KR102369544B1

KR102369544B1 - 암 검출을 위한 뉴클레오솜-전사 인자 복합체의 용도

Info

Publication number: KR102369544B1
Application number: KR1020217012412A
Authority: KR
Inventors: 제이콥 빈센트 미칼레프; 조지 레이스-필류
Original assignee: 벨지언 볼리션 에스피알엘
Priority date: 2016-03-22
Filing date: 2017-03-22
Publication date: 2022-03-03
Also published as: JP2019510974A; EP3839513B1; CN109313192A; EP4270007A2; KR102246699B1; EP3839513A1; EP3433616A1; KR20190013707A; CN109313192B; MY187655A; US20200363418A1; ES2951136T3; JP6777757B2; CA3018428A1; EP4270007A3; CA3018428C; WO2017162755A1; AU2017238442A1; EP3433616B1; KR20210049954A

Abstract

본 발명은 대상체에서의 암의 검출 또는 진단을 위한 생물학적 유체 중 바이오마커로서의 조직 특이적 전사 인자-뉴클레오솜 부가물 또는 전사 보조인자-뉴클레오솜 부가물의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 대상체에서 암의 발생 부위를 확인하기 위해 상기 조직 특이적 전사 인자 또는 보조인자 부가물을 사용하는 것에 관한 것이다.

Description

암 검출을 위한 뉴클레오솜-전사 인자 복합체의 용도 {USE OF NUCLEOSOME-TRANSCRIPTION FACTOR COMPLEXES FOR CANCER DETECTION}

본 발명은 최소 침습적 혈액 시험에 의해 암을 검출하는, 특히 원발부위 불명의 전이 암 질환을 갖는 대상체에서 원발 암을 확인하는 방법에 관한 것이다.

폭넓은 범위의 면역검정 혈액 시험이 폭넓은 범위의 임상 필요를 다루기 위해 통상적으로 임상에 사용되고 있다. 몇몇 예시적인 예는 바이러스성 질환, 심근경색, 갑상선 질환, 불임, 부인과 병태, 염증 반응, 면역 상태, 알레르기, 약물 상태 (제약, 안드로겐, 성능 증진 및 기분전환) 및 기타 많은 것을 검출 또는 조사하기 위한 용도를 포함한다. 거대 진단 회사에 의해 제공된 자동화 면역검정 시스템은 수백개의 면역검정 시험의 메뉴를 갖는다. 면역검정 시험의 많은 장점은 그의 극도의 분석 감수성 및 특이성과 이와 조합된 강건성 및 신뢰성; 이와 함께 단지 한 방울의 혈액만이 요구되는 최소 침습적 환자 포맷, 거대 실험실 또는 의사 진료실 또는 가정 사용 포맷에서 및 모두 저비용으로 시험이 수행되도록 하는 극도의 유연성을 포함한다. 이러함에도 불구하고, 전립선암의 경우 전립선 특이적 항원 (PSA) 시험처럼 암 검출을 위해 단지 1개의 면역검정 혈액 시험만이 통상적으로 임상에 사용되고 있다. 다른 전형적인 단백질 암 바이오마커, 예컨대 CA125, CA19.9, CEA (암배아성 항원) 및 AFP (알파-태아단백질)는 암 치료를 모니터링하는데 사용되지만, 그의 불량한 임상 정확도로 인해 암 검출을 위해서는 권장되지 않는다.

순환 종양 세포 검출을 기반으로 하는 비-면역검정 혈액 기반 암 검출 방법이 개발 중이지만, 통상적으로 임상에 사용되지 않는다. 유사하게, 순환 종양 DNA (ctDNA), RNA 또는 다른 순환 핵산에 대한 방법도 개발 중이지만, 이들 또한 광범위하게 임상에 사용되지 않는다. 폭넓게 다양한 순환 핵산 방법이 존재한다. 일부는 암 연관된 ctDNA 서열 돌연변이 또는 암과 연관된 다른 DNA 서열 효과의 검출을 기반으로 한다. 다른 예는 암과 연관된 메틸화 DNA 서열 또는 암과 연관된 마이크로RNA 서열의 검출을 기반으로 하는 방법을 포함한다. DNA 이상은 모든 암 질환의 특징이다. 암 세포의 DNA는 건강한 세포의 DNA와, 점 돌연변이, 메틸화 상태, 전위, 유전자 카피수, 미소위성체 이상 및 DNA 가닥 완전성을 포함하나 이에 제한되지는 않는 많은 면에서 상이하다. 임의의 이들 돌연변이는 ctDNA 시험에 적용가능할 수 있다.

암이 질환의 초기에서 검출되는 경우에, 이것은 현재 분변 시험, 침습적 내시경검사 방법, 침습적 생검 방법, 잠재적으로 위험한 X선 스캐닝 방법, MRI 스캐닝 방법, 자궁경부 도말 시험에 의하거나 또는 증후성으로 인한 것일 가능성이 있다. 이들 방법은 모두 침습성, 불쾌함, 환자 위험, 환자 순응도 및/또는 고비용의 단점을 갖는다. 검출된 경우, 암은 생검시에 제거된 종양 조직의 면역조직화학 (IHC) 시험에 의해 정상적으로 현재 확인 및 진단된다. 암의 조기 검출은 개선된 환자 결과, 및 고가의 후기 병원 체류 및 치료를 피하면서 건강관리 제공자에 대한 재정적 이익으로 이어진다. 불행하게도, 암은 현재 원발 종양의 부위를 넘어서 확산되어 있을 수 있는 때인 질환 발생 후기에 도달할 때까지 종종 비검출된 채로 남아있으며, 치료 옵션은 보다 더 제한적이고, 보다 더 고가이고, 보다 덜 효과적이어서 불량한 환자 결과로 이어진다. 보다 많은 및 보다 우수한 암 혈액 시험에 대한 명백한 미충족 의료 필요가 존재한다.

암으로 진단된 환자에는 원발 암이 발생한 기관을 넘어서 이미 확산된 후기 또는 전이 암이 존재할 수 있다. 많은 경우에 원발 암이 원래 발생한 부위는 명확하지 않으며, 이들 경우는 원발부위 불명의 암종 (CUP) 또는 잠재 종양으로 알려져 있다. 이들 경우에 원발 종양 부위의 확인은 큰 임상 관련성을 갖는데, 이는 암이 신체의 다른 부분으로 확산되더라도 암이 원래 어디에서 발생하였는지에 따라 치료되기 때문이다. 이것은 원발 부위 암종에 표적화되어야 하는 주어진 임의의 표적화 요법에 대해 특히 해당된다. 예를 들어, 원발 폐암이 간으로 확산된 경우에, 그것은 간 전이 또는 속발성을 갖는 폐암이다. 그것은 암 세포가 암성 폐 세포이기 때문에 간암이 아니다.

대상체에 전이 암이 존재하는 많은 경우에서 원발 암의 부위는 명확하다. 그러나, CUP에서 원발 암은 결정될 수 없다. 이것은, 예를 들어 속발성 암은 매우 빨리 성장한 반면에 원발 암은 여전히 작고 스캔 상에 보이지 않기 때문, 또는 원발 암은 아마도 면역 공격 또는 원발 암의 탈피 (예를 들어, 결장직장암은 장 벽으로부터 탈피되어 분변과 함께 신체 밖으로 통과됨)로 인해 소멸되었기 때문을 포함한 수많은 이유로 일어날 수 있다.

현재 전이 질환이 존재하는 환자에서의 원발 종양은 환자 검사, 환자 증상, 스캐닝 및 생검시에 제거된 종양 조직의 면역조직화학 (IHC) 시험에 의해 통상적으로 위치를 찾아낸다. 원발 종양 부위는 조직-특이적 전사 인자의 IHC에 의해 확인 또는 확증될 수 있다.

순환 종양 DNA 분석 또는 다른 바이오마커 방법은 암의 부위를 확인하는 것 없이 대상체에서 원발 암의 존재를 밝혀낼 수 있다. 이것은 대상체가 암을 갖는 것으로 알려지거나 의심되지만 암의 부위를 알지 못하는 CUP와 유사한 상황 (임의의 전이가 존재할 필요는 없는 경우를 제외)으로 이어질 수 있다. 예를 들어, ctDNA 서열 기술을 사용하여 진단된 암은 대상체의 혈액에서 암 연관된 유전자 돌연변이를 확인할 수 있으며 이는 암의 부위를 나타내지 않으면서 암의 존재를 나타낸다. 순환 종양 세포 기술 또는 검출된 종양의 부위를 밝혀낼 수 없는 다른 암 검출 방법에 의한 암의 검출에 대해 유사한 상황이 일어날 수 있다.

인간 신체는 수백 종의 세포 유형을 포함한다. 이들 세포 유형 모두는 동일한 게놈을 함유하지만, 폭넓게 상이한 표현형 및 상이한 신체 내 기능을 함유한다. 이러한 표현형 다양성은 상이한 세포 유형에서의 게놈의 차등 발현으로 인한 것이다. 차등 유전자 발현의 제어는 전적으로 이해되지는 않지만, 기본적인 메카니즘은 진정염색질 또는 이질염색질으로서의 염색질 패킹의 제어, 뉴클레오솜 위치설정 및 뉴클레아제 접근가능 부위의 제어, DNA의 메틸화, 및 주위로 DNA가 감싸져 있는 뉴클레오솜의 히스톤 구조에서의 변화 및 전사 인자 및 전사 보조인자 발현 및 이들이 결합하는 유전자와의 상호작용에서의 변화를 포함한, 유전자와 연관된 수많은 상호연결된 후성적 신호에 의한 유전자 조절을 포함한다.

뉴클레오솜은 염색질 구조의 기본 단위이며, 8종의 고도로 보존된 코어 히스톤 (히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4 각각의 쌍을 포함함)의 단백질 복합체로 이루어진다. 이러한 복합체 주위에는 대략 146개 염기쌍의 DNA가 감싸져 있다. 또 다른 히스톤인 H1 또는 H5는 링커로서 작용하며, 염색질 압착에 관여된다. DNA는 종종 "비드 온 스트링"과 유사한 것으로 언급되는 구조로 연속 뉴클레오솜 주위에 감겨져 있으며, 이것은 개방형 또는 진정염색질의 기본 구조를 형성한다. 압착형 또는 이질염색질에서, 이러한 스트링은 폐쇄형 및 복합 구조로 코일링 및 슈퍼 코일링되어 있다 (Herranz and Esteller, 2007).

성인 인간에서의 정상 세포 전환은 매일 10¹¹개 정도 세포의 세포 분할에 의한 생성 및 주로 아폽토시스에 의한 유사한 수의 사멸을 수반한다. 아폽토시스 과정에서 염색질은 세포로부터 방출되는 모노뉴클레오솜 및 올리고뉴클레오솜을 포함한 단편으로 분해된다. 정상 조건 하에서 이들은 제거되며 건강한 대상체에서 발견되는 순환 뉴클레오솜의 수준은 낮다. 상승된 수준은 많은 암, 자가면역 질환, 염증성 병태, 졸중 및 심근 경색을 포함한 다양한 병태를 갖는 대상체에서 발견된다 (Holdenrieder & Stieber, 2009).

모노뉴클레오솜 및 올리고뉴클레오솜은 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 검출될 수 있으며, 여러 방법이 보고되었다 (Salgame et al., 1997; Holdenrieder et al., 2001; van Nieuwenhuijze et al., 2003). 이들 검정은 전형적으로 항-히스톤 항체 (예를 들어, 항-H2B, 항-H3 또는 항-H1, H2A, H2B, H3 및 H4)를 포획 항체로서 사용하고, 항-DNA 또는 항-H2A-H2B-DNA 복합 항체를 검출 항체로서 사용한다. 실시간 PCR (폴리머라제 연쇄 반응)에 의해 측정시에 순환 무세포 뉴클레오솜 수준에 대한 ELISA 결과와 순환 DNA 수준에 대한 ELISA 결과 사이의 상관 계수는 혈청에서 r=0.531 및 혈장에서 r=0.350인 것으로 보고되었다 (Holdenrieder et al., 2005).

