KR102203568B1

KR102203568B1 - 장 및 방광의 운동 장애 및 섬유근육통의 진단 및 치료

Info

Publication number: KR102203568B1
Application number: KR1020157009889A
Authority: KR
Inventors: 마크 피멘텔; 크리스토퍼 창
Original assignee: 세다르스-신나이 메디칼 센터
Priority date: 2012-09-17
Filing date: 2013-08-19
Publication date: 2021-01-15
Also published as: DK2895856T3; AU2013315981B2; CA2884413C; US20180364255A1; EP2895856A2; WO2014042828A2; EP2895856A4; CA2884413A1; ES2646598T3; EP2895856B1; US9702884B2; US20150233944A1; KR20150058404A; MX2021003764A; HK1207420A1; WO2014042828A3; US10466254B2; US20200271665A1; US20180088130A1; AU2013315981A1

Abstract

위장 운동 장애, 방광 운동 장애 또는 섬유근육통의 존재 또는 존재 가능성을 결정하기 위한, 항-빈쿨린 항체의 검출을 위한 방법 및 시스템이 본원에 기재된다. 항-빈쿨린 항체의 존재 또는 부재를 기초로 하여 요법을 선택하고/거나 투여하는 방법이 추가로 제공된다.

Description

장 및 방광의 운동 장애 및 섬유근육통의 진단 및 치료 {DIAGNOSIS AND TREATMENT OF MOTILITY DISORDERS OF THE GUT AND BLADDER, AND OF FIBROMYALGIA}

본원에서의 모든 공보는 각 개별 공보 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 나타내어진 경우와 동일한 정도로 참조로 포함된다. 하기의 기재는 본 발명을 이해하는데 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 이는 본원에 제공된 정보 중 임의의 것이 선행 기술이거나 현재 청구된 발명에 관련된 것이거나, 또는 구체적으로 또는 함축적으로 참조된 임의의 공보가 선행 기술이라는 것을 인정하는 것은 아니다.

과민성 장 증후군 (IBS)은 가장 통상적인 기능성 위장 장애이다. 종래에는 발병기전이 내장 통각과민에 초점을 맞추었지만 (1), IBS의 병리생리상태에 대한 최근 연구 포인트는 장 균총에서의 이상으로 인한 것이다. 이러한 가설은 2가지 다른 연구 영역에서 나타났다. 제1 장 균총 가설은 소장 박테리아 과도성장 (SIBO)이 IBS 및 그의 증상에 기여할 수 있다는 것이다. 최근 논문 (2)에서, 코흐(Koch)의 가정은 증거가 이 개념을 뒷받침한다고 시사한다. 이는 IBS를 치료하는데 있어서 항생제의 최근 III상 성공 (3) 및 근위 소장의 배양 연구에 의해 추가로 지지된다 (포세루드(Posserud) 및 필레리스(Pyleris) 연구). 다른 장 균총 가설은 위장염의 급성 에피소드 후에 IBS의 발생을 기초로 한다. 현재 급성 위장염을 나타내는 대상체의 대략 10%가 IBS를 장기간 발생시킬 것이라는 유사한 발견을 나타내는 2가지 메타-분석이 존재한다 (4, 5).

선행 기술의 많은 치료 방법은 증상의 완화에 초점을 맞춘다. 따라서, IBS를 진단하고 치료하는, 특히 IBS의 원인을 치료하는 추가의 방법, 뿐만 아니라 장 및 방광의 운동 장애를 치료하는 추가의 방법에 대한 필요성이 관련 기술분야에 존재한다.

하기 실시양태 및 그의 측면은 조성물 및 방법과 관련하여 기재되고 예시되며, 범위를 제한하는 것이 아리나 예시적이고 설명적인 것을 의미한다.

본 발명의 다양한 실시양태는 위장 운동 장애, 방광 운동 장애 또는 섬유근육통의 진단을 필요로 하는 대상체로부터의 생물학적 샘플을 제공하는 것; 생물학적 샘플에서 항-빈쿨린 항체의 존재 또는 수준을 검출하는 것; 및 항-빈쿨린 항체의 존재가 검출되는 경우, 항-빈쿨린 항체의 수준이 확립된 대조 수준보다 더 높은 경우, 또는 항-빈쿨린 항체의 수준이 확립된 대조 수준보다 유의하게 더 높은 경우에, 위장 운동 장애, 방광 운동 장애 또는 섬유근육통의 존재 또는 존재 가능성을 결정하는 것, 또는 항-빈쿨린 항체의 부재가 검출되는 경우, 항-빈쿨린 항체의 수준이 확립된 대조 수준과 동일하거나 그보다 더 낮은 경우, 또는 항-빈쿨린 항체의 수준이 확립된 대조 수준보다 유의하게 더 높지 않은 경우에, 위장 운동 장애, 방광 운동 장애 또는 섬유근육통의 부재 또는 부재 가능성을 결정하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

다양한 실시양태에서, 방법은 위장 운동 장애, 방광 운동 장애 또는 섬유근육통의 존재 또는 존재 가능성이 결정되는 경우에, 위장 운동 장애, 방광 운동 장애 또는 섬유근육통에 대한 요법을 선택하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

다양한 실시양태에서, 요법은 일련의 항생제 요법일 수 있다. 다양한 실시양태에서, 요법은 항-빈쿨린 항체 중화제 또는 항-빈쿨린 항체 억제제를 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 요법은 빈쿨린을 불활성 상태에서 활성 상태로 변경시키기 위한 작용제를 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 요법은 빈쿨린 효능제를 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 빈쿨린 효능제는 빈쿨린 활성화 펩티드일 수 있다. 다양한 실시양태에서, 요법은 빈쿨린 활성화제를 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 빈쿨린 활성화제는 탈린, f-액틴, a-카테닌 또는 이들의 조합일 수 있다.

다양한 실시양태에서, 방법은 요법을 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 다양한 실시양태는 위장 운동 장애, 방광 운동 장애 또는 섬유근육통의 진단을 필요로 하는 대상체로부터의 단리된 생물학적 샘플; 및 생물학적 샘플에서 항-빈쿨린 항체의 존재를 검출하기 위한 검정을 포함하는 시스템을 제공한다.

다양한 실시양태에서, 검정은 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA)이며, 여기서 ELISA는 항-빈쿨린 항체에 결합하기 위한 기질 또는 시약으로서 빈쿨린, 서열 1 또는 그의 단편을 사용하는 것을 포함한다.

본 발명의 다양한 실시양태는 위장 운동 장애, 방광 운동 장애 또는 섬유근육통의 진단을 필요로 하는 대상체로부터의 생물학적 샘플을 제공하는 것; 생물학적 샘플에서 항-빈쿨린 항체의 존재 또는 수준을 검출하는 것; 및 항-빈쿨린 항체의 존재가 검출되는 경우, 항-빈쿨린 항체의 수준이 확립된 대조 수준보다 더 높은 경우, 또는 항-빈쿨린 항체의 수준이 확립된 대조 수준보다 유의하게 더 높은 경우에, 과민성 장 증후군 (IBS)의 존재 또는 존재 가능성을 결정하는 것, 또는 항-빈쿨린 항체의 부재가 검출되는 경우, 항-빈쿨린 항체의 수준이 확립된 대조 수준과 동일하거나 그보다 더 낮은 경우, 또는 항-빈쿨린 항체의 수준이 확립된 대조 수준보다 유의하게 더 높지 않은 경우에, 염증성 장 질환 (IBD)의 존재 또는 존재 가능성을 결정하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

다양한 실시양태에서, 방법은 IBS가 진단되는 경우에 IBS 요법을 선택하는 것, 또는 IBD가 진단되는 경우에 IBD 요법을 선택하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서, IBS 요법은 일련의 항생제 요법일 수 있다. 다양한 실시양태에서, IBS 요법은 항-빈쿨린 항체 중화제 또는 항-빈쿨린 항체 억제제를 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서, IBS 요법은 빈쿨린을 불활성 상태에서 활성 상태로 변경시키기 위한 작용제를 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서, IBS 요법은 빈쿨린 효능제를 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 빈쿨린 효능제는 빈쿨린 활성화 펩티드일 수 있다. 다양한 실시양태에서, IBS 요법은 빈쿨린 활성화제를 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 빈쿨린 활성화제는 탈린, f-액틴, a-카테닌 또는 이들의 조합일 수 있다.

다양한 실시양태에서, 방법은 IBS 요법 또는 IBD 요법을 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 다양한 실시양태는 과민성 장 증후군 (IBS)과 염증성 장 질환 (IBD)을 구별하기 위한 진단을 필요로 하는 대상체로부터의 단리된 생물학적 샘플; 및 생물학적 샘플에서 항-빈쿨린 항체의 존재를 검출하기 위한 검정을 포함하는 시스템을 제공한다.

본 발명의 다양한 실시양태는 항-빈쿨린 항체 중화제, 항-빈쿨린 항체 억제제, 빈쿨린을 불활성 상태에서 활성 상태로 변경시킬 수 있는 작용제, 빈쿨린 효능제, 빈쿨린 활성화제 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 요법제를 제공하는 것; 및 상기 요법제를 위장 운동 장애, 방광 운동 장애 또는 섬유근육통의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하여 위장 운동 장애, 방광 운동 장애 또는 섬유근육통을 치료하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

다양한 실시양태에서, 빈쿨린 효능제는 빈쿨린 활성화 펩티드일 수 있다. 다양한 실시양태에서, 빈쿨린 활성화제는 탈린, f-액틴, a-카테닌 또는 이들의 조합일 수 있다.

예시적인 실시양태는 참조된 도면에 도시되어 있다. 본원에 개시된 실시양태 및 도면은 제한적이기보다는 예시적인 것으로 간주되어야 한다.
도 1은 본 발명의 다양한 실시양태에 따른 단백질 vs. 항체의 웨스턴 블롯을 도시한다.
도 2는 본 발명의 다양한 실시양태에 따른 씨. 용해물 vs. 항체의 웨스턴 블롯을 도시한다.
도 3은 본 발명의 다양한 실시양태에 따른 제2일 급성 래트로부터의 샘플의 면역조직화학을 도시한다.
도 4는 본 발명의 다양한 실시양태에 따른 제2일 급성 래트로부터의 샘플; 면역전 vs. 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)의 공초점 영상화를 도시한다.
도 5는 본 발명의 다양한 실시양태에 따른 대조 샘플의 면역조직화학을 도시한다.
도 6은 본 발명의 다양한 실시양태에 따른 대조 샘플; 면역전 vs. 캄필로박터 제주니의 공초점 영상화를 도시한다.
도 7은 본 발명의 다양한 실시양태에 따른 인간 샘플의 면역조직화학을 도시한다.
도 8은 본 발명의 다양한 실시양태에 따른 대조 샘플, ckit 및 공동국재화의 공초점 영상화를 도시한다.
도 9는 본 발명의 다양한 실시양태에 따른 대조 샘플, S100 및 공동국재화의 공초점 영상화를 도시한다.
도 10은 본 발명의 다양한 실시양태에 따른 인간, S100 및 공동국재화의 공초점 영상화를 도시한다.
도 11은 본 발명의 다양한 실시양태에 따른 인간, PGP 9.5 및 공동국재화의 공초점 영상화를 도시한다.
도 12는 본 발명의 다양한 실시양태에 따른 분획화 및 블록의 웨스턴 블롯을 도시한다.
도 13은 본 발명의 다양한 실시양태에 따른 인간, 빈쿨린 및 공동국재화의 공초점 영상화를 도시한다.
도 14는 본 발명의 다양한 실시양태에 따른 래트의 소장에서의 높은 박테리아 계수와 낮은 박테리아 계수 사이의 차이를 도시한다.
도 15는 본 발명의 다양한 실시양태에 따른 항체 역가와 SIBO 수준 사이의 비교 (r=0.3, P=0.04)를 도시한다.
도 16은 본 발명의 다양한 실시양태에 따른 인간 혈청에서의 cdtB 항체를 도시한다.
도 17은 본 발명의 다양한 실시양태에 따른 cdtB 및 면역전 혈청 vs. 빈쿨린 단백질을 도시한다.
도 18은 본 발명의 다양한 실시양태에 따른 인간 혈청에서의 빈쿨린 항체를 도시한다.
도 19는 IBS, IBD 및 건강한 대조군에서 측정된 항체의 역가를 도시한다. IBS 대상체는 본 발명의 다양한 실시양태에 따른 항체의 최상위 수준을 갖는다. y 축은 ELISA 시험의 광학 밀도 (OD)이다.

본원에 인용된 모든 참고문헌은 완전히 기재된 것처럼 그 전문이 참조로 포함된다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 전문 과학 용어는 본 발명이 속한 분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 문헌 [Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3^rd ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 2001); March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 5^th ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 2001); 및 Sambrook and Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY 2001)]은 본원에 사용된 많은 용어에 대한 일반적인 지침을 통상의 기술자에게 제공한다. 이러한 항체를 제조하는 방법에 대한 참고문헌에 대해서는, 문헌 [D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor NY, 1988); Kohler and Milstein, (1976) Eur. J. Immunol. 6: 511; Queen et al. U. S. Patent No. 5,585,089; 및 Riechmann et al., Nature 332: 323 (1988)]을 참조한다.

통상의 기술자는 본 발명의 실시에 사용될 수 있는, 본원에 기재된 것과 유사하거나 또는 동등한 다수의 방법 및 물질을 인식할 것이다. 실제로, 본 발명은 결코 기재된 방법 및 물질로 제한되지 않는다.

본원에 사용된 "특이적으로 결합한다"는 항체가 그의 항원에 결합하는 작용을 지칭하고, 무작위 단백질 사이에 일어날 수 있는 저-수준, 비-특이적 결합을 제외하는 것으로 의도된다. 본원에 사용된 "특이적으로 결합한다"는 항체가 관련 에피토프를 포함하는 임의의 단백질과 교차반응할 수 있기 때문에 본원에 개시된 단백질 또는 폴리펩티드 이외의 임의의 단백질에 결합하지 않을 것임을 의도하거나 암시하지 않는다.

참조량과 관련하여 본원에 사용된 "유의하게 더 높은"은 참조량보다 더 높은 통계적으로 유의한 양을 지칭한다.

면역조직화학에 의한 비감염 래트 회장 조직에서의 내인성 인자와 CdtB 항체의 교차 반응성에 대한 본 발명자들의 발견은 박테리아 과도성장의 발생에서의 메카니즘으로서 CdtB 분자 모방을 통해 IBS의 발생에 대한 감수성 연구를 유도하였다. 이 연구에서, 본 발명자들은 래트와 인간 모두에서 IBS의 예측인자로서 CdtB-연관 항체의 급성 감염 및 발생 동안 CdtB에 결합하는 항체를 추적함으로써 동물 및 인간 시스템에서 CdtB와 연관된 면역 반응을 연구하였다.

