TWI757285B

TWI757285B - 癌症偵測方法

Info

Publication number: TWI757285B
Application number: TW106114215A
Authority: TW
Inventors: 雅各文森米考夫; 荷黑雷斯菲洛
Original assignee: 比利時商比利時意志有限公司
Priority date: 2017-04-28
Filing date: 2017-04-28
Publication date: 2022-03-11
Also published as: TW201839395A

Abstract

本發明係關於組織特異轉錄因子-核小體加合物或轉錄輔因子-核小體加合物用於生物體液中偵測或診斷癌症之生物標記。本發明進一步關於使用該組織特異轉錄因子或輔因子-核小體加合物辨認患者體內癌症發展位置。

Description

癌症偵測方法

本發明係關於一種偵測癌症的方法，特定而言，藉由微創血液試驗，辨認具有轉移性癌症之患者之未知原發癌。

多種免疫分析血液試驗因應臨床需求，而經常使用於臨床用途。若干例示包括：偵測或研究病毒疾病、心肌梗塞、甲狀腺疾病、生殖能力、婦科疾病、發炎反應、免疫狀態、過敏、用藥狀態(藥物、雄性素、增強運動、娛樂)等。大型診斷公司可提供自動化之免疫分析系統，且具有數百種免疫分析測試。免疫分析測試具有多項優點，包括極佳分析敏感性和特異性，且具有穩定性和可靠性；試驗具有極高的可用性，患者僅需提供一滴血，便能於實驗室、醫師辦公室、或家中以極低成本完成。儘管如此，只有一種免疫分析血液試驗經常在臨床上用於偵測癌症：前列腺專一性抗原(Prostate Specific Antigen(PSA))，用於偵測前列腺癌。其他典型之癌症生物標記蛋白質，例如CA125、CA19.9、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen)、和AFP(alpha-fetoprotein)，用於監測癌症治療，但因其臨床上精準度低，不建議用於癌症偵測。

非免疫分析之血液癌症偵測方法，係依據偵測循環腫瘤細胞，仍在發展中，但不常用於臨床用途。相似地，針對循環腫瘤DNA(ctDNA)、RNA、或其他循環核酸之方法，亦在發展中，但臨床應用並不廣泛。循環核酸的方法有許多種類，有些依據偵測癌症相關ctDNA序列突變，或其他DNA序列對於癌症之影響；其他則依據偵測癌症相關之DNA序列甲基化、或癌症相關之微小RNA(miRNA)。DNA異常為所有癌症之特徵。癌細胞與正常細胞之DNA有多處相異，包括但不限於點突變、甲基化程度、轉位、基因複製數、微衛星DNA異常、和DNA雙股整全性。前述任何突變均適用於ctDNA試驗。

若在早期便偵測到癌症，可能之方法包括糞便試驗、侵入性內視鏡、侵入性組織切片、(較危險的)X光掃描檢查、MRI掃描、子宮頸抹片、或觀察症狀。前述方法均具有侵入性、不舒適感、患者風險、患者順從度、和/或高費用等缺點。若已被偵測，癌症則進一步藉由腫瘤組織切片，並以免疫組織化學法(IHC)診斷及確認。癌症之早期偵測可使患者有較佳治療效果，以及免於晚期癌症於住院照護和治療所造成之大量開銷。但不幸地癌症於近期仍無法於發展至晚期之前便及時偵測，以至於原發癌已擴散，治療方針更加限縮，並且開銷更高、治療效果更低。故，在癌症血液試驗方面有極高的醫療需求有待發展。

診斷出癌症之患者具有晚期或轉移性癌症，已擴散至原發癌增生之器官之外。許多案例中，並不清楚原發癌增生之位置，該些案例被辨識為未知原發癌(carcinomas of unknown primary(CUPs))或隱匿性腫瘤。針對辨認原發癌位置之案例具有高度臨床相關性，因為癌症係依據其原始發展之位置而進行治療，即使已擴散至身體其他部位。特別是對於標靶治療，應針對癌症之原發位進行治療。例如，原發肺癌擴散至肝，則視為肺癌且具有肝轉移或繼發性(secondary)癌症，而非視為肝癌，因為該癌症之細胞為肺細胞。

許多案例中，具有轉移性癌症之患者，亦可診斷原發癌位置。但對於CUP而言，無法診斷其原發癌。可能有許多原因，包括繼發性癌症生長快速，但原發癌極小並且難以掃描診斷；或原發癌已消失，原因包括免疫反應或原發癌已脫落(例如，結腸直腸癌可能自腸壁上脫落，並隨糞便排出體外)。

近來具有轉移性癌症之患者之原發癌係依據患者檢驗、症狀、掃描診斷、和組織切片之IHC而定位。原發癌之位置可使用組織特異轉錄因子之IHC而辨認和確認。

循環腫瘤DNA分析、或其他生物標記方法，可揭露個體中原位癌之存在，但並不辨認其位置。對於已知罹患或疑似罹患CUP之患者亦同(除了不須有任何癌症轉移存在)，但並無法得知其原發癌之位置。例如，利用ctDNA序列診斷癌症之技術可辨認血液中癌症相關基因突變，並顯示是否有癌症存在，即便不知道癌症位置。以循環腫瘤細胞之技術、或其他癌症偵測技術用於判斷癌症位置亦相似。

人體中具有數以百計之細胞型態，這些細胞型態均具有相同基因體，但在體內表現極為不同之表現型和不同功能。表現型的多樣性係源自於不同細胞具有基因體之不同表現。目前仍未完全了解不同基因表現之調控，但已了解其基本機制，包括互相關聯之表觀遺傳訊息所調控之基因、真染色質或異染色質之染色質折疊方式、核小體位置或核酸酶可切割位置之調控、DNA甲基化、核小體中組織蛋白與DNA纏繞之結構、轉錄因子或轉錄輔因子表現以及其與基因之交互作用。

核小體係染色質結構之基本單元，並且為由8個高度保守之核心組織蛋白所構成之複合體(包括H2A、H2B、H3、H4組織蛋白各一對)。環繞該複合體之DNA約為146鹼基對。其他組織蛋白，即H1或H5，則作為連接並且參與形成緊密染色質。DNA於核小體上連續環繞之結構被稱為「串珠型」，並且其為真染色質或開放染色質之基本構造。若為緊密染色質或異染色質，前述串珠則為螺旋狀或超螺旋狀，形成緊閉且複雜之結構(Herranz and Esteller,2007)。

成人正常細胞之增減牽涉每日約10¹¹個細胞產生分裂以及相近數量之細胞死亡，主要藉由細胞凋亡而死亡。於細胞凋亡之過程，染色質斷裂成片段，並且細胞釋放出單核小體和寡核小體；正常狀態之下，會被人體清除，並且健康個體血液循環中核小體濃度極低。而在多種疾病患者體內，可觀察到核小體濃度提高，包括癌症、自體免疫疾病、發炎反應、中風、核心肌梗塞等疾病(Holdenrieder & Stieber,2009)。

單核小體和寡核小體可藉由酵素免疫測定法(Enzyme-Linked ImmunoSorbant Assay，ELISA)偵測，並且有數種方法已被發表(Salgame et al,1997；Holdenrieder et al,2001；van Nieuwenhuijze et al,2003)。測定方法包括使用組織蛋白之抗體(例如anti-H2B、anti-H3、或anti-H1、H2A、H2B、H3和H4)作為捕抓抗體，以及DNA抗體或H2A-H2B-DNA複合體抗體作為偵測抗體。使用ELISA偵測循環無細胞核小體之濃度以及循環DNA濃度之相關係數，以即時定量PCR測定，其結果顯示血清中r=0.531，血漿中r=0.350(Holdenrieder et al,2005)。

核小體ELISA之方法可用於細胞培養，主要用於偵測細胞凋亡(Salgame et al,1997；Holdenrieder et al,2001；van Nieuwenhuijze et al,2003)；另可用於測定血漿和血清中循環無細胞核小體(Holdenrieder et al,2001)。死亡細胞釋放至循環中之無細胞血清和血漿核小體，已被報導可使用ELISA測定多種癌症，作為可能之生物標記用途之評估(Holdenrieder et al,2001)。於先前報導中，多種癌症之循環核小體之平均濃度均偏高。可於肺癌患者體內觀察到最高循環核小體濃度。但有報導指出，惡性腫瘤患者之血清核小體濃度變異極大，某些具有晚期腫瘤之患者具有較低循環核小體濃度，且落於正常人之濃度內(Holdenrieder et al,2001)。因此，考量非癌症因素所造成之核小體濃度變異，循環核小體之濃度尚未用於癌症之臨床生物標記(Holdenrieder and Stieber,2009)。