뉴클레오솜 ELISA 방법은 주로 아폽토시스를 검출하는 방법으로서 세포 배양물에서 사용되며 (Salgame et al., 1997; Holdenrieder et al., 2001; van Nieuwenhuijze et al., 2003), 또한 혈청 및 혈장에서 순환 무세포 뉴클레오솜의 측정을 위해 사용된다 (Holdenrieder et al., 2001). 사멸 세포에 의해 순환 내로 방출되는 무세포 혈청 및 혈장 뉴클레오솜 수준은 수많은 상이한 암의 연구에서 잠재적인 바이오마커로서의 그의 용도를 평가하기 위해 ELISA 방법에 의해 측정되었다 (Holdenrieder et al., 2001). 평균 순환 뉴클레오솜 수준은 연구된 대부분의 암에서 높은 것으로 보고되어 있다. 가장 높은 순환 뉴클레오솜 수준은 폐암 대상체에서 관찰되었다. 그러나, 악성 종양을 갖는 대상체는 상당히 가변적인 혈청 뉴클레오솜 농도를 갖는 것으로 보고되어 있으며, 진행성 종양 질환을 갖는 일부 대상체는 건강한 대상체에 대해 측정된 범위 이내의 낮은 순환 뉴클레오솜 수준을 갖는 것으로 발견되었다 (Holdenrieder et al., 2001). 이것, 및 상승된 뉴클레오솜 수준의 다양한 비-암 원인 때문에, 순환 뉴클레오솜 수준은 임상적으로 암의 바이오마커로서 사용되지 않는다 (Holdenrieder and Stieber, 2009).

뉴클레오솜의 구조는 히스톤 단백질의 전사후 변형 (PTM), 및 변이 히스톤 단백질의 포함에 의해 달라질 수 있다. 히스톤 단백질의 PTM은 전형적으로 8종의 코어 히스톤의 꼬리에서 일어나며, 통상적인 변형은 리신 잔기의 아세틸화, 메틸화 또는 유비퀴틴화, 뿐만 아니라 아르기닌 잔기의 메틸화 및 세린 잔기의 인산화를 포함한다. 히스톤 변형은 유전자 발현의 후성적 조절에 수반되는 것으로 공지되어 있다 (Herranz and Esteller, 2007). 뉴클레오솜의 구조는 또한 상이한 유전자 또는 스플라이스 산물이며 상이한 아미노산 서열을 갖는 대안적 히스톤 이소형 또는 변이체의 포함에 의해 달라질 수 있다. 히스톤 변이체는 수많은 패밀리로 분류될 수 있으며, 이는 개별 유형으로 세분된다. 다수의 히스톤 변이체의 뉴클레오티드 서열이 공지되어 있으며, 예를 들어 국립 인간 게놈 연구소 NHGRI 히스톤 데이터베이스 (Marino-Ramirez et al., 2011 및 http://genome.nhgri.nih.gov/histones/complete.shtml), 진뱅크 (NIH 유전자 서열) 데이터베이스, EMBL 뉴클레오티드 서열 데이터베이스 및 일본 DNA 데이터 뱅크 (DDBJ)에서 공중 이용가능하다.

수많은 (대부분 면역조직화학) 연구에서 건강한 세포 및 이환 세포에 존재하는 히스톤 변이체 및 히스톤 변형 패턴은 상이한 것으로 제시되었다 (Herranz and Esteller, 2007). 임상 용도를 위한 면역조직화학 방법의 한 가지 단점은 조직 샘플 수집이 수술 또는 생검을 수반하여 침습적이라는 것이다.

뉴클레오솜 구조 및 위치에 의해 매개되는 후성적 신호전달에 추가로, 세포 내 유전자 발현의 제어는 뉴클레오솜 회합된 DNA의 구조에 대한 변형에 의해, 예를 들어 DNA의 메틸화에 의해 또한 매개된다 (Herranz and Esteller, 2007). DNA는 시토신 뉴클레오티드의 5 위치에서 메틸화되어 5-메틸시토신을 형성할 수 있다는 것이 얼마 동안 관련 기술분야에 공지되었다. 전반적 DNA 저메틸화는 암 세포의 특징이다 (Esteller 2007 및 Hervouet et al., 2010). 전반적 DNA 메틸화는 면역조직화학 기술을 사용하여 세포에서 연구될 수 있다.

핵산 및 히스톤 단백질에 추가로, 염색질은 그의 구성성분 DNA 및/또는 히스톤에 결합된 다수의 비-히스톤 단백질을 포함한다는 것이 수년 동안 공지되었다 (Yoshida and Shimura, 1972). 이들 염색질 회합된 단백질은 폭넓게 다양한 유형을 가지며, 전사 인자, 전사 증진 인자, 전사 억제 인자, 히스톤 변형 효소, DNA 손상 복구 단백질 및 기타 많은 것을 포함한 다양한 기능을 갖는다. 염색질 결합된 단백질의 연구는 대부분 염색질 면역침전 (ChIP) 방법에 의해 수행되었다. 이들 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있지만, 복잡하고, 어려우며, 고가이다.

전형적인 ChIP 방법에서 세포 염색질은 가교되어 모든 단백질 및 핵산 성분이 서로 공유 부착되도록 한다. 이어서, 염색질은 전단되어 모노뉴클레오솜 및 올리고뉴클레오솜의 제제를 형성한다. 관심 단백질에 대한 항체가 전단된 염색질에 첨가되어, 단백질을 함유하는 상기 염색질 단편을 면역침전시킨다. 항체는 통상적으로 고체 상 (예를 들어 플라스틱 비드)에 부착되어 있어 관심 단백질을 함유하는 염색질 복합체의 단리를 용이하게 한다. 이어서, 가교가 반전되고, 프로테이나제를 사용한 소화에 의해 단백질이 제거된다. 염색질 복합체와 회합된 DNA가 단리된 후, PCR에 이어지는 겔 전기영동, DNA 서열분석 (ChIP-Seq) 또는 DNA 마이크로어레이 (칩-상-ChIP)를 포함한 임의의 다양한 기술을 사용하여 분석되어 특정한 단백질 결합과 연관된 DNA 서열, 유전자 또는 유전자좌를 결정한다. 이들 ChIP 방법은 염색질 결합된 히스톤 단백질과 연관된 DNA 서열을 밝혀낸다. 예를 들어 히스톤 연관 검정 (Ricke and Bielinsky, 2005)을 포함한, 비-히스톤 단백질의 히스톤 및 뉴클레오솜과의 회합에 대한 연구를 용이하게 하기 위한 ChIP 방법의 파생물이 개발되었다.

뉴클레오솜-단백질 또는 크로마토솜-단백질 부가물 형태의 비-히스톤 단백질을 함유하는 염색질 단편이 또한 뉴클레오솜-단백질 부가물로서 순환에서 검출되었다. 무세포 뉴클레오솜-단백질 부가물을 검출하기 위한 검정 예는 WO2013/084002에 기재되어 있다.

다른 후성적 조절 메카니즘에 추가로, 차등 유전자 발현은 전사 인자 발현 및 활성에서의 변화에 의해 조절된다. 전사 인자는 발현이 조절될 유전자 또는 유전자들과 연관된 특이적 유전자 서열에 결합하는 DNA 결합 도메인 (DBD)을 함유하는 물질이다. 예를 들어, 안드로겐 수용체 (AR)는 염색체에서 안드로겐 반응 요소 (ARE)로 불리는 특이적 DNA 서열에 결합하는 전사 인자이고, ARE를 함유하거나 그에 의해 조절되는 안드로겐 의존성 유전자의 발현을 상향조절 또는 하향조절한다. 전사 인자가 그의 표적 유전자 서열에 결합하는 경우에 이들은 유전자 발현을 촉진 또는 억제할 수 있다. 일부 전사 인자는 모든 또는 대부분의 조직에서 발현된다. 다른 전사 인자는 상이한 조직에서 차등 발현될 수 있으며, 따라서 보다 조직 특이적이다.

조직 특이적 전사 인자는 특정 원발 암 세포의 세포에서 발생하지만 다른 세포에서는 발생하지 않는 것으로 IHC에 의해 제시되었다. 예를 들어, 전사 인자 CDX2는 위장암 세포, 특히 결장직장암 세포에서 발생하며, 생검 또는 수술시에 제거된 조직에서 IHC에 의해 제시된 그의 존재는 원발 위장암을 확인하는데 사용될 수 있다.

유사하게, 조직 특이적 전사 보조인자가 기재되었으며, 예를 들어 전립선 및 심장 조직에 특이적인 안드로겐 수용체 (AR)에 대한 보조인자인 것으로 보고된 FHL2가 포함된다 (Muller et al.; 2000).

본 발명자들은 본 발명에 이르러 생물학적 샘플에서의 전사 인자-뉴클레오솜 및 전사 보조인자-뉴클레오솜 부가물의 직접적 추정을 위한 간단한 면역검정 방법을 보고한다. 조직 특이적 전사 인자 및/또는 보조인자의 선택에 의해 이 방법은 암을 검출하거나 또는 전이 질환을 갖는 대상체에서 원발 종양의 부위를 결정 또는 확인하기 위한 비-침습적 또는 최소 침습적 혈액 시험으로서 사용될 수 있다. 본 발명자들은 이러한 뉴클레오솜 부가물이 혈청 샘플에서 검출될 수 있으며 이들이 질환에서 바이오마커로서의 용도를 갖는다는 것을 제시하였다.

본 발명의 제1 측면에 따르면 대상체에서의 암의 검출 또는 진단을 위한 생물학적 유체 중 바이오마커로서의 조직 특이적 전사 인자-뉴클레오솜 부가물 또는 전사 보조인자-뉴클레오솜 부가물의 용도가 제공된다.

본 발명의 제2 측면에 따르면 이전에 암으로 진단된 대상체에서의 암의 발생 부위의 확인 또는 진단을 위한 생물학적 유체 중 바이오마커로서의 조직 특이적 전사 인자-뉴클레오솜 부가물 또는 전사 보조인자-뉴클레오솜 부가물의 용도가 제공된다.

본 발명의 추가 측면에 따르면,

(i) 대상체로부터 생물학적 유체 샘플을 수득하는 단계;

(ii) 샘플을 뉴클레오솜 또는 그의 성분에 결합하는 제1 결합제와 접촉시키는 단계;

(iii) 뉴클레오솜 또는 샘플을 뉴클레오솜에 부가된 조직 특이적 전사 인자 또는 보조인자에 결합하는 제2 결합제와 접촉시키는 단계; 및

(iv) 샘플에서 부가된 조직 특이적 전사 인자 또는 보조인자에 대한 상기 제2 결합제의 결합을 검출 또는 정량화하는 단계

를 포함하며,

여기서 뉴클레오솜에 부가된 조직 특이적 전사 인자 또는 보조인자의 존재 또는 수준은 상기 암의 존재 및/또는 발생 부위의 지표로서 사용되는 것인,

대상체에서 암을 검출하고/거나 암의 발생 부위를 결정하는 방법이 제공된다.

