JP6322845B2 - ヌクレオチド含有ヌクレオソーム検出法 - Google Patents
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Description
本発明は、モノヌクレオソーム及びオリゴヌクレオソーム及び特定のヌクレオチドを含有するヌクレオソームの存在を検出及び測定する方法、並びに疾患の検出及び診断のためのそのような測定の使用に関する。本発明はまた、疾患の検出及び診断のためにヌクレオソームに会合されたヌクレオチドバイオマーカーを同定する方法、並びに該方法により同定されたバイオマーカーに関する。
ヒトの体は、数百種の細胞型を含んでいる。これらの細胞型は全て、同じゲノムを含んでいるが、広範に異なる表現型及び体内での異なる機能を有する。この表現型の多様性は、異なる細胞型におけるゲノムの差次的発現によるものである。差次的遺伝子発現の制御は、完全には理解されていないが、その基本的機構は、ユークロマチン又はヘテロクロマチンとしてのクロマチンパッキングの制御、ヌクレオソームポジショニング及びヌクレアーゼ到達可能部位の制御、メチル化、ヒドロキシメチル化及び他のDNAの修飾、並びにその周りにDNAが巻き付いたヌクレオソームの構造の変化を含む、遺伝子と関連する多数の相互接続されたエピジェネティックシグナルによる遺伝子調節を含んでいる。
本発明の第一の態様に従い、癌、心筋症、全身性紅斑性狼瘡、大腸炎、慢性閉塞性肺疾患、クローン病及び関節リウマチの診断用バイオマーカーとして使用するための、DNA塩基、ヌクレオチド又はヌクレオシドを含有する無細胞系ヌクレオソームが、提供される。
(i)該試料を、該DNA塩基、ヌクレオチド又はヌクレオシドに結合する結合剤(binding agent)と接触させる工程;
(ii)該結合剤の、該試料中のDNA塩基、ヌクレオチド又はヌクレオシドへの結合を検出又は定量する工程;並びに
(iii)該試料中の、DNA塩基、ヌクレオチド又はヌクレオシドを含有するヌクレオソームの存在の測定値として、当該結合の存在又は程度を使用する工程:
を含む方法が、提供される。
(i)該試料を、ヌクレオソームに結合する第一の結合剤と接触させる工程;
(ii)該ヌクレオソーム又は試料を、該DNA塩基、ヌクレオチド又はヌクレオシドに結合する第二の結合剤と接触させる工程;
(iii)該第二の結合剤の、該試料中のDNA塩基、ヌクレオチド又はヌクレオシドへの結合を検出又は定量する工程;並びに
(iv)該試料中の、DNA塩基、ヌクレオチド又はヌクレオシドを含有するヌクレオソームの存在の測定値として、当該結合の存在又は程度を使用する工程:
を含む方法が、提供される。
(i)該試料を、DNA塩基、ヌクレオチド又はヌクレオシドに結合する第一の結合剤と接触させる工程;
(ii)該ヌクレオソーム又は試料を、ヌクレオソームに結合する第二の結合剤と接触させる工程;
(iii)該第二の結合剤の、該試料中のヌクレオソームへの結合を検出又は定量する工程;並びに
(iv)該試料中のDNA塩基、ヌクレオチド又はヌクレオシドを含有するヌクレオソームの存在の測定値として、当該結合の存在又は程度を使用する工程:
を含む方法が、提供される。
(i)細胞からクロマチンを単離する工程;
(ii)該クロマチンを消化するか、音波処理するか又は別様に破壊し、モノヌクレオソーム及び/又はオリゴヌクレオソームを形成する工程;並びに
(iii)本発明の方法に従い、該ヌクレオソーム内のDNA塩基、ヌクレオチド又はヌクレオシドの存在を検出又は測定する工程:
を含む方法が、提供される。
(i)対象の体液中の、DNA塩基、ヌクレオチド又はヌクレオシドを含有するヌクレオソームを検出又は測定する工程;並びに
(ii)該対象の疾患状態を同定するために検出されたヌクレオソームに会合されたDNA塩基、ヌクレオチド又はヌクレオシドのレベルを使用する工程:
を含む方法が、提供される。
(i)該対象の体液中の、DNA塩基、ヌクレオチド又はヌクレオシドを含有するヌクレオソームを検出又は測定する工程;並びに