核小體結構因組織蛋白之轉錄後修飾、以及內含組織蛋白之變異體而異，組織蛋白之轉錄後修飾一般發生於8個核心組織蛋白之尾端，常見之修飾包括離胺酸之乙醯化、甲基化、或泛素化；精胺酸之甲基化；以及絲胺酸之磷酸化。組織蛋白修飾是基因表觀調控中一環(Herranz and Esteller,2007)。核小體之結構因其內含組織蛋白同功型或變異體而異，該同功型或變異體係來自不同基因或不同基因剪接因此具有不同胺基酸序列。組織蛋白變異體可區分為多個種類，其中可進一步區分個別不同類型。多數組織蛋白變異體之核酸序列已被發表，並可自國家人類基因體研究中心之組織蛋白資料庫(Mariño-Ramírez et al,2011 and http：//genome.nhgri.nih.gov/histones/complete.shtml)、GenBank資料庫(NIH基因序列)、EMBL核酸序列資料庫、和日本DNA資料庫(DDBJ)中取得。

健康細胞和疾病細胞之組織蛋白變異體和組織蛋白修飾具有多種差異，通常可以免疫組織化學方法分辨(Herranz and Esteller,2007)。臨床應用中，免疫組織化學方法之缺點之一係組織樣本需以手術或切片等侵入式方法取得。

核小體結構、位置能調控表觀訊息之外，連結DNA之核小體結構之修飾亦可調控細胞中基因表現，例如DNA之甲基化(Herranz and Esteller,2007)。目前已知DNA於胞嘧啶第5位置可甲基化形成5-甲基胞嘧啶。總體DNA 低度甲基化為癌症之標誌(Esteller,2007 and Hervouet et al,2010)。細胞中總體DNA甲基化可使用免疫組織化學技術研究。

除了核酸和組織蛋白之外，染色質包含大量非組織蛋白之蛋白質並與DNA和組織蛋白結合(Yoshida and Shimura,1972)。染色質相關蛋白在類型上和功能上有大量變異，包括轉錄因子、轉錄增強因子、轉錄抑制因子、組織蛋白修飾酶、DNA損傷修復蛋白等。結合至染色質之蛋白質研究大多使用染色質免疫沉澱(ChIP)方法研究，雖常見於文獻中，但該方法複雜、困難、並且昂貴。

使用ChIP時，必須先將染色質交聯，使蛋白質和核酸以共價鍵鍵結。再剪切染色質，形成單核小體和寡核小體。再加入研究目標之蛋白質之抗體，以免疫沉澱具有蛋白質之染色質片段。該抗體通常接合至固態物質(例如塑膠珠)，以協助分離具有目標蛋白質之染色質複合體。去交聯之後，使用蛋白酶分離蛋白質，染色質中的DNA則可進一步分離並分析其與目標蛋白質結合之序列、基因、或基因座等，該分析可藉由多種技術完成，包括PCR和膠體電泳、DNA定序(ChIP-Seq)、或DNA微陣列(ChIP-on-chip)。該些ChIP技術可揭示與染色質組織蛋白結合之DNA序列，其他衍伸技術亦有利於研究組織蛋白或核小體相關之其他蛋白，例如組織蛋白相關測定(Histone Associated Assays)(Ricke and Bielinsky,2005)。

具有非組織蛋白之染色質片段，形成核小體-蛋白質或染色體-蛋白質加合物，可於循環中偵測；例如WO2013/084002揭示無細胞核小體-蛋白質加合物之偵測方法。

除了表觀遺傳調控機制，不同轉錄因子之表現和功能亦可調控不同基因表現。轉錄因子具有DNA結合域(DNA Binding Domain，DBD)，可結合至特定基因序列並調控其表現。例如，雄性素受體(Androgen Receptor)係一轉錄因子結合至染色體中特定序列，即雄性素回應元件(Androgen response element，ARE)，提高或抑制ARE調控之雄性素相關基因之表現。轉錄因子結合至目標基因序列時，可增強或抑制基因表現，某些轉錄因子於所有、或大部份組織均有表現，其他轉錄因子則因不同組織而異，而為組織特異轉錄因子。

組織特異轉錄因子可使用IHC判斷其存在於特定原發癌細胞中，但於其他癌症中則否。例如，轉錄因子CDX2表現於腸胃道癌細胞，特別是結腸直腸癌，自手術或切片所得到之組織使用IHC可辨認其為原發腸胃道癌。

相似地，組織特異轉錄輔因子例如FHL2，為前列腺和心組織特異之雄性素受體輔因子(Muller et al；2000)。

本發明提供簡單的免疫試驗方法，可直接評估生物樣本之轉錄因子-核小體和轉錄輔因子-核小體加合物。藉由選定組織特異轉錄因子和/或輔因子，該方法可作為非侵入性、或微創、血液試驗，以偵測癌症，或確認及判定轉移癌症患者之原發腫瘤之位置。本發明揭示核小體加合物可於血清樣本中偵測，並用於疾病之生物標記。

本發明之一實施態樣係提供一種組織特異轉錄因子-核小體或組織特異轉錄輔因子-核小體於生物體液中生物標記之用途，用於偵測或診斷癌症。

本發明之另一實施態樣係提供一種組織特異轉錄因子-核小體或組織特異轉錄輔因子-核小體於生物體液中生物標記之用途，用於偵測或診斷已知癌症患者之癌症增生位置。

本發明之另一實施態樣係提供一種偵測癌症和/或判斷癌症增生位置之方法，包括：(i)取得患者體液樣本；(ii)第一結合劑接觸樣本，該第一結合劑結合至核小體或其部分；(iii)第二結合劑接觸樣本，該第二結合劑結合至加合至核小體之組織特異轉錄因子或輔因子；以及(iv)偵測或定量樣本中該組織特異轉錄因子或輔因子與該第二結合劑之結合；其中，依據加合至核小體之該組織特異轉錄因子或輔因子之存在或其濃度，判斷該癌症之存在和/或其增生位置。

本發明之另一實施態樣係提供一種偵測癌症和/或判斷癌症增生位置之方法，包括：(i)取得患者體液樣本；(ii)第一結合劑接觸樣本，該第一結合劑結合至組織特異轉錄因子或輔因子；(iii)第二結合劑接觸樣本或核小體，該第二結合劑結合至核小體或其部分；以及(iv)偵測或定量樣本中核小體或其部分與該第二結合劑之結合；其中，以加合至核小體之該組織特異轉錄因子或輔因子之存在或其濃度，判斷該癌症之存在和/或增生位置。

本發明另一實施態樣係提供一種評估動物或人類個體之適當治療方法之方法，包括： (i)偵測或測量本說明書所述之方法所定義之個體之生物體液中加合至核小體之組織特異轉錄因子或輔因子；以及(ii)依據被偵測之加合至核小體之該組織特異轉錄因子或輔因子之類型，判斷該個體之醫療適宜性。

本發明進一步實施態樣係提供一種監測動物或人類個體之治療之方法，包括：(i)偵測或測量本說明書所述之方法所定義之個體之生物體液中加合至核小體之組織特異轉錄因子或輔因子；(ii)重複地於特定一或多時間點，偵測或測量本說明書所述之方法所定義之個體之生物體液中加合至核小體之該組織特異轉錄因子或輔因子；以及(iii)依據被偵測之加合至核小體之該組織特異轉錄因子或輔因子之濃度變化，判斷該個體病勢之改變。

本發明進一步實施態樣係提供一種治療癌症之方法，包括：(i)依據本說明書所述之方法，偵測患者之癌症和/或診斷患者癌症增生之位置；以及(ii)依據該癌症或/和該增生之位置，給予患者適當之癌症治療之療法、手術、或藥物。