본 발명의 추가 측면에 따르면,

(i) 대상체로부터 생물학적 유체 샘플을 수득하는 단계;

(ii) 샘플을 조직 특이적 전사 인자 또는 보조인자에 결합하는 제1 결합제와 접촉시키는 단계;

(iii) 뉴클레오솜 또는 샘플을 뉴클레오솜 또는 그의 성분에 결합하는 제2 결합제와 접촉시키는 단계; 및

(iv) 샘플에서 뉴클레오솜 또는 그의 성분에 대한 상기 제2 결합제의 결합을 검출 또는 정량화하는 단계

를 포함하며,

본 발명의 추가 측면에 따르면,

(i) 본원에 기재된 바와 같은 방법에 정의된 바와 같은 대상체의 생물학적 유체 중 뉴클레오솜에 부가된 조직 특이적 전사 인자 또는 보조인자를 검출 또는 측정하는 단계; 및

(ii) 검출된 뉴클레오솜에 부가된 조직 특이적 전사 인자 또는 보조인자의 유형을 사용하여 대상체에 대한 적합한 치료를 결정하는 단계

를 포함하는, 의학적 치료를 위한 적합성에 대해 동물 또는 인간 대상체를 평가하는 방법이 제공된다.

본 발명의 추가 측면에 따르면,

(i) 본원에 기재된 바와 같은 방법에 정의된 바와 같은 대상체의 생물학적 유체 중 뉴클레오솜에 부가된 조직 특이적 전사 인자 또는 보조인자를 검출 또는 측정하는 단계;

(ii) 대상체의 생물학적 유체 중 뉴클레오솜에 부가된 조직 특이적 전사 인자 또는 보조인자의 검출 또는 측정을 1회 이상 반복하는 단계; 및

(iii) 검출된 뉴클레오솜에 부가된 조직 특이적 전사 인자 또는 보조인자의 수준에서의 임의의 변화를 대상체의 상태에서의 임의의 변화에 대한 파라미터로서 사용하는 단계

를 포함하는, 동물 또는 인간 대상체의 치료를 모니터링하는 방법이 제공된다.

본 발명의 추가 측면에 따르면,

(a) 본원에 기재된 방법에 따른 개체에서 암을 검출하고/거나 암의 발생 부위를 진단하는 단계; 이어서

(b) 상기 개체에게 상기 암 및/또는 발생 부위에 적절한 항암 요법, 수술 또는 의약을 투여하는 단계

를 포함하는, 암의 치료를 필요로 하는 개체에서 암을 치료하는 방법이 제공된다.

본 발명의 추가 측면에 따르면, 대상체에서의 암의 검출을 위한 생물학적 유체 중 바이오마커로서의 2종 이상의 전사 인자 또는 보조인자의 조직 특이적 조합을 함유하는 염색질 단편의 용도가 제공된다.

본 발명의 추가 측면에 따르면,

(i) 대상체로부터 생물학적 유체 샘플을 수득하는 단계;

(ii) 샘플을 제1 전사 인자 또는 보조인자에 결합하는 제1 결합제와 접촉시키는 단계;

(iii) 샘플을 제2 전사 인자 또는 보조인자에 결합하는 제2 결합제와 접촉시키는 단계; 및

(iv) 샘플에서 상기 제1 또는 제2 결합제의 결합을 검출 또는 정량화하는 단계

를 포함하며,

여기서 염색질 단편 중 제1 및 제2 전사 인자 또는 보조인자 둘 다의 조합의 존재, 및/또는 단편의 수준은 암의 존재 및/또는 발생 부위의 지표로서 사용되는 것인,

대상체에서 암을 검출하거나 암의 발생 부위를 결정하는 방법이 제공된다.

도 1: 1명의 건강한 대상체, 유방암으로 진단된 3명의 대상체, 방광암으로 진단된 2명의 대상체로부터 취한 샘플 및 음성 대조군 샘플에 대한 순환 무세포 뉴클레오솜 결합된 GATA 3 부가물 ELISA 결과.
도 2: 1명의 건강한 대상체, 갑상선암으로 진단된 3명의 대상체, 폐암으로 진단된 2명의 대상체로부터 취한 샘플 및 음성 대조군 샘플에 대한 순환 무세포 뉴클레오솜 결합된 TTF-1 부가물 ELISA 결과.
도 3: 3명의 건강한 대상체, 갑상선암으로 진단된 1명의 대상체, 폐암으로 진단된 4명의 대상체, 직장암으로 진단된 3명의 대상체, 결장암으로 진단된 3명의 대상체, 유방암으로 진단된 3명의 대상체로부터 취한 샘플 및 음성 대조군 샘플에 대한 순환 무세포 뉴클레오솜 결합된 TTF-1 부가물 ELISA 결과.
도 4: 3명의 건강한 대상체, 갑상선암으로 진단된 1명의 대상체, 폐암으로 진단된 4명의 대상체, 직장암으로 진단된 3명의 대상체, 결장암으로 진단된 3명의 대상체, 유방암으로 진단된 3명의 대상체로부터 취한 샘플 및 음성 대조군 샘플에 대한 순환 무세포 뉴클레오솜 결합된 CDX2 ELISA 부가물 결과.

본 발명의 제1 측면에 따르면, 대상체에서의 암의 검출 또는 진단을 위한 생물학적 유체 중 바이오마커로서의 조직 특이적 전사 인자 또는 보조인자 뉴클레오솜 부가물의 용도가 제공된다.

한 실시양태에서, 조직 특이적 전사 인자-뉴클레오솜 부가물 또는 전사 보조인자-뉴클레오솜 부가물은 대상체에서 암의 발생 부위를 확인하는데 사용된다.

한 실시양태에서, 대상체는 이전에 암으로 진단되지 않았다 (즉, 겉보기에 건강하다). 예를 들어, 암은 스크리닝 시험에서 겉보기에 건강한 사람에서 검출된다. 한 실시양태에서, 대상체는 암과 연관된 증상으로 확인되었으며, 즉 암은 질환의 증상을 갖는 사람에서 검출된다. 증상은 암을 시사할 수 있거나 또는 특정한 조직 또는 기관의 기능부전을 시사할 수 있다. 이러한 증상은 통증, 비통상적 출혈, 비통상적 덩어리 또는 종창, 지속적 기침, 숨가쁨 및/또는 설명되지 않는 체중 감소를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 예를 들어 ctDNA 시험, 순환 종양 세포 시험을 사용하여 또는 증후성으로 인해, 암의 위치를 알지 못하면서 원발 암으로 이미 진단된 환자에서 유용성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 제2 측면에 따르면, 이전에 암으로 진단된 대상체에서의 암의 발생 부위의 확인 또는 진단을 위한 생물학적 유체 중 바이오마커로서의 조직 특이적 전사 인자 또는 보조인자 뉴클레오솜 부가물의 용도가 제공된다.

본 발명자들은 조직 특이적 전사 인자 또는 보조인자가 무세포 뉴클레오솜에서 검출될 수 있고 따라서 이전에 암으로 진단되었지만 그의 발생 부위는 알지 못하는 환자와 같은 환자에서 암을 검출하고/거나 암의 기원을 확인하는데 사용될 수 있다는 것을 발견하였다. 암의 발생 부위의 확인은 적절한 요법을 선택하고 이에 따라 환자의 예후 및 치료를 개선시키기 위해 중요하다.

한 실시양태에서, 암은 원발 암, 즉 암이 신체에서 시작/기원하는 곳이다. 대안적 실시양태에서, 암은 속발성 암, 즉 암 세포가 신체의 또 다른 부분으로 확산되었을 때인 전이이다.

한 실시양태에서, 대상체는 원발부위 불명의 전이 암 (CUP)을 갖는 대상체이다. 이러한 실시양태에서, 대상체는 전이를 확인함으로써 암으로 진단되었을 수 있지만, 적절한 치료를 제공하기 위해 원발 암의 위치를 찾아내는 것은 여전히 중요하다.

한 실시양태에서, 대상체는 이전에 순환 핵산 방법을 사용하여, 예를 들어 ctDNA, RNA, miRNA 또는 암 그 자체를 검출하는 다른 순환 혈액 핵산 기반 방법을 사용하여 암으로 진단되었다. 추가 실시양태에서, 대상체는 이전에 순환 종양 DNA (ctDNA)를 바이오마커로서 사용하여 암으로 진단되었다. 한 실시양태에서, 대상체는 이전에 순환 종양 세포를 검출함으로써 암으로 진단되었다. 이들 실시양태에서, 암은 검출되지만 대상체에서 암의 원래 위치에 대한 정보가 불충분하거나 존재하지 않은 채로 검출된다.

본 발명의 추가 측면에 따르면 전이 질환을 갖는 대상체에서의 원발 암의 부위, 위치 또는 기관 위치의 확인 또는 진단을 위한 생물학적 유체 중 바이오마커로서의 조직 특이적 전사 인자-뉴클레오솜 부가물의 용도가 제공된다. 본 발명자들은, 각각 갑상선 또는 폐암 조직 (TTF-1), 위장암 조직 (CDX2) 및 유방암 조직 (GATA 3)에서 발현되는 TTF-1, CDX2 또는 GATA 3을 함유하는 3종의 이러한 부가물이 암을 갖는 대상체의 순환 내에 존재한다는 것, 및 그의 존재 또는 수준은 환자가 각각 원발 갑상선암, 결장직장암 또는 유방암을 갖고 이들 조직 특이적 전사 인자-뉴클레오솜 부가물이 다른 암을 갖는 대상체 또는 건강한 대상체의 순환 내에 통상적으로 존재하지 않음 (또는 낮은 수준으로 존재함)을 나타내는데 사용될 수 있다는 것을 제시하였다.

문헌에서 TTF-1은 대부분의 폐암 조직 샘플 뿐만 아니라 대부분의 갑상선암 조직 샘플에서도 발현되는 것으로 보고된다. 때때로는 결장직장암 조직도 조직 TTF-1 발현이 상승되어 있다. 따라서 TTF-1에 대한 조직 검정은 CUP 종양을 갑상선 또는 폐 원발 기원을 갖는 것으로 확인하는데 사용될 수 있지만, 결장직장암을 포함한 일부 다른 암이 폐 또는 갑상선암으로서 잘못 확인될 수 있는 "가양성" 결과도 가능하다. 본 발명자들은 순환 뉴클레오솜 결합된 TTF-1 부가물 수준이 갑상선 종양을 갖는 대상체의 혈액에서 상승되어 있고 폐암을 갖는 대상체에서는 보다 덜 상승되어 있다는 것을 발견하였다. 놀랍게도, 본 발명자들은 또한 순환 뉴클레오솜 결합된 TTF-1 부가물 수준이 결장직장 (결장 또는 직장) 암으로 진단된 모든 대상체의 혈액에서 상승되었다는 것을 발견하였다. 이것은 체액 중 무세포 뉴클레오솜-전사 인자 부가물 수준의 조직 특이성이 생검시에 제거된 암 조직에서의 전사 인자 발현 수준의 특이성과 모든 경우에 동일할 수는 없다는 것을 나타낸다.