(ii)該対象に関する好適な治療の選択のためのパラメータとして、検出されたヌクレオソームに会合されたDNA塩基、ヌクレオチド又はヌクレオシドのレベルを使用する工程:
を含む方法が、提供される。
(i)該対象の体液中の、DNA塩基、ヌクレオチド又はヌクレオシドを含有するヌクレオソームを検出又は測定する工程;
(ii)1回以上にわたって対象の体液中の、DNA塩基、ヌクレオチド又はヌクレオシドを含有するヌクレオソームの検出又は測定を反復する工程;並びに
(iii)該対象の状態の何らかの変化に関するパラメータとして、検出されたヌクレオソームに会合されたDNA塩基、ヌクレオチド又はヌクレオシドのレベルの何らかの変化を使用する工程:
を含む方法が、提供される。
(i)該対象の体液中の、DNA塩基、ヌクレオチド又はヌクレオシドを含有するヌクレオソームを検出又は測定する工程;
(ii)健常対象又は対照対象の体液中の、DNA塩基、ヌクレオチド又はヌクレオシドを含有するヌクレオソームを検出又は測定する工程;並びに
(iii)DNA塩基、ヌクレオチド又はヌクレオシドが、疾患状態のバイオマーカーとして有用であるかどうかを同定するために、罹患対象及び対照対象において検出されたレベル間の差異を使用する工程:
を含む方法が、提供される。
本発明の第一の態様に従い、癌、心筋症、全身性紅斑性狼瘡、大腸炎、慢性閉塞性肺疾患、クローン病及び関節リウマチの診断用バイオマーカーとしての使用するための、DNA塩基、ヌクレオチド又はヌクレオシドを含有する無細胞系ヌクレオソームが提供される。
一実施態様において、前記ヌクレオソームは、モノヌクレオソーム又はオリゴヌクレオソームである。
一実施態様において、前記癌は、膀胱、乳房、結腸、頸部、食道、腎臓、大腸、肺、口腔、卵巣、膵臓、前立腺、直腸、皮膚又は胃の癌である。言及され得る一つの特定の実施態様において、癌は、結腸、肺、口腔又は膵臓の癌である。
(i)ヌクレオソームを含有し得る試料を、ヌクレオソームに結合する一次抗体又は他のバインダーと接触させる工程;
(ii)ヌクレオソーム又は試料を、ヌクレオチドに結合する二次抗体又は他のバインダーと接触させる工程;
(iii)該二次抗体又は他のバインダーの、試料中のヌクレオチドへの結合を検出及び/又は定量する工程;並びに
(iv)試料中のヌクレオソームに会合されたヌクレオチド存在の測定値として、当該結合の存在又は程度を使用する工程:
を含む、免疫検定である。
(i)ヌクレオソームを含有し得る試料を、ヌクレオチドに結合する一次抗体又は他のバインダーと接触させる工程;
(ii)ヌクレオソーム又は試料を、ヌクレオソームに結合する二次抗体又は他のバインダーと接触させる工程;
(iii)該二次抗体又は他のバインダーの、試料中のヌクレオソームへの結合を検出及び/又は定量する工程;並びに
(iv)試料中のヌクレオソームに会合されたヌクレオチド存在の測定値として、当該結合の存在又は程度を使用する工程:
を含む方法が、提供される。
(i)試料を、ヌクレオチドに結合する抗体又は他のバインダーと接触させる工程;
(ii)試料中のヌクレオチドへの該抗体又は他のバインダーの結合を検出及び/又は定量する工程;並びに
(iii)試料中のヌクレオチドの存在の測定値として、当該結合の存在又は程度を使用する工程:
を含む方法が、提供される。
(i)試料を、ヌクレオチドに結合する抗体又は他のバインダーと接触させる工程;
(ii)試料中のヌクレオチドへの該抗体又は他のバインダーの結合を検出及び/又は定量する工程;並びに
(iii)試料中のヌクレオチドの存在の測定値として、当該結合の存在又は程度を使用する工程:
を含む方法が、提供される。
(i)試料中の無細胞系DNAのレベルを検出又は測定する工程;
(ii)本発明の方法に従い、ヌクレオソームに会合されたヌクレオチドのレベルを検出又は測定する工程;並びに
(iii)前記ヌクレオチドを含むDNAの割合を決定するために、2つの測定値を使用する工程:
を含む方法が、提供される。
