TW202242146A - 肺癌的檢測方法 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及一種生物標記套組用於在一體液樣品中用於診斷和/或監測肺癌（特別是早期肺癌）之方法和用途。生物標記包括存在於游離核小體上的特定組織蛋白修飾、以及癌胚抗原（CEA）。

Description

肺癌的檢測方法
本發明涉及一種使用組合生物標記套組檢測肺癌的體液檢測方法。本發明特別適用於早期肺癌的檢測，因此可以與肺癌篩檢方法如LDCT掃描結合使用，作為一種簡單的確認血液測試來劃入（rule-in）癌症或排除（rule-out）癌症。
癌症是高死亡率的常見疾病。疾病的生物學被理解為涉及從罹癌前狀態發展到第I期、第II期、第III期及最終第IV期癌症的進程。對於多數癌症疾病，死亡率的差異很大，其取決於是在可以找到有效的治療方案的早期局部階段時發現疾病，還是在疾病可能在受影響的器官內擴散或擴散到較難治療之處的晚期階段才發現。晚期階段的癌症症狀多變，取決於癌症種類，症狀包括可見的血便、血尿、咳出血液、陰道出血、不明原因的體重減輕、持續不明原因的腫塊（例如，在乳房內）、消化不良、吞嚥困難、疣或痣的變化以及許多其他可能的症狀。然而，由於這些症狀而診斷出的多數癌症已處於晚期階段而難以治療。多數癌症在早期階段為無症狀或伴隨出現非特異性症狀因而不利於診斷。因此，理想情況下應使用癌症測試及早檢測癌症。
已發展國家中死亡率最高的癌症是肺癌。當疾病仍局限於肺部時，肺癌的五年存活率大於50%，但當疾病擴散到其他器官時，只有5%。不幸的是，大多數肺癌病例在已經轉移時才被診斷出來（57%），僅有16%是在早期被診斷出來的。許多其他癌症疾病也遵循類似的模式，因此，許多國家都有篩檢計劃來識別患有癌症或癌前疾病的個體。肺癌篩檢計劃的一個例子涉及低劑量電腦斷層（Low-Dose Computed Tomography，LDCT） 掃描。
透過觸診身體是否有不適當的腫塊、結節或團塊可檢測到某些癌症病例。任何這樣的腫塊本質上可能是癌性的也可能不是癌性的，可能需要進一步研究以確定腫塊本質上是惡性還是良性的。然而，觸診諸如肺、結腸或胰腺等內臟器官是不可能的，需要其他癌症檢測。大多數癌症檢測可大致分為以下幾類：（i）掃描以顯示體內的結節、團塊或腫塊、（ii）組織切片檢查以尋找目標器官中的異常細胞、或（iii）針對由癌症或相關組織或周圍組織釋放的物質的體液檢測。所有目前的癌症篩檢方法都具有缺點。掃描雖允許肉眼檢測腫塊或結節，但像觸診一樣，通常無法區分惡性結節及無痛或非惡性（例如，纖維性）腫塊，從而導致特異性差及/或過度診斷。組織切片檢查涉及對於多數組織（例如，肺、肝、腎、前列腺）的高侵入性手術或穿刺檢查。血液及其他體液檢測為成本低廉及非侵入性的，但卻很罕見。
最近推薦透過LDCT進行肺癌篩檢作為用於在高風險主體（例如，長期重度吸菸者）中及早發現該疾病的篩檢測試。LDCT使用低劑量X射線來顯示肺部的早期小腫塊或結節。然而，與其他掃描方法一樣，觀察到的任何腫塊本質上可能是也可能不是癌性的，因此必須透過切片組織學確認癌症。據報導，95%的LDCT陽性結果是偽陽性，且LDCT在至少25% 的未患癌症的患者中發現可能是癌症的異常（Lazris et al, 2019）。發現了許多病因不明的結節，這些結節本質上可能是也可能不是惡性的，但對於切片檢查而言太小。偽陽性結果可能導致不必要的侵入性程序，而病因不明的結節可能導致反覆的追蹤掃描以監測腫塊，而進一步反覆暴露於X射線。臨床上並未使用血液測試來檢測肺癌主要是由於缺乏準確性。例如，已經提出了以76%的特異性檢測出21%的肺癌病例的miRNA測試以作為前線篩檢測試，且正在評估以87%的特異性檢測出41%的肺癌病例的EarlyCDT-Lung測試作為主要篩檢測試（Midthun, 2016）。
目前篩檢方法的一個重要失敗點是患者依從性低，因為未能進行篩檢可能導致患者早逝，並增加醫療機構昂貴的晚期癌症治療負擔。LDCT是近期的篩檢發展，但早期經驗指出依從性差，可能低至2%（Lazris et al; 2019）。造成這種情況的原因可能包含需要每3-6個月對病因不明的結節進行重複掃描，使主體暴露於重複的X射線劑量下，這可能會加速原本生長緩慢的結節的癌症發展。美國預防服務工作組（USPSTF）已確定需要生物標記以準確地辨別在LDCT掃描中發現的良性及惡性結節（Moyer, 2014）。目前所有的癌症篩檢方法均具有準確性低、過度診斷、成本高昂、高度侵入性、暴露於X射線及患者依從性低的缺點。
為了滿足對簡單例行性癌症血液測試的需求，已對許多血源性生物標記進行研究以作為潛在癌症檢測方法，包含用於CRC的癌胚抗原（carcinoembryonic antigen, CEA）、用於肝癌的α-胎兒蛋白（alpha-fetoprotein, AFP）、用於卵巢癌的CA125、用於胰腺癌的CA19-9、用於乳癌的CA15-3及用於前列腺癌的PSA。然而，它們的臨床準確性對於例行性診斷使用而言太低，並被認為更適合用於監測患者。
此領域的工作人員還研究了許多其他用於癌症檢測的生物標記，包含循環游離核小體本身（Holdenrieder et al, 2001）及諸如TNFα、白介素-6（IL-6）及白介素-8（IL-8）的發炎性分子（Chadha et al, 2014）。
儘管眾所皆知，在多種癌症疾病下，游離核小體本身的循環含量可能會升高，但游離核小體的測量尚未在臨床上用於檢測癌症或用於任何其他臨床目的（Holdenrieder et al, 2001）。在臨床用途中游離核小體本身的測量的主要缺點在於升高量為細胞死亡的非特異性指標，並據報導存在包含婦科疾病、自體免疫性疾病、發炎性疾病、中風、心臟病、敗血症、移植物抗宿主疾病的創傷及後續燒傷（graft vs host disease trauma and following burns）、手術或運動後的多種疾病（Holdenrieder et al, 2005和Holdenrieder and Stieber, 2009）。因此，核小體本身的升高量的測量被認為是過於非特異性的疾病指標，而無法在腫瘤學中使用。
還研究了包含特定表觀遺傳訊號的循環游離核小體以作為癌症的標記，該特定表觀遺傳訊號包含特定的轉譯後修飾、組織蛋白同功異形體、修飾核苷酸及非組織蛋白染色質蛋白（在WO2005019826、WO2013030577、WO2013030579及WO2013084002中引用）。