유사한 조직 특이적 전사 인자 발현이 많은 다른 암에 대해 발생하는 것으로 공지되어 있으며 (Kandalaft and Gown, 2015), 적절한 조직 특이적 전사 인자-뉴클레오솜 부가물에 대한 유사한 뉴클레오솜 부가물 검정은 이러한 전사 인자가 이미 확인된 광범위한 암에 대해 원발 부위 불명의 암을 확인하는데 사용될 수 있다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 이것은 예를 들어, 제한 없이, GATA 3, CDX2, TTF-1, PAX8, WT1, NKX3.1, P63 (TP63) 또는 P40 및/또는 임의의 이러한 조직 특이적 전사 인자 발현이 확인될 수 있는 임의의 암을 포함한다. 본 발명의 방법은, 대상체가 비검출 또는 미지의 암을 가지고 있을 수 있거나, 또는 CUP의 경우 또는 암이 그의 발생 부위를 알지 못하면서 검출된 경우를 포함한, 암을 갖는 것으로 알려져 있지만 원발 종양의 발생 부위가 알려지지 않은 임의의 상황에 임상 유용성을 갖는다. 상기 후자의 상황은, 예를 들어 ctDNA, RNA를 기반으로 하는 암 검출 방법 또는 암 그 자체를 검출하는 다른 순환 혈액 핵산 기반 방법이 사용되는 경우, 또는 원발 기원 불명의 순환 종양 세포가 검출되는 경우에 일어날 수 있다. 폭넓게 다양한 순환 핵산 방법이 존재한다. 일부는 암 연관된 ctDNA 서열 돌연변이 또는 암과 연관된 다른 DNA 서열 효과의 검출을 기반으로 한다. 다른 것은 암과 연관된 마이크로RNA 서열, 암과 연관된 메틸화 DNA 서열 및 기타의 검출을 기반으로 한다. DNA 이상은 모든 암 질환의 특징이다. 암 세포의 DNA는 건강한 세포의 DNA와 점 돌연변이, 메틸화 상태, 전위, 유전자 카피수, 미소위성체 이상 및 DNA 가닥 완전성을 포함하나 이에 제한되지는 않는 많은 면에서 상이하다. 그러나, 유전자 돌연변이는 모든 암의 특징이고, 그의 존재는 원발 종양의 성질에 관한 정보를 제공하지 않을 수도 있다. 예시적인 예로서, P53 유전자 돌연변이는 암에서 통상적이고, ctDNA에서의 그의 존재는 암 검출을 위한 바이오마커로서 사용될 수 있다. 그러나, P53 돌연변이는 폭넓게 다양한 암에 존재하기 때문에 그의 존재는 원발 암의 성질에 대해 정보를 제공하지 않을 것이다. 본 발명은 임의의 바이오마커를 사용하는 또 다른 방법에 의해 또는 그러한 검출 방법에 상관없이 증후성 이유로 암 그 자체가 검출된 암 발생 부위를 결정하는데 유용하다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 따라서, 본 발명은 이전에 암으로 진단되었지만 질환의 기원, 부위 또는 위치를 알지 못하는 환자에서 유용한 2차 시험이다.

"전사 인자"에 대한 언급은 DNA에 결합하고 전사의 촉진 (즉, 활성화제) 또는 전사의 억제 (즉, 리프레서)에 의해 유전자 발현을 조절하는 단백질을 지칭한다. 전사 인자는 이들이 조절하는 유전자에 인접한 DNA의 특이적 서열에 부착하는 1개 이상의 DNA 결합 도메인 (DBD)을 함유한다.

본원에 기재된 바와 같은 용어 "조직 특이적 전사 인자"는 특정 조직 또는 암에서는 항상 또는 통상적으로 발현되는 반면에 다른 조직 또는 암에서는 드물게 발현되거나 절대 발현되지 않는 전사 인자를 지칭한다. 이러한 조직 특이적 전사 인자는 단지 제한된 수의 조직 또는 암 유형, 예컨대 단지 1, 2, 3, 4 또는 5종의 조직 또는 암 유형에서만 발현될 수 있다. 순환 내 무세포 뉴클레오솜-전사 인자 부가물의 존재 또는 수준은 그러한 전사 인자를 발현하는 세포의 세포 사멸을 나타내고, 그의 조직 특이성은 종양 발생의 원발 부위로서의 기원 조직을 나타내기 위한 바이오마커로서 사용될 수 있다.

본원에 기재된 바와 같은 용어 "보조인자" 또는 "전사 인자 보조인자"는 전사 인자의 효과를 조정하는 단백질을 지칭한다. 많은 전사 인자는, 단지 결합을 조정하고 때때로 개시전 복합체 및 RNA 폴리머라제의 동원에 관여하는 이들 협력 보조인자의 존재 하에서만 그의 표적 DNA 서열에 결합한다. 본원에 사용된 바와 같은 전사 인자를 수반하는 실시양태에 대한 언급은 보조인자에 동등하게 적용될 수 있다.

추가로, 전사 인자 및/또는 전사 보조인자의 조직 특이적 조합이 기재되었으며, 여기서 그 자신의 발현의 관점에서 조직 특이적이 아닐 수 있는 전사 인자는 조직 특이적인 조합 전사 인자 제어를 통해 조직 특이적 유전자 발현을 조절한다. 따라서, 개별 발현이 조직 특이적이 아닐 수 있는 2종 이상의 전사 인자 또는 보조인자의 결합은 실제로 조직 특이적 유전자의 발현을 조절할 수 있으며, 여기서 유전자의 발현은 둘 다의 또는 다중의 전사 인자 또는 보조인자의 존재를 요구한다. 따라서, "조직 특이적" 전사 인자 및 보조인자에 대한 언급은 조직 특이성을 달성하기 위해 협력하여 작동하는 전사 인자 및/또는 보조인자의 조합을 포함하고, 즉 한 실시양태에서, 본원에 기재된 측면은 조직 특이적인 전사 인자 및/또는 보조인자의 조합을 검출하는 것을 포함한다.

용어 "바이오마커"는 과정, 사건 또는 상태의 특유한 생물학적 또는 생물학적으로 유래된 지표를 의미한다. 바이오마커는 암의 감별 진단 방법, 예를 들어 예후 평가 및 요법의 결과의 모니터링, 특정한 치유적 치료에 반응할 가능성이 가장 큰 환자의 확인, 약물 스크리닝 및 개발에 사용될 수 있다. 바이오마커 및 그의 용도는 새로운 약물 치료의 확인 및 약물 치료를 위한 새로운 표적의 발견에 중요하다.

본 발명의 추가 측면에 따르면, 암의 부위를 알지 못하는 대상체에서 검출된 원발 암의 부위의 확인 또는 진단을 위한 혈액 중 바이오마커로서의 조직 특이적 전사 인자-뉴클레오솜 또는 보조인자-뉴클레오솜 부가물의 용도가 제공된다. 한 실시양태에서, 대상체에서 암의 존재는 증후성 이유로 (즉, 환자 증상을 기반으로 하여) 의심되고, 본 발명은 암의 존재 및/또는 부위, 위치 또는 기관 위치를 확인하는데 사용된다.

본 발명은 체액 중 뉴클레오솜에 결합된 조직 특이적 전사 인자 또는 보조인자의 검출을 목표로 한다. 이것은 대상체로부터 체액의 샘플을 취하고, 하나의 항체는 뉴클레오솜에 결합하도록 지시되고 다른 것은 뉴클레오솜에 결합 또는 부가된 조직 특이적 전사 인자 또는 보조인자에 결합하도록 지시된 이중 항체 ELISA 시험을 수행하는 것에 의해 이루어질 수 있다. 그러나, 뉴클레오솜에 결합하도록 지시된 항체가 전체 뉴클레오솜 복합체에 대해 지시될 필요는 없으며 오히려 뉴클레오솜의 성분 부분에 대해 지시될 수는 있다. 본 발명의 이러한 실시양태에서 뉴클레오솜에 결합하도록 사용된 항체는, 예를 들어 특정한 히스톤, 히스톤 변형체, 히스톤 변이체 또는 이소형, 또는 DNA 또는 특정한 뉴클레오티드, 예컨대 5-메틸시토신을 포함한 뉴클레오솜의 임의의 성분 부분에 결합하도록 지시될 수 있다. 유사하게, 조직 특이적 전사 인자에 결합하도록 사용된 항체는 전사 인자의 임의의 성분 부분 또는 도메인에 결합하도록 지시될 수 있다. 전사 인자가 다중 단백질로 이루어진 단백질 복합체인 경우에 이들 중 어느 것은 유사하게 항체에 의해 표적화될 수 있다.

본 발명의 추가 측면에 따르면,

(i) 대상체로부터 생물학적 유체 샘플을 수득하는 단계;

(ii) 샘플을 뉴클레오솜 또는 그의 성분 또는 뉴클레오솜에 부가된 조직 특이적 전사 인자 또는 보조인자에 결합하는 제1 결합제와 접촉시키는 단계;

(iii) 뉴클레오솜 또는 샘플을, 제1 결합제가 뉴클레오솜 또는 그의 성분에 결합할 때 뉴클레오솜에 부가된 조직 특이적 전사 인자 또는 보조인자에 결합하는 제2 결합제와 접촉시키거나, 또는 제1 결합제가 뉴클레오솜에 부가된 조직 특이적 전사 인자 또는 보조인자에 결합할 때 뉴클레오솜 또는 그의 성분에 결합하는 상기 제2 결합제와 접촉시키는 단계; 및

(iv) 샘플에서 부가된 조직 특이적 전사 인자 또는 보조인자, 뉴클레오솜 또는 그의 성분에 대한 상기 제2 결합제의 결합을 검출 또는 정량화하는 단계

를 포함하며,

본 발명의 추가 측면에 따르면,

(i) 대상체로부터 생물학적 유체 샘플을 수득하는 단계;

를 포함하며,

검출 결합제는 부가된 조직 특이적 전사 인자 또는 보조인자에 또는 뉴클레오솜 또는 뉴클레오솜의 성분 부분에 결합하도록 지시되기 위해 선택될 수 있다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.

따라서, 본 발명의 추가 측면에 따르면,

(i) 대상체로부터 생물학적 유체 샘플을 수득하는 단계;

(ii) 샘플을 뉴클레오솜에 부가된 조직 특이적 전사 인자 또는 보조인자에 결합하는 제1 결합제와 접촉시키는 단계;

를 포함하며,

본 발명의 방법은 또한 이전에 암으로 진단된 대상체에서 사용될 수 있다.

상기에 기재된 바와 같이 조직 특이성은 전사 인자에 대해 1종 또는 다중의 다른 전사 인자 또는 보조인자와의 협력적 결합에 의해 부여될 수 있고, 이들 다중 보조인자는 게놈 내 한 부위에 밀접하게 공동-위치되어 있을 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Zhang & Glass, 2013; 및 Yu et al., 2006] 참조). 이것은 세포 사멸에서의 염색질 소화가 다중 전사 인자를 함유하는 염색질 단편으로 이어질 것임을 의미한다. 이러한 염색질 단편은 뉴클레오솜의 존재 또는 부재 하에 다중 전사 인자를 포함할 수 있다. 다중 전사 인자를 포함하는 염색질 단편은 본 발명의 추가 측면에서 사용될 수 있다.

전사 인자 및 보조인자의 공동-위치화는 종종 게놈 내 그의 각각의 DNA 결합 부위의 공동-위치화로 인해 일어날 수 있지만, 결합 부위가 멀리 떨어져 있는 전사 인자 및 보조인자의 공동-위치화는 보다 원위의 부위가 유전자 조절을 위해 합쳐지는 DNA 내 루핑으로 인해 또한 일어날 수 있다. 염색질 단편은 이러한 루프로부터 유발되는 전사 인자 및 보조인자의 조직 특이적 조합을 또한 함유할 수 있다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.

본원에 사용된 용어 "염색질 단편"은 세포의 염색체에 기원을 둔 단백질 및 핵산의 복합체를 지칭한다. 염색질의 단편은 다중-단백질-핵산 복합체에 뉴클레오솜 및/또는 회합된 DNA 및/또는 임의의 매우 다양한 비-히스톤 염색질 회합된 단백질을 함유할 수 있다. 비-히스톤 염색질 회합된 단백질의 일부 예는 전사 인자, 보조인자, 보조-활성화제, 보조-리프레서, RNA 폴리머라제 모이어티, 신장 인자, 염색질 리모델링 인자, 매개자, STAT 모이어티, 상류 결합 인자 (UBF) 및 기타를 포함한다.