本發明進一步實施態樣係提供生物體液中具有至少二組織特異轉錄因子或輔因子之染色質片段用於偵測癌症之生物標記之用途。

本發明進一步實施態樣係提供一種偵測癌症或判斷癌症增生位置之方法，包括： (i)取得患者體液樣本；(ii)第一結合劑接觸樣本，該第一結合劑可與第一轉錄因子或輔因子結合；(iii)第二結合劑接觸樣本，該第二結合劑可與第二轉錄因子或輔因子結合；以及(iv)偵測或定量樣本中該第一或第二結合劑之結合；其中，以染色質片段中該第一和第二轉錄因子或輔因子之組合之存在和/或其濃度，作為癌症之存在和/或增生位置之標記。

圖1 使用ELISA偵測循環無細胞核小體與GATA3加合物之結果，樣本取自一健康個體、三乳癌患者、二膀胱癌患者、和一負控制組。

圖2 使用ELISA偵測循環無細胞核小體與TTF-1加合物之結果，樣本取自一健康個體、三甲狀腺癌患者、二肺癌患者、和一負控制組。

圖3 使用ELISA偵測循環無細胞核小體與TTF-1加合物之結果，樣本取自三健康個體、一甲狀腺癌患者、四肺癌患者、三直腸癌患者、三結腸癌患者、三乳癌患者、和一負控制組。

圖4 使用ELISA偵測循環無細胞核小體與CDX2加合物之結果，樣本取自三健康個體、一甲狀腺癌患者、四肺癌患者、三直腸癌患者、三結腸癌患者、三乳癌患者、和一負控制組。

依據本發明第一實施態樣，本發明提供生物體液中組織特異轉錄因子或輔因子與核小體加合物作為偵測或診斷患者之癌症之生物標記之用途。

於一具體實施例，該組織特異轉錄因子-核小體加合物或組織特異轉錄輔因子-核小體加合物係用於辨認患者癌症增生之位置。

於一具體實施例，該患者先前未診斷出癌症(即，表面上健康)。例如，針對表面上健康之受試者，以篩選試驗偵測癌症。於一具體實施例，該患者已診斷出癌症相關症狀；即，以患者之疾病症狀偵測癌症。前述之症狀隱含癌症、或特定組織或器官之異常。前述之症狀包括疼痛、異常出血、異常腫塊或水腫、持續咳嗽、呼吸短促、和/或不明原因之體重下降。

本發明亦可用於以診斷出原發癌但不知其位置之癌症患者，例如，使用ctDNA試驗、循環腫瘤試驗、或依據症狀。因此，依據本發明第二實施態樣，本發明提供生物體液中組織特異轉錄因子或輔因子與核小體加合物作為辨認或診斷已診斷出癌症之患者之癌症增生位置之生物標記之用途。

本發明揭示可於無細胞核小體上偵測組織特異轉錄因子或輔因子，以及可進一步用於偵測癌症和/或辨認患者癌症之源頭，例如針對已診斷出癌症但不知其增生位置之患者。辨認癌症增生位置對於選用適當療法、以及改善患者預後和治療非常重要。

於一具體實施例，該癌症係原發癌，即癌症於體內起始/起源之位置。於一替代實施例，該癌症係繼發性癌症，即癌細胞轉移已至身體其他部位。

於一具體實施例，該患者係具有CUP之轉移性癌症患者。此時實例中，該患者已診斷出轉移性癌症，但定位其原發癌以提供適當治療仍然重要。

於一具體實施例，該患者已藉由循環核酸方法診斷出癌症，例如使用ctDNA、RNA、miRNA、或其他可偵測癌症之循環血液核酸方法。進一步實施例中，該患者已藉由循環腫瘤DNA(ctDNA)作為生物標記診斷出癌症。於一具體實施例，該患者已藉由偵測循環腫瘤細胞診斷出癌症。前述實施例中，該癌症已被診斷但仍未知其於患者體內原始位置。

依據本發明進一步實施態樣，本發明提供生物體液中組織特異轉錄因子或輔因子與核小體加合物作為辨認或診斷具有轉移性癌症之患者之原發癌位置、部位、或器官之生物標記之用途。本發明揭示三種加合物存在於癌症患者循環，包括TTF-1、CDX2、或GATA3，分別表現於甲狀腺或肺癌組織(TTF-1)、腸胃道癌組織(CDX2)、和乳癌組織(GATA3)，並且其存在或量可做為患者具有原發甲狀腺、結腸直腸、或乳癌之標記，以及該些組織特異轉錄因子與核小體加合物通常於其他癌症患者或健康個體之循環中不存在、或僅有低量。

文獻中已有報導指出TTF-1表現於大多肺癌和甲狀腺癌組織。結腸直腸癌組織有時具有較高TTF-1表現。因此TTF-1之組織試驗可用於辨認具有甲狀腺或肺原發癌之CUP腫瘤，但包括結腸直腸癌之其他癌症可能為偽陽性，將其誤認為肺或甲狀腺癌。本發明揭示循環核小體與TTF-1之加合物於甲狀腺癌腫瘤患者血液中濃度較為升高，但肺癌患者中升高量較低。令人驚訝地，本發明揭示循環核小體與TTF-1之加合物於所有結腸直腸癌腫瘤患者血液中濃度亦有升高。前述結果表示體液中無細胞組織特異核小體-轉錄因子加合物之濃度、與癌症組織切片中特異轉錄因子表現量並不相同，但並非適用於所有情況。

目前已知相似之組織特異轉錄因子表現於多種其他癌症(Kandalaft and Gown,2015)，此外習知技術者可得知組織特異轉錄因子-核小體加合物可用於相似之核小體加合物試驗，並且辨認多種癌症之未知原發位置。其例示包括但不限於GATA3、CDX2、TTF-1、PAX8、WT1、NKX3.1、P63(TP63)、或P40，和/或其他可辨識組織特異轉錄因子之表現之癌症。本發明提供之方法可於臨床上應用之情況，例如，個體未被偵測出或未知是否罹患癌症，或已知罹患癌症但其原發癌增生位置仍然未知，適用情況包括CUP、或已偵測癌症但尚未得知原發位置。後者之情況，例如，依據ctDNA、RNA、或其他血液循環核酸之偵測方法偵測癌症，或偵測循環腫瘤細胞之未知原發源。多種循環核酸方法可用於偵測，其中一部分係依據偵測癌症相關ctDNA序列突變，或其他癌症相關DNA序列變異；另一部分係依據癌症相關微RNA序列、癌症相關DNA序列甲基化、或其他方法。DNA異常係所有癌症之特徵。癌細胞與健康細胞於DNA之差異包括但不限於，點突變、甲基化狀態、轉位、基因數量、微衛星異常、以及DNA雙股整全性。但，基因突變係所有癌症之特徵，並且其存在並無法提供其原發腫瘤之相關資訊。例如，P53基因突變常見於癌症當中，其ctDNA之存在可用於癌症偵測之生物標記。但因P53突變廣泛地存在於多種癌症中，因此無法自其存在得知任何原發癌相關資訊。習知技術者可得知，本發明可用於判定癌症增生位置，其中該癌症已藉由生物標記或症狀而使用其他可行的方法偵測。因此，本發明可用於針對已診斷出癌症但未知其起源、位置、或部位之患者之附加測試。

用語「轉錄因子」指涉結合至DNA且藉由提高(即活化蛋白)或抑制(即抑制蛋白)轉錄而調控基因表現之蛋白質。轉錄因子包括一或多DNA結合域，可結合至與被調控基因相鄰之特定DNA序列。

本說明書用語「組織特異轉錄因子」指涉總是、或經常表現於特定組織或癌症、並且極少或不表現於其他組織或癌症之轉錄因子。前述組織特異轉錄因子之僅表現於有限的組織或癌症類型，例如單一、二、三、四、或五種組織或癌症類型。循環中無細胞核小體-轉錄因子加合物之存在或濃度表示表現該轉錄因子之細胞之死亡以及其特定組織可用於偵測腫瘤原發位置之組織之生物標記。

本說明書用語「轉錄輔因子」、或「輔因子」指涉調控轉錄因子功能之蛋白質。許多轉錄因子僅於輔因子共同存在、並調控其結合且有時引導前起始複合體和RNA聚合酶時，才結合至目標DNA序列。本說明書實施例中，轉錄因子之使用方法亦適用於輔因子。

