CN109313192A - 核小体-转录因子复合体用于癌症检测的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及组织特异性转录因子‑核小体加合物或转录辅因子‑核小体加合物作为生物学流体中的生物标志用于检测或诊断受试者中的癌症的用途。本发明进一步涉及使用所述组织特异性转录因子或辅因子加合物鉴定受试者中的癌症发展位点。

Description

核小体-转录因子复合体用于癌症检测的用途
发明领域
本发明涉及用于通过最小侵入性血液检验的手段检测癌症，特别是鉴定具有未知原发的转移癌疾病的受试者中的原发癌的方法。
发明背景
广泛范围的免疫测定血液检验在临床上常用，以解决广泛范围的临床需求。几个说明性的实例包括检测或研究病毒疾病、心肌梗塞、甲状腺疾病、不育、妇科病况、炎症应答、免疫状态、变态反应、药物状态(药物的、雄激素的、性能增强的和消遣性的)等的用途。大的诊断公司提供的自动化免疫测定系统具有数百个免疫测定检验的项目单。免疫测定检验的许多优点包括其极端的分析灵敏性与特异性，组合稳健性和可靠性；连同最小侵入性的患者形式，其仅需一滴血，极端的灵活性，允许检验在大实验室中或在医生办公室中或以家用形式并且均以低成本进行。尽管如此，对于癌症检测，仅一种免疫测定血液检验在临床上常用；用于前列腺癌的前列腺特异性抗原(PSA)检验。其它典型的蛋白癌生物标志，例如CA125、CA19.9、CEA (癌胚抗原)和AFP (α-甲胎蛋白)用于监测癌症治疗但由于其临床准确度差不推荐用于癌症检测。
基于循环肿瘤细胞检测的非免疫测定的基于血液的癌症检测方法正在开发中，但在临床上没有普遍使用。相似地，用于循环肿瘤DNA (ctDNA)、RNA或其它循环核酸的方法正在开发中，但这些在临床上也没有广泛使用。存在各种各样的循环核酸方法。一些基于检测与癌症相关的ctDNA序列突变，或与癌症相关的其它DNA序列效应。其它实例包括基于检测与癌症相关的甲基化DNA序列或与癌症相关的微RNA序列的方法。DNA异常为所有癌症疾病的特征。癌症细胞的DNA与健康细胞在许多方面不同，包括，但不限于，点突变、甲基化状态、易位、基因拷贝数目、微卫星异常和DNA链完整性。任何这些突变可经受ctDNA检验。
当癌症在疾病的早期阶段被检测时，这当前有可能通过粪便检验、侵入性内窥镜检查方法、侵入性活组织检查方法、潜在危险的X射线扫描方法、MRI扫描方法、宫颈涂片检验或根据症状。这些方法均具有侵入性、不愉快、患者风险、患者依从性和/或高费用的缺点。一旦检出，癌症当前通常通过在活组织检查处移除的肿瘤组织的免疫组织化学(IHC)检验确认和诊断。早期检测癌症导致改善的患者结果和对健康护理提供者的财务效益，避免昂贵的晚期住院和治疗。不幸地，当前癌症常常未检出，直至其达到疾病发展晚期，此时其可能已经扩散超出原发肿瘤的位点，治疗选择更受限、更昂贵和不太有效，导致较差的患者结果。对更多和更好的癌症血液检验存在明确未满足的医疗需求。
诊断患有癌症的患者可呈现晚期或转移癌，其已经扩散超出原发癌发展的器官。在许多情况下原发癌最初发展的位点不清楚，这些情况称作未知原发的癌(CUP)或隐匿性肿瘤。在这些情况下原发肿瘤位点的鉴定具有重要的临床意义，因为癌症根据其最初在何处发展治疗，即使其已经扩散至身体的其它部分。对于给予的应靶向原发位点的癌的任何靶向疗法尤其如此。例如，如果原发性肺癌已经扩散至肝脏，其为伴随肝转移或继发的肺癌。其不是肝癌，因为癌细胞为癌性肺细胞。
在受试者呈现转移癌的许多情况下，原发癌的位点是清楚的。然而，在CUP中原发癌不能确定。这可能由于许多原因而发生，包括例如，由于继发癌症生长非常迅速，而原发癌仍小并且在扫描上不可见，或由于原发癌消失，可能由于免疫攻击或原发癌脱落(例如结直肠癌可从肠壁脱落并随粪便排出体外)。
当前存在转移性疾病的患者中的原发性肿瘤常常通过患者检查、患者症状、扫描和从活组织检查移除的肿瘤组织的免疫组织化学(IHC)检验定位。原发性肿瘤位点可通过组织特异性转录因子的IHC鉴定或确认。
循环肿瘤DNA分析或其它生物标志方法可揭示受试者中原发癌的存在情况，而不鉴定癌症位点。这可导致与CUP相似的情况(除了不必有任何转移存在)，其中受试者已知或疑似具有癌症，但不知道癌症位点。例如，使用ctDNA序列技术诊断的癌症可鉴定受试者的血液中与癌症相关的基因突变，指示癌症的存在情况但不指示癌症位点。对于通过循环肿瘤细胞技术或其它癌症检测方法检测癌症，可发生相似的情况，其可能不揭示检出的肿瘤的位点。