본 발명의 추가 측면에 따르면, 대상체에서의 암의 검출을 위한 생물학적 유체 중 바이오마커로서의 2종 이상의 전사 인자 또는 보조인자의 조직 특이적 조합을 함유 또는 포함하는 염색질 단편의 용도가 제공된다. 함께 조직 특이성을 부여하는 2종의 전사 인자 또는 보조인자는, 예를 들어 2종의 전사 인자 또는 보조인자 중 하나에 각각 결합하도록 지시된 2종의 항체를 사용하는 단일 ELISA 유형 검정으로 검출 또는 측정될 수 있다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 대안적으로, 함께 조직 특이성을 부여하는 2종의 전사 인자 또는 보조인자는, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 2종의 개별 전사 인자 또는 전사 보조인자-뉴클레오솜 부가물 검정 또는 2종의 개별 전사 인자 또는 전사 보조인자-DNA 부가물 검정을 사용하는 개별 ELISA 유형 검정으로 검출 또는 측정될 수 있다. 함께 조직 특이성을 부여하는 다중 전사 인자 또는 보조인자는, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 3, 4종 또는 그 초과의 개별 전사 인자 또는 전사 보조인자-뉴클레오솜 부가물 검정 또는 개별 전사 인자 또는 전사 보조인자-DNA 부가물 검정을 사용하는 개별 ELISA 유형 검정으로 검출 또는 측정될 수 있다는 것이 또한 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.

조직 특이성을 부여하는 (조직 특이적) 전사 인자 또는 보조인자를 포함하는 염색질 단편은 그 자체로 조직 특이적이라는 것이 이해될 것이다. 유사하게, 조직 특이성을 부여하는 2종 이상의 전사 인자 또는 보조인자의 조직 특이적 조합을 포함하는 염색질 단편은 그 자체로 조직 특이적이다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같은 용어 "조직 특이적 염색질 단편"은 조직 특이적 전사 인자 또는 보조인자를 포함하거나 또는 2종 이상의 전사 인자 또는 보조인자의 조직 특이적 조합을 포함하는 염색질 단편을 지칭한다.

조직 특이적 조합은 대상체에서 암의 발생 부위를 확인하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 추가 측면에 따르면, 대상체에서의 암의 발생 부위의 확인 또는 진단을 위한 생물학적 유체 중 바이오마커로서의 2종 이상의 전사 인자 또는 보조인자의 조직 특이적 조합을 함유 또는 포함하는 염색질 단편의 용도가 제공된다.

본 발명의 추가 측면에 따르면,

(i) 대상체로부터 생물학적 유체 샘플을 수득하는 단계;

를 포함하며,

여기서 제1 및 제2 전사 인자 또는 보조인자 둘 다를 포함하는 염색질 단편의 존재 또는 수준은 상기 암의 존재 및/또는 발생 부위의 지표로서 사용되는 것인,

단계 (iv)는 결합된 항체 둘 다를 측정하는 것이 요구되지 않는데 이는 단지 항체 둘 다가 결합될 때에만 어느 하나로부터의 신호가 발생할 것이기 때문임을 이해할 것이다. 바람직한 실시양태에서, 제1 전사 인자 또는 보조인자에 결합하도록 지시된 제1 결합제는 고체 표면 상에 고정화되고, 제2 전사 인자 또는 보조인자에 결합하도록 지시된 제2 결합제는 검출가능한 표지로 표지된다. 결합제는 샘플에서 염색질 단편에 노출되고, 고체 상 결합된 표지된 항체가 검출된다. 본 발명의 이러한 측면에 따라 수행된 면역검정은 단지 제1 및 제2 결합제가 둘 다 제1 및 제2 전사 인자 또는 보조인자에 결합할 때에만 신호를 생성할 것이며, 이는 둘 다의 전사 인자 또는 보조인자가 생물학적 샘플에서 염색질 단편 내에 공동-위치되어 있을 때에만 발생할 것임을 이해할 것이다.

한 실시양태에서, 조합은 염색질 단편에서 검출된다. 추가 실시양태에서, 염색질 단편은 DNA 및 2종 이상의 전사 인자를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 염색질 단편은 2종 이상의 전사 인자 및 1종 이상의 뉴클레오솜을 포함한다.

2종 이상의 전사 인자 또는 보조인자의 단일 유전자 또는 유전자 프로모터 유전자좌에 대한 동시 결합은 단일 조직 또는 제한된 수의 조직에 특이적일 수 있다. 전사 인자 및/또는 보조인자의 이러한 조직 특이적 동시 결합이 일어날 경우에, 결합 모티프는 통상적으로 밀접하게 근접되어 있고 200개 미만의 염기 쌍으로 이격되어 있다.

이러한 협력 인자는 그 자체로 폭넓게 발현되는 많은 신호-의존성 전사 인자의 작용에 대해 조직 특이성을 부여할 수 있다. 예는 제한 없이, 핵 호르몬 수용체, STAT 전사 인자, NF-κB 패밀리 구성원, CREB 및 기타를 포함한 세포 표면 수용체를 통해 세포외 신호에 의해 활성화되는 전사 인자의 다양한 패밀리의 구성원을 포함한다. 따라서, 폭넓게 발현되는 세포 표면 수용체는 각각 조직 특이적 방식으로 상이한 조직에서 다양한 상이한 유전자를 조절할 수 있다. 보고된 예는 전사 인자 FoxA1와 협력하는 전립선 특이적 유전자의 전사의 안드로겐 수용체 조절, 전사 인자 Hnf4α와 협력하는 신장 특이적 유전자의 전사, 및 전사 인자 AP-2α와 협력하는 부고환 특이적 유전자의 전사를 포함한다 (Pihlajamaa, 2014). 유사한 예가 문헌 [Levy et al., 2007; Zhao et al., 2010; 및 Zhang & Glass, 2013]에서 다른 핵 호르몬 수용체에 대해 보고되었으며; 이들은 본원에 참조로 포함된다.

본 발명에 사용하기에 적합한 전사 인자 및 보조인자의 다수의 조직 특이적 조합은 공지되어 있으며, 예를 들어 존스 홉킨스 대학의 윌머 아이 연구소에서의 생물정보학 실험실에 의해 개발된 조직 특이적 유전자 발현 및 조절 (TiGER) 데이터베이스를 포함한 공중 이용가능한 데이터베이스에서 찾아볼 수 있다. 다양한 조직 (말초 신경계 (PNS) 및 유선 (유방) 포함)에 대해 각각 조직 특이성을 갖는 3쌍의 예시적인 전사 인자 또는 보조인자가 하기에 제시된다:

본 발명의 추가 측면에 따르면 2종 이상의 조직 특이적 전사 인자 또는 보조인자에 대한 검정을 포함한 전사 인자/보조인자 패널 바이오마커가 제공된다. 본 발명의 이러한 측면은 개별 전사 인자/보조인자가 제한된 조직 특이성을 갖고 그의 조합된 조직 특이성이 그의 개별 성분 검정의 것보다 더 큰 경우에 유용할 수 있다. 본 발명의 이러한 측면에서 전사 인자는 생물학적으로 연관되지 않을 수 있고 단일 염색질 단편에서 발생하지 않을 수 있지만, 그럼에도 불구하고 함께 조직 특이성을 부여할 수 있다. 이러한 전사 인자/보조인자 조합은, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 2, 3, 4종 또는 그 초과의 개별 전사 인자 또는 전사 보조인자-뉴클레오솜 부가물 검정 또는 개별 전사 인자 또는 전사 보조인자-DNA 부가물 검정의 패널을 사용하는 개별 ELISA 유형 검정으로 검출 또는 측정될 수 있다.

본 발명의 추가 측면에 따르면, 생물학적 유체 중 2종 이상의 전사 인자/보조인자의 조합된 존재 또는 수준에 대한 패널은 암의 존재 및/또는 그의 발생 부위를 나타내는데 사용된다. 본 발명의 이러한 측면에서 전사 인자/보조인자는 DNA 결합 부위 중 그의 부위의 관점에서 밀접하게 위치될 필요가 없고, 단일 염색질 단편 내에 함유될 필요가 없다. 2종 이상의 전사 인자/보조인자의 이러한 조합은 이들이 염색질 단편의 성분 부분인지 아닌지 여부에 관계없이 각각 직접적으로 검정될 수 있다. 본 발명의 이러한 측면에서 제한 없이, 단일 항체 (또는 다른 결합제) 면역검정 방법, 이중 항체 (또는 다른 결합제) 면역검정 방법, 질량 분광광도측정 방법, ChIP 방법 또는 임의의 다른 적합한 분석 방법을 포함한, 각각의 전사 인자/보조인자를 검출하는 임의의 방법이 사용될 수 있다. 생물학적 유체 중 2종 이상의 전사 인자/보조인자의 조합된 존재 또는 수준은 암의 존재 및/또는 그의 발생 부위를 나타내기에 충분하다.

생물학적 유체 중 조직 특이적 무세포 전사 인자 및/또는 보조인자 및 그의 조합은 뉴클레오솜 또는 DNA가 결합되었는지 아닌지 관계없이 세포 또는 염색질 기원의 조직 특이적 바이오마커로서 간주될 수 있다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 본 발명의 추가 측면에 따르면, 생물학적 유체 중 조직 특이적 무세포 전사 인자 또는 보조인자 바이오마커 또는 이러한 바이오마커의 패널이 제공된다. 본 발명의 이러한 측면에서 제한 없이, 단일 항체 (또는 다른 결합제) 면역검정 방법, 이중 항체 (또는 다른 결합제) 면역검정 방법, 질량 분광광도측정 방법, ChIP 방법 또는 임의의 다른 적합한 분석 방법을 포함한, 무세포 전사 인자 또는 보조인자를 검출하는 임의의 방법이 사용될 수 있다. 생물학적 유체 중 전사 인자/보조인자의 존재 또는 수준 또는 그의 패널은 암의 존재 또는 수준 및/또는 그의 발생 부위를 나타내는데 사용된다.

폭넓게 다양한 면역화학적 및 다른 분석 방법은 본 발명과 함께 전사 인자- 및/또는 보조인자-뉴클레오솜 부가물을 포함하는 조직 특이적 염색질 단편을 측정하는데 사용될 수 있다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 예를 들어 제한 없이 염색질 면역침전 기반 방법 (ChIP) 또는 염색질 물질의 분석을 위한 다른 방법을 포함한 다양한 분자 생물학적 방법이 또한 본 발명과 함께 사용하기에 적합하다. 비-면역화학적 방법은 임의의 크로마토그래피 또는 질량 분광측정 방법, 및 면역화학적, 크로마토그래피, 질량 분광광도측정 또는 다른 수단에 의한 조직 특이적 전사 인자-뉴클레오솜 부가물의 분리 및 분리된 조직 특이적 전사 인자의 측정을 수반하는 임의의 방법을 포함한다. 단백질 복합체 또는 부가물 및 단백질-핵산 복합체 또는 부가물을 분리하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 제한 없이; 산성 또는 염기성 pH 매질 또는 높은 염 농도에의 상기 부가물의 노출, 또는 기계적 또는 초음파처리 방법 또는 생물학적 소화 또는 다른 효소 기반 방법이 있다. 따라서, 본 발명의 추가 측면에 따르면,

(i) 대상체로부터 생물학적 유체 샘플을 수득하는 단계;

(ii) 샘플에서 뉴클레오솜 또는 그가 부가된 염색질 단편으로부터 조직 특이적 전사 인자 또는 보조인자를 분리하는 단계;

(iii) 분리된 조직 특이적 전사 인자 또는 보조인자를 검출 또는 정량화하는 단계

를 포함하며,

여기서 조직 특이적 전사 인자 또는 보조인자의 존재 또는 수준은 상기 암의 발생 부위의 지표로서 사용되는 것인,

대상체에서 암의 존재를 검출하거나 암의 발생 부위를 결정하는 방법이 제공된다.