進一步地，組織特異轉錄因子和/或輔因子之組合中，轉錄因子之表現不必然為組織特異，但藉由組合組織特異轉錄因子而可調控組織特異基因之表現。因此，二或多轉錄因子和輔因子之結合，雖其個別表現非必定為組織特異，但實際上可調控組織特異基因之表現，該基因之表現需要二或多轉錄因子或輔因子同時存在。因此，指稱「組織特異」轉錄因子和輔因子時，其包括轉錄因子和/或輔因子之組合，可共同作用以達成組織特異性，即，於一具體實施例中，本發明之態樣包括偵測組織特異轉錄因子和/或輔因子之組合。

用語「生物標記」指稱特定過程、結果、或條件之生物或生物衍生標記。生物標記可用於癌症鑑別診斷之方法，例如預後評估和監測治療結果、辨認患者可能對於特定治療之反應、篩選和發展藥物。生物標記及其應用對於鑑定新藥治療或發現藥物治療之新目標極有價值。

依據本發明進一步之態樣，本發明提供血液中組織特異轉錄因子-核小體或輔因子-核小體加合物作為辨認或診斷患者原發癌位置之生物標記，其中該患者已偵測出癌症但未知其癌症位置。於一實施例，依據患者症狀疑似罹患癌症，本發明可用於確認癌症存在和/或癌症之位置、部位、或器官所在。

本發明之目標係偵測體液中可結合至核小體之組織特異轉錄因子或輔因子，可藉由取得個體之體液樣本、以及實施雙抗體ELISA試驗完成，該ELISA試驗包括使用一結合至核小體之抗體、以及另一結合至與核小體結合或加合之組織特異轉錄因子或輔因子。但，該結合至核小體之抗體不需結合至整個核小體複合體，僅需結合至該核小體之部分。本發明實施例中，用於結合至核小體之抗體可結合至核小體之任一部分，例如特定組織蛋白、組織蛋白修飾、組織蛋白變異或異構物、DNA、或特定核苷酸如5-甲基胞嘧啶。相似地，用於結合至組織特異轉錄因子之抗體可結合至轉錄因子之任一部分或域。若該轉錄因子係具有多個蛋白質之蛋白質複合體，該複合體中任何蛋白質均可為抗體之目標。

依據本發明進一步態樣，本發明提供一種偵測癌症和/或判斷癌症增生位置，包括：(i)自患者體內取得生物體液樣本；(ii)第一結合劑接觸樣本，該第一結合劑結合至核小體或其部分、或加合至核小體之組織特異轉錄因子或輔因子；(iii)第二結合劑接觸樣本或該核小體，該第二結合劑結合至加合至核小體之組織特異轉錄因子或輔因子，若該第一結合劑結合至核小體或其部分；或，該第二結合劑結合至核小體或其部分，若該第一結合劑結合至加合至核小體之組織特異轉錄因子或輔因子；以及(iv)偵測或定量該第二結合劑與組織特異轉錄因子或輔因子、核小體、或其部分之結合；其中，加合至核小體之該組織特異轉錄因子或輔因子之存在或濃度係用於癌症存在或其增生位置之標記。

依據本發明進一步之態樣，本發明提供一種偵測癌症和/或判斷癌症增生位置之方法，包括(i)自患者體內取得生物體液樣本；(ii)第一結合劑接觸樣本，該第一結合劑結合至核小體或其部分；(iii)第二結合劑接觸核小體或樣本，該第二結合劑結合至加合至核小體之組織特異轉錄因子或輔因子；以及(iv)偵測或定量該第二結合劑與該組織特異轉錄因子或輔因子之結合；其中，加合至核小體之該組織特異轉錄因子或輔因子之存在或濃度係用於癌症存在或其增生位置之標記。

習知技術者可得知，偵測結合劑可選擇結合至組織特異轉錄因子或輔因子、或核小體或其部分。

故，依據本發明進一步態樣，本發明提供一種偵測癌症和/或判斷癌症增生位置之方法，包括：(i)自患者體內取得生物體液樣本；(ii)第一結合劑接觸樣本，該第一結合劑結合至加合至核小體之組織特異轉錄因子或輔因子； (iii)第二結合劑接觸核小體或樣本，該第二結合劑結合至核小體或其部分；以及(iv)偵測或定量該第二結合劑與該核小體或其部分之結合；其中，加合至核小體之該組織特異轉錄因子或輔因子之存在或濃度係用於癌症存在或其增生位置之標記。

本發明提供之方法亦可用於已診斷出癌症之患者。

如上文所述，轉錄因子和另一轉錄因子或輔因子共同結合可產生組織特異性，並且多種輔因子可位於基因體中接近之位置(如Zhang & Glass,2013和Yu et al,2006)。即，細胞死亡且染色質斷裂後產生具有多種轉錄因子之染色質片段。該染色質片段可包括具有或不具有核小體之多種轉錄因子，其可用於本發明進一步之態樣。

轉錄因子和輔因子於基因體中DNA結合位置接近而共同定位，即使轉錄因子和輔因子之DNA結合位置不相近，仍可藉由DNA環化(looping)而使較遠距離之位置彼此接近而使轉錄因子調控基因。習知技術者可得知，染色質片段可包括由環化形成之組織特異轉錄因子和輔因子之組合。

本說明書用語「染色質片段」指涉蛋白質和核酸複合體，其源自於細胞染色體。染色質片段可包含核小體和/或相關DNA和/或任何多蛋白-核酸複合體中非組織蛋白之染色質相關蛋白質。非組織蛋白之染色質相關蛋白質例如，轉錄因子、輔因子、輔活化子、輔抑制子、RNAS聚合酶之部分、延長因子、染色質重塑因子、仲介蛋白、STAT之部分、上游結合因子(UBF)、或其他。

依據本發明進一步之態樣，本發明提供個體體液中包含二或多組織特異轉錄因子或輔因子之染色質片段作為偵測癌症之生物標記之用途。習知技術者可得知，共同導致組織特異性之二轉錄因子或輔因子，可以一ELISA相關之試驗偵測或測量，例如使用二抗體分別結合至二轉錄因子或輔因子其中之一。或，共同導致組織特異性之二轉錄因子或輔因子可分別以ELISA相關之試驗偵測或測量，例如分別使用轉錄因子或輔因子-核小體加合試驗、或轉錄因子或輔因子-DNA加合試驗。習知技術者可得知，共同導致組織特異性之二轉錄因子或輔因子可分別以ELISA相關之試驗偵測或測量，例如分別使用三、四、或多種轉錄因子或輔因子-核小體加合試驗、或轉錄因子或輔因子-DNA加合試驗，如本說明書所揭示。

習知技術者可得知，包括共同導致組織特異性之轉錄因子或輔因子，其本身即是組織特異。相似地，包括導致組織特異性之二或多轉錄因子或輔因子染色質片段，其本身即是組織特異。因此，本說明書用語「組織特異染色質片段」指涉染色質片段，其包括組織特異轉錄因子或輔因子、或包括二或多組織特異轉錄因子或輔因子之組合。

組織特異性之組合可用於辨認患者癌症增生位置。因此，依據本發明進一步態樣，本發明提供體液中包含二或多組織特異轉錄因子或輔因子之染色質片段用於判斷或診斷患者癌症增生位置之生物標記之用途。

依據本發明進一步態樣，本發明提供一種偵測癌症或判斷患者癌症增生位置之方法，包括：(i)自患者體內取得生物體液樣本；(ii)第一結合劑與樣本接觸，該第一結合劑結合至第一轉錄因子或輔因子； (iii)第二結合劑與樣本接觸，該第二結合劑結合至第二轉錄因子或輔因子；以及(iv)偵測或定量樣本中該第一或第二結合劑之結合；其中，包含該第一和第二轉錄因子或輔因子之染色質片段之存在或其濃度，用於癌症存在或其增生位置之標記。

習知技術者可得知，前述步驟(iv)無須測定二結合抗體，由於其中任一之訊號僅當二抗體均結合時才放出。於一較佳實施例，結合至第一轉錄因子或輔因子之第一結合劑係固定於固態表面，以及結合至第二轉錄因子或輔因子之第二結合劑具有一可偵測標記。該些結合劑與樣本中染色質片段接觸後，可偵測固定於固態物質之抗體標記。習知技術者可得知，依據本發明態樣實施之免疫試驗，僅當該第一和第二結合劑均結合至該第一和第二轉錄因子或輔因子時才放出訊號，即轉錄因子或輔因子均位於樣本中相同染色質片段。