人体包含数百个细胞类型。所有这些细胞类型包含相同的基因组但在体内广泛不同的表型和不同的功能。该表型多样性是由于不同细胞类型中基因组的差别表达。差别基因表达的控制没有完全被理解，但基本机制包括通过许多与基因相关的互联的表观遗传信号的基因调节，包括控制染色质包装为常染色质或异染色质，控制核小体定位和核酸酶可接近位点、DNA甲基化和周围包裹DNA的核小体的组蛋白结构的变化，以及转录因子和转录辅因子表达和与其所结合的基因的相互作用的变化。
核小体是染色质结构的基本单位，并且由8个高度保守的核心组蛋白(包含各组蛋白H2A、H2B、H3和H4的一对)的蛋白复合物组成。在该复合物周围包裹着约146个碱基对的DNA。另一组蛋白H1或H5，作为接头并参与染色质致密化。DNA在通常被称为类似于“串上的珠(beads on a string)”的结构中缠绕连续核小体周围，并且这形成了开放或常染色质的基本结构。在致密或异染色质中，该串盘绕并超级盘绕成封闭和复杂的结构(Herranz和Esteller, 2007)。
成年人的正常细胞更新涉及通过细胞分裂每天约1011个细胞的产生并且主要由细胞凋亡导致类似数量的死亡。凋亡过程期间，染色质分解为片段，包括单核小体和寡核小体，其从细胞释放。在正常条件下这些被移除，并且健康受试者中存在的循环核小体的水平低。提高的水平存在于具有各种病况包括许多癌症、自身免疫疾病、炎症性病况、中风和心肌梗塞的受试者中(Holdenrieder & Stieber, 2009)。
单核小体和寡核小体可通过酶联免疫吸附测定(ELISA)检测，并且已经报道了几种方法(Salgame等人, 1997; Holdenrieder等人, 2001; van Nieuwenhuijze等人,2003)。这些测定通常使用抗组蛋白抗体(例如，抗H2B、抗H3或抗H1、H2A、H2B、H3和H4)作为捕获抗体，抗DNA或抗H2A-H2B-DNA复合体抗体作为检测抗体。已报道循环无细胞核小体水平的ELISA结果和如实时PCR (聚合酶链反应)所测量的循环DNA水平之间的相关系数为在血清中r=0.531和在血浆中r=0.350 (Holdenrieder等人, 2005)。
核小体ELISA方法在细胞培养物中使用，主要作为检测凋亡的方法(Salgame等人,1997; Holdenrieder等人, 2001; van Nieuwenhuijze等人, 2003)，并且还用于测量血清和血浆中的循环无细胞核小体(Holdenrieder等人, 2001)。濒死细胞所释放入循环中的无细胞血清和血浆核小体水平在许多不同的癌症研究中通过ELISA方法测量以评估其作为潜在的生物标志的用途(Holdenrieder等人, 2001)。已经报道平均循环核小体水平在所研究的大多数癌症中高。最高的循环核小体水平在肺癌受试者中观察到。然而，具有恶性肿瘤的受试者据报道具有显著不同的血清核小体浓度，发现一些具有晚期肿瘤疾病的受试者具有低循环核小体水平，在对于健康受试者所测量的范围内(Holdenrieder等人, 2001)。由于这一点以及升高的核小体水平的多种非癌症原因，循环核小体水平在临床上未用作癌症生物标志(Holdenrieder和Stieber, 2009)。
核小体的结构可由于组蛋白的转录后修饰(PTM)和变体组蛋白的包含而变化。组蛋白的PTM通常在八个核心组蛋白的尾巴上发生，常见的修饰包括赖氨酸残基的乙酰化、甲基化或泛素化以及精氨酸残基的甲基化和丝氨酸残基的磷酸化。已知组蛋白修饰涉及基因表达的表观遗传调节(Herranz和Esteller, 2007)。核小体的结构也可由于备选的组蛋白同种型或变体的包含而变化，所述同种型或变体为不同的基因或剪接产物并且具有不同的氨基酸序列。组蛋白变体可分类为许多家族，其再分为个体类型。大量组蛋白变体的核苷酸序列为已知的并且例如在国家人类基因组研究所NHGRI组蛋白数据库(National HumanGenome Research Institute NHGRI Histone DataBase) (Mariño-Ramírez等人, 2011和http://genome.nhgri.nih.gov/histones/complete.shtml)、GenBank (NIH基因序列)数据库、EMBL核苷酸序列数据库和日本DNA数据库(DDRJ)中公开可得。
健康的和患病的细胞中存在的组蛋白变体和组蛋白修饰模式已经在许多(多数为免疫组织化学)研究中显示不同(Herranz和Esteller, 2007)。用于临床用途的免疫组织化学方法的一个缺点为组织样品收集为侵入性的，涉及手术或活组织检查。
