MX2008010297A

MX2008010297A - Deteccion de cancer mediante niveles elevados de linfoma 2 de celulas b

Info

Publication number: MX2008010297A
Application number: MXMX/A/2008/010297A
Authority: MX
Inventors: Patricia A Kruk
Original assignee: Patricia A Kruk; University Of South Florida
Priority date: 2006-02-09
Filing date: 2008-08-08
Publication date: 2008-10-03

Abstract

La presente invención se refiere a un método para el diagnóstico, pronóstico y monitoreo de cáncer, tal como cáncer de ovario de etapa temprana o tardía, en un sujeto al detectar Bcl-2 en una muestra biológica del sujeto, preferiblemente una muestra de orina o de sangre;Bcl-2 se puede medir usando un agente que detecta o se une a proteína Bcl-2 o un agente que detecta o se une aácidos nucleicos codificadores, tal como anticuerpos específicamente reactivos con proteína Bcl-2 o una porción de los mismos;la invención además se refiere a equipos para llevara cabo los métodos de la invención;la invención se refiere a un dispositivo para la detección rápida de Bcl-2 en un fluido del cuerpo y métodos para medir rápidamente Bcl-2 en un fluido del cuerpo.

Description

DETECCION DE CANCER MEDIANTE NIVELES ELEVADOS DE LINFOMA 2 DE CELULAS B REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUD RELACIONADA La presente solicitud reclama el beneficio de la solicitud provisional de E.U.A. No. 60/771 ,677, presentada el 9 de febrero de 2006, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad, incluyendo cualesquiera figuras, cuadros, secuencias de ácido nucleico, secuencias de aminoácidos y dibujos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Los marcadores de cáncer son sustancias que se pueden encontrar en el cuerpo (usualmente en la sangre u orina) cuando el cáncer está presente. Pueden ser productos de las células cancerosas mismas, o del cuerpo en respuesta a cáncer u otras condiciones. Por varias razones, los marcadores de cáncer mismos usualmente no son suficientes para diagnosticar (o descartar) un tipo especifico de cáncer. La mayoría de los marcadores de cáncer pueden ser producidos por células normales así como por células cancerosas, aun cuando estén en cantidades más pequeñas. Algunas veces, las enfermedades no cancerosas también pueden causar que los niveles de ciertos marcadores de cáncer sean más altos que los normales.

Además, no toda persona con cáncer puede tener niveles más altos de un marcador de cáncer. Por estas razones, sólo una pequeña cantidad de marcadores de cáncer son usados comúnmente por la mayoría de los médicos. Cuando un médico ve el nivel de un cierto marcador de cáncer, típicamente lo considera junto con los resultados de la historia y examen médico del paciente, y otras pruebas de laboratorio o pruebas de formación de imagen. Determinación selectiva se refiere a buscar cáncer en individuos que no tienen síntomas de la enfermedad, mientras que la detección temprana es el hallazgo de cáncer en una etapa temprana de la enfermedad, cuando es menos probable que se haya diseminado (y es más probable que sea tratada de manera efectiva). Aunque los marcadores de cáncer originalmente se investigaron y desarrollaron para hacer pruebas de cáncer en personas sin síntomas, se ha mostrado que muy pocos marcadores son útiles de esta manera. El cáncer de ovario tiene la más alta mortalidad entre los cánceres ginecológicos. La falta de síntomas tempranos y la ausencia de una prueba de determinación selectiva confiable para detectar cáncer de ovario da por resultado más de 70% de mujeres a quienes se ha diagnosticado después de que la enfermedad se ha diseminado más allá del ovario por lo que el pronóstico es deficiente con aproximadamente 12,000 muertes debidas a cáncer de ovario anualmente (la supervivencia de 5 años no es mejor que 37%). En la actualidad, el examen pélvico físico por un médico, ultrasonido o medición de niveles en la sangre para CA125 son los únicos métodos estándares disponibles para detección e cáncer de ovario. Sin embargo, ninguno de estos métodos provee un método confiablemente consistente y exacto para detectar cáncer de ovario. Por ejemplo, aunque más de 80% de las mujeres con cáncer de ovario tendrán niveles elevados en la sangre de CA125, los niveles en la sangre de CA125 son sólo aproximadamente 50% exactos para detectar enfermedad de etapa temprana. El desarrollo de una prueba alternativa y nueva para detectar de manera confiable y exacta todos los cánceres de ovario es imperativo. Por lo tanto, lo que se necesita es una tecnología que supere la actual falta de una prueba confiable, exacta, segura y efectiva en costos para cáncer de ovario. Además, lo que se necesita es una tecnología que detecte con exactitud todos los cánceres de ovario, muchos de los cuales ahora no son detectados, y que monitoree la carga de enfermedad a lo largo del curso de cáncer de ovario. Una prueba exacta, segura, simple y confiable para diagnosticar cáncer de ovario beneficiaría a todas las mujeres, en los Estados Unidos y en todo el mundo, incluyendo áreas geográficas con muy poco servicio médico y especialmente mujeres con alto riesgo de desarrollar cáncer de ovario. Dado que a aproximadamente 25,000 mujeres se les diagnostica cáncer de ovario cada año en los E.U.A., un biomarcador de cáncer de ovario que es detectable tanto en etapas temprana como tardía de enfermedad no sólo confirmaría el diagnóstico de cáncer de ovario, sino también podría detectar potencialmente miles de cánceres de ovario previamente no detectados. Esto es especialmente importante para la detección de cáncer de ovario en etapas tempranas en donde la enfermedad está confinada al ovario, pero actualmente representa menos de 10% de los cánceres de ovario detectados. En estas situaciones, la reducción quirúrgica del ovario enfermo incrementa la supervivencia del paciente a más de 90% y se esperaría que redujera los costos médicos. La capacidad para detectar con exactitud y monitorear cáncer de ovario en cada paciente a través del curso de su enfermedad, no sólo serviría para diagnóstico de cáncer de ovario inicial, sino también indicaría eficacia terapéutica y/o enfermedad recurrente. El desarrollo de una prueba basada en ELISA aprobada por la FDA, actualmente disponible, por ejemplo, podría convertirse en el estándar de oro para diagnóstico clínico de cáncer de ovario. Aunque la apoptosis es un proceso biológico esencial para el desarrollo y mantenimiento normales de homeostasis de tejido, también involucraría un número de condiciones patológicas incluyendo lesión de tejido, enfermedades degenerativas, enfermedades inmunológicas y cáncer (Lowe, S. W. y Lin, A. W. Carcinogenesis, 2000, 21 :485-495). Ya sean activadas por receptores de muerte ligada a membrana (Ashkenazi, A. et al J. Clin. Invest., 1 999, 104: 155-162; Walczak, H. Krammer, P.H. Exp. Cell Res, 2000, 256:58-66) o por perturbación mitocondrial inducida por estrés con subsecuente liberación de citocromo c (Loeffler, M. y Kroemer, G. Exp. Cell Res., 2000, 256: 19-26; Wernig, F. y Xu, Q. Prog. Biophys. Mol. Biol. , 2002, 78: 105-137; Takano, T. et al. Antiox. Redox. Signal, 2002, 4:533-541 ), activación de caspasas hacia el extremo 3' conduce a destrucción celular paso a paso al perturbar el citoesqueleto, anulando la replicación y reparación de ADN, degradando el ADN cromosómico y, finalmente, desintegrando la célula en cuerpos apoptóticos (Nagata, S. Exp. Cell Res. , 2000, 256:12-18). Los reguladores clave de apoptosis incluyen miembros de la familia de proteína bcl-2 (Farrow, S.N. y Brown, R. Curr. Opin. Gen. Dev., 1996, 6:45-49). La familia de proteína bcl-2 consiste tanto de miembros de la familia de proteína pro-apoptótica como anti-apoptótica que actúan a diferentes niveles de la cascada apoptótica para regular la apoptosis. Los miembros de la familia bcl-2 contienen por lo menos un dominio de homología de Bcl-2 (BH) (Farrow, S.N. y Brown, R. Curr. Opin. Gen. Dev., 1996, 6:45-49). A través de todos los miembros de la familia bcl-2 demuestran actividad de formación de canal de membrana, los canales de Bcl-2 (el miembro de la familia de bcl-2 de arquetipo) son selectivos de cationes (Ca++) y, debido a su localización exclusiva en ER y membrana mitocondrial (Thomenius, M.J. y Distelhorst, CW. J. Cell Sci, 2003, 1 6:4493-4499), la función anti-apoptótica de Bcl-2 es por lo menos parcialmente mediada por su capacidad para prevenir liberación de calcio de ER y subsecuente perturbación de membrana mitocondrial y liberación de citocromo c. Puesto que Bcl-2 es sobreexpresado en muchos tipos de tumores incluyendo cáncer de ovario (Sharma, H. et al. Head Neck, 2004, 26:733-740; Hanaoka, T. et al. Intl. J. Clin. Oncol, 2002, 7: 152-158; Trisciuoglio, D. et al. J. Cell Physiol, 2005, 205:414-421 ; Khalifeh, I. et al. Int. J. Gynecol. Pathol, 2004,' 23: 162- 69; O'Neill, CJ. et al Am. J. Surg.

Pathol, 2005, 29:1034-1041 ), contribuye a quimiorresistencia al estabilizar la membrana mitocondrial contra ataques apoptóticos. Actualmente, los estudios preclínicos se enfocan en el desarrollo de agentes para inhibir Bcl-2, incluyendo oligonucleótidos de antisentido tales como G3.139 (Ackermann, EJ. et al J. Biol. Chem., 1999, 274:1 1245-1 1252), e inhibidores moleculares pequeños de Bcl-2 (Lickliter, J.D. et al Leukemia, 2003, 17:2074-2080). Aunque dichos estudios utilizan como objetivo Bcl-2 para intervención terapéutica, la cuantificación de Bcl-2 en la orina no se ha reportado previamente en la literatura. Sería ventajoso tener pruebas disponibles que provean métodos seguros, sensibles, específicos y económicos para la detección de cánceres tales como cáncer de ovario, que beneficiaría a la sociedad a nivel mundial.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención se refiere a determinación selectiva de cáncer. Bcl-2 constituye un biomarcador para pronóstico, diagnóstico y monitoreo de cáncer, tal como cáncer del aparato reproductor. Por ejemplo, Bcl-2 se puede usar para diagnosticar y monitorear cáncer de ovario de etapa temprana y etapa tardía. Bcl-2 se puede usar como un biomarcador para cáncer antes de cirugía y después de recaída. Bcl-2, y agentes que se unen a polinucleótidos o polipéptidos de Bcl-2 se pueden usar para detectar y monitorear cáncer de ovario, y otros cánceres del aparato reproductor y que no son del aparato reproductor. Por lo tanto, muy particularmente, esta invención se refiere a la detección de cáncer al determinar selectivamente para niveles elevados de Bcl-2 en muestras biológicas, tales como orina, sangre (v.gr., sangre entera, suero o plasma), y fluido de ascitos. En una modalidad, el cáncer es cáncer de ovario. En otra modalidad, el cáncer es un tipo seleccionado del grupo que consiste de mama, endometrio, cervical, pulmón, colon, próstata, melanoma, glioblastoma, sarcoma, vejiga y cabeza y cuello. Opcionalmente, el método además comprende verificar que el sujeto está padeciendo el cáncer detectado (v.gr., al evaluar la presencia de uno o más síntomas de cáncer, detectar marcadores de cáncer adicionales, detectar la presencia del cáncer a través de una modalidad de formación de imagen tal como rayos X, CT, formación de imagen nuclear (PET y SPECT), ultrasonido, MRI) y/o tratar al sujeto para el cáncer detectado (v.gr., por cirugía, quimioterapia, y/o radiación). La invención también se refiere a equipos para llevar a cabo los métodos de la invención. En otro aspecto, la presente invención se refiere a un dispositivo para la detección rápida de Bcl-2 en un fluido del cuerpo tal como sangre u orina. Preferiblemente, el dispositivo es un dispositivo de flujo lateral. En una modalidad, el dispositivo comprende una zona de aplicación para recibir una muestra de fluido del cuerpo tal como sangre u orina; una zona de mareaje que contiene un agente de unión que se une a Bcl-2 en la muestra; y una zona de detección en donde el agente de unión a Bcl-2 es retenido para dar una señal, en donde la señal dada para una muestra de un sujeto con un nivel de Bcl-2 menor que una concentración de umbral es diferente de la señal dada para una muestra de un paciente con un nivel de Bcl-2 igual a o mayor que una concentración de umbral. En otro aspecto, la invención se refiere a una prueba simple, rápida, confiable, exacta y efectiva en costos para Bcl-2 en un fluido del cuerpo tal como sangre u orina, similar a las pruebas de embarazo en el hogar actualmente disponibles que podrían ser usadas por los sujetos en el hogar, el consultorio médico, o junto a la cama del paciente. En una modalidad, la prueba es un método para medir Bcl-2 en un fluido del cuerpo, que comprende: (a) obtener una muestra de fluido del cuerpo, tal como sangre u orina, de un sujeto; (b) poner en contacto la muestra con un agente de unión que se une a cualquier Bcl-2 en la muestra; (c) separar el agente de unión a Bcl-2; (d) detectar una señal asociada con el agente de unión separado de (c); y (e) comparar la señal detectada en el paso (d) con una señal de referencia que corresponde a la señal dada por una muestra de un sujeto con un nivel de Bcl-2 igual a una concentración de umbral. En una modalidad, el fluido del cuerpo es orina, y la concentración de umbral es entre 0 ng/ml y 2.0 ng/ml. En otra modalidad, el fluido del cuerpo es orina, y la concentración de umbral es 1.8 ng/ml. Para evaluar si los niveles en la orina de Bcl-2 se podrían usar para detectar cáncer de ovario, la orina se recolectó de voluntarios sanos normales, de pacientes con cáncer de ovario y se midieron para Bcl-2 por ELISA. La cantidad promedio de Bcl-2 en la orina de pacientes con cáncer fue generalmente por lo menos 10X mayor que los controles sanos. Además, ninguna de las muestras de orina recolectadas de 35 mujeres con enfermedad ginecológica benigna (incluyendo teratomas, quistes de ovario, leiomiomas, enfermedad de ovario policístico, adenofibromas o cistadenomas) tuvieron niveles de Bcl-2 por arriba del encontrado en voluntarios sanos normales. Los niveles de Bcl-2 en la orina disminuyeron hasta 100% en pacientes con cáncer de ovario después de cirugía de reducción. La sensibilidad y especificidad para Bcl-2 en la orina elevado asociado con cáncer de ovario fue casi de 100% mientras que los niveles de CA125 en la sangre > 35 U/ml sólo identificaron 68% de pacientes con cáncer de ovario. La comparación de parámetros clínicos indicó que los niveles de Bcl-2 en la orina se correlacionaron bien con la etapa y grado del tumor. Sin embargo, los niveles de Bcl-2 en la orina no se correlacionaron con la edad del paciente o tamaño del tumor. Por lo tanto, la cuantificación de Bcl-2 en la orina por pruebas basadas en ELISA provee un método seguro, sensible, específico y económico para detectar cáncer de ovario, para monitorear cáncer de ovario a través del curso de enfermedad y predecir resultado terapéutico y de pronóstico.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La figura 1 es un histograma que ilustra los niveles de Bcl-2 en la orina. Los niveles de Bcl-2 en la orina son mayores en pacientes con cáncer de ovario comparados con voluntarios sanos normales. Se recolectó orina de voluntarios sanos normales y de pacientes con cáncer de ovario (incluyendo los subtipos histológicos serosos, mucinosos) y cáncer peritoneal. Los cánceres de ovario serosos se subdividieron adicionalmente en etapa 1 (las primeras tres barras a la izquierda en el grupo seroso), etapa 2 (las siguientes ocho barras en el grupo seroso (es decir, barras 4-1 1 de la izquierda del grupo seroso)) y etapa 3 (las once barras en la sección de mano derecha del grupo seroso (es decir, barras 12-22 de la izquierda del grupo seroso). La orina se probó por triplicado para Bcl-2 por ELISA (equipos de ELISA de Bender MedSystems, catálogo #BMS244/3) y los resultados se expresan como el ng/ml promedio de Bcl-2 ± E.E. Los datos indican consistentemente niveles elevados de Bcl-2 en la orina de pacientes con cáncer. El análisis de prueba de t de Student reveló una diferencia estadística entre especímenes normales y con cáncer a p < 0.00001. La figura 2 es un histograma que ilustra los niveles de Bcl-2 en la orina en pacientes normales y con cáncer. Especímenes de orina adicionales se recolectaron de voluntarios sanos normales y de pacientes con cáncer de ovario (incluyendo los subtipos histológicos endometroide, seroso y mucinoso) y cáncer peritoneal. Los cánceres de ovario serosos se subdividieron adicionalmente en la etapa 1 (7 barras más a la izquierda en el grupo seroso), etapa 2 (barras 8-17 de la izquierda en el grupo seroso) y etapa 3 (12 barras más a la derecha en el grupo seroso). La orina se probó por triplicado para Bcl-2 por ELISA (equipos de ELISA de Bender Med Systems), los resultados expresados como el ng/ml promedio de Bcl-2 y representan todos los especímenes de orina normales y con cáncer pre-quirúrgicos probados hasta la fecha. De conformidad con la figura 1 , los datos indican consistentemente niveles elevados de Bcl-2 en la orina de pacientes con cáncer. El análisis de prueba de t de Student reveló una diferencia estadística entre especímenes normales y con cáncer a p < 0.00001. Las figuras 3A y 3B son histogramas que demuestran que Bcl-2 en la orina está relacionado con la etapa y grado del tumor, respectivamente. Los niveles de Bcl-2 en la orina se graficaron contra la etapa de tumor de todos los subtipos de cáncer de ovario histológicos disponibles (seroso, endometriode, mucinoso). Las etapas I, II, III y V están representadas por números romanos con grupos debajo de ellos. Aunque aún considerablemente mayores que los controles normales, la figura 3A ilustra que los niveles de Bcl-2 en la orina fueron los más bajos en tumores de etapa I y II (ng/ml promedio de Bcl-2 = 2.2) en donde la enfermedad se localiza dentro del ovario y cavidad peritoneal, respectivamente. Los niveles de Bcl-2 en la orina fueron los más grandes entre las etapas III y V (ng/ml promedio de Bcl-2 = 4.22) cuando la enfermedad se ha diseminado más allá del ovario o es enfermedad recurrente, respectivamente.