(i)細胞からクロマチンを単離する工程;
(ii)該クロマチンを破壊し、モノヌクレオソーム及び/又はオリゴヌクレオソームを形成する工程;並びに
(iii)本発明の免疫検定法により、モノヌクレオソーム及び/又はオリゴヌクレオソーム中のヌクレオチドの存在を検出又は測定する工程:
を含む方法が、提供される。
(i)罹患対象の体液中の、ヌクレオチドを含有する無細胞系ヌクレオソームのレベルを検出又は測定する工程;
(ii)対照対象の体液中の、ヌクレオチドを含有する無細胞系ヌクレオソームのレベルを検出又は測定する工程;並びに
(iii)ヌクレオチドが、その疾患のバイオマーカーとして有用であるかどうかを同定するために、罹患対象及び対照対象において検出されたレベル間の差異を使用する工程:
を含む方法が、提供される。
(i)罹患対象の体液中のヌクレオチドを含有する無細胞系ヌクレオソームのレベルを検出又は測定する工程;並びに
(ii)罹患対象の体液中で検出されたヌクレオチドを含有する無細胞系ヌクレオソームのレベルを、該対象の疾患転帰と相関させる工程:
を含む方法が、提供される。
(i)罹患対象の体液中のヌクレオチドを含有する無細胞系ヌクレオソームのレベルを検出又は測定する工程;並びに
(ii)罹患対象の体液中のヌクレオチドを含有する無細胞系ヌクレオソームのレベルを、それらの対象における治療レジメンの認められた有効性と相関させる工程:
を含む方法が、提供される。
(i)罹患対象の体液中の、ヌクレオチドを含有する無細胞系ヌクレオソームのレベルを検出又は測定する工程;
(ii)対象の疾患進行時、1回以上にわたり、該検出又は測定を反復する工程;並びに
(iii)罹患対象の体液中に検出されたヌクレオチドを含有する無細胞系ヌクレオソームのレベルを、対象における疾患進行と相関させる工程:
を含む方法が、提供される。
(i)本明細書に規定されたバイオマーカーの量を定量する工程;並びに
(ii)試験試料中の該バイオマーカーの量を、1以上の対照及び/又は同じ試験対象からより早い時点で採取した1以上の以前の試験試料中に存在する量と比較する工程:
を含む方法が、提供される。
更なる実施態様において、素早く作用する療法に起因した、より迅速な変化のモニタリングを、数時間又は数日の短い間隔で行うことができる。
本発明のバイオセンサーは、バイオマーカーへの特異的結合が可能である本明細書記載のリガンドバインダー又はリガンドを含んでよい。そのようなバイオセンサーは、本発明のバイオマーカーの検出及び/又は定量において有用である。
更に、診断用バイオマーカー試験は、軽度の又は無症候性の疾患を伴うか、或いは症候性疾患を発症するリスクの高い、家族の一員又は患者を同定するために有用である。このことは、適切な療法の開始、又は予防的対策、例えばリスク因子の管理を可能にする。これらの方策は、転帰を改善し、且つ該障害の顕性の発症を防止することができることが認められる。
(実施例1)
ヌクレオソーム内のDNA及びタンパク質が安定のために架橋されている(その調製品中に存在する全てのヒストンが無傷のヌクレオソーム中に組み込まれていることを確実にするため)MCF7細胞から抽出されたクロマチンの消化により生成された市販のヌクレオソーム調製品を、無傷のヌクレオソームに結合する固相抗-ヒストン捕獲抗体、及びビオチン化されたモノクローナル抗-5-メチルシトシン検出抗体を使用する、ヌクレオソームに会合されたヌクレオチド5-メチルシトシンに関するELISA法を用い、メチル化されたDNAについてアッセイした。ヌクレオソーム試料を、ウシ胎仔血清中に連続希釈し、且つELISAにおいて2つ組で試験した。未希釈のウシ胎仔血清もまた、無細胞系ヌクレオソームを含有しない対照試料として、ELISAにおいて試行した。アッセイ法は、下記に従う:0.1Mリン酸緩衝液(pH7.4)中の抗-ヒストン抗体の溶液を、マイクロタイターウェルに添加し(100μL/ウェル)、4℃で一晩インキュベーションし、ウェルを捕獲抗体により被覆した。過剰な抗-ヒストン抗体をデカントした。