분자 모방을 통한 급성 위장염 후의 cdtB에 대한 항체는 IBS에서 빈쿨린에 대한 자가항체를 생산한다. 이러한 항체의 검출은 IBD 및 건강한 대조군 보다 IBS를 예측한다. 동물에서, 본 발명자들은 항-cdtB의 역가가 박테리아 과도성장의 정도와 상관관계가 있다는 것을 제시하였고, 어떠한 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 본 발명자들은 이러한 항체에 의해 유발된 신경병증이 SIBO의 원인인 것으로 생각한다.

본 발명자들은 처음으로 자가면역을 통한 분자 모방이 래트와 인간 모두에서의 감염후 IBS의 병리생리상태에서 중요한 역할을 할 수 있음을 한다. 씨. 제주니(C. jejuni)의 세포치사 팽창 독소 B 서브유닛에 대한 항체는 장 신경계의 요소, 구체적으로는 ICC 및 장근 신경절과 교차반응한다. 이러한 상호작용은 어느 정도의 세포 염증을 생성하고 아마도 장 운동 활동에 대한 효과를 통해 소장 박테리아 과도성장을 생성하는 것처럼 보이는데, 이는 보다 큰 항체 역가가 소장 균총에서 보다 큰 이상을 예측하였기 때문이다. 게다가, 인간 및 래트의 혈청에서 이러한 항체의 검출은 중요한 진단 가치를 갖는다.

급성 위장염이 과민성 장 증후군의 원인이라는 것이 분명해졌다. 최근의 2가지 메타-분석으로부터, 박테리아성 위장염의 발생 후의 IBS의 발생률은 대략 10%이다 (타반(Thabane) 및 할보르손(Halvorsson) 연구). 캐나다 워커턴에서의 발생 및 스페인에서의 발생을 비롯한 2가지 중요한 발생이 가장 많이 연구되었다 (Mearin et al.). 이러한 연구 전에, 연구자들은 감염후 IBS가 별도의 실체이거나 전체 IBS 집단의 작은 하위세트였음을 시사하였다. 그러나, 미국에서 위장염의 발생률에 대한 CDC 데이터와 합해진 감염후 IBS에 대한 군대 데이터 및 알려진 예상 데이터를 사용하는 최근 모델은 현재, 전체 미국 인구의 9%를 초과하는 인구가 이러한 원인으로부터 IBS를 가지고 있을 것임을 시사한다. 모델링이 어려울 수 있지만, 그것은 적어도 급성 위장염이 공동체에서 IBS의 대부분에 대한 책임이 있고 주요 원인일 수 있음을 시사한다.

IBS를 가지는 대상체에서 수많은 생리학적 관찰이 있었다. 이는 내장 과민증의 입증을 포함한다. 다수가 IBS에서 내장 감수성이 롬(Rome) 기준에 대한 기초라고 시사하지만, 역설적이게도 복부팽창이 종종 환자 연구에서 가장 성가신 증상으로서 주목된다. 이러한 증상을 기초로, 10년 넘게 전에, 연구는 소장 박테리아 과도성장 (SIBO)이 IBS의 양상일 수 있다고 시사하기 시작하였다. 이러한 개념이 처음에는 논란이 많았지만, 최근의 2가지 대규모 연구는 건강한 대조군과 비교하여 (포세루드) 및 심지어 다른 전장 질환을 가지는 대상체와 비교하여 (필레리스) IBS의 소장에서 과량의 대장균군을 확인하였다. 실제로, 설사 우세형 IBS를 가지는 대상체에서, 대상체의 60%는 배양 증명된 SIBO를 가지고 있었다 (필레리스).

다수의 동물 모델이 감염후 IBS를 연구하기 위해 생성되었다. 그러나, 보다 우세하게 공개된 모델의 일부는 IBS에서 드문 병원체인 병원체들을 사용하였고, 이러한 모델의 초점은 내장 통각과민의 발생에 있었다. 미국에서 박테리아성 위장염의 가장 통상적인 원인은 캄필로박터 제주니이고, 따라서 미국에서 감염후 IBS의 전체 발생률에 대한 최대의 기여자일 가능성이 있다. 이러한 병원체를 사용하여, 최근 설치류 모델은 변경된 장 형태, SIBO의 발생, 감소된 ICC 및 증가된 직장내 림프구를 입증하였다. 이러한 발견은 IBS 및 감염후 IBS를 가지는 인간에서의 발견을 모방한다.

씨. 제주니가 위장염의 통상적인 원인이며 감염후 IBS의 중요한 원인이지만, 다중 박테리아 병원체가 IBS의 발생에 있어서 원인이라고 간주되었다. 이는 상기 감염 또는 공통 독소에 대한 공통 숙주 반응을 시사한다. 세포치사 팽창 독소는 급성 위장염의 거의 모든 박테리아성 원인에 대하여 공통된다. 이러한 독소는 3개의 성분 (Cdt A, B 및 C)을 갖는다. 그러나, 활성 독소는 HeLa 세포에 대한 효과의 시험관내 연구를 기초로 하여 CdtB인 것으로 생각된다. 상기 기재된 설치류 모델에서, CdtB의 삽입 결실을 갖는 씨. 제주니 81-176에 의한 래트의 감염은 감염후 IBS의 완전한 표현형을 유발하지 않았다. 인간 연구는 급성 위장염의 강도가 IBS의 발생에서 중요하였다고 시사하였지만, 2가지 급성 설치류 감염 연구에서 장 손상은 무손상 CdtB의 존재 또는 부재에 의해 단지 미미하게 변경되었다. 따라서, CdtB는 IBS의 발생에 대하여 또 다른 생체내 역할을 가지는 것처럼 보였다.

본 발명자들은 본원에서, 면역조직화학 접근법을 사용하여, CdtB가 자가항체의 생산을 통해 숙주에 대한 효과를 생성하고 있음을 입증한다. CdtB에 대한 항체는 장근 뉴런 및 카할 간질 세포에 결합한다. 이러한 자가항체는 감염후 IBS를 가지는 래트와 인간 모두에서 검출가능하다. 실제로, 항체는 래트에서 감염후 IBS를 확인하는데 있어서 (심지어 크론병 및 궤양성 결장염과는 다름) 및 소장 신경병증의 결과 (소장 박테리아 과도성장)를 예측하는데 있어서 유의한 진단 가치를 갖는다. 이러한 데이터는 IBS가 자가면역 질환임을 시사한다.

현재 증거를 기초로, 현재 감염후 IBS는 미국 인구에서의 대다수의 IBS를 설명할 수 있는 것처럼 보이고, 최근 증거는 SIBO가 IBS에서 통상적이며 (포세루드 및 필레리스) 소장의 신경근육 장애로 인한 것일 수 있음을 지지한다. 그러나, 이러한 연구는 CdtB를 함유하는 박테리아 병원체에 대한 노출로 시작하는 상기 장애로 이어지는 일련의 사건을 시사한다. 생성되는 CdtB에 대한 면역 반응은 숙주 장 신경 시토졸 단백질을 또한 인식하는 항체를 생산한다. 생성되는 자가항체 및 그의 역가는 소장의 뉴런 장애의 간접적 척도일 수 있는 SIBO의 정도와 상관관계가 있는 것처럼 보인다. SIBO의 정도 및 존재는 상기 모델 (제1 래트 모델 확인) 및 인간 (표적 1 및 2) 연구에서 장 장애를 결정하는 것처럼 보인다.

결론적으로, 어떠한 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 본 발명자들은 급성 위장염이 IBS의 주요 원인인 것으로 생각한다. 본원에서, 본 발명자들은 세포치사 팽창 독소가 항체의 유도를 통해 및 장 신경 단백질에 대한 자가면역이고 SIBO를 예측하는 분자 모방을 통해 IBS의 발생에 있어서 중요함을 입증한다. 이러한 연구는 IBS의 병리생리상태를 이해하는데 있어서 주요 돌파구일 수 있다.

따라서, 본 발명의 다양한 실시양태는, 적어도 부분적으로, 이러한 발견을 기초로 한다.

진단

다양한 실시양태는 위장 운동 장애, 방광 운동 장애 또는 섬유근육통을 진단하는 방법 및 시스템을 제공한다.

다양한 실시양태에서, 방법은 위장 운동 장애, 방광 운동 장애 또는 섬유근육통의 진단을 필요로 하는 대상체로부터의 생물학적 샘플을 제공하는 것; 생물학적 샘플에서 항-빈쿨린 항체의 존재를 검출하는 것; 및 항-빈쿨린 항체의 존재가 검출되는 경우에 위장 운동 장애, 방광 운동 장애 또는 섬유근육통의 존재 또는 존재 가능성을 결정하는 것, 또는 항-빈쿨린 항체의 부재가 검출되는 경우에 위장 운동 장애, 방광 운동 장애 또는 섬유근육통의 부재 또는 부재 가능성을 결정하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 항-빈쿨린 항체의 존재 또는 부재에 대해 생물학적 샘플을 분석하는 것을 추가로 포함한다.

다양한 실시양태에서, 방법은 위장 운동 장애, 방광 운동 장애 또는 섬유근육통의 진단을 필요로 하는 대상체로부터의 생물학적 샘플을 제공하는 것; 생물학적 샘플에서 항-빈쿨린 항체의 수준을 검출하는 것; 및 항-빈쿨린 항체의 수준이 확립된 대조 수준보다 더 높은 경우에 위장 운동 장애, 방광 운동 장애 또는 섬유근육통의 존재 또는 존재 가능성을 결정하는 것, 또는 항-빈쿨린 항체의 수준이 확립된 대조 수준과 동일하거나 그보다 더 낮은 경우에 위장 운동 장애, 방광 운동 장애 또는 섬유근육통의 부재 또는 부재 가능성을 결정하는 것을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 확립된 대조 수준은 위장 운동 장애, 방광 운동 장애 또는 섬유근육통이 없는 대상체로부터의 항-빈쿨린 항체 수준의 두 표준 편차 내에 있는 항-빈쿨린 항체의 수준이다. 특정 실시양태에서, 방법은 항-빈쿨린 항체의 수준에 대해 생물학적 샘플을 분석하는 것을 추가로 포함한다.

다양한 실시양태에서, 방법은 위장 운동 장애, 방광 운동 장애 또는 섬유근육통의 진단을 필요로 하는 대상체로부터의 생물학적 샘플을 제공하는 것; 생물학적 샘플에서 항-빈쿨린 항체의 수준을 검출하는 것; 및 항-빈쿨린 항체의 수준이 확립된 대조 수준보다 유의하게 더 높은 경우에 위장 운동 장애, 방광 운동 장애 또는 섬유근육통의 존재 또는 존재 가능성을 결정하는 것, 또는 항-빈쿨린 항체의 수준이 확립된 대조 수준보다 유의하게 더 높지 않은 경우에 위장 운동 장애, 방광 운동 장애 또는 섬유근육통의 부재 또는 부재 가능성을 결정하는 것을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 확립된 대조 수준은 위장 운동 장애, 방광 운동 장애 또는 섬유근육통이 없는 대상체로부터의 항-빈쿨린 항체의 수준이다. 특정 실시양태에서, 방법은 항-빈쿨린 항체의 수준에 대해 생물학적 샘플을 분석하는 것을 추가로 포함한다.

다양한 실시양태에서, 시스템은 위장 운동 장애, 방광 운동 장애 또는 섬유근육통의 진단을 필요로 하는 대상체로부터의 단리된 생물학적 샘플, 및 생물학적 샘플에서 항-빈쿨린 항체의 존재 또는 수준을 검출하기 위한 검정을 포함한다.

다양한 실시양태에서, 검정은 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA)이며, 이에는 간접적 ELISA, 샌드위치 ELISA, 경쟁적 ELISA, 다중 및 휴대용 ELISA가 포함되나 이에 제한되지는 않는다.

다양한 실시양태에서, 검정은 생물학적 샘플과 반응하기 위한 제1 시약, 항-빈쿨린 항체와 반응하기 위한 제2 시약 (예를 들어, 이차 항체), 및 기질을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 제1 시약은 빈쿨린 또는 그의 단편이며, 이는 생물학적 샘플에서 항-빈쿨린 항체 (존재한다면)와 반응할 것이다. 다양한 실시양태에서, 제2 시약은 항-빈쿨린 항체의 존재를 나타내기 위한 신호를 생성하는 표지를 포함한다. 다양한 실시양태에서, 표지는 방사성표지, 발색단, 형광단, 양자 점, 효소, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 알칼리성 포스파타제 (AP), 비오틴 또는 이들의 조합이다. 다양한 실시양태에서, 표지는 기질과 반응할 효소이다. 다양한 실시양태에서, 제1 시약은 고체 상 (예를 들어, 플레이트, 멀티-웰 플레이트) 상에 있다.

다양한 실시양태에서, 검정은 항-빈쿨린 항체와 반응하기 위한 제1 시약을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 제1 시약은 항-빈쿨린 항체의 존재를 나타내기 위한 신호를 생성하는 표지를 포함한다. 다양한 실시양태에서, 표지는 방사성표지, 발색단, 형광단, 양자 점, 효소, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 알칼리성 포스파타제 (AP), 비오틴 또는 이들의 조합이다. 다양한 실시양태에서, 시약은 고체 상 (예를 들어, 플레이트, 멀티-웰 플레이트) 상에 있다.

다양한 실시양태에서, 시스템은 항-빈쿨린 항체의 존재가 검출되는 경우에 위장 운동 장애, 방광 운동 장애 또는 섬유근육통의 존재 또는 존재 가능성을 결정하거나 또는 항-빈쿨린 항체의 부재가 검출되는 경우에 위장 운동 장애, 방광 운동 장애 또는 섬유근육통의 부재 또는 부재 가능성을 결정하기 위한 기계를 추가로 포함한다. 다양한 실시양태에서, 기계는 컴퓨터이다. 다양한 실시양태에서, 컴퓨터는 위장 운동 장애, 방광 운동 장애 또는 섬유근육통의 존재 또는 부재 여부를 디스플레이하기 위한 디스플레이 소자를 포함한다.