Las figuras 4A y 4B son un par de histogramas que ilustran la capacidad de Bcl-2 en la orina (figura 4A) en relación con las mediciones de los niveles en el plasma de CA125 (figura 4B) en la detección de cáncer de ovario. Donde es posible, los niveles de Bcl-2 en la orina como se mostró anteriormente en las figuras 1-3 se compararon con los niveles de CA125 en el plasma de los mismos voluntarios sanos normales y pacientes con cáncer. El último grupo incluía pacientes con cáncer de ovario mucinoso (Muc), cáncer peritoneal primario (PP) y cáncer de ovario seroso (Serous). Los niveles de CA125 se determinaron por ELISA (equipos de Bio-Quant, San Diego, CA, Catálogo # BQI 013T) por triplicado. Los datos se expresan como el ng/ml promedio de Bcl-2 (A) y U/ml promedio de CA125 (figura 4B). La sensibilidad y especificidad para detectar cáncer de ovario por niveles elevados de Bcl-2 en la orina fue casi 100%. Por el contrario, niveles de CA125 en la sangre > 35 U/ml, el estándar actual para detección de cáncer de ovario, sólo correctamente identificó 68% de pacientes con cáncer de ovario. La figura 5 es un histograma que muestra que Bcl-2 en la orina no se correlaciona con la edad del paciente. Para examinar si los niveles de Bcl-2 en la orina elevados en pacientes con cáncer se correlacionaban con la edad del paciente, los niveles de Bcl-2 en la orina (como se determinó anteriormente en las figuras 1 -3 y 4A-4B) se compararon contra la edad del paciente en años. Aunque la edad promedio de voluntarios sanos normales en este estudio fue un poco más bajo (54.8 años) que los pacientes con cáncer (66.2 años), no hubo diferencia estadística en edad entre los grupos debido al amplio intervalo en edad (véase inserto en la figura 5). Además, la edad promedio de los pacientes con cáncer concuerda con los datos de la literatura y clínicos que indican que el cáncer de ovario generalmente tiene como objetivo mujeres peri-menopáusicas y post-menopáusicas. Sin embargo, no parecía haber una correlación entre los niveles de Bcl-2 en la orina con la edad del paciente. La figura 6 es un histograma que muestra que Bcl-2 en la orina no se correlaciona con el tamaño del tumor de ovario. Para examinar si los niveles de Bcl-2 elevados en la orina en pacientes con cáncer se correlacionaban con el tamaño del tumor, los niveles de Bcl-2 en la orina (como se determinó anteriormente en las figuras 1-3 y 4A-4B) se compararon contra el tamaño del tumor. Los tumores se agruparon como: 1 = microscópico en tamaño; 3 = tumores menores que 3 cm; 6 = tumores entre 3 y 6 cm; 10 = tumores mayores que 6 cm y hasta 10 cm; 1 1 = tumores mayores que 10 cm. Los datos indican que no pareció haber una correlación entre los niveles de Bcl-2 en la orina con el tamaño del tumor. Las figuras 7A y 7B son un par de histogramas que muestran que Bcl-2 en la orina disminuye después de cirugía de reducción de cáncer de ovario. Para probar adicionalmente la exactitud de Bcl-2 en la orina para detectar cáncer de ovario, los niveles de Bcl-2 en la orina se compararon en aquellos pacientes con cáncer de ovario disponibles inmediatamente antes de (barras negras) y dentro de 2 semanas después de (barras grises) cirugía de reducción (remoción de todo el tumor visible) inicial (figura 7A). Par aquellos 7 pacientes en donde las muestras de orina se recolectaron antes y después de cirugía inicial, los niveles de Bcl-2 disminuyeron hasta 100% después de remoción quirúrgica del tumor. Estos datos, entonces, sugieren que el tumor es la fuente de Bcl-2 encontrada elevada en la orina de pacientes con cáncer de ovario y que los niveles de Bcl-2 en la orina son paralelos a la presencia de cáncer de ovario. Además, las muestras de orina se recolectaron de 5 de los 7 pacientes en la figura 7A en visitas clínicas de seguimiento subsecuentes que variaban de 7 a 11 meses después de cirugía inicial y medidas para Bcl-2 (barras azules) (figura 7B). Los niveles de Bcl-2 en la orina permanecieron bajos en 3 pacientes en seguimiento (#41 , 43, 54) y se volvieron elevados en 2 pacientes (#5, 27). La revisión de diagrama preliminar indica que los pacientes #41, 43, 54 recibieron quimioterapia en el tiempo de las visitas de seguimiento y que su enfermedad de cáncer de ovario estaba bajo control. Por el contrario, la revisión de diagrama sugiere que los pacientes #5, 27 tuvieron enfermedad recurrente (5B, 27B) y que el paciente #27b tuvo cirugía de reducción de tumor adicional. De conformidad con la información clínica, Bcl-2 en los niveles de orina permaneció reducida en pacientes que tuvieron quimioterapia y que no tenían enfermedad residual aparente o que era mínima (#41 , 43, 54). Asimismo, Bcl-2 elevado en los niveles de orina se correlacionó con la presencia de enfermedad recurrente (#5b, 27B) y disminuyó con reducción de enfermedad subsecuente (#27c). Las figuras 8A y 8B muestran los resultados de prueba de Bcl-2 en pacientes con enfermedad ginecológica benigna. Las muestras de orina se examinaron por ELISA para Bcl-2 en pacientes con enfermedad ginecológica benigna. Las muestras se examinaron por triplicado y los datos se expresaron como el ng/ml promedio de Bcl-2 ± E.E. (figura 8A). Muestras de enfermedad ginecológica benigna se subdividieron por tipo (teratoma cístico benigno, quiste simple, leiomioma, ovario policístico, adenofibroma, cistadenoma mucinoso y seroso) muestra #41 de paciente con cáncer de ovario barra blanca) que sirve como un control positivo interno, ng/ml ± S.E. promedio de Bcl-2 en la orina entre enfermedad benigna se indican bajo se encabezado respectivo. Muestras de la figura 2 y figura 3A se re-graficaron para mostrar la distribución de expresión de Bc3-2 para este grupo de estudio (n=92), mostrado en la figura 8B. Los niveles de Bcl-2 en individuos con tumor benigno, cáncer y normales variaron de 0.1 15-1.016 ng/ml, 1.12-9.8 ng/ml y 0-1 .26 ng/ml y promediaron 0.614 ng/ml, 3.4 ng/ml y 0.21 ng/ml, respectivamente. La figura 9 es un histograma que muestra que Bcl-2 puede ser secretado en el medio condicionado de cultivo de células. El medio condicionado (CM) se recolectó de líneas de células cancerosas establecidas que representan cánceres de ovario (OV2008, SKOV3, PAI), cuello uterino (Hela), próstata (LNCap, DU 145, PC-3), cabeza y cuello (HN5a) y linfoma (Raji) y se examinaron por ELISA para presencia de Bcl-2. Los datos se expresan como la media de muestras triplicadas. La presencia de Bcl-2 en la CM de cultivos de células de cáncer de ovario, cervical y de próstata sugiere que estas células cancerosas producen y secretan Bcl-2.

La figura 10 muestra que Bcl-2 es sobreexpresada en algunas células cancerosas. Los lisados de células de líneas de células cancerosas establecidas que representan cánceres de ovario (SW626, C 13), cabeza y cuello (HN5a), cuello uterino (Hela) y próstata (DU 145) se sometieron a análisis de Western blott para Bcl-2. La actina sirvió como un control de carga y células FHIOSEI 18 (células epiteliales de superficie de ovario humano transfectadas con antígeno T grande SV-40) sirvieron como células de control epiteliales de superficie de ovario normales, non-malignas. Después de los análisis densitométricos, el nivel de Bcl-2 se normalizó a actina, indicado debajo de las transferencias. Las células normales contenían cantidades insignificantes de bcl-2, mientras que las células de cáncer de ovario y cuello uterino contenían la mayor cantidad de Bcl-2. La figura 1 1 muestra concentraciones de proteína Bcl-2 después del almacenamiento. Muestras de orina de individuos sanos normales (#506, 508) y pacientes con cáncer de ovario (#77, 97) se probaron originalmente para Bcl-2 como parte de este estudio (control) y después de almacenamiento durante 4 días ya sea a temperatura ambiente (25°C), en un refrigerador (4°C), en un congelador -20°C (-20°C) o en un congelador -80°C (-80X). Las muestras de AU se probaron por duplicado para los niveles de Bcl-2 en la orina usando un equipo de ELISA (BenderMed Systems). La figura 12 muestra concentraciones de proteína Bcl-2 en medio condicionado (CM) de líneas de células de cáncer después del tratamiento con ácido lisofosfatidico (LPA), incluyendo DU 145, una línea de células de cáncer de próstata. La figura muestra que el tratamiento con LPA, que con frecuencia se retroalimenta en las células cancerosas en forma de un bucle de autocrina, estimula la secreción de Bcl-2 en el CM de algunos tipos de células de cáncer. Puesto que estas líneas de células de cáncer secretan Bcl-2 en sur CM, como lo hacen las líneas de células de cáncer de ovario, las contrapartes de tumor in vivo de dichas líneas de células potencialmente secretan Bcl-2 en fluidos biológicos tales como orina y/o sangre y pueden ser detectadas usando la presente invención.

BREVE DESCRIPCION DE LAS SECUENCIAS SEQ ID NO:1 es ADN de Bcl-2 humano (acceso al GenBank No. M14745); región codificadora (CDS): bases 32-751. SEQ ID NO:2 es proteína Bcl-2 humana (Acceso a GenBank No.

AAA35591 ). SEQ ID NO:3 es ADN de Bcl-2 humano, variante de transcripción alfa (Acceso a GenBank No. NM_000633); CDS: bases 494-1213. SEQ ID NO:4 es proteína Bcl-2 humana, variante de transcripción alfa (Acceso a GenBank No. NP_000624). SEQ ID NO:5 es ADN de Bcl-2 humano, variante de transcripción beta (Acceso a GenBank No. NM_000657); CDS: bases 494-1 1 1 1 . SEQ ID NO:6 es proteína Bcl-2 humana, variante de transcripción beta (Acceso a GenBank No. NP_000648).

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Bcl-2 es un marcador molecular efectivo para cáncer tal como cáncer de ovario. Los marcadores de cáncer (también llamados marcadores de tumor) son moléculas tales como hormonas, enzimas, e inmunoglobulinas encontradas en el cuerpo que están asociadas con cáncer y cuya medición o identificación es útil en diagnóstico o manejo clínico del paciente. Pueden ser productos de las células cancerosas mismas, o del cuerpo en respuesta a cáncer u otras condiciones. La mayoría de los marcadores de cáncer son proteínas. Algunos marcadores de cáncer se ven sólo en un solo tipo de cáncer, mientras que otros pueden ser detectados en varios tipos de cáncer. Igual que con otros marcadores de cáncer, Bcl-2 se puede usar para una variedad de propósitos, tales como: determinar selectivamente una población sana o una población con alto riesgo para la presencia de cáncer; hacer un diagnóstico de cáncer o de un tipo específico de cáncer, tal como cáncer de ovario; determinar el pronóstico de un sujeto; y monitorear el curso en un sujeto en remisión o mientras recibe cirugía, radiación, quimioterapia u otro tratamiento de cáncer. Para evaluar si los niveles de Bcl-2 en la orina se podrían usar para detectar cáncer de ovario, se recolectó orina de voluntarios sanos normales (N=21 ) y de pacientes con cáncer de ovario (N=34) y peritoneal primario (N=2) y se midió por triplicado para Bcl-2 usando equipos de ELISA comercialmente disponibles (BenderMedSystems, catálogo #BMS244/3) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Los resultados se expresaron como el ng/ml promedio de Bcl-2 ± E.E. La cantidad promedio de Bcl-2 en la orina de voluntarios sanos fue 0.204 ng/ml mientras que la de pacientes con cáncer de pre-cirugía promedió 3.12 ng/ml, generalmente por lo menos 10X más que la encontrada en controles normales. El análisis de prueba de t de Student reveló una diferencia estadística entre especímenes normales y con cáncer a p < 0.00001. La comparación de parámetros clínicos indicó que los niveles de Bcl-2 en la orina se correlacionó bien con la etapa y grado del tumor (figuras 3 A y 3B). Muestras de plasma de algunos de estos mismos individuos anteriores se examinaron por triplicado para niveles de CA125 por una ELISA comercialmente disponible (Bio-Quant, catálogo #BQ1013T) de conformidad con las instrucciones del fabricante. La sensibilidad y especificidad para Bcl-2 elevada en la orina asociada con detección de cáncer de ovario fue casi 100% mientras que los niveles en la sangre de CA125 > 35 U/ml, el estándar actual para detección de cáncer de ovario, sólo correctamente identificó 68% de pacientes con cáncer de ovario. Para probar adicionalmente la exactitud para niveles de Bcl-2 en la orina para detectar cáncer de ovario, los niveles de Bcl-2 en la orina se compararon con los de aquellos los pacientes disponibles con cáncer de ovario inmediatamente antes de y dentro de 2 semanas después de cirugía de reducción inicial (remoción de todo tumor visible). Para aquellos 7 pacientes en donde se recolectaron muestras de orina antes y después de cirugía inicial, los niveles de Bcl-2 disminuyeron hasta 100% después de remoción quirúrgica de tumor. Estos datos, entonces, sugieren que el tumor es la fuente de Bcl-2 encontrada elevada en la orina de pacientes con cáncer de ovario. Además, se recolectaron muestras de orina de 5 de estos 7 pacientes en visitas clínicas de seguimiento subsecuentes que variaban de 7 a 1 1 meses después de cirugía inicial y se midieron para Bcl-2. Los niveles de Bcl-2 en la orina permanecieron bajos en 3 pacientes en seguimiento (#41 , 43, 54) y se volvieron elevados en 2 pacientes (#5, 27). La revisión de diagrama preliminar indica que los pacientes #41 , 43, 54 recibieron quimioterapia en el tiempo de las visitas de seguimiento y que su enfermedad de cáncer de ovario estaba bajo control. Por el contrario, La revisión de diagrama sugiere que los pacientes #5, 27 tuvieron enfermedad recurrente y que el paciente #27 tuvo cirugía de reducción de tumor adicional. De conformidad con la información clínica, Bcl-2 en los niveles de orina permaneció reducida en pacientes que tuvieron quimioterapia y que no tenían enfermedad residual aparente o que era mínima (#41 ,43,54). Asimismo, Bcl-2 elevado en los niveles de orina se correlacionó con la presencia de enfermedad recurrente (#5, 27) y disminuyó con reducción de enfermedad subsecuente (#27c). Tomados juntos, estos datos indican que la cuantificación de Bcl-2 en la orina por pruebas basadas en ELISA parece proveer un método novedoso, seguro, sensible, específico y económico para la detección de cáncer de ovario. Además, los niveles de Bcl-2 en la orina se pueden usar para monitorear la presencia de cáncer de ovario en todo el curso de la enfermedad y pueden predecir el resultado terapéutico y de pronóstico. En un aspecto, la invención incluye un método para detectar cáncer en un sujeto, que comprende detectar la presencia de Bcl-2 en una muestra biológica del sujeto, tal como orina, sangre, fluido peritoneal o fluido de ascitos, y en donde un nivel de Bcl-2 por arriba de un umbral predeterminado es indicativo de cáncer en el sujeto. Preferiblemente, la detección no se lleva a cabo por una prueba de ranura-transferencia cualitativa (tal como aquella comercialmente disponible de BioRad). La detección y/o monitoreo de cáncer usando los métodos, dispositivos, y equipos de la invención incluyen, pero no se limitan a, cáncer de mama (v.gr., infiltración (invasiva), preinvasiva, inflamatoria, enfermedad de Paget, metastática o recurrente); cáncer gastrointestinal/digestivo (v.gr., cáncer de apéndice, conducto biliar, colon, esofágico, vesícula biliar, gástrico, intestinal, hepático, pancreático, rectal y de estómago); cáncer genitourinario/urinario (v.gr., suprarrenal, vejiga, riñon, penil, próstata, testicular y urinario); cáncer ginecológico (v.gr., cuello uterino, endometrio, trompas de falopio, ovario, uterino, vagina y vulva); cabeza y cuello cáncer (v.gr., ojos, cabeza y cuello, mandíbula, laringe, cavidad nasal, cáncer oral, faringe, glándulas salivales, senos nasales, garganta, tiroides, lengua y amígdalas); cáncer hematológico/sangre (v.gr., enfermedad de Hodgkin, leucemia (leucemia linfocítica aguda, leucemia granulocítica aguda, leucemia mielógena aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica), mieloma múltiple, linfoma, y nodos linfáticos);cáncer de tejido musculoesquelético/liso (v.gr., hueso, osteosarcoma, melanoma, piel (células básales, células escamosas), sarcoma (sarcoma de Ewing, sarcoma de Kaposi)); cáncer neurológico (v.gr., cerebro (astrocitoma, glioblastoma, glioma), glándula pituitaria, médula espinal)); y cáncer respiratorio/pulmón (v.gr., pulmón, (adenocarcinoma, células en forma de avena, células no pequeñas, células pequeñas, células escamosas) y mesotelioma). En una modalidad, el cáncer es cáncer de ovario. En otra modalidad, el cáncer es un tipo seleccionado del grupo que consiste de cáncer de mama, cáncer de endometrio, cáncer de cuello uterino, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de próstata, melanoma, glioblastoma, sarcoma, cáncer de vejiga y cáncer de cabeza y cuello. En una modalidad del método de la invención, la detección comprende: (a) poner en contacto la muestra biológica con un agente de unión que se une a la proteína Bcl-2 para formar un complejo; y (b) detectar el complejo; y correlacionar el complejo detectado con la cantidad de proteína Bcl-2 en la muestra, en donde la presencia de proteína Bcl-2 elevada es indicativa de cáncer. En una modalidad específica, la detección de (b) comprende además enlazar o incorporar un marcador sobre el agente, o usar detección inmunoenzimática basada en ELISA. Opcionalmente, los métodos de la invención además comprenden detectar un biomarcador de cáncer en la misma muestra biológica o una muestra biológica diferente obtenida del sujeto, antes, durante o después de la detección de Bcl-2. En una modalidad, el biomarcador de cáncer es un biomarcador de cáncer del aparato reproductor, tal como cáncer ginecológico. En otra modalidad, el biomarcador es CA125 o OVXI. El sujeto puede tener nivel de CA125 elevado en la sangre en el tiempo en que se lleva a cabo la detección de Bcl-2, o el sujeto puede no tener un nivel de CA125 elevado en la sangre en el tiempo en que se lleva a cabo la detección de Bcl-2. En algunas modalidades, el sujeto padece cáncer, tal como cáncer de ovario, y la detección se realiza en varios puntos de tiempo a intervalos, como parte de un monitoreo del sujeto antes, durante o después el tratamiento del cáncer. Opcionalmente, los métodos de la invención además comprenden comparar el nivel de Bcl-2 en la muestra biológica con el nivel de Bcl-2 presente en una muestra de control normal, en donde un nivel más alto de Bcl-2 en la muestra biológica en comparación con el nivel en la muestra de control normal es indicativa de cáncer tal como cáncer de ovario. En algunas modalidades, el sujeto no presenta síntomas de cáncer en el tiempo en que se lleva a cabo la detección de Bcl-2. En otras modalidades, el sujeto presenta uno o más síntomas de cáncer en el tiempo en que se lleva a cabo la detección de Bcl-2. Por ejemplo, con respecto a cáncer ginecológico (v.gr., cáncer de ovario), uno o más síntomas de cáncer ginecológico incluyen aquellos seleccionados del grupo que consiste de dolor pélvico, sangrado vaginal anormal, inflamación o hinchazón abdominal, dolor de espalda persistente, malestar estomacal persistente, cambio en el patrón de intestino o vejiga (tal como constipación, diarrea, sangre en las heces, gases, heces delgadas, frecuencia o urgencia de orinar, constipación), dolor durante el coito, pérdida de peso no intencional de cinco o más kilos, anormalidad de la vulva o vaginal (tal como ampollas, cambio en el color de la piel, o flujo), cambio en la mama (tal como un abultamiento, dolor, flujo por los pezones, lunares, enrojecimiento o inflamación) y fatiga. En otra modalidad, la invención incluye un método para evaluación de pronóstico de un sujeto que tiene, o que se sospecha que tiene, cáncer, que comprende: a) determinar el nivel de Bcl-2 en una muestra biológica obtenida del sujeto, tal como orina, sangre o fluido de ascitos; b) comparar el nivel determinado en el paso (a) con un intervalo de Bcl-2 que se sabe que está presente en una muestra biológica obtenida de un sujeto normal que no tiene cáncer; y c) determinar el pronóstico del sujeto basado en la comparación del paso (b), en donde un alto nivel de Bcl-2 en el paso (a) indica una forma agresiva de cáncer y, por lo tanto, un pronóstico deficiente. Los términos "detectar" o "detección" incluye evaluar o de otra manera establecer la presencia o ausencia del objetivo Bcl-2 (secuencia de ácido nucleico que codifica Bcl-2 o producto de gen de Bcl-2 (polipéptido)), subunidades de los mismos, o combinaciones de objetivos de unión a agente, y similares, o prueba para, interrogar, indagar, establecer o de otra manera determinar una o más características reales de cáncer ginecológico, metástasis, etapa, o condiciones similares. El término abarca aplicaciones de diagnóstico, pronóstico y monitoreo para Bcl-2 y otros biomarcadores de cáncer. El término abarca metodologías de detección cuantitativa, semi-cuantitativa y cualitativa. En modalidades de la invención que implican detección de proteína Bcl-2 (a diferencia de moléculas de ácido nucleico que codifican proteína Bcl-2), el método de detección es preferiblemente un método basado en ELISA. Preferiblemente, en las diversas modalidades de la invención, el método de detección provee una salida (es decir, lectura o señal) con información concerniente a la presencia, ausencia o cantidad de Bcl-2 en una muestra de un sujeto. Por ejemplo, la salida puede ser cualitativa (v.gr., "positiva" o "negativa"), o cuantitativa (v.gr., una concentración tal como nanogramos por mililitro). En una modalidad, la invención se refiere a un método para detectar cáncer en un sujeto al cuantificar proteína Bcl-2 o ácidos nucleicos (ADN o ARN) codificadores en una muestra biológica tal como orina del sujeto, que comprende (a) poner en contacto (hacer reaccionar) la muestra biológica con un anticuerpo específico para Bcl-2 que es directamente o indirectamente marcado con una sustancia detectable; y (b) detectar la sustancia detectable. En una modalidad, la invención se refiere a un método para diagnosticar y/o monitorear cáncer en un sujeto al cuantificar Bcl-2 en una muestra biológica, tal como orina o sangre, del sujeto, que comprende (a) hacer reaccionar la muestra biológica con un anticuerpo específico para Bcl-2 que es directamente o indirectamente marcado con una sustancia detectable; y (b) detectar la sustancia detectable.