儘管最近取得了進展，但在癌症篩檢期間例行性使用的血液檢測方法卻很少。需要開發非侵入性血液檢測，用於各癌症之癌症診斷以劃入或排除癌症，將之作為有症狀患者的潛在診斷，或作為其他癌症檢測方法的輔助手段。
根據本發明之第一態樣，提供了一種生物標記套組用於在一體液樣品中診斷及/或監測肺癌之用途，其中，該生物標記包括H3K27Me3、H3K36Me3和癌胚抗原（CEA）。
根據本發明之另一態樣，提供了一種診斷一患者中肺癌之方法，包括： 檢測或測量取自該患者的一體液樣品中H3K27Me3、H3K36Me3和CEA的含量；和 使用在該體液樣品中檢測到的含量來確定該患者是否患有肺癌。
根據本發明之另一態樣，提供了一種評估一患者是否需要進一步檢測肺癌的方法，包括： 檢測或測量取自該患者的一體液樣品中H3K27Me3、H3K36Me3和CEA的含量；和 使用在該體液樣品中檢測到的含量來確定該患者是否需要進一步檢測肺癌。
根據本發明之另一態樣，提供了一種治療一患者中肺癌之方法，包括： （i） 檢測或測量取自該患者之一體液樣品中H3K27Me3、H3K36Me3和CEA的含量； （ii） 使用在該體液樣品中檢測到的含量來確定該患者是否患有肺癌；和 （iii） 如果在步驟（ii）中確定該患者患有肺癌，則對該患者進行治療。
根據本發明之另一態樣，提供了一種試劑盒，包括檢測H3K27Me3、H3K36Me3和CEA之試劑。
低劑量電腦斷層掃描（LDCT）是被廣泛接受的用於篩檢肺癌高危險個體的標準。然而，LDCT 有幾個侷限，包括檢出非惡性結節的高盛行率導致過度診斷、累積輻射劑量的潛在危害以及對建議追蹤的依從性差。因此，一種新穎的基於血液的檢測可以提供一種簡單的追蹤確認方法，以幫助區分肺癌和非惡性結節。患者將受益於用於劃入癌症或排除癌症的血液檢測中的其中一種或全部。
劃入測試提供了一個可以識別那些癌症可能性高的患者的結果。對於透過LDCT發現病因不明肺結節的患者，這將確定結節為惡性的患者。因此，良好的劃入測試的特徵包括低偽陽性率，以提供結節本質上是癌性的信賴度。就接受者操作特徵（Receiver Operating Characteristic，ROC）曲線而言，這對應於那些在ROC曲線左下角以非常高的臨床特異性被確定為癌症陽性的患者，如圖1所示（即，那些被確定為患有癌症的患者，而未在任何沒有癌症的患者中錯誤地診斷出癌症）。
排除測試提供了識別那些癌症可能性低的患者的結果。對於透過LDCT發現病因不明的肺結節的患者，這將識別出具有結節但極不可能是癌症的患者，因此不需要治療或積極的侵入性檢測。因此，直到下一次預定的篩檢測試，這些患者可能會接受較少的追蹤或者出院。因此，良好排除測試的特徵包括低偽陰性率，以提供結節本質上不是癌性的信賴度。就ROC曲線而言，這對應於那些在ROC曲線右上角以非常高的臨床敏感性被確定為癌症陰性的患者，如圖1所示（即，那些被確定為沒有癌症但沒有遺漏任何具有癌症的患者）。
根據本發明之第一態樣，提供了一種生物標記套組用於在一體液樣品中診斷及/或監測肺癌之用途，其中，該生物標記包括H3K27Me3、H3K36Me3和癌胚抗原（CEA）。
本文提供的數據顯示本發明的生物標記套組能夠區分患有肺癌的患者與患有良性肺結節的患者。在LDCT篩檢期間檢測到肺結節後，從被轉診進行CT掃描的患者獲得血液樣品，並針對生物標記套組進行測試。從套組得到的結果能夠排除32%的非惡性結節患者的癌症，沒有早期肺癌（即，0、I 和 II 期）。
LDCT具有非常高的臨床敏感性，可以檢測出大多數肺癌。LDCT的主要問題是對於區分小的惡性腫瘤和非惡性結節的不佳臨床特異性，其導致不必要的切片檢查或重複掃描。因此，驗血將適用於：識別惡性結節；幫助選擇治療方法（即，是否需要手術）；並幫助消除重複/後續掃描的輻射暴露頻率。
生物標記套組包括組織蛋白轉譯後修飾：H3K27Me3（即在第27位點離胺酸殘基處的三甲基化組織蛋白H3）和H3K36Me3（即第36位點離胺酸殘基處的三甲基化組織蛋白H3）。因此，根據本發明的一個態樣，提供了一種生物標記套組用於在一體液樣品中診斷及/或監測肺癌之用途，其中，該生物標記包括H3K27Me3和H3K36Me3。該套組還結合了癌胚抗原（CEA）的檢測，CEA以前是一種與結腸直腸癌相關的血源性生物標記。因此，在另一實施例中，套組另外包含CEA。
核小體是染色質結構的基本單位，由八個高度守恆的核心組織蛋白（包括各一對的組織蛋白H2A、H2B、H3及H4）的蛋白質複合物所組成。此複合物周圍包裹大約146個鹼基對的DNA。另一組織蛋白H1或H5充當連接子，並參與染色質的壓實。DNA以通常被稱為類似於「串珠」的結構纏繞在連續的核小體上，而此舉形成開放或真染色質的基本結構。在壓實或異染色質中，此串線被纏繞及超級纏繞成封閉且複雜的結構（Herranz and Esteller （2007））。
在一實施例中，該套組包含一或多種額外的生物標記。在另一實施例中，額外的生物標記是C-反應蛋白（CRP）。先前已測量CRP含量以檢測體內炎症的存在，例如由於感染、心血管疾病或慢性發炎疾病，如類風濕性關節炎或紅斑性狼瘡。將CRP添加到生物標記套組增加了檢測肺癌的檢測（即劃入檢測）特異性，尤其是在吸煙患者中。
額外的生物標記還可以包括游離核小體本身和游離核小體的一或多種表觀遺傳特徵。在檢測體液樣品時提及到的「核小體」可能是指「游離核小體」。將意識的是，貫穿本文使用的術語「游離核小體」旨在包含任何游離染色質片段，其包含一或多個核小體。本文所指的游離核小體的表觀遺傳訊號結構/特徵可包括但不限於一或多種組織蛋白轉譯後修飾、組織蛋白同功異形體/變體、修飾的核苷酸及/或與核小體結合的蛋白質以作為核小體-蛋白質加成物。提及到的「核小體本身」是指樣品中存在的總核小體含量或濃度，與核小體可能包含或不包含的任何表觀遺傳特徵無關。此種類型的測定法也通常稱為「核小體測定法」或「總核小體測定法」且通常涉及檢測所有核小體共有的組織蛋白，諸如組織蛋白H4或組織蛋白H3。因此，於一實施例中，透過檢測核心組織蛋白（例如組織蛋白H3）以測量核小體本身。如本文所述，組織蛋白形成稱為核小體的結構單元，其用於將DNA包裝在真核細胞中。於一實施例中，組織蛋白為核心組織蛋白，諸如H2A、H2B、H3或H4。如先前報導的WO2016067029（透過引用併入本文），特定組織蛋白變體，諸如組織蛋白H3.1、H3.2或H3t，可用於分離源自腫瘤細胞的游離核小體。因此，可檢測到腫瘤來源的游離核小體的含量。