於一實施例，前述轉錄因子之組合於染色質片段上偵測。於進一步實施例，該染色質片段具有DNA和二或多轉錄因子。於另一實施例，該染色質片段具有二或多轉錄因子和一或多核小體。

二或多轉錄因子或輔因子同時結合至一基因或基因啟動子之基因座可為單一組織特異、或限定於特定組織。若轉錄因子和/或輔因子同時特異結合至組織，其結合模體(motif)通常位置相近、或距離少於200鹼基對。

對於許多廣泛地表現之訊息依賴(signal-dependent)轉錄因子之功能，前述共同作用之轉錄因子可形成組織特異性。例如許多轉錄因子，其藉由細胞表面受體傳遞之胞外訊息而活化，該受體包括但不限於賀爾蒙核受體、STAT轉錄因子、NF-κB族群、CREB、及其他。因此，廣泛表現之細胞受體可於不同組織調節不同基因，形成組織特異性。已被報導之例示包括雄性素受體，其與轉錄因子FoxA1共同調控前列腺特異基因之轉錄、與轉錄因子Hnf4α共同調控腎臟特異基因之轉錄、和與轉錄因子AP-2α共同調控副睪特異基因之轉錄(Pihlajamaa,2014)。類似之報導，包括賀爾蒙核受體相關文獻：Levy et al,2007；Zhao et al,2010；和Zhang and Glass,2013；揭示於參考文獻。

眾多之組織特異轉錄因子和輔因子之組合已被揭示並可用於本發明，可於開放資料庫中獲得，例如組織特異基因表現和調控資料庫(Tissue Specific Gene Expression and Regulation，TiGER)，由約翰霍普金斯大學Wilmer眼科研究所生物資訊實驗室所建立。轉錄因子或輔因子對之三例示，各自於多種組織中具有特異性，其揭示如下：膀胱 ARNT：SREBP1 MAX：SREBP1 SREBP1：MYC/MAX

血液 ELF1：PEA3 ETF：NRF1 PEA3：PU.1

骨 EF-C：MIF1 EF-C：RFX1 GATA-3：MIF1

骨髓 ETF：NRF1 MAX：SREBP1 NRF1：STAT3

腦 AP2alpha：ETF C/EBP：PBX1 ETF：LBP1

子宮頸 CREB：NRF1 ELK1：NRF1 ETF：NRF1

結腸 AFP1：HNF1 CDP：FOXO4 CDP：HNF1

眼 CHX10：CRX CHX10：GATA6 CRX：PITX2

心 AP1：MEF2 AP1：RSRFC4 FOXJ2：POU3F2

腎 CRX：HNF1 GCNF：HNF1 COUP-TF/HNF4：HNF1

咽喉 AP1：NFE2 AP1：TCF11/MAFG BACH1：NFE2

肝 CDP：HNF1 C/EBPgamma：HNF1 E4BP4：HNF1

肺 ETF：MYC/MAX ETF：LBP1 ETF：TBP

淋巴結 c-Ets-1：c-Ets-2 ELK1：PU.1 ICSBP：c-Ets-2

乳腺 E2F：SRY ETF：TAX/CREB ETF：ZID

肌肉 AP-4：MEF2 MEF2：MYOD MEF2：RSRFC4

卵巢 AP2alpha：VDR CREB：MAZ DBP：VDR

胰臟 ATF：HEB ATF：NF-muE1 ATF：NRL

周邊神經系統 CREB：RSRFC4 HNF1：SRY MYOD：OCT1

胎盤 ATF1：CHX10 ATF1：LHX3 ATF：CHX10

前列腺 AFP1：LHX3 CART1：LHX3 C/EBPγ：LHX3

皮膚 AREB6：ALX4 AREB6：ARP-1 AREB6：E47

腸 CART1：LHX3 HNF1：LHX3 HNF1：NKX6-2

軟組織 C/EBPγ：FOXO4 FOXO1：SF1 FOXO4：TBP

脾臟 E12：c-Ets-1 GCM：NFKB1 LBP1：MYOD

胃 AP2γ：ETF AREB6：NFE2 ER：HIF1

睪丸 AP2：NRF1 EGR1：NRF1 EGR3：NRF1

胸腺 ATF：TAX/CREB c-Ets-1：c-Ets-2 ETF：NRF1

舌 ATF：CREB ATF：CREBP1 CREBP1：CREB

子宮 E4BP4：POU1F1 E4BP4：POU3F2 NKX6-2：POU3F2

依據本發明進一步態樣，本發明提供一種轉錄因子/輔因子生物標記套組，包括二或多組織特異轉錄因子或輔因子之試驗。前述本發明之態樣可用於個別轉錄因子/輔因子之組織特異性有侷限，並且其組合所揭露之組織特異性較單一試驗準確。前述本發明之態樣中，該轉錄因子無須互相連接以及無須存在於單一染色質片段，但可共同形成組織特異性。前述轉錄因子/輔因子之組合可分別藉由ELISA偵測或測量，例如使用二、三、四、或多個各別之轉錄因子或輔因子-核小體加合物試驗之套組，或各別之轉錄因子或輔因子-DNA加合物試驗之套組，如本說明書所述。

依據本發明進一步態樣，針對體液中二或多轉錄因子/輔因子之組合之存在或濃度之套組，可用於癌症存在和/或其增生位置之生物標記。前述本發明態樣中，該轉錄因子/輔因子無需具有彼此接近之DNA結合位，亦無需位於單一染色質片段。二或多轉錄因子/輔因子之組合可各別直接進行試驗，無論是否為單一染色質片段之部分。前述本發明態樣中，任何可偵測各別轉錄因子/輔因子之方法均可使用，包括但不限於單一抗體(或其他結合物)之免疫分析法、二抗體(或其他結合物)之免疫分析法、質量分光光度法、ChIP、或其他適當之分析方法。體液中二或多轉錄因子/輔因子之組合之存在或濃度可充分表示癌症之存在和/或其增生位置。

習知技術者可得知，無細胞組織特異轉錄因子和/或輔因子及其組合可做為細胞或染色質來源之組織特異生物標記，無論其是否結合於DNA或核小體。依據本發明進一步態樣，本發明提供一種體液中無細胞組織特異轉錄因子或輔因子之生物標記、或其套組。前述本發明態樣中，任何可偵測各別轉錄因子/輔因子之方法均可使用，包括但不限於單一抗體(或其他結合物)之免疫分析法、二抗體(或其他結合物)之免疫分析法、質量分光光度法、ChIP、或其他適當之分析方法。體液中二或多轉錄因子/輔因子之組合之存在或濃度可用於癌症之存在和/或其增生位置之標記。

習知技術者可得知，多種免疫化學及其他分析方法可用於偵測組織特異染色質片段，該片段包括本發明相關之轉錄因子和/或輔因子-核小體加合物。多種分子生物學方法可適當地用於本發明，包括但不限於ChIP或其他分析染色質之方法。非免疫化學法，包括層析或質譜法、和其他方法，包括可分離組織特異轉錄因子-核小體加合物和偵測該分離之組織特異轉錄因子之免疫化學、層析、質譜、或其他方法。分離蛋白質複合體或加合物、和蛋白質、核酸複合體或加合物之方法已揭示於先前技術，例如但不限於，將該加合物暴露於酸或鹼性介質、高鹽濃度、或使用機械或音波震動、生物降解、或其他酵素為主之方法。故，依據本發明進一步態樣，本發明提供一種偵測癌症存在或判斷癌症增生位置之方法，包括：(i)自患者體內取得體液樣本；(ii)自具有加合物之核小體或染色質片段中，分離組織特異轉錄因子或輔因子；以及(iii)偵測或定量該分離之組織特異轉錄因子或輔因子；其中，該組織特異轉錄因子或輔因子之存在或濃度係用於癌症增生位置之標記。

於本發明進一步態樣，該組織特異轉錄因子或輔因子係結合至DNA，並且偵測體液中DNA-組織特異轉錄因子或輔因子加合物以及用於生物標記，如本說明書所述。於一實施例，依據本發明揭示之方法，體液中DNA-組織特異轉錄因子或輔因子加合物之偵測方法，係使用結合劑直接結合至組織特異轉錄因子或輔因子，另使用另一結合劑直接結合至DNA或其任何部分。