다양한 실시양태에서, 시스템은 항-빈쿨린 항체의 수준이 확립된 대조 수준보다 더 높은 경우에 위장 운동 장애, 방광 운동 장애 또는 섬유근육통의 존재 또는 존재 가능성을 결정하거나 또는 항-빈쿨린 항체의 수준이 확립된 대조 수준과 동일하거나 그 보다 더 낮은 경우에 위장 운동 장애, 방광 운동 장애 또는 섬유근육통의 부재 또는 부재 가능성을 결정하기 위한 기계를 추가로 포함한다. 다양한 실시양태에서, 확립된 대조 수준은 위장 운동 장애, 방광 운동 장애 또는 섬유근육통이 없는 대상체로부터의 항-빈쿨린 항체 수준의 두 표준 편차 내에 있는 항-빈쿨린 항체의 수준이다. 특정 실시양태에서, 방법은 항-빈쿨린 항체의 수준에 대해 생물학적 샘플을 분석하는 것을 추가로 포함한다.

다양한 실시양태에서, 시스템은 항-빈쿨린 항체의 수준이 확립된 대조 수준보다 유의하게 더 높은 경우에 위장 운동 장애, 방광 운동 장애 또는 섬유근육통의 존재 또는 존재 가능성을 결정하거나 또는 항-빈쿨린 항체의 수준이 확립된 대조 수준보다 유의하게 더 높지 않은 경우에 위장 운동 장애, 방광 운동 장애 또는 섬유근육통의 부재 또는 부재 가능성을 결정하기 위한 기계를 추가로 포함한다. 다양한 실시양태에서, 확립된 대조 수준은 위장 운동 장애, 방광 운동 장애 또는 섬유근육통이 없는 대상체로부터의 항-빈쿨린 항체의 수준이다. 특정 실시양태에서, 방법은 항-빈쿨린 항체의 수준에 대해 생물학적 샘플을 분석하는 것을 추가로 포함한다.

다양한 실시양태에서, 방법 또는 시스템에 의해 검출된 위장 운동 장애, 방광 운동 장애 또는 섬유근육통은 과민성 장 증후군 (IBS), 변비 우세형 IBS (C-IBS), 설사 우세형 IBS (D-IBS), 교대 IBS (A-IBS) (보다 최근에는 혼합 IBS (M-IBS)로 재명명됨), 위식도 역류 질환 (GERD), 기능성 소화불량, 감염후 과민성 장 증후군 (PI-IBS), 소장 박테리아 과도성장 (SIBO), 위식도 역류 질환 (GERD), 위부전마비, 알레르기성/호산구성 위장염, 변비, 만성 변비, 가성-폐쇄, 간질성 방광염, 누출성 장 증후군 또는 섬유근육통이다. 어떠한 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 본 발명자들은 빈쿨린이 세포를 이동시키고 서로 부착되도록 도우며, 상피 세포가 빈쿨린을 갖기 때문에, 손상된 빈쿨린은 장이 "누출성"이 되게 할 수 있는 것으로 생각한다. 장 신경계의 경우에, 손상된 빈쿨린은 장 신경망을 손상시킬 수 있다. 다양한 실시양태에서, 위장 운동 장애는 IBS이다. 다양한 실시양태에서, 위장 운동 장애는 GERD이다. 다양한 실시양태에서, 위장 운동 장애는 기능성 소화불량이다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 시스템에 따른 위장 운동 장애, 방광 운동 장애 또는 섬유근육통의 진단을 필요로 하는 대상체는 위장 운동 장애, 방광 운동 장애 또는 섬유근육통을 나타내는 하나 이상의 증상, 예를 들어 복부팽창, 설사, 변비, 복통, 피로, 섬유근육통 통증을 가질 수 있다.

본 발명의 다양한 실시양태는 IBS와 IBD를 구별하는 방법 및 시스템을 제공한다.

방법은 IBS와 IBD를 구별하기 위한 진단을 필요로 하는 대상체로부터의 생물학적 샘플을 제공하는 것, 생물학적 샘플에서 항-빈쿨린 항체의 수준을 검출하는 것, 및 항-빈쿨린 항체의 존재가 검출되는 경우에 IBS를 진단하거나, 또는 항-빈쿨린 항체의 부재가 검출되는 경우에 IBD를 진단하는 것을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 방법은 항-빈쿨린 항체의 존재 또는 부재에 대해 생물학적 샘플을 분석하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 IBS가 진단되는 경우에 IBS 치료를 선택하는 것, 또는 IBD가 진단되는 경우에 IBD 치료를 선택하는 것을 추가로 포함한다.

다양한 실시양태에서, 방법은 IBS와 IBD를 구별하기 위한 진단을 필요로 하는 대상체로부터의 생물학적 샘플을 제공하는 것, 생물학적 샘플에서 항-빈쿨린 항체의 수준을 검출하는 것, 및 항-빈쿨린 항체의 수준이 확립된 대조 수준보다 더 높은 경우에 IBS를 진단하거나, 또는 항-빈쿨린 항체의 수준이 확립된 대조 수준과 동일하거나 그보다 더 낮은 경우에 IBD를 진단하는 것을 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 확립된 대조 수준은 IBS, IBD 또는 이들 모두가 없는 건강한 대상체로부터의 항-빈쿨린 항체 수준의 두 표준 편차 내에 있는 항-빈쿨린 항체의 수준이다. 특정 실시양태에서, 방법은 항-빈쿨린 항체의 수준에 대해 생물학적 샘플을 분석하는 것을 추가로 포함한다.

다양한 실시양태에서, 방법은 IBS와 IBD를 구별하기 위한 진단을 필요로 하는 대상체로부터의 생물학적 샘플을 제공하는 것, 생물학적 샘플에서 항-빈쿨린 항체의 수준을 검출하는 것, 및 항-빈쿨린 항체의 수준이 확립된 대조 수준보다 유의하게 더 높은 경우에 IBS를 진단하거나, 또는 항-빈쿨린 항체의 수준이 확립된 대조 수준보다 유의하게 더 높지 않은 경우에 IBD를 진단하는 것을 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 확립된 대조 수준은 IBS, IBD 또는 이들 모두가 없는 대상체로부터의 항-빈쿨린 항체의 수준이다. 특정 실시양태에서, 방법은 항-빈쿨린 항체의 수준에 대해 생물학적 샘플을 분석하는 것을 추가로 포함한다.

다양한 실시양태에서, 시스템은 IBS와 IBD의 구별을 필요로 하는 대상체로부터의 단리된 생물학적 샘플, 및 생물학적 샘플에서 IBS와 IBD를 구별하기 위한 항-빈쿨린 항체의 존재 또는 항-빈쿨린 항체의 수준을 검출하기 위한 검정을 포함할 수 있다.

다양한 실시양태에서, 검정은 생물학적 샘플이 항-빈쿨린 항체를 포함한다면 생물학적 샘플과 반응하기 위한 제1 시약 (항-빈쿨린 항체가 존재하지 않는다면, 제1 시약은 생물학적 샘플과 반응하지 않을 것이지만, 제1 시약은 검정에 여전히 존재함), 항-빈쿨린 항체와 반응하기 위한 제2 시약 (예를 들어, 이차 항체) 또는 제1 시약과 반응하기 위한 제2 시약, 및 기질을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 제1 시약은 빈쿨린 또는 그의 단편이다. 다양한 실시양태에서, 제2 시약은 항-빈쿨린 항체의 존재를 나타내기 위한 신호를 생성하는 표지를 포함한다. 다양한 실시양태에서, 표지는 방사성표지, 발색단, 형광단, 양자 점, 효소, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 알칼리성 포스파타제 (AP), 비오틴 또는 이들의 조합이다. 다양한 실시양태에서, 표지는 기질과 반응할 효소이다. 다양한 실시양태에서, 제1 시약은 고체 상 (예를 들어, 플레이트, 멀티-웰 플레이트) 상에 있다.

다양한 실시양태에서, 시스템은 항-빈쿨린 항체의 존재가 검출되는 경우에 IBS의 존재 또는 존재 가능성을 결정하거나 또는 항-빈쿨린 항체의 부재가 검출되는 경우에 IBD의 존재 또는 존재 가능성을 결정하기 위한 기계를 추가로 포함한다. 다양한 실시양태에서, 기계는 컴퓨터이다. 다양한 실시양태에서, 컴퓨터는 환자가 IBS 또는 IBD를 가질 가능성이 있는지 여부를 디스플레이하기 위한 디스플레이 소자를 포함한다.

다양한 실시양태에서, 시스템은 항-빈쿨린 항체의 수준이 확립된 대조 수준보다 더 높은 경우에 IBS의 존재 또는 존재 가능성을 결정하거나 또는 항-빈쿨린 항체의 수준이 확립된 대조 수준과 동일하거나 그보다 더 낮은 경우에 IBD의 존재 또는 존재 가능성을 결정하기 위한 기계를 추가로 포함한다. 다양한 실시양태에서, 확립된 대조 수준은 IBS, IBD 또는 이들 모두가 없는 건강한 대상체로부터의 항-빈쿨린 항체 수준의 두 표준 편차 내에 있는 항-빈쿨린 항체의 수준이다. 특정 실시양태에서, 방법은 항-빈쿨린 항체의 수준에 대해 생물학적 샘플을 분석하는 것을 추가로 포함한다.

다양한 실시양태에서, 시스템은 항-빈쿨린 항체의 수준이 확립된 대조 수준보다 유의하게 더 높은 경우에 IBS의 존재 또는 존재 가능성을 결정하거나 또는 항-빈쿨린 항체의 수준이 확립된 대조 수준보다 유의하게 더 높지 않은 경우에 IBD의 존재 또는 존재 가능성을 결정하기 위한 기계를 추가로 포함한다. 다양한 실시양태에서, 확립된 대조 수준은 IBS, IBD 또는 이들 모두가 없는 대상체로부터의 항-빈쿨린 항체의 수준이다. 특정 실시양태에서, 방법은 항-빈쿨린 항체의 수준에 대해 생물학적 샘플을 분석하는 것을 추가로 포함한다.

다양한 실시양태에서, 기계는 컴퓨터이다. 다양한 실시양태에서, 컴퓨터는 환자가 IBS 또는 IBD를 가질 가능성이 있는지 여부를 디스플레이하기 위한 디스플레이 소자를 포함한다.

다양한 실시양태에서, 이러한 방법 또는 시스템에서 검출된 항-빈쿨린 항체는 빈쿨린에 특이적으로 결합하는 항체이다.

다양한 실시양태에서, 항-빈쿨린 항체는 빈쿨린의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개의 인접 잔기와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상동성을 갖는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개의 잔기 펩티드에 특이적으로 결합하는 항체이다.

또 다른 실시양태에서, 항-빈쿨린 항체는 빈쿨린의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개의 인접 잔기와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상동성을 갖는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개의 잔기를 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다.

또 다른 실시양태에서, 항-빈쿨린 항체는 빈쿨린의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개의 인접 잔기를 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다.

다양한 실시양태에서, 항-빈쿨린 항체는 서열 1에 특이적으로 결합하는 항체이다.

다양한 실시양태에서, 항-빈쿨린 항체는 서열 1의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개의 인접 잔기와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상동성을 갖는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개의 잔기 펩티드에 특이적으로 결합하는 항체이다.

또 다른 실시양태에서, 항-빈쿨린 항체는 서열 1의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개의 인접 잔기와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상동성을 갖는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개의 잔기를 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다.

또 다른 실시양태에서, 항-빈쿨린 항체는 서열 1의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개의 인접 잔기를 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다.

빈쿨린 또는 서열 1의 인접 잔기는 빈쿨린 또는 서열 1의 임의의 아미노산에서 시작하여 임의의 아미노산에서 종료되는 잔기를 포함한다.

빈쿨린의 단백질 서열 (서열 1):

다양한 실시양태에서, 항체의 존재 또는 부재를 검출하는 것은 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 수행된다. 또 다른 실시양태에서, 항체의 존재 또는 부재를 검출하는 것은 대상체로부터 얻은 혈액, 혈청 또는 대변 샘플에서 수행된다. 통상의 기술자는 빈쿨린, 서열 1 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체의 존재 또는 부재를 검출하는데 사용될 수 있는 방법 및 시스템을 용이하게 이해할 것이다. 이러한 방법 및 시스템은 ELISA, 면역조직화학, 유동 세포측정법, 형광 계내 혼성화 (FISH), 방사성면역 검정 및 친화도 정제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

다양한 실시양태에서, 빈쿨린, 서열 1 또는 그의 단편 (상기 기재된 바와 같음)은 항-빈쿨린 항체 (존재한다면)에 결합하기 위한 기질 또는 시약 (예를 들어, 포수제, 트랩)으로서 사용된다.

특정 실시양태에서, 빈쿨린, 서열 1 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체의 존재 또는 부재를 검출하는 것은 빈쿨린, 서열 1 또는 그의 단편을 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에 접촉시켜 빈쿨린, 서열 1 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 단리시킴으로써 수행될 수 있으며, 여기서 빈쿨린, 서열 1 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체의 단리는 항체의 존재를 나타내고, 빈쿨린, 서열 1 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체의 단리의 결핍은 항체의 결핍을 나타낸다. 다양한 실시양태에서, 빈쿨린 또는 서열 1의 단편은 본원에 기재된 바와 같은 단편일 수 있다. 예로서, 빈쿨린, 서열 1 또는 그의 단편을 포함하는 친화성 매트릭스는 고체 지지체에 결합될 수 있고; 생물학적 샘플은 친화성 매트릭스에 접촉되어 친화성 매트릭스-항체 복합체 (항체가 존재한다면)를 생산할 수 있고; 친화성 매트릭스-항체 복합체는 생물학적 샘플의 나머지로부터 분리될 수 있고; 항체는 친화성 매트릭스로부터 방출될 수 있다. 또 다른 예에서, 표지 (예를 들어, 형광 표지)는 빈쿨린, 서열 1 또는 그의 단편 상에 놓일 수 있고; 표지된 빈쿨린, 서열 1 또는 그의 단편은 생물학적 샘플과 접촉되어 항체 (존재한다면)가 표지된 빈쿨린, 서열 1 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하도록 할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 표지된 빈쿨린, 서열 1 또는 그의 단편은 분리되어 그의 항체에의 결합에 대해 분석될 수 있다.

요법

다양한 실시양태는 위장 운동 장애, 방광 운동 장애 또는 섬유근육통에 대한 요법을 필요로 하는 대상체에 대해 상기 요법을 선택하는 방법을 제공한다. 다양한 실시양태에서, 방법은 항-빈쿨린 항체의 존재를 검출하는 것; 및 위장 운동 장애, 방광 운동 장애 또는 섬유근육통을 치료하기 위한 요법을 선택하는 것을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 요법을 선택하는 것은 치료에 관하여 대상체를 선택하거나, 고르거나, 처방하거나, 충고하거나, 권고하거나, 지시하거나 또는 조언하는 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 다양한 실시양태에서, 방법은 위장 운동 장애, 방광 운동 장애 또는 섬유근육통을 치료하기 위한 요법을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 다양한 실시양태에서, 요법은 본원에 기재된 바와 같은 요법이다. 다양한 실시양태에서, 이용가능한 요법은 위장 운동 장애, 방광 운동 장애 또는 섬유근육통을 치료하기 위한 일련의 항생제 요법을 투여하는 것을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 요법은 선행 기술에서 이용가능한 요법이다.

