclusiones: En la fisiopatologfa del IBS posinfeccioso, los sujetos desarrollan anticuerpos contra CdtB que tienen reactividad cruzada, a traves del mimetismo molecular, con la vinculina, una protema del citoesqueleto de la membrana celular que es importante en la migracion y en la adherencia de las celulas neurales. Dada nuestra informacion emergente acerca de niveles reducidos de vinculina en ratas posinfecciosas, el mimetismo molecular a vinculina puede ser importante para la causa de SIBO y del IBS a traves de los efectos sobre las ICC y los ganglios.
Ejemplo 25
La expresion de vinculina se reduce en un modelo animal del IBS posinfeccioso Los inventores evaluan la expresion de vinculina en el modelo de rata posinfecciosa.
Metodos: Las ratas Sprague Dawley se dividieron en 3 grupos. Las ratas del grupo 1 sirvieron como controles (n=20). A las ratas del grupo 2 se les administro, mediante sonda oral, 108cfu/mL C. jejuni en el penodo adulto (J-/A+). A las ratas del grupo 3 se les administro, mediante sonda oral, C. jejuni en el penodo juvenil y despues nuevamente 2 meses mas tarde, una segunda vez como adultos. Las ratas infectadas, se sacrificaron mediante eutanasia 3 meses despues de la eliminacion de C. jejuni. En el momento de la eutanasia, las secciones del intestino delgado (duodeno, yeyuno e Aeon) se ligaron y los contenidos bacterianos totales se cuantificaron por qPCR como se describio previamente. Ademas, se obtuvo un segmento de intestino medio y se conservo en la solucion ARN later. Despues de la homogenizacion, la extraccion de RNA y la conversion a cDNA, se uso el qPCR para determinar el nivel de vinculina en la pared intestinal despues de normalizar con respecto a la p-actina. El nivel de vinculina se evaluo en base al numero de infecciones por C. jejuni y la presencia o ausencia de SIBO en este modelo animal.
Resultados: En base a los niveles bacterianos normales en los segmentos del intestino delgado de sujetos normales, se identifico SIBO en 26 % y 46 % de las ratas con exposicion simple y doble a C. jejuni. En general, la expresion de vinculina se redujo en el intestino delgado de las ratas expuestas a C. jejuni (0.058±0.0053) en comparacion con las ratas controles (0.087±0.0053) (P<0.001). Ademas, hubo una mayor reduccion de vinculina con dos exposiciones a C. jejuni en comparacion con una sola exposicion (ver figura) (P<0.0001). Ademas, hubo una tendencia a disminuir la expresion de vinculina en ratas con SIBO (P=0.05).
Conclusiones: La expresion de vinculina se reduce por la exposicion a C. jejuni. Esta reduccion depende del numero de exposiciones a C. jejuni, con una mayor reduccion en las ratas que se expusieron dos veces a C. jejuni. Finalmente, el SIBO se asocia con un nivel mas bajo de expresion de vinculina. La vinculina puede ser importante en la patogenesis del IBS posinfeccioso.
Ejemplo 26
En los Centros Medicos Cedars-Sinai y Beth Israel Deaconess se reclutaron sujetos (18-65 anos) con IBS positivo segun criterios de Roma. Los sujetos se evaluaron por smtomas y caractensticas demograficas, y posteriormente se les recolectaron los sueros. Los sujetos se excluyeron si ternan enfermedad GI concomitante, cirugfa GI previa, adherencias, enfermedad tiroidea inestable, diabetes o HIV. Se reclutaron controles sanos basados en la conclusion de un cuestionario de smtomas GI. En este cuestionario, los sujetos ternan que tener <10 marcas para hinchazon, diarrea, dolor abdominal y estrenimiento inclusive sobre un VAS de 0-100. Los sujetos con enfermedad inflamatoria intestinal se reclutaron en un centro medico experto de atencion terciaria. Se excluyeron los sujetos con enfermedad de Crohn o colitis ulcerativa si existfan antecedentes de terapia biologica y el uso actual de prednisona. Para realizar el ELISA y determinar los anticuerpos contra vinculina recombinante humana se usaron los sueros de los 3 grupos.