본 발명의 추가 측면에서, 조직 특이적 전사 인자 또는 보조인자는 DNA에 결합되고, DNA-조직 특이적 전사 인자 또는 보조인자 부가물은 체액 중에서 측정되며 본원에 기재된 바와 같은 바이오마커로서 사용된다. 한 실시양태에서, DNA-조직 특이적 전사 인자 또는 보조인자 부가물은 조직 특이적 전사 인자 또는 보조인자에 결합하도록 지시된 결합제를 DNA 또는 DNA의 임의의 성분 부분에 결합하도록 지시된 또 다른 결합제와 조합하여 사용하여 본원에 기재된 방법에 따라 체액 중에서 검출된다.

그의 표적 뉴클레오솜 DNA에 직접적으로 결합하는 전사 인자는 관련 기술분야에서 선구적 전사 인자로 지칭된다. 그러나, 많은 전사 인자는 단지 결합을 조정하고 또한 추가의 조직 특이성을 부여할 수 있는 협력 보조인자의 존재 하에서만 그의 표적 DNA 서열에 결합한다. 예를 들어, FoxA1은 전립선 조직에서 안드로겐 반응 요소 (ARE)에 결합하는 안드로겐 수용체 (AR) 및 유방암에서 에스트로겐 반응 요소 (ERE)에 결합하는 에스트로겐 수용체 (ER)에 대해 요구되는 보조인자이다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태에서 (전사 인자의) 무세포 뉴클레오솜 결합된 보조인자가 측정되어 암의 발생 부위를 확인하는데 사용된다. 전사 인자는 또한 보조인자와 결합된 뉴클레오솜일 수 있거나 아닐 수 있다. 무세포 뉴클레오솜 결합된 보조인자는 전사 인자의 존재 또는 부재 하에 측정될 수 있다.

한 실시양태에서, 조직 특이적 보조인자는 FoxA1이다. 보조인자가 FoxA1인 경우에, 암의 발생 부위는 다음으로부터 선택될 수 있다: 유방 및 전립선.

바람직한 실시양태에서, 조직 특이적 전사 인자는 다음으로부터 선택된다: GATA 3, CDX2, TTF-1, PAX8, WT1, NKX3.1, P63 (TP63) 또는 P40. 표 1은 암 조직에서 이들 전사 인자와 연관된 종양을 열거한다.

표 1: 암 조직에서 조직 특이적 전사 인자 및 그와 연관된 종양의 예

표 1 내의 예는 총망라한 것은 아니다. 본 발명의 방법에 의해 체액에서 검출된 뉴클레오솜 전사 인자 부가물 수준의 조직 특이성은 때때로 암 조직에서의 전사 인자 발현 수준의 것과 상이하다.

한 실시양태에서, 상기 조직 특이적 전사 인자는 GATA 3이고 암의 발생 부위는 다음으로부터 선택된다: 유방, 타액선, 이행 세포 암종 및 피부 부속기 종양.

한 실시양태에서, 상기 조직 특이적 전사 인자는 CDX2이고 암의 발생 부위는 다음으로부터 선택된다: 결장직장 및 위 암종.

한 실시양태에서, 상기 조직 특이적 전사 인자는 TTF-1이고 암의 발생 부위는 다음으로부터 선택된다: 폐 선암종, 결장직장 암종, 갑상선 및 신경내분비 암종.

한 실시양태에서, 상기 조직 특이적 전사 인자는 PAX8이고 암의 발생 부위는 다음으로부터 선택된다: 부인과, 갑상선 및 신세포 암종.

한 실시양태에서, 상기 조직 특이적 전사 인자는 WT1이고 암의 발생 부위는 다음으로부터 선택된다: 난소 및 중피종.

한 실시양태에서, 상기 조직 특이적 전사 인자는 NKX3.1이고 암의 발생 부위는 전립선이다.

한 실시양태에서, 상기 조직 특이적 전사 인자는 P63 (TP63)이고 암의 발생 부위는 다음으로부터 선택된다: 편평 세포 암종, 이행 세포 암종, 흉선종, 타액선 및 영양막 종양.

한 실시양태에서, 상기 조직 특이적 전사 인자는 P40이고 암의 발생 부위는 다음으로부터 선택된다: 편평 세포 암종, 이행 세포 암종, 흉선종, 타액선 및 영양막 종양.

상기 방법은 뉴클레오솜 자체에 대해 지시된 항체를 뉴클레오솜에 부가된 조직 특이적 전사 인자에 결합하도록 지시된 항체와 조합하여 사용하거나, 또는 뉴클레오솜의 성분에 대해 지시된 항체를 다시 뉴클레오솜에 부가된 조직 특이적 전사 인자에 결합하도록 지시된 항체와 조합하여 사용하여 수행될 수 있다. 유사하게, 방법은 DNA 또는 DNA의 임의의 성분, 또는 특정한 뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 5-메틸시토신에 결합하도록 지시된 항체를 사용하여 수행될 수 있다.

한 실시양태에서, 뉴클레오솜 또는 그의 성분에 결합하는 결합제는 특정한 히스톤, 히스톤 변형체, 히스톤 변이체 또는 이소형, 또는 특정한 뉴클레오티드에 결합하도록 지시된다. 추가 실시양태에서, 뉴클레오솜 또는 그의 성분에 결합하는 결합제는 DNA, 또는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 5-메틸시토신을 포함한 뉴클레오티드에 결합하도록 지시되고, DNA 결합된 전사 인자를 검출한다.

용어 "결합제"는 바이오마커 (즉, 뉴클레오솜 또는 뉴클레오솜에 부가된 조직 특이적 전사 인자)에 대한 특이적 결합이 가능한 리간드 또는 결합제, 예컨대 자연 발생 또는 화학적으로 합성된 화합물을 지칭한다. 본 발명에 따른 리간드 또는 결합제는 바이오마커에 대한 특이적 결합이 가능한 펩티드, 항체 또는 그의 단편, 또는 합성 리간드, 예컨대 플라스틱 항체, 또는 압타머 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 항체는 표적에 대한 특이적 결합이 가능한 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 또는 그의 단편일 수 있다. 본 발명에 따른 리간드 또는 결합제는 검출가능한 마커, 예컨대 발광, 형광, 효소 또는 방사성 마커로 표지될 수 있고; 대안적으로 또는 추가적으로 본 발명에 따른 리간드는 친화성 태그, 예를 들어 비오틴, 아비딘, 스트렙타비딘 또는 His (예를 들어 헥사-His) 태그로 표지될 수 있다. 한 실시양태에서, 결합제는 다음으로부터 선택된다: 항체, 항체 단편 또는 압타머. 추가 실시양태에서, 사용된 결합제는 항체이다. 용어 "항체", "결합제" 또는 "결합제"는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.

한 실시양태에서, 샘플은 생물학적 유체이다 (이는 본원에서 용어 "체액"과 상호교환가능하게 사용됨). 유체 샘플은 대상체로부터 취한 임의의 생물학적 유체 샘플일 수 있고, 제한 없이, 뇌척수액 (CSF), 전혈, 혈청, 혈장, 월경혈, 자궁내막액, 소변, 타액, 또는 다른 체액 (대변, 누액, 활액, 객담), 예를 들어 응축된 호흡으로서의 호흡, 또는 그로부터의 추출물 또는 정제물, 또는 그의 희석물을 포함한다. 생물학적 샘플은 또한 살아있는 대상체로부터의 또는 사후에 취한 시편을 포함한다. 샘플은, 예를 들어 적절한 경우에 희석 또는 농축되어 제조될 수 있고, 통상적인 방식으로 저장될 수 있다. 추가 실시양태에서, 생물학적 유체 샘플은 다음으로부터 선택된다: 혈액 또는 혈청 또는 혈장. 체액 중 뉴클레오솜 부가물의 검출은 생검을 요구하지 않는 최소 침습적 방법이라는 이점을 갖는다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.

한 실시양태에서, 대상체는 포유동물 대상체이다. 추가 실시양태에서, 대상체는 인간 또는 동물 (예컨대 마우스) 대상체로부터 선택된다.

한 실시양태에서, 뉴클레오솜은 무세포 모노뉴클레오솜 또는 올리고뉴클레오솜이다.

본 발명의 용도 및 방법은 시험관내, 생체외 및/또는 생체내에서 수행될 수 있다는 것이 이해될 것이다.

본 발명의 추가 측면에 따르면,

(i) 대상체의 생물학적 유체 중 염색질 단편 내 또는 뉴클레오솜에 부가된 1종 이상의 조직 특이적 전사 인자 또는 보조인자를 검출 또는 측정하는 단계; 및

(ii) 대상체에서 원발 종양의 성질을 확인하기 위해 염색질 단편 내 또는 뉴클레오솜에 부가된 1종 이상의 조직 특이적 전사 인자 또는 보조인자의 검출을 사용하는 단계

를 포함하는, 동물 또는 인간 대상체에서 원발 종양의 성질을 결정 또는 진단하는 방법이 제공된다.

본 발명의 한 실시양태에서, 샘플에서 염색질 단편 내 또는 뉴클레오솜에 부가된 1종 이상의 조직 특이적 전사 인자의 존재 또는 수준은 치료를 필요로 하는 대상체에 대한 최적 치료 요법을 결정하는데 사용된다. 조직 특이적 염색질 단편 또는 전사 인자-뉴클레오솜 부가물은 암의 부위, 위치 및/또는 기관 위치를 확인하는데 사용될 수 있으며, 이는 즉 암의 기원/위치를 기반으로 하여 최적 치료를 결정하는데 사용될 수 있다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다.

본 발명의 추가 측면에 따르면,

(ii) 검출된 염색질 단편 내 또는 뉴클레오솜에 부가된 조직 특이적 전사 인자 또는 보조인자의 유형을 사용하여 대상체에 대해 적합한 치료를 결정하는 단계

본 발명의 추가 측면에 따르면,

(i) 대상체의 생물학적 유체 중 염색질 단편 내 또는 뉴클레오솜에 부가된 1종 이상의 조직 특이적 전사 인자 또는 보조인자를 검출 또는 측정하는 단계;

(ii) 대상체의 생물학적 유체 중 염색질 단편 내 또는 뉴클레오솜에 부가된 1종 이상의 조직 특이적 전사 인자 또는 보조인자의 검출 또는 측정을 1회 이상 반복하는 단계; 및

(iii) 검출된 염색질 단편 내 또는 뉴클레오솜에 부가된 1종 이상의 조직 특이적 전사 인자 또는 보조인자의 수준에서의 임의의 변화를 대상체의 상태에서의 임의의 변화에 대한 파라미터로서 사용하는 단계

동일한 시험 대상체로부터 초기에 취한 이전 시험 샘플에서의 수준에 비해 시험 샘플에서의 조직 특이적 염색질 단편 또는 전사 인자- 또는 보조인자-뉴클레오솜 부가물의 수준에서의 변화는 장애 또는 의심되는 장애에 대한 상기 요법의 유익한 효과, 예를 들어 안정화 또는 개선의 지표일 수 있다. 추가로, 치료가 완료되고 나면, 본 발명의 방법은 질환의 재발을 모니터링하기 위해 주기적으로 반복될 수 있다.

한 실시양태에서, 조직 특이적 염색질 단편 또는 전사 인자 뉴클레오솜 부가물은 한 패널의 측정들 중 하나로서 검출 또는 측정된다. 예를 들어, 조직 특이적 전사 인자 뉴클레오솜 부가물은 그 조직에 특이적인 다른 바이오마커로, 예를 들어 문헌 [Kandalaft and Gown, 2015]에 기재된 조직 특이적 마커와 조합되어 검출될 수 있다.

본 발명의 추가 실시양태에서, 암이 진단된 대상체로부터 취한 샘플을 시험의 패널의 일부로서 뉴클레오솜에 부가된 조직 특이적 전사 인자의 존재 또는 수준에 대해 시험하는 것을 포함하는, 약물 또는 다른 치료 옵션이 표적화할 최적 암 유형을 평가하기 위해 암 질환의 유형을 검출 또는 진단하는 방법이 제공된다.