ウシ血清アルブミン(20g/L)の溶液をウェルへ添加し(200μL/ウェル)、室温で30分間インキュベーションし、ウェル上の過剰なタンパク質結合部位をブロックした。過剰なウシ血清アルブミン溶液をデカントし、これらのウェルを、洗浄緩衝液(200μL/ウェル、1%Tween 20を含有する0.05Mトリス/HCl緩衝液(pH7.5))により3回洗浄した。試料(10μL/ウェル)及びアッセイ緩衝液(50μL/ウェル、0.9%NaCl、0.05%デオキシコール酸ナトリウム及び1% Nonidet P40置換体(substitute)を含有する0.05Mトリス/HCl(pH7.5))を、ウェルへ添加し、室温で90分間、穏やかに攪拌しながらインキュベーションした。試料とアッセイ緩衝液の混合物をデカントし、ウェルを、洗浄緩衝液(200μL/ウェル)により3回洗浄した。ビオチン化された抗-5-メチルシトシン検出抗体の溶液を添加し(50μL/ウェル)、且つ穏やかに攪拌しながら、室温で90分間インキュベーションした。過剰な検出抗体をデカントし、再度ウェルを、洗浄緩衝液(200μL/ウェル)により3回洗浄した。ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体を含有する溶液を添加し(50μL/ウェル)、且つ穏やかに攪拌しながら、室温で30分間インキュベーションした。過剰な複合体をデカントし、ウェルを、洗浄緩衝液(200μL/ウェル)により3回洗浄した。呈色基質溶液(100μL/ウェル、2,2'-アジノビス[3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸]-ジアンモニウム塩)を添加し、穏やかに攪拌しながら、室温で20分間インキュベーションした。ウェルの光学密度(OD)を、標準マイクロタイタープレートリーダーを用い、波長405nmで測定した。ヌクレオソームに会合された抗-5-メチルシトシン濃度を増加することにより増加する色の用量反応曲線が認められ、5-メチルシトシン非存在(ウシ胎仔血清)下では、低いバックグラウンドシグナルが認められた。陽性ELISAシグナルは、(i)この捕獲抗体は、試料中のヒストンに結合し、且つ(ii)検出抗体は、DNAの5-メチルシトシン成分に結合するので、ELISAにより検出された5-メチルシトシンは、ヒストンタンパク質及びDNAの両方を含有する無傷のヌクレオソーム内に組み込まれていることを指摘している。これらの結果は、図1に示している。
ヌクレオソーム内のDNA及びタンパク質が安定のために架橋されているA375細胞から抽出されたクロマチンの消化により生成された市販のヌクレオソーム調製品(その調製品中に存在する全てのヒストンが無傷のヌクレオソーム中に組み込まれていることを確実にするため)を、無傷のヌクレオソームに結合する固相抗-ヒストン捕獲抗体、及びビオチン化されたモノクローナル抗-5-ヒドロキシメチルシトシン検出抗体を使用する、ヌクレオソームに会合されたヌクレオチド5-ヒドロキシメチルシトシンに関するELISA法を用い、5-ヒドロキシメチル化されたDNAについてアッセイした。ヌクレオソーム試料を、ウシ胎仔血清中に連続希釈し、且つELISAにおいて2つ組で試験した。未希釈のウシ胎仔血清もまた、無細胞系ヌクレオソームを含有しない対照試料として、ELISAにおいて試行した。アッセイ法は、下記に従う:0.1Mリン酸緩衝液(pH7.4)中の抗-ヒストン抗体の溶液を、マイクロタイターウェルに添加し(100μL/ウェル)、4℃で一晩インキュベーションし、ウェルを捕獲抗体により被覆した。過剰な抗-ヒストン抗体をデカントした。ウシ血清アルブミン(20g/L)の溶液をウェルへ添加し(200μL/ウェル)、室温で30分間インキュベーションし、ウェル上の過剰なタンパク質結合部位をブロックした。過剰なウシ血清アルブミン溶液をデカントし、これらのウェルを、洗浄緩衝液(200μL/ウェル、1%Tween 20を含有する0.05Mトリス/HCl緩衝液(pH7.5))により3回洗浄した。