Las modalidades de los métodos de la invención implican (a) poner en contacto una muestra biológica de un sujeto con un anticuerpo específico para Bcl-2 que es directamente o indirectamente marcado con una enzima; (b) añadir un sustrato para la enzima en donde el sustrato se selecciona de modo que el sustrato, o un producto de reacción de la enzima y sustrato, forma complejos fluorescentes; (c) cuantificar Bcl-2 en la muestra midiendo fluorescencia de los complejos fluorescentes; y (d) comparar los niveles cuantificados con el del estándar. Una modalidad preferida de la invención comprende los siguientes pasos: (a) incubar una muestra biológica con un primer anticuerpo específico para Bcl-2 que es directamente o indirectamente marcado con una sustancia detectable, y un segundo anticuerpo específico para Bcl-2 que es inmovilizado; (b) separar el primer anticuerpo del segundo anticuerpo para proveer una primera fase de anticuerpo y una segunda fase de anticuerpo; (c) detectar la sustancia detectable en la primera o segunda fase de anticuerpo cuantificando Bcl-2 en la muestra biológica; y (d) comparar la Bcl-2 cuantificada con un estándar. Un estándar usado en un método de la invención puede corresponder a niveles de Bcl-2 obtenidos para muestras de sujetos de control sanos, de sujetos con enfermedad benigna (v.gr., enfermedad ginecológica benigna), sujetos con cáncer ginecológico de etapa temprana, o de otras muestras del sujeto. Los niveles incrementados de Bcl-2 en comparación con el estándar pueden ser indicativos de cáncer, tales como cáncer de ovario de etapa temprana o tardía. La invención también contempla el uso de los métodos, dispositivos, y equipos descritos aquí junto con uno o más marcadores adicionales ("biomarcadores") para cáncer. Por lo tanto, la invención contempla un método para analizar una muestra biológica para la presencia de Bcl-2 y analizar la misma muestra, u otra muestra biológica del mismo sujeto, para otros marcadores que son indicadores específicos de un cáncer. Uno o más marcadores adicionales pueden ser detectados antes, durante, y/o después de que se lleva a cabo la detección de Bcl-2. Ejemplos de marcadores incluyen CA125, LPA y OVXI. En una modalidad preferida, los marcadores son Bcl-2 y CA125. Los métodos, dispositivos y equipos descritos aquí pueden ser modificados incluyendo agentes para detectar los marcadores adicionales, o ácidos nucleicos que codifican los marcadores. Marcadores de cáncer que se pueden usar junto con la invención incluyen, pero no se limitan a: alfa fetoproteína (AFP), v.gr., para cánceres pancreático, de riñon, ovario, cuello uterino y testicular; antígeno embrionario carcinogénico (CEA), v.gr., para cánceres de pulmón, pancreático, de riñon, mama, uterino, hígado, gástrico y colorrectal; antigeno de carbohidrato 15-3 (CAI 5-3), v.gr., para cánceres de pulmón, pancreático, mama, ovario e hígado; antigeno de carbohidrato 19-9 (CA 19-9), v.gr., para cánceres de pulmón, ovario, uterino, hígado, gástrico, colorrectal y conducto biliar; antigeno de cáncer 125 (CA125), v.gr., para pulmón, páncreas, mama, ovario, cuello uterino, uterino, hígado, gástrico y colorrectal; antígeno específico de próstata libre y antígeno alfa(l) específico de próstata (PSA), para cáncer de próstata; antígeno específico de próstata libre (PSAF), para cánceres de próstata y colorrectal; complejo de antígeno alfa(l) específico de próstata antiquimotripsina (PSAC), para cáncer de próstata; fosfatasa ácida prostática (PAP), para cáncer de próstata; tiroglobulina humana (hTG), para cáncer de tiroides o tumor de Wilm; gonadaotropina coriónica beta (hCGb) humana, v.gr., para cánceres de pulmón, pancreático, riñon, ovario, uterino, testicular, hígado, colorrectal, vejiga, y cerebro; ferritina (Ferr), v.gr.; para cáncer de pulmón, cáncer testicular, cáncer de la laringe, linfoma de Burkitt, neuroblastoma y leucemia; enolasa específica de neurona (NSE), para cáncer de pulmón, cáncer de tiroides, tumor de Wilm y neuroblastoma; interleucina 2 (IL-2), para cáncer de riñon y mieloma múltiple; interleucina 6 (IL-6), para cáncer de riñon, cáncer de mama, cáncer de ovario y mieloma múltiple; microglobulina beta 2 (B2M), para cáncer de riñon, cáncer de ovario, cáncer de próstata, leucemia, mieloma múltiple y linfoma; y microglobulina alfa 2 (A2M), para cáncer de próstata. La selección de muestra biológica (tal como sangre u orina) en la cual los marcadores de cáncer antes mencionados son para diagnóstico y/o pronóstico pueden ser fácilmente determinados por los expertos en la técnica. Como se indicó antes, la presente invención provee un método para monitoreo, diagnóstico, o para el pronóstico de cáncer, tal como cáncer de ovario, en un sujeto al detectar Bcl-2 en una muestra biológica del sujeto. En una modalidad, el método comprende poner en contacto la muestra con un anticuerpo especifico para Bcl-2 que es directamente o indirectamente marcado con una sustancia detectable, y detectar la sustancia detectable. Los métodos de la invención se pueden usar para la detección de una sobre- o una sub-abundancia de Bcl-2 en relación con un estado no desordenado o la presencia de una Bcl-2 modificada (v.gr., menor que la longitud de la lámina) que se correlaciona con un estado desordenado (v.gr., cáncer de ovario), o una progresión hacia un estado desordenado. Los métodos descritos aquí se pueden usar para evaluar la probabilidad de la presencia de células malignas o pre-malignas. Dichos métodos se pueden usar para detectar tumores, cuantificar su crecimiento y ayudar en el diagnóstico y pronóstico de cáncer ginecológico. Los métodos se pueden usar para detectar la presencia de metástasis de cáncer, asi como confirmar la ausencia o remoción de todo el tejido tumoral después de cirugía, quimioterapia de cáncer, y/o terapia de radiación. Además se pueden usar para monitorear quimioterapia de cáncer y reaparición de tumor. Los métodos de la invención son particularmente útiles en el diagnóstico de cáncer de ovario de etapa temprana (v.gr., cuando el sujeto es asintomático) y el pronóstico de cáncer de progresión de enfermedad de ovario y mortalidad. Como se ilustra aquí, los niveles incrementados de Bcl-2 detectados en una muestra (v.gr., orina, suero, plasma, sangre entera, ascitos) comparados con un estándar (v.gr., niveles para trastornos normales o benignos) son indicativos de enfermedad de etapa avanzada, tipo histológico seroso, reducción subóptima, tumor residual grande, y/o riesgo incrementado de progresión de enfermedad y mortalidad. Los términos "muestra", "muestra biológica", y similares se refieren a un tipo de material que se sabe o que se sospecha que expresa o que contiene Bcl-2, tal como orina. La muestra e prueba se puede usar directamente como se obtiene de la fuente o siguiendo un pretratamiento para modificar el carácter de la muestra. La muestra se puede derivar de cualquier fuente biológica, tal como tejidos o extractos, incluyendo células (v.gr., células tumorales) y fluidos fisiológicos, tales como, por ejemplo, sangre entera, plasma, suero, fluido peritoneal, ascitos y similares. La muestra se puede obtener de animales, preferiblemente mamíferos, muy preferiblemente humanos. La muestra se puede pretratar por cualquier método y/o se puede preparar en cualquier medio conveniente que no interfiera con la prueba. La muestra se puede tratar antes de usarse, tal como preparando plasma de la sangre, diluyendo fluidos viscosos, aplicando uno o más inhibidores de proteasa a muestras tales como orina (v.gr., fluoruro de 4-(2-.aminoetil)-bencensulfonilo, EDTA, leupeptina y/o pepstatina) y similares. El tratamiento de muestras puede implicar filtración, destilación, extracción, concentración, inactivación de componentes de interferencia, la adición de reactivos y similares. La presencia de bcl-2 puede ser detectada en una variedad de muestras biológicas, incluyendo tejidos o extractos de los mismos.

Preferiblemente, Bcl-2 es detectado en orina humana. En modalidades de la invención, el método descrito aquí es adaptado para diagnosticar y monitorear cáncer ginecológico cuantificando Bcl-2 en muestras biológicas de un sujeto. Preferiblemente, la cantidad de Bcl-2 cuantificado en una muestra de un sujeto que es probado se comparara con los niveles cuantificados para otra muestra o una muestra temprana del sujeto, o niveles cuantificados para una muestra de control. Los niveles para muestras de control de sujetos sanos pueden ser estabilizados por estudios estadísticos prospectivos y/o retrospectivos. Los sujetos sanos que no tienen enfermedad clínicamente evidente o anormalidades se pueden seleccionar para estudios estadísticos. El diagnóstico se puede hacer encontrando niveles de Bcl-2 estadísticamente diferentes comparados con una muestra de control o niveles previos cuantificados para el mismos sujeto. El término "Bcl-2" se refiere a proteína de linfoma 2 de células B humanas (también conocida como CLL/linfoma 2 de células B), una proteína mitocondrial externa integral que bloquea la muerte apoptótica de algunas células tales como línfocitos (Cleary MX. et al, Cell, 1986, 47(1 ): 19-28; Tsujimoto Y., y Croce CM., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 1986, 83:5214-5218, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad). El término "Bcl-2" incluye secuencias de ácido nucleico (v.gr., Acceso a GenBank No. M14745; SEQ ID NO: 1 ) que codifican el producto de gen de Bcl-2 (polipéptido), así como el polipéptido de Bcl-2 (v.gr., Acceso a GenBank No. AAA35591 ; SEQ ID NO:2). El término incluye todos los homólogos, variantes alélicas, isoformas y precursores de Bcl-2 humana que ocurren naturalmente de los accesos a GenBank Nos. M14745 y AAA35591. En general, las vanantes alélicas que ocurren naturalmente de Bcl-2 humana compartirán homología de secuencia significativa (70-90%) con las secuencias mostradas en accesos a GenBank Nos. M14745 y AAA35591 . Las variantes alélicas pueden contener sustituciones de aminoácidos conservativas de la secuencia Bcl-2 o contendrán una sustitución de un aminoácido de una posición correspondiente en un homólogo de Bcl-2. Dos variantes de transcripciones, alfa y beta, producidas por empalme alternativo, difieren en sus extremos C-terminales. La variante alfa (Acceso a GenBank No. NP_000624 (SEQ ID NO:4); y Acceso a GenBank No. NM_000633 (SEQ ID NO:3)) representa la transcripción más grande y codifica la isoforma más larga (alfa), y beta siendo más corta (Acceso a GenBank No. NM_000648 (SEQ ID NO:6); Acceso a GenBank No. NP_000657 (SEQ ID NO:5). La variante beta difiere en la 3' UTR y región codificadora comparada con la variante alfa, asi como el extremo C-terminal. En una modalidad particular, los métodos, dispositivos, y equipos de la invención son específicos para Bcl-2 (v.gr., SEQ ID NOs: 1 , 2, 3, 4, 5, y/o 6), pero no moléculas de ácido nucleico o polipéptidos conocidos en la técnica como moléculas "similares a Bcl-2" (v.gr., utilizando agentes de unión específicos para (v.gr., inmunorreactivos con) Bcl-2, pero no reactivos con moléculas similares a Bcl-2), tales como aquellos descritos en Rubén et al., publicación de solicitud de patente de E.U.A. 2002/0106731 A1 , publicada el 8 de agosto de 2002, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad.

Los términos "sujeto" y "paciente" se usan intercambiablemente aquí para referirse a un animal de sangre caliente, tal como un mamífero, que puede ser afectado con cáncer. En algunos cánceres, el sujeto es un mamífero humano o no humano de sexo femenino. En otros cánceres, el sujeto es un mamífero humano o no humano de sexo masculino. Los agentes que son capaces de detectar Bcl-2 en las muestras biológicas de sujetos son aquellos que interactúan o se unen con el polipéptido Bcl-2 o la molécula de ácido nucleico que codifica Bcl-2. Ejemplos de dichos agentes (también referidos aquí como agentes de unión) incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos de Bcl-2 o fragmentos de los mismos que se unen a Bcl-2, parejas de unión de Bcl-2, y moléculas de ácido nucleico que hibridan a las moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos de Bcl-2. Preferiblemente, el agente de unión es marcado con una sustancia detectable (v.gr., una porción detectable). El agente de unión puede funcionar como un marcador.

Anticuerpos de Bcl-2 Los anticuerpos específicos para Bcl-2 que se usan en los métodos de la invención se pueden obtener de fuentes científicas y comerciales. Alternativamente, Bcl-2 nativos aislados o Bcl-2 recombinante se pueden utilizar para preparar anticuerpos, anticuerpos monoclonales o policlonales, y fragmentos inmunológicamente activos (v.gr., un fragmento Fab o (Fab)2), una cadena pesada de anticuerpo, una cadena ligera de anticuerpo, anticuerpos humanizados, una molécula Fv una sola cadena genéticamente manipulada (Ladne et al., patente de E.U.A. No. 4,946,778), o un anticuerpo quimérico, por ejemplo, un anticuerpo que contiene la especificidad de unión de un anticuerpo de murino, pero en el cual las porciones restantes son de origen humano. Los anticuerpos incluyendo anticuerpos monoclonales y policlonales, fragmentos y quimeras, se pueden preparar usando métodos conocidos por los expertos en la técnica. Preferiblemente, los anticuerpos usados en los métodos de la invención son reactivos contra Bcl-2 si se unen con una Ka mayor que o igual a 107 M. En un inmunoensayo intercalado de la invención, se utilizan los anticuerpos policlonales de ratón y anticuerpos policlonales de conejo. Para producir anticuerpos monoclonales, un mamífero hospedero es inoculado con una proteína o péptido Bcl-2 y después reforzado. Los bazos se recolectan de mamíferos inoculados unos cuantos días después del refuerzo final. Suspensiones de células de los bazos se fusionan con una célula tumoral de conformidad con el método general descrito por Kohier y Milstein {Nature, 1975, 256:495-497). Para ser útil, un fragmento de péptido debe contener suficientes residuos de aminoácidos para definir el epítope de la molécula de Bcl-2 que es detectada. Si el fragmento es demasiado corto para ser inmunogénico, se puede conjugar a una molécula portadora. Algunas moléculas portadoras adecuadas incluyen hemocianina de lapa y albúmina de suero de bovino. La conjugación se puede llevar a cabo por métodos conocidos en la técnica. Un método de éstos es combinar un residuo de cisteína del fragmento con un residuo de cisteína sobre la molécula portadora. Los fragmentos de péptido pueden ser sintetizados por métodos conocidos en la técnica. Algunos métodos adecuados los describe Stuart y Young en "Solid Phase Peptide Synthesis," segunda edición, Pierce Chemical Company (1984). La purificación de los anticuerpos o fragmentos se pueden lograr mediante una variedad de métodos conocidos por los expertos en la técnica incluyendo, precipitación por sulfato de amonio o sulfato de sodio seguido por diálisis contra solución salina, cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de afinidad o inmunoafinidad así como filtración en gel, electroforesis de zona, etc. (Goding en, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, 2d ed., pp. 104-126, Orlando, Fia., Academic Press). Es preferible usar anticuerpos purificados o fragmentos purificados de los anticuerpos que tienen por lo menos una porción de una región de unión de Bcl-2, incluyendo fragmentos tales como Fv, F(ab')2, Fab (Harlow y Lañe, 1988, Antibody Cold Spring Harbor) para la detección de Bcl-2 en los fluidos de pacientes ginecológicos con cáncer o aquellos en riesgo, preferiblemente en la orina o sangre de pacientes con cáncer de ovario. Para usarse en la detección y/o monitoreo de cáncer, los anticuerpos purificados pueden ser covalentemente unidos, ya sea directamente o mediante enlazador, a un compuesto que sirve como un grupo reportero para permitir la detección de la presencia de Bcl-2. Una variedad de diferentes tipos de sustancias puede servir como el grupo reportero, incluyendo pero sin limitarse a enzimas, colorantes, isótopos radioactivos de metal y no metal, compuestos fluorogénicos, compuestos fluorescentes, etc. Los métodos para la preparación de conjugados de anticuerpo de los anticuerpos (o fragmentos de los mismos) de la invención útiles para detección, monitoreo se describen en las patentes de E.U.A. Nos. 4,671 ,958; 4,741 ,900 y 4,867,973. En un aspecto de la invención, epitopes de unión preferidos se pueden identificar de una secuencia de gen de Bcl-2 conocida y su secuencia de aminoácidos codificada y usada para generar anticuerpos Bcl-2 con afinidad de unión alta. También, la identificación de epitopes de unión sobre Bcl-2 se puede usar en el diseño y construcción de anticuerpos preferidos. Por ejemplo, un ADN que codifica un epítope preferido sobre Bcl-2 puede ser recombinantemente expresado y usado para seleccionar un anticuerpo que se une selectivamente a ese epítope. Los anticuerpos seleccionados entonces se expusieron a la muestra bajo condiciones suficientes para permitir la unión específica del anticuerpo al epítope de unión específico sobre Bcl-2 y la cantidad de complejo formado entonces detectado. Las metodologías de anticuerpo específicas se entienden bien y se describen en la literatura. Una descripción más detallada de su preparación se puede encontrar, por ejemplo, en Practical Immunology, Butt, W. R., ed., Marcel Dekker, New York, 1984. La presente invención también contempla la detección de anticuerpos de Bcl-2. Bcl-2 es un marcador específico de cáncer ginecológico. Por lo tanto, la detección de anticuerpos de Bcl-2 en fluidos biológicos de un sujeto puede permitir el diagnóstico de cáncer ginecológico.

