KR102074528B1 - 뉴클레오티드를 함유하는 뉴클레오솜의 검출 방법 - Google Patents

뉴클레오티드를 함유하는 뉴클레오솜의 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 특정 뉴클레오티드를 함유하는 모노-뉴클레오솜 및 올리고-뉴클레오솜 및 뉴클레오솜의 존재를 검출 및 측정하는 방법, 및 질환의 검출 및 진단을 위한 상기 측정의 사용 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 질환의 검출 및 진단을 위해 뉴클레오솜 연관 뉴클레오티드 바이오마커를 확인하는 방법, 및 상기 방법에 의해 확인된 바이오마커에 관한 것이다.

Description

뉴클레오티드를 함유하는 뉴클레오솜의 검출 방법 {METHOD FOR DETECTING NUCLEOSOMES CONTAINING NUCLEOTIDES}
본 발명은 특정 뉴클레오티드를 함유하는 모노-뉴클레오솜 및 올리고-뉴클레오솜 및 뉴클레오솜의 존재를 검출 및 측정하는 방법, 및 질환의 검출 및 진단을 위한 상기 측정의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 질환의 검출 및 진단을 위한 뉴클레오솜 연관 뉴클레오티드 바이오마커의 확인 방법, 및 상기 방법에 의해 확인된 바이오마커에 관한 것이다.
인체는 수백 개의 세포 종류를 포함한다. 모든 상기 세포 종류는 동일한 게놈을 함유하지만, 신체에서 크게 상이한 표현형 및 상이한 기능을 갖는다. 상기 표현형 다양성은 상이한 세포 종류 내의 게놈의 차별적인 발현 때문이다. 차별적인 유전자 발현의 제어는 완전히 이해되지는 않았고, 기본적인 메카니즘은 진정염색질 (euchromatin) 또는 이질염색질 (heterochromatin)로서 염색질 충전 (packing)의 제어, 뉴클레오솜 위치 및 뉴클레아제 접근 가능 부위의 제어, DNA의 메틸화, 히드록시메틸화 및 다른 변형 및 그 주위에서 DNA가 감싸지는 뉴클레오솜의 구조의 변이를 비롯하여 유전자와 연관된 많은 서로 연결된 후성적 (epigenetic) 신호에 의한 유전자 조절을 포함한다.
뉴클레오솜은 염색질 구조의 기본 단위이고, 8개의 고도로 보존된 코어 히스톤 (각각의 히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4의 쌍을 포함)의 단백질 복합체로 이루어진다. 상기 복합체 주위에서 약 146개 염기쌍의 DNA가 감싸진다. 또 다른 히스톤 H1 또는 H5는 링커로서 작용하고, 염색질 압축 (compaction)에 관여한다. DNA는 종종 "실로 이어진 구슬 (beads on a string)"과 유사한 것으로 언급되는 구조로 연속적인 뉴클레오솜 주위에서 감기고, 이것은 개방된 또는 진정염색질의 기본적인 구조를 형성한다. 압축된 또는 이질염색질에서, 상기 실은 꼬이고, 닫힌 복합체 구조로 고차코일화 (super coiled)된다 (문헌 [Herranz and Esteller, 2007]).
뉴클레오솜의 구조는 히스톤 단백질의 전사후 변형 (PTM)에 의해 및 변이체 히스톤 단백질의 포함에 의해 상이할 수 있다. 히스톤 단백질의 PTM은 일반적으로 코어 히스톤의 테일 (tail)에서 발생하고, 통상적인 변형은 리신 잔기의 아세틸화, 메틸화 또는 유비퀴틴화 및 아르기닌 잔기의 메틸화 및 세린 잔기의 인산화 및 기타 다수의 변형을 포함한다. 히스톤 변형은 유전자 발현의 후성적 조절에 관여하는 것으로 알려져 있다 (문헌 [Herranz and Esteller, 2007]). 또한, 뉴클레오솜의 구조는 상이한 유전자 또는 스플라이스 (splice) 생성물이고 상이한 아미노산 서열을 갖는 대체 히스톤 이소형 또는 변이체의 포함에 의해 상이할 수 있다. 히스톤 변이체는 많은 패밀리로 분류될 수 있고, 이는 다시 개개의 종류로 세분된다. 매우 많은 히스톤 변이체의 뉴클레오티드 서열이 알려져 있고, 예를 들어 NHGRI (National Human Genome Research Institute) 히스톤 데이터베이스 (Marino-Ramirez, L, Levine, K.M., Morales, M., Zhang, S., Moreland, R.T., Baxevanis, A.D., and Landsman, D. The Histone Database: an integrated resource for histones and histone fold-containing proteins. Database Vol.2011. (Submitted) 및 http://genome.nhgri.nih.gov/histones/complete.shtml), 진뱅크 (GenBank) (NIH 유전자 서열) 데이터베이스, EMBL 뉴클레오티드 서열 데이터베이스 및 DDBJ (DNA Data Bank of Japan)에서 공개적으로 이용가능하다.
성인 인간에서 정상 세포 교체율은 하루에 1011개 세포의 세포 분열에 의한 생성 및 주로 아폽토시스 (apoptosis)에 의한 유사한 수의 사멸을 수반한다. 아폽토시스 과정 동안, 염색질은 모노뉴클레오솜 및 올리고뉴클레오솜으로 파괴되고, 이는 세포로부터 방출된다. 정상 조건 하에 건강한 대상체에서 발견되는 순환 뉴클레오솜의 수준은 낮은 것으로 보고된다. 수준 상승은 많은 암, 자가면역 질환, 염증성 병태, 졸중 및 심근경색을 비롯한 다양한 병태를 갖는 대상체에서 발견된다 (문헌 [Holdenreider & Stieber, 2009]).
모노뉴클레오솜 및 올리고뉴클레오솜은 효소 결합 면역 흡착 검정 (ELISA)에 의해 검출될 수 있고, 몇몇 방법이 문헌에 보고되었다 (문헌 [Salgame et al., 1997]; [Holdenrieder et al., 2001]; [van Nieuwenhuijze et al., 2003]). 상기 검정은 일반적으로 항-히스톤 항체 (예를 들어 항-H2B, 항-H3 또는 항-H1, H2A, H2B, H3 및 H4)를 포획 항체로서, 항-DNA 또는 항-H2A-H2B-DNA 복합체 항체를 검출 항체로서 이용한다. 상기 검정을 사용하여, 당업계의 연구자들은 혈청 내의 뉴클레오솜의 수준이 동일한 환자로부터 채취한 혈장 샘플 내보다 더 높다 (10배까지)고 보고하였다. 또한, 이것은 PCR에 의한 DNA의 혈청 및 혈장 측정치에도 동일하게 적용된다 (문헌 [Holdenrieder et al., 2005]). 그 이유는 알려져 있지 않지만, 저자들은 이것이 응고 과정 동안 DNA의 추가의 방출 때문일 수 있다고 추정한다. 그러나, 본 발명자들은 현재 기술의 뉴클레오솜 ELISA 검정 결과가 서로 일치하지 않음을 발견하였다. 또한, 혈청 또는 혈장 내의 대부분의 순환 DNA는 모노-뉴클레오솜 및 올리고-뉴클레오솜으로서 존재한다고 보고되었지만 (문헌 [Holdenrieder et al., 2001]), 혈청 또는 혈장 내의 뉴클레오솜 및 DNA의 측정 수준은 잘 일치하지 않는다. 실시간 PCR (폴리머라제 연쇄 반응)에 의해 측정된 순환 세포 유리 뉴클레오솜 수준과 순환 DNA 수준에 대한 ELISA 결과 사이의 상관 계수는 혈청에서 r=0.531 및 혈장에서 r=0.350인 것으로 보고되었다 (문헌 [Holdenrieder et al., 2005]).
현재의 뉴클레오솜 ELISA 방법은 주로 아폽토시스를 검출하는 방법으로서 세포 배양에서 사용되고 (문헌 [Salgame et al., 1997]; [Holdenrieder et al., 2001]; [van Nieuwenhuijze et al., 2003]), 또한 혈청 및 혈장 내의 순환 세포 유리 뉴클레오솜의 측정을 위해 사용된다 (문헌 [Holdenrieder et al., 2001]). 죽어가는 세포에 의해 순환계 내로 방출되는 세포 유리 혈청 및 혈장 뉴클레오솜 수준은 잠재적인 바이오마커로서의 그의 용도를 평가하기 위해 많은 상이한 암 연구에서 ELISA 방법에 의해 측정되었다 (문헌 [Holdenrieder et al., 2001]). 평균 순환 뉴클레오솜 수준은 전부는 아니지만 연구된 대부분의 암에서 높은 것으로 보고되었다. 가장 높은 순환 뉴클레오솜 수준은 폐암 대상체에서 관찰되었다. 가장 낮은 수준은 전립선암에서 관찰되었고, 이것은 건강한 대상체의 정상 범위 내에 해당하였다. 그러나, 악성 종양이 있는 환자는 상당히 다른 혈청 뉴클레오솜 농도를 갖는 것으로 보고되었고, 진행된 종양 질환이 있는 일부 환자는 건강한 대상체에서 측정된 범위 내의 낮은 순환 뉴클레오솜 수준을 갖는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Holdenrieder et al., 2001]). 이러한 사실 및 뉴클레오솜 수준 상승에 대한 다양한 비-암성 원인 때문에, 순환 뉴클레오솜 수준은 암의 바이오마커로서 임상에서 사용되지 않는다 (문헌 [Holdenrieder and Stieber, 2009]). 놀랍게도, 본 발명자들은 그의 순환 뉴클레오솜 수준이 현재 기술의 상기 뉴클레오솜 ELISA 방법에 의해 측정시에 낮거나 비검출가능한 많은 암 대상체가 순환 세포 유리 뉴클레오솜의 수준 증가를 나타냄을 밝혀내었다. 본 발명자들은 현재 기술의 ELISA 방법에 의해 검출되지 않는 뉴클레오솜을 검출하는, 뉴클레오솜에 대한 신규한 ELISA 방법을 고안하고 제시하였다.
히스톤 PTM의 검출을 위한 ELISA 방법이 또한 당업계에 공지되어 있다. 유리 히스톤 단백질 (뉴클레오솜 복합체 내의 다른 히스톤 및 DNA에 부착되지 않은 것) 내의 PTM 검출을 위한 ELISA 방법은 대체로 세포 용해액으로부터 산 추출에 의해 히스톤 내의 PTM의 검출을 위해 사용된다. 순환 세포 유리 뉴클레오솜 내의 PTM의 검출을 위한 면역검정이 보고되었다 (문헌 [Bawden et al., 2005]). 마이크로타이터 웰에 직접 코팅된 정제된 뉴클레오솜 내의 히스톤 PTM의 ELISA 검출을 위한 방법이 최근에 보고되었다 (문헌 [Dai et al., 2011]). 상기 방법에서, 배양된 세포로부터 염색질 추출물의 소화에 의해 얻은 뉴클레오솜은 마이크로타이터 웰에 직접 코팅되고, 항-PTM 항체와 반응한다. 상기 방법은 비교적 순수한 뉴클레오솜 샘플을 필요로 하고 복잡한 생물학적 매체, 예컨대 혈액, 혈장 또는 혈청 내의 히스톤 PTM의 직접 측정에는 적합하지 않음이 당업자에게 분명할 것이다.
특정 DNA 서열과 연관된 세포 유리 뉴클레오솜 내의 히스톤 PTM (H3K9Me, 리신 잔기 K9에서 모노메틸화된 히스톤 H3)의 검출을 위한 변형된 염색질 면역침전 (ChIP) 방법이 혈장에서 보고되었다. 서열 특이적 히스톤 메틸화의 수준은 순환 뉴클레오솜의 농도와 무관한 것으로 보고되었다 (문헌 [Deligezer et al., 2008]).
히스톤 변이체 (히스톤 이소형으로도 알려짐)는 유전자 발현의 후성적 조절제로 알려져 있다 (문헌 [Herranz and Esteller, 2007]). 히스톤 변이체는 특정 변이체를 코딩하는 유전자의 녹다운 (knock-down) 연구 (예를 들어 RNAi 녹다운 이용), 염색질 면역침전, 아미노산의 안정한 동위원소 표지 및 정량적 질량 분광분석 단백질체학 (proteomics), 면역조직화학 및 웨스턴 블롯팅 (Western Blotting)을 비롯한 다양한 기술을 사용하여 생체내에서 및 시험관내에서 연구되었다 (문헌 [Whittle et al., 2008]; [Boulard et al., 2010]; [Sporn et al., 2009]; [Kapoor et al., 2010]; [Zee et al., 2010]; [Hua et al., 2008]).
폐암, 유방암 및 흑색종으로 진단된 대상체로부터 수술 또는 생검에 의해 제거된 조직 샘플에서 히스톤 변이체 발현의 면역조직화학 연구가 보고되었다. 이들 면역조직화학 연구는 절제된 암 조직 샘플에서 히스톤 macroH2A (mH2A) 및 H2AZ 변이체의 염색이 상기 암에서 예후 용도로 사용될 수 있음을 보고하였다 (문헌 [Sporn et al., 2009], [Hua et al., 2008], [Kapoor et al., 2010]). 임상 용도를 위한 면역조직화학적 방법의 한 가지 단점은 수술 또는 생검을 수반하는 조직 샘플 수집이 침습적이라는 것이다. 면역조직화학 방법의 또 다른 단점은 대체로 질환의 합리적인 예상이 생검 또는 조직 절제가 수행되기 전에 이미 존재하여야 하기 때문에 조기 진단 또는 진단제 스크리닝에 부적합하다는 것이다. 최소 침습성 혈액 ELISA 시험이 보다 광범위한 적용을 위해 적합하고, 상기 단점을 극복하며, 환자에게 바람직할 뿐만 아니라, 보다 빠르고 비용이 적으며 보다 고속 처리를 의료 제공자에게 제공할 것이다.
그러나, 세포 유리 뉴클레오솜 내의 세포 유리 히스톤 변이체는 혈액 또는 다른 매질에서 측정되지 않았다. 혈액 내의 세포 유리 뉴클레오솜 내의 히스톤 변이체의 존재 또는 부재에 대한 연구는 보고되지 않았다. 무손상 세포 유리 뉴클레오솜 내의 히스톤 변이체의 검출 또는 측정 방법은 현재 존재하지 않고 임의의 상기 측정은 제안되거나 고려되지 않았다.
뉴클레오솜 위치 및 뉴클레오솜 구조 (구성하는 히스톤 단백질 변이체 및 PTM 구조 둘 모두의 측면에서)에 의해 매개되는 후성적 신호전달에 추가로, 세포에서 유전자 발현의 제어는 또한 DNA의 시토신 메틸화 상태를 포함한 DNA 뉴클레오티드의 변형에 의해서도 매개된다. DNA가 시토신 뉴클레오티드의 5 위치에서 메틸화되어 5-메틸시토신을 형성할 수 있다고 한동안 당업계에 알려져 왔다. 5-메틸시토신 형태의 메틸화된 DNA는 시토신 뉴클레오티드가 구아닌 뉴클레오티드 옆에 존재하는 DNA 서열 내의 위치에서 발생하는 것으로 보고되었다. 상기 위치는 "CpG"로 약칭된다. 70% 초과의 CpG 위치가 척추동물에서 메틸화되는 것으로 보고되었다 (문헌 [Pennings et al., 2005]). 높은 비율의 CpG 부위를 함유하는 게놈 영역은 종종 "CpG 섬 (island)"으로 언급되고, 약 60%의 인간 유전자 프로모터 서열은 상기 CpG 섬과 연관된다 (문헌 [Rodriguez-Paredes and Esteller, 2011]). 활동 유전자에서, 상기 CpG 섬은 일반적으로 저메틸화된다. 유전자 프로모터 서열의 메틸화는 안정한 유전자 불활성화와 연관된다. DNA 메틸화는 또한 Alu 반복 요소를 포함하는 반복 요소 및 긴 산재된 뉴클레오티드 요소에서 통상적으로 발생한다 (문헌 [Herranz and Estellar, 2007]; [Allen et al., 2004]).
암에서 DNA 메틸화의 관련성은 1983년도에 이미 보고되었다 (문헌 [Feinberg and Vogelstein, 1983]). 암 세포에서 관찰된 DNA 메틸화 패턴은 건강한 세포의 것과 상이하다. 특히 동원체 주변 (pericentromeric) 영역 주위의 반복 요소는 건강한 세포에 비해 암에서 저메틸화되는 것으로 보고되었지만, 특이적인 유전자의 프로모터는 암에서 과메틸화되는 것으로 보고되었다. 상기 두 효과의 균형은 암 세포에서 전체적인 DNA 저메틸화를 유도한다고 보고되었다 (문헌 [Rodriguez-Paredes; Esteller, 2007]).
특정한 특이적인 유전자의 과메틸화는 암에 대한 진단 바이오마커로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 혈장으로부터 추출된 DNA의 PCR 증폭에 의한 셉틴 (Septin) 9 유전자의 과메틸화의 검출에 대해 보고된 방법은 10%의 위 양성 비율로 72%의 결장암을 검출하는 것으로 보고되었다 (문헌 [Grutzmann et al., 2008]). 특이적인 유전자 또는 유전자좌의 DNA 메틸화 상태는 서열분석 또는 다른 수단에 의해 검출될 수 있는 1차 DNA 서열을 유도하는, 5-메틸시토신이 아닌 시토신의 우라실로의 선택적인 비술파이트 탈아민화에 의해 대체로 검출된다 (문헌 [Allen et al., 2004]).