試料(10μL/ウェル)及びアッセイ緩衝液(50μL/ウェル、0.9%NaCl、0.05%デオキシコール酸ナトリウム及び1% Nonidet P40置換体を含有する0.05Mトリス/HCl(pH7.5))を、ウェルへ添加し、室温で90分間、穏やかに攪拌しながらインキュベーションした。試料とアッセイ緩衝液の混合物をデカントし、ウェルを、洗浄緩衝液(200μL/ウェル)により3回洗浄した。ビオチン化された抗-5-ヒドロキシメチルシトシン検出抗体の溶液を添加し(50μL/ウェル)、且つ穏やかに攪拌しながら、室温で90分間インキュベーションした。過剰な検出抗体をデカントし、再度ウェルを、洗浄緩衝液(200μL/ウェル)により3回洗浄した。ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体を含有する溶液を添加し(50μL/ウェル)、且つ穏やかに攪拌しながら、室温で30分間インキュベーションした。過剰な複合体をデカントし、ウェルを、洗浄緩衝液(200μL/ウェル)により3回洗浄した。呈色基質溶液(100μL/ウェル、2,2'-アジノビス[3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸]-ジアンモニウム塩)を添加し、穏やかに攪拌しながら、室温で20分間インキュベーションした。ウェルの光学密度(OD)を、標準マイクロタイタープレートリーダーを用い、波長405nmで測定した。ヌクレオソームに会合された5-ヒドロキシメチルシトシン濃度を増加することにより増加する色の用量反応曲線が認められ、5-ヒドロキシメチルシトシン非存在(ウシ胎仔血清)下では、低いバックグラウンドシグナルが認められた。陽性ELISAシグナルは、(i)この捕獲抗体は、試料中のヒストンに結合し、且つ(ii)検出抗体は、DNAの5-ヒドロキシメチルシトシン成分に結合するので、ELISAにより検出された5-ヒドロキシメチルシトシンは、ヒストンタンパク質及びDNAの両方を含有する無傷のヌクレオソーム内に組み込まれていることを指摘している。これらの結果は、図2に示している。
本発明者らは、健常対象20名から採取した血清及び血漿の血液試料の循環無細胞系ヌクレオソーム含量を測定するために、現在の技術の2つのヌクレオソームELISA法を使用した。第一の現在のELISA法(ELISA 1)は、ロッシュ細胞死検出ELISAであり、他方(ELISA 2)は、抗-ヒストン捕獲抗体及び抗-ヒストン-DNA複合体検出抗体を利用するELISAである。両方の現在のヌクレオソームELISA法により検出したヌクレオソームレベルは、正常血漿中において、正常血清中よりもより低かった。ヌクレオソームの血清レベルに関する正常範囲(光学密度単位で表される)を計算し(20名の健常対象の血清の結果の平均±平均の2標準偏差)、ELISA 1に関して0〜4.3 OD単位、及びELISA 2に関して0〜1.4であった。血漿に関する各々の範囲は、0〜0.95及び0〜0.96であった。これらの結果は、図3に示している。
本発明者らは、健常対象13名、並びに胃、大腸、直腸、肺(小細胞癌及び様々な非小細胞癌)、乳房、卵巣、膵臓、前立腺、腎臓の癌及び様々な口腔癌(口腔、口蓋、咽頭及び喉頭)を伴う対象55名から採取したEDTA血漿中の5-メチルシトシンを含有する無細胞系ヌクレオソームを測定した。健常対象由来の13種の試料全て、1種以上の無細胞系ヌクレオソーム型について陽性であった。癌患者由来の55種の試料全て、アッセイした無細胞系ヌクレオソーム型全てについて陽性であった。しかし、癌対象から採取した試料中で検出されたレベルは、健常対象由来の試料において認められたレベルよりもより高く、これらの結果は、健常対象と癌対象を識別することができることを示した。例えば、ヌクレオソームに会合された5-メチルシトシンに関する、平均±該平均の2標準偏差としてのOD項目において算出された正常範囲は、0〜1.41であった。このカットオフ値を使用すると、13種の健常試料は全て陰性であり、且つ55種の癌試料の30種は陽性であり(全般的臨床感受性55%)、これは胃癌試料の38%(8中3)、大腸癌試料の60%(5中3)、直腸癌試料の33%(3中1)、小細胞肺癌試料の33%(6中2)、非小細胞肺癌試料の64%(14中9)、乳癌試料の33%(6中2)、卵巣癌試料の100%(1中1)、膵臓癌試料の100%(1中1)、前立腺癌試料の33%(6中2)、腎臓癌試料の100%(1中1)及び口腔癌試料の60%(5中3)であった。これらの結果は、図17に示している。