除了核小体结构和位置介导的表观遗传信号传导，细胞中基因表达的控制也通过修饰与核小体相关的DNA的结构，例如，通过DNA的甲基化介导(Herranz和Esteller,2007)。本领域已经知道一段时间，DNA可在胞嘧啶核苷酸的5位置甲基化以形成5-甲基胞嘧啶。全局DNA低甲基化为癌细胞的标志(Esteller, 2007和Hervouet等人, 2010)。全局DNA甲基化可在细胞中使用免疫组织化学技术研究。
已经知道许多年，除了核酸和组蛋白之外，染色质包含结合于其组分DNA和/或组蛋白的大量非组蛋白(Yoshida和Shimura, 1972)。这些染色质相关蛋白具有广泛不同的类型并且具有各种功能，包括转录因子、转录增强因子、转录阻抑因子、组蛋白修饰酶、DNA损伤修复蛋白等。染色质结合蛋白的研究主要通过染色质免疫沉淀(ChIP)方法进行。这些方法为本领域所熟知，但复杂、费力和昂贵。
在一个典型的ChIP方法中，细胞染色质交联，以致于所有的蛋白和核酸组分彼此共价连接。染色质然后剪切以形成单核小体和寡核小体制备物。将目的蛋白的抗体加入剪切的染色质以免疫沉淀包含蛋白的那些染色质片段。抗体通常连接固相(例如塑料珠)以促进分离包含目的蛋白的染色质复合体。交联然后逆转，蛋白通过用蛋白酶消化移除。将与染色质复合体相关的DNA使用任何各种技术，包括PCR接着凝胶电泳、DNA测序(ChIP-Seq)或DNA微阵列(ChIP-on-chip)分离和分析以测定与特定蛋白结合相关的DNA序列、基因或基因座。这些ChIP方法揭示与染色质结合的组蛋白相关的DNA序列。ChIP方法的衍生已经开发以促进研究非组蛋白与组蛋白和核小体的关联，包括例如组蛋白相关测定(Ricke和Bielinsky, 2005)。
包含核小体-蛋白或染色小体-蛋白加合物形式的非组蛋白的染色质片段也已经在循环中作为核小体-蛋白加合物检测。用于检测无细胞核小体-蛋白加合物的实例测定在WO2013/084002中描述。
除了其它表观遗传调节机制，差别基因表达通过转录因子表达和活性的变化调节。转录因子为包含DNA结合结构域(DBD)的物质，所述DNA结合结构域(DBD)结合与其表达待调节的一种或多种基因相关的特定基因序列。例如，雄激素受体(AR)为结合染色体中称为雄激素响应元件(ARE)的特定DNA序列并上调或下调包含ARE或受ARE调节的雄激素依赖性基因的表达的转录因子。当转录因子结合其靶基因序列时，其可促进或抑制基因表达。一些转录因子在所有或多数组织中表达。其它转录因子可在不同的组织中差别表达，因此更加组织特异。
组织特异性转录因子已经通过IHC显示存在于某些原发癌细胞中，但不存在于其它细胞中。例如，转录因子CDX2存在于胃肠癌细胞中，特别是结肠直肠癌细胞，并且通过IHC显示的其在活组织检查或手术移除的组织中的存在情况可用于鉴定原发性胃肠癌症。
相似地，组织特异性转录辅因子已经描述，包括，例如，FHL2，其经报道为前列腺和心脏组织特异的雄激素受体(AR)的辅因子(Muller等人; 2000)。
我们现在报道用于直接估计生物学样品中的转录因子-核小体和转录辅因子-核小体加合物的简单的免疫测定方法。通过选择组织特异性转录因子和/或辅因子，该方法可用作无侵入性或最小侵入性血液检验以检测癌症或者测定或确认具有转移性疾病的受试者中原发性肿瘤的位点。我们已经表明这样的核小体加合物可在血清样品中检测并且其具有在疾病中作为生物标志的用途。
发明概述
根据本发明的第一个方面，提供组织特异性转录因子-核小体加合物或转录辅因子-核小体加合物作为生物学流体中的生物标志用于检测或诊断受试者中的癌症的用途。
根据本发明的第二个方面，提供组织特异性转录因子-核小体加合物或转录辅因子-核小体加合物作为生物学流体中的生物标志用于鉴定或诊断先前诊断患有癌症的受试者中的癌症发展位点的用途。
根据本发明的进一步的方面，提供用于在受试者中检测癌症和/或测定癌症发展位点的方法，所述方法包括以下步骤：
(i) 从所述受试者获得生物学流体样品；
(ii) 使样品接触结合核小体或其组分的第一结合剂；
(iii) 使核小体或样品接触结合加合到核小体的组织特异性转录因子或辅因子的第二结合剂；和
(iv) 检测或定量所述第二结合剂与样品中加合的组织特异性转录因子或辅因子的结合；
其中加合到核小体的组织特异性转录因子或辅因子的存在情况或水平用作所述癌症的存在情况和/或发展位点的指示。
根据本发明的进一步的方面，提供用于在受试者中检测癌症和/或测定癌症发展位点的方法，所述方法包括以下步骤：
(i) 从所述受试者获得生物学流体样品；
(ii) 使样品接触结合组织特异性转录因子或辅因子的第一结合剂；
(iii) 使核小体或样品接触结合核小体或其组分的第二结合剂；和
(iv) 检测或定量所述第二结合剂与样品中的核小体或其组分的结合；