Pruebas de unión de proteina Los anticuerpos específicamente reactivos con Bcl-2, o derivados, tales como conjugados de enzima o derivados marcados, se pueden usar para detectar Bcl-2 en varias muestras biológicas, por ejemplo se pueden usar en cualesquiera inmunoensayos conocidos que se basan en la interacción de unión entre un determinante antigénico de una proteina y los anticuerpos. Ejemplos de dichos ensayos son radioinmunoensayos, inmunoensayo de enzima (v.gr., ELISA), inmunofluorescencia, inmnunoprecipitación, aglutinación de látex, hemaglutinación y pruebas histoquimicas. Un anticuerpo específico para Bcl-2 se puede marcar con una sustancia detectable y localizada en muestras biológicas basadas bajo la presencia de la sustancia detectable. Ejemplos de sustancias detectables incluyen, pero no se limitan a, los siguientes radioisótopos (v.gr., 3H, 14C, 35S, 125l, 31 l), marcadores fluorescentes (v.gr., FITC, rodamina, lantánido-fósforos), marcadores luminiscentes tales como luminol; marcadores enzímáticos (v.gr., peroxidasa de rábano picante, beta-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina, acetilcolinesteasa), grupos biotinilo (que pueden ser detectados por avidita marcada, v.gr., estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede ser detectada por métodos ópticos o calorimétricos), epítopes de polipéptido predeterminados reconocidos por un reportero secundario (v.gr., secuencias de pares de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión de metal, etiquetas de epítope). Se pueden utilizar métodos indirectos en los cuales la reacción de antígeno-anticuerpo primaria es amplificada por la introducción de un segundo anticuerpo, que tiene especificidad para el anticuerpo reactive contra Bcl-2. A manera de ejemplo, si el anticuerpo que tiene especificidad contra Bcl-2 es un anticuerpo de IgG de conejo, el segundo anticuerpo puede ser gamma-globulina anti-conejo de cabra marcada con una sustancia detectable como se describe aquí. Los métodos para conjugar o marcar los anticuerpos descritos anteriormente los puede lograr fácilmente un experto en la técnica. (Véase, por ejemplo, Imman, Methods in Enzymology, Vol. 34, Affinity Techniques, Enzyme Purification: Part B, Jakoby and Wichek (eds.), Academic Press, New York, p. 30, 1974; y Wilchek y Bayer, "The Avidin-Biotin Complex in Bioanalytical Applications," Anal. Biochem. 171 : 1 -32, 1988, referentes a métodos para conjugar o marcar los anticuerpos con una enzima o patrón de unión de ligando). La fluorometría resuelta en el tiempo se puede usar para detectar una señal. Por ejemplo, el método descrito en Christopoulos T.K. y Diamandis E.P., Anal. Chem., 1992:64:342- 346 se puede usar con un fluorómetro resuelto en el tiempo convencional. Por lo tanto, de conformidad con una modalidad de la invención, se provee un método en donde un anticuerpo de Bcl-2 es marcado con una enzima, se añade un sustrato para la enzima en donde el sustrato se selecciona de manera que el sustrato, o un producto de reacción de la enzima y sustrato, forma complejos fluorescentes con un metal lantánido. Un metal lantánido se añade y Bcl-2 se cuantifica en la muestra midiendo la fluorescencia de los complejos fluorescentes. Los anticuerpos específicos para Bcl-2 pueden ser directamente o indirectamente marcados con una enzima. Las enzimas se seleccionaron con base en la capacidad de un sustrato de la enzima, o un producto de reacción de la enzima y sustrato, para formar complejo con metales lantánido tales como europio y terbio. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen fosfatasa alcalina y beta-galactosidasa. Preferiblemente, la enzima es fosfatasa alcalina. Los Bcl-2 anticuerpos también pueden ser indirectamente marcados con una enzima. Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser conjugados a una pareja de un par de unión de ligando, y la enzima puede ser acoplada a la otra pareja de un par de unión de ligando. Ejemplos representativos incluyen avidina-biotina, y proteína de unión de riboflavina-riboflavina. Preferiblemente, los anticuerpos son biotinilados, y la enzima es acoplada a estreptavidina. En una modalidad del método, el anticuerpo unido a Bcl-2 en una muestra es detectado al añadir un sustrato para la enzima. El sustrato se selecciona de modo que en presencia de un metal lantánido (v.gr., europio, terbio, samario y disprosio, preferiblemente europio y terbio), el sustrato o un producto de reacción de la enzima y sustrato, forma un complejo fluorescente con el metal lantánido. Ejemplos de enzimas y sustratos para enzimas que proveen dichos complejos fluorescentes se describen en la patente de E.U.A. No. 5,31 12,922 a Diamandis. A manera de ejemplo, cuando el anticuerpo es directamente o indirectamente marcado con fosfatasa alcalina, el sustrato utilizado en el método puede ser fosfato de 4-metilumbeliferilo, o fosfato de 5-fluorosalicilo. La intensidad de fluorescencia de los complejos típicamente se mide usando un fluorómetro resuelto en el tiempo, v.gr., un ¡nmunoanalizador CyberFluor 615 Immoanalyzer (Nordion International, Kanata, Ontario). La muestra, anticuerpo específico para Bcl-2, o Bcl-2, puede ser inmovilizada en un portador. Ejemplos de portadores adecuados son agarosa, celulosa, dextrano, Sephadex, Sepharose, liposomas, carboximetilcelulosa, poliestireno, papel filtro, resina de intercambio de iones, película de plástico, tubo de plástico, esferas de vidrio, copolimero de poliamina-éter metilvinílico-ácido maleico, copolimero de aminoácido, copolimero de etileno-ácido maleico, nylon, seda, etc. El portador puede estar en forma de, por ejemplo, un tubo, placa de prueba, pozo, esferas, disco, esfera, etc. El anticuerpo inmovilizado se puede preparar haciendo reaccionar el material con un vehículo insoluble adecuado usando métodos químicos y físicos conocidos, por ejemplo, acoplamiento de bromuro de cianógeno. De conformidad con una modalidad, la presente invención provee un modo para determinar Bcl-2 en una muestra apropiada tal como orina midiendo Bcl-2 por inmunoensayo. Será evidente para un experto en la técnica que una variedad de métodos de inmunoensayo se pueden usar para medir Bcl-2. En general, un método de inmunoensayo de Bcl-2 puede ser competitivo o no competitivo. Los métodos competitivos típicamente utilizan un anticuerpo inmovilizado o ¡nmovilizable a Bcl-2 (anti-Bcl-2) y una forma marcada de Bcl-2. La Bcl-2 de la muestra y la Bcl-2 marcada compiten para unirse a anti-Bcl-2. Después de la separación de la Bcl-2 marcada resultante que se ha unido a anti-Bcl-2 (fracción unida) de aquella que ha permanecido sin unirse (fracción no unida), la cantidad del marcador ya sea en la fracción unida o en la no unida se mide y se puede correlacionar con la cantidad de Bcl-2 en la muestra biológica de cualquier manera convencional, v.gr., en comparación con una curva estándar. Preferiblemente, un método no competitivo se usa para la determinación de Bcl-2-, el método más común siendo el método de "intercalado". En esta prueba se utilizan dos anticuerpos anti-Bcl-2. Uno de los anticuerpos anti-Bcl-2 es directamente o indirectamente marcado (también referido como el "anticuerpo de detección") y el otro es inmovilizado o ¡nmovilizable (también referido como el "anticuerpo de captura"). Los anticuerpos de captura y detección se pueden poner en contacto simultáneamente o secuencialmente con la muestra biológica. Los métodos secuenciales se pueden lograr incubando el anticuerpo de captura con la muestra, y añadiendo el anticuerpo de detección en un tiempo predeterminado posteriormente (algunas veces referido como el método "directo"); o el anticuerpo de detección se puede incubar con la muestra primero y después añadir el anticuerpo de captura (algunas veces referido como el método de "reversa"). Después de que ha(n) ocurrido la(s) incubación(es) necesaria(s), para completar la prueba, el anticuerpo de captura es separado de la mezcla de prueba líquida, y el marcador se mide en por lo menos una porción de la fase de anticuerpo de captura separada o el resto de la mezcla de prueba líquida. Generalmente, se mide en la fase de anticuerpo de captura ya que comprende Bcl-2 unido por ("intercalado" entre) los anticuerpos de captura y detección. En una prueba inmunométrica de dos sitios típica para Bcl-2, uno o los dos de los anticuerpos de captura y detección son anticuerpos policlonales. El marcador usado en el anticuerpo de detección se puede seleccionar de cualquiera de aquellos conocidos convencionalmente en la técnica. Igual que con otras modalidades de la prueba de detección de proteína, el marcador puede ser una enzima o una porción quimioluminiscente, por ejemplo, o un isótopo radioactivo, un fluoróforo; un ligando detectable (v.gr., detectable por una unión secundaria por una pareja de unión marcada para el ligando), y similares. Preferiblemente, el anticuerpo es marcado con una enzima que es detectada añadiendo un sustrato que se selecciona de modo que un producto de reacción de la enzima y sustrato forma complejos fluorescentes. El anticuerpo de captura se selecciona de manera que provea un modo para ser separado del resto de la mezcla. Por consiguiente, el anticuerpo de captura se puede introducir a la prueba en una forma ya inmovilizada o insoluble, o puede estar en una forma inmovilizable, es decir, una forma que permite que la inmovilización se logre después de la introducción del anticuerpo de captura a la prueba. Un anticuerpo de captura inmovilizado puede comprender un anticuerpo covalentemente o no covalentemente unido a una fase sólida tal como una partícula magnética, una partícula de látex, una placa de microtitulación de pozos múltiples, una esfera, un tubo u otro recipiente de reacción. Un ejemplo de un anticuerpo de captura inmovilizable es un anticuerpo que ha sido químicamente modificado con una porción de ligando, v.gr., un hapteno, biotina, o similar, y que puede ser subsecuentemente inmovilizado por contacto con una forma inmovilizada de una pareja de unión para el ligando, v.gr., un anticuerpo, avidina o similar. En una modalidad, el anticuerpo de captura puede ser inmovilizado usando un anticuerpo específico de especie para el anticuerpo de captura que se une a la fase sólida. Un método de inmunoensayo intercalado particular de la invención utiliza dos anticuerpos reactivos contra Bcl-2, un segundo anticuerpo que tiene especificidad contra un anticuerpo reactivo contra Bcl-2 marcado con un marcador enzimático, y un sustrato fluorogénico para la enzima. En una modalidad, la enzima es fosfatasa alcalina (ALP) y el sustrato es fosfato de 5-fluorosalicilo. ALP digiere el fosfato del sustrato fluorogénico, fosfato de 5-fluorosalicilo, para producir ácido 5-fluorosalicílico (FSA). Acido 5-fluorosalicílico entonces puede formar un complejo ternario altamente fluorescente de la forma FSA-Tb(3+)-EDTA, que se puede cuantificar midiendo la fluorescencia de Tb3+ en un modo resuelto en el tiempo. La intensidad de fluorescencia típicamente se mide usando una fluorometría resuelta en el tiempo como se describe aquí.

Se pretende que los métodos y formatos de inmunoensayo anteriormente descritos sean ilustrativos y no limitantes ya que, en general, se entenderá que cualquier método o formato de de inmunoensayo se puede usar en la presente invención. Los métodos, dispositivos y equipos de detección de proteina de la invención pueden utilizar tecnología de sensor de nanoalambre (Zhen et al, Nature Biotechnology, 2005, 23(10): 1294-1301 ; Lieber et al, Anal. Chem., 2006, 78(13):4260-4269, que se incorporan aquí por referencia) o tecnología de microvoladizo (Lee et al., Biosens. Bioelectron, 2005, 20(10):2157-2162; Wee et al., Biosens. Bioelectron., 2005, 20(10): 1932-1938; Campbell y Mutharasan, Biosens. Bioelectron., 2005, 21 (3):462-473; Campbell y Mutharasan, Biosens. Bioelectron., 2005, 21 (4):597-607; Hwang et al, Lab Chip, 2004, 4(6):547-552; Mukhopadhyay et al, Nano. Lett, 2005, 5(12):2835-2388, que se incorporan aquí por referencia) para detección de Bcl-2 en muestras. Además, Huang et al. describen un inmunoensayo de antígeno específico de próstata sobre un biosensor de resonancia de plasmón de superficie comercialmente disponible (Biosens. Bioelectron., 2005, 21 (3):483-490, que se incorpora aquí por referencia) que se puede adaptar para detección de Bcl-2. Inmunoensayos miniaturizados de alta sensibilidad también se pueden utilizar para detección de Bcl-2 (Cesaro-Tadic et al, Lab Chip, 2004, 4(6):563-569; Zimmerman et al, Biomed. Microdispositivos, 2005, 7(2): 99-1 10, que se incorporan aquí por referencia).

Acidos nucleicos Los ácidos nucleicos que incluyen ácidos nucleicos, oligonucleótidos, oligonucleótidos de antisentido y oligonucleótidos sintéticos que ocurren naturalmente que hibridan al ácido nucleico que codifica Bcl-2, son útiles como agentes para detectar la presencia de Bcl-2 en las muestras biológicas de pacientes con cáncer ginecológico o aquellos en riesgo de cáncer ginecológico, preferiblemente en la orina de pacientes con cáncer de ovario o aquellos en riesgo de cáncer de ovario. La presente invención contempla el uso de secuencias de ácido nucleico correspondientes a la secuencia codificadora de Bcl-2 y a la secuencia complementaria de las mismas, así como secuencias complementarias a las secuencias de transcripción de Bcl-2 que ocurren adicionalmente hacia el extremo 5' o hacia el extremo 3' de la secuencia codificadora (v.gr., secuencias contenidas en, o que se extienden en, las regiones no traducidas 5' y 3') para usarse como agentes para detectar la expresión de Bcl-2 en muestras biológicas de pacientes con cáncer ginecológico, o aquellos en riesgo de cáncer ginecológico, preferiblemente en la orina de pacientes con cáncer de ovario o aquellos en riesgo de cáncer de ovario. Los oligonucleótidos preferidos para detectar la presencia de Bcl-2 en muestras biológicas son aquellos que son complementarios a por lo menos parte de la secuencia de ADNc que codifica Bcl-2. Estas secuencias complementarias también se conocen en la técnica como secuencias de "antisentido". Estos oligonucleótidos pueden ser oligoribonucleótidos u oligodesoxirribonucleótidos. Además, los oligonucleótidos pueden ser oligómeros naturales compuestos de los nucleótidos biológicamente significativos, es decir, A (adenina), dA (desoxiadenina), G (guanina), dG (desoxiguanins), C (citosins), dC (desoxicitosins), T (timins) y U (uracilo), o especies de oligonucleótido modificadas, usando, por ejemplo, un grupo metilo o un átomo de azufre en lugar de un oxígeno de fosfato en el enlace de fosfodiéster del inter-nucleótido. Además, estos nucleótidos mismos, y/o las porciones ribosa pueden ser modificadas. Los oligonucleótidos pueden ser sintetizados químicamente, usando cualquiera de los métodos de síntesis de oligonucleótido químicos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los oligonucleótidos se pueden preparar usando cualquiera de los sintetizadores de ácido nucleico automatizados comercialmente disponibles. Alternativamente, los oligonucleótidos se pueden crear mediante técnicas de ADN recombinantes estándares, por ejemplo, induciendo transcripción de la cadena no codificadora. La secuencia de ADN que codifica Bcl-2 puede ser invertida en un sistema de ADN recombinante, v.gr., insertado en orientación de reversa hacia el extremo 3' de un promotor adecuado, de tal manera que la cadena no codificadora ahora es transcrita. Aunque se puede utilizar un oligonucleótido de cualquier longitud para hibridar a un ácido nucleico que codifica Bcl-2, los oligonucleótidos típicamente dentro del intervalo de 8-100 nucleótidos son preferidos. La mayoría de los oligonucleótidos preferibles para usarse en la detección de Bcl-2 en las muestras de orina son aquellos dentro del intervalo de 15-50 nucleótidos. El oligonucleótido seleccionado para hibridar a la molécula de ácido nucleico de Bcl-2, ya sea sintetizado químicamente o por tecnología de ADN recombinante, es entonces aisaldo y purificado usando técnicas estándares y después preferiblemente marcado (v.gr., con 35S o 32P) usando protocolos de mareaje estándares. La presente invención también contempla el uso de pares de oligonucleótido en reacciones de cadena de polimerasa (PCR) para detectar la expresión de Bcl-2 en muestras biológicas. Los pares de oligonucleótidos incluyen un iniciador de Bcl-2 hacia adelante e iniciador de Bcl-2 de reversa. La presencia de Bcl-2 en una muestra de un paciente se puede determinar por hibridación de ácido nucleico, tal como pero sin limitarse a análisis de Northern blot, transferencia de punto, análisis de Southern blot, hibridación in situ de fluorescencia (FISH) y PCR. La cromatografía, preferiblemente CLAR, y otras pruebas conocidas también se pueden usar para determinar niveles de ARN mensajero de Bcl-2 en una muestra. Las moléculas de ácido nucleico que codifican Bcl-2 de manera concebible se pueden encontrar en los fluidos biológicos dentro de una célula cancerosa Bcl-positiva que está siendo cambiada o liberada en el fluido bajo investigación. En un aspecto, la presente invención contempla el uso de ácidos nucleicos como agentes para detectar Bcl-2 en muestras biológicas de pacientes, en donde los ácidos nucleicos son marcados. Los ácidos nucleicos pueden ser marcados con un marcador radioactivo, un marcador fluorescente, una enzima, una etiqueta quimioluminescente, una etiqueta colorimétrica u otros marcadores o etiquetas que se describieron anteriormente o que se conocen en la técnica. En otro aspecto, la presente invención contempla el uso de análisis de Northern blot para detectar la presencia de ARNm de Bcl-2 en una muestra de fluido del cuerpo. El primer paso del análisis implica separar una muestra que contiene ácido nucleico de Bcl-2 por electroforesis de gel. Los ácidos nucleicos dispersos son entonces transferidos a un filtro de nitrocelulosa u otro filtro. Subsecuentemente, el oligonucleótido marcado es expuesto al filtro bajo condiciones de hibridación adecuadas, v.gr., 50% de formamida, 5 x SSPE, 2 x solución de Denhardt, 0.1% SDS a 42° C, como se describe en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Maniatis et al (1982, CSH Laboratory). Otros procedimientos útiles conocidos en la técnica incluyen hibridación en solución, hibridación de ARN de punto y ranura, y microdisposiciones basadas en sonda. La medición de la radioactividad de fragmentos hibridados, usando procedimientos estándares conocidos en la técnica cuantifica la cantidad de ácido nucleico de Bcl-2 presente en el fluido biológico de un paciente. La transferencia de punto implica aplicar muestras que contienen el ácido de interés a una membrana. El ácido nucleico se puede desnaturalizar antes o después de la aplicación a la membrana. La membrana se incuba con una sonda marcada. Los procedimientos de transferencia de punto son bien conocidos por el experto en la técnica y se describen en forma más completa en las patentes de E.U.A. Nos. 4,582,789 y 4,617,261 , cuyas descripciones se incorporan aquí por referencia. La reacción de cadena de polimerasa (PCR) es un procedimiento para amplificar una o más secuencias específicas de ácido nucleico presentes en una muestra de ácido nucleico usando iniciadores y agentes para polimerización y después detectando la secuencia amplificada. El producto de extensión de un iniciador cuando se híbrida al otro se convierte en una plantilla para la producción de la secuencia de ácido nucleico específica deseada, y viceversa, y el procedimiento se repite tan frecuentemente como es necesario para producir la cantidad deseada de la secuencia. El experto en la técnica que ha de detectar la presencia de secuencia deseada (patente de E.U.A. No. 4,683, 195) rutinariamente usa reacción de cadena de polimerasa. Un ejemplo específico de PCR que es utilizado rutinariamente por un experto en la técnica para detectar secuencias deseadas es PCR de transcripción de reversa (RT-PCR; Saiki et al, Science, 1985, 230: 1350; Scharf et al, Science, 1986, 233: 1076). RT-PCR implica aislar ARN total del fluido biológico, desnaturalizando el ARN en presencia de iniciadores que reconocen la secuencia de ácido nucleico deseada, usando los iniciadores para generar una copia de ADNc del ARN por transcripción inversa, amplificar el ADNc por PCR usando iniciadores específicos, y detectar el ADNc amplificado por electroforesis u otros métodos conocidos por un experto en la técnica.