本発明者らは、現在の技術の2種のヌクレオソームELISA法を使用し、Holdenriederの方法(*Holdenriederらの文献、2001)に従い、結腸癌対象3名、肺癌対象13名、膵臓癌対象2名、口腔癌対象1名から採取した試料、及び健常対象から生成されたヌクレオソーム試料の循環無細胞系ヌクレオソーム含量を測定した。第一の現在のELISA法(ELISA 1)は、ロッシュ細胞死検出ELISAであり、他方(ELISA 2)は、抗-ヒストン捕獲抗体及び抗-ヒストン-DNA複合体検出抗体を利用するELISAである。
本発明者らは、健常対象3名及び結腸癌患者10名から採取した血清試料において、本発明の方法を試験した。本発明者らは、これらの試料中の5-メチルシトシンを含有するヌクレオソームを測定し、且つ図16に示したように、癌の結果は、健常対象について得られた結果よりも一様に上昇した。
本発明者らは、肺癌及び結腸癌患者から採取したヒトEDTA血漿試料のヌクレオソームに会合された5-メチルシトシンレベルを測定した。検出したレベルを、患者の疾患進行と相関させた。図19に示した結果は、ヌクレオソームに会合された5-メチルシトシンレベルは、サイズ、病期、結節の播種に関する疾患の重篤度と共に増加し、且つヌクレオソームに会合された5-メチルシトシンレベルは、疾患進行の指標として、単独で又は診断パネルの一部として、使用することができることを指摘している。
Claims (17)
- 無細胞系ヌクレオソームと関連したDNA塩基を含む、体液試料中の癌の診断用バイオマーカーであって、該DNA塩基が、ウラシル、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン又は修飾塩基から選択される、前記バイオマーカー。
- 前記無細胞系ヌクレオソームが、モノヌクレオソーム又はオリゴヌクレオソームである、請求項1記載のバイオマーカー。
- 前記無細胞系ヌクレオソームと関連したDNA塩基が、血液試料中で測定される、請求項1又は2記載のバイオマーカー。
- 前記癌が、膀胱、乳房、結腸、頸部、食道、腎臓、大腸、肺、口腔、卵巣、膵臓、前立腺、直腸、皮膚又は胃の癌である、請求項1〜3のいずれか一項記載のバイオマーカー。
- 前記癌が、結腸、肺、口腔又は膵臓の癌である、請求項4記載のバイオマーカー。
- 前記修飾塩基が、5-メチルシトシン、5-ヒドロキシメチルシトシン又は7,8-ジヒドロ-8-オキソ-グアニンから選択される、請求項1〜5のいずれか一項記載のバイオマーカー。
- 体液試料中の、無細胞系ヌクレオソームと関連したDNA塩基の存在を検出する方法であって:
(i)該体液試料を、ヌクレオソームに結合する第一の結合剤と接触させる工程;
(ii)該ヌクレオソーム又は体液試料を、該DNA塩基に結合する第二の結合剤と接触させる工程;
(iii)該第二の結合剤の、該体液試料中のDNA塩基への結合を検出又は定量する工程;並びに
(iv)該体液試料中の、DNA塩基を含有するヌクレオソームの存在の測定値として、当該結合の存在又は程度を使用する工程:
を含み、
該DNA塩基が、ウラシル、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン又は修飾塩基から選択される、前記方法。 - 体液試料中の、無細胞系ヌクレオソームと関連したDNA塩基の存在を検出する方法であって:
(i)該体液試料を、該DNA塩基に結合する第一の結合剤と接触させる工程;