전체적인 DNA 저메틸화는 암 세포의 특징이다 (문헌 [Estellar 2007] 및 [Hervouet et al., 2010]). 전체적인 DNA 메틸화는 면역조직화학 (IHC) 기술을 사용하여 세포에서 연구될 수 있다. 별법으로, DNA는 분석을 위해 세포로부터 추출된다. 제한 소화 및 최근접 이웃 (nearest-neighbour) 분석, 클로르아세트알데하이드를 이용한 형광 검정, 비메틸화된 CpG의 양을 계산하기 위해 삼중수소-표지된 S-아데노실 메티오닌과 함께 DNA 메틸트랜스퍼라제를 사용한 모든 CpG 부위의 메틸화에 의한 역 결정 (inverse determination) 및 고성능 액체 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피, 또는 액체 크로마토그래피, 이어서 질량 분광법에 의한 분석을 위한 단일 뉴클레오티드로의 DNA의 소화를 비롯하여 세포 또는 다른 매질로부터 추출된 DNA 내의 전체적인 메틸화의 검출을 위한 많은 방법이 보고되었다. 상기 방법의 단점은 이들이 노동집약적이고/이거나 다량의 우수한 품질의 추출된 DNA를 필요로 한다는 것이다 (문헌 [Allen et al., 2004]). 비술파이트 탈아민화를 수반하는 PCR 기반 방법은 다량의 DNA 필요성을 극복하지만, 5-메틸시토신의 총 게놈 함량을 나타내는, 특이적인 게놈 영역, 일반적으로 반복 서열을 증폭하여야 한다 (문헌 [Allen et al., 2004]). 상기 전체적인 DNA 메틸화 측정 방법은 다양한 세포 및 조직으로부터 추출된 DNA를 연구하기 위해 사용되었다. 몇몇의 연구자들은 최소-침습 방식으로 얻기가 더 쉽기 때문에 전혈 내의 백혈구로부터 추출된 DNA를 연구하였다 (문헌 [Moore et al., 2008]; [Ting Hsiung et al., 2007]; [Mansour et al., 2010]). 질량 분광분석과 함께 액체 크로마토그래피는 전체적인 DNA 메틸화 측정을 위한 최적 표준으로 간주되지만, 비용이 많이 소요되고, DNA는 분석 전에 단일 뉴클레오티드 수준으로 소화되어야 한다 (문헌 [Vasser et al., 2009]).
최근의 전체적인 DNA 메틸화 평가 방법은 조직으로부터 추출된 가수분해된 DNA의 질량 분광분석과 함께 초고압 액체 크로마토그래피 (문헌 [Zhang et al., 2011]) 및 메틸화-특이적 디지탈 서열분석 (MSDS) 방법 (문헌 [Ogoshi et al., 2011])을 포함한다. 전체적인 DNA 메틸화에 대한 전통적인 경쟁적 면역검정 (및 전체적인 5-히드록시메틸시토신 메틸화에 대한 유사한 검정)이 설명된 바 있다. 상기 방법에서, 세포 또는 조직으로부터 추출된 DNA는 5-메틸화된 시티딘 접합체로 코팅된 마이크로타이터 웰에 첨가되고, 항-5-메틸시티딘 항체가 첨가되고, 코팅된 5-메틸시티딘 접합체와 추출된 샘플 내의 메틸화된 DNA 사이의 항체 결합의 분포는 샘플에 존재하는 전체적인 DNA 메틸화 수준을 평가하기 위해 공지의 표준물질의 것과 비교된다 (문헌 [Cell Biolabs, 2011]). 또 다른 면역검정 유사 방법에서, 조직 또는 혈장 또는 혈청 샘플로부터 추출된 DNA는 마이크로타이터 웰에 코팅되고, 메틸화된 DNA는 항-5-메틸시토신 항체를 사용하여 검출된다 (문헌 [Vasser, et al., 2009]; [Epigentek, 2009]). 상기 방법의 단점은 이들이 DNA로부터 모든 뉴클레오솜 및 염색질 구조의 변성 및 제거를 수반하는 DNA의 추출을 필요로 한다는 것이다. 따라서, 이들은 뉴클레오솜 결합 뉴클레오티드를 측정할 수 없고, 예를 들어 DNA 추출 단계 없이 생물학적 유체, 예컨대 조직 용해액, 혈액, 혈장 또는 혈청 내의 전체적인 DNA 메틸화의 직접적인 측정에 부적합하다.
또한, DNA 내의 시토신 염기의 5-히드록시메틸 변형이 보고되었다. 5-히드록시메틸화의 역할은 아직까지 이해되지 않았지만, 유전자 조절에 관여하는 것으로 보인다 (문헌 [Stroud et al., 2011]).
현재의 전체적인 DNA 메틸화 검출 방법은 DNA의 추출 또는 정제를 수반하고, 신속한 고속 처리, 저비용의 최소-침습성 진단 방법에 적합하지 않다. 유사하게, 다른 변형된 또는 이상 염기 (예를 들어 우라실, 이노신, 크산틴, 히포크산틴)에 대한 DNA의 분석은 실질적으로 순수한 또는 추출된 DNA의 분석에 의해서만 조사될 수 있다. 상기 분석은 복잡한 생물학적 매질, 예컨대 조직 용해액, 혈액, 혈장 또는 혈청에서 직접 수행될 수 없다.
5-메틸시토신 또는 임의의 다른 특정 뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드를 함유하는 세포 유리 뉴클레오솜은 혈액 또는 임의의 다른 매질에서 측정되지 않았다. 혈액 내의 특정 뉴클레오티드를 함유하는 세포 유리 뉴클레오솜의 존재 또는 부재에 대한 연구는 보고되지 않았다. 특정 뉴클레오티드를 함유하는 세포 유리 뉴클레오솜에 대한 검정은 제시되거나 고려되지 않았다. 세포 유리 뉴클레오솜 연관 뉴클레오티드의 검출 또는 측정 방법은 현재 존재하지 않는다.
본 발명자들은 본 발명에 이르러, 예를 들어 추출을 수행하지 않으면서 생물학적 샘플에서 5-메틸시토신 및 5-히드록시메틸시토신을 포함하는 뉴클레오솜 연관 뉴클레오티드의 직접적인 평가를 위한 간단한 면역검정 방법을 보고한다. 놀랍게도, 본 발명자들은 현재 기술의 ELISA 방법에 의해 검출되지 않는 뉴클레오솜 연관 뉴클레오티드가 혈액 샘플에서 검출될 수 있음을 밝혀내었다.
발명의 개요
본 발명의 제1 측면에 따르면, 암, 심근병증, 전신 홍반성 루푸스, 결장염, 만성 폐쇄성 폐 장애, 크론병 및 류마티스 관절염의 진단용 바이오마커로서 사용하기 위한, DNA 염기, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 포함하는 세포 유리 뉴클레오솜이 제공된다.
본 발명의 제2 측면에 따르면,
(i) 샘플을 DNA 염기, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드에 결합하는 결합제와 접촉시키는 단계;
(ii) 샘플에서 DNA 염기, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드에 대한 상기 결합제의 결합을 검출하거나 정량하는 단계; 및
(iii) 샘플 내 DNA 염기, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 함유하는 뉴클레오솜의 존재의 척도로서 상기 결합의 존재 또는 정도를 사용하는 단계
를 포함하는, 샘플에서 DNA 염기, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 함유하는 뉴클레오솜의 존재를 검출하는 방법이 제공된다.
본 발명의 제3 측면에 따르면,
(i) 샘플을 뉴클레오솜에 결합하는 제1 결합제와 접촉시키는 단계;
(ii) 뉴클레오솜 또는 샘플을 DNA 염기, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드에 결합하는 제2 결합제와 접촉시키는 단계;
(iii) 샘플에서 DNA 염기, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드에 대한 상기 제2 결합제의 결합을 검출하거나 정량하는 단계; 및
(iv) 샘플 내 DNA 염기, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 함유하는 뉴클레오솜의 존재의 척도로서 상기 결합의 존재 또는 정도를 사용하는 단계
를 포함하는, 샘플에서 DNA 염기, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 함유하는 뉴클레오솜의 존재를 검출하는 방법이 제공된다.
본 발명의 제4 측면에 따르면,
(i) 샘플을 DNA 염기, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드에 결합하는 제1 결합제와 접촉시키는 단계;
(ii) 뉴클레오솜 또는 샘플을 뉴클레오솜에 결합하는 제2 결합제와 접촉시키는 단계;
(iii) 샘플에서 뉴클레오솜에 대한 상기 제2 결합제의 결합을 검출하거나 정량하는 단계; 및
(iv) 샘플 내 DNA 염기, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 함유하는 뉴클레오솜의 존재의 척도로서 상기 결합의 존재 또는 정도를 사용하는 단계
를 포함하는, 샘플에서 DNA 염기, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 함유하는 뉴클레오솜의 존재를 검출하는 방법이 제공된다.
본 발명의 추가의 측면에 따르면,
(i) 염색질을 세포로부터 단리하는 단계;
(ii) 염색질을 소화시키거나, 초음파처리하거나, 또는 다른 방식으로 파괴하여 모노-뉴클레오솜 및/또는 올리고-뉴클레오솜을 형성하는 단계; 및
(iii) 본 발명의 방법에 따라 상기 뉴클레오솜 내의 DNA 염기, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 존재를 검출하거나 측정하는 단계
를 포함하는, 세포에서 DNA 염기, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 함유하는 뉴클레오솜의 존재를 검출하는 방법이 제공된다.
본 발명의 추가의 측면에 따르면,
(i) 대상체의 체액에서 DNA 염기, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 함유하는 뉴클레오솜을 검출하거나 측정하는 단계; 및
(ii) 검출된 뉴클레오솜 연관 DNA 염기, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 수준을, 대상체의 질환 상태를 확인하기 위해 사용하는 단계
를 포함하는, 동물 또는 인간 대상체에서 질환 상태를 검출하거나 진단하는 방법이 제공된다.
본 발명의 추가의 측면에 따르면,
(i) 대상체의 체액에서 DNA 염기, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 함유하는 뉴클레오솜을 검출하거나 측정하는 단계; 및
(ii) 검출된 뉴클레오솜 연관 DNA 염기, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 수준을, 대상체에 대한 적합한 치료의 선택을 위한 파라미터로서 사용하는 단계
를 포함하는, 의학적 치료 적합성에 대해 동물 또는 인간 대상체를 평가하는 방법이 제공된다.
본 발명의 추가의 측면에 따르면,
(i) 대상체의 체액에서 DNA 염기, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 함유하는 뉴클레오솜을 검출하거나 측정하는 단계;
(ii) 대상체의 체액에서 DNA 염기, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 함유하는 뉴클레오솜의 검출 또는 측정을 1회 이상 반복하는 단계; 및
(iii) 검출된 뉴클레오솜 연관 DNA 염기, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 수준의 임의의 변화를, 대상체 상태의 임의의 변화에 대한 파라미터로서 사용하는 단계
를 포함하는, 동물 또는 인간 대상체의 치료를 모니터링하는 방법이 제공된다.
본 발명의 추가의 측면에 따르면,
(i) 대상체의 체액에서 DNA 염기, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 함유하는 뉴클레오솜을 검출하거나 측정하는 단계;
(ii) 건강한 대상체 또는 대조군 대상체의 체액에서 DNA 염기, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 함유하는 뉴클레오솜을 검출하거나 측정하는 단계; 및
(iii) DNA 염기, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드가 질환 상태에 대한 바이오마커로서 유용한지 확인하기 위해 질환에 걸린 대상체에서 검출된 수준과 대조군 대상체에서 검출된 수준 사이의 차이를 사용하는 단계
를 포함하는, 동물 또는 인간 대상체에서 질환 상태를 검출 또는 진단하기 위한 DNA 염기, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 바이오마커를 확인하는 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 측면에 따르면, 본 발명의 상기 방법에 의해 확인된 바이오마커를 제공한다.
본 발명의 추가의 측면에 따르면, 뉴클레오솜 연관 DNA 염기, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 또는 그의 성분 부분, 또는 뉴클레오솜 연관 DNA 염기, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 또는 그의 성분 부분의 구조/형상 모방체에 특이적인 리간드 또는 결합제를 키트 사용 설명서와 함께 포함하는, 뉴클레오솜 연관 DNA 염기, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 검출을 위한 키트를 제공한다.
도 1. 송아지 혈청 내로 희석된, MCF7 세포로부터 추출된 가교결합 소화 염색질 내의 세포 유리 뉴클레오솜 내의 5-메틸시토신 메틸화된 DNA의 검출을 위한 ELISA 용량 반응 곡선.
도 2. 송아지 혈청 내로 희석된, A375 세포로부터 추출된 가교결합 소화 염색질 내의 세포 유리 뉴클레오솜 내의 5-히드록시메틸시토신 메틸화된 DNA의 검출을 위한 ELISA 용량 반응 곡선.
도 3. 현재 기술의 뉴클레오솜 ELISA 방법을 사용하여 20명의 건강한 자원자로부터 채취한 혈청 및 EDTA 혈장 샘플에 대해 검출된 뉴클레오솜 수준.
도 4. 20명의 건강한 자원자로부터 채취한 혈청 및 EDTA 혈장 샘플에 대해 검출된, 세포 유리 뉴클레오솜 연관 히스톤 변이체 mH2A1.1의 수준.
도 5. 20명의 건강한 자원자로부터 채취한 혈청 및 EDTA 혈장 샘플에 대해 검출된, 세포 유리 뉴클레오솜 연관 히스톤 변이체 mH2A2의 수준.
도 6. 20명의 건강한 자원자로부터 채취한 혈청 및 EDTA 혈장 샘플에 대해 검출된, 세포 유리 뉴클레오솜 연관 히스톤 변이체 H2AZ의 수준.
도 7. 20명의 건강한 자원자로부터 채취한 혈청 및 EDTA 혈장 샘플에 대해 검출된, 세포 유리 뉴클레오솜 연관 히스톤 변형 P-H2AX(Ser139)의 수준.
도 8. 본 발명의 ELISA를 사용하여 20명의 건강한 자원자로부터 채취한 혈청 및 EDTA 혈장 샘플에 대해 검출된, 세포 유리 뉴클레오솜 연관 5-메틸시토신 메틸화된 DNA의 수준.
도 9. 본 발명의 ELISA를 사용하여 20명의 건강한 자원자로부터 채취한 혈청 샘플에 대해 검출된, 세포 유리 뉴클레오솜 연관 5-히드록시메틸시토신 메틸화된 DNA의 수준.
도 10. 3명의 결장암 대상체로부터 채취한 EDTA 혈장 샘플에 대해 검출된, 세포 유리 뉴클레오솜 연관 뉴클레오티드 및 히스톤 유형의 수준.
도 11. 13명의 폐암 대상체로부터 채취한 EDTA 혈장 샘플에 대해 검출된, 세포 유리 뉴클레오솜 연관 뉴클레오티드 및 히스톤 유형의 수준.
도 12. 2명의 췌장암 대상체로부터 채취한 EDTA 혈장 샘플에 대해 검출된, 세포 유리 뉴클레오솜 연관 뉴클레오티드 및 히스톤 유형의 수준.
도 13. 1명의 구강암 대상체로부터 채취한 EDTA 혈장 샘플에 대해 검출된, 세포 유리 뉴클레오솜 연관 뉴클레오티드 및 히스톤 유형의 수준.
도 14. 본 발명의 ELISA 방법을 사용하여 뉴클레오솜 연관 5-메틸시토신 메틸화된 DNA 수준의 비율로서 정규화된, 4개의 상이한 암 질환으로부터 채취한 EDTA 혈장 샘플에 대해 검출된, 세포 유리 뉴클레오솜 연관 뉴클레오티드 및 히스톤 유형의 수준. 문헌 *[Holdenrieder et al., 2001]의 방법에 의해 생성된, 건강한 자원자로부터의 뉴클레오솜을 함유하는 샘플에 대해 정규화된 수준이 비교를 위해 제시된다 (mH2A2 및 5-히드록시메틸시토신은 본 샘플에 대해 측정되지 않았다).
도 15. 본 발명의 ELISA 방법을 사용하여 건강한 자원자로부터 채취한 EDTA 혈장, 시트레이트 혈장 및 헤파린 혈장 샘플에서 검출된, 세포 유리 뉴클레오솜 연관 5-메틸시토신 (5mc), mH2A1.1, H2AZ 및 P-H2AX(Ser139)의 수준.
도 16. 본 발명의 ELISA 방법을 사용하여 3명의 건강한 자원자 및 10명의 결장암 대상체로부터 채취한 혈청 샘플에 대해 검출된 세포 유리 뉴클레오솜 연관 5-메틸시토신 수준.
도 17. 13명의 건강한 자원자 및 55명의 암 환자로부터 채취한 EDTA 혈장 샘플에 대해 검출된 세포 유리 뉴클레오솜 연관 5-메틸시토신 수준. 건강한 샘플의 평균값 + 평균의 1 또는 2 표준 편차로서 규정된 컷-오프 (cut-off) 점이 제시된다.
도 18. 10명의 건강한 자원자 및 61명의 암 환자로부터 채취한 EDTA 혈장 샘플에 대해 검출된 세포 유리 뉴클레오솜 연관 5-메틸시토신 수준. 건강한 샘플의 평균값 + 평균의 2 표준 편차로서 규정된 컷-오프 점이 제시된다.
도 19. 증가하는 종양 크기, 질환의 병기 및 림프절 발생과 함께, 폐 및 결장암 환자로부터 채취한 EDTA 혈장 샘플에 대해 검출된 세포 유리 뉴클레오솜 연관 5-메틸시토신 수준.