其中加合到核小体的组织特异性转录因子或辅因子的存在情况或水平用作所述癌症的存在情况和/或发展位点的指示。
根据本发明的进一步的方面，提供用于评估动物或人受试者对药物治疗的适合性的方法，所述方法包括以下步骤：
(i) 如本文所描述的方法中所定义的检测或测量受试者的生物学流体中加合到核小体的组织特异性转录因子或辅因子；和
(ii) 使用所检测的加合到核小体的组织特异性转录因子或辅因子的类型以确定用于受试者的合适的治疗。
根据本发明的进一步的方面，提供用于监测动物或人受试者的治疗的方法，所述方法包括以下步骤：
(i) 如本文所描述的方法中所定义的检测或测量受试者的生物学流体中加合到核小体的组织特异性转录因子或辅因子；
(ii) 一次或多次重复检测或测量受试者的生物学流体中加合到核小体的组织特异性转录因子或辅因子；和
(iii) 使用所检测的加合到核小体的组织特异性转录因子或辅因子的水平的任何变化作为受试者病况的任何变化的参数。
根据本发明的进一步的方面，提供在有需要的个体中治疗癌症的方法，其中所述方法包括下列步骤：
(a) 根据本文所描述的方法在个体中检测癌症和/或诊断癌症发展位点；接着
(b) 给予所述受试者适合所述癌症和/或发展位点的抗癌疗法、手术和/或药剂。
根据本发明的进一步的方面，提供包含两种或更多种转录因子或辅因子的组织特异性组合的染色质片段作为生物学流体中的生物标志用于检测受试者的癌症的用途。
根据本发明的进一步的方面，提供用于在受试者中检测癌症或测定癌症发展位点的方法，所述方法包括以下步骤：
(i) 从所述受试者获得生物学流体样品；
(ii) 使样品接触结合第一转录因子或辅因子的第一结合剂；
(iii) 使样品接触结合第二转录因子或辅因子的第二结合剂；和
(iv) 检测或定量所述第一种或第二结合剂在样品中的结合；
其中第一和第二转录因子或辅因子二者的组合在染色质片段中的存在情况和/或片段的水平用作所述癌症的存在情况和/或发展位点的指示。
附图简述
图1：对于从1个健康受试者、3个诊断患有乳腺癌的受试者、2个诊断患有膀胱癌的受试者获取的样品和一个阴性对照样品的循环无细胞核小体结合GATA 3加合物的ELISA结果。
图2：对于从1个健康受试者、3个诊断患有甲状腺癌的受试者、2个诊断患有肺癌的受试者获取的样品和一个阴性对照样品的循环无细胞核小体结合TTF-1加合物的ELISA结果。
图3：对于从3个健康受试者、1个诊断患有甲状腺癌的受试者、4个诊断患有肺癌的受试者、3个诊断患有直肠癌的受试者、3个诊断患有结肠癌的受试者、3个诊断患有乳腺癌的受试者获取的样品和一个阴性对照样品的循环无细胞核小体结合TTF-1加合物的ELISA结果。
图4：对于从3个健康受试者、1个诊断患有甲状腺癌的受试者、4个诊断患有肺癌的受试者、3个诊断患有直肠癌的受试者、3个诊断患有结肠癌的受试者、3个诊断患有乳腺癌的受试者获取的样品和一个阴性对照样品的循环无细胞核小体结合CDX2加合物的ELISA结果。
发明详述
根据本发明的第一个方面，提供组织特异性转录因子或辅因子核小体加合物作为生物学流体中的生物标志用于检测或诊断受试者中的癌症的用途。
在一个实施方案中，组织特异性转录因子-核小体加合物或转录辅因子-核小体加合物用于鉴定受试者中的癌症发展位点。
在一个实施方案中，受试者先前未诊断患有癌症(即表面上健康)。例如，癌症在筛查检验中在表面上健康的人中检出。在一个实施方案中，受试者已经鉴定具有与癌症相关的症状，即，癌症在具有疾病症状的人中检出。症状可提示癌症或提示特定组织或器官功能障碍。这样的症状可包括疼痛、异常出血、异常团块或肿胀、持久性咳嗽、呼吸短促和/或不明原因的体重损失。
本发明还可用于已经例如使用ctDNA检验、循环肿瘤细胞检验或根据症状诊断患有原发癌但未知癌症位置的患者。因此，根据本发明的第二个方面，提供组织特异性转录因子或辅因子核小体加合物作为生物学流体中的生物标志用于鉴定或诊断先前诊断患有癌症的受试者中的癌症发展位点的用途。
我们已经发现组织特异性转录因子或辅因子可在无细胞核小体上检出，因此可用于在患者中，例如在先前诊断患有癌症但未知其发展位点的患者中检测癌症和/或鉴定癌症起源。鉴定癌症的发展位点是关键性的，以选择适当的疗法并以此改善患者的预后和治疗。
在一个实施方案中，癌症为原发癌，即身体中癌症开始/起源的位置。在备选的实施方案中，癌症为继发癌，即一旦癌细胞已经扩散至身体的另一个部分，转移。
在一个实施方案中，受试者为具有未知原发的转移癌(CUP)的受试者。在该实施方案中，受试者已经通过鉴定转移诊断患有癌症，但定位原发癌仍很重要，以便提供适当的治疗。