依據先前技術，直接結合至目標核小體DNA之轉錄因子可視為前驅轉錄因子。但，多種轉錄因子結合至目標DNA序列，僅當輔因子共同存在並調節其結合、以及進一步形成組織特異性。例如，FoxA1為前列腺組織中雄性素受體結合至ARE所需之輔因子，亦為乳癌中雌性素受體結合至雌性素回應元件所需(estrogen response element，ERE)之輔因子。因此，於本發明一實施例中，結合輔因子(或轉錄因子)之無細胞核小體可用於偵測並辨認癌症癌症增生位置。轉錄因子非必然為結合輔因子之核小體。無論是否存在轉錄因子，結合輔因子之無細胞核小體皆可用於偵測。

於一實施例中，該組織特異轉錄輔因子係FoxA1。若該輔因子係FoxA1，癌症增生位置可選自乳房或前列腺。

於一較佳實施例，該組織特異轉錄因子選自GATA3、CDX2、TTF-1、PAX8、WT1、NKX3.1、P63(TP63)、或P40。表1提供癌症組織中腫瘤相關之轉錄因子。

例示並非詳盡於於表1。依據本發明之方法，偵測體液中核小體轉錄因子加合物濃度之組織特異性，於不同癌症組織中其濃度可能彼此相異。

於一實施例中，該組織特異轉錄因子係GATA3，癌症增生位置係選自乳癌、唾腺癌、移行細胞癌、和皮膚附屬器腫瘤。

於一實施例中，該組織特異轉錄因子係CDX2，癌症增生位置係選自結腸直腸癌和胃癌。

於一實施例中，該組織特異轉錄因子係TTF-1，癌症增生位置係選自肺腺癌、結腸直腸癌、胸腺癌、和神經內分泌癌。

於一實施例中，該組織特異轉錄因子係PAX8，癌症增生位置係選自婦科癌、胸腺癌、和腎臟癌。

於一實施例中，該組織特異轉錄因子係WT1，癌症增生位置係選自卵巢癌、和間皮瘤。

於一實施例中，該組織特異轉錄因子係NKX3.1，癌症增生位置係前列腺瘤。

於一實施例中，該組織特異轉錄因子係P63(TP63)，癌症增生位置係選自鱗狀細胞癌、移行細胞癌、胸腺瘤、唾腺癌、滋胚層瘤。

於一實施例中，該組織特異轉錄因子係P40，癌症增生位置係選自鱗狀細胞癌、移行細胞癌、胸腺瘤、唾腺癌、滋胚層瘤。

前述方法可使用一抗體結合至核小體、另使用另一抗體結合至加合至核小體之組織特定轉錄因子；或，使用一抗體結合至核小體之部分、另使用另一抗體結合至加合至核小體之組織特定轉錄因子。相似地，可使用一抗體結合至DNA或其部分、特定或經修飾核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶。

於一實施例中，結合至核小體或其部分之結合劑，係用於結合至特定組織蛋白、組織蛋白修飾、組織蛋白變異或異構物、或特定核苷酸。於進一步實施例，結合至核小體或其部分之結合劑，係用於結合至DNA或核苷酸，包括經修飾核苷酸如5-甲基胞嘧啶，以及偵測結合轉錄因子之DNA。

用語「結合劑」指涉配體或結合物，例如天然或化學合成之化合物，可專一地結合至生物標記(即，核小體或加合至核小體之組織特定轉錄因子)。本發明之配體或結合物可包括胜肽、抗體、或其片段，或合成配體例如塑料抗體(plastic antibody)、或適體或寡核苷酸，可專一性地結合至生物標記。前述抗體可為單株或多株抗體或其片段，可專一地結合至目標。本發明之配體或結合物可具有一可偵測標記，例如冷光、螢光、酵素、或放射標記；另，本發明之配體亦可具有一親和標記，例如生物素、抗生物素蛋白、鏈親和素、或His標記(例如hexa-His)。於一實施例，該結合劑係選自：抗體、抗體片段、或適體。於進一步實施例，該結合劑係抗體。本說明書用語「抗體」、「結合劑」、「結合物」可互相替代使用。

於一實施例，該樣本係生物體液(本說明書中可與「體液」互相替代使用)。體液樣本可為任何取自生物體之液體，包括但不限於腦脊髓液、血液、血清、血漿、經血、子宮內膜液、尿液、唾液、或其他體液(糞便、淚液、滑液、痰)；另可為呼吸，例如濃縮呼吸、或其純化物、萃取物、或稀釋物。樣本可為取自活體或非活體之切片。樣本製備後，例如，可適當地以一般技術稀釋、濃縮、和儲存。於進一步實施例，體液樣本係選自血液、血清、或血漿。習知技術者可知，體液中核小體加合物之偵測可具有最低侵入性、且無須自活體切片之優勢。

於一實施例，前述生物體係哺乳類動物。於進一步實施例，前述生物體係選自人類或動物(例如老鼠)個體。

於一實施例，該核小體係無細胞單核小體或寡核小體。

習知技術者可知，本發明提供之用途及方法可於體外(in vitro)、離體(ex vivo)、和/或體內(in vivo)實施。

依據本發明進一步態樣，本發明提供一種判斷或診斷動物體或人體中原發癌之特性，包括：(i)偵測或測量體液樣本中染色質片段或其與核小體之加合物上一或多組織特異轉錄因子或輔因子；以及(ii)依據染色質片段或其與核小體之加合物上一或多組織特異轉錄因子或輔因子之偵測結果辨認該原發癌之特性。

於本發明一實施例，染色質片段或其與核小體之加合物上一或多組織特異轉錄因子係用於決定患者適當治療之療程。習知技術者可知，組織特異染色質片段或轉錄因子-核小體加合物可用於辨認癌症位置、部位、或/和器官，並且決定適當之療法，即依據癌症之起源或位置。

依據本發明進一步態樣，本發明提供一種評估動物或人類個體之適當治療方法之方法，包括：(i)偵測或測量體液樣本中染色質片段或其與核小體之加合物上一或多組織特異轉錄因子或輔因子；以及(ii)依據染色質片段或其與核小體之加合物上一或多組織特異轉錄因子或輔因子之類型判斷適當之治療方法。

依據本發明進一步態樣，本發明提供一種監測動物體或人體之治療之方法，包括：(i)偵測或測量體液樣本中染色質片段或其與核小體之加合物上一或多組織特異轉錄因子或輔因子；(ii)重複地於特定一或多時間點，偵測或測量體液樣本中染色質片段或其與核小體之加合物上一或多組織特異轉錄因子或輔因子；以及(iii)依據被偵測之染色質片段或其與核小體之加合物上一或多組織特異轉錄因子或輔因子之濃度變化，判斷該個體病勢之改變。

試驗樣本中組織特異染色質片段或轉錄因子(或輔因子)-核小體加合物相對於相同個體之前次試驗之濃度改變，可視為有益之效果，例如治療可穩定或改善異常或疑似異常。此外，治療完成後，可定期重複本發明之方法，以監測疾病是否復發。

於一實施例，本發明之方法偵測或測量組織特異染色體片段或轉錄因子-核小體加合物，作為偵測套組其中之一。例如，組織特異轉錄因子-核小體加合物可與其他生物標記一併偵測，該生物標記具有相同組織特異性，例如組合組織特異標記如Kandalaft and Gown,2015所述。

於本發明進一步實施例，本發明提供一種偵測或診斷癌症類型以評估適當癌症藥物或治療之標靶，包括：試驗樣本作為試驗套組之部分，該樣本取自已藉由加合至核小體之組織特異轉錄因子之存在或濃度診斷癌症之患者。

因此，前述試驗套組可由，例如，具有不同組織特異轉錄因子之二以上或多個核小體加合物之測量所組成。

本說明書所述之組織特異染色體片段和轉錄因子-核小體加合物係疾病位置之標記，該加合物用於辨認體外或/和體內試驗之新穎治療化合物。因此，本發明之核小體加合物可用於篩選化合物，該化合物可調控核小體加合物之濃度，故可針對特定癌症類型實施標靶治療。