도 20. 뉴클레오솜 연관 5-메틸시토신 (5mc) 메틸화된 DNA 수준의 비율로서 정규화되고 11명의 건강한 대상체에서 발견된 평균 비율과 비교하여 표현된, 10명의 상이한 암 질환으로부터 채취한 EDTA 혈장 샘플에 대해 본 발명의 ELISA 방법을 사용하여 검출된, 세포 유리 뉴클레오솜 연관 뉴클레오티드 및 히스톤 유형의 평균 수준.
도 21. 뉴클레오솜 연관 5-메틸시토신 (5mc) 메틸화된 DNA 수준의 비율로서 정규화되고 11명의 건강한 대상체에서 발견된 평균 비율과 비교하여 표현된, 2명의 심근병증 환자, 10명의 전신 홍반성 루푸스 (루푸스) 환자, 12명의 궤양성 결장염 환자, 10명의 만성 폐쇄성 폐 장애 (COPD) 환자, 8명의 크론병 환자 및 10명의 류마티스 관절염 (RA) 환자로부터 채취한 EDTA 혈장 샘플에 대해 본 발명의 ELISA 방법을 사용하여 검출된, 세포 유리 뉴클레오솜 연관 뉴클레오티드 및 히스톤 유형의 평균 수준.
발명의 상세한 설명
본 발명의 제1 측면에 따르면, 암, 심근병증, 전신 홍반성 루푸스, 결장염, 만성 폐쇄성 폐 장애, 크론병 및 류마티스 관절염의 진단용 바이오마커로서 사용하기 위한, DNA 염기, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 포함하는 세포 유리 뉴클레오솜을 제공한다.
한 실시양태에서, 뉴클레오솜은 모노뉴클레오솜 또는 올리고뉴클레오솜이다.
언급될 수 있는 본 발명의 한 측정 측면에 따르면, 암의 진단용 바이오마커로서의 DNA 염기, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 용도가 제공된다. 한 실시양태에서, 암은 방광, 유방, 결장, 자궁경부, 식도, 신장, 대장, 폐, 구강, 난소, 췌장, 전립선, 직장, 피부 또는 위의 암이다. 언급될 수 있는 한 특정 실시양태에서, 암은 결장, 폐, 구강 또는 췌장의 암이다.
본 발명자들은 DNA 염기 5-메틸시토신 및 5-히드록시메틸시토신을 함유하는 뉴클레오솜의 검출 및 측정을 위한 ELISA 시험을 개발하였다. 본 발명자들은 상기 검정을 위해 포획 항체로서 항-히스톤 항체를 적절한 특이적 항-뉴클레오티드 항체와 조합하여 사용하였다. 본 발명자들은 특이적인 뉴클레오티드를 함유하는 뉴클레오솜이 암이 있는 대상체로부터 채취한 혈액 샘플에서 측정될 수 있고 비침습성 또는 최소 침습성 바이오마커로서 사용하기 위해 특이적임을 보여주기 위해 검정을 사용하였다. 질환에 걸린 대상체로부터 채취한 혈청 및 혈장 샘플에서 검출된, 다른 뉴클레오솜 에피토프의 수준에 비해 뉴클레오솜 연관 DNA 5-메틸시토신 수준은, 건강한 대상체로부터 채취한 샘플에서 검출된 것과 상이하였다. 또한, 상이한 질환이 있는 대상체로부터 채취한 샘플에서의 뉴클레오솜에서 검출된 뉴클레오티드 수준의 패턴은 특히 뉴클레오솜 연관 뉴클레오티드 패턴이, 상이한 히스톤 변이체 및 히스톤 변형을 함유하는 뉴클레오솜에 대해 결정된 패턴과 조합하여 조사될 때 질환의 차별적인 진단이 가능하도록 상이한 것으로 밝혀졌다. 상이한 또는 추가의 뉴클레오티드를 함유하는 뉴클레오솜에 대한 시험을 포함하면, 상기 패턴을 사용하여 차별적인 진단의 식별이 개선될 가능성이 있음이 당업자에게 자명할 것이다.
현재 기술의 방법을 사용하여 건강한 대상체에서 발견되는 뉴클레오솜의 수준을 조사하기 위해서, 본 발명자들은 20명의 건강한 대상체로부터 채취한 혈청 및 혈장 샘플에서 뉴클레오솜을 측정하였다. 현재 기술의 두 방법은 혈장 샘플에서보다 건강한 대상체로부터 채취한 혈청 샘플에서 보다 높은 신호를 생성하였다. 결과를 도 3에 제시한다. 이것은 뉴클레오솜 수준이 혈장보다 혈청에서 더 높다고 발표된 데이터와 일치한다 (문헌 *[Holdenrieder et al., 2001]).
본 발명의 방법을 사용하여 건강한 대상체에서 발견된 뉴클레오솜의 수준을 조사하기 위해서, 본 발명자들은 20명의 건강한 대상체의 혈청 및 건강한 소 혈청에서 변형된 뉴클레오티드 5-메틸시토신을 함유하는 뉴클레오솜을 측정하였다. 혈청 결과는 20명의 모든 건강한 대상체에서 낮거나 비검출가능하였다. 또한, 본 발명자들은 20명의 건강한 대상체로부터 채취한 EDTA 혈장 샘플에서 변형된 뉴클레오티드 5-메틸시토신을 함유하는 뉴클레오솜을 측정하였고, 놀랍게도, 더 높은 신호가 관찰되었다. 변형된 뉴클레오티드 5-메틸시토신을 함유하는 세포 유리 뉴클레오솜의 높은 수준이 건강한 인간 EDTA 혈장에서 본 발명의 방법에 의해 검출되었지만, 도 8에 제시된 바와 같이 건강한 인간 혈청에서는 보다 낮은 수준이 검출되었다. 도 4-9는 유사한 결과가 다른 뉴클레오솜 구조에 대해 얻어졌음을 보여준다. 상기 발견은 예상치 못한 것이고, 공개된 결과 (문헌 *[Holdenrieder et al., 2001]) 및 본 발명자들이 현재 기술의 뉴클레오솜 ELISA 방법에 대해 관찰된 결과 둘 모두와 상이하다. 따라서, 놀랍게도 본 발명의 방법은 혈청 및 EDTA 혈장 샘플에서 발생하는 뉴클레오솜의 상대적인 수준에 대해 현재 기술의 방법과 상반되는 결과를 생성한다.
본 발명자들은 뉴클레오솜 구조가 수집될 수 있는 모든 다양한 통상적인 종류의 혈장에서 검출가능한지 조사하였다. 본 발명자들은 세포 유리 뉴클레오솜 연관 5-메틸시토신의 높은 수준이 건강한 대상체로부터 채취한 EDTA 혈장에서 및 보다 약한 정도로 시트레이트 혈장에서 본 발명의 방법에 의해 검출가능하지만, 뉴클레오솜 연관 5-메틸시토신은 건강한 대상체로부터 채취한 대부분 (5개 중 3개)의 헤파린 혈장 샘플에서 완충제 또는 말 혈청 배경 신호에 비해 낮거나 비검출가능함을 밝혀내었다. 그 결과를 도 15에 제시한다. 요약하면, 세포 유리 뉴클레오솜은 본 발명의 방법을 사용하여 건강한 대상체로부터 채취한 대부분의 또는 모든 EDTA 혈장 및 시트레이트 혈장 샘플에서 비교적 고농도로 발견되지만, 건강한 대상체로부터 채취한 대부분의 헤파린 혈장 또는 혈청 샘플에는 낮거나 존재하지 않는다. 따라서, 정확한 샘플 종류의 선택이 상이한 용도에 대단히 중요할 것임이 분명하다.
본 발명자들은 특정 뉴클레오티드 구조를 함유하는 세포 유리 뉴클레오솜의 검출을 위한 샘플 선택이 몇몇의 파라미터를 포함함을 밝혀내었다. 이들은 일반적으로 건강한 대상체로부터 채취한 혈청 및 헤파린 혈장 샘플에 존재하는 세포 유리 뉴클레오솜의 낮은 수준, 일반적으로 건강한 대상체로부터 채취한 EDTA 및 시트레이트 혈장 샘플에 존재하는 보다 높은 수준, 세포 유리 뉴클레오솜을 함유하는 혈청 샘플은 혈병으로부터 혈청의 분리 후에 EDTA의 첨가에 의해 안정화되어야 한다는 권장사항 (문헌 *[Holdenreider et al., 2001]), 및 혈청 샘플 채취 프로토콜을 포함한다. 다른 안정화제 (예를 들어 프로테아제 억제제)도 사용될 수 있다. 가능한 경우, 본 발명자들은 정맥천자 1시간 내에 원심분리된 후, 10 mM EDTA를 첨가하고, 샘플을 동결시킨 혈청 샘플을 사용하였다.
임상 샘플을 위한 혈액 샘플 종류의 선택은 특정 시험에 대한 최적 임상 식별력을 기초로 하여 수행되어야 한다. 본 발명자들이 건강한 대상체의 혈청에서 본 발명의 방법에 의해 일관되게 낮은 뉴클레오솜 수준을 발견한 후에, 본 발명자들은 암이 있는 대상체로부터 채취한 혈청 샘플에서 뉴클레오티드 5-메틸시토신을 함유하는 뉴클레오솜을 측정하였다. 도 16에 제시된 바와 같이 100%까지의 임상 민감도가 결장암 샘플에 대해 관찰되었다.
본 발명자들은 또한 다양한 질환이 있는 대상체로부터 채취한 EDTA 혈장 샘플에서 뉴클레오티드 5-메틸시토신 및 5-히드록시메틸시토신을 함유하는 세포 유리 뉴클레오솜 및 다른 뉴클레오솜 구조의 상대적인 수준을 측정하였다. 세포 유리 뉴클레오솜의 수준은 건강한 대상체 및 질환에 걸린 대상체 둘 모두로부터 채취한 EDTA 혈장 샘플에서 높고, 따라서 EDTA 혈장 샘플은 질환에 걸린 및 건강한 대상체의 민감한 식별인자 (sensitive discriminator)를 위한 최상의 샘플 선택일 것으로 보이지 않는다. 그러나, 본 발명자들은 상이한 뉴클레오티드를 함유하는 뉴클레오솜 (및 다른 뉴클레오솜 구조)의 상대적인 수준의 측면에서 순환 세포 유리 뉴클레오솜의 수준 및 조성이 질환에 걸린 개체 및 건강한 개체 사이에 및 또한 상이한 질환들 사이에서 상이함을 밝혀내었다. 따라서, 본 발명자들은 (i) 높은 수준의 순환 뉴클레오솜이 건강한 및 질환에 걸린 대상체 둘 모두로부터 채취한 모든 또는 대부분의 EDTA 혈장 샘플에 존재하지만, 이것은 모든 혈액 샘플 종류에 적용되는 것은 아니고; (ii) 그럼에도 불구하고, 놀랍게도, 질환의 검출 및 질환 종류의 식별은 질환에 걸린 및 건강한 대상체의 혈장에 존재하는 뉴클레오솜 구조의 하나 이상의 상대적인 종류의 수준 및 구조적 프로파일을 기초로 하여 상기 EDTA 혈장 뉴클레오솜의 분석에 의해 이루어질 수 있음을 최초로 보고한다.
본 발명자들은 건강한 대상체 및 각각 55명 및 62명의 암 대상체로 이루어진 2개의 실험을 통해 117명의 다양한 암 종류가 존재하는 대상체로부터 채취한 EDTA 혈장 샘플에서 세포 유리 뉴클레오솜을 측정하였다. 총 78% (117개 중 91개)의 암 샘플에서, 건강한 대상체에 대한 평균 결과 + 평균의 2 표준 편차의 컷-오프 수준을 사용하여 뉴클레오솜 연관 5-메틸시토신에 대한 본 발명의 방법을 사용하여 암에 대해 양성으로 정확하게 확인되었다.
상기 2개의 실험 중 제1 실험에서, 본 발명자들은 13명의 건강한 대상체 및 위, 대장, 직장, 폐 (소세포 암종 및 다양한 비-소세포 암종), 유방, 난소, 췌장, 전립선, 신장의 암 및 다양한 구강암 (구강, 구개, 인두 및 후두)이 있는 55명의 대상체로부터 채취한 EDTA 혈장에서 세포 유리 뉴클레오솜을 측정하였다. 건강한 대상체로 채취한 13개의 모든 샘플 및 암 환자의 샘플은 뉴클레오솜에 대해 양성이었다. 그러나, 암 대상체로부터 채취한 샘플에서 검출된 뉴클레오솜의 수준은 건강한 대상체로부터 채취한 샘플에서 발견된 것보다 더 높았고, 이 결과는 건강한 및 암 대상체가 식별될 수 있음을 보여주었다. 예를 들어, 뉴클레오솜 연관 5-메틸시토신에 대해 평균 ± 평균의 2 표준 편차로서 OD 측면에서 계산된 정상 범위는 0-1.41이었다. 상기 컷-오프 값을 사용하여, 13개의 모든 건강한 샘플은 음성이었고, 위 38% (3/8), 대장 60% (3/5), 직장 33% (1/3), 소세포 폐 33% (2/6), 비-소세포 폐 64% (9/14), 유방 33% (2/6), 난소 100% (1/1), 췌장 100% (1/1), 전립선 33% (2/6), 신장 100% (1/1) 및 구강암 샘플 60% (3/5)를 포함하여, 55개의 암 샘플 중 30개는 양성이었다 (총 임상 민감도 55%). 그 결과를 도 17에 제시한다.
유사하게, 뉴클레오솜 연관 H2AZ 검정에 대한 정상 범위는 0 - 0.95이었다. 상기 0.95의 컷-오프 수준을 사용하여, 13명의 모든 건강한 대상체는 상승한 뉴클레오솜 H2AZ 수준에 대해 음성이었다. 이와 대조적으로, 상승한 뉴클레오솜 H2AZ 수준에 대한 양성 결과는 위 100% (8/8), 대장 100% (5/5), 직장 67% (2/3), 소세포 폐 83% (5/6), 비-소세포 폐 79% (11/14), 유방 50% (3/6), 난소 100% (1/1), 췌장 100% (1/1), 전립선 80% (4/5), 신장 100% (1/1) 및 구강암 샘플 100% (5/5)를 포함하여, 암 샘플의 84% (46/55)에서 발견되었다 (총 임상 민감도 84%).
본 발명의 한 실시양태에서, 대조군 샘플이 제공되고, 양성 또는 음성 결과 사이를 구별하기 위한 검정의 컷-오프 수준은 대조 샘플의 결과와 비교하여 규정된다. 이것은 대조 샘플 결과의 수준과 동일하거나 초과하거나 미만인 임의의 비율일 수 있다. 상기 수준 미만의 환자 결과는 음성으로 간주되고, 상기 수준 초과의 환자 결과는 양성으로 간주된다. 또한, 컷-오프 수준에 매우 근접한 "회색 영역" 범위의 환자 결과가 존재할 수 있고, 이에 대한 결정은 결정할 수 없는 것으로 간주되고/되거나 시험을 반복하여야 한다.
유사하게, 뉴클레오솜 연관 mH2A1.1 검정에 대해 정상 범위는 0 - 0.91이었다. 상기 컷-오프 값을 사용하여, 13개의 모든 건강한 샘플은 음성이었고, 64% (35/55)의 암 샘플은 양성이었다. 뉴클레오솜 연관 P-H2AX(Ser139) 검정에 대해 정상 범위는 0 - 1.08이었다. 상기 컷-오프 값을 사용하여, 13개의 모든 건강한 샘플은 음성이었고, 60% (33/55)의 암 샘플은 양성이었다. 따라서, 일부 뉴클레오솜 검정은 다른 것보다 더 우수한 임상 민감도를 보인다.
또한, 본 발명의 임상 유용성을 개선하기 위해 뉴클레오솜 구조의 패턴을 사용할 수 있다. 이것은 예를 들어 뉴클레오솜 연관 5-메틸시토신 검정의 컷-오프 점을 평균 + 1 표준 편차로 저하시켜 1.01까지의 범위를 생성함으로써 수행할 수 있다. 이 경우에, 위 음성의 수는 4로 감소되어 임상 민감도를 93% (51/55)로 개선하였지만, 건강한 대상체로부터 채취한 샘플에 대한 위 양성 결과가 0%에서 23% (3/13)로 증가하였다. 결과를 도 17에 제시한다.
5-메틸시토신 연관 뉴클레오솜, 또는 임의의 뉴클레오솜에 대해 양성으로 밝혀진 샘플은 뉴클레오솜 구조 프로파일을 위해 조사될 수 있다. 뉴클레오솜 프로파일은 도 20 및 21에 예시된 바와 같이 건강한 및 질환에 걸린 환자 사이를 구별하기 위해 사용될 수 있고, 여기서 질환에 걸린 환자에서 다양한 뉴클레오솜 구조의 상대적인 비율은 건강한 환자 및 다른 비-암 질환이 있는 환자에서 발견되는 것과 비교하여 표현된다. 이것은 시험 패널 내의 다중 뉴클레오솜 구조의 조사가 보다 우수한 임상 식별을 용이하게 할 수 있음을 보여준다.
유사하게, 본 발명의 진단 특이성 및/또는 민감도는 비율 형태의 1회 초과의 시험으로부터의 데이터를 조합함으로써 증가될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오솜 연관 P-H2AX:5-메틸시토신 비율의 사용은 건강한 대상체로부터 채취한 샘플에 대해 100% (13/13)의 음성 결과를 유지하면서 진 양성 암 환자의 검출을 뉴클레오솜 연관 5-메틸시토신 단독에 대한 55% (30/55)로부터 2 표준 편차 컷-오프 수준에서 67% (37/55)로 증가시킨다.