En una modalidad preferida, los métodos de detección de ácido nucleico de Bcl-2 en fluidos biológicos de pacientes con cáncer ginecológico o aquellos en riesgo del mismo, preferiblemente orina de pacientes con cáncer de ovario o aquellos en riesgo del mismo, incluyen análisis de Northern blot, transferencia de punto, análisis de Southern blot, FISH y PCR.

Dispositivos Los métodos de la invención se pueden llevar a cabo en un soporte sólido. Los soportes sólidos usados pueden ser aquellos que son convencionales para el propósito de evaluar un analito en una muestra biológica, y son típicamente construidos de materiales tales como celulosa, polisacárido tal como Sephadex, y similares, y pueden ser parcialmente rodeados por un alojamiento para protección y/o manejo del soporte sólido. El soporte sólido puede ser rígido, semi-rígido, flexible, elástico (que tiene memoria de forma), etc., dependiendo de la aplicación deseada. Bcl-2 se puede detectar en una muestra in vivo o in vitro (ex vivo). Cuando, de conformidad con una modalidad de la invención, la cantidad de Bcl-2 en una muestra se ha de determinar sin remover las muestra del cuerpo (es decir, in vivo), el soporte debe ser uno que sea inocuo al sujeto y puede estar en cualquier forma conveniente para inserción en una parte apropiada del cuerpo. Por ejemplo, el soporte puede ser una sonda hecha de politetrafluoroetileno, poliestireno u otro material de plástico no dañino rígido y que tenga un tamaño y forma para permitir que sea introducido en un sujeto.

La selección de un soporte inerte apropiado está dentro de la competencia de los expertos en la técnica, como son sus dimensiones para el propósito destinado. Un paso de con tacto en la prueba (método) de la invención puede implicar poner en contacto, combinar o mezclar la muestra biológica y el soporte sólido, tal como un recipiente de reacción, micro-recipiente, tubo, micro-tubo, pozo, placa de pozos múltiples u otro soporte sólido. En una modalidad de la invención, el soporte sólido que ha de ser puesto en contacto con la muestra biológica (v.gr., orina) tiene una almohadilla absorbente o membrana para flujo lateral del medio líquido que ha de ser probado, tal como aquellos disponibles de Millipore Corp. (Bedford, MA), incluyendo pero sin limitarse a membranas y tarjetas de membrana Hi-Flow Plus™, y materiales de almohadilla SureWick™. El dispositivo de diagnóstico útil para llevar a cabo los métodos de la invención se puede construir en cualquier forma adaptada para el uso destinado. Por lo tanto, en una modalidad, el dispositivo de la invención se puede construir como una tira o varilla de prueba desechable o reutilizable para ser puesta en contacto con una muestra biológica tal como orina o sangre para la cual el nivel de Bcl-2 se ha de determinar. En otra modalidad, el dispositivo se puede construir usando técnicas de fabricación a microescala reconocidas en la técnica para producir modalidades en forma de aguja capaces de ser implantadas o inyectadas en un sitio anatómico, tal como la cavidad peritoneal, para aplicaciones de diagnóstico en residencia. En otras modalidades, los dispositivos destinados para uso de laboratorio repetido se pueden construir en forma de una sonda alargada. En modalidades preferidas, los dispositivos de la invención comprenden un soporte sólido (tal como una tira o varilla de inmersión), con una superficie que funciona como una matriz de flujo lateral que define una trayectoria de flujo para una muestra biológica tal como orina, sangre entera, suero, plasma, fluido peritoneal o ascitos. Pruebas inmunocromatográficas, también conocidas como tiras de prueba de flujo lateral o simplemente tiras de prueba, para detectar varios analitos de interés, se han conocido por cierto tiempo, y se pueden usar para la detección de Bcl-2. Los beneficios de pruebas de flujo lateral incluyen un formato inocuo para el usuario, resultados rápidos, estabilidad a largo plazo sobre una amplia gama de climas, y costo de fabricación relativamente bajo. Estas características hacen las pruebas de flujo lateral ideal para aplicaciones que implican pruebas en el hogar, punto rápido de pruebas de cuidado, y pruebas en el campo para varios analitos. El principio detrás de la prueba es directo. Esencialmente, cualquier ligando que pueda ser unido a un soporte sólido visualmente detectable, tal como microesferas teñidas, se puede probar cualitativamente, y en muchos casos incluso semi-cuantitativamente. Por ejemplo, una inmuno-tira de flujo lateral de un paso para la detección de antígeno específico de próstata libre y total en suero se describe en Fernandez-Sánchez et al. (J. Immuno. Methods, 2005, 307(1 -2):1 -12, que se incorpora aquí por referencia) y se puede adaptar para detección de Bcl-2 en una muestra biológica tal como sangre u orina. Algunas de las pruebas inmuno-cromatográficas más comunes actualmente en el mercado son pruebas para embarazo (como un equipo de prueba de venta en aparador (OTC)), garganta con Strep, y Chlamydia. Muchas pruebas nuevas para antígenos bien conocidos se han desarrollado recientemente usando el método de prueba inmuno-cromatográfico. Por ejemplo, el antigeno para la causa más común de neumonía adquirida en la comunidad se ha conocido desde 1917, pero una prueba simple se desarrolló sólo recientemente, y ésta se hizo usando este método de tira de prueba simple (Murdoch, D.R. et al. J Clin Microbiol, 2001 , 39:3495-3498). El virus de inmunodeficiencia humana (VIH) se ha detectado rápidamente en sangre de acervo usando una prueba similar (Soroka, S.D. et al. J Clin Virol, 2003, 27:90-96). Una tarjeta de membrana de nitrocelulosa también se ha usado para diagnosticar esquistosomiasis al detectar el movimiento y la unión de nanopartículas de carbono (van Dam, G.J. et al. J Clin Microbiol, 2004, 42:5458-5461 ). Los dos enfoques comunes para la prueba inmuno-cromatográfica son los esquemas de reacción no competitivos (o directos) y competitivos (o inhibición competitiva) (TechNote #303, Rev. #001 , 1999, Bangs Laboratories, Inc., Fishers, IN). El formato directo (intercalado de anticuerpo doble) se usa típicamente cuando se prueba para analitos más grandes con múltiples sitios antigénicos tales como hormona luteinizante (LH), gonadotropina coriónica humana (hCG), y VIH. En este caso, se desea menos de un exceso de analito de muestra, por lo que algunas de las microesferas no serán capturadas en la línea de captura, y seguirá fluyendo hacia la segunda línea de anticuerpos inmovilizados, la zona de control. Esta linea de control usa anticuerpos de anti-inmunoglobulina específicos de especie, específicos para los anticuerpos conjugados en las microesferas. El antígeno libre, si está presente, es introducido en el dispositivo al añadir la muestra (orina, suero, etc.) en una almohadilla de adición de muestra. El antígeno libre entonces se une a complejos de anticuerpo-microesfera. El anticuerpo 1 , específico para epítope 1 del antígeno de muestra, se acopla a microesferas de colorante y se seca en el dispositivo. Cuando se añade la muestra, el complejo microesfera-anticuerpo es rehidratado llevado a una zona de captura y líneas de control por líquido. El anticuerpo 2, específico para un segundo sitio antigénico (epítope 2) de antígeno de muestra, se seca sobre una membrana en la línea de captura. El anticuerpo 3, un anticuerpo anti-inmunoglobulina específico de especie que reaccionará con el anticuerpo 1 , se seca sobre la membrana en la línea de control. Sí el antígeno está presente en la muestra (es decir, una prueba positiva), se unirá por sus dos sitios antigénicos, tanto al anticuerpo 1 (conjugado a microesferas) como al anticuerpo 2 (secado sobre la membrana en la línea de captura). Las microeferas revestidas con anticuerpo 1 son unidas por el anticuerpo 3 en la línea de control, ya sea que el antígeno esté o no presente. Si el antígeno no está presente en la muestra (una prueba negativa), las microesferas pasan la línea de captura sin ser atrapadas, pero son capturadas por la línea de control. El esquema de reacción competitivo típicamente se usa cuando se prueban moléculas pequeñas con determinantes antigénicos individuales, que no se pueden unir a dos anticuerpos simultáneamente. Igual que con la prueba de intercalado de anticuerpo doble, el antígeno libre, si está presente es introducido en el dispositivo añadiendo la muestra sobre una almohadilla de muestra. El antígeno libre presente en la muestra se une a un complejo de anticuerpo-microesfera. El anticuerpo 1 es específico para antígeno de muestra y se acopla a microesferas teñidas. Un conjugado de antígeno-molécula portadora (típicamente BSA) se seca sobre una membrana en la línea de captura. El anticuerpo 2 (Ab2) se seca sobre la membrana en la línea de control, y es una anti-inmunoglobulina especifica de especie que capturará las partículas de reactivo y confirmarán que la prueba se ha completado. Si el antígeno está presente en la muestra (una prueba positiva), el anticuerpo sobre microesferas (Ab1 ) es ya saturado con antigeno de la muestra y, por lo tanto, el conjugado de antígeno unido a la líneas de captura no se une al mismo. Cualesquiera microesferas no atrapadas por la molécula portadora de antígeno pueden ser atrapadas por Ab2 en la línea de captura. Sí el antígeno no está presente en la muestra (una prueba negativa), las microesferas teñidas revestidas con anticuerpo se dejan capturar por conjugado de antígeno unido en la linea de captura. Normalmente, las membranas usadas para contener los anticuerpos en su lugar sobre estos dispositivos se hacen de materiales hidrofóbicos primarios, tales como nitrocelulosa. Tanto las microesferas usadas como los soportes de fase sólida y los anticuerpos conjugados son hidrofóbicos, y su interacción con la membrana permite que sean secados de manera efectiva sobre la membrana. Las muestras y/o agentes de unión específicos de Bcl-2 pueden disponerse sobre el soporte sólido, o se pueden utilizar múltiples soportes, para detección o análisis múltiples. "Disposición" se refiere al acto de organizar o disponer miembros de una genoteca (v.gr., una disposición de diferentes muestras o una disposición de dispositivos que se tienen como objetivo las mismas moléculas objetivo o diferentes moléculas objetivo), u otra recolección, en una disposición lógica o física. Por lo tanto, una "disposición" se refiere a una disposición física o lógica de, v.gr., muestras biológicas. Una disposición física puede ser cualquier "formato espacial" o "formato físicamente de rejilla" en el cual manifestaciones físicas de los miembros de genoteca correspondientes están dispuestos de una manera ordenada, prestándose a determinación selectiva combinatoria. Por ejemplo, muestras correspondientes a miembros individuales o de acervo de una genoteca de muestra se pueden disponer en una serie de hileras y columnas numeradas, v.gr., sobre una placa de pozos múltiples. De manera similar, los agentes de unión se pueden colocar en placas o depositar de otra manera en placas (o charolas) microtituladas, v.gr., de 96 pozos, 384 pozos o 1536 pozos. Opcionalmente, los agentes de unión específicos de Bcl-2 pueden ser inmovilizados sobre el soporte sólido.

La detección de Bcl-2 y biomarcadores de cáncer, y otras pruebas que se llevan a cabo sobre muestras, se pueden llevar a cabo simultáneamente o secuencialmente con la detección de otras moléculas objetivo, y se pueden llevar a cabo de una manera automatizada, en un formato de alto rendimiento. Los agentes de unión específicos de Bcl-2 pueden ser depositados pero "libres" (no inmovilizados) en la zona de conjugado, y ser inmovilizados en la zona de captura de un soporte sólido. Los agentes de unión específicos de Bcl-2 pueden ser inmovilizados, por ejemplo, por adsorción no específica sobre el soporte o por unión covalente al soporte. Las técnicas para inmovilización de agentes de unión sobre soportes son conocidas en la técnica y se describen por ejemplo en las patentes de E.U.A. Nos. 4,399,217, 4,381 ,291 , 4,357,31 1 , 4,343,312 y 4,260,678, que se incorporan aquí por referencia. Dichas técnicas se pueden usar para inmovilizar los agentes de unión en la invención. Cuando el soporte sólido es politetrafluoroetíleno, es posible acoplar anticuerpos de hormona sobre el soporte al activar el soporte usando sodio y amoniaco para aminarlo y covalentemente uniendo el anticuerpo al soporte activado por medio de una reacción de carbodiimida (von Klitzing, Schultek, Strasburger, Fricke y Wood en "Radioinmunoensayo and Related Procedures in Medicine 1982", International Atomic Energy Agency, Viena (1982), páginas 57-62). El dispositivo de diagnóstico de la invención puede utilizar tecnología de tira de flujo lateral (LFS), que se ha aplicado a un número de otros sistemas de prueba de tira rápidos, tales como tiras de prueba de embarazo temprana de venta en aparadores basada en anticuerpos para gonadotropina coriónica humana (hCG). Igual que con muchos otros dispositivos de diagnóstico, el dispositivo utiliza un agente de unión para unir la molécula objetivo (Bcl-2). El dispositivo tiene una zona de aplicación para recibir una muestra biológica tal como sangre u orina, una zona de mareaje que contiene marcador que se une a Bcl-2 en la muestra, y una zona de detección en donde el marcador de Bcl-2 es retenido. El agente de unión retenido en la zona de detección da una señal, y la señal difiere dependiendo de si los niveles de Bcl-2 en la muestra biológica son menores que, iguales a, o mayores que una concentración de umbral dada. Por ejemplo, en el caso de Bcl-2 en la orina para la detección de cáncer de ovario, la concentración de umbral puede ser entre 0 ng/ml y 2.0 ng/ml. En otra modalidad, en el caso de Bcl-2 en la orina para la detección de cáncer de ovario, la concentración de umbral es 1 .8 ng/ml. Una muestra de un sujeto que tiene un nivel de Bcl-2 igual a o mayor que la concentración de Bcl-2 de referencia dada se puede referir como un "nivel de umbral", "cantidad de umbral" o "muestra de umbral". La zona de aplicación en el dispositivo es adecuada para recibir la muestra biológica que se ha de probar. Típicamente se forma de material absorbente tal como papel secante. La zona de mareaje contiene agente de unión que se une a cualquier Bcl-2 en la muestra. En una modalidad, el agente de unión es un anticuerpo (v.gr., anticuerpo monoclonal, anticuerpo policlonal, fragmento de anticuerpo). Para facilidad de detección, el agente de unión está preferiblemente en asociación con un marcador que provee una señal que es visible a simple vista, v.gr., está etiquetado con una etiqueta fluorescente o una etiqueta de color tal como oro coloidal conjugado, que es visible como un color rosa. La zona de detección retiene Bcl-2 a la cual el agente de unión se ha unido. Esto típicamente se logrará usando un agente de unión inmovilizado tal como un anticuerpo inmovilizado. En donde el agente de unión en la zona de mareaje y la zona de detección son ambos anticuerpos, típicamente reconocerán diferentes epitopes sobre la molécula objetivo (proteína de Bcl-2). Esto permite la formación de un "intercalado" que comprende anticuerpo-Bcl-2-anticuerpo. La zona de detección está corriente abajo de la zona de aplicación, con la zona de mareaje típicamente localizada entre las dos. Una muestra por lo tanto migrará de la zona de aplicación a la zona de mareaje, en donde cualquiera en la muestra se une al marcador. Los complejos de Bcl-2-agente de unión continúan migrando a la zona de detección junto con agente de unión en exceso. Cuando el complejo de Bcl-2-agente de unión encuentra el reactivo de captura, el complejo es retenido mientras la muestra y agente de unión en exceso continúan migrando. A medida que los niveles de Bcl-2 en la muestra incrementan, la cantidad de agente de unión (en forma de complejo de Bcl-2-agente de unión) retenido en la zona de detección incrementa en forma proporcional. En modalidades preferidas, el dispositivo de la invención tiene la capacidad para distinguir entre muestras de conformidad con la concentración de umbral. Esto se puede lograr de varias maneras. Un tipo de dispositivo incluye una zona de referencia que incluye una señal de intensidad fija contra la cual la cantidad de agente de unión retenido en la zona de detección se puede comparar — cuando la señal en la zona de detección iguala la señal en la zona de referencia, la muestra es una muestra de umbral; cuando la señal en la zona de detección es menos intensa que la zona de referencia, la muestra contiene menos Bcl-2 que una muestra de umbral; cuando la señal en la zona de detección es más intensa que la zona de referencia, la muestra contiene más Bcl-2 que una muestra de umbral. Una zona de referencia adecuada se puede preparar y calibrar sin dificultad. Para este tipo de dispositivo, el agente de unión generalmente está presente en exceso a Bcl-2 en la muestra, y la zona de referencia puede ser corriente arriba o, preferiblemente, corriente abajo de la zona de detección. La señal en la zona de referencia será del mismo tipo que la señal en la zona de detección, es decir, típicamente ambas serán visibles a simple vista, v.gr., usarán la misma etiqueta. Una zona de referencia preferida en un dispositivo de este tipo comprende proteína inmovilizada (v.gr., albúmina de suero de bovino) que es etiquetada con oro coloidal. En otro dispositivo de la invención, la zona de referencia está corriente abajo de la zona de detección e incluye un reactivo que captura agente de unión (v.gr. , un anticuerpo de agente anti-unión inmovilizado). El agente de unión que fluye a través del dispositivo no está presente en exceso, pero está a una concentración tal que 50% del mismo es unido por una muestra que tiene Bcl-2 en la concentración de umbral. En una muestra de umbral, por lo tanto, 50% del agente de unión será retenido en la zona de detección y 50% en la zona de referencia. Si el nivel de Bcl-2 en la muestra es mayor que en una muestra de umbral, menor que 50% del agente de unión alcanzará la zona de referencia, y la zona de detección dará una señal más intensa que la zona de referencia; por el contrario, si el nivel de Bcl-2 en la muestra es menor que en una muestra de umbral, menos de 50% del agente de unión será retenido en la zona de detección y la zona de referencia dará una señal más intensa que la zona de detección. En otro dispositivo de la invención que opera de conformidad con principios similares, la zona de referencia está corriente abajo de la zona de detección e incluye una cantidad limitante de un reactivo que captura agente de unión (v.gr., un anticuerpo de agente anti-unión inmovilizado). El reactivo está presente a un nivel tal que retiene la misma cantidad de marcador que uniría a la zona de detección para una muestra de umbral, con exceso de marcador continuando para emigrar más allá de la zona de referencia. En estos tres tipos de dispositivo, por lo tanto, se usa una comparación entre la zona de detección y la zona de referencia para comparar la muestra con la concentración de umbral. La relación de unión de detección: referencia se puede determinar preferiblemente a simple vista. La yuxtaposición cercana de las zonas de detección y referencia es preferida a fin de facilitar la comparación visual de las intensidades de señal en las dos zonas. En un cuarto tipo de dispositivo, no se necesita zona de referencia, sino que la zona de detección está configurada de tal manera que da una respuesta esencialmente de encendido/apagado, v.gr., no se da señal por debajo de la concentración de umbral pero, en o por arriba del umbral, se da la señal. En un quinto tipo de dispositivo, no se necesita zona de referencia, sino que se usa una referencia externa que corresponde a la concentración de umbral. Esta puede adoptar varias formas, v.gr., una tarjeta impresa contra la cual la señal en la zona de detección se puede comparar, o un lector de máquina que compara un valor absoluto medido en la zona de detección (v.gr., una señal calorimétrica) contra un valor de referencia almacenado en la máquina. En algunas modalidades de la invención, el dispositivo incluye una zona de control corriente abajo de la zona de detección. Este generalmente se usaba para capturar exceso de agente de unión que pasa a través de las zonas de detección y/o referencia (v.gr., anticuerpo de agente anti-unión inmovilizado). Cuando el agente de unión es retenido en la zona de control, esto confirma que la movilización del agente de unión y migración a través del dispositivo ha ocurrido. Se apreciará que esta función puede ser lograda por la zona de referencia. En una modalidad preferida, las zonas de detección, referencia y control preferiblemente se forman sobre un soporte de nitrocelulosa. La migración de la zona de aplicación a la zona de detección generalmente será auxiliada por una mecha corriente debajo de la zona de detección para ayudar al movimiento capilar. Esta mecha está formada típicamente de material absorbente tal como papel secante o de cromatografía. El dispositivo de la invención se puede producir de manera simple y barata, convenientemente en forma de una varilla de inmersión. Además, puede ser usada muy fácilmente, por ejemplo, por el usuario doméstico. La invención por lo tanto provee un dispositivo que se puede usar en el hogar como un determinador selectivo cáncer, tal como cáncer de ovario.