따라서, 이러한 시험의 패널은, 예를 들어 상이한 조직 특이적 전사 인자를 함유하는 뉴클레오솜 부가물의 2종 이상의 또는 다중 측정으로 이루어질 수 있다.

본원에 기재된 조직 특이적 염색질 단편 및 전사 인자 뉴클레오솜 부가물이 질환의 위치의 지표이므로, 이들 부가물은 시험관내 및/또는 생체내 검정에서 신규 치료 화합물의 확인에 유용하다. 따라서, 본 발명의 뉴클레오솜 부가물은 뉴클레오솜 부가물의 수준을 조정하여 특이적 암 유형을 표적화할 수 있는 화합물을 스크리닝하는 방법에 사용될 수 있다.

따라서, 시험 물질을 대상체 동물에게 투여하는 단계 및 대상체로부터의 시험 샘플에 존재하는 조직 특이적 염색질 단편 또는 전사 인자 뉴클레오솜 부가물의 수준을 검출 및/또는 정량화하는 단계를 포함하는, 대상체에서 특이적 암 유형을 표적화할 수 있는 물질을 확인하는 방법이 제공된다.

암 유형의 효율적인 감별 진단 및 모니터링 방법은 정확한 진단을 확립하여 가장 적절한 치료의 신속한 확인 (따라서 유해한 약물 부작용에 대한 불필요한 노출 감소)을 가능하게 하고 재발률을 감소시킴으로써 개선된 예후에 대한 잠재력을 갖는 매우 강력한 "환자 해결책"을 제공한다.

확인 및/또는 정량화는 환자로부터의 생물학적 샘플 또는 생물학적 샘플의 정제물 또는 추출물 또는 그의 희석물 중 특이적 단백질의 존재 및/또는 양을 확인하기에 적합한 임의의 방법에 의해 수행될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 본 발명의 방법에서, 정량화는 샘플 또는 샘플들 중 바이오마커의 농도를 측정함으로써 수행될 수 있다. 본 발명의 방법에서 시험될 수 있는 생물학적 샘플은 본원 상기에 정의된 바와 같은 것을 포함한다. 샘플은, 예를 들어 적절한 경우에 희석 또는 농축되어 제조될 수 있고, 통상적인 방식으로 저장될 수 있다.

바이오마커의 확인 및/또는 정량화는 바이오마커 또는 그의 단편, 예를 들어 C-말단 말단절단 또는 N-말단 말단절단을 갖는 단편의 검출에 의해 수행될 수 있다. 단편은 적합하게는 4개 초과의 아미노산의 길이이며, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산의 길이이다.

바이오마커는, 예를 들어 SELDI 또는 MALDI-TOF에 의해 직접적으로 검출될 수 있다. 대안적으로, 바이오마커는 바이오마커에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드 또는 리간드들, 예컨대 항체 또는 그의 바이오마커-결합 단편, 또는 다른 펩티드 또는 리간드, 예를 들어 압타머, 또는 올리고뉴클레오티드와의 상호작용을 통해 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있다. 리간드 또는 결합제는 검출가능한 표지, 예컨대 발광, 형광 또는 방사성 표지, 및/또는 친화성 태그를 보유할 수 있다.

예를 들어, 검출 및/또는 정량화는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법(들)에 의해 수행될 수 있다: SELDI (-TOF), MALDI (-TOF), 1-D 겔-기반 분석, 2-D 겔-기반 분석, 질량 분광측정법 (MS), 역상 (RP) LC, 크기 투과 (겔 여과), 이온 교환, 친화도, HPLC, UPLC 및 다른 LC 또는 LC MS-기반 기술. 적절한 LC MS 기술은 ICAT® (어플라이드 바이오시스템즈, 미국 캘리포니아주), 또는 iTRAQ® (어플라이드 바이오시스템즈, 미국 캘리포니아주)를 포함한다. 액체 크로마토그래피 (예를 들어, 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC) 또는 저압 액체 크로마토그래피 (LPLC)), 박층 크로마토그래피, NMR (핵 자기 공명) 분광분석법이 또한 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 암의 감별 진단 또는 모니터링 방법은 SELDI TOF 또는 MALDI TOF에 의해 샘플을 분석함으로써 바이오마커의 존재 또는 수준을 검출하는 것을 포함할 수 있다. 이들 방법은 또한 예후, 요법 결과의 모니터링, 특정한 치유적 치료에 반응할 가능성이 가장 큰 환자의 확인, 약물 스크리닝 및 개발, 및 약물 치료를 위한 새로운 표적의 확인에도 적합하다.

분석물 바이오마커를 확인 및/또는 정량화는 것은 바이오마커에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 그의 단편을 수반하는 면역학적 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 적합한 면역학적 방법은 분석물 바이오마커 상의 상이한 에피토프를 인식하는 2종의 항체를 사용하여 분석물 바이오마커의 검출이 수행되는 샌드위치 면역검정, 예컨대 샌드위치 ELISA; 방사성면역검정 (RIA), 직접, 간접 또는 경쟁적 효소 연결 면역흡착 검정 (ELISA), 효소 면역검정 (EIA), 형광 면역검정 (FIA), 웨스턴 블롯팅, 면역침전 및 임의의 입자-기반 면역검정 (예를 들어 금, 은, 또는 라텍스 입자, 자기 입자, 또는 Q-도트 사용)을 포함한다. 면역학적 방법은, 예를 들어 마이크로타이터 플레이트 또는 스트립 포맷으로 수행될 수 있다.

본 발명의 면역검정은 효소 검출 방법 (예를 들어 ELISA), 형광 표지된 면역측정 검정, 시간-분해 형광 표지된 면역측정 검정, 화학발광 면역측정 검정, 면역탁도측정 검정, 미립자 표지된 면역측정 검정 및 면역방사측정 검정을 사용하는 면역측정 검정, 및 방사성, 효소, 형광, 시간-분해 형광 및 미립자 표지를 포함한 다양한 표지 유형을 사용하는 표지된 항원 및 표지된 항체 경쟁적 면역검정 방법을 포함한 경쟁적 면역검정 방법을 포함한다. 일부 면역검정은 임의의 표지된 모이어티의 사용 없이 직접적으로 항체 결합을 검출하는 방법을 사용한다. 모든 상기 면역검정 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Salgame et al., 1997 및 van Nieuwenhuijze et al., 2003]을 참조한다.

본 발명의 추가 측면에 따르면 조직 특이적 전사 인자에 특이적인 리간드 또는 결합제 및 뉴클레오솜 또는 그의 성분 부분에 특이적인 또 다른 리간드 또는 결합제를 포함하는, 뉴클레오솜에 부가된 조직 특이적 전사 인자 또는 보조인자의 검출을 위한 키트가, 본원에 기재된 방법에 따른 키트의 사용에 대한 지침서와 함께 제공된다.

본 발명의 추가 측면에 따르면 제1 전사 인자 또는 보조인자에 특이적인 리간드 또는 결합제 및 제2 전사 인자 또는 보조인자에 특이적인 또 다른 리간드 또는 결합제를 포함하는, 조직 특이적 염색질 단편의 검출을 위한 키트가, 본원에 기재된 방법에 따른 키트의 사용에 대한 지침서와 함께 제공된다.

본 발명의 추가 측면에 따르면,

(a) 본원에 기재된 방법에 따라 개체에서 암을 검출 또는 진단하는 단계; 이어서

(b) 상기 개체에게 상기 암에 적절한 항암 요법, 수술 또는 의약을 투여하는 단계

본 발명의 추가 측면에 따르면,

(a) 본원에 기재된 방법에 따라 개체에서 암의 발생 부위를 진단하는 단계; 이어서

(b) 상기 개체에게 상기 발생 부위에 적절한 항암 요법, 수술 또는 의약을 투여하는 단계

본 발명자들은 포획 항체로서 적절한 특이적 항-조직 특이적 전사 인자 항체와 조합하여, 본원에 기재된 검정을 위한 검출 항체로서 항-히스톤 항체를 사용하였다. 본 발명자들은 상기 검정을 사용하여, 특이적 조직 특이적 전사 인자를 함유하는 뉴클레오솜 부가물이 암을 갖는 대상체로부터 취한 혈액 샘플에서 측정될 수 있으며 비-침습적 또는 최소 침습적 바이오마커로서 사용하기에 탁월하다는 것을 나타내었다.

본 발명의 용도 및 방법은 뉴클레오솜에 부착 또는 결합될 수 있는 임의의 조직 특이적 전사 인자 또는 보조인자를 검출 또는 측정하는데 사용될 수 있다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.

본 발명자들은 본 발명의 방법이 조직 특이적 염색질 단편 및 조직 특이적 전사 인자-뉴클레오솜 부가물의 검출 및 측정을 위한 성공적인 방법이고, 이 방법이 대상체에서 암의 비-침습적 검출을 위한 및/또는 또 다른 암 검출 방법에 의해 (예를 들어 ctDNA 서열 방법에 의해) 검출된 원발 종양 또는 CUP의 확인을 위한 우수한 방법이라고 결론내린다.

본 발명은 이제 하기 비제한적 실시예를 참조하여 보다 상세하게 기재될 것이다.

실시예 1

혈청 샘플을 1명의 건강한 대상체, 유방암을 갖는 2명의 대상체 및 비뇨기 요로상피 방광암을 갖는 2명의 대상체로부터 취하였다 (GATA 3 암 조직 발현 시험에서 양성 결과를 제공하는 것으로 공지된 이행 세포암). 마이크로타이터 웰에 코팅된 GATA 3 전사 인자에 대한 고체 상 항체를 포함한, GATA 3에 대한 상업적으로 입수가능한 96 웰 연구 전용 ELISA 키트를 구입하였다. GATA 3은 유방암으로부터 취한 모든 또는 대부분의 생검 물질 샘플에서 발현된 조직 특이적 전사 인자이고, 그것은 또한 이행 세포 암종 및 피부 부속기 종양에서는 양성이지만 다른 암으로부터의 대부분의 샘플에서는 아니다. 고체 상 GATA 3 항체를 비오티닐화 항-뉴클레오솜 항체와 함께, 하기와 같이 무세포 뉴클레오솜 결합된 GATA 3에 대한 이중 항체 ELISA에서 사용하였다: 혈청 샘플 (50μl) 및 검정 완충제 (50μl)를 항-GATA 3 항체 코팅된 웰에 첨가하고, 2.5시간 동안 진탕하면서 실온 (대략 20℃)에서 인큐베이션하였다. 이어서, 샘플을 제거하고, 비오티닐화 항-뉴클레오솜 항체 (100μl)를 첨가하고, 1.5시간 인큐베이션하였다. 비오티닐화 항체 용액을 제거하고, 웰을 세척 완충제 (200μl)로 3회 세척하였다. 스트렙타비딘-HRP 접합체 용액을 웰에 첨가하고, 30분 인큐베이션하였다. 웰을 추가로 3회 세척하고, HRP 기질 용액 (2,2'-아지노비스 [3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산]-디암모늄 염 용액 100μl)을 첨가하고, 20분 동안 인큐베이션하였다. 정지 용액 (50μl)을 첨가하고, 웰의 광학 밀도 (OD)를 405nm에서 결정하였다.