본 발명자들은 3명의 결장암 환자, 13명의 폐암 환자, 2명의 췌장암 환자 및 1명의 구강암 환자로부터 채취한 EDTA 혈장 샘플에서 2개의 상이한 뉴클레오티드를 함유하는 순환 세포 유리 뉴클레오솜의 수준을 측정하고, 이를 20명의 건강한 대상체로부터의 혈액 샘플에 존재하는 수준 및 문헌 *[Holdenreider et al., 2001]에 기재된 바와 같이 제조된 건강한 대상체로부터의 혈청 뉴클레오솜의 인공적으로 생산된 제제와 비교하였다. 본 발명자들은 또한 하나의 특정 뉴클레오티드를 함유하는 뉴클레오솜의 수준의 비율로서 정규화된 형태로 관찰된 수준을 표현하고, 상기 비율 또는 비율의 패턴이 일반적인 암의 진단 및 특정 암 종류의 차별적인 진단에 유용함을 밝혀냈다. 또한, 본 발명자들은 뉴클레오솜 연관 5-메틸시토신의 수준이 질환이 진행하면서 상이한지 조사하였다. 본 발명자들은 5-메틸시토신을 함유하는 세포 유리 뉴클레오솜의 평균 수준이 질환의 중증도와 함께 증가하고 질환의 림프절로의 확산 증가와 함께 증가함을 관찰하였다. 이것은 검출된 뉴클레오솜이 종양과 연관된다는 증거를 제공한다.
또한, 본 발명자들은 현재 기술의 2개의 뉴클레오솜 ELISA 방법을 사용하여 상기 19개의 암 샘플에 존재하는 뉴클레오솜을 측정하였다. 연구된 19명의 암 대상체 중에서, 대부분은 현재 기술의 뉴클레오솜 ELISA 1 및 2에 의해 결정시에 낮은 EDTA 혈장 뉴클레오솜 수준을 갖는 것으로 밝혀졌다. 이 결과는 현재 기술의 검정이 통상적인 임상 목적을 위해 사용되지 않는 하나의 이유를 제시한다.
본 발명자들은 동일한 19개의 샘플에서 5-메틸시토신 및 5-히드록시메틸시토신 뉴클레오티드를 함유하는 뉴클레오솜을 측정하기 위해 본 발명의 ELISA 방법을 사용하였다. 놀랍게도, 높은 수준의 5-메틸시토신을 함유하는 뉴클레오솜이 19개의 모든 샘플에서 검출가능하였다. 따라서, 한 실시양태에서 본 발명은 현재 기술의 뉴클레오솜 검정에 의해 검출되지 않는 뉴클레오솜을 검출할 수 있는 신규한 뉴클레오솜 ELISA 방법을 제공한다.
본 발명자들은 또한 문헌 *[Holdenrieder et al., 2001]에 기재된 방법에 의해 암 대상체로부터 채취한 동일한 19개의 샘플 및 건강한 대상체로부터 생성된 뉴클레오솜의 샘플에서 3개의 상이한 히스톤 변이체 및 히스톤 PTM을 함유하는 뉴클레오솜의 수준을 측정하였다. 본 발명자들은 4개의 상이한 종류의 암이 있는 대상체 및 건강한 대상체로부터 채취한 생물학적 유체에 존재하는 일군의 다양한 세포 유리 뉴클레오솜으로서 본원에서 설명되는 뉴클레오솜 연관 뉴클레오티드 측정과 함께 상기 측정을 사용하였다. 놀랍게도, 조사된 4 종류의 암 (폐, 결장, 췌장 및 구강)에서 발견된 뉴클레오솜의 패턴은 건강한 대상체로부터 생성된 뉴클레오솜 샘플에서 발견된 것과 모두 구별가능하였다. 또한, 상이한 암 종류는 대상체의 혈액에서 검출가능한 세포 유리 뉴클레오솜의 패턴을 기초로 하여 서로 구별가능하였다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, 대상체의 건강 또는 질환 상태의 표시자로서 상이한 DNA 염기 또는 하나 이상의 DNA 염기 및 하나 이상의 히스톤 변이체 및/또는 하나 이상의 히스톤 변형의 조합을 함유하는 뉴클레오솜의 2회 이상의 측정 및/또는 뉴클레오솜 자체, 또는 이들의 임의의 조합 또는 이들의 임의의 비율의 측정으로 이루어지는 일군의 상이한 뉴클레오솜 에피토프에 대한 샘플의 시험에 의해 질환의 존재, 종류, 재발 또는 중증도를 검출 또는 진단하거나 또는 최적 약물 또는 다른 선택 치료법을 평가하는 방법이 제공된다.
본 발명자들은 다양한 암 및 비-암 질환에서 순환 세포 유리 뉴클레오솜의 뉴클레오티드 및 히스톤 구조의 변이성을 검출하기 위해 본 발명의 ELISA 방법을 유사하게 사용하고, 이를 건강한 대상체에서 발견된 뉴클레오솜의 구조와 비교하였다. 뉴클레오솜은 조사된 모든 암 및 비-암 질환에 존재하는 것으로 밝혀졌고, 건강한 대상체의 것과 상이한 프로파일을 갖는 것으로 밝혀졌다.
본 발명자들은 2명의 심근병증 환자, 10명의 전신 홍반성 루푸스 (루푸스) 환자, 12명의 궤양성 결장염 환자, 10명의 만성 폐쇄성 폐 장애 (COPD) 환자, 8명의 크론병 환자 및 10명의 류마티스 관절염 (RA) 환자로부터 채취한 EDTA 혈장 샘플을 연구하고, 검출된 다양한 뉴클레오솜 구조의 수준을 평균 뉴클레오솜 연관 5-메틸시토신 수준의 비율로서 정규화하고, 그 결과를 11명의 건강한 대상체에서 발견된 것과 비교하여 표현하였다. 본 발명자들은 질환들이 건강한 또는 암 대상체의 것과 상이한 뉴클레오솜 구조 프로파일과 연관됨을 밝혀냈다. 따라서, 뉴클레오솜 구조 프로파일은 매우 다양한 비-암 질환에서 검출, 예후 예측, 모니터링 및 치료 효능 예측을 위한 진단 도구로서 사용될 수 있다. 그 결과를 도 21에 제시한다.
또한, 본 발명자들은 10개의 상이한 암 질환으로부터 채취한 EDTA 혈장 샘플을 사용하여 55명의 환자에 대해 본 발명의 ELISA 방법을 사용하여 검출된 뉴클레오티드 및 히스톤 유형의 측면에서 세포 유리 뉴클레오솜의 구조의 변이성을 연구하였다. 검출된 다양한 뉴클레오솜 구조의 수준을 뉴클레오솜 연관 5-메틸시토신 (5mc) 메틸화된 DNA 수준의 비율로서 정규화하고, 11명의 건강한 대상체에서 발견된 평균 비율과 비교하여 표현하였다. 본 발명자들은 모든 대상체에 존재하는 뉴클레오솜 및 뉴클레오솜 구조 프로파일이 암 질환, 비-암 질환 및 건강한 대상체 사이에서 상이함을 밝혀냈다. 따라서 뉴클레오솜 구조 프로파일은 암 및 다른 질환에서 검출, 예후 예측, 모니터링 및 치료 효능 예측을 위한 진단 도구로서 사용될 수 있다. 결과를 도 20 및 21에 제시한다.
혈청 또는 혈장 내의 대부분의 순환 DNA는 모노-뉴클레오솜 및 올리고-뉴클레오솜으로서 존재한다고 보고되었기 때문에 (문헌 [Holdenrieder et al., 2001]), 본 발명의 방법이 혈액, 혈청 및 혈장을 포함하는 생물학적 유체에서 직접 세포 유리 메틸화된 DNA 자체 (예를 들어 5-메틸시토신 또는 5-히드록시메틸시토신을 함유하는 뉴클레오솜 연관 DNA)를 검출하거나 측정하기 위해서도 사용될 수 있음은 당업자에게 분명할 것이다. 따라서, 사용되는 본 발명의 방법은 특히 DNA의 추출이 수반되거나 필요하지 않기 때문에, 현재 기술의 메틸화된 DNA 측정 방법에 비해 간단함 및 속도의 이점을 갖는다.
본 발명의 방법은 뉴클레오솜 내의 임의의 핵산 또는 DNA 염기 또는 핵산 유사체 또는 유도체를 검출하거나 측정하기 위해 사용될 수 있음이 보다 분명해질 것이다. 그러한 염기는 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 우라실, 이노신, 크산틴, 히포크산틴, 7,8-디히드로-8-옥소-구아닌 및 이들의 임의의 유도체 또는 유사체를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 통상적인 뉴클레오티드 (비제한적인 예를 들어 구아닌, 시토신, 티민 또는 아데닌)는 모든 또는 대부분의 뉴클레오솜에서 발생할 것이고, 통상적인 뉴클레오티드에 대한 항체를 사용하는 본 발명의 방법은 샘플 내의 실질적으로 모든 뉴클레오솜에 결합하고 이를 검출하는 방법을 제공할 것임은 당업자에게 자명할 것이다. 따라서 한 실시양태에서, 본 발명은 통상적인 뉴클레오티드를 함유하는 뉴클레오솜이 모든 또는 대부분의 뉴클레오솜이 검출됨을 보장하는 수단으로서 측정되는, 뉴클레오솜 자체의 검출을 위한 신규한 방법을 제공한다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 통상적인 뉴클레오티드를 함유하는 뉴클레오솜이 모든 또는 대부분의 뉴클레오솜 결합 DNA가 검출됨을 보장하는 수단으로서 측정되는, 모든 뉴클레오솜 연관 DNA의 검출을 위한 신규한 방법을 제공한다. 또한, 2종 이상의 DNA 염기의 측정은 이들 DNA 염기의 상대적인 DNA 함량의 비율 측정을 위한 기초를 제공할 것이다. 본 발명자들은 도 10-14에 샘플 내의 5-메틸시토신 및 5-히드록시메틸시토신의 상대적인 수준에 대한 상기 비율을 제시한다. 본 발명자들의 데이터는 검출가능한 5-메틸시토신 및 5-히드록시메틸시토신의 상대적인 수준이 상이한 종류의 암에서 상이하고 상기 암을 구별하기 위해 사용될 수 있음을 보여준다. 다른 유사한 비율도 당업계에서 유용할 것이다. 예를 들어, 총 뉴클레오솜 결합 DNA에 대한 측정 기준으로서 적절한 DNA 염기 (또는 염기들)를 측정하기 위해 본 발명을 사용하고 또 다른 염기 (예를 들어, 5-메틸시토신)의 상대적인 수준을 측정함으로써, 본 발명의 방법이 임의의 특정 염기를 포함하는 DNA의 비율 (예를 들어 샘플 내의 메틸화된 DNA의 비율)을 검출하기 위해 사용될 수 있음이 분명해질 것이다. 따라서, 본 발명의 방법은 샘플 내의 임의의 염기의 DNA 함량 비율의 측정을 위한 간단하고 신속한 방법을 제공한다. 이 방법은 다중 샘플, 예를 들어 혈액 샘플에서 신속하고 간단하게 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 예를 들어 세포로부터 추출된 염색질의 소화에 의해 얻어진 샘플을 비롯하여 상기 뉴클레오솜이 발생하는 임의의 샘플에서 뉴클레오솜 내의 DNA 염기를 검출하고 측정하기 위해 사용될 수 있다. 본원에서 용어 뉴클레오티드는 연관된 당이 존재하거나 존재하지 않고 인산화가 존재하거나 존재하지 않는 퓨린, 피리미딘 또는 이들의 임의의 유사체, 유도체 또는 모방체를 비롯한 임의의 다른 핵산 염기 및 유사한 분자를 포함하고 이로 제한되지 않음을 의도함이 당업자에게 자명할 것이다.
본 발명자들은 본 발명의 방법이 특정 뉴클레오티드를 함유하는 뉴클레오솜 연관 DNA의 검출 및 측정을 위한 성공적인 방법이고, 상기 방법이 또한 뉴클레오솜 자체의 검출을 위한 방법으로서 성공적으로 사용될 수 있으며, 현재 기술의 방법보다 뉴클레오솜 자체의 검출을 위한 더 우수한 방법이고, 상기 방법이 또한 세포 유리 DNA 자체 및 세포 유리 DNA 자체의 뉴클레오티드 조성의 직접 검출을 위한 방법으로서 성공적으로 사용될 수 있고, 현재 기술의 방법보다 뉴클레오솜 연관 DNA 및 그의 뉴클레오티드 조성의 검출을 위한 더 우수한 방법이라고 결론지었다. 이 방법은 신속하고, 비용이 적게 들고, 복잡한 생물학적 매질 및 유체에 사용하기 적합하다. 본 발명자들은 본 발명의 방법이 혈액 내의 뉴클레오솜 및 메틸화된 DNA를 함유하는 뉴클레오솜을 검출하기 위해 사용될 수 있고, 암에 대한 바이오마커로서 사용될 수 있음을 입증하였다. 암 환자로부터 채취한 혈액 샘플에 존재하는 바이오마커가 순환 뉴클레오솜 증가와 연관된 암 및 다른 질환의 광범한 진단 및 질환 스크리닝 목적을 위한 값을 갖는다는 것은 당업자에게 자명할 것이다 (문헌 [Holdenrieder et al., 2001]).
뉴클레오솜의 수준 상승이 본 발명의 방법을 사용하여 건강한 대상체에서 발견되지 않는지 확인하기 위해, 본 발명자들은 20명의 건강한 대상체의 혈청 및 건강한 소 혈청에서 뉴클레오티드 5-메틸시토신 및 5-히드록시메틸시토신을 함유하는 뉴클레오솜을 측정하였다. 본 발명의 두 ELISA 시험에 대한 혈청 순환 뉴클레오솜 결과는 20명의 모든 건강한 대상체에 대해 낮거나 비검출가능하였다. 또한, 본 발명자들은 동일한 20명의 건강한 대상체로부터 채취한 혈장 샘플에서 유사한 시험을 수행하였고, 놀랍게도 더 높은 신호가 관찰되었다. 이러한 발견은 예기치 않은 것이고, 본 발명자들이 현재 기술의 뉴클레오솜 ELISA 방법에서 발견한 결과와 매우 상이하였다.
본 발명은 많은 암 및 비-암 질환에 대해 시험되었고, 시험된 모든 질환의 검출에 효과적임이 밝혀졌다. 이것은 현재 기술의 뉴클레오솜 ELISA 시험에 의해 검출가능하지 않은 전립선암 환자의 검출을 포함한다 (문헌 [Holdenrieder, 2001]). 본 발명은 모든 또는 대부분의 암의 검출에 효과적임이 분명하다. 본 발명의 임상 수행능은 추가의 뉴클레오솜 구조 시험을 포함하고 존재하는 상이한 뉴클레오솜 구조의 비율을 조사함으로써 보다 개선될 수 있음이 당업자에게 자명할 것이다.
본 발명의 한 측면에 따르면, 샘플에서 뉴클레오티드를 함유하는 세포 유리 뉴클레오솜의 검출 및 측정을 위한 이중 항체, 면역계측 (immunometric) 또는 샌드위치 (sandwich) 면역검정 방법을 제공한다. 상기 측면의 한 실시양태는
(i) 뉴클레오솜을 함유할 수 있는 샘플을 뉴클레오솜에 결합하는 제1 항체 또는 다른 결합제와 접촉시키는 단계;
(ii) 뉴클레오솜 또는 샘플을 뉴클레오티드에 결합하는 제2 항체 또는 다른 결합제와 접촉시키는 단계;
(iii) 샘플에서 뉴클레오티드에 대한 상기 제2 항체 또는 다른 결합제의 결합을 검출 및/또는 정량하는 단계; 및
(iv) 샘플 내 뉴클레오솜 연관 뉴클레오티드 존재의 척도로서 상기 결합의 존재 또는 정도를 사용하는 단계
를 포함하는 면역검정이다.
제2 실시양태에 따르면,
(i) 뉴클레오솜을 함유할 수 있는 샘플을 뉴클레오티드에 결합하는 제1 항체 또는 다른 결합제와 접촉시키는 단계;
(ii) 뉴클레오솜 또는 샘플을 뉴클레오솜에 결합하는 제2 항체 또는 다른 결합제와 접촉시키는 단계;
(iii) 샘플에서 뉴클레오솜에 대한 상기 제2 항체 또는 다른 결합제의 결합을 검출 및/또는 정량하는 단계; 및
(iv) 샘플 내 뉴클레오솜 연관 뉴클레오티드 존재의 척도로서 상기 결합의 존재 또는 정도를 사용하는 단계
를 포함하는 면역계측 면역검정에 의해 샘플에서 뉴클레오티드를 함유하는 세포 유리 뉴클레오솜을 검출 및 측정하는 방법을 제공한다.
다양한 항체 또는 다른 결합제가 본 발명에서 뉴클레오솜에 결합하는 결합제로서 사용될 수 있다. 이들은 무손상 뉴클레오솜에서 발생하지만 유리 히스톤에서 발생하지 않는 에피토프 (예를 들어, 뉴클레오솜 내의 2개의 히스톤 사이의 연결부에서 발견되는 에피토프)에 결합하기 위해 작용하는 결합제, 및 통상적인 뉴클레오솜 단백질, 히스톤 또는 핵산 에피토프를 포함하는 임의의 뉴클레오솜 성분에 대해 작용하는 결합제를 포함한다.