在一个实施方案中，受试者先前使用循环核酸方法，例如使用ctDAN、RNA、miRNA或其它基于循环血液核酸检测癌症本身的方法诊断患有癌症。在进一步的实施方案中，受试者先前使用循环肿瘤DNA (ctDNA)作为生物标志诊断患有癌症。在一个实施方案中，受试者先前通过检测循环肿瘤细胞诊断患有癌症。在这些实施方案中，癌症在受试者中检出，但对癌症的起源位置信息不足或无信息。
根据本发明的进一步的方面，提供组织特异性转录因子-核小体加合物作为生物学流体中的生物标志用于鉴定或诊断具有转移疾病的受试者中原发癌的位点、位置或器官定位的用途。我们已经表明具有癌症的受试者的循环中存在3种这样的加合物，其包含TTF-1、CDX2或GATA 3，分别在甲状腺癌或肺癌组织(TTF-1)、胃肠癌组织(CDX2)和乳腺癌组织(GATA 3)中表达，并且其存在情况或水平可分别用于指示患者具有原发性甲状腺癌、结肠直肠癌或乳腺癌，并且这些组织特异性转录因子-核小体加合物在具有其它癌症的受试者或健康受试者的循环中通常不存在(或以低水平存在)。
文献报道TTF-1在多数肺癌组织样品以及多数甲状腺癌组织样品中表达。结肠直肠癌组织的组织TTF-1表达有时提高。因此TTF-1的组织测定可用于将CUP肿瘤鉴定为甲状腺或肺原发源，但一些其它癌症包括结肠直肠癌为可能的“假阳性”结果，其可错误地鉴定为肺癌或甲状腺癌。我们发现循环核小体结合的TTF-1加合物水平在具有甲状腺肿瘤的受试者的血液中提高，在具有肺癌的受试者中提高较少。意外地，我们还发现循环核小体结合的TTF-1加合物水平在诊断患有结肠直肠(结肠或直肠)癌的所有受试者的血液中提高。这表明体液中的无细胞核小体-转录因子加合物水平的组织特异性可能并非在所有情况下，与活组织检查移除的癌组织中的转录因子表达水平的特异性相同。
已知相似的组织特异性转录因子表达对于许多其它癌症发生(Kandalaft和Gown,2015)，本领域技术人员将会清楚，对于其中这样的转录因子已经鉴定的广泛的癌症，对于适当的组织特异性转录因子-核小体加合物的类似的核小体加合物测定可用于鉴定未知原发位点的癌症(所述转录因子包括例如，但不限于，GATA 3、CDX2、TTF-1、PAX8、WT1、NKX3.1、P63 (TP63)或P40)和/或其中任何这样的组织特异性转录因子表达可被鉴定的任何癌症。本发明的方法在其中受试者可具有未检测的或未知的癌症或已知具有癌症但未知原发性肿瘤的发展位点的任何情况，包括CUP情况下，或其中检出癌症但未知其发展位点的情况下具有临床用途。后一情况可，例如在使用基于ctDNA、RNA的癌症检测方法或其它基于循环血液核酸检测癌症本身的方法时或在检出未知原发源的循环肿瘤细胞时发生。存在多种多样的循环核酸方法。一些基于检测与癌症相关的ctDNA序列突变，或与癌症相关的其它DNA序列效应。其它基于检测与癌症相关的微RNA序列、与癌症相关的甲基化的DNA序列等。DNA异常为所有癌症疾病特有的。癌细胞的DNA与健康细胞在许多方面不同，包括，但不限于，点突变、甲基化状态、易位、基因拷贝数目、微卫星异常和DNA链完整性。然而，基因突变为所有癌症特有的，其存在情况可能不提供关于原发瘤性质的信息。作为说明性的实例，P53基因突变在癌症中普遍，其在ctDNA中的存在情况可用作用于癌症检测的生物标志。然而，由于P53突变在各种各样的癌症中存在，其存在情况将不提供关于原发癌性质的信息。本领域技术人员将会清楚，本发明可用于测定癌症发展的位点，其中无论哪种检测方法，癌症本身已经通过另一种方法使用任何生物标志或由于症状原因检出。因此，本发明在先前诊断患有癌症但不知道疾病的起源、位点或定位的患者中为有用的二次检验。
对“转录因子”的提及指结合DNA和通过促进(即激活因子)或抑制(即阻遏因子)转录而调节基因表达的蛋白。转录因子包含一个或多个DNA结合结构域(DBD)，其附着到邻近其所调节的基因的特定DNA序列。
如本文所描述的术语“组织特异性转录因子”指总是或通常在某些组织或癌症中表达但很少或从不在其它组织或癌症中表达的转录因子。这样的组织特异性转录因子可仅在有限数目的组织或癌症类型，例如仅1种、2种、3种、4种或5种组织或癌症类型中表达。循环中的无细胞核小体-转录因子加合物的存在情况或水平指示表达该转录因子的细胞的细胞死亡，并且其组织特异性可用作生物标志以指示组织起源为肿瘤发展的原发位点。
如本文所描述的术语“辅因子”或“转录因子辅因子”指调节转录因子的作用的蛋白。许多转录因子仅在调节结合并且有时涉及募集前起始复合体和RNA聚合酶的这些协作辅因子存在下结合其靶DNA序列。如本文所使用的，对涉及转录因子的实施方案的提及可等同应用于辅因子。