다양한 실시양태에서, 항-빈쿨린 항체의 존재를 검출하는 것은 본 발명의 방법 또는 시스템에 의해 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.

다양한 실시양태에서, 대상체는 예를 들어 본원에 논의된 바와 같은 위장 운동 장애, 방광 운동 장애 또는 섬유근육통의 하나 이상의 증상을 나타내는 대상체일 수 있다.

다양한 실시양태에서, 방법은 항-빈쿨린 항체의 존재를 검출하는 것; 및 위장 운동 장애, 방광 운동 장애 또는 섬유근육통을 치료하기 위한 일련의 항생제 요법을 선택하는 것을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 방법은 위장 운동 장애, 방광 운동 장애 또는 섬유근육통을 치료하기 위한 일련의 항생제 요법을 투여하는 것을 추가로 포함한다.

다양한 실시양태에서, 위장 운동 장애, 방광 운동 장애 또는 섬유근육통은 과민성 장 증후군 (IBS), C-IBS, D-IBS, A-IBS (또한 M-IBS로도 알려짐), 위식도 역류 질환 (GERD), 기능성 소화불량, 감염후 과민성 장 증후군 (PI-IBS), 소장 박테리아 과도성장 (SIBO), 위식도 역류 질환 (GERD), 위부전마비, 알레르기성/호산구성 위장염, 변비, 만성 변비, 가성-폐쇄, 간질성 방광염, 누출성 장 증후군 또는 섬유근육통의 일부일 수 있다. 다양한 실시양태에서, 위장 운동 장애는 IBS이다. 특정 실시양태에서, 위장 운동 장애는 GERD이다. 특정 실시양태에서, 위장 운동 장애는 기능성 소화불량이다.

항생제의 예는 아미노글리코시드 (예를 들어, 아미카신, 겐타미신, 카나마이신, 네오마이신, 네틸미신, 스트렙토마이신, 토브라마이신, 파로모마이신), 안사마이신 (예를 들어, 겔다나마이신, 헤르비마이신), 카르바세펨 (예를 들어, 로라카르베프), 카르바페넴 (예를 들어, 에르타페넴, 도리페넴, 이미페넴, 실라스타틴, 메로페넴), 세팔로스포린 (예를 들어, 제1 세대: 세파드록실, 세파졸린, 세팔로틴 또는 세팔로씬, 세팔렉신; 제2 세대: 세파클로르, 세파만돌, 세폭시틴, 세프프로질, 세푸록심; 제3 세대: 세픽심, 세프디니르, 세프디토렌, 세포페라존, 세포탁심, 세프포독심, 세프타지딤, 세프티부텐, 세프티족심, 세프트리악손; 제4 세대: 세페핌; 제5 세대: 세프토비프롤), 당펩티드 (예를 들어, 테이코플라닌, 반코마이신), 마크롤리드 (예를 들어, 아지트로마이신, 클라리트로마이신, 디리트로마이신, 에리트로마이신, 록시트로마이신, 트롤레안도마이신, 텔리트로마이신, 스펙티노마이신), 모노박탐 (예를 들어, 아즈트레오남), 페니실린 (예를 들어, 아목시실린, 암피실린, 아즐로실린, 카르베니실린, 클록사실린, 디클록사실린, 플루클록사실린, 메즐로실린, 메티실린, 나프실린, 옥사실린, 페니실린, 피페라실린, 티카르실린), 항생제 폴리펩티드 (예를 들어, 바시트라신, 콜리스틴, 폴리믹신 b), 퀴놀론 (예를 들어, 시프로플록사신, 에녹사신, 가티플록사신, 레보플록사신, 로메플록사신, 목시플록사신, 노르플록사신, 오플록사신, 트로바플록사신), 리파마이신 (예를 들어, 리팜피신 또는 리팜핀, 리파부틴, 리파펜틴, 리팍시민), 술폰아미드 (예를 들어, 마페니드, 프론토실, 술프아세트아미드, 술파메티졸, 술파닐아미드, 술파살라진, 술프이속사졸, 트리메토프림, 트리메토프림-술파메톡사졸 (코-트리목사졸, "tmp-smx")), 및 테트라시클린 (예를 들어, 데메클로시클린, 독시시클린, 미노시클린, 옥시테트라시클린, 테트라시클린), 뿐만 아니라 아르스페나민, 클로람페니콜, 클린다마이신, 린코마이신, 에탐부톨, 포스포마이신, 푸시드산, 푸라졸리돈, 이소니아지드, 리네졸리드, 메트로니다졸, 뮤피로신, 니트로푸란토인, 플라텐시마이신, 피라진아미드, 퀴누프리스틴/달포프리스틴 조합 및 티니다졸, 또는 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 다양한 실시양태에서, 항생제는 리팍시민과 네오마이신의 조합이다. 다양한 실시양태에서, 항생제는 리팍시민과 독시시클린의 조합이다. 다양한 실시양태에서, 항생제는 리팍시민과 메트로니다졸의 조합이다.

다양한 실시양태에서, 항생제는 비-흡수성 항생제이다. 비-흡수성 항생제의 예는 리팍시민, 네오마이신, 바시트라신, 반코마이신, 테이코플라닌, 라모플라닌 및 파로모마이신을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

다양한 실시양태는 위장 운동 장애, 방광 운동 장애 또는 섬유근육통을 치료하는 방법을 제공한다. 다양한 실시양태에서, 치료된 위장 운동 장애, 방광 운동 장애 또는 섬유근육통은 과민성 장 증후군 (IBS), C-IBS, D-IBS, A-IBS (또한 M-IBS로도 알려짐), 위식도 역류 질환 (GERD), 기능성 소화불량, 감염후 과민성 장 증후군 (PI-IBS), 소장 박테리아 과도성장 (SIBO), 위식도 역류 질환 (GERD), 위부전마비, 알레르기성/호산구성 위장염, 변비, 만성 변비, 가성-폐쇄, 간질성 방광염, 누출성 장 증후군 또는 섬유근육통일 수 있다. 다양한 실시양태에서, 위장 운동 장애는 IBS이다. 특정 실시양태에서, 위장 운동 장애는 GERD이다. 특정 실시양태에서, 위장 운동 장애는 기능성 소화불량이다.

다양한 실시양태에서, 방법은 항-빈쿨린 항체 중화제 또는 억제제를 제공하는 것 및 항-빈쿨린 항체 중화제 또는 억제제를 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하여 항-빈쿨린 항체를 중화시키거나 억제하는 것을 포함할 수 있다.

다양한 실시양태에서, 항-빈쿨린 항체 중화제 또는 억제제는 항-빈쿨린 항체에 결합하여 그의 기능을 중화시키거나 억제할 수 있는 폴리펩티드이다.

다양한 실시양태에서, 항-빈쿨린 항체 중화제 또는 억제제는 항-빈쿨린 항체의 항원 결합 부위에 결합할 수 있는 폴리펩티드이다. 어떠한 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 본 발명자들은 이러한 폴리펩티드가 항-빈쿨린 항체에 대한 디코이로서의 역할을 할 수 있는 것으로 생각한다. 다양한 실시양태에서, 폴리펩티드는 본원에 완전히 기재된 것처럼 그의 전문이 참조로 포함된 문헌 [Lucchese and Delfino (Developing an anti-Campylobacter jejuni vaccine. Immunopharmacology and Immunotoxicology, 2012; Early Online: 1-6)]에 개시된 바와 같은 CDT 펜타펩티드이다.

다양한 실시양태에서, 항-빈쿨린 항체 중화제 또는 억제제는 항-빈쿨린 항체에 결합하여 그의 기능을 중화시키거나 억제할 수 있는 소분자이다.

다양한 실시양태에서, 항-빈쿨린 항체 중화제 또는 억제제는 항-빈쿨린 항체의 항원 결합 부위에 결합할 수 있는 소분자이다.

다양한 실시양태에서, 방법은 빈쿨린을 불활성 상태에서 활성 상태로 변경시키기 위한 작용제를 제공하는 것; 및 상기 작용제를 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하여 위장 운동 장애, 방광 운동 장애 또는 섬유근육통을 치료하는 것을 포함할 수 있다.

다양한 실시양태에서, 빈쿨린을 불활성 상태에서 활성 상태로 변경시키기 위한 작용제는 빈쿨린을 활성화시킬 수 있는 소분자이다.

다양한 실시양태에서, 방법은 빈쿨린 효능제를 제공하는 것; 및 빈쿨린 효능제를 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하여 위장 운동 장애, 방광 운동 장애 또는 섬유근육통을 치료하는 것을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 빈쿨린 효능제는 본원에 완전히 기재된 것처럼 그의 전문이 참조로 포함된 문헌 [Nelson et al., Vinculin Activators Target Integrins from Within the Cell to Increase Melanoma Sensitivity to Chemotherapy, Mol Cancer Res June 2011 9; 712 (published online April 1, 2011)]에 개시된 바와 같은 빈쿨린 활성화 펩티드 (VAP)일 수 있다. 다양한 실시양태에서, VAP는 시겔라(Shigella)의 인바신 단백질 IpaA의 잔기 500-633일 수 있다.

시겔라의 IpaA의 단백질 서열:

다양한 실시양태에서, 방법은 빈쿨린 활성화제를 제공하는 것; 및 빈쿨린 활성화제를 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하여 위장 운동 장애, 방광 운동 장애 또는 섬유근육통을 치료하는 것을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 빈쿨린 활성화제는 탈린, f-액틴, a-카테닌 또는 이들의 조합일 수 있다.

다양한 실시양태는 결장 폴립 또는 악성종양의 진행을 치료하거나 억제하는 방법을 제공한다. IBS를 가지는 환자에서 더 적은 폴립이 존재하는 것으로 관찰되었다. 이에 따라, 빈쿨린을 차단하는 항-빈쿨린 항체 또는 작용제는 결장 폴립 또는 악성종양의 진행을 감소시킬 수 있다.

다양한 실시양태에서, 방법은 빈쿨린을 활성 상태에서 불활성 상태로 변경시키기 위한 작용제를 제공하는 것; 및 상기 작용제를 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하여 결장 폴립 또는 악성종양의 진행을 치료하거나 억제하는 것을 포함할 수 있다.

다양한 실시양태에서, 빈쿨린을 활성 상태에서 불활성 상태로 변경시키기 위한 작용제는 빈쿨린을 불활성화시킬 수 있는 소분자이다.

다양한 실시양태에서, 방법은 빈쿨린 길항제를 제공하는 것; 및 빈쿨린 길항제를 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하여 결장 폴립 또는 악성종양의 진행을 치료하거나 억제하는 것을 포함할 수 있다.

다양한 실시양태에서, 방법은 빈쿨린 불활성제를 제공하는 것; 및 빈쿨린 불활성제를 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하여 결장 폴립 또는 악성종양의 진행을 치료하거나 억제하는 것을 포함할 수 있다.

다양한 실시양태에서, 방법은 빈쿨린의 기능을 억제할 수 있는 항-빈쿨린 항체를 제공하는 것; 및 항-빈쿨린 항체를 대상체에게 투여하여 결장 폴립 또는 악성종양의 진행을 치료하거나 억제하는 것을 포함할 수 있다.

다양한 실시양태에서, 본 발명은 치료 유효량의 본원에 기재된 작용제와 함께 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. "제약상 허용되는 부형제"는 제약 조성물을 제조하는데 유용한 것으로서, 일반적으로 안전하고 비독성이며 바람직한 부형제를 의미하고, 수의학적 용도 뿐만 아니라 인간 제약 용도로도 허용되는 부형제를 포함한다. 이러한 부형제는 고체, 액체, 반고체, 또는 에어로졸 조성물의 경우에는 기체일 수 있다.

다양한 실시양태에서, 본 발명에 따른 제약 조성물은 임의의 투여 경로를 통한 전달을 위해 제제화될 수 있다. "투여 경로"는 에어로졸, 비강, 경구, 경점막, 경피 또는 비경구를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 관련 기술분야에 공지된 임의의 투여 경로를 지칭할 수 있다. "경피" 투여는 국소 크림 또는 연고를 사용하여 또는 경피 패치에 의해 수행될 수 있다. 국소 경로를 통해, 본 발명에 따른 화합물 기재의 제약 조성물은 피부 및 점막의 치료를 위해 제제화될 수 있고, 연고, 크림, 유액, 살브, 분말, 침투성 패드, 용액, 겔, 스프레이, 로션 또는 현탁액의 형태이다. 이들은 또한 제어 방출을 가능케 하는 마이크로구체 또는 나노구체 또는 지질 소포 또는 중합체 소포 또는 중합체 패치 및 히드로겔의 형태일 수 있다. 이러한 국소 경로 조성물은 임상 적응증에 따라 무수 형태 또는 수성 형태일 수 있다. "비경구"는 안와내, 주입, 동맥내, 피막내, 심장내, 피내, 근육내, 복강내, 폐내, 척수내, 흉골내, 척수강내, 자궁내, 정맥내, 지주막하, 피막하, 피하, 경점막 또는 경기관을 비롯한, 일반적으로 주사와 연관된 투여 경로를 지칭한다. 비경구 경로를 통해, 조성물은 주입 또는 주사를 위한 용액 또는 현탁액의 형태로, 또는 동결건조 분말로서 존재할 수 있다. 경장 경로를 통해, 제약 조성물은 정제, 겔 캡슐, 당-코팅된 정제, 시럽, 현탁액, 용액, 분말, 과립, 에멀젼, 제어 방출을 가능케 하는 마이크로구체 또는 나노구체 또는 지질 소포 또는 중합체 소포의 형태일 수 있다. 비경구 경로를 통해, 조성물은 주입 또는 주사를 위한 용액 또는 현탁액의 형태일 수 있다.