總游離核小體或核小體本身也可透過定量其DNA片段含量來測量。血液中的循環游離DNA（ccfDNA）包括長度小於200個鹼基對的DNA片段，其以染色質片段且特別是核小體的形式循環。已顯示使用PicoGreen核酸染色法對ccfDNA進行的血液測量與游離核小體的ELISA測量有95%的相關性（Bjorkman et al; 2003）。因此，可以將ccfDNA的測量視為等同於或替代了總核小體或總染色質片段含量的測量。用於ccfDNA的定量以作為核小體的替代測量的典型方法包含但不限於使用核酸染色（例如，PicoGreen、SYBR Green、SYBER Gold、噁唑黃及噻唑橙）的定量或透過聚合酶鏈反應（PCR）方法用於放大且測量單一複製基因序列的重複DNA序列或其他方法。因此，於一實施例中，游離染色質片段透過檢測ccfDNA測量（或定量）。於再一實施例中，使用核酸染色測量ccfDNA。於再一實施例中，ccfDNA透過PCR測量。此外，依據本發明的再一態樣，提供一種生物標記套組用於在體液樣品中診斷及/或監測癌症的用途，其中該生物標記包括ccfDNA的測量。
可透過酵素免疫測定法（ELISA）檢測單核小體及寡核小體，並且已報導了幾種方法（Salgame et al,1997；Holdenrieder et al, 2001；van Nieuwenhuijze et al, 2003；WO2005019826；WO2013030577；WO2013030579；及WO2013084002，所有這些都透過引用併入本文）。這些測定法通常使用作為捕獲抗體及檢測抗體（依據要檢測的部分而有所不同）的抗組織蛋白抗體（例如，抗H2B、抗H3或抗H1、H2A、H2B、H3及H4）或作為捕獲抗體的抗組織蛋白抗體及作為檢測抗體的抗DNA抗體。於一實施例中，抗組織蛋白抗體包括抗H3抗體或抗H1抗體。
循環核小體不是蛋白質核苷酸複合物的均質群。相反地，它們是染色質片段的異質群，該染色質片段起源於細胞死亡時對染色質的消化並包含大量表觀遺傳結構，表觀遺傳結構包含特定組織蛋白同功異形體（或變體）、轉譯後組織蛋白修飾、核苷酸或修飾的核苷酸及蛋白質加成物。本領域技術人員將了解，核小體含量的升高將與某些含有特定表觀遺傳訊號的循環核小體子群的升高相關，其包含包括特定組織蛋白同功異形體（或變體）、包括特定轉譯後組織蛋白修飾、包括特定的核苷酸或修飾核苷酸以及包括特定蛋白質加成物的核小體。這些類型的染色質片段的測定法為本領域眾所皆知的（例如，參見WO2005019826、WO2013030579、WO2013030578、WO2013084002，其透過引用併入本文）。
於一實施例中，表觀遺傳特徵是選自組織蛋白轉譯後修飾、組織蛋白同功異形體、修飾核苷酸及/或與核小體結合的蛋白質（即作為核小體-蛋白質加成物）。應當理解的是，術語「表觀遺傳訊號結構」及「表觀遺傳特徵」在本文中可互換使用，是指可以檢測到的核小體的特定特徵。
於一實施例中，游離核小體包括組織蛋白同功異形體。作為生物標記套組的一部份所測量的核小體部分（moiety）可為含有一或多種特定或指定組織蛋白同功異形體的循環游離核小體。許多組織蛋白異形體是本領域眾所皆知的。大量的組織蛋白同功異形體的核苷酸序列可在例如國家人類基因組研究所NHGRI組織蛋白數據庫（Mariño-Ramírez, L.、Levine, K.M.、Morales, M.、Zhang, S.、Moreland, R.T.、Baxevanis, A.D.、以及Landsman, D. 組織蛋白資料庫：組織蛋白及組織蛋白折疊蛋白質 資料庫 Vol.2011）、GenBank（NIH遺傳序列）資料庫、EMBL核苷酸序列資料庫及日本的DNA資料銀行（DDBJ）中為公開可用的。於一較佳實施例中，游離核小體包括組織蛋白H3的組織蛋白同功異形體，例如選自H3.1、H3.2及H3t的組織蛋白同功異形體。
於另一實施例中，游離核小體包括一或多種特定或指定轉譯後組織蛋白修飾。核小體的結構可能因組織蛋白的轉譯後修飾（PTM）而異。組織蛋白的PTM通常發生在核心組織蛋白的尾部，而常見的修飾包含離胺酸殘基的乙醯化、甲基化或泛素化以及精胺酸殘基的甲基化及絲胺酸殘基的磷酸化等。許多組織蛋白修飾是本領域眾所皆知的，且數量隨著識別出新的修飾而增加（Zhao and Garcia, 2015）。
於一實施例中，檢測到一組或一類相關的組織蛋白（轉譯後）修飾（而非單一修飾）。此實施例的典型實例，但不限於，將涉及使用一種抗體或其他選擇性結合劑直接與核小體結合以及一種抗體或其他選擇性結合劑直接與所討論的組織蛋白修飾組結合的2位點免疫測定法。直接與組織蛋白修飾組結合的這類抗體的實例將包含（出於說明而非限制的目的）：抗泛乙醯化（anti-pan-acetylation）抗體（例如，泛乙醯H4抗體）、抗瓜胺酸化（anti-citrullination）抗體或抗泛素化（anti-ubiquitin）抗體。
於一實施例中，游離核小體包括一或多種DNA修飾（即修飾核苷酸）。除了透過核小體組織蛋白同功異形體及組織蛋白轉譯後修飾組成物介導的表觀遺傳訊號外，核小體的核苷酸及修飾核苷酸組成物也不同。總體DNA低甲基化是癌細胞的標誌，而某些核小體可能比其他核小體包括更多的5-甲基胞嘧啶殘基（或5-羥甲基胞嘧啶殘基或其他核苷酸或修飾核苷酸）。例如，可以在基因組中的CpG島上檢測到5-羥甲基化。於一實施例中，DNA的修飾選自5-甲基胞嘧啶或5-羥甲基胞嘧啶。
於另一實施例中，游離核小體包括蛋白質加成物，即核小體及與核小體或染色質片段加成的另一非組織蛋白。這樣的加成物可以包含任何含有或包含DNA結合結構域或核小體結合域或組織蛋白結合域的蛋白質。實例包含轉錄因子、結構染色質蛋白、CpG 甲基-CpG結合域蛋白、高遷移率族蛋白（例如，HMGB1）、諸如組織蛋白乙醯基轉移酶、組織蛋白甲基轉移酶、組織蛋白脫乙醯基酶、DNA甲基轉移酶、PARP（聚ADP核糖聚合酶）結合劑等的表觀遺傳酶。
於一實施例中，加成至核小體上的蛋白質（因此可用作生物標記）是選自轉錄因子、高遷移率族蛋白質或染色質修飾酶。提及到的「轉錄因子」是指結合DNA並透過促進（即活化子）或抑制（抑制子）轉錄來調控基因表達的蛋白質。轉錄因子含有一或多個DNA結合域（DBD），其附著在與他們調控的基因相鄰的特定DNA序列上。本文所述的所有循環核小體和核小體部分、類型或亞組可用於本發明。
本文提供的數據發現，含有感興趣的組織蛋白標記的游離核小體的比例的確定能夠提高所請之生物標記套組的鑑別能力，特別是對於早期肺癌。因此，於一實施例中，生物標記H3K27Me3和H3K36Me3被測量為樣品中游離核小體或其組分的含量的比例。游離核小體及其組分係如上文所定義。特別地，H3K27Me3和H3K36Me3可測量為樣品中含有組織蛋白H3變體（例如組織蛋白H3.1）的游離核小體含量的比例。