설명되는 본 발명의 방법이 바이오센서 타입 검정 및 예를 들어 포르테바이오 인코포레이티드 (ForteBio Incorporated, 미국)에 의해 시판되는 종류의 무표지 (label-free) 검정을 포함하는 다양한 실시양태를 포함함은 당업자에게 자명할 것이다. 면역계측 면역검정은 분석물에 결합하는 항체 (또는 다른 결합제)를 사용한다. 따라서, 결합된 분석물은 원래의 시험 샘플 내의 그의 수준 또는 농도의 직접적인 척도로서 검출된다. 이와 대조적으로, "경쟁적" 면역검정은 종종 일정 비율의 분석물에 결합하기 위해 훨씬 더 적은 양의 항체 (또는 다른 결합제)를 사용하고, 표지된 분석물 (또는 분석물 유사체) 제제가 결합된 분석물 분획과 유리 분석물 분획 (샘플 분석물을 갖는) 사이에 분배되기 위해 사용된다. 결합된 표지된 분석물의 양은 원래의 샘플 내의 분석물 농도의 간접적인 척도로서 측정된다. "경쟁적" 면역검정 설계의 변형에서, 표지된 항체가 고체상 분석물 (또는 분석물 유사체) 제제와 함께 사용된다. 표지된 항체의 결합은 샘플 분석물과 고체상 분석물 (또는 분석물 유사체) 사이에 분배된다. 고체상 분석물 (또는 분석물 유사체) 제제에 결합된 항체의 양은 샘플의 분석물 농도의 간접적인 척도로서 사용된다.
본 발명의 제3 실시양태에 따르면,
(i) 샘플을 뉴클레오티드에 결합하는 항체 또는 다른 결합제와 접촉시키는 단계;
(ii) 샘플에서 뉴클레오티드에 대한 상기 항체 또는 다른 결합제의 결합을 검출 및/또는 정량하는 단계; 및
(iii) 샘플 내 뉴클레오티드 존재의 척도로서 상기 결합의 존재 또는 정도를 사용하는 단계
를 포함하는 무표지 면역계측 면역검정에 의해 샘플에서 뉴클레오솜 연관 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드를 검출 및 측정하는 방법이 제공된다.
본 발명의 제4 실시양태에 따르면,
(i) 샘플을 뉴클레오티드에 결합하는 항체 또는 다른 결합제와 접촉시키는 단계;
(ii) 샘플에서 뉴클레오티드에 대한 상기 항체 또는 다른 결합제의 결합을 검출 및/또는 정량하는 단계; 및
(iii) 샘플 내 뉴클레오티드 존재의 척도로서 상기 결합의 존재 또는 정도를 사용하는 단계
를 포함하는 경쟁적 면역검정에 의해 샘플에서 뉴클레오솜 연관 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드를 검출 및 측정하는 방법이 제공된다.
본 발명의 이들 면역검정 방법이 어떠한 DNA 추출도 필요로 하지 않으면서 뉴클레오티드 및 뉴클레오솜 연관 뉴클레오티드를 직접 측정함은 당업자에게 자명할 것이다. 이와 대조적으로, 현재 기술의 뉴클레오티드 면역검정 방법은 샘플로부터 DNA의 추출 후에 (비-뉴클레오솜 연관) 뉴클레오티드를 검출한다. 본 발명의 방법은 혈액 또는 그의 유도체를 포함하는 복잡한 생물학적 샘플에서 직접적인 측정을 위한 속도, 간단함 및 적합성의 이점을 갖는다.
본 발명의 제5 실시양태에 따르면,
(i) 샘플에서 세포 유리 DNA의 수준을 검출하거나 측정하는 단계;
(ii) 본 발명의 방법에 따라 뉴클레오솜 연관 뉴클레오티드의 수준을 검출하거나 측정하는 단계; 및
(iii) 뉴클레오티드를 포함하는 DNA의 비율을 결정하기 위해 두 측정을 사용하는 단계
를 포함하는, 샘플에서 특정 뉴클레오티드를 포함하는 세포 유리 DNA의 비율을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 측면의 한 실시양태에 따르면, 샘플 내의 세포 유리 DNA 수준 및 관심 있는 뉴클레오티드 둘 모두가 본 발명의 방법을 사용하여 측정된다. 또 다른 실시양태에서, 관심 있는 뉴클레오티드는 메틸화된 시토신 뉴클레오티드이고, 뉴클레오티드를 포함하는 DNA의 비율은 전체적인 DNA 메틸화의 척도를 제공한다.
본 발명자들은 대상체로부터 채취한 혈액에서 뉴클레오티드를 함유하는 뉴클레오솜의 검출 및 측정이 암이 있는 대상체를 확인하기 위한 및 이들을 건강한 대상체로부터 구별하기 위한 진단 방법으로서 사용될 수 있음을 밝혀냈다. 또한, 본 발명자들은 일군의 상이한 뉴클레오티드, 히스톤 변이체 및 히스톤 PTM를 함유하는 뉴클레오솜의 패턴이 상이한 암들을 구별하기 위해 사용될 수 있음을 밝혀냈다. 이것은 대상체에서 암을 검출하는 암 혈액 시험을 제공하고 암 양성 대상체에서 암 종류를 구별하기 위해 사용될 수 있음이 당업자에게 자명할 것이다. 본 발명의 추가의 측면에 따르면, 체액에서 뉴클레오티드를 함유하는 세포 유리 뉴클레오솜의 존재 및/또는 수준 또는 농도를 측정하거나 검출하고, 검출된 수준을 질환의 임상 진단, 질환 종류 또는 아형 (subtype)의 차별적인 진단, 또는 질환 예후, 또는 질환 재발, 또는 치료 요법에 대한 대상체 감수성의 진단을 포함하고 이로 제한되지 않는 대상체의 질환 상태의 바이오마커로서 사용함으로써 질환의 존재를 검출하거나 진단하는 방법을 제공한다. 진단 시험을 위해 사용되는 체액이 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 뇌척수액 및 다른 유체를 포함하고 이로 제한되지 않음은 당업자에 의해 이해될 것이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플로서 선택된 체액은 혈액, 혈청 또는 혈장이다. 체액 내의 뉴클레오솜 연관 뉴클레오티드의 검정 반응, 수준, 농도 또는 양은 절대적인 측면으로서 또는 상대적인 측면으로서, 비제한적인 예를 들어 존재하는 총 뉴클레오솜 수준의 비율로서 또는 또 다른 뉴클레오티드 또는 히스톤 변이체 또는 히스톤 PTM을 함유하는 뉴클레오솜의 수준에 대한 또는 총 DNA의 수준에 대한 비율로서 표현할 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 뉴클레오솜 연관 뉴클레오티드 측정은 질환의 임상 진단, 질환 종류 또는 아형의 차별적인 진단, 또는 질환 예후, 또는 질환 재발, 또는 치료 요법에 대한 대상체 감수성의 진단을 포함하고 이로 제한되지 않는 대상체의 질환 상태를 검출 또는 진단하기 위한 시험 또는 측정의 진단 패널 중의 한 멤버로서 사용된다.
모든 또는 대부분의 순환 세포 유리 DNA는 뉴클레오솜 연관 DNA로 존재하는 것으로 보고되기 때문에, 질환 상태의 진단 또는 검출이 뉴클레오솜 연관 뉴클레오티드에 대한 면역검정보다는 또는 이에 추가로, 생물학적 유체에서 DNA 추출 단계를 수행하지 않으면서 본 발명의 직접적인 뉴클레오티드 면역검정을 사용한 뉴클레오티드 자체의 검출 또는 측정에 의해 달성될 수 있음은 당업자에게 자명할 것이다. 본 발명의 추가의 측면에 따르면, 체액에서 뉴클레오티드의 존재 및/또는 수준 또는 농도를 측정하거나 검출하고, 검출된 수준을 질환의 임상 진단, 질환 종류 또는 아형의 차별적인 진단, 또는 질환 예후, 또는 질환 재발, 또는 치료 요법에 대한 대상체 감수성의 진단을 포함하고 이로 제한되지 않는 대상체의 질환 상태의 바이오마커 (단독으로 또는 일군의 시험의 멤버로서)로서 사용함으로써 질환의 존재를 검출하거나 진단하기 위한 비-추출 뉴클레오티드 면역검정 방법이 제공된다. 진단 시험을 위해 사용되는 체액이 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 뇌척수액 및 다른 유체를 포함하고 이로 제한되지 않음은 당업자에 의해 이해될 것이다. 바람직한 실시양태에서, 샘플로서 선택된 체액은 혈액, 혈청 또는 혈장이다. 체액 내의 뉴클레오티드의 검정 반응, 수준, 농도 또는 양은 절대적인 측면으로서 또는 상대적인 측면으로서, 비제한적인 예를 들어 존재하는 총 뉴클레오솜 수준의 비율로서 또는 또 다른 뉴클레오티드 또는 히스톤 변이체 또는 히스톤 PTM의 수준에 대한 또는 총 DNA의 수준에 대한 비율로서 표현할 수 있다.
본 발명의 추가의 측면에 따르면,
(i) 염색질을 세포로부터 단리하는 단계;
(ii) 염색질을 파괴하여 모노-뉴클레오솜 및/또는 올리고-뉴클레오솜을 형성하는 단계; 및
(iii) 본 발명의 면역검정 방법에 의해 모노-뉴클레오솜 및/또는 올리고-뉴클레오솜 내의 뉴클레오티드의 존재를 검출하거나 측정하는 단계
를 포함하는, 세포에서 뉴클레오티드를 함유하는 뉴클레오솜의 존재 및/또는 수준을 검출하거나 측정하는 방법이 제공된다.
염색질로부터 모노-뉴클레오솜 및/또는 올리고-뉴클레오솜을 생산하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 효소 소화 및 초음파처리를 포함한다 (문헌 [Dai et al., 2011]). 한 실시양태에서, 방법에 의한 검출을 위해 선택된 뉴클레오티드는 모든 또는 대부분의 무손상 뉴클레오솜에서 발생하는 통상적으로 발생하는 뉴클레오티드이고, 이에 의해 뉴클레오솜 자체의 검출 또는 측정 방법이 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 방법에 의한 검출을 위해 선택된 뉴클레오티드는 모든 또는 대부분의 무손상 뉴클레오솜에서 발생하는 통상적으로 발생하는 뉴클레오티드이고, 이에 의해 뉴클레오솜 결합 DNA의 검출 또는 측정 방법이 제공된다.
세포 또는 조직에서 뉴클레오솜 연관 뉴클레오티드를 검출하는 상기 설명된 방법이, IHC, 또는 제한 소화 및 최근접 이웃 분석, 클로르아세트알데하이드를 이용한 형광 검정, 비메틸화된 CpG의 양을 계산하기 위해 삼중수소-표지된 S-아데노실 메티오닌과 함께 DNA 메틸트랜스퍼라제를 사용한 모든 CpG 부위의 메틸화에 의한 역 결정 및 고성능 액체 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피, 또는 액체 크로마토그래피, 이어서 질량 분광법에 의한 분석을 위한 단일 뉴클레오티드로의 DNA의 소화를 비롯하여 세포로부터 추출된 DNA 내의 뉴클레오티드 검출을 비롯하여 현재 사용되는 방법에 비해 이점을 갖는다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 특정 뉴클레오솜 연관 뉴클레오티드의 수준, 농도 또는 양은 절대적인 측면으로서 또는 상대적인 측면으로서, 예를 들어 존재하는 총 뉴클레오솜의 비율로서 또는 뉴클레오솜의 총 수준에 대한 또는 또 다른 뉴클레오티드 또는 히스톤 변이체 또는 히스톤 PTM을 함유하는 뉴클레오솜의 수준에 대한 또는 총 DNA의 수준에 대한 비율로서 표현할 수 있다.
본 발명의 임의의 측면에 대한 용어 항체, 결합제 또는 리간드는 제한적인 의미가 아니라, 특정 분자 또는 엔티티 (entity)에 결합할 수 있는 임의의 결합제를 포함하는 것이 의도되고, 임의의 적합한 결합제가 본 발명의 방법에 사용될 수 있음이 당업자에게 자명할 것이다. 또한, 용어 뉴클레오솜은 유체 매질에서 분석될 수 있는 모노뉴클레오솜 및 올리고뉴클레오솜 및 임의의 상기 염색질 단편을 포함하는 것이 의도됨이 분명할 것이다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 뉴클레오티드 또는 그의 성분 부분, 또는 뉴클레오솜 또는 그의 성분 부분의 구조/형상 모방체에 특이적인 리간드 또는 결합제를, 본원에 규정된 임의의 방법에 따라 키트를 사용하기 위한 설명서와 함께 포함하는, 뉴클레오솜의 검출 또는 측정을 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 추가의 측면에 따르면, 뉴클레오티드 또는 그의 성분 부분, 또는 뉴클레오티드 또는 그의 성분 부분의 구조/형상 모방체에 특이적인 리간드 또는 결합제를, 본원에 규정된 임의의 방법에 따라 키트를 사용하기 위한 설명서와 함께 포함하는, 뉴클레오티드를 함유하는 뉴클레오솜의 검출 또는 측정을 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면,
(i) 질환에 걸린 대상체의 체액에서 뉴클레오티드를 함유하는 세포 유리 뉴클레오솜의 수준을 검출하거나 측정하는 단계;
(ii) 대조군 대상체의 체액에서 뉴클레오티드를 함유하는 세포 유리 뉴클레오솜의 수준을 검출하거나 측정하는 단계; 및
(iii) 뉴클레오티드가 그 질환에 대한 바이오마커로서 유용한지 확인하기 위해 질환에 걸린 대상체에서 검출된 수준과 대조군 대상체에서 검출된 수준 사이의 차이를 사용하는 단계
를 포함하는, 동물 또는 인간에서 질환 상태를 검출 또는 진단하기 위한 뉴클레오솜 연관 뉴클레오티드 바이오마커 또는 뉴클레오티드 바이오마커를 확인하는 방법이 제공된다.
대조군 대상체는 다양한 기준을 기초로 하여 선택될 수 있고, 예를 들어 질환이 없는 것으로 알려진 대상체를 포함하거나 또는 상이한 질환이 있는 대상체 (예를 들어, 차별적인 진단 조사를 위해)일 수 있음이 당업자에게 자명할 것이다.
본 발명의 추가의 측면에 따르면,
(i) 질환에 걸린 대상체의 체액에서 뉴클레오티드를 함유하는 세포 유리 뉴클레오솜의 수준을 검출하거나 측정하는 단계; 및
(ii) 질환에 걸린 대상체의 체액에서 검출된 뉴클레오티드를 함유하는 세포 유리 뉴클레오솜의 수준을, 대상체의 질환 결과와 상관시키는 단계
를 포함하는, 질환에 걸린 동물 또는 인간 대상체의 예후를 평가하기 위한 뉴클레오솜 연관 뉴클레오티드 바이오마커 또는 뉴클레오티드 바이오마커를 확인하는 방법이 제공된다.
본 발명의 추가의 측면에 따르면,
(i) 질환에 걸린 대상체의 체액에서 뉴클레오티드를 함유하는 세포 유리 뉴클레오솜을 검출하거나 측정하는 단계; 및
(ii) 질환에 걸린 대상체의 체액에서 검출된 뉴클레오티드를 함유하는 세포 유리 뉴클레오솜의 수준을, 대상체에서 관찰된 치료 요법의 효능과 상관시키는 단계
를 포함하는, 치료를 필요로 하는 질환에 걸린 동물 또는 인간 대상체에 대한 치료 요법을 선택하기 위해 사용되는 뉴클레오티드 바이오마커를 확인하는 방법이 제공된다.
본 발명의 추가의 측면에 따르면,
(i) 질환에 걸린 대상체의 체액에서 뉴클레오티드를 함유하는 세포 유리 뉴클레오솜의 수준을 검출하거나 측정하는 단계;
(ii) 대상체의 질환 진행 동안 상기 검출 또는 측정을 1회 이상 반복하는 단계; 및
(iii) 질환에 걸린 대상체의 체액에서 검출된 뉴클레오티드를 함유하는 세포 유리 뉴클레오솜의 수준을, 대상체에서의 질환 진행과 상관시키는 단계
를 포함하는, 질환에 걸린 동물 또는 인간 대상체의 치료를 모니터링하기 위해 사용되는 뉴클레오솜 연관 뉴클레오티드 바이오마커 또는 뉴클레오티드 바이오마커를 확인하는 방법이 제공된다.
본 발명의 추가의 측면에 따르면, 본원에 규정된 방법에 의해 확인된 바이오마커를 제공한다.
다른 모이어티 (moiety)를 함유하는 복합체의 일부로서 포함되는 모이어티의 존재를 면역검정 방법에 의해 검출할 수 있음이 당업계에 공지되어 있다. 뉴클레오티드를 함유하는 세포 유리 뉴클레오솜이 유체 내의 뉴클레오티드 자체의 직접 면역검정을 수반하는 절차에 의해 혈액, 혈장, 혈청 및 소변을 포함하는 생물학적 유체에서 검출될 수 있음은 당업자에게 자명할 것이다. 상기 절차에서, 뉴클레오티드 상에 존재하는 에피토프에 대해 작용하는 항체를 이용하는 단일 항체 면역검정, 또는 뉴클레오티드 상에 존재하는 2개의 에피토프에 대해 작용하는 2개의 항체를 이용하는 2-부위 면역검정이 뉴클레오솜 내의 뉴클레오티드의 존재를 검출하기 위해 사용된다. 따라서, 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 뉴클레오솜 내에 함유된 뉴클레오티드는 뉴클레오티드에 대한 면역검정 방법의 사용에 의해 혈액, 혈장, 혈청 및 소변을 포함하는 생물학적 유체에서 직접 검출된다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, 뉴클레오솜 연관 뉴클레오티드는 뉴클레오티드에 대한 면역검정을 이용하여 혈액, 혈장, 혈청 및 소변을 포함하는 생물학적 유체에서 사전 추출 없이 직접 검출된다.