En total se evaluaron 165 sujetos con IBS, 30 sujetos con IBD y 26 sujetos controles sanos. Los datos demograficos fueron similares entre los grupos. En general, el grupo IBS tuvo una densidad optica significativamente mayor en el ELISA para los anticuerpos anti-vinculina en comparacion con los sujetos IBD y los sujetos sanos. (Figura 19) Mediante la comparacion de los dos centros principales que reclutaron pacientes con IBS, los resultados de ambos centros fueron igualmente anormales (P=NS). Curiosamente, en los sujetos con antecedentes de gastroenteritis aguda, incluso se observaron niveles de anticuerpos mas altos (P<0.05).
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Los anticuerpos anti-vinculina son elevados en el IBS en comparacion con los que no tienen IBS. Esta es la primera prueba diagnostica para el IBS basada en el suero y en un mecanismo fisiopatologico del IBS mediante la gastroenteritis aguda desencadenado por el mimetismo molecular y la autoinmunidad.
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Diversas modalidades de la invencion se describen anteriormente en la Descripcion Detallada. Aunque estas descripciones describen directamente las modalidades anteriores, se entiende que los expertos en la tecnica pueden concebir modificaciones y/o variaciones a las modalidades espedficas mostradas y descritas en la presente descripcion. Cualquiera de tales modificaciones o variaciones que caen dentro del alcance de esta descripcion se incluyen tambien de esta manera. A menos que se indique espedficamente, es la intencion de los inventores que se les confiera a las palabras y frases en la descripcion y reivindicaciones los significados usuales y ordinarios para los expertos en las aplicaciones de la tecnica(s).
La descripcion anterior de diversas modalidades de la invencion conocida para el solicitante al momento de presentar la solicitud se presentan con propositos de ilustracion y descripcion. La presente descripcion no pretende ser exhaustiva ni limitar la invencion en la forma precisa publicada y son posibles muchas modificaciones y variaciones a la luz de las ensenanzas anteriores. Las modalidades descritas sirven para explicar los principios de la invencion y su aplicacion practica y para capacitar a otros con experiencia en la tecnica para utilizar la invencion en diversas modalidades y con varias modificaciones como se ajusta al uso particular contemplado. Por tanto, es la intencion que la invencion no se limite a las modalidades particulares descritas para llevar a cabo la invencion.
Se entendera por aquellos dentro del estado de la tecnica que, en general, los terminos usados en la presente descripcion deben entenderse generalmente como terminos "abiertos" (por ejemplo, el termino "que incluye" debe
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interpretarse como "que incluye pero no se limita a", el termino "que tiene" debe interpretarse como "que tiene al menos", el termino "incluye" debe interpretarse como "incluye pero no se limita a", etc.).
Listado de Secuencias
<110> CENTRO MEDICO CEDARS-SINAI PIMENTEL, Mark CHANG, Christopher
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<160>6
<170>PatentIn version 3.5
<210> 1 <211> 1066 <212> PRT <213> Homo sapiens
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Claims (11)

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    Reivindicaciones
    1. Un metodo, que comprende:
    proporcionar una muestra biologica de un sujeto que requiere el diagnostico de un trastorno de la motilidad gastrointestinal, trastorno de la motilidad de la vejiga o fibromialgia;
    detectar en la muestra biologica, una presencia o un nivel de un anticuerpo anti-vinculina; y determinar una presencia o probable presencia del smdrome de intestino irritable (IBS) si se detecta la presencia del anticuerpo anti-vinculina, si el nivel del anticuerpo anti-vinculina es mas alto que un nivel del control establecido, o si el nivel del anticuerpo anti-vinculina es significativamente mas alto que un nivel del control establecido, o
    determinar una ausencia o probable ausencia del smdrome de intestino irritable (IBS) si se detecta una ausencia del anticuerpo anti-vinculina, si el nivel del anticuerpo anti-vinculina es igual o inferior al nivel del control establecido, o si el nivel del anticuerpo anti-vinculina no es significativamente mas alto que un nivel del control establecido.