樣品可為取自主體的任何生物流體（或體液）樣品，包含但不限於，腦脊髓液（CSF）、全血、血清、血漿、經血、子宮內膜液、尿液、唾液、或其他體液（糞便、淚液、滑液、痰）、呼吸（例如，凝結的呼吸）、或其萃取物或純化物或其稀釋物。生物樣品還包含來自活體或驗屍的標本。樣品可例如在適當稀釋或濃縮的情況下製備，並以常規方式儲存。應當理解的是，本發明的方法及用途在從患者獲得的血液、血清或血漿樣品中發現特定用途。於一實施例中，樣品為血液或血漿樣品。於再一實施例中，樣品為血清樣品。於再一實施例中，血清及血漿樣品均用於測定法套組中不同部分的測量。
於一實施例中，生物標記用於診斷癌症的階段。癌症可分為第0期、第I期、第II期、第III期及第IV期。各期的定義隨不同癌症疾病而變化，並且是本領域眾所皆知的。通常，將第I期歸類為癌症較小且局限於起源組織內。第II期被歸類為癌症已長大且超出其起源處而進入器官內的周圍組織或附近的淋巴結。第III期被歸類為癌症已經生長到超過起源器官以外的附近組織，但尚未擴散到身體其他較遠的部分。第IV期被歸類為癌症已擴散到一或以上個身體的遠處，諸如肝臟或肺部。早期癌症通常包括第0、I和II期。晚期癌症通常包括第III期和第IV期。
於一實施例中，癌症為第I期（例如，第IA期或第IB期）、第II期（例如，第IIA期或第IIB期）、第III期（例如，第IIIA期或第IIIB期）或第IV期（例如，第IVA期或第IVB期）癌症。本發明可用於檢測早期癌症，特別是第I期及第II期。因此，於一實施例中，癌症為第I期、第II期、或第III期。於再一實施例中，癌症為第I期或第II期。於一替代實施例中，癌症為第II期或第III期。本發明還可用於檢測晚期癌症，特別是第III期及第IV期。因此，於一實施例中，癌症為第III期或第IV期。於再一實施例中，癌症為第IV期。
根據本發明的再一態樣，提供了H3K27Me3、H3K36Me3和CEA結合劑在製造用於在體液樣品中診斷和/或監測肺癌的試劑盒。
診斷方法
根據本發明的另一態樣，提供了一種診斷一患者中肺癌之方法，包括： 檢測或測量取自該患者的一體液樣品中H3K27Me3、H3K36Me3和CEA；和 使用在該體液樣品中檢測到的含量來確定該患者是否患有肺癌。
於另一態樣中，實施本發明的方法以辨別一患有肺癌的高風險並因此需要進一步檢測（即進一步的肺癌研究）的主體。進一步的檢測可能涉及切片檢查和一或多種內視鏡或掃描方法（例如 LDCT）。
除了用作獨立測試之外，癌症劃入或排除血液測試可用作為其他篩檢方式的輔助方法，包括例如用於LDCT陽性人員。LDCT陽性患者的肺部有腫塊或結節，但結節可能不是惡性的，LDCT 的特異性約為 60%。
於一實施例中，肺癌是早期肺癌（即第0、I或II期）。於一替代性實施例中，肺癌是晚期肺癌（即第III或IV期）。
於一實施例中，患者患有肺結節。這可能已被辨識出來，例如，透過LDCT掃描。
於一實施例中，該方法還包括確定患者的至少一種臨床參數。此參數可用於結果的解釋。臨床參數可包含任何相關的臨床資訊，例如但不限於，性別、體重、體重指數（BMI）、吸菸狀態及飲食習慣。因此，於一實施例中，臨床參數是選自由：吸菸狀態、肺癌家族史、年齡、性別和體重指數（BMI） 所組成之群組。於再一實施例中，臨床參數是選自由：吸菸狀態、肺癌家族史所組成之群組。
於一實施例中，使用個體測定法臨界值量，且如果個體套組測定法結果高於（或低於，如果適用的話）所有或最小數量的套組測定法（例如兩個之一、兩個中的兩個、三個中的兩個等）的測定法臨界值量，則該患者在該套組測試中被認為是陽性的。於本發明一實施例中，採用決策樹模型或算法來分析結果。
本領域技術人員將清楚的是，本文所揭示的生物標記的任何組合可以用於檢測癌症的套組及算法中，並且可以將其他標記添加到包含這些標記的套組中。
治療方法
根據本發明的再一態樣，提供了一種治療一患者中肺癌之方法，包括： （i） 檢測或測量取自該患者之一體液樣品中H3K27Me3、H3K36Me3和CEA； （ii） 使用在該體液樣品中檢測到的含量來確定該患者是否患有肺癌；和 （iii） 如果在步驟（ii）中確定該患者患有肺癌，則對該患者進行治療。
於一實施例中，該方法還包括對主體執行一或多種掃描方法（例如，在步驟（i）或（iii）之前）。舉例而言，掃描方法可為LDCT。
可用於肺癌的治療包括手術（包括切片檢查）、放射療法（包括近程放射療法）、激素療法、免疫療法以及用於化學療法的多種藥物治療。於一實施例中，所施用的治療是選自：手術、放射療法、激素療法、免疫療法和/或化學療法。
根據本發明之另一態樣，提供了一種治療肺癌的方法，包括使用本發明的套組測試辨識需要肺癌治療的患者並提供所述治療，其中該套組測試包括用於在來自患者體液樣品中檢測H3K27Me3、H3K36Me3和CEA的試劑。
於一實施例中，如果患者與對照組相比具有升高的含量，則患者處於肺癌的高風險中。
於一實施例中，對組包括健康主體、未罹病的主體及/或沒有癌症的主體。於一實施例中，該方法包括將從主體取得的體液樣品中存在的生物標記的量與從正常主體取得的體液樣品中存在的生物標記的量進行比較。應當理解的是，「正常」主體是指健康/未罹病的主體。
於一實施例中，對照組包括患有非癌性疾病的主體。本發明的方法能夠區分患有癌症的主體和患有非惡性結節的主體。因此，於一態樣中，診斷包括肺癌患者與非惡性（即良性）結節患者的鑑別診斷。
患者評估方法
本發明特別適用於評估患者是否需要進一步調查癌症（例如診斷和/或識別器官位置）。此類程序，包括LDCT掃描、其他掃描和切片檢查，具有侵入性或潛在危險，並且對醫療保健提供者而言成本相對較高。因此，有必要減少送去進行不必要檢查的患者人數。舉例而言，本發明此態樣將用於評估LDCT陽性的人是否需要切片檢查。因此，根據本發明的另一態樣，提供了一種評估患者是否需要進一步檢測肺癌的方法，包括： 檢測或測量取自患者的體液樣品中H3K27Me3、H3K36Me3和CEA的含量；和 使用在體液樣品中檢測到的含量來確定患者是否需要進一步檢測肺癌。
於一實施例中，對肺癌的進一步測試是肺切片檢查。
於一實施例中，患者患有肺結節。這可能已被辨識出來，例如，透過LDCT掃描。
根據本發明的另一態樣，提供了一種識別需要進行LDCT掃描的患者的方法，該方法包括將從患者獲得的體液樣品應用於本文定義的套組測試，並使用從套組測試獲得的結果以確定患者是否需要掃描。
於一實施例中，本文所描述的方法在多種情況下重複進行。此實施例提供了允許在一段時間內監測檢測結果的優點。這樣的安排將提供監測或評估疾病狀態的治療功效的益處。本發明的此類監測方法可用於監測發作、進程、穩定、改善、復發及/或緩解。