因此，本發明提供一種辨認可用於癌症標靶治療之物質之方法，包括給予動物個體一試驗物質，以及偵測和/或定量該個體樣本中組織特異染色質片段或轉錄因子-核小體加合物。

癌症類型之不同有效診斷和監測方法提供有效且可改善預後之解決方法，該方法係藉由建立正確診斷、最適治療之快速鑑定(可減少非必要之藥物副作用)、和降低復發率達成。

習知技術者可知，可藉由任何適合用於辨認取自患者之樣本、其純化物、萃取物、或稀釋物中特定蛋白質之存在或/和濃度，進行辨認或/和定量。本發明之方法中，可藉由測量樣本中生物標記之濃度，進行定量。本發明之方法用於樣本之試驗，包括前文所述之方法。樣本製備後，例如，可適當地以一般技術稀釋、濃縮、和儲存。

生物標記之辨認和/或定量可藉由偵測該生物標記或其片段達成，例如，偵測C端截斷或N端截斷之片段。前述片段，較佳地係大於4個胺基酸，例如長度為5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20個胺基酸之胜肽。

生物標記可直接偵測，例如使用SELDI或MALDI-TOF。替代地，可使用配體之間交互作用，例如抗體或其結合生物標記之片段、或其他胜肽、或可特異結合至生物標記之配體如適體或寡核苷酸，直接或間接地偵測該生物標記。配體或結合物可具有一偵測標記，例如冷光、螢光、或放射標記，和/或親和力標記。

例如，可使用一或多種方法偵測和/或定量，該方法選自SELDI(-TOF)、MALDI(-TOF)、1-D膠體分析、2-D膠體分析、質譜法、逆相層析法、尺寸滲透(膠體過濾)、離子交換、親和力、HPLC、UPLC、和其他LC或LC-MS相關技術。適當之LC-MS技術包括ICAT®(Applied Biosystems,CA,USA)、或iTRAQ®(Applied Biosystems,CA,USA)。亦可使用液相層析法(例如高壓液相層析法(HPLC)或低壓液相層析法(LPLC))、薄膜層析法、NMR光譜法等。

本發明提供之不同癌症診斷或監測方法，可包括使用SELDI-TOF或MALDI-TOF分析樣本，以偵測生物標記之存在或濃度。前述方法亦適用於預後、監測治療結果、辨認對於特定治療之最可能產生反應之患者、篩選及發展藥物、以及辨認藥物治療之新目標。

可使用免疫方法辨認和/或定量待分析之生物標記，包括抗體或其片段，可特異地結合至生物標記。適當之免疫方法包括三明治型免疫試驗，例如三明治型ELISA，使用二種可辨認生物標記之不同抗原決定位之抗體用以偵測；此外，例如放射免疫試驗(RIA)、直接、間接、或競爭型ELISA、酵素免疫試驗(EIA)、螢光免疫試驗(FIA)、西方墨漬法、免疫沉澱法、和其他使用粒子之免疫試驗(例如使用金、銀、乳膠粒子、磁性粒子、或量子點)。免疫方法可於，例如，微量盤或條狀盤上進行。

本發明之免疫試驗包括使用酵素偵測之免疫試驗(例如ELISA)、螢光標記免疫試驗、時間解析(time-resolved)螢光標記免疫試驗、化學發光免疫試驗、免疫濁度分析試驗(immunoturbidimetric assays)、粒子標記免疫試驗、以及免疫放射試驗；此外，另可為競爭型免疫試驗，包括標定抗原和標定抗體競爭性免疫試驗，該標定種類範圍廣泛，可包括放射性標記、酵素、螢光、時間解析螢光、和粒子標記。特定免疫試驗中，使用之方法係直接地偵測抗體結合而無使用任何標記。前述所有免疫試驗係發表於文獻，例如Salgame et al,1997以及van Nieuwenhuijze et al,2003。

依據本發明進一步態樣，本發明提供一種偵測結合至核小體之組織特異轉錄因子或輔因子之套組，該套組包括配體或結合物可特異地結合至組織特異轉錄因子，另包括另一配體或結合物可特異地結合至核小體或其部分，並且依據本說明書提供之方法使用該套組。

依據本發明進一步態樣，本發明提供一種治療患者之癌症之方法，包括：(a)依據本說明書提供之方法，偵測或診斷患者之癌症；以及(b)針對該癌症，給予該患者適當之抗癌療法、手術、或藥物。

依據本發明進一步態樣，本發明提供一種治療患者之癌症之方法，包括：(a)依據本說明書提供之方法，診斷患者癌症增生之位置；以及(b)針對該癌症增生之位置，給予該患者適當之抗癌療法、手術、或藥物。

本發明使用抗組織蛋白之抗體作為本說明書中試驗所用之偵測抗體，並合併使用適當之組織特異轉錄因子之抗體作為捕捉抗體。本發明藉由前述試驗，用以揭示包括組織特異轉錄因子之核小體加合物可於取自癌症患者之血液樣本中測量，並可作為非侵入性或微創取得之生物標記。

習知技術者可得知，本發明提供之用途及方法可用於偵測或測量任何結合或連結至核小體組織特異轉錄因子或輔因子。

綜上所述，本發明之方法係偵測和測量組織特異染色質片段和組織特異轉錄因子-核小體加合物之有效方法，並且該方法係非侵入性偵測癌症、和/或辨認原發癌之有效方法，該原發癌已為另一偵測癌症之方法(如ctDNA序列方法)偵測或為CUP。

本發明係詳述於實施例，但本發明不限於以下實施例。

實施例1

血清樣本取自1名健康個體、3名乳癌患者、以及2名尿道上皮膀胱癌患者(移行細胞癌，癌症組織表現試驗中GATA3陽性)。試驗使用市面上可得之96孔盤試驗用於GATA3之ELISA套組，包括固相具有GATA3轉錄因子之抗體，固定於微量孔。GATA3係表現於所有或大多數乳癌切片之組織特異轉錄因子，於移行細胞癌或皮膚附屬器腫瘤亦為陽性，但其他癌症樣本中大多則否。固相GATA3抗體與生物素化之抗核小體抗體合併使用，雙重抗體ELISA偵測具有GATA3之無細胞核小體之方法如下：將血清樣本(50μl)和試驗緩衝液(50μl)加入固定GATA3抗體之微量孔並且於室溫(約20℃)搖晃2.5小時。而後，分離樣本並加入生物素化之抗核小體抗體，放置1.5小時。再取出生物素化抗體溶液，並使用清洗緩衝液(200μl)清洗微量孔3次。再加入鏈親和素(streptavidin)-HRP結合溶液並放置30分鐘，而後將微量孔清洗3次並加入HRP受質溶液(100μl之2,2'-次偶氮基二[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二銨鹽溶液)放置20分鐘。最後加入停止溶液(50μl)並測量波長405奈米(nm)之吸光(OD)值。

可於3名乳癌患者之樣本其中之二，觀察到較強之ELISA訊號、以及較高量之循環無細胞核小體-GATA3加合物，而健康個體以及負控制組則無。相較於健康個體，2名移行細胞癌患者其中之一亦具有較高OD值。前述結果揭示於圖1，並且顯示，針對乳癌患者血清中核小體-GATA3加合物試驗可用於偵測癌症和/或未知原發位之癌症增生位置，並且核小體-GATA3加合物可用於生物標記已達成試驗目的。

實施例2

血清樣本取自3名甲狀腺癌患者、2名肺癌患者、以及1名健康個體。試驗使用市面上可得之96孔盤試驗用於TTF-1(thyroid transcription factor 1)之ELISA套組，包括固相具有TTF-1轉錄因子之抗體，固定於微量孔。TTF-1係表現於所有或大多數肺癌和甲狀腺癌切片之組織特異轉錄因子，但其他癌症樣本中大多則否。固相TTF-1抗體與生物素化之抗核小體抗體合併使用，雙重抗體ELISA偵測具有TTF-1之無細胞核小體之方法如實施例1所述。

可於甲狀腺癌患者之樣本，觀察到較強之ELISA訊號、以及較高量之循環無細胞核小體-TTF-1加合物，而健康個體以及負控制組則無。肺癌患者血液中無細胞核小體-TTF-1加合物濃度些微提高。前述結果揭示於圖2。