본 발명의 추가의 측면은 바이오마커에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드 또는 결합제, 예컨대 천연 생성 또는 화학적으로 합성된 화합물을 제공한다. 본 발명에 따른 리간드 또는 결합제는 바이오마커에 특이적으로 결합할 수 있는 펩티드, 항체 또는 그의 단편, 또는 합성 리간드, 예컨대 플라스틱 (plastic) 항체, 또는 앱타머 (aptamer) 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 항체는 바이오마커에 특이적으로 결합할 수 있는 모노클로날 항체 또는 그의 단편일 수 있다. 본 발명에 따른 리간드는 검출가능한 마커, 예컨대 발광, 형광, 효소 또는 방사성 마커로 표지될 수 있고; 별법으로 또는 추가로 본 발명에 따른 리간드는 친화도 태그, 예를 들어 비오틴, 아비딘, 스트렙타비딘 또는 His (예를 들어 6-His) 태그로 표지될 수 있다. 별법으로, 리간드 결합은 무표지 기술, 예를 들어 포르테바이오 인크.의 기술을 사용하여 결정할 수 있다.
본 발명에 따른 바이오센서는 바이오마커에 대한 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 바이오마커 또는 그의 구조/형상 모방체를 포함할 수 있다. 본원에서 설명되는 리간드 또는 모방체를 포함하는 어레이 (array)를 또한 제공한다.
또한, 바이오마커를 검출 및/또는 정량하기 위한, 천연 생성되거나 화학적으로 합성될 수 있고 적합하게는 펩티드, 항체 또는 그의 단편, 앱타머 또는 올리고뉴클레오티드인 본원에서 설명되는 하나 이상의 리간드의 용도, 또는 본 발명의 바이오센서, 또는 본 발명의 어레이, 또는 본 발명의 키트의 용도를 본 발명에 따라 제공한다. 이들 용도에서, 검출 및/또는 정량은 본원에 규정된 바와 같은 생물학적 샘플 상에서 수행할 수 있다.
본 발명의 방법을 수행하기 위한 진단 또는 모니터링 키트를 제공한다. 상기 키트는 적합하게는 본원에서 설명되는 바이오마커의 검출 및/또는 정량을 위한 본 발명에 따른 리간드, 및/또는 바이오센서, 및/또는 어레이를, 임의로 키트 사용 설명서와 함께 포함할 것이다.
본 발명의 추가의 측면은 본원에서 규정된 하나 이상의 바이오마커의 검출 및/또는 정량이 가능한 바이오센서를 포함하는, 질환 상태의 존재를 검출하기 위한 키트이다.
질환의 존재를 검출하기 위한 바이오마커는 장애의 진행을 지연시키거나 정지시키는 신규한 표적 및 약물 분자의 발견을 위한 필수적인 표적이다. 바이오마커의 수준은 장애 및 약물 반응을 표시하므로, 바이오마커는 시험관내 및/또는 생체내 검정에서 신규한 치료 화합물의 확인에 유용하다. 본 발명의 바이오마커는 바이오마커의 활성을 조정하는 화합물의 스크리닝 방법에 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 추가의 측면에서, 바이오마커 생성의 촉진 및/또는 억제가 가능한 물질을 확인하기 위한, 본 발명에 따른 펩티드, 항체 또는 그의 단편 또는 앱타머 또는 올리고뉴클레오티드일 수 있는, 본원에서 설명되는 결합제 또는 리간드의 용도; 또는 본 발명에 따른 바이오센서, 또는 본 발명에 따른 어레이; 또는 본 발명에 따른 키트의 용도를 제공한다.
시험 물질을 대상체 동물에게 투여하고 대상체로부터의 시험 샘플에 존재하는 바이오마커의 수준을 검출 및/또는 정량하는 것을 포함하는, 대상체에서 바이오마커의 생성을 촉진하거나 억제할 수 있는 물질을 확인하는 방법을 또한 제공한다.
용어 "바이오마커"는 과정, 사건 또는 병태의 특유한 생물학적 또는 생물학적으로 유래된 표시자를 의미한다. 바이오마커는 진단 방법, 예를 들어 임상 스크리닝, 및 예후 평가 및 요법의 결과 모니터링, 특정 치료 처치에 가장 반응할 가능성이 있는 환자의 확인, 약물 스크리닝 및 개발에 사용될 수 있다. 바이오마커 및 그의 용도는 새로운 약물 치료제의 확인 및 약물 치료제에 대한 새로운 표적의 발견을 위해 유용하다.
본원에서 사용되는 용어 "검출" 및 "진단"은 질환 상태의 식별, 확인, 및/또는 특성 결정을 포함한다. 본 발명에 따른 검출, 모니터링 및 진단 방법은 질환의 존재 확인, 발병 및 진행의 평가에 의한 질환 발생의 모니터링, 또는 질환의 개선 또는 퇴행의 평가에 유용하다. 또한, 검출, 모니터링 및 진단 방법은 임상 스크리닝, 예후의 평가, 요법의 선택, 치료 이익의 평가, 즉, 약물 스크리닝 및 약물 개발을 위한 방법에 유용하다.
효율적인 진단 및 모니터링 방법은 정확한 진단을 확립하여 가장 적절한 치료의 신속한 확인 (따라서 유해한 약물 부작용에 대한 불필요한 노출 감소)이 가능하고 재발률을 감소시킴으로써 개선된 예후에 대한 잠재력을 갖는 매우 강력한 "환자 해결방안"을 제공한다.
한 실시양태에서, 상기 바이오마커는 종양 세포로부터 방출된다. 따라서, 본 발명의 추가의 측면에 따르면, (i) 종양 세포와 연관되거나 종양 세포로부터 방출된 생물학적 샘플에서 바이오마커를 측정하는 단계, 및 (ii) 상기 바이오마커의 수준이 종양의 크기, 병기, 침습성 또는 전파성과 연관됨을 입증하는 단계를 포함하는, 종양 성장의 검출 방법을 제공한다.
증가된 세포 교체율, 세포 사멸 및 아폽토시스가 세포 유리 뉴클레오솜의 순환 수준의 증가를 유발함이 알려져 있다 (문헌 [Holdenrieder et al., 2001]). 순환 세포 유리 뉴클레오솜 수준은 비-특이적 표시자이고, 염증성 질환, 매우 다양한 양성 및 악성 병태, 자가면역 질환을 포함하는 다양한 병태에서, 및 외상 또는 허혈 후에 발생한다 (문헌 [Holdenrieder et al., 2001]). 본 발명이 순환 뉴클레오솜이 대상체에서 발견되는 다양한 질환 영역에 유용성을 가질 것임은 당업자에게 자명할 것이다. 이들은 외상 (예를 들어, 중증 외상 또는 수술), 과도한 운동 (예를 들어 마라톤 달리기), 졸중 및 심장마비, 패혈증 또는 다른 심각한 염증 및 자궁내막증을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 본 발명자들은 심근병증, 전신 홍반성 루푸스, 궤양성 결장염, 만성 폐쇄성 폐 장애, 크론병 및 류마티스 관절염을 포함하는 다양한 상기 질환에서 뉴클레오솜 수준을 측정하고 그들의 뉴클레오티드 및 히스톤 구조 변이성을 조사하기 위해 본 발명의 면역검정 방법을 사용하였고, 이를 건강한 대상체의 결과와 비교하였다. 본 발명자들은 이들 모든 질환에서 뉴클레오솜을 검출하고 그들의 상대적인 구조 (히스톤 및 뉴클레오티드 조성물의 면에서)를 결정할 수 있다. 본 발명의 방법은 현재의 뉴클레오솜 ELISA 방법보다 더 넓은 범위의 뉴클레오솜을 검출할 수 있기 때문에, 본 발명의 방법은 넓은 범위의 암 및 비-암 질환 영역에서 유용성을 갖는다.
본 발명의 면역검정은 효소 검출 방법을 이용하는 면역계측 검정 (예를 들어 ELISA), 형광 표지된 면역계측 검정, 시간차 (time-resolved) 형광 표지된 면역계측 검정, 화학발광 면역계측 검정, 면역비탁 (immunoturbidimetric) 검정, 입자 표지된 면역계측 검정 및 면역방사계측 검정 및 방사성, 효소, 형광, 시간차 형광 및 입자 표지를 포함하는 다양한 표지 종류를 사용하여 표지된 항원 및 표지된 항체 경쟁적 면역검정 방법을 포함하는 경쟁적 면역검정 방법을 포함한다. 상기 모든 면역검정 방법은 당업계에 잘 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Salgame et al., 1997] 및 [van Nieuwenhuijze et al., 2003]을 참조한다.
한 실시양태에서, 상기 생물학적 샘플은 체액을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 방법에서 시험될 수 있는 생물학적 샘플은 뇌척수액 (CSF), 전혈, 혈액 혈청, 혈장, 월경혈, 자궁내막 유체, 소변, 타액, 또는 다른 체액 (대변, 눈물, 윤활액, 가래), 호흡, 예를 들어 응결된 호흡, 또는 이로부터의 추출물 또는 정제물, 또는 그의 희석물을 포함한다. 또한, 생물학적 샘플은 살아있는 대상체로부터, 또는 사후에 채취한 시료를 포함한다. 샘플은 제조되고, 예를 들어 적절한 경우 희석 또는 농축되고, 통상적인 방식으로 보관될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 여러 차례 반복된다. 상기 실시양태는 검출 결과를 일정 시간에 걸쳐 모니터링할 수 있다는 이점을 제공한다. 상기 방식은 질환 상태에 대한 치료 효능의 모니터링 또는 평가의 이점을 제공할 것이다. 본 발명의 그러한 모니터링 방법은 발병, 진행, 안정화, 개선, 재발 및/또는 진정을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 질환이 존재하는 것으로 의심되는 대상체로부터의 생물학적 샘플에 존재하는 바이오마커를 검출 및/또는 정량하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 질환 상태에 대한 요법의 효능을 모니터링하는 방법을 제공한다. 모니터링 방법에서, 시험 샘플은 2회 이상 채취될 수 있다. 방법은 시험 샘플 내에 존재하는 바이오마커(들)의 수준을 하나 이상의 대조군(들) 및/또는 동일한 시험 대상체로부터 보다 일찍, 예를 들어 요법의 개시 전에, 및/또는 요법의 더 이른 시기에 동일한 시험 대상체로부터 채취한 하나 이상의 선행 시험 샘플(들)과 비교하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 방법은 상이한 횟수로 채취한 시험 샘플 내의 바이오마커(들)의 성질 또는 양의 변화를 검출하는 것을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 추가의 측면에 따르면,
(i) 본원에서 규정된 바와 같은 바이오마커의 양을 정량하는 단계; 및
(ii) 시험 샘플 내의 상기 바이오마커의 양을 하나 이상의 대조군(들) 및/또는 동일한 시험 대상체로부터 더 이른 시기에 채취한 하나 이상의 선행 시험 샘플(들)에 존재하는 양과 비교하는 단계
를 포함하는, 인간 또는 동물 대상체에서 질환 상태에 대한 요법의 효능을 모니터링하는 방법을 제공한다.
동일한 시험 대상체로부터 더 일찍 채취된 선행 시험 샘플 내의 수준에 비해 시험 샘플 내의 바이오마커의 수준의 변화는 장애 또는 의심되는 장애에 대한 상기 요법의 유익한 효과, 예를 들어 안정화 또는 개선을 나타낼 수 있다. 또한, 치료가 종료된 후에, 본 발명의 방법은 질환의 재발을 모니터링하기 위해 주기적으로 반복될 수 있다.
요법의 효능을 모니터링하는 방법은 인간 대상체 및 비-인간 동물에서 (예를 들어, 동물 모델에서) 기존의 요법 및 새로운 요법의 치료 유효성을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 이들 모니터링 방법은 새로운 약물 물질 및 물질의 조합물의 스크리닝 내에 포함될 수 있다.
추가의 실시양태에서, 신속하게 작용하는 요법에 의한 보다 신속한 변화의 모니터링은 수시간 또는 수일의 보다 짧은 간격으로 수행될 수 있다.
본 발명의 추가의 측면에 따르면, 질환 상태의 존재를 검출하기 위해 바이오마커를 확인하는 방법을 제공한다. 본원에서 사용되는 용어 "확인하는"은 생물학적 샘플 내에 존재하는 바이오마커의 존재의 확인을 의미한다. 샘플 내에 존재하는 바이오마커의 양을 정량하는 것은 샘플 내에 존재하는 바이오마커의 농도를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 확인 및/또는 정량은 샘플에 대해 직접, 또는 그로부터의 추출물 또는 그의 희석물에 대해 간접적으로 수행할 수 있다.
본 발명의 별도의 측면에서, 바이오마커의 존재는 바이오마커에 반응하여 대상체의 신체에 의해 생성되고 따라서 질환 상태가 있는 대상체로부터의 생물학적 샘플 내에 존재하는, 바이오마커에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 그의 단편의 검출 및/또는 정량에 의해 평가된다.
확인 및/또는 정량은 환자로부터의 생물학적 샘플 또는 생물학적 샘플의 정제물 또는 추출물 또는 그의 희석물 내의 특이적 단백질의 존재 및/또는 양을 확인하기 적합한 임의의 방법에 의해 수행할 수 있다. 본 발명의 방법에서, 정량은 샘플 또는 샘플들에서 바이오마커의 농도를 측정함으로써 수행할 수 있다. 본 발명의 방법에서 시험될 수 있는 생물학적 샘플은 상기 규정된 바와 같은 샘플을 포함한다. 샘플은 제조되고, 예를 들어 적절한 경우 희석 또는 농축되고, 통상적인 방식으로 보관될 수 있다.
바이오마커의 확인 및/또는 정량은 바이오마커 또는 그의 단편, 예를 들어 C-말단에서의 말단절단, 또는 N-말단에서의 말단절단이 존재하는 단편의 검출에 의해 수행할 수 있다. 단편의 길이는 적합하게는 4개 초과의 아미노산, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 아미노산이다. 특히, 히스톤 테일의 펩티드와 동일하거나 이와 관련된 서열의 펩티드가 히스톤 단백질의 특히 유용한 단편임을 유의한다.
바이오마커는 예를 들어 SELDI 또는 MALDI-TOF에 의해 직접 검출될 수 있다. 별법으로, 바이오마커는 바이오마커에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드 또는 리간드들, 예컨대 항체 또는 그의 바이오마커-결합 단편, 또는 다른 펩티드, 또는 리간드, 예를 들어 앱타머, 또는 올리고뉴클레오티드와의 상호작용을 통해 직접 또는 간접적으로 검출될 수 있다. 리간드 또는 결합제는 검출가능한 표지, 예컨대 발광, 형광 또는 방사성 표지, 및/또는 친화도 태그를 가질 수 있다.
예를 들어, 검출 및/또는 정량은 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법(들)에 의해 수행할 수 있다: SELDI (-TOF), MALDI (-TOF), 1-D 겔-기반 분석, 2-D 겔-기반 분석, 질량 분광 (MS), 역상 (RP) LC, 크기 투과 (겔 여과), 이온 교환, 친화도, HPLC, UPLC 및 다른 LC 또는 LC MS-기반 기술. 적절한 LC MS 기술은 이카트 (ICAT)® (어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems, 미국 캘리포니아)), 또는 이트라크 (iTRAQ)® (어플라이드 바이오시스템즈, 미국 캘리포니아)를 포함한다. 액체 크로마토그래피 (예를 들어 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC) 또는 저압 액체 크로마토그래피 (LPLC)), 박층 크로마토그래피, NMR (핵 자기 공명) 분광법도 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 진단 또는 모니터링의 방법은 바이오마커의 존재 또는 수준을 검출하기 위해 SELDI TOF 또는 MALDI TOF에 의해 샘플을 분석하는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법은 또한 임상 스크리닝, 예후, 요법 결과의 모니터링, 특정 치료 처치에 가장 반응할 가능성이 있는 환자의 확인, 약물 스크리닝 및 개발, 및 약물 치료를 위한 새로운 표적의 확인에도 적합하다.
분석물 바이오마커의 확인 및/또는 정량은 바이오마커에 대한 특이적 결합이 가능한 항체, 또는 그의 단편을 수반하는 면역학적 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 적합한 면역학적 방법은 분석물 바이오마커의 검출이 분석물 바이오마커 상의 상이한 에피토프를 인식하는 2개의 항체를 사용하여 수행되는 샌드위치 면역검정, 예컨대 샌드위치 ELISA; 방사성 면역검정 (RIA), 직접, 간접적 또는 경쟁적 효소 연결 면역흡착 검정 (ELISA), 효소 면역검정 (EIA), 형광 면역검정 (FIA), 웨스턴 블롯팅, 면역침전 및 임의의 입자-기반 면역검정 (예를 들어, 금, 은 또는 라텍스 입자, 자기 입자, 또는 Q-도트 (dot) 사용)을 포함한다. 면역학적 방법은 예를 들어 마이크로타이터 플레이트 또는 스트립 (strip) 방식으로 수행할 수 있다.
한 실시양태에서, 하나 이상의 바이오마커는 생물학적 경로에서 바이오마커의 상류 또는 하류에서 발견되는 분자, 또는 분자의 측정가능한 단편에 의해 교체될 수 있다.
질환에 특이적인 바이오마커의 확인은 진단 절차 및 치료 요법의 통합에 매우 중요하다. 예측 바이오마커를 사용하여, 적절한 진단 도구, 예컨대 바이오센서가 개발될 수 있고; 따라서, 본 발명의 방법 및 용도에서, 확인 및 정량은 바이오센서, 마이크로분석 시스템, 마이크로공학 (microengineered) 시스템, 마이크로분리 시스템, 면역크로마토그래피 시스템 또는 다른 적합한 분석 장치를 사용하여 수행할 수 있다. 바이오센서는 바이오마커(들)의 검출을 위해 면역학적 방법, 전기, 열, 자기, 광학 (예를 들어 홀로그램) 또는 음향 (acoustic) 기술을 포함할 수 있다. 상기 바이오센서를 사용하여, 생물학적 샘플에서 발견되는 예상된 농도에서 표적 바이오마커(들)을 검출하는 것이 가능하다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "바이오센서"는 바이오마커의 존재를 검출할 수 있는 임의의 것을 의미한다. 바이오센서의 예를 본원에서 설명한다.