因此，本發明還提供了一種監測疑似患有這種疾病的主體的疾病狀態的治療功效的方法，包括檢測及/或定量存在於來自該主體的生物樣品中的生物標記（例如，本文所述的生物標記套組）。於監測方法中，可兩次或多次採集樣品。該方法可進一步包括將測試樣品中存在的生物標記的量與一或多對照組進行比較，及/或與較早（例如，在開始治療之前）從相同測試主體取得的一或多個先前的測試樣品進行比較，及/或與在較早治療階段從相同測試主體採集的一或多個先前的測試樣品進行比較。該方法可以包括檢測在不同情況下採集的測試樣品中生物標記的性質或量的變化。
因此，根據本發明之另一態樣，提供了一種用於監測對人或動物主體的疾病狀態的治療效果的方法，包括： （a） 定量本文定義的生物標記套組；和 （b） 將測試樣品中的套組結果與一或多對照及/或一或多早些時間從相同測試主體採集的測試樣品的結果進行比較。
相對於較早取自相同測試主體的先前測試樣品中的量，測試樣品中生物標記結果的改變可以指出該療法對疾病或疑似疾病的有益效果（例如，穩定或改善）。此外，一旦治療完成，就可以週期性地重複本發明的方法，以監測疾病的復發。
監測治療功效的方法可用於監測現有療法及新療法在人類主體及非人類動物（例如在動物模型中）的療效。這些監測方法可以納入新藥物質及物質組合的篩選之中。
於再一實施例中，由快速作用療法而引起的更快速變化的監測可以以小時或天的較短間隔進行。
試劑盒和套組測試
本文所述的標記組合可用於製備試劑盒或套組測試，特別是用於肺癌的診斷及/或疑似肺癌患者的監測。
因此，根據本發明之另一態樣，提供了一種試劑盒，其包含檢測H3K27Me3、H3K36Me3和CEA含量的試劑。本文所述的試劑盒可用於肺癌的診斷。
試劑盒可以包含用於一種或多種如本文所述的另外的生物標記的試劑。例如，於一實施例中，該試劑盒另外包含檢測CRP含量的試劑。
根據本發明之另一態樣，提供了本文定義的試劑盒用於鑑定需要肺癌治療的患者的用途。
根據本發明之另一態樣，提供了本文定義的試劑盒用於監測患者肺癌進展（例如腫瘤的進一步生長，或進展到癌症的不同階段）的用途。該態樣的實施例包括用於在觀察性等待、主動監測和監測手術後或其他治療復發中檢測疾病進展。
根據本發明的另一態樣，提供了本文定義的試劑盒用於評估患者中肺癌治療的有效性的用途。
根據本發明的另一態樣，提供了本文定義的試劑盒在選擇肺癌患者的治療中的用途。
於其他實施例中，試劑盒可包括檢測總核小體含量及/或H1-核小體含量的試劑及/或可以包括其他核小體測量，例如核小體的表觀遺傳特徵（例如組織蛋白H3.1含量）。
測量方法
於一實施例中，將檢測到的生物標記（即H3K27Me3、H3K36Me3和CEA，選擇性地包括CRP）的含量或濃度與對照組進行比較。對於本領域技術人員將清楚的是，可以在多種基礎上選擇對照組主體，其可以包含例如已知沒有疾病的主體或可以是患有不同疾病的主體（例如鑑別診斷調查）。「對照組」可包括健康主體、未罹病主體及/或沒有癌症的主體。對照組也可以是患有不同癌症階段的主體，例如第I期、第II期、第III期或第IV期癌症。與對照組的比較在診斷領域是眾所皆知的。
應當理解的是，沒有必要在每種情況下都測量健康/非罹病對照以進行比較，因為一旦建立了「正常範圍」，就可以將其用作所有後續測試的基準。可以透過從多個沒有癌症的對照組主體取得樣品並測試生物標記的含量來建立正常範圍。然後可以檢查疑似患有癌症的主體的結果（即生物標記含量），以查看是否落在各自的正常範圍之內或之外。使用「正常範圍」是檢測疾病的標準做法。
如果判斷主體沒有癌症，則本發明仍可以用於監測疾病進程的目的。例如，如果用途包括來自被確定未罹患癌症的主體的血液、血清或血漿樣品，則可以在另一時間點重複進行生物標記量的測量，以確定生物標記量是否已經改變。
提及到的「主體」或「患者」在本文中可互換地使用。於一實施例中，患者是人類患者。於一實施例中，患者是（非人類）動物。本文所述的用途、套組及方法較佳可在體外進行。
於一實施例中，套組（即H3K27Me3、H3K36Me3和CEA，選擇性地包括CRP）的檢測或測量包括免疫測定、免疫化學、質譜、色譜、染色質免疫沉澱或生物感測器方法。
於一實施例中，檢測或測量包括免疫測定法。於本發明的一較佳實施例中，提供了針對核小體部分的2位點免疫測定法。特別是，此種方法對於將抗組織蛋白修飾或抗組織蛋白變體或抗DNA修飾或抗加成蛋白檢測結合劑結合使用兩種抗核小體結合劑或抗核小體結合劑用於原位測量核小體或摻入核小體的表觀遺傳特徵是較佳的。於本發明的另一實施例中，提供了一種使用標記的抗核小體檢測結合劑與固化的抗組織蛋白修飾或抗組織蛋白變體或抗DNA修飾或抗加成蛋白結合劑結合的2位點免疫測定法。
可以使用一或多試劑（例如合適的結合劑）來檢測或測量生物標記的含量。於一實施例中，該一或多結合劑包含對所需生物標記（例如H3K27Me3、H3K36Me3和CEA）、或生物標記或其組成部分之結構/形狀模擬物具有特異性的配體或結合劑。本文所定義的術語「生物標記」包括生物標記套組中的任何單個生物標記部分或單個生物標記部分的組合。
如本文所述，一或多組織蛋白生物標記的含量可以相對於樣品中游離核小體的含量進行標準化，即，以確定含有感興趣的組織蛋白生物標記的游離核小體的比例。因此，生物標記H3K27Me3和H3K36Me3的含量可以測量為樣品中游離核小體或其組分的含量的比例。特別是，H3K27Me3和H3K36Me3可以測量為樣品中含有組織蛋白H3變體（例如組織蛋白H3.1）的游離核小體含量的比例。
本領域技術人員將清楚的是，就本發明的任何態樣而言，術語「抗體」、「結合劑」或「配體」不限於但旨在包含能夠與特定分子或實體結合的任何結合劑，並可以在本發明的方法中使用任何適合的結合劑。
檢測生物標記的方法是本領域眾所皆知的。於一實施例中，該試劑包括一或多種配體或結合劑。於一實施例中，本發明的配體或結合劑包含天然存在或化學合成的化合物，其能夠與所需的標靶特異性結合。配體或結合劑可以包括能夠與所需標靶特異性結合的胜肽、抗體或其片段、或合成的配體（諸如，塑性抗體、或適體或寡核苷酸）。該抗體可為單株抗體或其片段。應當理解的是，如果使用抗體片段，則其保留結合生物標記的能力，使得可以檢測生物標記（依據本發明）。配體/結合劑可以用可檢測到的標記進行標記，諸如發光、螢光、酶、放射性標記。或者是或另外地，依據本發明的配體可以用親和性標籤進行標記，例如生物素、抗生物素蛋白、鏈親和素或組氨酸（hexa-His）標籤。或者是，可以使用無標記技術（例如ForteBio公司）以判斷配體結合。