건강한 대상체 또는 음성 대조군보다 유방암을 갖는 3명의 대상체 중 2명으로부터 취한 샘플에서 더 높은 ELISA 신호 및 더 높은 수준의 순환 무세포 뉴클레오솜-GATA 3 부가물이 관찰되었다. 이행 세포암을 갖는 2명의 대상체 중 1명은 또한 건강한 대상체에 비해 상승된 OD 수준을 가졌다. 결과는 도 1에 제시되고, 혈청 뉴클레오솜-GATA 3 부가물 검정이 암을 검출하는데 및/또는 유방암인 원발 발생 부위 불명의 암을 확인하는데 사용될 수 있다는 것 및 뉴클레오솜-GATA 3 부가물이 이러한 목적을 위한 바이오마커로서 사용될 수 있는 것을 예시한다.

실시예 2

혈청 또는 샘플을 갑상선암을 갖는 2명의 대상체, 폐암을 갖는 3명의 대상체 및 1명의 건강한 대상체로부터 취하였다. 마이크로타이터 웰에 코팅된 TTF-1 (갑상선 전사 인자 1)에 대한 고체 상 항체를 포함하는, TTF-1에 대한 상업적으로 입수가능한 96 웰 연구 전용 ELISA 키트를 구입하였다. TTF-1은 갑상선암 및 폐암으로부터 취한 모든 또는 대부분의 생검 물질 샘플에서 발현되지만 다른 암으로부터의 대부분의 샘플에서는 발현되지 않는 조직 특이적 전사 인자이다. 고체 상 TTF-1 항체를 비오티닐화 항-뉴클레오솜 항체와 함께, 실시예 1에 기재된 바와 같이 무세포 뉴클레오솜 결합된 TTF-1에 대한 이중 항체 ELISA에서 사용하였다.

건강한 대상체 또는 음성 대조군보다 갑상선암 환자로부터 취한 샘플에서 더 높은 ELISA 신호 및 더 높은 수준의 순환 무세포 뉴클레오솜-TTF-1 부가물이 관찰되었다. 폐암 환자의 혈액 중 순환 무세포 뉴클레오솜-TTF-1 부가물의 수준은 다소 상승되었다. 결과는 도 2에 제시된다.

후속 실험에서, 3명의 건강한 대상체로부터의 혈청 샘플 뿐만 아니라 갑상선암, 폐암, 췌장암, 직장암, 결장암 및 유방암으로 진단된 대상체로부터의 샘플을 순환 무세포 뉴클레오솜-TTF-1 부가물 수준에 대해 검정하여 검정의 조직 특이성을 확인하였다. 검정된 단일 갑상선암 환자에 대한 결과는 강력하게 양성이었다. 모든 4명의 폐암 환자, 모든 3명의 췌장암 환자 및 3명의 유방암 환자 중 2명에서의 수준은 낮았다. 놀랍게도, 모든 6명의 결장직장암 환자에서의 수준은 상승되었으며, 이는 순환 무세포 뉴클레오솜-TTF-1 부가물 수준이 원발부위 불명의 암을 결장직장 원발 암으로서 확인하는데 사용될 수 있다는 것을 나타낸다. 이것은 혈액 중 순환 무세포 뉴클레오솜-전사 인자 부가물 수준의 조직 특이성이 생검시에 제거된 암 조직에서의 전사 인자 발현 수준의 특이성과 반드시 동일하지는 않을 수 있다는 것을 나타낸다. 결과는 도 3에 제시된다.

뉴클레오솜-TTF-1 부가물 검정이 암을 검출하거나 또는 갑상선암 또는 결장직장암인 원발 발생 부위 불명의 암을 확인하는데 사용될 수 있다는 것 및 뉴클레오솜-TTF-1 부가물이 이러한 목적을 위한 바이오마커로서 사용될 수 있다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.

실시예 3

혈청 샘플을 3명의 건강한 대상체, 갑상선암으로 진단된 1명의 대상체, 폐암을 갖는 3명의 대상체, 췌장암을 갖는 3명의 대상체, 결장직장암을 갖는 6명의 대상체 (결장암을 갖는 3명 및 직장암을 갖는 3명) 및 유방암을 갖는 3명의 대상체로부터 취하였다. 마이크로타이터 웰에 코팅된 CDX2 (미측-유형 호메오박스 전사 인자-2)에 대한 고체 상 항체를 포함하는, CDX2에 대한 상업적으로 입수가능한 96 웰 연구 전용 ELISA 키트를 구입하였다. CDX2는 결장직장암으로부터 취한 모든 또는 대부분의 생검 물질 샘플에서 발현되지만 다른 암으로부터의 대부분의 샘플에서는 발현되지 않는 조직 특이적 전사 인자이다. 고체 상 CDX2 항체를 비오티닐화 항-뉴클레오솜 항체와 함께, 실시예 1에 기재된 바와 같이 무세포 뉴클레오솜 결합된 CDX2에 대한 이중 항체 ELISA에서 사용하였다.

건강한 대상체 또는 다른 암을 갖는 대상체 또는 음성 대조군보다 결장직장암 환자로부터 취한 샘플에서 더 높은 ELISA 신호 및 더 높은 수준의 순환 무세포 뉴클레오솜-CDX2 부가물이 관찰되었다. 1명의 건강한 대상체 및 유방암을 갖는 1명의 대상체는 또한 가양성 결과일 수 있는 상승된 수준을 가졌다. 결과는 도 4에 제시되며, 순환 무세포 뉴클레오솜-CDX2 부가물 수준이 암을 검출하거나 또는 결장직장암인 원발 발생 부위 불명의 암을 확인하는데 사용될 수 있다는 것 및 뉴클레오솜-CDX2 부가물이 이러한 목적을 위한 바이오마커로서 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.

본 발명자들은 성공적으로 3종의 원형 무세포 뉴클레오솜-조직 특이적 전사 인자 부가물 검정을 개발하였으며, 3종 모두 대상체가 이미 암으로 진단된 원발 부위 불명의 암을 확인하기 위한 임상 유용성을 나타냈다. 이것은 일반적인 효과라는 것 및 유사한 뉴클레오솜-조직 특이적 전사 인자 검정이, 암이 진단되거나 검출되어 있지만 원발 암의 발생 부위는 알려지지 않은 폭넓은 범위의 원발 암 질환의 확인을 위해 개발될 수 있다는 것이 명백하다. 유사한 조직 특이적 전사 인자 발현이 많은 다른 암에 대한 수술 또는 생검에 의해 제거된 암 조직 샘플에서 일어나는 것으로 공지되어 있다 (Kandalaft and Gown, 2015). 적절한 조직 특이적 염색질 단편 또는 조직 특이적 뉴클레오솜-전사 인자 또는 보조인자 부가물에 대한 실시예 1-3에 기재된 것과 유사한 유사 혈액 또는 다른 체액 기반 무세포 뉴클레오솜 부가물 검정은 암을 검출하거나 또는 이러한 전사 인자가 이미 확인된 폭넓은 범위의 암 및/또는 임의의 이러한 조직 특이적 전사 인자, 조직 특이적 전사 보조인자 또는 전사 인자 및/또는 보조인자 발현의 조직 특이적 조합이 확인될 수 있는 임의의 암에 대한 원발 부위 불명의 암을 확인하는데 사용될 수 있다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.

본원에 기재된 실시양태는 본 발명의 모든 측면에 적용될 수 있음을 이해할 것이다. 추가로, 본 명세서에서 인용된 특허 및 특허 출원을 포함하나 이에 제한되지는 않는 모든 공개문헌은 완전히 제시된 것처럼 본원에 참조로 포함된다.

참고문헌

Claims

DNA-조직 특이적 전사 인자 부가물을 생물학적 유체 내 바이오마커로 이용하여 대상체에서 암을 검출하거나 진단하기 위한 시험관내 방법으로서, 상기 조직 특이적 전사 인자는 GATA 3, CDX2, TTF-1, PAX8, WT1, NKX3.1, P63 또는 P40으로부터 선택되는 것인, 대상체에서 암을 검출하거나 진단하기 위한 시험관내 방법.
제1항에 있어서, DNA-조직 특이적 전사 인자 부가물이 대상체에서 암의 발생 부위를 확인하는 데 사용되는 것인 방법.
(i) 대상체로부터 수득한 생물학적 유체 샘플을 DNA 또는 DNA의 임의의 성분 부분, 또는 조직 특이적 전사 인자에 결합하는 제1 결합제와 접촉시키는 단계,
(ii) 제1 결합제가 DNA 또는 DNA의 임의의 성분 부분에 결합하는 경우에는, 샘플을 조직 특이적 전사 인자에 결합하는 제2 결합제와 접촉시키거나, 또는
제1 결합제가 조직 특이적 전사 인자에 결합하는 경우에는, 샘플을 DNA 또는 DNA의 임의의 성분 부분에 결합하는 제2 결합제와 접촉시키는 단계, 및
(iii) 샘플에서, 부가된 조직 특이적 전사 인자, DNA 또는 DNA의 임의의 성분 부분에 대한 상기 제2 결합제의 결합을 검출 또는 정량화하는 단계
를 포함하며,
여기서 DNA에 부가된 조직 특이적 전사 인자의 존재 또는 수준은 암의 발생 부위의 지표로서 사용되고, 상기 조직 특이적 전사 인자는 GATA 3, CDX2, TTF-1, PAX8, WT1, NKX3.1, P63 또는 P40으로부터 선택되는 것인,
대상체에서 암을 검출하고/거나 암의 발생 부위를 결정하는 방법.
제3항에 있어서,
(i) 대상체로부터 수득한 생물학적 유체 샘플을 DNA 또는 DNA의 임의의 성분 부분에 결합하는 제1 결합제와 접촉시키는 단계,
(ii) 샘플을, 조직 특이적 전사 인자에 결합하는 제2 결합제와 접촉시키는 단계, 및
(iii) 샘플에서, 부가된 조직 특이적 전사 인자에 대한 상기 제2 결합제의 결합을 검출 또는 정량화하는 단계
를 포함하는 방법.
제3항에 있어서,
(i) 대상체로부터 수득한 생물학적 유체 샘플을 조직 특이적 전사 인자에 결합하는 제1 결합제와 접촉시키는 단계,
(ii) 샘플을, DNA 또는 DNA의 임의의 성분 부분에 결합하는 제2 결합제와 접촉시키는 단계, 및
(iii) 샘플에서, DNA 또는 DNA의 임의의 성분 부분에 대한 제2 결합제의 결합을 검출 또는 정량화하는 단계
를 포함하는 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 원발 암인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 원발부위 불명의 전이 암을 갖는 대상체인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 이전에 암으로 진단된 것인 방법.
제8항에 있어서, 대상체가 이전에 순환 종양 DNA (ctDNA)를 바이오마커로서 사용하여 암으로 진단된 것인 방법.
제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 결합제가 항체, 항체 단편 또는 압타머(aptamer)인 방법.
(i) 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 방법에 정의된 바와 같이 대상체의 생물학적 유체 내 DNA에 부가된 조직 특이적 전사 인자를 검출 또는 측정하는 단계, 및
(ii) 검출된 DNA에 부가된 조직 특이적 전사 인자의 유형을 사용하여 대상체에 대한 적합한 치료를 결정하는 단계
를 포함하는, 의학적 치료를 위한 적합성에 대해 동물 또는 인간 대상체를 평가하는 데 필요한 정보를 제공하는 방법.
(i) 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 방법에 정의된 바와 같이 대상체의 생물학적 유체 내 DNA에 부가된 조직 특이적 전사 인자를 검출 또는 측정하는 단계,
(ii) 대상체의 생물학적 유체 내 DNA에 부가된 조직 특이적 전사 인자의 검출 또는 측정을 1회 이상 반복하는 단계, 및
(iii) 검출된 DNA에 부가된 조직 특이적 전사 인자의 수준에서의 임의의 변화를, 대상체의 상태에서의 임의의 변화에 대한 파라미터로서 사용하는 단계
를 포함하는, 동물 또는 인간 대상체의 치료를 모니터링하는 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 유체가 혈액, 혈청 또는 혈장으로부터 선택된 것인 방법.
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