(ii)該ヌクレオソーム又は体液試料を、ヌクレオソームに結合する第二の結合剤と接触させる工程;
(iii)該第二の結合剤の、該体液試料中のヌクレオソームへの結合を検出又は定量する工程;並びに
(iv)該体液試料中の、DNA塩基を含有するヌクレオソームの存在の測定値として、当該結合の存在又は程度を使用する工程:
を含み、該DNA塩基が、ウラシル、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン又は修飾塩基から選択される、前記方法。 - 前記修飾塩基が、5-メチルシトシン、5-ヒドロキシメチルシトシン又は7,8-ジヒドロ-8-オキソ-グアニンから選択される、請求項7又は8記載の方法。
- 前記結合剤が、抗体である、請求項7〜9のいずれか一項記載の方法。
- 前記体液試料が、血液又は血清又は血漿である、請求項7〜10のいずれか一項記載の方法。
- 動物又はヒト対象における疾患状態を検出又は診断するためのデータを取得する方法であって:
(i)該対象の体液中の、DNA塩基を含有するヌクレオソームを検出又は測定する工程;並びに
(ii)該対象の疾患状態を同定するために検出された該ヌクレオソームに会合されたDNA塩基レベルを使用する工程:
を含み、該DNA塩基が、ウラシル、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン又は修飾塩基から選択される、前記方法。 - 医学治療に関する適性について動物又はヒト対象を評価するためのデータを取得するための方法であって:
(i)該対象の体液中の、DNA塩基を含有するヌクレオソームを検出又は測定する工程;並びに
(ii)該対象に関する好適な治療の選択のためのパラメータとして、検出された該ヌクレオソームに会合されたDNA塩基レベルを使用する工程:
を含み、該DNA塩基が、ウラシル、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン又は修飾塩基から選択される、前記方法。 - 動物又はヒト対象の治療をモニタリングするためのデータを取得するための方法であって:
(i)該対象の体液中の、DNA塩基を含有するヌクレオソームを検出又は測定する工程;
(ii)1回以上にわたって該対象の体液中の、DNA塩基を含有するヌクレオソームの該検出又は該測定を反復する工程;並びに
(iii)該対象の状態の何らかの変化に関するパラメータとして、検出された該ヌクレオソームに会合されたDNA塩基レベルの何らかの変化を使用する工程:
を含み、該DNA塩基が、ウラシル、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン又は修飾塩基から選択される、前記方法。 - 前記ヌクレオソームに会合されたDNA塩基が、測定のパネルの一つとして検出又は測定される、請求項12〜14のいずれか一項記載の方法。
- 実際の又は推定される癌、良性腫瘍、炎症疾患、自己免疫疾患、子宮内膜症、感染症、敗血症、脳卒中又は心筋梗塞を伴う対象において使用するための、請求項12〜15のいずれか一項記載の方法。
- 動物又はヒト対象における疾患状態を検出又は診断するためのデータを取得するためのDNA塩基バイオマーカーを同定する方法であって:
(i)該対象の体液中の、DNA塩基を含有するヌクレオソームを検出又は測定する工程;
(ii)健常対象又は対照対象の体液中の、該DNA塩基を含有するヌクレオソームを検出又は測定する工程;並びに
(iii)DNA塩基が、疾患状態のバイオマーカーとして有用であるかどうかを同定するために、罹患対象及び対照対象において検出されたレベル間の差異を使用する工程:
を含み、該DNA塩基が、ウラシル、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン又は修飾塩基から選択される、前記方法。
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