提供診斷或監測試劑盒（或套組）以進行本發明的方法。這樣的試劑盒將適當地包括如本文所述之一或多種用於檢測及/或定量依據本發明的生物標記的配體、及/或生物感測器、及/或陣列，可選地連同該試劑盒的使用說明。
本發明的再一態樣是用於檢測疾病狀態的存在的試劑盒，其包括能夠檢測及/或定量一或多種如本文所定義的生物標記的生物感測器。如本文所用，術語「生物感測器」是指能夠檢測生物標記的存在的任何物質。本文描述了生物感測器的實例。生物感測器可以包括如本文所述能夠與生物標記特異性結合的配體結合劑或配體。此種生物感測器可用於檢測及/或定量本發明的生物標記。
適當地，用於檢測本發明的一或多種生物標記的生物感測器將生物分子辨識與適當的手段相結合，以將樣品中生物標記的存在或定量的檢測轉換為訊號。生物感測器可以適用於「替代場所」診斷測試，例如在病房裡、門診部、手術室、家庭、田野及工作場所。用於檢測本發明的一或多種生物標記的生物感測器包含聲學、電漿共振、全像攝影、生物層干涉法（BLI）及微工程感測器。印記辨識元件、薄膜電晶體技術、磁聲諧振器裝置及其他新穎的聲電系統可用於生物感測器中，以檢測本發明的一或多種生物標記。
用於檢測疾病的存在的生物標記是發現延緩或阻止疾病進程的新標靶和藥物分子的重要目標。由於生物標記或生物標記套組的結果是指示疾病及藥物反應，因此該生物標記可用於體外及/或體內測定法中鑑定新型治療化合物。本發明的生物標記及生物標記套組可用於篩選調節生物標記活性的化合物的方法。
因此，於本發明的另一態樣，提供了如前所述的結合劑或配體的用途，該結合劑或配體可以是針對依據本發明的生物標記的胜肽、抗體或其片段或適體或寡核苷酸；或依據本發明的生物感測器、或陣列或試劑盒的用途，以識別能夠促進及/或抑制生物標記產生的物質。
術語「生物標記」是指過程、事件、或情況的特殊生物學或生物學衍生指標。生物標記可用於診斷方法，例如臨床篩檢、預後評估及監測治療結果，鑑定最有可能對特定治療方法、藥物篩選及開發產生反應的主體。生物標記及其用途對於新藥治療的鑑定及藥物治療新標靶的發現是有價值的。
如本文所用的術語「檢測」或「診斷」涵蓋疾病狀態的鑑定、確認及/或表徵。依據本發明的檢測、監測及診斷的方法可用於確認疾病的存在、透過評估發作及進程來監測疾病的發展、或評估疾病的改善或消退。檢測、監測及診斷的方法也可用於評估臨床篩檢、預後、治療的選擇、評估治療效益的方法，即用於藥物篩選及藥物開發。
識別及/或定量可以透過適合於識別來自主體的生物樣品中、或生物樣品的純化物或萃取物或其稀釋液中特定蛋白質的存在及/或量的任何方法來進行。於本發明的方法中，可以透過測量一或多個樣品中標靶的濃度來進行定量。可以用本發明的方法測試的生物樣品包含上文所定義的那些。樣品可以例如在適當稀釋或濃縮的情況下製備，並以常規方式儲存。
生物標記的識別及/或定量可以透過生物標記或其片段（例如，具有C端截短或N端截短的片段）的檢測來進行。片段的長度適當地大於4個胺基酸，例如長度為5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸。特別要注意的是，與組織蛋白尾部相同或相關序列的胜肽是組織蛋白特別有用的片段。
例如，可以使用免疫學方法（例如免疫測定法）來進行檢測及/或定量。免疫測定法包含採用一或多種抗體或其他特異性結合劑直接與本文所定義的生物標記結合的任何方法。免疫測定法包含2位點免疫測定法或採用酶檢測方法（例如，ELISA）的免疫測定法、螢光標記免疫測定法、時間分辨螢光標記免疫測定法、化學發光免疫測定法、免疫比濁測定法、微粒標記免疫測定法及免疫放射測定法以及單位點免疫測定法、試劑有限免疫測定法、競爭性免疫測定方法，該競爭性免疫測定方法包含標記抗原及標記抗體單抗體免疫測定方法，其具有多種標記類型，包含放射性標記、酶標記、螢光標記、時間分辨螢光標記及微粒標記。
於另一實例中，檢測及/或定量可以透過一或多種方法進行，該一或多種方法選自由：SELDI（-TOF）、MALDI（-TOF）、1-D凝膠基分析、2-D凝膠基分析、質譜（MS）、反相（RP）LC、尺寸滲透（凝膠過濾）、離子交換、親和力、HPLC、UPLC及其他LC或LC MS基的技術所組成之群組。適當的LC MS技術包含ICAT®（Applied Biosystems, CA, USA）、或iTRAQ®（Applied Biosystems, CA, USA）。也可以使用液相層析法（例如，高壓液相層析法（HPLC）或低壓液相層析法（LPLC））、薄層層析法、NMR（核磁共振）光譜法。
涉及本發明的一或多種生物標記的識別及/或定量的方法可以在實驗臺儀器上進行，或可以結合到可在非實驗室環境中使用的一次性、診斷或監測平台（例如，在醫師的辦公室或主體床邊）上。用於進行本發明的方法的適合的生物感測器包含具有光學或聲學讀取器的「信用」卡。生物感測器可以被配置為允許將收集到的數據以電子方式傳輸給醫師以進行解釋，並因此可以形成電子醫學的基礎。
用於疾病狀態的生物標記的鑑定允許診斷程序及治療方案的整合。本發明的生物標記的檢測可用於在主體參加臨床試驗之前對其進行篩檢。生物標記提供了指示治療反應、無反應、不良副作用、藥物依從性及達到足夠血清藥物量的手段。生物標記可用於提供藥物不良反應的警告。生物標記可用於個人化治療的開發，因為對反應的評估可用於微調劑量、減少處方藥的數量、減少獲得有效治療的延遲並避免藥物不良反應。因此，透過監測本發明的生物標記，可以精確地調整主體照護以匹配由疾病和對象的藥物基因組學特徵所決定的需求，因此該生物標記可以用於滴定最佳劑量、預測陽性治療反應並識別那些有嚴重副作用的高風險主體。
基於生物標記的測試提供了對「新」主體的第一線評估，並提供了準確及快速診斷的客觀措施，而這是使用當前措施無法實現的。
生物標記監測方法、生物感測器及試劑盒作為主體監測工具也至關重要，以使醫師能夠判斷復發是否是由於疾病惡化而引起的。如果藥理學治療被評估為不適當，則可以恢復治療或增加治療；如果適當的話，可以改變治療方法。由於生物標記對疾病狀態是敏感的，因此它們提供了藥物治療效果的指示。
應當理解的是，本文所描述的實施例可以應用於本發明的所有態樣，即描述的用途的實施例可以等同地應用於所要求保護的方法等。
現在將參考以下的非限制性實施例說明本發明。
實例
實例1
從220名先前透過LDCT掃描的肺癌患者取得EDTA血漿樣品，其中70名患者未發現結節，100 名患者發現結節並透過手術切除的切片檢查組織樣本的組織學證實為惡性，以及50名有結節的患者並透過手術切除的切片檢查組織樣本的組織學發現並確認為非惡性。患者隊列（cohort）的詳細訊息列於表1中。
表1：研究隊列的人口統計