본 발명에 따른 제약 조성물은 또한 임의의 제약상 허용되는 담체를 함유할 수 있다. 본원에 사용된 "제약상 허용되는 담체"는 관심 화합물을 하나의 조직, 장기 또는 신체 일부분에서 또 다른 조직, 장기 또는 신체 일부분으로 운반하거나 수송하는데 관여하는 제약상 허용되는 물질, 조성물 또는 비히클을 지칭한다. 예를 들어, 담체는 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질, 또는 이들의 조합일 수 있다. 담체의 각각의 성분은 제제의 다른 성분과 상용성이어야 한다는 점에서 "제약상 허용되는"이어야 한다. 이는 또한 접촉하게 될 수 있는 임의의 조직 또는 장기와 접촉하여 사용하기에 적합하여야 하며, 독성, 자극, 알레르기 반응, 면역원성, 또는 그의 치료 이익보다 과도하게 더 큰 임의의 다른 합병증의 위험을 가지지 않아야 함을 의미한다.

본 발명에 따른 제약 조성물은 또한 경구 투여를 위한 에멀젼 또는 시럽으로 캡슐화, 정제화 또는 제조될 수 있다. 제약상 허용되는 고체 또는 액체 담체를 첨가하여 조성물을 증진시키거나 안정화시키거나, 조성물의 제조를 용이하게 할 수 있다. 액체 담체는 시럽, 땅콩 오일, 올리브 오일, 글리세린, 염수, 알콜 및 물을 포함한다. 고체 담체는 전분, 락토스, 황산칼슘, 2수화물, 테라 알바, 스테아르산마그네슘 또는 스테아르산, 활석, 펙틴, 아카시아, 한천 또는 젤라틴을 포함한다. 담체는 또한 지속 방출 물질, 예컨대 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트를 단독으로 또는 왁스와 함께 포함할 수 있다.

제약 제제는 필요한 경우 정제 형태를 위한 밀링, 혼합, 과립화 및 압축; 또는 경질 젤라틴 캡슐 형태를 위한 밀링, 혼합 및 충전을 포함한 통상의 조제 기술에 따라 제조한다. 액체 담체가 사용되는 경우, 제제는 시럽, 엘릭시르, 에멀젼 또는 수성 또는 비-수성 현탁액의 형태일 것이다. 이러한 액체 제제는 직접 경구 투여되거나 연질 젤라틴 캡슐에 충전될 수 있다.

본 발명에 따른 제약 조성물은 치료 유효량으로 전달될 수 있다. 정확한 치료 유효량은 소정의 대상체에서의 치료 효능의 면에서 가장 효과적인 결과를 생성할 조성물의 양이다. 이러한 양은 치료 화합물의 특성 (활성, 약동학, 약역학 및 생체이용률 포함), 대상체의 생리학적 상태 (연령, 성별, 질환 유형 및 병기, 일반적인 신체 상태, 소정의 투여량에 대한 반응성 및 의약 유형 포함), 제제 내의 제약상 허용되는 담체 또는 담체들의 성질, 및 투여 경로를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 인자에 따라 변할 것이다. 임상 및 약리학적 분야의 통상의 기술자는 일상적인 실험을 통해, 예를 들어 화합물 투여에 대한 대상체의 반응을 모니터링하고 이에 따라 투여량을 조정하여 치료 유효량을 결정할 수 있을 것이다. 추가의 지침에 대해서는, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Gennaro ed. 20th edition, Williams & Wilkins PA, USA) (2000)]을 참조한다.

실시예

하기 실시예는 청구된 발명을 더 잘 예시하기 위해 제공되고, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지는 않는다. 특정 물질이 언급되는 경우에, 이는 단지 예시를 위한 것이고 본 발명을 제한하고자 의도하는 것은 아니다. 통상의 기술자는 독창적인 능력을 행사하지 않으면서 본 발명의 범위에서 벗어나지 않고 등가의 수단 또는 반응물을 개발할 수 있다.

실시예 1

방법

건강한 대조 대상체, IBS 대상체 및 염증성 장 질환 (IBD)을 가지는 대상체를 동원하여 혈청을 수집하였다. 96 웰 플레이트를 재조합 cdtB 및 인간 빈쿨린으로 코팅함으로써 ELISA를 준비하였다. 코팅 후, 정제된 상업용 항-cdtB 및 항-인간-빈쿨린을 사용하여 cdtB 및 빈쿨린에 대한 보정 곡선을 작성하였다. 건강한 대조군, IBS 및 IBD 대상체로부터의 혈청을 웰에 첨가하고 검사하였다. 웰을 60분 동안 인큐베이션한 후, 세척하고, 이차 항체를 적용하였다.

실시예 2

항-CdtB 항체

IBS의 발생에 있어서 CdtB의 역할을 결정하기 위해, 씨. 제주니 81-176으로부터 CdtB에 대한 2종의 항체를 개발하였다. 제1 항체는 단백질 모델링 (아나스펙(AnaSpec), 캘리포니아주 산호세)을 통해 고도로 항원성인 것으로 확인된 18개의 아미노산 잔기 (haAB)로 토끼를 면역화시키는 것에 의하였다. 제2 항체는 거의 전장 CdtB 펩티드 (wAb)로 토끼를 면역화시키는 것을 통해 개발하였다. CdtB에 대한 토끼 혈청의 선택성을 확인하기 위해, 씨. 제주니 81-176의 용해물을 CdtB 단백질에 의한 차단의 존재 및 부재 하에 웨스턴 겔 상에서 구동시켜 28kDa 밴드를 확인하였다. 이러한 확인에 따라, wAb를 나머지 실험에 사용하였다.

실시예 3

급성 씨. 제주니 노출 및 씨. 제주니로 급성으로 감염된 래트에서의 CdtB

본 발명자들의 동물 모델에서 CdtB의 역할을 결정하기 위해, 본 발명자들은 씨. 제주니로 급성으로 감염된 토끼에서 회장 조직을 검사하였다. 래트에 10⁸ cfu/mL의 씨. 제주니 81-176을 위관영양으로 제공하였다. 제2일에, 래트를 안락사시키고, 회장 섹션을 절제하고, 10% 포르말린 (VWR, 펜실베니아주 래드너) 중에 고정시키고, 면역조직화학을 위한 섹션을 준비하였다. 비교를 위해, 씨. 제주니에 대해 나이브한 래트로부터의 회장을 유사하게 준비하였다. 이들 섹션에, wAb 및 면역전 토끼 혈청 (음성 대조군)을 연속 섹션에 적용하였다.

실시예 4

인간 회장에서 항-CdtB 항체 추적

씨. 제주니 감염된 래트 및 대조군 래트 둘 다의 점막 및 신경 요소에 대한 wAb의 관찰된 활성에 기초하여, 인간 회장 섹션을 사용하여 연구를 반복하였다. 결장 악성종양에 대해 회맹장절제술을 받은 인간을 확인하고, 회장의 일부를 탑재하고, 섹션을 wAb 및 면역전 혈청과 함께 인큐베이션하고, 면역조직화학을 사용하여 분자 모방에 대한 지지가 존재하는지 여부를 결정하였다.

실시예 5

분자 모방을 담당하는 장 뉴런 단백질의 확인

장 신경계 및 특히 신경절 및 장 뉴런은 항체가 CdtB (wAb)에 대해 국재화되는 부위이기 때문에, 장 뉴런 줄기 세포 용해물을 수득하였다. 용해물을 CdtB 단백질에 의한 차단의 존재 및 부재 하에 wAb 및 haAB를 사용하여 웨스턴 겔 상에서 구동시켜 wAb가 부착하는 잠재적인 단백질을 확인하였다. 이것은 117kDa에서 확인되었고, 후속해서 비드에 적용되는 wAb를 사용하는 면역침전을 사용하여 관심 단백질을 빼내었다. 이는 --- 단백질을 비드에 결합시킨 다음 2.5x10⁸개의 장 뉴런 줄기 세포의 용해물로부터 결합된 것을 통과시키는 것에 의해 수행하였다. 용출액을 겔 상에서 구동시키고, 밴드가 117kDa의 단백질임을 다시 확인하였다. 이 밴드를 잘라내어 질량 분광분석법을 사용하여 단백질 내용물을 분석하였다.

관심 단백질을 확인한 후, 공초점 현미경을 사용하여 래트 및 인간 둘 다에서의 CdtB wAb에 의한 조직 친화도와 비교하여 조직에서 이 단백질에 대한 항체의 공동국재화를 결정하였다.

실시예 6

씨. 제주니에 노출된 래트에서 CdtB 및 빈쿨린에 대한 항체의 검출

본 발명자들의 감염후 IBS의 확인된 동물 모델에서, 씨. 제주니 81-176에 노출된 수컷 스프라그-돌리 래트는 qPCR에 의한 총 박테리아 계수에 기초하여 소장 박테리아의 과도성장을 발생시켰다. 이러한 표현형은 씨. 제주니에 대한 반복된 노출에 의해 증가되었다. 본 실험에서, 3 군의 래트를 비교하였다. 제1 군은 씨. 제주니에 전혀 노출된 적이 없는 대조군 래트를 포함하였다 (n=20). 래트의 제2 군에서는, 동물에게 아성체일 때 비히클을 위관영양으로 제공하였고, 2개월 후 성체일 때 10⁸ cfu/mL의 씨. 제주니 81-176을 위관영양으로 제공하였다 (J-/A+) (n=50). 제3 군의 동물에게는 아성체일 때 10⁸ cfu/mL의 씨. 제주니 81-176을 위관영양으로 제공하고, 2개월 후 성체일 때 10⁸ cfu/mL의 씨. 제주니 81-176을 위관영양으로 제공하여 다시-노출시켰다 (J+/A+) (n=50). 성체 노출 후, 대변 배양물로부터의 씨. 제주니 클리어런스가 30일만에 달성되었다. 이어서 앞서 보고된 바와 같이 실제로 감염후 상태임을 보장하기 위해, 씨. 제주니의 클리어런스 후 90일째에 래트를 안락사시켰다. 해부 동안, 십이지장, 공장 및 회장 섹션을 포르말린 고정시키고, 조직학을 위해 절제하고, 앞서 보고된 바와 같이 qPCR에 의해 내강 박테리아 정량화를 행하였다. 안락사시, 심장내 천자를 사용하여 혈액을 수집하고, 혈청을 분리하여 보관하였다.

실시예 7

ELISA 방법론

BBS 중 100 μl/웰 0.125 μg/ml 단백질 (피어스(Pierce))을 사용하여 항원 (전체 CdtB 또는 빈쿨린 (노보(Novo), 뉴저지주 쇼트 힐스))을 습식 조건 하에 밤새 4℃에서 96 웰 플레이트에 결합시켰다. 웰을 0.05%PBS-T로 세척하고, 습식 박스 내에서 1시간 동안 실온에서 120 μl/웰 0.5% BSA/PBS로 차단하였다. 샘플 (래트 혈청, 인간 혈청) 뿐만 아니라 대조군: wAB, 빈쿨린 Ab (산타 크루즈(Santa Cruz), 캘리포니아주 산타 크루즈)를 0.5% BSA/PBS 중의 1:100 희석액으로 습식 박스 내에서 2시간 동안 실온에서 첨가하였다. HRP와 접합된 이차 항체, 인간, 래트 또는 염소 IgG (잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch), 펜실베니아주 웨스트 그로브)를 0.5% BSA/PBS 중의 1:1000 희석액으로 습식 박스 내에서 30분 동안 실온에서 100 μl/웰로 첨가하였다. 플레이트를 0.05% PBS-T로 세척한 후, 기질 용액 (잭슨 이뮤노리서치, 펜실베니아주 웨스트 그로브)을 100μl/웰로 첨가하고, 하기 나타낸 바와 같이 래트 또는 인간 혈청의 적용 후 플레이트 판독기에서 판독하였다 (바이오테크 시너지 에이치티(BioTek Synergy HT)).

실시예 8

캄필로박터 감염 및 과도성장이 있는 래트 및 없는 래트에서의 ELISA

각각의 3개의 군의 래트로부터의 혈청을 검정하였다: 비감염된 것, 성체일 때 1회 캄필로박터 노출, 및 이중 감염된 미성숙체 및 성체. 생성된 OD를 3개의 군 사이에서 뿐만 아니라 앞서 공개된 바와 같이 소장 박테리아 과도성장 (평균의 >2 SD 초과로 정의됨)이 있는 것과 없는 것으로 분리된 래트와 비교하였다. 마지막으로, 혈청 항체의 수준을 회장 내 박테리아의 정도와 비교하여 상관관계 곡선을 작성하였다.

실시예 9

IBS를 가지는 인간에서의 ELISA

3개의 군의 인간을 사용하여 항-CdtB 및 항-빈쿨린 항체의 역가를 평가하였다. 제1 군은 건강한 대조군의 군이다. 건강한 대조 대상체는 설문지 상 변경된 장 기능이 없고, 복부팽창이 없고, 복통이 없는 것으로 보고된 대상체로서 정의되었다 (특정 증상에 대한 100mm VAS 척도에서 각각 10mm 미만). 제2 군은 롬 III 기준에 기초하여 설사 우세형 IBS 대상체 군이다. 제3 군은 10명의 크론병 대상체 및 10명의 궤양성 결장염 대상체로 구성되었다. 래트 연구와 유사하게 ELISA를 설정하였다. 항-CdtB 및 항-빈쿨린의 역가를 3개의 군 사이에서 비교하였다. 또한, 항-CdtB 및 항-빈쿨린 사이에 상관관계를 확인하였다. 마지막으로, IBS를 가지는 인간에서 비-특이적 결합에 대한 대조군을 결정하기 위해 2종의 비관련 단백질, c-kit 및 라트로필린을 ELISA에서 사용하였다.

실시예 10

항-cdtB 항체, 신경 마커 및 빈쿨린의 면역형광, 공초점 영상화

면역조직화학에서 특히 신경절주위 영역 및 카할의 심부근 신경총 간질 세포 (DMP-ICC)에서 wAb에 의한 뉴런 결합의 증거가 존재하기 때문에, 모두 염소에서 생성된 항-c-kit (R&D 시스템즈(R&D Systems), 미네소타주 미네아폴리스), S-100 (뉴런) (피어스 바이오테크놀로지(Pierce Biotechnology), 일리노이주 록포드) 및 PGP 9.5 (신경절) (피어스 바이오테크놀로지, 일리노이주 록포드) 및 항-빈쿨린 (산타 크루즈, 캘리포니아주 산타 크루즈)에 대한 wAb의 국재화와 비교하여 공동국재화 실험에 착수하였다. 비교를 위해 래트와 인간으로부터의 회장의 연속 섹션에서 공초점 현미경 영상을 취하였다.