본 발명에 따른 바이오센서는 바이오마커에 특이적으로 결합할 수 있는, 본원에서 설명되는 리간드 결합제 또는 리간드를 포함할 수 있다. 상기 바이오센서는 본 발명의 바이오마커를 검출 및/또는 정량하는데 유용하다.
본 발명의 바이오마커(들)은 "스마트 (smart)" 홀로그램, 또는 고주파 음향 시스템을 기초로 한 기술을 포함하는 바이오센서를 사용하여 검출될 수 있고, 상기 시스템은 특히 "바 코드 (bar code)" 또는 어레이 입체형태에 잘 적용될 수 있다.
스마트 홀로그램 센서 (스마트 홀로그램스 리미티드 (Smart Holograms Ltd, 영국 캠브리지))에서, 홀로그램 영상은 바이오마커와 특이적으로 반응하도록 민감화된 중합체 박막에 저장된다. 노출시에, 바이오마커는 중합체와 반응하여, 홀로그램에 의해 제시되는 영상을 변경시킨다. 시험 결과 판독은 광학 휘도, 영상, 색상 및/또는 영상의 위치의 변화일 수 있다. 정성적 및 반-정량적 적용을 위해, 센서 홀로그램은 육안으로 판독될 수 있고, 따라서 검출 장비를 필요로 하지 않는다. 간단한 색상 센서는 정량적 측정이 필요할 때 신호를 판독하기 위해 사용될 수 있다. 샘플의 불투명도 또는 색상은 센서의 작동을 저해하지 않는다. 센서의 포맷은 몇몇 물질의 동시 검출을 위해 다중화 (multiplexing)를 허용한다. 가역적인 및 비가역적인 센서는 상이한 요건을 충족하도록 설계될 수 있고, 관심 있는 특정 바이오마커의 연속적인 모니터링이 실행될 수 있다.
적합하게는, 본 발명의 하나 이상의 바이오마커의 검출을 위한 바이오센서는 생체분자 인식을, 샘플 내의 바이오마커의 존재 검출 또는 정량을 신호로 전환하기 위한 적절한 수단과 조합한다. 바이오센서는 예를 들어 병실, 외래환자 진료, 수술, 가정, 야외 및 직장에서의 "대체 장소" 진단 시험을 위해 변경될 수 있다.
본 발명의 하나 이상의 바이오마커를 검출하기 위한 바이오센서는 음향, 플라즈몬 (plasmon) 공명, 홀로그램, 생물층 간섭계 (BLI) 및 마이크로공학 센서를 포함한다. 임프린트 인식 (Imprinted recognition) 요소, 박막 트랜지스터 기술, 자기 음향 공명기 장치 및 다른 신규한 음향-전기 (acousto-electrical) 시스템이 본 발명의 하나 이상의 바이오마커의 검출을 위해 바이오센서에 사용될 수 있다.
본 발명의 하나 이상의 바이오마커의 확인 및/또는 정량을 수반하는 방법은 벤치-탑 (bench-top) 기기에서 수행할 수 있거나, 비-실험실 환경, 예를 들어 의사의 사무실 또는 환자의 침대 옆에서 사용될 수 있는 일회용 진단 또는 모니터링 프랫폼에 포함될 수 있다. 본 발명의 방법을 수행하기 위한 적합한 바이오센서는 광학 또는 음향 판독기와 함께 "크레딧 (credit)" 카드를 포함한다. 바이오센서는 수집한 데이터를 해석을 위해 의사에게 컴퓨터로 전달될 수 있도록 구성될 수 있고, 따라서 전자 진료 (e-medicine)의 기반을 형성할 수 있다.
질환 상태의 존재의 진단 및 모니터링을 위한 진단 키트가 본원에서 설명된다. 한 실시양태에서, 키트는 바이오마커를 확인 및/또는 정량할 수 있는 바이오센서를 추가로 포함한다. 적합하게는, 본 발명에 따른 키트는 바이오마커 또는 바이오마커의 구조/형상 모방체에 특이적인 리간드 결합제, 또는 리간드들, 하나 이상의 대조군, 하나 이상의 시약 및 하나 이상의 소모품의 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분을, 임의로 본원에서 규정된 임의의 방법에 따라 키트를 사용하기 위한 설명서와 함께 포함할 수 있다.
질환 상태에 대한 바이오마커를 확인하면, 진단 절차 및 치료 요법을 통합할 수 있다. 본 발명의 바이오마커의 검출은 임상 시험에 참여하기 전에 대상체를 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. 바이오마커는 치료 반응, 반응 실패, 불리한 부작용 프로파일, 약물 이행도 및 적당한 혈청 약물 수준의 달성을 나타내기 위한 수단을 제공한다. 바이오마커는 유해 약물 반응의 경고를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 바이오마커는 반응의 평가가 투여량의 미세 조정, 처방 약물의 수 최소화, 효과적인 요법 달성의 지연 감소 및 유해 약물 반응의 방지를 위해 사용될 수 있기 때문에 맞춤형 요법의 개발에 유용하다. 따라서, 본 발명의 바이오마커를 모니터링함으로써, 환자 보호는 환자의 장애 및 약물유전체학 프로파일에 의해 결정된 필요 사항에 정확하게 일치하도록 조정될 수 있고, 따라서 바이오마커는 최적 용량을 적정하고, 양성 치료 반응을 예측하고, 심각한 부작용 위험이 높은 환자를 확인하기 위해 사용될 수 있다.
바이오마커-기반 시험은 '새로운' 환자의 제1선 평가를 제공하고, 현재의 수단을 사용하여 달성할 수 없는, 정확하고 신속한 진단을 위한 객관적인 수단을 제공한다.
또한, 진단적 바이오마커 시험은 경증 또는 무증상 질환이 있는 또는 증상을 보이는 질환이 발병할 위험이 클 수 있는 가족 구성원 또는 환자를 확인하기 위해 유용하다. 이것은 적절한 요법의 개시, 또는 예방적 수단, 예를 들어 위험 인자의 관리를 허용한다. 이들 방안은 결과를 개선하는 것으로 인식되고, 장애의 명백한 발병을 억제할 수 있다.
바이오마커 모니터링 방법, 바이오센서 및 키트는 또한 의사가 재발이 장애의 악화 때문인 것인지 결정할 수 있도록 하기 위해 환자 모니터링 도구로서 필수적이다. 약물학적 치료가 부적당한 것으로 평가되면, 요법은 회복 또는 증가될 수 있고; 적절하다면 요법의 변화가 이루어질 수 있다. 바이오마커가 장애의 상태의 감수성이면 약물 요법의 영향을 표시한다.
이제 본 발명을 다음 비제한적인 실시예를 참조로 예시할 것이다.
실시예 1
안정성을 위해 뉴클레오솜 내의 DNA 및 단백질이 가교결합된 MCF7 세포로부터 추출된 염색질의 소화에 의해 생산된 상업상 이용가능한 뉴클레오솜 제제 (제제 내에 존재하는 모든 히스톤이 무손상 뉴클레오솜으로 포함되도록 보장함)를, 무손상 뉴클레오솜에 결합하는 고체상 항-히스톤 포획 항체 및 비오티닐화 모노클로날 항-5-메틸시토신 검출 항체를 사용하는, 뉴클레오솜 연관 뉴클레오티드 5-메틸시토신에 대한 ELISA 방법을 이용하여 메틸화된 DNA에 대해 검정하였다. 뉴클레오솜 샘플을 태송아지 혈청 내에 연속 희석하고, ELISA에서 이중으로 시험하였다. 순수한 (neat) 태송아지 혈청을 또한 세포 유리 뉴클레오솜을 함유하지 않는 대조군 샘플로서 ELISA에서 실행하였다. 검정 방법은 다음과 같았다: 0.1 M 포스페이트 완충제 pH 7.4 내의 항-히스톤 항체의 용액을 마이크로타이터 웰 (100 ㎕/웰)에 첨가하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하여 웰을 포획 항체로 코팅하였다. 과량의 항-히스톤 항체를 경사분리하였다. 소 혈청 알부민 (20 g/L)의 용액을 웰에 첨가하고 (200 ㎕/웰), 실온에서 30분 인큐베이션하여 웰 상의 과량의 단백질 결합 부위를 차단하였다. 과량의 소 혈청 알부민 용액을 경사분리하고, 웰을 세척 완충제 (200 ㎕/웰, 1% 트윈 (Tween) 20을 함유하는 0.05 M TRIS/HCl 완충제 pH 7.5)로 3회 세척하였다. 샘플 (10 ㎕/웰) 및 검정 완충제 (50 ㎕/웰, 0.9% NaCl, 0.05% 나트륨 데옥시콜레이트 및 1% 노니데트 (Nonidet) P40 대체물을 함유하는 0.05 M TRIS/HCl pH 7.5)를 웰에 첨가하고, 가볍게 교반하면서 실온에서 90분 인큐베이션하였다. 샘플 및 검정 완충제 혼합물을 경사분리하고, 웰을 세척 완충제 (200 ㎕/웰)로 3회 세척하였다. 비오티닐화 항-5-메틸시토신 검출 항체의 용액을 첨가하고 (50 ㎕/웰), 가볍게 교반하면서 실온에서 90분 인큐베이션하였다. 과량의 검출 항체를 경사분리하고, 웰을 다시 세척 완충제 (200 ㎕/웰)로 3회 세척하였다. 스트렙타비딘-호스 래디시 페록시다제 접합체를 함유하는 용액을 첨가하고 (50 ㎕/웰), 가볍게 교반하면서 실온에서 30분 인큐베이션하였다. 과량의 접합체를 경사분리하고, 웰을 다시 세척 완충제 (200 ㎕/웰)로 3회 세척하였다. 착색된 기질 용액 (100 ㎕/웰, 2,2'-아지노비스 [3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산]-디암모늄 염)을 첨가하고, 가볍게 교반하면서 실온에서 20분 인큐베이션하였다. 웰의 광학 밀도 (OD)를 405 nm의 파장에서 표준 마이크로타이터 플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다. 증가하는 뉴클레오솜 연관 항-5-메틸시토신 농도와 함께 증가하는 색상의 용량 반응 곡선이 5-메틸시토신의 부재 하에 관찰된 낮은 배경 신호 (태송아지 혈청)와 함께 관찰되었다. (i) 포획 항체는 샘플 내의 히스톤에 결합하고, (ii) 검출 항체는 DNA의 5-메틸시토신 성분에 결합하므로, 양성 ELISA 신호는 ELISA에 의해 검출된 5-메틸시토신이 히스톤 단백질 및 DNA 모두를 포함하는 무손상 뉴클레오솜 내에 포함됨을 나타낸다. 결과를 도 1에 제시한다.
실시예 2
안정성을 위해 뉴클레오솜 내의 DNA 및 단백질이 가교결합된 A375 세포로부터 추출된 염색질의 소화에 의해 생산된 상업상 이용가능한 뉴클레오솜 제제 (제제 내에 존재하는 모든 히스톤이 무손상 뉴클레오솜으로 포함되도록 보장함)를, 무손상 뉴클레오솜에 결합하는 고체상 항-히스톤 포획 항체 및 비오티닐화 모노클로날 항-5-히드록시메틸시토신 검출 항체를 사용하는, 뉴클레오솜 연관 뉴클레오티드 5-히드록시메틸시토신에 대한 ELISA 방법을 이용하여 5-히드록시메틸화된 DNA에 대해 검정하였다. 뉴클레오솜 샘플을 태송아지 혈청 내에 연속 희석하고, ELISA에서 이중으로 시험하였다. 순수한 태송아지 혈청을 또한 세포 유리 뉴클레오솜을 함유하지 않는 대조군 샘플로서 ELISA에서 실행하였다. 검정 방법은 다음과 같았다: 0.1 M 포스페이트 완충제 pH 7.4 내의 항-히스톤 항체의 용액을 마이크로타이터 웰에 첨가하고 (100 ㎕/웰), 4℃에서 밤새 인큐베이션하하여 웰을 포획 항체로 코팅하였다. 과량의 항-히스톤 항체를 경사분리하였다. 소 혈청 알부민 (20 g/L)의 용액을 웰에 첨가하고 (200 ㎕/웰), 실온에서 30분 인큐베이션하여 웰 상의 과량의 단백질 결합 부위를 차단하였다. 과량의 소 혈청 알부민 용액을 경사분리하고, 웰을 세척 완충제 (200 ㎕/웰, 1% 트윈 20을 함유하는 0.05 M TRIS/HCl pH 7.5)로 3회 세척하였다. 샘플 (10 ㎕/웰) 및 검정 완충제 (50 ㎕/웰, 0.9% NaCl, 0.05% 나트륨 데옥시콜레이트 및 1% 노니데트 P40 대체물을 함유하는 0.05 M TRIS/HCl pH 7.5)를 웰에 첨가하고, 가볍게 교반하면서 실온에서 90분 인큐베이션하였다. 샘플 및 검정 완충제 혼합물을 경사분리하고, 웰을 세척 완충제 (200 ㎕/웰)로 3회 세척하였다. 비오티닐화 항-5-히드록시메틸시토신 검출 항체의 용액을 첨가하고 (50 ㎕/웰), 가볍게 교반하면서 실온에서 90분 인큐베이션하였다. 과량의 검출 항체를 경사분리하고, 웰을 다시 세척 완충제 (200 ㎕/웰)로 3회 세척하였다. 스트렙타비딘-호스 래디시 페록시다제 접합체를 함유하는 용액을 첨가하고 (50 ㎕/웰), 가볍게 교반하면서 실온에서 30분 인큐베이션하였다. 과량의 접합체를 경사분리하고, 웰을 다시 세척 완충제 (200 ㎕/웰)로 3회 세척하였다. 착색된 기질 용액 (100 ㎕/웰, 2,2'-아지노비스 [3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산]-디암모늄 염)을 첨가하고, 가볍게 교반하면서 실온에서 20분 인큐베이션하였다. 웰의 광학 밀도 (OD)를 405 nm의 파장에서 표준 마이크로타이터 플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다. 증가하는 뉴클레오솜 연관 5-히드록시메틸시토신 농도와 함께 증가하는 색상의 용량 반응 곡선이 5-히드록시메틸시토신의 부재 하에 관찰된 낮은 배경 신호 (태송아지 혈청)와 함께 관찰되었다. (i) 포획 항체는 샘플 내의 히스톤에 결합하고, (ii) 검출 항체는 DNA의 5-히드록시메틸시토신 성분에 결합하므로, 양성 ELISA 신호는 ELISA에 의해 검출된 5-히드록시메틸시토신이 히스톤 단백질 및 DNA 모두를 포함하는 무손상 뉴클레오솜 내에 포함됨을 나타낸다. 결과를 도 2에 제시한다.
실시예 3
본 발명자들은 20명의 건강한 대상체로부터 채취한 혈청 및 혈장 샘플의 순환 세포 유리 뉴클레오솜 함량을 측정하기 위해 현재 기술의 2가지 뉴클레오솜 ELISA 방법을 사용하였다. 현재의 제1 ELISA 방법 (ELISA 1)은 로슈 (Roche) 세포 사멸 ELISA이고, 다른 것 (ELISA 2)은 항-히스톤 포획 항체 및 항-히스톤-DNA 복합체 검출 항체를 사용하는 ELISA이었다. 현재의 뉴클레오솜 ELISA 방법 둘 모두에 의해 검출된 뉴클레오솜 수준은 정상 혈청 내에서보다 정상 혈장 내에서 더 낮았다. 뉴클레오솜의 혈청 수준에 대한 정상 범위 (광학 밀도 단위로 표현함)는 ELISA 1에 대해 0 - 4.3 OD 단위 및 ELISA 2에 대해 0 - 1.4인 것으로 계산되었다 (20명의 건강한 대상체 혈청 결과의 평균 ± 평균의 2 표준 편차). 혈장에 대한 각각의 범위는 0 - 0.95 및 0 - 0.96이었다. 결과를 도 3에 제시한다.
본 발명자들은 또한 건강한 대상체로부터 채취한 동일한 20개의 샘플 내에서 2개의 뉴클레오솜 연관 뉴클레오티드뿐만 아니라 3개의 뉴클레오솜 연관 히스톤 변이체 및 히스톤 PTM을 함유하는 뉴클레오솜의 수준을 측정하였다. 결과는 건강한 혈청 샘플에서 히스톤 변이체 또는 PTM 또는 뉴클레오티드를 함유하는 뉴클레오솜의 수준이 균일하게 낮았음을 보여준다. 히스톤 변이체, PTM 또는 뉴클레오티드를 함유하는 뉴클레오솜의 혈청 수준에 대한 정상 범위 (광학 밀도로서 표현됨)는 (a) mH2A1.1에 대해 0 - 0.36, (b) mH2A2에 대해 0.05 - 0.78, (c) H2AZ에 대해 0.11 - 0.58, (d) P-H2AX(Ser139)에 대해 0.06 - 0.61, (e) 5-메틸시토신에 대해 0.06-0.36, 및 (f) 5-히드록시메틸시토신에 대해 0.03-0.36이었다. 측정된 EDTA 혈장 결과는 20명의 모든 건강한 대상체에 대해 더 높았다. 결과를 도 4, 5, 6, 7, 8 및 9에 제시한다.