Equipos para diagnosticar o monitorear cáncer ginecológico En un aspecto, la presente invención incluye equipos que comprenden los elementos requeridos para diagnosticar o monitorear cáncer. Preferiblemente, los equipos comprenden un contenedor para recolectar fluido biológico de un paciente y un agente para detectar la presencia de Bcl-2 o su ácido nucleico codificador en el fluido. Los componentes de lo equipos pueden ser empacados ya sea en medio acuoso o en forma liofilizada. Los métodos de la invención se pueden llevar a cabo usando un equipo de diagnóstico para detectar cualitativamente o cuantitativamente de Bcl-2 en una muestra tal como sangre u orina. A manera de ejemplo, un equipo puede contener agentes de unión (v.gr., anticuerpos) específicos para Bcl-2, anticuerpos contra los anticuerpos marcados con una enzima; y un sustrato para la enzima. El equipo también puede contener un soporte sólido tal como placas de pozos múltiples de microtitulación, estándares, diluyente de prueba, regulador de pH de lavado, cubiertas de placa adhesivas, y/o instrucciones para llevar a cabo un método de la invención usando el equipo. En una modalidad, el equipo incluye uno o más inhibidores de proteasa (v.gr., un cóctel de inhibidores de proteasa) para aplicarse a la muestra biológica que se ha de probar (tal como sangre u orina). Los equipos de diagnóstico o monitoreo de cáncer ginecológico que contienen uno o más agentes que detectan la proteína Bcl-2, tal como pero sin limitarse a anticuerpos Bcl-2, fragmentos de los mismos, o parejas de unión de Bcl-2, se pueden preparar. El agente(s) puede ser empacado con un contenedor para recolectar el fluido biológico de un paciente. Cuando los anticuerpos o pareja de unión se usan en los equipos en forma de conjugados en los cuales se une un marcador, tal como un ion de metal radioactivo o porción, los componentes de dichos conjugados se pueden suministrar ya sea en forma completamente conjugada, en forma de intermediarios o como porciones separadas que han de ser conjugadas por el usuario del equipo. Los equipos que contienen uno o más agentes que detectan ácido nucleico de Bcl-2, tal como pero sin limitarse al ácido nucleico de Bcl-2 de longitud completa, oligonucleótidos de Bcl-2 y pares de iniciadores de Bcl-2 también se pueden preparar. El agente(s) se puede empacar con un contenedor para recolectar muestras biológicas de un paciente. El ácido nucleico puede estar en la forma marcada o puede ser la forma marcada. Otros componentes del equipo pueden incluir pero sin limitarse a medios para recolección de muestras biológicas, medios para detectar agente de detección (agente de unión), membranas para inmovilizar la proteína Bcl-2 o ácido nucleico de Bcl-2 en la muestra, medios para aplicar la muestra biológica a una membrana, medios para unir el agente a Bcl-2 en la muestra biológica de un sujeto, un segundo anticuerpo, un medio para aislar el ARN total de fluido biológico de un sujeto, medios para realizar electroforesis de gel, medios generar ADNc del ARN total aislado, medios para realizar pruebas de hibridación y medios para realizar PCR, etc. Como se usa aquí, el término "ELISA" incluye una prueba inmunoabsorbente ligada a enzima que utiliza un anticuerpo o antígeno unido a una fase sólida y un conjugado de enzíma-antígeno o de enzima-anticuerpo para detectar y cuantificar la cantidad de un antígeno, (v.gr., Bcl-2) o un anticuerpo presente en una muestra. Una descripción de la técnica de ELISA se encuentra en el capítulo 22 de la 4a. edición de Basic and Clinical Immunology de D.P. Sites et al, 1982, publicada por Lange Medical Publications de Los Altos, Calif, y en las patentes de E.U.A. Nos. 3,654,090; 3,850,752; y 4,016,043, cuyas descripciones se incorporan aquí por referencia. ELISA es una prueba que se puede usar para cuantificar la cantidad de antigeno, proteínas u otras moléculas de interés en una muestra. En particular, ELISA se puede llevar a cabo uniendo sobre un soporte sólido (v.gr., cloruro de polivinilo) un anticuerpo específico para un antígeno o proteína de interés. El extracto de células u otra muestra de interés tal como orina se puede añadir para la formación de un complejo de anticuerpo-antígeno, y la muestra no unida adicional se elimina lavando. Un anticuerpo ligado a enzima, específico para un sitio diferente en el antígeno se añade. El soporte se lava para remover el segundo anticuerpo ligado a enzima no unido. El anticuerpo ligado a enzima puede incluir, pero sin limitarse a fosfatasa alcalina. La enzima en el segundo anticuerpo puede convertir un sustrato incoloro añadido a un producto de color o puede convertir un sustrato no fluorescente a un producto fluorescente. El método de prueba basado en ELISA provisto aquí puede ser conducido en una sola cámara o en una disposición de cámaras y se puede adaptar para procedimientos automatizados. En estas modalidades ilustrativas, los anticuerpos se pueden marcar con pares de colorantes FRET, proteína de transferencia de energía de resonancia bioluminiscente (BRET), combinaciones de colorante extintor de colorante fluorescente, fragmentos de proteína de prueba de complementación de beta gal. Los anticuerpos pueden participar en FRET, BRET, extinción de fluorescencia o complementación de beta-gal para generar, por ejemplo, señales de fluorescencia, quimioluminiscencia colorimétrica o mejorada (ECL). Estos métodos se utilizan rutinariamente en la detección de respuestas de anticuerpo específico de antígeno y se describen bien en libros de texto de inmunología general tales como Immunology de Ivan Roitt, Jonathan Brostoff y David Male (London: Mosby, c1998. 5a ed. e Immunobiology: Immune System in Health and Disease/Charles A. Janeway y Paul Travers. Oxford: Blackwell Sci. Pub., 1994), cuyos contenidos se incorporan aquí por referencia.

Definiciones Como se usa aquí, los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la condición fisiológica en mamíferos que es típicamente caracterizada por el crecimiento o regulado de células, es decir, trastornos proliferativos. Ejemplos de dichos trastornos proliferativos incluyen cánceres tales como carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, y leucemia, así como otros cánceres descritos aquí. Ejemplos muy particulares de dichos cánceres incluyen cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer peritoneal, cáncer de hígado, v.gr., carcinoma hepático, cáncer de vejiga, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial, cáncer de riñon y cáncer de tiroides. Otros ejemplos no limitantes de cánceres son carcinomas de células básales, cáncer del tracto biliar; cáncer de hueso; cáncer de cerebro y SNC; coriocarcínoma; cáncer de tejido conectivo; cáncer esofágico; cáncer de los ojos; cáncer de la cabeza y cuello; cáncer gástrico; neoplasma intraepitelial; cáncer de la laringe; linfoma incluyendo linfoma de Hodgkin y no Hodgkin; melanoma; mieloma; neuroblastoma; cáncer de cavidad oral (v.gr., labio, lengua, boca y faringe); cáncer pancreático; retinoblastoma; rabdomiosarcoma; cáncer rectal; cáncer del sistema respiratorio; sarcoma; cáncer de la piel; cáncer de estómago; cáncer testicular; cáncer uterino; cáncer del sistema urinario, así como otros carcinomas y sarcomas. Ejemplos de tipos de cáncer se listan en el cuadro 1.

CUADRO 1 Ejemplos de tipos de cáncer ? Leucemia linfoblástica aguda, ? Leucemia de células pilosas en adultos Cáncer de cabeza y cuello Leucemia linfoblástica aguda, Cáncer hepatocelular (hígado), en en niños adultos (Primario) Leucemia mieloide aguda, en Cáncer hepatocelular (hígado), en adultos niños, (primario) Leucemia mieloide aguda, Linfoma de Hodgkin, en adultos en niños Carcinoma adrenocortical Linfoma de Hodgkin, en niños Carcinoma adrenocortical, Linfoma de Hodgkin durante el en niños embarazo Cánceres relacionados con SIDA Cáncer hipofaríngeo Linfoma relacionado con SIDA Glioma hipotalámico y vía visual, en niños Cáncer anal ? Melanoma Infraocular Astrocitoma, cerebelar en niños Carcinoma de células del islote (páncreas endocrino) Astrocitoma, cereberal en niños ? Sarcoma de Kaposi ? Carcinoma de células básales Cáncer de riñon (células renales) Cáncer del ducto biliar, Cáncer de riñon, en niños Extrahepático Cáncer de vejiga ? Cáncer de laringe Cáncer de vejiga, en niños Cáncer de laringe, en niños Cáncer de hueso Leucemia, linfoblástica aguda, en adultos Osteosarcoma/ Histiocitoma Leucemia, linfoblástica aguda, en fibroso maligno niños Glioma de tallo cerebral, en niños Leucemia, mieloide aguda, en adultos Tumor de cerebro, en adultos Leucemia, mieloide aguda, en niños Tumor de cerebro, glioma de tallo Leucemia, linfocítica crónica cerebral, en niños Tumor de cerebro, Cerebelar Leucemia, mielógena crónica Astrocitoma, en niños Leucemia, células pilosas Tumor de cerebro, Cerebral Cáncer de cavidad oral y labio Astrocitoma/Glioma maligno, en Cáncer de hígado, en adultos niños (primario) Tumor de cerebro, Ependimoma, Cáncer de hígado, en niños en niños (primario) Tumor de cerebro, Cáncer de pulmón, células no Meduloblastoma, en niños pequeñas Tumor de cerebro, Supratentorial Cáncer de pulmón, células pequeñas Tumores neuroectodermales Linfoma relacionado con SIDA primitivos, en niños Tumor de cerebro, Vía visual y Linfoma de Burkitt Glioma hipotalámico, en niños Linfoma cutáneo de células T, véase Mycosis Fungoides y Síndrome de Sézary Tumor de cerebro, en niños Linfoma, de Hodgkin, en adultos Cáncer de mama Linfoma, de Hodgkin, en niños Cáncer de mama, en niños Linfoma, de Hodgkin durante el embarazo Cáncer de mama, masculino Linfoma, de no Hodgkin, en adultos Adenomas/Carcinoides Linfoma, de no Hodgkin, en niños bronquiales, en niños Liforma de Burkitt Linfoma, de no Hodgkin durante el embarazo ? Tumor Carcinoide, en niños Linfoma, sistema nervioso central primario Tumor Carcinoide, gastrointestinal ? Macroglobulinemia, de Waldenstróm Carcinoma de sistema nervioso Histiocitoma fibroso maligno de central primario desconocido hueso/osteosarcoma Linfoma, astrocitoma cerebelar Meduloblastoma, en niños primario, en niños Astrocitoma cerebral/glioma Melanoma maligno, en niños Cáncer cervical Melanoma, Infraocular (ojo) Cánceres en niños Carcinoma de células de Merkel Leucemia linfocítica crónica Mesotelioma, maligno en adultos Leucemia mielógena crónica Mesotelioma, en niños Trastornos mieloproliferativos Cáncer de cuello escamoso crónicos metastásico con oculto primario Cáncer de colon Síndrome de neoplasia endocrino múltiple, en niños Cáncer colorectal, en niños Mieloma múltiple/neoplasma de células del plasma Linfoma de células T cutáneas, Micosis fungoide véase Mycosis Fungoides y síndrome de Sézary ? Cáncer endometrial Síndromes mielodisplásicos Ependimoma, en niños Enfermedades mielodisplásicas/mieloprolifera- tivas Cáncer esofágico Leucemia mielógena, crónica Cáncer esofágico, en niños Leucemia mieloide, aguda en adultos Familia de tumores de Ewing Leucemia mieloide, aguda en niños Tumor de células germinales Mieloma, trastornos extracraneal, en niños mieloproiferativos múltiples, crónicos Tumor de células germinales Trastornos mieloproliferativos, extragonadal crónicos Cáncer de ducto biliar ? Cáncer de cavidad nasal y senos extrahepático paranasales Cáncer de ojo, melanoma Cáncer nasofaríngeo intraocular Cáncer de ojo, retinoblastoma Cáncer nasofaríngeo, en niños ? Cáncer de vesícula biliar Neuroblastoma Cáncer gástrico (estómago) Linfoma de no Hodgkin, en adultos Cáncer gástrico (estómago), en Linfoma de no Hodgkin, en niños niños Tumor carcinoide gastrointestinal Linfoma de no Hodgkin durante el embarazo, Tumor de células germinales, Cáncer de pulmón de células no extracraneal, en niños pequeñas Tumor de células germinales, ? Cáncer oral, en niños extragonadal Tumor de células germinales, Cáncer de cavidad oral, labio y ovario cáncer orofaríngeo Tumor trofoblástico gestacional Osteosarcoma/histiocitoma fibrosa maligna de hueso Glioma, en adultos Cáncer de ovario, en niños Glioma, tallo cerebral en niños Cáncer de ovario epitelial ? Glioma, astrocitoma cerebral, en Tumor de células germinal de niños ovario Glioma, vía visual e hopotalámico, Tumor potencial de ovario de baja en niños malignidad Cáncer de piel (melanoma) ? Cáncer de páncreas Carcinoma de piel, células Merkel Cáncer de páncreas, en niños Cáncer de pulmón de células Cáncer de páncreas, células del pequeñas islote Cáncer de intestino pequeño Senos paranasales y cáncer de cavidad nasal Sarcoma de tejido suave, adulto Cáncer paratiroideo Sarcoma de tejido suave, en niños Cáncer penil Carcinoma de células escamosas, Feocromocitoma véase cáncer de piel (no- melanoma) Cáncer de cuello escamoso con Tumores de pineoblastoma y primario oculto, metastático supratentoriales primitivos neuroectodermales, en niños Cáncer de estómago (gástrico) Tumor de la pituitaria ? Cáncer de estómago (gástrico), en Neoplasma de células plasmáticas niños /mieloma múltiple Tumores neuroectodermales Blastoma pleuropulmonar primitivos supratentorial, en niños Linfoma de células T, cutáneo, Embarazo y cáncer de mama véase Mycosis Fungoides y síndrome de Sézary Cáncer testicular Embarazo y Linfoma de Hodgkin Timoma, en niños Embarazo y Linfoma no Hodgkin Carcinoma de timoma y tímico Linforma del sistema nervioso central Cáncer de tiroides Cáncer de próstata Cáncer de tiroides, en niños ? Cáncer rectal ? Cáncer de células transicionales Cáncer de células renales (riñon) de la pelvis renal y uretra Tumor trofoblástico, gestacional Cáncer de células renales (riñon), en niños Carcinoma de sitio primario Renal, pelvis y Ureteros, células desconocido, en adultos de transición Carcinoma de sitio primario Retinoblastoma desconocido, en niños Cánceres inusuales en la infancia Rabdomiosarcoma, en niños Cáncer de células transicionales, ? Cáncer de glándulas salivales uretra y pelvis renal Cáncer de la uretra Cáncer de glándulas salivales, en niños ? Cáncer uterino, endometrial Sarcoma, familia de tumores de Swing Sarcoma uterino Sarcoma, Kaposi Cáncer de vagina Sarcoma, tejido blando, en adultos ? Glioma de vía visual e hipotaláico, Sarcoma, tejido blando, en niños en niños Cáncer vulvar Sarcoma, Uterino Macroglobulinemia de Síndrome de Sézary Waldenstrom Tumor de Wilms Cáncer de piel (no-melanoma) Cáncer de piel, en niños Como se usa aquí, el término "tumor" se refiere a todo el crecimiento y proliferación celular neoplásica, ya sea maligna o benigna, y todas las células o tejidos precancerosos y cancerosos. Por ejemplo, un cáncer particular se puede caracterizar por un tumor de masa sólida. El tumor de masa sólida, si está presente, puede ser una masa de tumor primario. Una masa de tumor primario se refiere a un crecimiento de células cancerosas en un tejido que resulta de la transformación de una célula normal de ese tejido.