간략하게, 급성으로 씨. 제주니에 감염된 래트 회장 및 비감염된 래트 회장의 슬라이드를 탈파라핀화하고, 크실렌 및 에탄올 중에서 순차적으로 세척한 후, 항원을 회수하고 혈청을 차단하였다. 일차 항체를 첨가하고 (토끼에서 생성된 1:200 wAb 플러스 염소에서 생성된 1:100 c-kit, S100, PGP 9.5, 또는 빈쿨린 항체), 실온에서 습식 조건에서 인큐베이션하였다. 일차 항체로 처리된 슬라이드를 PBS 중에서 세척하고, 1:30 DAPI (인비트로젠(Invitrogen), 뉴욕주 그랜드 아일랜드) 및 이차 항체: c-kit, S100, PGP 9.5 또는 빈쿨린 항체의 경우에 알렉사 레드(Alexa red) 568 항-염소 (인비트로젠, 뉴욕주 그랜드 아일랜드) (1:300) 및 wAB의 경우에 알렉사 그린(Alexa green) 488 항-토끼 (인비트로젠, 뉴욕주 그랜드 아일랜드) (1:300)와 함께 인큐베이션하였다. 암소의 습식 조건에서 인큐베이션한 후, 프로롱 골드(Prolong Gold) (인비트로젠, 뉴욕주 그랜드 아일랜드)를 첨가하고, 공초점 현미경 (라이카(Leica) TCS SP5 X 현미경, 라이카 SCN400 F 디지털 슬라이드 스캐너) 하에 관찰하면서 섹션을 글라스로 덮었다.

실시예 11

SIBO가 있는 래트 및 없는 래트에서의 빈쿨린의 유전자 발현

씨. 제주니 감염 후 3개월째의 동물 및 대조군의 비감염된 동물로부터 래트 회장 조직 RNA를 추출하고 (퀴아젠(Qiagen)), 아이스크립트(iScript) 역전사 (바이오 래드(Bio Rad), 캘리포니아주 허큘레스)에 의해 cDNA로 전환시켰다. 래트 빈쿨린에 특이적인 프라이머를 사용하여 정량적 PCR을 수행하고, 베타 액틴의 유전자 발현으로 정규화하였다.

프라이머

¹ 참고문헌: Qian-Qian Liang et al., (2010) Herb Formula "Fufangqishe-Pill" Prevents Upright Posture-Induced Intervertebral Disc Degeneration at the Lumbar in Rats. J Pharmacol Sci 113: 23 - 31)

² 참고문헌: Zhang et al., Proteome Science 2010 8:12 (doi:10.1186/1477-5956-8-12)

실시예 12

통계적 분석

군들 사이의 항-CdtB 및 항-빈쿨린 수준의 비교를 비-파라미터 만-휘트니(Mann-Whitney) U 검정과 비교하였다. 박테리아 계수 및 항체 역가 사이의 상관관계 곡선을 피어슨(Pearson) 보정에 의해 비교하였다. 인간에서 항-CdtB 및 항-빈쿨린을 비교하기 위해 피어슨 보정을 또한 사용하였다. 양성 및 음성 ELISA의 결정에 있어서 카이-스퀘어(Chi-square)를 수행하였다. 소장 균총의 콜로니 계수에 대한 ELISA 비교를 위해, 피어슨 등급 상관관계를 사용하였다. 마지막으로, IBS를 진단하는 방법으로서 항-CdtB (>2.0 OD) 및 항-빈쿨린 (>1.2 OD)에 대한 역치를 대조군 및 염증성 장 질환을 가지는 대상체와 비교하였다. 시험 특징, 예컨대 감수성 및 특이성을 이들 역치에 기초하여 결정하였다. P<0.05인 경우에 군들 사이의 차이가 유의한 것으로 결정하였고, 데이터는 평균±SD로 표현하였다.

실시예 13

결과

19명의 건강한 대조군, 20명의 IBD 대상체 및 42명의 IBS 대상체가 본 연구에 참여하였다. 집단통계는 군들 사이에 유사하였다. 항-cdtB의 검출을 위해 광학 밀도 ≥2.0을 양성으로 설정하고, 항-인간 빈쿨린 항체의 검출을 위해 OD를 ≥1.2로 설정하였다. 이들 컷오프에 기초하여 항-빈쿨린 또는 항-cdtB를 사용하는 것은 IBD 또는 건강한 대조군에 비하여 IBS를 진단하는데 성공적이었다 (표 1a). 항-cdtB가 항-빈쿨린이기 때문에, 모든 대상체에서의 혈청 항-cdtB의 역가는 항-인간 빈쿨린에 상응할 것으로 예상되었고, 이는 사실인 것으로 밝혀졌다 (R=0.58, P<0.001).

<표 1a>

실시예 14

항-CdtB 항체의 확인

항-CdtB 항체를 확인하기 위해, 정제된 CdtB를 사용하는 웨스턴 블롯을 준비하였다. 전체 CdtB (wAb)에 대해 생성된 항체 (도 1a) 및 CdtB의 고항원성 18개의 잔기 서열 (haAb)에 대한 항체 (도 1b) 둘 다를 사용하는 경우에, 둘 다 CdtB를 활성 밴드로서 27kDa (CdtB의 분자량)에서 인식하였다. 토끼 면역전 혈청은 CdtB를 인식하지 않았고, 펩티드에 의한 haAb의 차단은 어떠한 가시적 밴드도 생성하지 않았다 (도 1c).

항체가 씨. 제주니에서 CdtB를 인식하는지 확인하기 위해, 또 다른 웨스턴 블롯을 준비하여 씨. 제주니 81-176의 용해물과 함께 구동시켰다. 이는 wAb (도 2a) 및 haAb (도 2b)가 CdtB를 활성 밴드로서 27kDa (CdtB의 분자량)에서 인식함을 입증하였다. 펩티드에 의한 haAb의 차단은 27kDa에서 밴드가 검출되지 않게 하였다 (도 2c).

실시예 15

씨. 제주니에 노출된 래트 및 비노출된 래트에서의 wAb

2개의 군의 래트를 본 연구에서 면역염색을 사용하여 비교하였다. 도 3a 및 b에서, 살아있는 씨. 제주니 81-176을 위관영양으로 제공한 후 2일째에 래트 회장을 검사하였다. 면역전 혈청은 어떠한 염색도 생성하지 않았다. 활성 감염 씨. 제주니 81-176에 노출된 래트는 점막 표면 및 음와를 포함하여 wAb에 대해 광범위한 염색을 나타내었다. 가장 많이 확인된 심부 조직 성분은 장관근 신경절, 카할 간질 세포 및 다른 신경 구조였다. 면역형광 기술에 의해 동일한 국재화가 관찰되었다 (도 4a 및 b). 그러나, 씨. 제주니에 전혀 노출된 적이 없는 래트에 대한 면역조직화학 (도 5a 및 b) 및 면역형광 (도 6a 및 b) 둘 다에 의해 동일한 패턴이 관찰되었다. 이는 CdtB에 대한 항체가 장 신경 요소 영역에 가장 우세하게 위치하는 천연 래트 단백질과 교차 반응함을 시사하며, 이는 분자 모방을 시사한다.

실시예 16

인간 회장에서 항-CdtB의 면역조직화학 국재화

면역조직화학에서 인간 전층 회장 조직을 사용하는 경우에, wAb는 다시 장근 신경총의 신경 요소에 국재화되는 것으로 보였다 (도 7a 및 b). 이들 대상체는 IBS 대상체가 아니기 때문에, CdtB에 대한 항체는 천연 단백질에 결합하는 것으로 추정되었다.

실시예 17

항-CdtB의 다른 신경 마커와의 공동국재화

장 신경계의 성분에 대한 모방의 특이성을 입증하기 위해, 3개의 항체 마커 (장 뉴런의 경우에 S-100, 신경절의 경우에 PGP 9.5 및 ICC의 경우에 항-c-kit)를 wAb 항-CdtB 항체와 비교하였다. 대조군 래트를 비롯한 모든 군의 래트에서의 연구로부터, 항-CdtB는 ICC (c-kit와 함께) (도 8a-c), 뉴런 (S-100과 함께) (도 9a-c) 둘 다에 대해 공동국재화되었다. 공동국재화이기는 하지만, c-kit에 대한 염색은 세포 막 염색이었고 S-100은 핵 염색이었다. 항-CdtB wAb는 장 뉴런 세포 (ICC 및 뉴런 둘 다)의 시토졸 성분에 국재화되는 것으로 보였다.

실시예 18

인간에서 분자 모방의 확인

항-CdtB wAb가 인간 소장에서 분자 모방을 나타낼 가능성을 확인하기 위해, 우측 결장반절제술 시편으로부터의 회장의 전층 섹션을 탑재하고, 상기 래트에서와 같이 염색하였다. 래트와 유사하게, c-kit, S-100 (도 10a-c) 및 PGP 9.5 (도 11a-c)와 함께 공동국재화가 관찰되었다.

실시예 19

장 뉴런의 시토졸 단백질에 대한 분자 모방

장 뉴런 줄기 세포의 용해물을 사용하는 경우에, wAb 항-CdtB 항체는 117kDa에서 밴드를 나타내었다 (도 12a 및 c). 용해물의 분획화에서, 117kDa 밴드는 용해물의 시토졸 분획에 위치하였다 (도 12a). 항체를 차단하기 위해 전체 CdtB를 사용한 차단 실험은 이러한 117kDa 단백질에 대한 결합을 차단하였다 (도 12a). 질량 분광분석법은 이러한 밴드에서의 단백질 후보물을 빈쿨린으로 확인시켜 주었다. 인간 조직에서, 공초점 현미경은 빈쿨린과 wAb의 공동국재화를 나타내었다 (도 13a-c).

실시예 20

IBS의 래트 모델에서 생체내 항-CdtB의 입증

감염후 IBS의 표현형에서 CdtB에 대한 항체의 역할을 입증하기 위해, 씨. 제주니 항-CdtB를 사용하여 ELISA를 전개하였다. 본 연구에서, 대조군 래트, 씨. 제주니에 1회 노출된 래트 및 2개월 차이로 씨. 제주니에 2회 노출된 래트를 시험하였고, 소장 장 균총의 PCR에 의해 소장 박테리아 과도성장의 결과를 비교하였다. 도 14에서, 항-CdtB는 씨. 제주니에 의한 이전 감염에 의존할 뿐만 아니라 소장 박테리아 과도성장을 발생시키는 것이 분명하였다. 씨. 제주니를 제공받은 래트 중에서, 박테리아가 과도성장하는 것은 씨. 제주니에 의한 감염의 횟수와 관계없이 박테리아의 과도성장이 없는 것보다 더 높은 항-CdtB의 역가를 가졌다. 이것은 순환 항-CdtB와, 총 박테리아의 qPCR에 기초한 보다 높은 정도의 소장 박테리아 과도성장 사이의 유의한 상관관계에 의해 추가로 입증되었다 (도 15).

실시예 21

감염후 IBS를 가지는 인간에서 항-CdtB 및 항-빈쿨린의 입증

본 마지막 실험에서, 43명의 IBS를 가지는 인간, 20명의 건강한 대상체 및 20명의 염증성 장 질환을 가지는 대상체 (10명은 크론병을 가지는 대상체이고 10명은 궤양성 결장염을 가지는 대상체)로부터 혈청을 수집하였다. 절대값을 사용하는 경우에, IBS를 가지는 대상체는 IBD 또는 대조군과 비교하여 더 높은 항-CdtB 항체 역가를 가졌다 (도 16). IBS 및 감염후 IBS의 진단으로서 OD>2를 사용하는 경우에, 이 역치는 염증성 장 질환과 비교하여 IBS를 85.7%의 감수성 및 67.2%의 특이성으로 확인시켜줄 수 있었다 (표 1b).

<표 1b>

ELISA 기질로서 빈쿨린을 사용하는 경우에, 웰에 면역전 혈청을 적용하는 것은 매우 낮은 반응을 생성하였다. 그러나, 웰에의 wAb의 적용은 격렬한 반응을 생성하였다. 이는 항-CdtAb가 ELISA에서 빈쿨린과 강력하게 반응함을 시사한다 (도 17). 3개의 인간 군으로부터의 혈청을 사용하여 빈쿨린에 대한 ELISA 시험을 수행하는 경우에, 다시 IBS 대상체에서 항-빈쿨린의 유의하게 더 높은 역가가 존재하였다.

마지막으로, 라트로필린 또는 c-kit를 사용한 ELISA는 IBS, 대조군 및 염증성 장 질환을 가지는 대상체 사이에 어떠한 차이도 없음을 나타내었고, 이는 차이가 비-특이적 결합으로 인한 것이 아님을 시사한다 (데이터는 제시되지 않음).

실시예 22

감염후 IBS의 래트 모델에서 세포치사 팽창 독소 B에 대한 순환 항체는 소장 박테리아 과도성장의 발생과 상관관계가 있음

감염후 IBS의 래트 모델에서 혈청 항-CdtB 항체의 수준을 검사하고, SIBO의 발생과 상호관련시켰다.

방법: 수컷 스프라그-돌리 래트 (n=100)를 갓 태어난 것으로서 수득하고, 3개의 군으로 무작위화하였다. 제1 군에는 씨. 제주니 81-176 (10⁸cfu/mL)을 아성체 및 2개월 후 성체일 때 위관영양으로 제공하였다 (J+/A+). 제2 군에는 씨. 제주니를 성체일 때만 위관영양으로 제공하였다 (J-/A+). 제3 군은 씨. 제주니에 전혀 노출시키지 않았다 (대조군). 성체 감염 후 3개월째에 모든 래트를 안락사시켰다. 안락사 후, 앞서 기재된 바와 같이 (Chatterjee, et al.) 회장, 공장 및 십이지장 절편을 라이게이션하고 떼어내었다. 각각의 장 절편으로부터, 장 내용물로부터 DNA를 추출하고, 보편적인 박테리아 프라이머를 사용하는 qPCR을 사용하여 SIBO의 존재 또는 부재를 결정하였다. SIBO는 각각의 절편에 대한 대조군의 평균보다 2 표준 편차를 초과하여 과량인 박테리아 계수로 정의된다. 안락사 시에, 혈액을 채취하고 혈청을 단리하였다. 96 웰 플레이트를 CdtB로 코팅하고, 래트 혈청을 첨가하고, 90분 동안 인큐베이션하였다. 웰을 세척하고, 형광 이차 항체와 함께 인큐베이션하고, 플레이트 판독기 상에서 판독하였다.