실시예 4
본 발명자들은 13명의 건강한 대상체 및 위, 대장, 직장, 폐 (소세포 암종 및 다양한 비-소세포 암종), 유방, 난소, 췌장, 전립선, 신장의 암 및 다양한 구강암 (구강, 구개, 인두 및 후두)이 있는 55명의 대상체로부터 채취한 EDTA 혈장에서 5-메틸시토신을 함유하는 세포 유리 뉴클레오솜을 측정하였다. 건강한 대상체로부터 채취한 13개의 모든 샘플은 하나 이상의 세포 유리 뉴클레오솜 종류에 대해 양성이었다. 암 환자로부터 채취한 55개의 모든 샘플은 검정된 모든 세포 유리 뉴클레오솜 종류에 대해 양성이었다. 그러나, 암 대상체로부터 채취한 샘플에서 검출된 수준은 건강한 대상체로부터 채취한 샘플에서 발견된 것보다 더 높았고, 이 결과는 건강한 대상체 및 암 대상체가 식별될 수 있음을 보여주었다. 예를 들어, 뉴클레오솜 연관 5-메틸시토신에 대해 평균 ± 평균의 2 표준 편차로서 OD 측면에서 계산된 정상 범위는 0-1.41이었다. 상기 컷-오프 값을 사용하여, 13개의 모든 건강한 샘플은 음성이었고, 위 38% (3/8), 대장 60% (3/5), 직장 33% (1/3), 소세포 폐암 33% (2/6), 비-소세포 폐암 64% (9/14), 유방 33% (2/6), 난소 100% (1/1), 췌장 100% (1/1), 전립선 33% (2/6), 신장 100% (1/1) 및 구강암 샘플 60% (3/5)를 포함하여, 55개의 암 샘플 중 30개가 양성이었다 (총 임상 민감도 55%). 결과를 도 17에 제시한다.
본 발명자들은 또한 동일한 샘플 내의 다양한 다른 뉴클레오솜 연관 구조를 측정하기 위해 본 발명의 방법을 사용하였다. 이들 면역검정의 결과를 컴파일링하여 5-메틸시토신을 함유하는 뉴클레오솜의 검출된 수준에 대해 정규화된, 암 환자로부터 채취한 샘플에서 뉴클레오솜 구조의 프로파일을 제공하였다. 본 발명자들은 생성되는 프로파일을 건강한 대상체로부터 채취한 샘플의 뉴클레오솜 구조에 비교하였다. 세포 유리 뉴클레오솜의 뉴클레오솜 구조 프로파일은 건강한 대상체와 상이한 것으로 밝혀졌다. 결과를 도 20에 제시한다. 유사하게 본 발명자들은 다양한 비-암 질환으로부터 채취한 샘플에 대해 뉴클레오솜 구조 프로파일을 컴파일링하고, 이들을 암 환자 및 건강한 대상체로부터 채취한 샘플에서 뉴클레오솜의 프로파일에 비교하였다. 결과를 도 21에 제시한다.
이어서, 본 발명자들은 10명의 건강한 대상체 및 다양한 종류의 암이 있는 추가의 62명의 환자로부터의 샘플을 포함한 또 다른 유사한 실험을 수행하였다. 결과는 제1 실험과 유사하였다. 예를 들어, 뉴클레오솜 연관 5-메틸시토신에 대한 결과 및 건강한 대상체에 대한 결과의 평균 + 평균의 2 표준 편차의 컷-오프를 사용하여, 10명의 모든 건강한 대상체에 대해 음성 결과를 얻었고, 9/9명의 전립선암 환자, 5/5명의 피부암 환자, 8/8명의 식도암 환자, 12/13명의 방광암 환자, 2/2명의 자궁경부암 환자 및 1/1명의 결장암 환자, 4/4명의 유방암 환자, 7/7명의 난소암 환자, 7/7명의 후두암 환자, 3/3명의 폐암 환자 및 3/3명의 신장암 환자를 포함하여, 암 환자의 95% (61/62)에 대해 양성 결과를 얻었다. 결과를 도 18에 제시한다. 상기 결과는 혈청 뉴클레오티드 수준 및 뉴클레오솜 연관 뉴클레오티드 수준 (특히 5-메틸시토신 포함)이 암에 대한 임상적으로 민감한 바이오마커임을 나타낸다.
실시예 5
본 발명자들은 홀덴리이더 (Holdenrieder) (문헌 *[Holdenrieder et al., 2001])의 방법에 따라 3명의 결장암 대상체, 13명의 폐암 대상체, 2명의 췌장암 대상체, 1명의 구강암 대상체로부터 채취한 샘플 및 건강한 대상체로부터 생성한 뉴클레오솜 샘플의 순환 세포 유리 뉴클레오솜 함량을 측정하기 위해 현재 기술의 2가지 뉴클레오솜 ELISA 방법을 사용하였다. 현재의 제1 ELISA 방법 (ELISA 1)은 로슈 세포 사멸 ELISA이고, 다른 것 (ELISA 2)은 항-히스톤 포획 항체 및 항-히스톤-DNA 복합체 검출 항체를 사용하는 ELISA이다.
본 발명자들은 또한 암 대상체로부터 채취한 동일한 19개의 샘플에서 뉴클레오티드 5-메틸시토신 및 5-히드록시메틸시토신뿐만 아니라 3개의 변이체 히스톤 및 히스톤 PTM을 함유하는 뉴클레오솜의 수준을 측정하였다. 결과는 대부분의 대상체, 특히 췌장암 및 구강암 환자에 대하여 현재 기술의 ELISA 방법에 대해 낮은 뉴클레오솜 결과가 검출되지만, 대부분의 이들 샘플은 하나 이상의 뉴클레오솜 연관 뉴클레오티드 또는 변이체 히스톤을 함유하는 뉴클레오솜을 더 높은 검출가능한 수준으로 가짐을 보여준다. 3명의 결장암 대상체, 13명의 폐암 대상체, 2명의 췌장암 대상체 및 1명의 구강암 대상체로부터 채취한 샘플에 대한 결과를 각각 도 10, 11, 12, 및 13에 제시한다. 유의한 뉴클레오솜 연관 히스톤 변이체 수준 및 히스톤 PTM 수준이 19개의 암 샘플 중 16개 (3개의 폐암 샘플을 제외한 전부)에서 검출되었다. 또한, 유의한 뉴클레오솜 연관 5-히드록시메틸시토신 수준이 19개의 암 샘플 중 12개에서 검출되었다. 또한, 유의한 뉴클레오솜 연관 5-메틸시토신 수준이 19개의 모든 암 샘플에서 검출되었다.
또한, 상이한 뉴클레오티드, 히스톤 변이체 및 히스톤 PTM 수준을 함유하는 뉴클레오솜 수준의 패턴은 모든 대상체에 대해 균일하지 않고, 대신에 시험한 상이한 암에 대해 상이한 패턴을 보인다. 동일한 또는 상이한 암이 있는 대상체에 대한 결과들 사이의 비교를 용이하게 하기 위해; 뉴클레오솜 시험에 대한 (macroH2A1.1, macroH2A2, H2AZ, P-H2AX(Ser139), 5-메틸시토신, 5-히드록시메틸시토신을 함유하는 뉴클레오솜에 대한) 결과를 5-메틸시토신을 함유하는 뉴클레오솜에 대해 관찰된 OD 신호의 비율로서 정규화하였다. 정규화된 결과 (하나 초과의 대상체로부터의 샘플이 시험되는 경우에 결과에서 표준 편차를 보여주는 오차 막대를 갖는)를 도 14에서 각각의 암에 대해 제시하고, 건강한 대상체로부터 생산된 뉴클레오솜 샘플에 대한 동일한 결과를 또한 제시한다 (mH2A2 및 5-히드록시메틸시토신은 상기 샘플에 대해 측정되지 않았다). 도 14는 조사된 4개의 모든 암에서 상이한 정규화된 뉴클레오티드, 히스톤 변이체 또는 PTM을 함유하는 뉴클레오솜의 분포 패턴이 건강한 대상체로부터 제조된 샘플에서 뉴클레오솜의 분포와 매우 현저하게 상이함을 보여준다. 예를 들어, 건강한 뉴클레오솜 샘플 내의 macroH2A1.1을 함유하는 뉴클레오솜의 상대적인 수준은 임의의 암 종류의 샘플에서 검출된 것과 상이하다. 따라서, 본 발명은 간단한 혈액 기반 스크리닝 시험에서 암의 검출을 위한 방법으로서 사용될 수 있다. 종양 또는 다른 질환 기원의 순환 세포 유리 뉴클레오솜 사이를 추가로 또는 더 잘 구분하기 위해 본 발명이 추가의 다른 뉴클레오티드 및/또는 히스톤 변이체 및/또는 히스톤 변형을 함유하는 뉴클레오솜의 시험을 포함하는 것은 당업자에게 자명할 것이다.
또한, 관찰된 뉴클레오솜 종류의 패턴은 상이한 암 종류에 대해 상이하다. 예를 들어, 결장, 췌장 및 구강암이 있는 대상체로부터 채취한 샘플은 뉴클레오솜 연관 H2AZ 및 5-히드록시메틸시토신의 상이한 정규화된 수준에 의해 구별될 수 있다. 유사하게, 구강암에서 mH2A2 또는 P-H2AX(Ser139)을 함유하는 뉴클레오솜 둘 모두의 정규화된 수준이 임의의 다른 3가지 암 종류와 상이하고, 췌장암 대상체로부터 채취한 샘플은 변이체 macroH2A1.1을 함유하는 뉴클레오솜의 상이한 상대적인 수준에 기초하여 결장암 대상체로부터 채취한 샘플로부터 구별될 수 있다. 따라서, 본 발명은 암을 일반적으로 진단하기 위한 및 특정 암 종류를 구별하는 방법으로서 사용될 수 있다. 상이한 특이적 종양 기원 또는 다른 질환 기원의 순환 세포 유리 뉴클레오솜 사이를 추가로 또는 더 잘 구분하기 위해 본 발명이 추가의 다른 히스톤 변이체 및/또는 히스톤 변형 및/또는 뉴클레오티드를 함유하는 뉴클레오솜의 시험을 포함하는 것은 당업자에게 자명할 것이다.
실시예 6
본 발명자들은 3명의 건강한 대상체 및 10명의 결장암 환자로부터 채취한 혈청 샘플에서 본 발명의 방법을 시험하였다. 본 발명자들은 이들 샘플 내의 5-메틸시토신을 함유하는 뉴클레오솜을 측정하였고, 도 16에 제시된 바와 같이 암 결과는 건강한 대상체에 대해 얻어진 결과에 비해 균일하게 상승되었다.
실시예 7
본 발명자들은 폐암 및 결장암 환자로부터 채취한 인간 EDTA 혈장 샘플의 뉴클레오솜 연관 5-메틸시토신 수준을 측정하였다. 검출된 수준은 환자의 질환 진행과 상호관련되었다. 도 19에 제시된 결과는 뉴클레오솜 연관 5-메틸시토신 수준이 크기, 병기, 림프절 확산의 면에서 질환의 중증도에 따라 증가함을 보여주고, 뉴클레오솜 연관 5-메틸시토신 수준은 단독으로 또는 진단 패널의 일부로서 질환 진행의 표시자로서 사용될 수 있다.
참고문헌
Figure 112014029459581-pct00001
Figure 112014029459581-pct00002
Figure 112014029459581-pct00003

Claims (23)

  1. 세포 유리(cell free) 뉴클레오솜과 연관된(associated) DNA 염기를 포함하고, 상기 DNA 염기는 우라실, 이노신, 크산틴, 히포크산틴, 또는 변형된 염기로부터 선택되는 것인, 체액 샘플에서 암, 심근병증, 전신 홍반성 루푸스, 결장염, 만성 폐쇄성 폐 장애, 크론병 또는 류마티스 관절염의 진단에 사용하기 위한 바이오마커 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 세포 유리 뉴클레오솜이 모노뉴클레오솜 또는 올리고뉴클레오솜인 바이오마커 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포 유리 뉴클레오솜과 연관된 DNA 염기가 혈액, 혈청, 또는 혈장 샘플에서 측정되는 것인 바이오마커 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 암이 방광, 유방, 결장, 자궁경부, 식도, 신장, 대장, 폐, 구강, 난소, 췌장, 전립선, 직장, 피부 또는 위의 암인 바이오마커 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 암이 결장, 폐, 구강 또는 췌장의 암인 바이오마커 조성물.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 변형된 염기가 5-메틸시토신, 5-히드로메틸시토신, 또는 7,8-디히드로-8-옥소-구아닌으로부터 선택되는 것인 바이오마커 조성물.
  7. 체액 샘플에서 세포 유리 뉴클리오솜에 연관된 DNA 염기의 존재를 검출하는 방법이며,
    (i) 체액 샘플을 뉴클레오솜에 결합하는 제1 결합제와 접촉시키는 단계,
    (ii) 뉴클레오솜 또는 체액 샘플을 DNA 염기에 결합하는 제2 결합제와 접촉시키는 단계,
    (iii) 체액 샘플에서 DNA 염기에 대한 상기 제2 결합제의 결합을 검출하거나 정량하는 단계, 및
    (iv) 체액 샘플 내 DNA 염기를 함유하는 뉴클레오솜의 존재의 척도로서 상기 결합의 존재 또는 정도를 사용하는 단계
    를 포함하고, 상기 DNA 염기가 우라실, 이노신, 크산틴, 히포크산틴, 또는 변형된 염기로부터 선택되는 것인, 방법.
  8. 체액 샘플에서 세포 유리 뉴클리오솜에 연관된 DNA 염기의 존재를 검출하는 방법이며,
    (i) 체액 샘플을 DNA 염기에 결합하는 제1 결합제와 접촉시키는 단계,
    (ii) 뉴클레오솜 또는 체액 샘플을 뉴클레오솜에 결합하는 제2 결합제와 접촉시키는 단계,
    (iii) 체액 샘플에서 뉴클레오솜에 대한 상기 제2 결합제의 결합을 검출하거나 정량하는 단계, 및
    (iv) 체액 샘플 내 DNA 염기를 함유하는 뉴클레오솜의 존재의 척도로서 상기 결합의 존재 또는 정도를 사용하는 단계
    를 포함하고, 상기 DNA 염기가 우라실, 이노신, 크산틴, 히포크산틴, 또는 변형된 염기로부터 선택되는 것인, 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 변형된 염기가 5-메틸시토신, 5-히드록시메틸시토신, 또는 7,8-디히드로-8-옥소-구아닌으로부터 선택되는 것인 방법.
  10. 제7항 또는 제8항에 있어서, 결합제가 항체인 방법.
  11. 제7항 또는 제8항에 있어서, 체액 샘플이 혈액 또는 혈청 또는 혈장인 방법.
  12. 동물 또는 인간 대상체에서 질환 상태를 검출하거나 진단하는 데 필요한 정보를 제공하는 시험관내 방법이며,
    (i) 대상체의 체액으로부터 수득된 샘플에서 세포 유리 뉴클레오솜에 연관된 DNA 염기를 검출하거나 측정하는 단계, 및
    (ii) 검출된 뉴클레오솜 연관 DNA 염기 수준을, 대상체의 질환 상태를 확인하기 위해 사용하는 단계
    를 포함하고, 상기 DNA 염기가 우라실, 이노신, 크산틴, 히포크산틴, 또는 변형된 염기로부터 선택되는 것이며, 상기 질환이 암, 심근병증, 전신 홍반성 루푸스, 결장염, 만성 폐쇄성 폐 장애, 크론병 및 류마티스 관절염으로부터 선택되는 것인, 방법.
  13. 의학적 치료를 위해 동물 또는 인간 대상체를 평가하는 시험관내 방법이며,
    (i) 대상체의 체액으로부터 수득된 샘플에서 세포 유리 뉴클레오솜과 연관된 DNA 염기를 검출하거나 측정하는 단계, 및
    (ii) 검출된 뉴클레오솜 연관 DNA 염기 수준을, 대상체에 대한 치료의 선택을 위한 파라미터로서 사용하는 단계
    를 포함하고,
    상기 DNA 염기가 우라실, 이노신, 크산틴, 히포크산틴, 또는 변형된 염기로부터 선택되는 것이며, 상기 치료가 암, 심근병증, 전신 홍반성 루푸스, 결장염, 만성 폐쇄성 폐 장애, 크론병 및 류마티스 관절염으로부터 선택되는 질환을 위한 것인, 방법.
  14. 동물 또는 인간 대상체의 치료를 모니터링하는 시험관내 방법이며,
    (i) 대상체의 체액으로부터 수득된 샘플에서 세포 유리 뉴클레오솜에 연관된 DNA 염기를 검출하거나 측정하는 단계,
    (ii) 대상체의 체액으로부터 수득된 샘플에서 세포 유리 뉴클레오솜에 연관된 DNA 염기의 검출 또는 측정을 1회 이상 반복하는 단계, 및
    (iii) 검출된 뉴클레오솜 연관 DNA 염기 수준의 임의의 변화를, 대상체 상태의 임의의 변화에 대한 파라미터로서 사용하는 단계
    를 포함하고, 상기 DNA 염기가 우라실, 이노신, 크산틴, 히포크산틴, 또는 변형된 염기로부터 선택되는 것이며, 상기 치료가 암, 심근병증, 전신 홍반성 루푸스, 결장염, 만성 폐쇄성 폐 장애, 크론병 및 류마티스 관절염으로부터 선택되는 질환을 위한 것인, 방법.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 유리 뉴클레오솜과 연관된 DNA 염기가 일군의 측정 중 하나로서 검출되거나 측정되는 것인 방법.
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