診斷 病患（n） 年齡（中位數, IQR） 性別（M:F） 抽菸者: 非抽菸者 有家族病史: 沒有家族病史
肺癌 100 62 （53-70） 39:61 20:80 32:68
第0-I期 67 60 （50-67） 16:51 4:63 23:44
第II期 3 66 （52-68） 2:1 1:2 1:2
第III期 15 69 （55-73） 10:5 9:6 5:10
第IV期 15 66 （55-71） 11:4 6:9 3:12
非惡性結節 50 58 （50-66） 20:30 9:41 15:35
健康 70 57 （45-66） 23:47 12:58 32:38
將全血樣品收集到EDTA血漿管中，並針對選定的生物標記進行測試。使用市售的免疫測定方法測量CEA和CRP的含量。亦使用夾心免疫測定對H3K27Me3和H3K36Me3進行測量，該方法使用一種結合至所選組織蛋白修飾的抗體以及一種結合至存在於完整核小體中的表位的抗體。
透過邏輯迴歸分析對測定結果進行建模，以訓練具有最高AUC的模型或算法，以比較肺癌患者vs非惡性結節（良性）患者。為了準備適當的診斷測試，建議使用最特異性的測試來確認（即劃入）診斷，並使用最敏感性的測試來確認疾病是不太可能的（即排除）。結果總結在表2中。
表2：結果總結
    劃入（Rule-in） 排除（Rule-out）
模型 AUC 在95%特異性的敏感性 在100%特異性的敏感性 在95%特異性的敏感性 在100%特異性的敏感性
總隊列
LnY = H3K27Me3 + H3K36Me3 + CRP + CEA 0.742* 42% 33% 14% 4.7%
LnY = H3K27Me3 + H3K36Me3 + CEA 0.730* 27.3% 26.1% 18.6% 4.7%
只有抽菸者
LnY = H3K27Me3 + H3K36Me3 + CRP + CEA 0.819* 66.7% 66.7% 12.5% 12.5%
無癌症家族史
LnY = H3K27Me3 + H3K36Me3 + CRP + CEA 0.795* 45.9% 34.4% 32.3% 16,1%
LnY = H3K27Me3 + H3K36Me3 + CEA 0.797* 27.9% 26.2% 45.2% 22.6%
無癌症家族史且為早期肺癌
LnY = H3K27Me3 + H3K36Me3 + CRP + CEA 0.777 32.5% 17.5% 35.5% 22.6%
LnY = H3K27Me3 + H3K36Me3 + CEA 0.772 10% 7.5% 54.8% 32.3%
* AUC與隨機顯著不同。
測試的套組能夠為肺癌提供合適的劃入和排除檢測。特別是，由H3K27Me3 + H3K36Me3 + CEA組成的小組能夠以高特異性（95%）將總隊列中的27%的癌性結節患者劃入癌症。（實例結果呈現於圖2）。因此，該套組有助於確認超過四分之一的需要進一步調查和治療的所有癌症病例。
該套組在沒有肺癌家族史的患者中效果特別好，能夠以100%特異性排除32%的非惡性結節患者為非早期癌症（0、I和II）（接受者操作特徵（ROC）曲線呈現於圖3）。早期癌症更可能出現較小的結節，因此早期癌症的排除試驗在篩檢項目中非常有用，因為 LDCT等掃描方法對區分非惡性結節的特異性較差，導致不必要的切片檢查或重複掃描。因此，其他臨床參數的結果可以與套組一起使用，以進一步提高準確性和實用性。
將CRP添加到套組中提供了一種有用的肺癌檢測（或劃入）方法，特別是在吸煙者（有或沒有肺癌家族史）中。該套組能夠在所有檢測主體中以95%的特異性檢測出42%的癌症。在吸煙者（肺癌篩檢項目中經常針對的群體）中，這一比例增加到66.7%，特異性為 95%。
實例2
我們假設循環中存在的含有特定組織蛋白修飾的核小體的比例可能比存在的這些核小體的簡單數量更具臨床相關性。我們在透過LDCT篩檢的大量患者中檢驗了這一假設。
從702名先前經過LDCT掃描的肺癌患者獲得EDTA血漿樣品，其中77名患者未發現結節，625名患者發現結節並透過手術切除的切片檢查組織樣品的組織學證實為惡性。625例確診肺癌患者中， 55例患有第0期疾病， 397例患有第Ⅰ期，35例患有第Ⅱ期，43例患有第Ⅲ期，68例患有第Ⅳ期，27例患有第分期不明的肺癌。因此，超過70%的患者患有早期第0期或第I期疾病。
使用市售的免疫測定方法測量CEA的含量。使用夾心免疫測定法測量含有組織蛋白變體H3.1以及組織蛋白修飾H3K27Me3和H3K36Me3的核小體，該方法使用一種結合至所選組織蛋白變體或修飾之抗體和一種結合至完整核小體中存在的表位的抗體。
我們使用Logistic迴歸分析計算了ROC曲線和AUC，以區分每種測定中患有和未患癌症的主體。我們還計算了H3K27Me3/H3.1和H3K36Me3/H3.1的比例的ROC曲線和AUC，以及包括表3中所示比例的套組。
表3. 625名患者隊列（以及隊列中各第0、I、II、III、IV期疾病的患者）的測定結果、核小體比例結果和套組計算的AUC
測定、比例或套組 AUC  （AUC第0, I, II, III, IV期）
CEA 65%  （43, 59, 81, 83, 94%）
H3.1 56%  （51, 52, 61, 65, 69%）
H3K27Me3 50%  （47, 47, 56, 53, 63%）
H3K36Me3 49%  （45, 46, 54, 55, 63%）
H3K27Me3/H3.1 68%  （63, 66, 73, 70, 77%）
H3K36Me3/H3.1 64%  （61, 64, 65, 64, 61%）
H3K27Me3/H3.1 + H3K36Me3/H3.1 71%  （65, 69, 74, 73, 76%）
H3K27Me3/H3.1 + CEA 70%  （54, 64, 85, 87, 94%）
H3K36Me3/H3.1 + CEA 71%  （55, 66, 85, 86, 95%）
*CEA // H3K27Me3/H3.1 + H3K36Me3/H3.1 76%  （64, 72, 89, 86, 93%）
* 表示決策樹分析，如果CEA含量異常（＞5ng/ml）或H3K27Me3/H3.1 + H3K36Me3/H3.1的邏輯迴歸結果異常（或兩者都有），則患者被分類為癌症陽性。
使用CEA、H3K27Me3/H3.1和CEA // H3K27Me3/H3.1 + H3K36Me3/H3.1決策樹分析得到的第0、I、II、III和IV期肺癌檢測的ROC曲線亦以圖形方式顯示在圖 4。