此外，已经描述转录因子和/或转录辅因子的组织特异性组合，其中转录因子(其关于其自身表达可能不是组织特异性的)通过组织特异性的组合转录因子控制而调节组织特异性的基因表达。因此，两种或更多种转录因子或辅因子(其个体表达可能不是组织特异性的)的结合可事实上调节组织特异性基因的表达，其中基因的表达需要存在两种或更多种转录因子或辅因子。因此，对“组织特异性”转录因子和辅因子的提及包括共同起作用以达到组织特异性的转录因子和/或辅因子组合，即在一个实施方案中，本文所描述的方面包括检测组织特异性的转录因子和/或辅因子组合。
术语“生物标志”意指过程、事件或情况的独特的生物学或生物学衍生的指示物。生物标志可用于癌症的差异诊断方法，例如，预后评估和监测疗法结果，鉴定最有可能响应特定治疗性治疗的患者，药物筛选和开发。生物标志及其用途对鉴定新药治疗和发现药物治疗的新靶标很有价值。
根据本发明的进一步的方面，提供组织特异性转录因子-核小体或辅因子-核小体加合物作为血液中的生物标志用于鉴定或诊断在受试者中检出但未知癌症位点的原发癌的位点的用途。在一个实施方案中，由于症状原因(即基于患者症状)受试者中疑似存在癌症，并且本发明用于确认癌症的存在情况和/或位点、位置或器官定位。
本发明旨在检测体液中与核小体结合的组织特异性转录因子或辅因子。这可通过从受试者获取体液样品和进行双抗体ELISA检验(其中一种抗体定向结合核小体，另一种抗体定向结合与核小体结合或加合的组织特异性转录因子或辅因子)的方式进行。然而，定向结合核小体的抗体不必定向于整个核小体复合体，而是可能定向于核小体的构成部分。在本发明的这一实施方案中，用于结合核小体的抗体可定向结合核小体的任何构成部分，例如特定的组蛋白、组蛋白修饰、组蛋白变体或同种型或者DNA或者特定核苷酸例如5-甲基胞嘧啶。类似地，用于结合组织特异性转录因子的抗体可定向结合转录因子的任何构成部分或结构域。在转录因子为由多种蛋白组成的蛋白复合体时，任何这些蛋白可相似地被抗体靶向。
根据本发明的进一步的方面，提供用于在受试者中检测癌症和/或测定癌症发展位点的方法，所述方法包括以下步骤：
(i) 从所述受试者获得生物学流体样品；
(ii) 使样品接触结合核小体或其组分或者加合到核小体的组织特异性转录因子或辅因子的第一结合剂；
(iii) 当第一结合剂结合核小体或其组分时，使核小体或样品接触结合加合到核小体的组织特异性转录因子或辅因子的第二结合剂，或者当第一结合剂结合加合到核小体的组织特异性转录因子或辅因子时，所述第二结合剂结合核小体或其组分；和
(iv) 检测或定量所述第二结合剂与样品中加合的组织特异性转录因子或辅因子、核小体或其组分的结合；
其中加合到核小体的组织特异性转录因子或辅因子的存在情况或水平用作所述癌症的存在情况和/或发展位点的指示。
根据本发明的进一步的方面，提供用于在受试者中检测癌症和/或测定癌症发展位点的方法，所述方法包括以下步骤：
(i) 从所述受试者获得生物学流体样品；
(ii) 使样品接触结合核小体或其组分的第一结合剂；
(iii) 使核小体或样品接触结合加合到核小体的组织特异性转录因子或辅因子的第二结合剂；和
(iv) 检测或定量所述第二结合剂与样品中加合的组织特异性转录因子或辅因子的结合；
其中加合到核小体的组织特异性转录因子或辅因子的存在情况或水平用作所述癌症的存在情况和/或发展位点的指示。
本领域技术人员将会清楚的是，检测结合剂可选择为定向结合加合的组织特异性转录因子或辅因子，或者定向结合核小体或核小体的构成部分。
因此，根据本发明的进一步的方面，提供用于在受试者中检测癌症和/或测定癌症发展位点的方法，所述方法包括以下步骤：
(i) 从所述受试者获得生物学流体样品；
(ii) 使样品接触结合加合到核小体的组织特异性转录因子或辅因子的第一结合剂；
(iii) 使核小体或样品接触结合核小体或其组分的第二结合剂；和
(iv) 检测或定量所述第二结合剂与样品中的核小体或其组分的结合；
其中加合到核小体的组织特异性转录因子或辅因子的存在情况或水平用作所述癌症的存在情况和/或发展位点的指示。
本发明的方法也可用于先前诊断患有癌症的受试者中。
如上文所指出的，组织特异性可通过与一种或多种其它转录因子或辅因子协同结合赋予转录因子，并且这些多种辅因子可紧密共定位于基因组中的位点(例如参见Zhang &Glass, 2013; 和Yu等人, 2006)。这意指细胞死亡时的染色质消化将会导致包含多种转录因子的染色质片段。这样的染色质片段可在核小体存在或不存在下包含多种转录因子。包含多种转录因子的染色质片段可用在本发明的进一步的方面中。