En la mayoría de los casos, la masa de tumor primaria se identifica por la presencia de un quiste, que se puede encontrar a través de métodos visuales o de palpación, o por irregularidad en forma, textura o peso del tejido. Sin embargo, algunos tumores primarios son no palpables y se pueden detectar sólo a través de técnicas de formación de imagen médicas tales como rayos X (v.gr., mamografía), ultrasonido, CT y MRI, o mediante aspiraciones con aguja. El uso de estas últimas técnicas es más conocido en la detección temprana. El análisis molecular y fenotípico de las células cancerosas dentro de un tejido usualmente confirmarán si el cáncer es endógeno al tejido o si la lesión se debe a metástasis desde otro sitio. Una "muestra" (muestra biológica) puede ser cualquier composición de materia de interés de un sujeto humano o no humano, en cualquier estado físico (v.gr., sólido, líquido, semi-sólido, vapor) y de cualquier complejidad. La muestra puede ser cualquier composición que se sospeche razonablemente que contiene Bcl-2 que se puede analizar por los métodos, dispositivos y equipos de la invención. Preferiblemente, la muestra es un fluido (fluido biológico). Las muestras pueden incluir muestras humanas o de animales. La muestra puede estar contenida dentro de un tubo de ensayo, un recipiente de cultivo, una placa de pozos múltiples o cualquier otro contenedor o sustrato de soporte. La muestra puede ser, por ejemplo, un cultivo de células, tejido humano o animal. Los homogenados de fluidos o tejidos celulares son fluidos biológicos que pueden contener Bcl-2 para detección por la invención. La "complejidad" de una muestra se refiere al número relativo de diferentes especies moleculares que están presentes en la muestra. Los términos "fluido del cuerpo" y "fluido corporal", como se usa aquí, se refieren a una composición obtenida de un sujeto humano o animal. Los fluidos corporales incluyen, pero no se limitan a, orina, sangre entera, plasma sanguíneo, suero, lágrimas, semen, saliva, esputo, respiración exhalada, secreciones nasales, exudados faríngeos, lavado broncoalveolar, aspiraciones traqueales, fluido intersticial, fluido linfático, fluido meníngeo, fluido amniótico, fluido glandular, heces, transpiración, moco, secreción vaginal o uretral, fluido cerebroespinal y exudado transdérmico. El fluido corporal también incluye fracciones experimentalmente separadas de todas las soluciones o mezclas anteriores que contienen material sólido homogeneizado tales como heces, tejidos o muestras de biopsia. El término "ex vivo", como se usa aquí se refiere a un ambiente fuera de un sujeto. Por consiguiente, una muestra de fluido corporal recolectado de un sujeto es una muestra ex vivo de fluido corporal como se contempla en la presente invención. Modalidades en residencia del método y dispositivo de la invención obtienen muestras in vivo. Como se usa aquí, el término "conjugado" se refiere a un compuesto que comprende dos o más moléculas unidas entre sí, opcionalmente a través de un grupo enlazador, para formar una sola estructura. La unión se puede hacer por conexión directa (v.gr. , un enlace químico) entre las moléculas o mediante el uso de un grupo enlazador. Como se usa aquí, los términos "soporte", "sustrato" y "superficie" sólido se refieren a una fase sólida que es un material insoluble en agua poroso o no poroso que puede tener cualquier número de formas, tales como tira, bastón, partícula, esferas o placas de pozos múltiples. En algunas modalidades, el soporte tiene una matriz de soporte organizacional fija que preferiblemente funciona como una matriz de organización, tal como una charola de microtitulación. Los materiales de soporte sólidos incluyen pero no se limitan a celulosa, polisacáridos tales como Sephadex, vidrio, poliacriloilmorfolido, sílice, vidrio con poros controlados (CPG), poliestireno, poliestireno/látex, polietileno tal como polietileno de peso molecular ultra alto (UPE), poliamida, fluoruro de polivinilideno (PVDF), politetrafluoroetileno (PTFE, TEFLN), teflón modificado con carboxilo, nylon, nitrocelulosa y metales y aleaciones tales como oro, platino y paladio. El soporte sólido puede ser biológico, no biológico, orgánico, inorgánico una combinación de cualquiera de éstos, existiendo como partículas, bandas, precipitados, geles, láminas, almohadillas, tarjetas, tiras, varillas de inmersión, tiras de prueba, tubos, esferas, contenedores, capilares, almohadillas, rebanadas, películas, placas, portaobjetos, etc., dependiendo de la aplicación particular. Preferiblemente, el soporte sólido es de forma plana, para facilitar el contacto con una muestra biológica tal como orina, sangre entera, plasma, suero, fluido peritoneal o fluido de ascitos. Otro material de soporte sólido adecuado será fácilmente evidente para los expertos en la técnica. El soporte sólido puede ser una membrana con o sin un respaldo (v.gr., poliestireno o respaldo de tarjeta de poliéster), tales como aquellas disponibles de Millipore Corp. (Bedford, MA), v.gr., tarjetas de membrana Hi-Flow™ Plus. La superficie del soporte sólido puede contener grupos reactivos tales como carboxilo, amino, hidroxilo, tiol o similares para la unión de ácidos nucleicos, proteínas, etc. Las superficies del soporte sólido algunas veces aunque no siempre están compuestas del mismo material que el soporte. Por lo tanto, la superficie puede estar compuesta de cualquiera de una amplia variedad de materiales tales como polímeros, plásticos, resinas, polisacáridos, materiales de sílice o basados en sílice, carbón, metales, vidrios inorgánicos, membranas o cualquiera de los materiales de soporte antes mencionados (v.gr., como una capa o revestimiento). Como se usa aquí, los términos "marcador" y "etiqueta" se refieren a sustancias que pueden conferir una señal e incluyen pero no se limitan a enzimas tales como fosfatasa alcalina, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, y peroxidasa de rábano picante, ribozima, un sustrato para una replicasa tal como QB replicasa, promotores, colorantes, fluorescentes tales como fluoresceína, isotiocinato, compuestos de rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído, y fluorescamina, quimioluminiscentes tales como isoluminol, sensibilizadores, coenzimas, sustratos de enzima, radiomarcadores, partículas tales como látex o partículas de carbón, liposomas, células, etc., que pueden ser marcados adicionalmente con un colorante, catalizador u otro grupo detectable. Como se usa aquí, el término "receptor" y "proteína receptora" como se usa aquí para indicar una molécula proteinácea biológicamente activa que se que específicamente a (o con) otras moléculas tales como Bcl-2. Como se usa aquí, el término "ligando" se refiere a una molécula que contiene una porción estructural que es unida por interacción específica con una proteína receptora particular.

Como se usa aquí, el término "anticuerpo" se refiere a moléculas de inmunoglobulína y porciones ¡nmunológicamente activas (fragmentos) o moléculas de inmunoglobulína, es decir, moléculas que contienen un sitio de combinación de anticuerpo o paratopo. El término es inclusivo de anticuerpos monoclonales y anticuerpos policlonales. Como se usa aquí, los términos "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" se refieren a una molécula de anticuerpo que contiene sólo una especie de sitio de combinación de anticuerpo capaz de inmunoreaccionar con un antígeno particular. Una composición de anticuerpo monoclonal por lo tanto despliega típicamente una sola afinidad de unión para cualquier antígeno con la cual inmunoreacciona. Una composición de anticuerpo monoclonal está típicamente compuesta de anticuerpos producidos por clones de una sola célula llamada hibridoma que secreta (produce) sólo un tipo de molécula de anticuerpo. Las células de hibridoma se forma fusionando una célula productora de anticuerpo y un mieloma o una línea de células auto-perpetuante. Dichos anticuerpos fueron descritos primero por Kohler y Milstein, Nature, 1975, 256:495-497, cuya descripción se incorpora aquí por referencia. Una tecnología de hibridoma ilustrativo es descrito por Niman ef al, Proc. Nati. Acad. Sci U.S. A., 1983, 80:4949-4953. Otros métodos para producir anticuerpos monoclonales, una célula de hibridoma o un cultivo de células de hibridoma también son bien conocidas. Véase, v.gr., Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; o el método de aislar anticuerpos monoclonales a partir de un repertorio inmunológico como lo describe Sasatry, et al., Proc. Nati. Acad. Sci, USA, 1989, 86:5728-5732; y Huse et al, Science, 1981 , 246:1275-1281. Las referencias citadas se incorporan aquí por referencia. Como se usa aquí, una membrana semi-permeable se refiere a un material biocompatible que es impermeable a líquidos y capaz de permitir la transferencia de gases a través del mismo. Dichos gases incluyen pero no se limitan a oxígeno, vapor de agua y bióxido de carbono. Las membranas semi-permeables son ejemplo de un material que se puede usar para formar por lo menos una porción de un alojamiento que define una cavidad de cámara de flujo. La membrana semi-permeable puede ser capaz de excluir contaminación microbiana (v.gr., el tamaño de poro es característicamente lo suficientemente pequeña para excluir el paso de microbios que pueden contaminar el analito, tales como células). En un aspecto particular, una membrana semi-permeable puede tener una transparencia y claridad ópticas suficientes para permitir la observación de un analito, tales como células, para color, crecimiento, tamaño, morfología, formación de imagen y otros propósitos bien conocidos en la técnica. Como se usa aquí, el término "unión" se refiere a cualquier unión física o asociación cercana, que pueda ser permanente o temporal. La unión puede resultar de unión a hidrógeno, fuerzas hidrofóbicas, fuerzas de van der Waals, covalentes o unión iónica, por ejemplo. Como se usa aquí, el término "partícula" incluye materiales insolubles de cualquier configuración incluyendo pero sin limitarse a formas esférica, en forma de filamentos, en forma de cepillo y formas irregulares. Las partículas pueden ser porosas con canales regulares o aleatorios en el interior. Las partículas pueden ser magnéticas. Ejemplos de partículas incluyen pero no se limitan a sílice, celulosa, esferas de Sepharose, esferas de políestireno (sólidas, porosas, derivadas), vidrio de poros controlados, esferas de gel, esferas magnéticas, soles, células biológicas, partículas subcelulares, microorganismos (protozoarios, bacterias, levaduras, virus y otros agentes infeccioso), micelas, liposomas, ciclodextrinas y otros materiales insolubles. Una "secuencia codificadora" o "región codificadora" es una secuencia de polinucleótidos que se transcribe a ARNm y/o se traduce a un polipéptido. Por ejemplo, una secuencia codificadora puede codificar un polipéptido de interés. Las colindancias de la secuencia codificadora están determinadas por un codón de inicio de traducción en el 5'-terminal y un codón de detención de traducción en el 3'-terminal. Una secuencia codificadora puede incluir, pero no se limita a ARNm, ADNc y secuencias de polinucleótidos recombinantes. Como se usa aquí, el término "polipéptido" se refiere a cualquier polímero que comprende cualquier número de dos o más aminoácidos, y se usa intercambiablemente aquí con el término "proteína", "producto de gen" y "péptido" Como se usa aquí, el término "nucleósido" se refiere a una molécula que tiene una base de purina o pirimidina covalentemente enlazada a un azúcar ribosa o desoxiribosa. Nucleóosidos ilustrativos incluyen adenosina, guanosina, citidina, uridina y timidina. El término "nucleótido" se refiere a un nucleósido que tiene uno o más grupos fosfato unidos en enlaces de éster a la porción de azúcar. Los nucleótidos ilustrativos incluyen monofosfatos, difosfatos y trifosfatos de nucleósido. Los términos "polinucleótido", "molécula de ácido nucleico" y "molécula de nucleótido" se usan intercambiablemente aquí y se refieren a un polímero de nucleótidos unidos entre sí por un enlace de fosfodíéster entre los átomos de carbono 5' y 3'. Los polinucleótidos pueden codificar un polipéptido tal como polipéptido Bcl-2 (ya sea expresado o no expresado), o pueden ser ARN de interferencia corto (siRNA), ácidos nucleicos de antisentido (oligonucleótidos de antisentido), aptámeros, ribozimas (ARN catalítico), u oligonucleótidos formadores de triplex (es decir, antígeno), por ejemplo. Como se usa aquí, el término "ARN" o "molécula de ARN" o "molécula de ácido ribonucleico" se refiere generalmente a un polímero de ribonucleótido. El término "ADN" o "molécula de ADN" o "molécula de ácido desoxirribonucleico" se refiere generalmente a un polímero de desoxirribonucleótidos. Las moléculas de ADN y ARN pueden ser sintetizadas naturalmente (v.gr., por replicación de ADN o transcripción de ADN, respectivamente). Las moléculas de ARN pueden ser modificadas post-transcripcionalmente. Las moléculas de ADN y ARN también pueden ser químicamente sintetizadas. Las moléculas de ADN y ARN pueden ser de una sola cadena (es decir, ssARN y ssADN, respectivamente) o de cadenas múltiples (v.gr., de doble cadena, es decir, dsARN y dsADN, respectivamente). Con base en la naturaleza de la invención, sin embargo, el término "ARN" o "molécula de ARN" o "molécula de ácido ribonucleico" también se puede referir a un polímero que comprende principalmente (es decir, mayor que 80% o preferiblemente mayor que 90%) ribonucleótidos pero opcionalmente incluyendo por lo menos una molécula que no es ribonucleótido, por ejemplo, por lo menos un desoxirribonucleótido y/o por lo menos un análogo de nucleótido. Como se usa aquí, el término "análogo de nucleótido" o "análogo de ácido nucleico", también se refiere aquí como un nucleótido/ácido nucleico alterado o nucleótido/ácido nucleico modificado se refiere a un nucleótido no estándar, incluyendo ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos que no ocurren naturalmente. Los análogos de nucleótido preferidos son modificados en cualquier posición para alterar ciertas propiedades químicas del nucleótido pero retienen la capacidad del análogo de nucleótido para realizar su función destinada. Por ejemplo, los ácidos nucleicos bloqueados (LNA) son una clase de análogos de nucleótido que poseen afinidad muy alta y excelente especificidad hacia ADN y ARN complementarios. Los oligonucleótidos de LNA se han aplicado a moléculas de antisentido tanto in vitro como in vivo (Jepsen J.S. er a/, Oligonucleotides, 2004, 14(2): 130-146). Como se usa aquí, el término "análogo de ARN" se refiere a un polinucleótido (v.gr., un polinucleótido químicamente sintetizado) que tiene por lo menos un nucleótido alterado o modificado en comparación con un ARN no alterado o no modificado correspondiente, pero que retiene la misma naturaleza o función o una similar que el ARN no alterado o no modificado correspondiente. Como se describió antes, los oligonucleótidos pueden ser enlazados con enlaces que dan por resultado una velocidad de hidrólisis más baja del análogo de ARN en comparación con la molécula de ARN con enlaces de fosfodiéster. Los análogos de ARN ilustrativos incluyen ribonucleótidos y/o desoxirribonucleótidos modificados en el azúcar y/o estructura de base. Dichas alteraciones o modificaciones pueden incluir además la adición de material que no es nucleótido, tal como el extremo(s) del ARN o internamente (en uno o más nucleótidos del ARN). Los términos "que comprenden", "que consiste de" y "que consiste esencialmente de" se definen de conformidad con su significado estándar. Los términos pueden sustituir a otros a lo largo de la presente solicitud para apegarse al significado específico asociado con cada término. Los términos "aislado" o "biológicamente puro" se refiere a material que es sustancialmente o esencialmente libre de componentes que normalmente acompañan al material como se encuentra en su estado nativo. Como se usa en esta especificación, las formas singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, una referencia a "un anticuerpo" incluye más de un anticuerpo. Una referencia a "una molécula" incluye más de una molécula, etc. La práctica de la presente invención puede utilizar, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, tecnología de ADN recombinante, electrofisiología y farmacología que están dentro del alcance de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la literatura (véase, v.gr., Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda edición (1989); ADN Cloning, Vols. I y II (D. N. Glover Ed. 1985); Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); la serie, Methods In Enzymology (S. Colowick y N. Kaplan Eds., Academic Press, Inc.); Transcription and Translation (Hames et al. Eds. 1984); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller et al Eds. (1987) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.); Scopes, Protein Purification: Principies and Practice (2a. ed., Springer-Verlag); y PCR: A Practical Approach (McPherson et al. Eds. (1991 ) IRL Press)), cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad. A continuación se dan ejemplos que ilustran materiales, métodos y procedimientos para poner en práctica la invención. Los ejemplos son ilustrativos y no deben considerarse como limitantes.

Materiales y métodos Cohorte de pacientes. Con aprobación institucional, se recolectaron muestras de orina y sangre de voluntarios de control sanos normales (N=21 ), mujeres con trastornos ginecológicos benignos (N=35) y pacientes con cáncer de ovario (N=34) en el H. Lee Moffitt Cáncer Center. Todos excepto 8 especímenes se recolectaron antes de la reducción quirúrgica inicial, mientras que los últimos 8 especímenes presentaron enfermedad recurrente en el tiempo de reclutamiento en el estudio. Bloques de parafina fueron identificados, en donde fue posible, y los portaobjetos fueron revisados para confirmar el diagnóstico histológico de conformidad con las calificaciones de FIGO. Los registros médicos de estas mujeres también se revisaron y la información referente a la edad del paciente, tipo de tumor, etapa, grado, tamaño y tratamiento quirúrgico realizado estuvo disponible. Preparación de la muestra. Con consentimiento informado por el paciente, se recolectaron muestras de orina y plasma de pacientes, se indicaron como anónimos y se codificaron para proteger la identidad del paciente, y se liberaron del H. Lee Moffitt Cáncer Center para este protocolo de investigación. Todas las muestras se mantuvieron en hielo. Las muestras de orina se trataron con un cóctel de inhibidor de proteasa estándar (80 µg/ml de fluoruro de 4-(2aminoetil)-bencensulfonilo, 200 µg/ml de EDTA, 0.2 g/ml de leupeptina, 0.2 µg/ml de pepstatina, Sigma Scientific, St. Louis, MI) y se centrifugaron a 3000 x g. Los sobrenadantes de orina y muestras de plasma se pusieron después en alícuotas y se almacenaron a -20°C. Prueba inmunoabsorbente ligada a enzima. Para medir los niveles de Bcl-2 en la orina de los pacientes, se probaron muestras usando la prueba inmunoabsorbente ligada a enzima intercalada cuantitativa (ELISA; R&D Systems, Minneapolis, MN) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Para medir los niveles de CA125 en el plasma de los sujetos, las muestras se probaron por ELISA (Bio-Quant, San Diego, CA) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Las reacciones enzimáticas se detectaron a 450 nm usando un lector de placas Dynex MRX (Dynex Technologies, Chantilly, VA) y los resultados de Bcl-2 se expresaron como la media de la absorbancia de muestras por triplicado ± E.E. mientras que los resultados de CA125 se expresaron como la media de muestras por duplicado. Análisis estadístico. Muestras para ELISA de Bcl-2 se realizaron por triplicado y los datos se sometieron a la prueba de Kruskal-Wallis para distribución normal. Los datos después se analizaron por la prueba de U de Mann-Whitney para determinar significancia estadística de las muestras de controles normales, pacientes con enfermedad benigna y pacientes con cáncer de ovario. Asimismo, análisis de discriminación en el que se usó el sistema SAS se utilizaron para determinar membresía apropiada en cada grupo (normal vs. benigno vs. cáncer).