  2. 2. El metodo de conformidad con la reivindicacion 1, que comprende, ademas, seleccionar una terapia para el smdrome del intestino irritable (IBS) si se determina la presencia o probable presencia del smdrome de intestino irritable (IBS).
  3. 3. Un metodo, que comprende:
    proporcionar una muestra biologica de un sujeto que requiere el diagnostico de un trastorno de la motilidad gastrointestinal, trastorno de la motilidad de la vejiga o fibromialgia;
    detectar en la muestra biologica, una presencia o un nivel de un anticuerpo anti-vinculina; y determinar una presencia o probable presencia del smdrome de intestino irritable (IBS) si se detecta la presencia del anticuerpo anti-vinculina, si el nivel del anticuerpo anti-vinculina es mas alto que un nivel del control establecido, o si el nivel del anticuerpo anti-vinculina es significativamente mas alto que un nivel del control establecido, o
    determinar una presencia o probable presencia de la enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) si se detecta una ausencia del anticuerpo anti-vinculina, si el nivel del anticuerpo anti-vinculina es igual o inferior al nivel del control establecido, o si el nivel del anticuerpo anti-vinculina no es significativamente mas alto que un nivel del control establecido.
  4. 4. El metodo de conformidad con la reivindicacion 3, que comprende, ademas, seleccionar una terapia para el IBS si se diagnostica el IBS, o seleccionar una terapia para la IBD si se diagnostica la IBD.
  5. 5. El metodo de conformidad con la reivindicacion 2 o con la reivindicacion 4, en donde la terapia es un curso de terapia antibiotica; un agente neutralizante de anticuerpo anti-vinculina o un agente inhibidor de anticuerpo anti- vinculina; o un agente para cambiar la vinculina de un estado inactivo a un estado activo.
  6. 6. El metodo de conformidad con la reivindicacion 2 y la reivindicacion 4, en donde la terapia comprende un agonista de vinculina.
  7. 7. El metodo de conformidad con la reivindicacion 6, en donde el agonista de vinculina es un peptido activador de vinculina.
  8. 8. El metodo de conformidad con la reivindicacion 2 o con la reivindicacion 4, en donde la terapia comprende un activador de vinculina.
  9. 9. El metodo de conformidad con la reivindicacion 8, en donde el activador de vinculina es talina, f-actina, a- catenina o una combinacion de estas.
  10. 10. El metodo de conformidad con cualquier reivindicacion precedente, en donde el anticuerpo anti-vinculina se detecta mediante el uso de vinculina, sec. con num. de ident. 1 o un fragmento de esta como sustrato o reactivo para unir el anticuerpo anti-vinculina.
  11. 11. El metodo de conformidad con la reivindicacion 10, en donde el anticuerpo anti-vinculina se detecta mediante el uso de un ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzima (ELISA).
    co
    GO
    haAb +
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    CdlB-*
    20
    imagen1
    wAb
    haPeptido
    haAb
    haAb +
    haPeptido
    wAh haAb
    imagen2
    Figura 2
    haAb + haPeptido
    wAb haAb
    imagen3
    haAb + haPeptido
    wAb haAb
    imagen4
    30
    CdtB^
    imagen5
    Suero
    preinmune
    CO
    CD
    imagen6
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    Figura 5
    imagen8
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    Suero
    co
    CD
    preinmune
    wAb
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    Figura 13
    Vinculina
    Vinculina + wAb
    imagen16
    Figura 14
    imagen17
    o
    o
    o
    O cs D Q Q
    o to V W q
    tvi Cvi T~ r* T"
    Densidad Optica (D.O)
    Baja Bacteria Baja Bacteria Alta Bacteria Alta Bacteria
    Figura 15
    imagen18
    HI
    LU
    UJ
    Bacterias en Neon
    Densidad optica (D.O)
    Figura 16
    imagen19
    imagen20
    imagen21
    O
    o Q a o a o
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    O a CM o
    oi
    <N n t- T- ¥- T-
    Densidad optica (D.O.)
    p<005 ulcerativa Crohn
    Figura 17
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    P<0.05
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