尽管转录因子和辅因子共定位常常由于其各自的DNA结合位点在基因组中共定位而发生，但其结合位点分开较远的转录因子和辅因子的共定位也可由于DNA中成环而发生，其中将更远的位点放在一起用于基因调节。本领域技术人员将会清楚的是，染色质片段可还包含由这样的环产生的转录因子和辅因子的组织特异性组合。
如本文所使用的术语“染色质片段”指其起源位于细胞的染色体中的蛋白和核酸的复合体。染色质片段可包含核小体和/或相关的DNA和/或多蛋白-核酸复合体中任何各种各样的非组蛋白染色质相关蛋白。非组蛋白染色质相关蛋白的一些实例包括转录因子、辅因子、共激活因子、共阻遏因子、RNA聚合酶部分、延伸因子、染色质重塑因子、介导物、STAT部分、上游结合因子(UBF)等。
根据本发明的进一步的方面，提供包含或包括两种或更多种转录因子或辅因子的组织特异性组合的染色质片段作为生物学流体中的生物标志用于检测受试者中的癌症的用途。本领域技术人员将会清楚的是，一起赋予组织特异性的两种转录因子或辅因子可在单个ELISA类型测定中，例如使用各自定向结合两种转录因子或辅因子之一的两种抗体检测或测量。备选地，一起赋予组织特异性的两种转录因子或辅因子可在单独的ELISA类型测定中，例如使用如本文所描述的两种单独的转录因子或转录辅因子-核小体加合物测定或两种单独的转录因子或转录辅因子-DNA加合物测定检测或测量。本领域技术人员还将清楚的是，一起赋予组织特异性的多种转录因子或辅因子可在单独的ELISA类型测定中，例如使用如本文所描述的3、4或更多种单独的转录因子或转录辅因子-核小体加合物测定或单独的转录因子或转录辅因子-DNA加合物测定检测或测量。
将理解的是，包含赋予组织特异性的(组织特异性)转录因子或辅因子的染色质片段自身为组织特异性的。类似地，包含赋予组织特异性的两种或更多种转录因子或辅因子的组织特异性组合的染色质片段自身为组织特异性的。因此，如本文所描述的术语“组织特异性的染色质片段”指包含组织特异性转录因子或辅因子或者包含两种或更多种转录因子或辅因子的组织特异性组合的染色质片段。
组织特异性组合可用于鉴定受试者中的癌症发展位点。因此，根据本发明的进一步的方面，提供包含或包括两种或更多种转录因子或辅因子的组织特异性组合的染色质片段作为生物学流体中的生物标志用于鉴定或诊断受试者中的癌症发展位点的用途。
根据本发明的进一步的方面，提供用于在受试者中检测癌症或测定癌症发展位点的方法，所述方法包括以下步骤：
(i) 从所述受试者获得生物学流体样品；
(ii) 使样品接触结合第一转录因子或辅因子的第一结合剂；
(iii) 使样品接触结合第二转录因子或辅因子的第二结合剂；和
(iv) 检测或定量所述第一或第二结合剂在样品中的结合；
其中包含第一和第二转录因子或辅因子二者的染色质片段的存在情况或水平用作所述癌症的存在情况和/或发展位点的指示。
将理解的是，(iv)不需要测量两种结合的抗体，因为来自任一的信号将仅在两种抗体均结合时出现。在一个优选的实施方案中，定向结合第一转录因子或辅因子的第一结合剂固定在固体表面，而定向结合第二转录因子或辅因子的第二结合剂用可检测标记标记。将结合剂暴露于样品中的染色质片段并检测固相结合的标记的抗体。将理解，根据本发明的该方面进行的免疫测定将仅在第一和第二结合剂二者均结合第一和第二转录因子或辅因子时给出信号，这将仅在两种转录因子或辅因子共定位在生物学样品中的染色质片段内时发生。
在一个实施方案中，组合在染色质片段中检出。在进一步的实施方案中，染色质片段包含DNA和两种或更多种转录因子。在另一个实施方案中，染色质片段包含两种或更多种转录因子和一个或多个核小体。
两种或更多种转录因子或辅因子与单个基因或基因启动子座位同时结合可为单一组织或有限数目的组织特异性的。在这样的转录因子和/或辅因子的组织特异性同时结合发生时，结合基序通常极其接近，相隔小于200个碱基对。
这种协作因子可将组织特异性赋予许多自身广泛表达的信号依赖性转录因子的作用。实例包括通过细胞表面受体被胞外信号激活的多种多样的转录因子家族的成员，包括，但不限于，核激素受体、STAT转录因子、NF-κB家族成员、CREB等。因此，广泛表达的细胞表面受体可调节不同组织中的各种不同的基因，各自以组织特异性的方式。报道的实例包括雄激素受体与转录因子FoxA1协作调节前列腺特异性基因转录、与转录因子Hnf4α协作调节肾特异性基因转录和与转录因子AP-2α协作调节附睾特异性基因转录(Pihlajamaa,2014)。Levy等人, 2007、Zhao等人, 2010和Zhang & Glass, 2013中报道了其它核激素受体的类似实例，其通过引用结合到本文中。