결과: 대조군 래트의 혈청에서 항-CdtB의 검출을 위한 ELISA는 1.27±0.15의 광학 밀도 (OD)를 나타내었다. 씨. 제주니에 노출된 모든 래트는 1.73±0.12 (P<0.05)의 더 큰 OD를 가졌다. J-/A+ 군에서, 씨. 제주니에의 1회 노출은 26%의 래트에서 SIBO를 야기하였다. J+/A+ 이중 노출된 래트에서, SIBO는 46% (P<0.05)에서 관찰되었다. 씨. 제주니에 1회 (1.79±0.31) 또는 이중 노출 (2.02±0.22)되었는지와는 관계없이 래트가 SIBO를 가질 경우에 항-CdtB는 더 높았다. SIBO를 갖지 않은 래트는 역가가 <1.7이었다. 회장 내 박테리아 수준의 ELISA 관찰치에 대한 플롯팅은 박테리아 수준과 항-CdtB 사이의 상관관계를 입증하였다 (R=0.3, P<0.05).

결론: CdtB에 대한 항체는 씨. 제주니에의 노출 후에 발생하지만, 씨. 제주니에 대한 노출 횟수보다 SIBO의 발생과 더 관련된 패턴으로 발생하는 것으로 보인다. ICC 및 신경절에 대한 친화도에 기초하여, 본 발명자들은 이들 항체가 아마도 SIBO를 야기하는 장 운동 기능에 영향을 미치는 것에 의해 IBS의 병리생리상태에 중요한 것으로 생각한다.

실시예 23

세포치사 팽창 독소 B에 대한 항체 및 인간 빈쿨린에 대한 자가-항체는 IBS 대상체에서 상승함

감염후 IBS의 동물 모델에서, CdtB에 대한 항체는 분자 모방/자가면역의 과정을 통해 카할 간질 세포 (ICC) 및 신경절을 비롯한 장 벽의 신경 요소에 결합한다. 이러한 모방이 일어나는 이들 신경 상의 단백질은 빈쿨린인 것으로 발견되었고, 빈쿨린에 대한 항체는 래트에서 SIBO를 예고한다. 본 발명자들은 IBS 및 염증성 장 질환 (IBD)을 가지는 대상체의 혈청에서 항-CdtB 및 항-빈쿨린 항체의 역가를 결정하기 위해 인간에 대한 이들 항체 시험을 해석하였다.

방법: GI 운동 클리닉(GI Motility clinic)으로부터 롬 III 기준을 충족시키는 계속적 IBS 대상체를 동원하였다 (n=45). 또한, 삼차 치료 IBD 클리닉으로부터 30명의 IBD를 가지는 대상체를 동원하였다. 마지막으로, 음성 증상 설문지에 기초하여 20명의 건강한 대조군을 확인하였다. 모든 대상체는 동의하였고, 혈청 샘플을 수득하였다. 96 웰 플레이트를 웰당 0.4μg의 재조합 빈쿨린 또는 0.4μg/mL의 정제된 CdtB로 코팅하여 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA)을 생성하였다. 각각의 대상체로부터의 혈청을 웰에 첨가하고, 90분 동안 인큐베이션하였다. 웰을 세척한 다음 이차 항체를 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트 판독기를 사용하여 광학 밀도 (OD) 측정치를 결정하였다.

결과: CdtB로 코팅된 플레이트에서, IBS 혈청에 대한 평균 OD는 1.89±0.12였다. 이는 IBD를 가지는 대상체 (1.35±0.22) (P<0.05) 또는 건강한 대조군 (1.46±0.20) (P<0.05)에 대한 것보다 유의하게 더 높았다. 빈쿨린으로 코팅된 플레이트에서, IBS 혈청에 대한 평균 OD는 0.53±0.07이었다. 이는 IBD를 가지는 대상체 (0.21±0.09) (P<0.05)에 대한 것보다 유의하게 더 높았다. 건강한 대조군 (0.31±0.10) (P=0.11)으로부터의 차이에 대한 추세가 존재하였다. IBS-C 또는 IBS-D 사이에는 항체에 대해 어떠한 차이도 존재하지 않았다.

결론: 항-CdtB 및 자가면역 항-빈쿨린 항체는 둘 다 IBS 대상체에서 검출가능하였고, 대조군 및 IBD와 비교하여 IBS에서 상승된 것으로 관찰되었다. 항-CdtB 및 항-빈쿨린의 검출은 IBS의 진단 및 병리생리상태에 대한 새로운 단서를 시사한다. 이는 급성 위장염을 IBS에서의 자가면역 과정과 연관짓는 첫번째 연구이다.

실시예 24

분자 모방은 인간에서 빈쿨린에 대한 자가면역을 야기함:

IBS의 병리생리상태에서의 연관 상실

본 발명자들은 항-CdtB가 결합하는 인간 항원을 조사하였다.

방법: 먼저, 비-IBS 인간 전층 회장 조직을 (우측 결장반절제술로부터) 수득하였다. 회장 섹션을 CdtB에 대한 정제된 토끼 항체와 함께 인큐베이션하고, 세척하고, 형광 이차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 항-c-kit (ICC에 특이적), S-100 (뉴런에 특이적) 및 PGP 9.5 (신경절에 특이적)를 사용하여 공동국재화 연구를 수행하였다. 다음으로, 항-CdtB 칼럼을 생성하고 이를 통해 인간 장 뉴런 세포의 용해물 (에모리 대학교(Emory University))을 통과시켜 면역침전을 수행하였다. 항-CdtB 부착 단백질을 용리시키고, 2회의 웨스턴 블롯을 수행하였다. 하나는 항-CdtB와 함께 인큐베이션하고, 다른 것은 CdtB 단백질 (차단 펩티드)과 예비인큐베이션한 항-CdtB와 인큐베이션하였다. 밴드가 117kDa에서 확인되었고, 이를 정제하고, 질량 분광분석법에 의해 인간 빈쿨린으로서 확인하였다. 상업용 빈쿨린의 0.4 ug 분취액을 96 웰 플레이트에 웰당 코팅하였다. 항-CdtB를 일련의 웰에 첨가하고, 항-CdtB를 전체 CdtB 단백질 (차단 펩티드)과 서로 혼합하였다.

결과: 전층 인간 회장 조직을 사용하는 경우에, 항-CdtB는 ICC 및 신경절에 대해 특이적이었다. 이는 항-CdtB의 항-c-kit, PGP 9.5 및 S-100와의 공동국재화에 기초하였다 (도면 참조). 따라서, 항-CdtB는 ICC 및 신경절 상의 인간 단백질과 상호작용하는 것으로 보였다. 면역침전에 기초하여, 단백질 밴드는 117kDa에서 확인되었다. 질량 분광분석법을 사용하는 경우에, 이 단백질은 인간 빈쿨린으로서 확인되었다. 후속하여, 인간 빈쿨린을 상업적으로 수득하였고, ELISA에 의하면 항-CdtB는 인간 빈쿨린에 대해서는 높은 친화도를 가졌지만 대조군 펩티드에 대해서는 그렇지 않았다. 빈쿨린에 대한 결합은 CdtB 펩티드에 의해 차단되었다.

결론: 감염후 IBS의 병리생리상태에서, 대상체는 CdtB에 대한 항체를 발생하였고, 이는 신경 세포 이동 및 부착에 있어서 중요한 세포 막 세포골격 단백질인 빈쿨린에 대한 분자 모방을 통해 교차 반응성을 가졌다. 감염후 래트에서의 감소된 빈쿨린 수준의 본 발명자들의 최신 데이터를 감안하면, 빈쿨린에 대한 분자 모방은 ICC 및 신경절에 대한 영향을 통한 SIBO 및 IBS의 유발에 중요할 수 있다.

실시예 25

빈쿨린 발현은 감염후 IBS의 동물 모델에서 감소됨

본 발명자들은 감염후 래트 모델에서 빈쿨린 발현을 평가하였다.

방법: 스프라그-돌리 래트를 3개의 군으로 나누었다. 군 1 래트는 대조군으로서 제공되었다 (n=20). 군 2 래트에는 성체일 때 10⁸cfu/mL 씨. 제주니를 위관영양으로 제공하였다 (J-/A+). 군 3 래트에는 아성체일 때 씨. 제주니를 위관영양으로 제공하고, 다시 2개월 후 성체일 때 두번째로 제공하였다. 감염된 래트의 경우에, 씨. 제주니의 클리어런스 후 3개월째에 안락사시켰다. 안락사시, 소장 섹션 (십이지장, 공장 및 회장)을 라이게이션하였고, 앞서 기재된 바와 같이 qPCR에 의한 총 박테리아 함량을 충족시켰다. 또한 중간 소장의 절편을 수득하고, 그 후 RNA를 보유하였다. 균질화, RNA의 추출 및 cDNA로의 전환 후, qPCR을 사용하여 β-액틴에 대한 정규화 이후 장 벽 내의 빈쿨린의 수준을 결정하였다. 이러한 동물 모델에서 씨. 제주니 감염의 횟수 및 SIBO의 존재 또는 부재에 기초하여 빈쿨린의 수준을 평가하였다.

결과: 정상 대상체의 소장 절편에서 정상 박테리아 수준에 기초하여, SIBO는 씨. 제주니에 1회 및 이중 노출된 래트의 26% 및 46%에서 확인되었다. 전반적으로, 빈쿨린 발현은 대조군 래트 (0.087±0.0053)와 비교하여 씨. 제주니에 노출된 래트의 소장 (0.058±0.0053)에서 감소되었다 (P<0.001). 또한, 1회 노출과 비교하여 씨. 제주니에 2회 노출된 경우에 더 큰 빈쿨린 감소가 존재하였다 (도면 참조) (P<0.0001). SIBO가 있는 래트에서 더 낮은 빈쿨린 발현 추세가 또한 존재하였다 (P=0.05).

결론: 빈쿨린 발현은 씨. 제주니에 대한 노출에 의해 감소된다. 이러한 감소는 씨. 제주니에 대한 노출 횟수에 의존적이며, 씨. 제주니에 2회 노출된 래트에서 더 크게 감소하였다. 마지막으로, SIBO는 더 낮은 빈쿨린 발현 수준과 연관이 있다. 빈쿨린은 감염후 IBS의 발병기전에 중요할 수 있다.

실시예 26

롬 양성 IBS를 가지는 대상체 (18-65세)를 세다르스-신나이　메디칼　센터(Cedars-Sinai Medical Center) 및 베스 이스라엘 디코니스 메디칼 센터(Beth Israel Deaconess Medical Center)로부터 동원하였다. 대상체에 대해 증상 및 집단통계를 평가한 후 혈청을 수집하였다. 동반 GI 질환, 이전 GI 수술, 유착, 불안정형 갑상선 질환, 당뇨병, 또는 HIV가 있을 경우에 이러한 대상체는 제외시켰다. 완성된 GI 증상 설문지에 기초하여 건강한 대조군을 동원하였다. 이러한 설문지 상, 대상체는 0-100 VAS에 포함되는 복부팽창, 설사, 복통, 및 변비에 대해 <10로 마킹되어야 한다. 염증성 장 질환을 가지는 대상체는 전문적 삼차 치료 메디칼 센터로부터 동원하였다. 크론병 또는 궤양성 결장염을 가지는 대상체는 과거 생물학 요법 및 현재 프레드니손 사용이 있는 경우에 제외시켰다. 모든 3개의 군으로부터의 혈청을 사용하여 ELISA를 수행하여 인간 재조합 빈쿨린에 대한 항체를 결정하였다.

총 165명의 IBS, 30명의 IBD 및 26명의 건강한 대조 대상체에서 평가하였다. 집단통계는 군들 사이에 유사하였다. 전반적으로, IBS는 ELISA에서 IBD 및 건강한 대상체와 비교하여 항-빈쿨린 항체에 대해 유의하게 더 큰 광학 밀도를 가졌다. (도 19). IBS 동원집단에 대한 2가지의 주요 중심을 비교하면, 양쪽 중심으로부터의 결과는 유사하게 비정상적이었다 (P=NS). 흥미롭게도, 급성 위장염의 병력을 가지는 대상체는 훨씬 더 높은 수준의 항체가 관찰되었다 (P<0.05).

항-빈쿨린 항체는 비-IBS와 비교하여 IBS에서 상승되었다. 이는 급성 위장염 침전 분자 모방 및 자가면역을 통한 IBS의 혈청 및 병리생리학적 메카니즘에 기초한, IBS에 대한 첫번째 진단 시험이다.

참고문헌

본 발명의 다양한 실시양태를 상기 상세한 설명에 기재하였다. 이들 기재는 상기 실시양태를 직접적으로 기재하였지만, 통상의 기술자는 본원에 제시되고 기재된 구체적인 실시양태에 대한 변형 및/또는 변경을 생각해낼 수 있을 것으로 이해된다. 이러한 기재의 범위 내에 있는 이러한 임의의 변형 또는 변경도 마찬가지로 그 안에 포함되는 것으로 의도된다. 구체적으로 언급되지 않는 한, 본 발명자들은 명세서 및 청구범위 내의 단어 및 어구가 적용가능한 분야(들)의 통상의 기술자들에게 통상적이고 익숙한 의미를 제공하는 것으로 의도한다.

본원의 출원시 본 출원인에게 공지된 본 발명의 다양한 실시양태를 상기 기재하였고 이는 예시 및 설명의 목적을 위한 것이다. 본 발명의 기재는 총망라한 것이 아니며 또한 개시된 정확한 형태로 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니고, 많은 변형 및 변경이 상기 교시의 관점에서 가능하다. 기재된 실시양태는 본 발명의 원리 및 그의 실질적인 적용을 설명하고 통상의 기술자가 고려되는 특정한 용도에 적합한 다양한 변형으로 및 다양한 실시양태에서 본 발명을 이용하는 것을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명은 본 발명을 수행하기 위해 개시된 특정한 실시양태로 제한되지 않는 것으로 의도된다.