EJEMPLO 1 Niveles de Bcl-2 en la orina son elevados en pacientes con cáncer Orina y sangre se recolectaron de 90 individuos con muestras recolectadas de controles normales (N=21 ), mujeres con enfermedad benigna (N=35) y mujeres con cáncer de ovario (N=34). La última categoría consistió de mujeres diagnosticadas con cáncer de ovario endometriode (N=1 ), mucinoso (N=7) así como seroso (N=24) y cáncer peritoneal primario, que con frecuencia se relaciona con cáncer de ovario (N=2). Las muestras recolectadas de mujeres con enfermedad ginecológica benigna consistió de mujeres con teratomas císticos benignos (N=2), quistes simples (N=10), leiomiomas (N=8), enfermedad de ovario policístico (N=1 ), adenofíbromas de ovario (N=4), cistadenomas mucinoso (N=2) y cistadenomas serosos (N=8). Aunque este cohorte comprende un estudio piloto pequeño, es representativo de una práctica clínica típica con respecto a histología, grado y distribución de etapas. Para determinar la adecuación potencial de los niveles de Bcl-2 en la orina como un marcador molecular nuevo para cáncer de ovario, muestras de orina de controles normales, mujeres con enfermedad ginecológica benigna y pacientes con especímenes de cáncer de ovario se determinaron selectivamente por análisis de ELISA (figura 1 ). La cantidad de Bcl-2 en la orina fue generalmente insignificante (en promedio 0.21 ng/ml) en muestras de control normales. Por el contrario, Bcl-2 en la orina asociado con cáncer de ovario y peritoneal primario, fue generalmente >10x (3.4 ng/ml) que se encontró en muestras de control normales (figura 1A). Ninguna muestra de orina normal contenía Bcl-2 >1.8 ng/ml, mientras que sólo 2 de las muestras de cáncer presentaron Bcl-2 menos de 1.8 ng/ml (1 .12 ng/ml y 1.78 ng/ml). Puesto que el carcinoma seroso representa la mayoría de cánceres de ovario epitelial, los niveles de Bcl-2 en pacientes con adenocarcinoma seroso se examinaron por grado de enfermedad (figura 1A) y etapa (figura B). Aunque hubo una tendencia para niveles de Bcl-2 elevados con incremento en el grado y etapa del tumor, la diferencia en los niveles de Bcl-2 entre el grado y etapa del tumor no fue estadísticamente significativo. Asimismo, la creatinina en el suero se midió en el tiempo de recolección de orina e indicó que los niveles de Bcl-2 en la orina no se relacionaron con disfunción renal (no se muestran datos). Cabe notar que un solo paciente (#77) demostró niveles de Bcl-2 en la orina extremadamente elevados (>9 ng/ml) en ausencia de otros síntomas clínicos notables. El cuadro 2 resume los resultados presentados en las figuras 1 y 2 para niveles de Bcl-2 promedio en especímenes de orina. Los números entre paréntesis indican el número de muestras en cada grupo respectivo. Además, los datos se agrupan para mostrar los niveles de Bcl-2 promedio (ng/ml) entre individuos normales y subtipos histológicos de cáncer de ovario, grado de tumor y etapa de tumor. Los datos muestran que aunque el nivel promedio de Bcl-2 en la orina de voluntarios sanos es 0.204 ng/ml, los de todos los pacientes con cáncer es generalmente 10X mayor (3.12 ng/ml). Además, los niveles de Bcl-2 en la orina parecen relacionarse fuertemente con la etapa del tumor y moderadamente relacionados con el grado de tumor entre los cánceres de ovario serosos (el tipo de cáncer de ovario que ocurre más frecuentemente).

CUADRO 2 Niveles de Bcl-2 en la orina en sujetos normales y con cáncer de ovario EJEMPLO 2 Bcl-2 en la orina en pacientes con enfermedad ginecológica benigna no es elevado Mediciones de ELISA Bcl-2 en la orina de 35 mujeres con enfermedad ginecológica benigna (orina recolectada justo antes del tratamiento del paciente) indicaron niveles de Bcl-2 promediando 0.02 ng/ml sin muestras >1.8 ng/ml Bcl-2, como se muestra en la figura 8A. Esas enfermedades benignas incluyeron teratomas benignos, quistes simples, leiomiomas, ovario polistrónico, fibromas, y adenomas. Estos valores fueron similares a los controles normales, pero significativamente menores que las muestras de cáncer de ovario sugiriendo que los niveles de Bcl-2 en la orina elevados mayores que 1.8 ng/ml estaban asociados con cáncer de ovario. La prueba de Kruskal-Wallis se usó para probar la distribución normal de los datos. Puesto que el grupo "normal" no cumplió con la distribución normal, probablemente debido a un número de muestreo pequeño, las diferencias entre los grupos se analizaron por la prueba de U de Mann-Whitney. Los resultaron indicaron que no hubo diferencia significativa entre grupos normales y benignos (p<0.5), pero p<0.001 entre grupos normales y con cáncer benignos y cáncer. Un resumen del nivel de Bcl-2 en la orina para este grupo de estudio se presenta en la figura 8B. Asimismo, análisis de discriminación usando el sistema SAS revelaron que la probabilidad de membresía apropiada en el grupo normal/benigno o con cáncer fue >90%.

EJEMPLO 3 Bcl-2 en la orina no se correlaciona con la edad del paciente o tamaño de tumor La comparación de parámetros clínicos sugirió que los niveles de Bcl-2 en la orina no se relacionan con la edad del paciente (véase figura 5). Aunque el intervalo de edad y la edad promedio de los controles normales (29-81 años, promedio 48.5 ± D.E. 12.7 años) y mujeres con enfermedad ginecológica benigna (28-84 años, promedio 55.9 ± D.E. 13.9 años) fue un poco menor que el de mujeres con cáncer de ovario (26-92 años, promedio 62.2 ± D.E. 13.8 años), las diferencias no fueron estadísticamente significativas en este estudio. De manera similar, los niveles de Bcl-2 en la orina no se correlacionaron con el tamaño del tumor medido en cirugía de reducción (figura 6), variando de microscópica a >10 cm y pueden reflejar variación biológica entre individuos o variación de composición tumoral.

EJEMPLO 4 Bcl-2 en la orina detecta cáncer de ovario en forma más exacta que CA125 en la sangre Para determinar si Bcl-2 en la orina elevado es un indicador de diagnóstico mejor para cáncer de ovario que el antígeno de cáncer 125 (CA125), Bcl-2 en la orina se comparó con los niveles de CA125 en 12 controles normales y 23 pacientes con cáncer de ovario (figuras 4A y 4B). De los pacientes examinados, Bcl-2 en la orina elevado asociado con detección de cáncer de ovario fue casi de 100%. Bcl-2 en la orina elevado (>1.8 ng/ml) identificó 17/17 pacientes con adenocarcinoma seroso, 4/4 pacientes con cáncer de ovario mucinoso y 1/2 pacientes con cáncer peritoneal primario como positivos para cáncer de ovario (figura 4A). Ninguno de los controles normales tuvo niveles de Bcl-2 en la orina >1 .8 ng/ml y después, se clasificaron correctamente como negativos para cáncer. Por el contrario, los niveles en la sangre de CA125 >35 U/ml, el estándar actual para detección de cáncer de ovario, identificó 13/17 ó 76% de pacientes con adenocarcinoma seroso (figura 4B). Asimismo, el análisis de CA125 identificó 3/4 ó 75% de pacientes con cáncer de ovario mucinoso, aunque los niveles de CA125 en estos pacientes variaron entre 41-43 U/ml, y 1/2 ó 50% de pacientes con cáncer peritoneal primario como positivo para cáncer. Los niveles de CA125 elevados también identificaron incorrectamente 2/12 ó 16% de individuos sano como positivos para cáncer lo que sugiere que Bcl-2 en la orina elevado parece detectar cáncer de ovario en forma más exacta que CA125.

EJEMPLO 5 Bcl-2 en la orina disminuye después de cirugía de reducción Para probar adicionalmente la exactitud para altos niveles de Bcl-2 en la orina para detectar cáncer de ovario, los niveles de Bcl-2 en la orina se compararon en 7 pacientes con cáncer de ovario inmediatamente antes de (figuras 7A y 7B, barras negras) y dentro de 2 semanas después de la cirugía de reducción inicial para remoción de todos los tumores visibles (barras blancas). Para esos pacientes, en donde las muestras de orina se recolectaron antes y después de cirugía inicial, los niveles de Bcl-2 disminuyeron hasta 100% después de remoción quirúrgica de tumor lo que sugiere que la presencia de tumor se correlaciona bien con Bcl-2 en la orina elevado en pacientes con cáncer de ovario. Actualmente, estudios preclinicos se enfocan en el desarrollo de agentes para inhibir Bcl-2, incluyendo oligonucleótidos de antisentido e inhibidores moleculares pequeños de Bcl-2. Aunque dichos estudios están dirigidos a Bcl-2 para intervención terapéutica, los presentes datos indican que la cuantificación de Bcl-2 en la orina por pruebas basadas en ELISA pueden proveer un método novedoso, seguro, sensible, específico y económico para la detección de cáncer de ovario que beneficiaría a todas las mujeres no sólo en los Estados Unidos, sino a nivel mundial, incluyendo áreas geográficas médicamente sin servicio, y especialmente mujeres con alto riesgo de desarrollar cáncer de ovario. Además, dado que aproximadamente 25,000 mujeres son diagnosticadas con cáncer de ovario cada año en los Estados Unidos, la detección de Bcl-2 en la orina de cáncer de ovario en las etapas temprana y tardía de la enfermedad no sólo confirmarían el diagnóstico de cáncer de ovario, sino que también podrían detectar potencialmente miles de cánceres de ovario previamente no diagnosticados. Esto es especialmente importante para la detección de cáncer de ovario en las etapas tempranas lo que representa menos de 10% de los cánceres de ovario diagnosticados, pero en donde la reducción quirúrgica del ovario enfermo incrementa la supervivencia del paciente por arriba del 90% y se esperaría que redujera los costos médicos de vida larga. Por último, además de tener una función de diagnóstico novedosa, los niveles de Bcl-2 en la orina se pueden usar para monitorear la presencia de cáncer de ovario a lo largo del curso de la enfermedad, lo que puede ¡mpactar los resultados terapéutico y de pronóstico. Claramente, los estudios de población más grande son garantizados para verificar el potencial para niveles de Bcl-2 en la orina para servir como un biomarcador para cáncer de ovario así como investigaciones en el mecanismo(s) molecular responsable de Bcl-2 en la orina elevado en cáncer de ovario. Sin embargo, puesto que no hay reportes que utilicen detección de Bcl-2 en la orina como un biomarcador para cáncer de ovario, este estudio piloto sugiere que la medición de Bcl-2 en la orina por ELISA puede proveer un método simple e innovador para detectar todos los cánceres de ovario y posiblemente reducir la mortalidad de una enfermedad insidiosa que mata a miles de mujeres anualmente.

EJEMPLO 6 Condiciones de almacenamiento de orina para pruebas de Bcl-2 Estudios que examinan la estabilidad de almacenamiento de bcl-2 en la orina indican que cuando las muestras se preparan con la adición de un cóctel de inhibidores de proteasa, estas muestras de orina se pueden almacenar durante 1 año a -20°C sin pérdida de detección de bcl-2 (véase 'Control' y '-20°C en la figura 1 1 ). Esto sería benéfico para individuos en donde pudiera ser deseable volver a probar muestras previas con las actuales. Alternativamente, estas muestras también se pueden almacenar a 4°C hasta por 4 días sin afectar adversamente la detección de Bcl-2 en la orina. Estos son resultados importantes ya que indican que el tiempo posiblemente requerido para transportar muestras de orina del paciente (de áreas geográficas potencialmente distantes) a un laboratorio para prueba de Bcl-2, no afectarían adversamente el resultado de detección de Bcl-2 en la orina si se añaden inhibidores de proteasa a las muestras de orina y las muestras de orina se mantienen frías. Sin embargo, Bcl-2 reducido se midió en muestras almacenadas a temperatura ambiente durante 4 días y Bcl-2 no se pudo detectar en muestras de orina almacenadas a -80°C; por lo tanto, parece prohibitivo almacenar muestras de orina para detección de Bcl-2 ya sea a temperatura ambiente o a -80°C. Todas las patentes, solicitudes de patente, solicitudes provisionales y publicaciones referidas a o citadas aquí, anteriormente o posteriormente, se incorporan por referencia en su totalidad, incluyendo todas las figuras y cuadros, al grado de que no son inconsistentes con las enseñanzas explícitas de esta especificación. Cabe entender que los ejemplos y modalidades descritos aquí son para propósitos ilustrativos únicamente y que varias modificaciones o cambios a la luz de los mismos serán sugeridos a los expertos en la técnica se incluirán dentro del espíritu y alcance de esta solicitud.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- Un método de detección de cáncer en un sujeto, que comprende detectar la presencia de Bcl-2 en una muestra biológica del sujeto, en donde un nivel de Bcl-2 por arriba de un umbral predeterminado es indicativo de cáncer en el sujeto. 2 - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha detección comprende detectar proteína Bcl-2 en la muestra biológica. 3. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha detección comprende detectar una secuencia de ácido nucleico que codifica proteína Bcl-2 en la muestra biológica. 4. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha detección comprende: (a) poner en contacto la muestra biológica con un agente de unión que se une a la proteína Bcl-2 para formar un complejo; (b) detectar el complejo; y correlacionar el complejo detectado a la cantidad de proteína Bcl-2 en la muestra, en donde la presencia de proteína Bcl-2 elevada es indicativa de cáncer. 5. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la muestra biológica es un fluido biológico seleccionado del grupo que consiste de orina, sangre entera, suero, plasma, fluido de ascitos y fluido peritoneal. 6.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la muestra biológica es orina. 7.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de ovario, cáncer peritoneal primario y endometrio cáncer. 8.- El método , de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el cáncer es cáncer de ovario. 9.- El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque la muestra biológica es orina o sangre, y el cáncer es cáncer de ovario. 10. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de mama, cáncer de endometrio, cáncer cervical, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de próstata, melanoma, glioblastoma, sarcoma, cáncer de vejiga y cáncer de cabeza y cuello. 1 1 . - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la muestra biológica es orina o sangre, y el cáncer es cáncer de próstata. 12. - El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el agente de unión es inmovilizado sobre un soporte. 13 - El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el agente de unión es un anticuerpo monoclonal o policlonal. 14. - El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque dicha detección de (b) además comprende enlazar o incorporar un marcador en el agente de unión. 15. - El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque dicha detección de (b) usa detección inmunoenzimática basada en ELISA. 16.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende adicionalmente detectar un biomarcador de cáncer en la misma muestra biológica o una muestra biológica diferente obtenida del sujeto, antes, durante, o después de dicha detección de Bcl-2. 17.- El método de conformidad con la reivindicación 16, en donde el biomarcador de cáncer es un biomarcador de cáncer ginecológico. 18. - El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque el biomarcador es CA125, LPA o OVXI. 19. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho sujeto padece cáncer, y en donde dicha detección se realiza en varios puntos de tiempo a intervalos, como parte de un monitoreo del sujeto antes, durante, o después del tratamiento del cáncer. 20 - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende adicionalmente comparar el nivel de Bcl-2 en la muestra biológica con el nivel de Bcl-2 presente en una muestra de control normal, en donde un nivel más alto de Bcl-2 en la muestra biológica en comparación con el nivel en la muestra de control normal es indicativo de cáncer. 21 . - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el sujeto no presenta síntomas de cáncer en el tiempo en que se lleva a cabo dicha detección. 22. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el sujeto presenta uno o más síntomas de cáncer en el tiempo en que se lleva a cabo dicha detección. 23. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el sujeto presenta uno o más de los síntomas seleccionados del grupo que consiste de dolor pélvico, sangrado vaginal anormal, inflamación o hinchazón abdominal, dolor de espalda persistente, malestar estomacal persistente, cambio en el patrón de intestino o vejiga, dolor durante el coito, pérdida de peso no intencional de cinco o más kilos, anormalidad de la vulva o vaginal, cambio en la mama y fatiga. 24. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el sujeto tiene un nivel de CA125 elevado en la sangre en el tiempo de dicha detección. 25. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el sujeto no tiene un nivel de CA125 elevado en la sangre en el tiempo de dicha detección. 26.- Un método para evaluación de pronóstico de un sujeto que tiene, o se sospecha que tiene, cáncer, que comprende: a) determinar el nivel de Bcl-2 en una muestra biológica obtenida del sujeto; b) comparar el nivel determinado en el paso (a) con un intervalo de Bcl-2 que se sabe que está presente en una muestra biológica obtenida de un sujeto normal que no tiene cáncer; y c) determinar el pronóstico del sujeto basado en la comparación del paso (b), en donde un alto nivel de Bcl-2 en el paso (a) indica una forma agresiva de cáncer y, por lo tanto, un pronóstico deficiente. 27.- Un dispositivo para la detección rápida de Bcl-2 en una muestra de fluido del cuerpo, que comprende una zona de aplicación para recibir una muestra de fluido del cuerpo; una zona de mareaje que contiene un agente de unión que se une a Bcl-2 en la muestra; y una zona de detección en donde el agente de unión a Bcl-2 es retenido para dar una señal, en donde la señal dada para una muestra de un sujeto con un nivel de Bcl-2 menor que una concentración de umbral es diferente de la señal dada para una muestra de un paciente con un nivel de Bcl-2 mayor que una concentración de umbral. 28. - El dispositivo de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque el fluido del cuerpo es orina y dicha concentración de umbral es entre 0 ng/ml y 2.0 ng/ml. 29. - El dispositivo de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque el fluido del cuerpo es orina y dicha concentración de umbral es 1.8 ng/ml. 30. - El dispositivo de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque el dispositivo tiene una zona de referencia que da una señal que tiene la misma intensidad que la señal dad en la zona de detección para una muestra de un sujeto que tiene un nivel de Bcl-2 igual a la concentración de umbral. 31. - El dispositivo de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque el agente de unión es un anticuerpo etiquetado. 32. - El dispositivo de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque el anticuerpo es etiquetado con oro coloidal. 33.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque la zona de detección comprende un anticuerpo anti-Bcl-2 inmovilizado. 34. - El dispositivo de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque el dispositivo tiene una zona de control corriente abajo de la zona de detección que retiene el agente de unión que pasa a través de la zona de detección. 35. - El dispositivo de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque la zona de control y la zona de referencia son la misma zona. 36.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque el agente de unión es un anticuerpo monoclonal etiquetado. 37.- Un método para medir Bcl-2 en un fluido del cuerpo, que comprende: (a) obtener una muestra de a fluido del cuerpo de un sujeto; (b) poner en contacto la muestra con un agente de unión que se une a cualquier Bcl-2 en la muestra; (c) separar el agente de unión a Bcl-2; (d) detectar una señal asociada con el agente de unión separado de (c); y (e) comparar la señal detectada en el paso (d) con una señal de referencia que corresponde a la señal dada por una muestra de un sujeto con un nivel de Bcl-2 igual a una concentración de umbral. 38. - El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado además porque el fluido del cuerpo es orina y la concentración de umbral es entre 0 ng/ml y 2.0 ng/ml. 39. - El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado además porque el fluido del cuerpo es orina y la concentración de umbral es 1.8 ng/ml. 40. - Un equipo para la detección de cáncer en una muestra biológica, que comprende un agente de unión específico para Bcl-2, e instrucciones impresas para detectar cáncer en un fluido biológico usando el agente de unión. 41 . - El equipo de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado además porque comprende uno o más inhibidores de proteasa para ser aplicados a una muestra biológica.