表3和圖4中的結果表明， CEA是肺癌的疾病分期依賴性標記（總隊列AUC = 65%），且是第II期和第III期肺癌的良好標記，也是第IV期癌症的優異標記。然而，它對第0期或第I期效果較差。單個H3.1、H3K27Me3和H3K36Me3核小體含量也是分期依賴性標記，但與CEA相比，其區別性較低（總體隊列AUC = 56和50%）。這表示這些含量反映了疾病和疾病的嚴重程度。
然而，我們觀察到，將單個組織蛋白修飾含量H3K27Me3和H3K36Me3標準化為與H3.1核小體含量的比例（即，H3K27Me3/H3.1和H3K36Me3/H3.1），可以提高對癌症的辨別能力，使其達到與CEA（總隊列AUC = 68和64%）相似或更好的程度。比例標記也是分期依賴性的並且反映疾病和疾病嚴重程度。此外，該比例提高了對第0期和第1期癌症的辨別能力。
使用邏輯迴歸分析的兩個比例的組合或任一比例與CEA的組合進一步改善了結果（總隊列 AUC = 70、71和70%）。
決策樹分析中的CEA和兩個比例的組合，其中如果CEA含量異常（＞5ng/ml）或 H3K27Me3/H3.1 + H3K36Me3/H3.1的邏輯迴歸結果異常（或兩者皆是），則將患者分類為癌症陽性，進一步提高了對癌症的區別力（總隊列AUC = 76%），與 CEA 相比，大幅提高對早期癌症的區別力。
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無
圖1：一圖表，顯示出良好的劃入或排除檢測特徵。一個好的劃入檢測至少對一些真正的癌症產生沒有或很少偽陽性的陽性結果。例如，大約25%的癌症病例在「A」處被確認為真陽性，具有100%的特異性（即沒有偽陽性）。一個好的排除檢測至少對一些沒有癌症的人產生沒有或很少偽陰性的陰性結果。例如，大約35%的未患癌症在「B」處被確認為未患癌症，具有100%的敏感性（即沒有偽陰性）。 圖 2：一盒點圖，顯示了220名先前透過LDCT篩檢並經組織切片學確認無肺癌家族史的患者的一組分析結果。測定血漿樣品中包含H3K27Me3 + H3K36Me3 + CEA 的一組分析物。 圖 3：對沒有肺癌家族史的患者進行一組分析的ROC曲線，患者先前透過LDCT篩檢肺結節呈陽性，並在後來的組織切片中發現其為惡性或良性（非惡性）。ROC曲線顯示所有癌性結節vs結節的檢測、早期（0、I、II）癌性結節vs良性結節的檢測以及晚期癌性結節（III、IV）vs良性結節的檢測。該模型能夠以高（95%）特異性劃入27%的癌性結節患者的癌症，並且以100%特異性排除32%的非惡性結節患者為非早期癌症（0、I和II）。 圖4：使用在實施例2中獲得的透過LDCT篩檢肺結節的患者的核小體和CEA測定結果，檢測患有第0、I、II、III或IV期肺癌的主體vs沒有結節的對照主體的ROC曲線。（a） CEA的ROC曲線；（b） H3K27Me3/H3.1比例的ROC曲線；（c） 決策樹分析的ROC曲線，其中，如果CEA含量異常 （＞5ng/ml）或H3K27Me3/H3.1 + H3K36Me3/H3.1 的邏輯回歸結果為異常，則患者被歸類為患有癌症的。
無

Claims (24)

  1. 一種生物標記套組用於在一體液樣品中診斷及/或監測肺癌之用途，其中，該生物標記包括H3K27Me3、H3K36Me3和癌胚抗原（CEA）。
  2. 如請求項1所述之用途，其中，該套組包含一或多額外的生物標記。
  3. 如請求項2所述之用途，其中，該額外的生物標記是C-反應蛋白（CRP）。
  4. 如請求項1至3中任一項所述之用途，其中，該體液樣品是血液、血清或血漿樣品。
  5. 如請求項1至4中任一項所述之用途，其中，肺癌是早期肺癌。
  6. 如請求項1至5中任一項所述之用途，其中H3K27Me3和H3K36Me3被測量為該體液樣品中游離核小體或其組分的含量的比例。
  7. 如請求項6所述之用途，其中H3K27Me3和H3K36Me3被測量為該體液樣品中含有組織蛋白H3.1的游離核小體含量的比例。
  8. 一種診斷一患者中肺癌之方法，包括： 檢測或測量取自該患者的一體液樣品中H3K27Me3、H3K36Me3和CEA的含量；和 使用在該體液樣品中檢測到的含量來確定該患者是否患有肺癌。
  9. 一種評估一患者是否需要進一步檢測肺癌的方法，包括： 檢測或測量取自該患者的一體液樣品中H3K27Me3、H3K36Me3和CEA的含量；和 使用在該體液樣品中檢測到的含量來確定該患者是否需要進一步檢測肺癌。
  10. 如請求項9所述之方法，其中，對肺癌的進一步檢測是肺切片檢查。
  11. 如請求項8至10中任一項所述之方法，其中，肺癌是早期肺癌。
  12. 如請求項8至11中任一項所述之方法，其中，該患者患有肺結節。
  13. 如請求項8至12中任一項所述之方法，其中H3K27Me3和H3K36Me3的含量被測量為該體液樣品中游離核小體或其組分的含量的比例。
  14. 如請求項13所述之方法，其中H3K27Me3和H3K36Me3的含量被測量為該體液樣品中含有組織蛋白H3.1的游離核小體含量的比例。
  15. 如請求項8至14中任一項所述之方法，其還包括檢測或測量C-反應蛋白（CRP）的含量。
  16. 如請求項8至15中任一項所述之方法，其還包括確定該患者的至少一種臨床參數。
  17. 如請求項16所述之方法，其中，該臨床參數是選自：吸煙狀況和肺癌家族史。
  18. 如請求項8至17中任一項所述之方法，其中，將檢測到的H3K27Me3、H3K36Me3和CEA的含量與對照組進行比較。
  19. 根據請求項8至18中任一項所述之方法，其中，該體液樣品是血液、血清或血漿樣品。
  20. 如請求項8至19中任一項所述之方法，其中，該檢測或測量是使用免疫測定法、免疫化學法、質譜法、色譜法、染色質免疫沉澱法或生物感測器法進行的。
  21. 一種治療一患者中肺癌之方法，包括： （i） 檢測或測量取自該患者之一體液樣品中H3K27Me3、H3K36Me3和CEA的含量； （ii） 使用在該體液樣品中檢測到的含量來確定該患者是否患有肺癌；和 （iii） 如果在步驟（ii）中確定該患者患有肺癌，則對該患者進行治療。
  22. 一種試劑盒，包括檢測H3K27Me3、H3K36Me3和CEA之試劑。
  23. 如請求項22所述之試劑盒，用於檢測肺癌。
  24. 如請求項22或23所述之試劑盒，用於一體液樣品中。
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