본 발명의 특정한 실시양태를 제시하고 기재하였지만, 본원의 교시에 기초하여 변화 및 변형이 본 발명 및 본 발명의 더 넓은 측면으로부터 벗어나지 않고 이루어질 수 있고, 따라서 첨부된 청구범위가 본 발명의 진정한 취지 및 범위 내에 있는 것으로서 모든 이러한 변화 및 변형이 청구범위의 범위 내에 포괄된다는 것이 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 통상의 기술자는, 본원에 사용된 용어가 일반적으로 "개방된" 용어 (예를 들어, 용어 "포함하는"은 "포함하나 이에 제한되지는 않는"으로 해석되어야 하고, 용어 "갖는"은 "적어도 갖는"으로 해석되어야 하고, 용어 "포함하다"는 "포함하나 이에 제한되지는 않는다"로 해석되어야 하는 등)로서 의도됨을 이해할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> CEDARS-SINAI MEDICAL CENTER PIMENTEL, Mark CHANG, Christopher <120> DIAGNOSIS AND TREATMENT OF MOTILITY DISORDERS OF THE GUT AND BLADDER, AND OF FIBROMYALGIA <130> 065472-000379WO00 <150> 61/701,923 <151> 2012-09-17 <150> 61/762,632 <151> 2013-02-08 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1066 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Pro Val Phe His Thr Arg Thr Ile Glu Ser Ile Leu Glu Pro Val 1 5 10 15 Ala Gln Gln Ile Ser His Leu Val Ile Met His Glu Glu Gly Glu Val 20 25 30 Asp Gly Lys Ala Ile Pro Asp Leu Thr Ala Pro Val Ala Ala Val Gln 35 40 45 Ala Ala Val Ser Asn Leu Val Arg Val Gly Lys Glu Thr Val Gln Thr 50 55 60 Thr Glu Asp Gln Ile Leu Lys Arg Asp Met Pro Pro Ala Phe Ile Lys 65 70 75 80 Val Glu Asn Ala Cys Thr Lys Leu Val Gln Ala Ala Gln Met Leu Gln 85 90 95 Ser Asp Pro Tyr Ser Val Pro Ala Arg Asp Tyr Leu Ile Asp Gly Ser 100 105 110 Arg Gly Ile Leu Ser Gly Thr Ser Asp Leu Leu Leu Thr Phe Asp Glu 115 120 125 Ala Glu Val Arg Lys Ile Ile Arg Val Cys 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Ala Asp Leu Ala Ala 545 550 555 560 Arg Gly Glu Gly Glu Ser Pro Gln Ala Arg Ala Leu Ala Ser Gln Leu 565 570 575 Gln Asp Ser Leu Lys Asp Leu Lys Ala Arg Met Gln Glu Ala Met Thr 580 585 590 Gln Glu Val Ser Asp Val Phe Ser Asp Thr Thr Thr Pro Ile Lys Leu 595 600 605 Leu Ala Val Ala Ala Thr Ala Pro Pro Asp Ala Pro Asn Arg Glu Glu 610 615 620 Val Phe Asp Glu Arg Ala Ala Asn Phe Glu Asn His Ser Gly Lys Leu 625 630 635 640 Gly Ala Thr Ala Glu Lys Ala Ala Ala Val Gly Thr Ala Asn Lys Ser 645 650 655 Thr Val Glu Gly Ile Gln Ala Ser Val Lys Thr Ala Arg Glu Leu Thr 660 665 670 Pro Gln Val Val Ser Ala Ala Arg Ile Leu Leu Arg Asn Pro Gly Asn 675 680 685 Gln Ala Ala Tyr Glu His Phe Glu Thr Met Lys Asn Gln Trp Ile Asp 690 695 700 Asn Val Glu Lys Met Thr Gly Leu Val Asp Glu Ala Ile Asp Thr Lys 705 710 715 720 Ser Leu Leu Asp Ala Ser Glu Glu Ala Ile Lys Lys Asp Leu Asp Lys 725 730 735 Cys Lys Val Ala Met Ala Asn Ile Gln Pro Gln Met Leu Val Ala Gly 740 745 750 Ala Thr Ser Ile Ala Arg Arg Ala Asn Arg Ile Leu Leu Val Ala Lys 755 760 765 Arg Glu Val Glu Asn Ser Glu Asp Pro Lys Phe Arg Glu Ala Val Lys 770 775 780 Ala Ala Ser Asp Glu Leu Ser Lys Thr Ile Ser Pro Met Val Met Asp 785 790 795 800 Ala Lys Ala Val Ala Gly Asn Ile Ser Asp Pro Gly Leu Gln Lys Ser 805 810 815 Phe Leu Asp Ser Gly Tyr Arg Ile Leu Gly Ala Val Ala Lys Val Arg 820 825 830 Glu Ala Phe Gln Pro Gln Glu Pro Asp Phe Pro Pro Pro Pro Pro Asp 835 840 845 Leu Glu Gln Leu Arg Leu Thr Asp Glu Leu Ala Pro Pro Lys Pro Pro 850 855 860 Leu Pro Glu Gly Glu Val Pro Pro Pro Arg Pro Pro Pro Pro Glu Glu 865 870 875 880 Lys Asp Glu Glu Phe Pro Glu Gln Lys Ala Gly Glu Val Ile Asn Gln 885 890 895 Pro Met Met Met Ala Ala Arg Gln Leu His Asp Glu Ala Arg Lys Trp 900 905 910 Ser Ser Lys Gly Asn Asp Ile Ile Ala Ala Ala Lys Arg Met Ala Leu 915 920 925 Leu Met Ala Glu Met Ser Arg Leu Val Arg Gly Gly Ser Gly Thr Lys 930 935 940 Arg Ala Leu Ile Gln Cys Ala Lys Asp Ile Ala Lys Ala Ser Asp Glu 945 950 955 960 Val Thr Arg Leu Ala Lys Glu Val Ala Lys Gln Cys Thr Asp Lys Arg 965 970 975 Ile Arg Thr Asn Leu Leu Gln Val Cys Glu Arg Ile Pro Thr Ile Ser 980 985 990 Thr Gln Leu Lys Ile Leu Ser Thr Val Lys Ala Thr Met Leu Gly Arg 995 1000 1005 Thr Asn Ile Ser Asp Glu Glu Ser Glu Gln Ala Thr Glu Met Leu 1010 1015 1020 Val His Asn Ala Gln Asn Leu Met Gln Ser Val Lys Glu Thr Val 1025 1030 1035 Arg Glu Ala Glu Ala Ala Ser Ile Lys Ile Arg Thr Asp Ala Gly 1040 1045 1050 Phe Thr Leu Arg Trp Val Arg Lys Thr Pro Trp Tyr Gln 1055 1060 1065 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 2 ggagattact gccctggctc cta 23 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 3 gactcatcgt actcctgctt gctg 24 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 4 gccaagcagt gcacagataa 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <400> 5 tctttctaac ccagcgcagt 20 <210> 6 <211> 633 <212> PRT <213> Shigella <400> 6 Met His Asn Val Asn Asn Thr Gln Ala Pro Thr Phe Leu Tyr Lys Ala 1 5 10 15 Thr Ser Pro Ser Ser Thr Glu Tyr Ser Glu Leu Lys Ser Lys Ile Ser 20 25 30 Asp Ile His Ser Ser Gln Thr Ser Leu Lys Thr Pro Ala Ser Val Ser 35 40 45 Glu Lys Glu Asn Phe Ala Thr Ser Phe Asn Gln Lys Cys Leu Asp Phe 50 55 60 Leu Phe Ser Ser Ser Gly Lys Glu Asp Val Leu Arg Ser Ile Tyr Ser 65 70 75 80 Asn Ser Met Asn Ala Tyr Ala Lys Ser Glu Ile Leu Glu Phe Ser Asn 85 90 95 Val Leu Tyr Ser Leu Val His Gln Asn Gly Leu Asn Phe Glu Asn Glu 100 105 110 Lys Gly Leu Gln Lys Ile Val Ala Gln Tyr Ser Glu Leu Ile Ile Lys 115 120 125 Asp Lys Leu Ser Gln Asp Ser Ala Phe Gly Pro Trp Ser Ala Lys Asn 130 135 140 Lys Lys Leu His Gln Leu Arg Gln Asn Ile Glu His Arg Leu Ala Leu 145 150 155 160 Leu Ala Gln Gln His Thr Ser Gly Glu Ala Leu Ser Leu Gly Gln Lys 165 170 175 Leu Leu Asn Thr Glu Val Ser Ser Phe Ile Lys Asn Asn Ile Leu Ala 180 185 190 Glu Leu Lys Leu Ser Asn Glu Thr Val Ser Ser Leu Lys Leu Asp Asp 195 200 205 Leu 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His Arg Pro Leu Asn Ile Gln Asn Ser Ser Thr Thr Pro Pro Leu 420 425 430 His Pro Glu Gly Val Thr Ser Ser Asn Asp Asn Ser Ser Asp Thr Thr 435 440 445 Lys Ser Ser Ala Ser Leu Ser His Arg Val Ala Ser Gln Ile Asn Lys 450 455 460 Phe Asn Ser Asn Thr Asp Ser Lys Val Leu Gln Thr Asp Phe Leu Ser 465 470 475 480 Arg Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Thr Arg Glu Thr Ile Phe Glu Ala Ser 485 490 495 Lys Lys Val Thr Asn Ser Leu Ser Asn Leu Ile Ser Leu Ile Gly Thr 500 505 510 Lys Ser Gly Thr Gln Glu Arg Glu Leu Gln Glu Lys Ser Lys Asp Ile 515 520 525 Thr Lys Ser Thr Thr Glu His Arg Ile Asn Asn Lys Leu Lys Val Thr 530 535 540 Asp Ala Asn Ile Arg Asn Tyr Val Thr Glu Thr Asn Ala Asp Thr Ile 545 550 555 560 Asp Lys Asn His Ala Ile Tyr Glu Lys Ala Lys Glu Val Ser Ser Ala 565 570 575 Leu Ser Lys Val Leu Ser Lys Ile Asp Asp Thr Ser Ala Glu Leu Leu 580 585 590 Thr Asp Asp Ile Ser Asp Leu Lys Asn Asn Asn Asp Ile Thr Ala Glu 595 600 605 Asn Asn Asn Ile Tyr Lys Ala Ala Lys Asp Val Thr Thr Ser Leu Ser 610 615 620 Lys Val Leu Lys Asn Ile Asn Lys Asp 625 630

Claims

과민성 장 증후군 (IBS), 염증성 장 질환 (IBD) 또는 소장 박테리아 과도성장 (SIBO)과 관련된 진단을 필요로 하는 대상체로부터의 생물학적 샘플을 제공하는 것;
생물학적 샘플에서 항-빈쿨린 항체의 존재 또는 수준을 검출하는 것; 및
항-빈쿨린 항체의 존재가 검출되는 경우, 항-빈쿨린 항체의 수준이 확립된 대조 수준보다 더 높은 경우, 또는 항-빈쿨린 항체의 수준이 확립된 대조 수준보다 유의하게 더 높은 경우에, IBS 또는 SIBO의 존재 또는 존재 가능성을 결정하는 것, 또는
항-빈쿨린 항체의 부재가 검출되는 경우, 항-빈쿨린 항체의 수준이 확립된 대조 수준과 동일하거나 그보다 더 낮은 경우, 또는 항-빈쿨린 항체의 수준이 확립된 대조 수준보다 유의하게 더 높지 않은 경우에, IBS 또는 SIBO의 부재 또는 부재 가능성을 결정하는 것
을 포함하는, IBS, IBD 또는 SIBO의 진단에 사용하기 위한 정보를 제공하는 방법.
제1항에 있어서, IBS 또는 SIBO의 존재 또는 존재 가능성이 결정되는 경우에, IBS 또는 SIBO에 대한 요법을 선택하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제2항에 있어서, 요법이 일련의 항생제 요법인 방법.
제2항에 있어서, 요법이 항-빈쿨린 항체 중화제 또는 항-빈쿨린 항체 억제제를 포함하는 것인 방법.
제2항에 있어서, 요법이 빈쿨린을 불활성 상태에서 활성 상태로 변경시키기 위한 작용제를 포함하는 것인 방법.
제2항에 있어서, 요법이 빈쿨린 효능제를 포함하는 것인 방법.
제6항에 있어서, 빈쿨린 효능제가 빈쿨린 활성화 펩티드인 방법.
제2항에 있어서, 요법이 빈쿨린 활성화제를 포함하는 것인 방법.
제8항에 있어서, 빈쿨린 활성화제가 탈린, f-액틴, a-카테닌 또는 이들의 조합인 방법.
제2항에 있어서, 요법을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
과민성 장 증후군 (IBS), 염증성 장 질환 (IBD) 또는 소장 박테리아 과도성장 (SIBO)과 관련된 진단을 필요로 하는 대상체로부터의 단리된 생물학적 샘플; 및
생물학적 샘플에서 항-빈쿨린 항체의 존재를 검출하기 위한 검정을 포함하며,
상기 검정이 항-빈쿨린 항체에 결합하기 위한 빈쿨린, 서열 1을 갖는 빈쿨린 또는 그의 단편을 포함하는 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA)인,
생물학적 샘플에서 항-빈쿨린 항체의 존재를 검출하기 위한 검정 시스템.
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염증성 장 질환 (IBD)으로부터 과민성 장 증후군 (IBS)을 구별하기 위한 진단을 필요로 하는 대상체로부터의 생물학적 샘플을 제공하는 것;
생물학적 샘플에서 항-빈쿨린 항체의 존재 또는 수준을 검출하는 것; 및
항-빈쿨린 항체의 존재가 검출되는 경우, 항-빈쿨린 항체의 수준이 확립된 대조 수준보다 더 높은 경우, 또는 항-빈쿨린 항체의 수준이 확립된 대조 수준보다 유의하게 더 높은 경우에, 과민성 장 증후군 (IBS)의 존재 또는 존재 가능성을 결정하는 것
을 포함하는, IBD로부터 IBS를 구별하기 위한 진단에 사용하기 위한 정보를 제공하는 방법.
제13항에 있어서, IBS가 진단되는 경우에 IBS 요법을 선택하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제14항에 있어서, IBS 요법이 일련의 항생제 요법인 방법.
제14항에 있어서, IBS 요법이 항-빈쿨린 항체 중화제 또는 항-빈쿨린 항체 억제제를 포함하는 것인 방법.
제14항에 있어서, IBS 요법이 빈쿨린을 불활성 상태에서 활성 상태로 변경시키기 위한 작용제를 포함하는 것인 방법.
제14항에 있어서, IBS 요법이 빈쿨린 효능제를 포함하는 것인 방법.
제18항에 있어서, 빈쿨린 효능제가 빈쿨린 활성화 펩티드인 방법.
제14항에 있어서, IBS 요법이 빈쿨린 활성화제를 포함하는 것인 방법.
제20항에 있어서, 빈쿨린 활성화제가 탈린, f-액틴, a-카테닌 또는 이들의 조합인 방법.
제14항에 있어서, IBS 요법을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
과민성 장 증후군 (IBS)과 염증성 장 질환 (IBD)을 구별하기 위한 진단을 필요로 하는 대상체로부터의 단리된 생물학적 샘플; 및
생물학적 샘플에서 항-빈쿨린 항체의 존재를 검출하기 위한 검정을 포함하는며,
상기 검정이 항-빈쿨린 항체에 결합하기 위한 빈쿨린, 서열 1을 갖는 빈쿨린 또는 그의 단편을 포함하는 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA)인,
염증성 장 질환 (IBD)으로부터 과민성 장 증후군 (IBS)을 구별하기 위한 검정 시스템.
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