後續實驗中，血清樣本取自3名健康個體，其他各取自甲狀腺癌、肺癌、胰臟癌、結腸癌、直腸癌、和乳癌患者，用於偵測循環無細胞核小體-TTF-1加合物濃度據以確認組織特異性。結果顯示，甲狀腺癌患者其中之一為高度陽性。全部4名肺癌患者、全部3名胰臟癌患者、以及3名乳癌患者其中之二為加合物低濃度。但，全部6名結腸直腸癌患者之加合物濃度均提高，顯示循環無細胞核小體濃度可用於辨識未知原發癌之位置為結腸直腸原發癌。前述結果顯示，血液中循環無細胞核小體-轉錄因子加合物濃度之組織特異性非必定與自癌組織取得切片之轉錄因子表現量之特異性相同。該結果揭示於圖3。

習知技術者可得知，核小體-TTF-1加合物試驗可用於偵測癌症或辨認原發癌之未知增生位置，其中該癌症係甲狀腺癌或結腸直腸癌；核小體-TTF-1加合物可作為生物標記用於前述目的。

實施例3

血清樣本取自3名健康個體、1名診斷出甲狀腺癌之患者、3名肺癌患者、3名胰臟癌患者、6名結腸直腸癌患者(3名結腸癌和3名直腸癌)、以及3名乳癌患者。試驗使用市面上可得之96孔盤試驗用於CDX2(caudal-type homeobox transcription factor-2)之ELISA套組，包括固相具有TTF-1轉錄因子之抗體，固定於微量孔。CDX2係表現於所有或大多數結腸直腸癌切片之組織特異轉錄因子，但其他癌症樣本中大多則否。固相CDX2抗體與生物素化之抗核小體抗體合併使用，雙重抗體ELISA偵測具有CDX2之無細胞核小體之方法如實施例1所述。

可於結腸直腸癌患者樣本中，觀察到較強之ELISA訊號、以及較高量之循環無細胞核小體-CDX2加合物，而健康個體以及負控制組則無。1名健康個體和1名乳癌患者具有較高濃度，應是偽陽性。結果揭示於圖4，顯示循環無細胞核小體-CDX2加合物濃度可用於偵測癌症或辨認原發癌之未知增生位置，其中該癌症係結腸直腸癌；核小體-CDX2加合物可作為生物標記用於前述目的。

本發明研發三種無細胞核小體-組織特異轉錄因子加合物試驗之模式，並且三者均顯示可應用至臨床用途，用於辨認以診斷出癌症患者之未知原發癌位置。前述用途係本發明概略之功效，另可發展相似之核小體-組織特異轉錄因子試驗，用於辨識已診斷或偵測出、但未知其原位癌增生位置之癌症。可由文獻中得知，相似之組織特異轉錄因子表現於手術取得之癌症組織或切片(Kandalaft and Gown,2015)。習知技術者可得知，類似於實施例1-3所述之使用血液或其他體液之無細胞核小體加合物並偵測適當之組織特異染色質片段或組織特異核小體-轉錄因子或輔因子加合物之試驗，可用於偵測癌症或辨認多種未知原發癌增生位置，其中該轉錄因子已被辨認；和/或，可用於辨認癌症，其中任何組織特異轉錄因子或輔因子、或其組合可被辨識。

習知技術者可得知，本說明書前述具體實施例可用於所有本發明之態樣。進一步地，下文提供本說明書引用之所有公開文件，包括但不限於專利或專利申請。

參考文獻

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Claims

一種體液中組織特異轉錄因子-核小體加合物或轉錄輔因子-核小體加合物用於偵測或診斷患者癌症之生物標記之體外用途。
如申請專利範圍第1項所述之體外用途，其中該組織特異轉錄因子-核小體加合物或轉錄輔因子-核小體加合物係用於辨認患者癌症增生位置。
如申請專利範圍第2項所述之體外用途，其中該患者係已診斷出癌症之患者。
如申請專利範圍第1至3項任一項所述之體外用途，其中該癌症係原發癌。
如申請專利範圍第1至3項任一項所述之體外用途，其中該患者係有未知原發癌之轉移癌之患者。
如申請專利範圍第3項所述之體外用途，其中該患者係已使用循環腫瘤DNA作為生物標記診斷出癌症之患者。
一種偵測患者癌症和/或判斷患者癌症增生位置之體外方法，包括步驟：(i)令一第一結合劑接觸取自該患者之一體液樣本，該第一結合劑結合至核小體或其部分、或結合至加合至核小體之組織特異轉錄因子或輔因子；(ii)令一第二結合劑接觸核小體或樣本，當該第一結合劑結合至核小體或其部分時，該第二結合劑結合至加合至核小體之組織特異轉錄因子或輔因子，或者，當該第一結合劑結合至加合至核小體之組織特異轉錄因子或輔因子時，該第二結合劑結合至核小體或其部分；以及 (iii)偵測或定量該樣本中該第二結合劑與加合的組織特異轉錄因子或輔因子、核小體或其部分之結合；其中，依據加合至核小體之該組織特異轉錄因子或輔因子之存在或量，判斷該癌症之增生位置。
如申請專利範圍第7項所述之體外方法，其中該癌症係原發癌。
如申請專利範圍第7或8項所述之體外方法，其中該患者係有未知原發癌之轉移癌之患者。
如申請專利範圍第7或8項所述之體外方法，其中該患者係已診斷出癌症之患者。
如申請專利範圍第7或8項所述之體外方法，其中該結合劑係抗體、抗體片段、或適體。
如申請專利範圍第7或8項所述之體外方法，其中結合至核小體或其部分之該結合劑係結合至特定組織蛋白、修飾組織蛋白、組織蛋白變異或異構物、或DNA或其部分。
一種評估動物或人類個體之適當治療方法之體外方法，包括步驟：(i)依據申請專利範圍第7至12項任一項所述之體外方法，偵測或測量取自患者之體液樣本中加合至核小體之組織特異轉錄因子或輔因子；以及(ii)依據加合至核小體之該組織特異轉錄因子或輔因子之類型判斷適當之治療方法。
一種監測動物或人類個體之治療之體外方法，包括步驟： (i)依據申請專利範圍第7至12項任一項所述之體外方法，偵測或測量取自患者之體液中加合至核小體之組織特異轉錄因子或輔因子；(ii)重複地於特定一或多時間點，偵測或測量取自患者之體液中該加合至核小體之該組織特異轉錄因子或輔因子；以及(iii)依據被偵測之加合至核小體之該組織特異轉錄因子或輔因子之濃度變化，判斷該個體病勢之改變。
如申請專利範圍第7、8、13或14項所述之體外方法，其中加合至核小體之該組織特異轉錄因子之偵測或測量係作為試驗套組其中之一。
如申請專利範圍第1至3項任一項或第6項所述之體外用途，其中該組織特異轉錄因子係選自GATA3、CDX2、TTF-1、PAX8、WT1、NKX3.1、P63、和P40所構成之群組。
如申請專利範圍第7、8、13或14項所述之體外方法，其中該組織特異轉錄因子係選自GATA 3、CDX2、TTF-1、PAX8、WT1、NKX3.1、P63和P40所構成之群組。
如申請專利範圍第1至3項任一項或第6項所述之體外用途，其中該體液係血液、血清、或血漿。
如申請專利範圍第7、8、13或14項所述之體外方法，其中該體液係血液、血清、或血漿。
一種體液中之包含二或多轉錄因子或輔因子之組織特異組合之染色質片段用於偵測患者癌症之生物標記之體外用途。
如申請專利範圍第20項所述之體外用途，其中該組織特異組合係用於辨認癌症增生位置。
如申請專利範圍第20或21項所述之體外用途，其中該患者係已診斷出癌症之患者。
如申請專利範圍第20或21項所述之體外用途，其中該癌症係原發癌。
如申請專利範圍第20或21項所述之體外用途，其中該患者係有未知原發癌之轉移癌之患者。
如申請專利範圍第22項所述之體外用途，其中該患者係已使用循環腫瘤DNA作為生物標記診斷出癌症之患者。
一種偵測癌症或判斷癌症增生位置之體外方法，包括步驟：(i)令一第一結合劑接觸取自患者之體液樣本，該第一結合劑結合至第一轉錄因子或輔因子；(ii)令一第二結合劑接觸該樣本，該第二結合劑結合至第二轉錄因子或輔因子；以及(iii)偵測或定量該樣本中該第一結合劑或該第二結合劑之結合；其中，依據染色質片段中該第一和第二轉錄因子或輔因子之組合之存在和/或量，判斷該癌症之存在和/或其增生位置。