适合用于本发明的转录因子和辅因子的大量组织特异性组合已知并且可在公开可用的数据库，包括例如Wilmer Eye Institute of Johns Hopkins University的生物信息学实验室开发的组织特异性基因表达和调节(Tissue Specific Gene Expression andRegulation, TiGER)数据库找到。转录因子或辅因子的三个示例对在以下示出，其各自具有对多种组织(包括周围神经系统(PNS)和乳腺(乳房))的组织特异性：
膀胱 ARNT:SREBP1 MAX:SREBP1 SREBP1:MYC/MAX
血液 ELF1:PEA3 ETF:NRF1 PEA3:PU.1
骨 EF-C:MIF1 EF-C:RFX1 GATA-3:MIF1
骨髓 ETF:NRF1 MAX:SREBP1 NRF1:STAT3
脑 AP2α:ETF C/EBP:PBX1 ETF:LBP1
宫颈 CREB:NRF1 ELK1:NRF1 ETF:NRF1
结肠 AFP1:HNF1 CDP:FOXO4 CDP:HNF1
眼 CHX10:CRX CHX10:GATA6 CRX:PITX2
心脏 AP1:MEF2 AP1:RSRFC4 FOXJ2:POU3F2
肾 CRX:HNF1 GCNF:HNF1 COUP-TF/HNF4:HNF1
喉 AP1:NFE2 AP1:TCF11/MAFG BACH1:NFE2
肝 CDP:HNF1 C/EBPγ:HNF1 E4BP4:HNF1
肺 ETF:MYC/MAX ETF:LBP1 ETF:TBP
淋巴结 c-Ets-1:c-Ets-2 ELK1:PU.1 ICSBP:c-Ets-2
乳房 E2F:SRY ETF:TAX/CREB ETF:ZID
肌肉 AP-4:MEF2 MEF2:MYOD MEF2:RSRFC4
卵巢 AP2α:VDR CREB:MAZ DBP:VDR
胰 ATF:HEB ATF:NF-muE1 ATF:NRL
PNS CREB:RSRFC4 HNF1:SRY MYOD:OCT1
胎盘 ATF1:CHX10 ATF1:LHX3 ATF:CHX10
前列腺 AFP1:LHX3 CART1:LHX3 C/EBPγ:LHX3
皮肤 AREB6:ALX4 AREB6:ARP-1 AREB6:E47
肠 CART1:LHX3 HNF1:LHX3 HNF1:NKX6-2
软组织 C/EBPγ:FOXO4 FOXO1:SF1 FOXO4:TBP
脾 E12:c-Ets-1 GCM:NFKB1 LBP1:MYOD
胃 AP2γ:ETF AREB6:NFE2 ER:HIF1
睾丸 AP2:NRF1 EGR1:NRF1 EGR3:NRF1
胸腺 ATF:TAX/CREB c-Ets-1:c-Ets-2 ETF:NRF1
舌 ATF:CREB ATF:CREBP1 CREBP1:CREB
子宫 E4BP4:POU1F1 E4BP4:POU3F2 NKX6-2:POU3F2
根据本发明的进一步的方面，提供用于两种或更多种组织特异性转录因子或辅因子的包含转录因子/辅因子组生物标志的测定。在个体转录因子/辅因子具有有限的组织特异性并且其组合组织特异性大于其个体组分测定时，本发明的该方面可为有用的。在本发明的该方面中，转录因子可能生物学上无联系并且可能不存在于单一染色质片段上，但仍可一起赋予组织特异性。这样的转录因子/辅因子组合可在单独的ELISA类型测定中，例如使用如本文所描述的一组2、3、4或更多种单独的转录因子或转录辅因子-核小体加合物测定或单独的转录因子或转录辅因子-DNA加合物测定检测或测量。
根据本发明的进一步的方面，用于生物学流体中两种或更多种转录因子/辅因子的组合存在情况或水平的组用于指示癌症的存在情况和/或其发展位点。在本发明的该方面，转录因子/辅因子关于其DNA结合位点的部位不必紧密定位，不必包含在单个染色质片段内。这样的两种或更多种转录因子/辅因子的组合可各自直接测定而不考虑其是否为染色质片段的构成部分。在本发明的该方面，任何用于检测每一转录因子/辅因子的方法均可使用，包括但不限于，单一抗体(或其它结合剂)免疫测定方法、双抗体(或其它结合剂)免疫测定方法、质谱方法、ChIP方法或任何其它合适的分析方法。生物学流体中两种或更多种转录因子/辅因子的组合存在情况或水平足以指示癌症的存在情况和/或其发展位点。
本领域技术人员将清楚，组织特异性无细胞转录因子和/或辅因子及其组合在生物学流体中可认为是细胞或染色质起源的组织特异性生物标志，无论是否结合核小体或DNA。根据本发明的进一步的方面，提供生物流体中组织特异性的无细胞转录因子或辅因子生物标志，或一组这样的生物标志。在本发明的该方面，用于检测无细胞转录因子或辅因子的任何方法均可使用，包括但不限于，单一抗体(或其它结合剂)免疫测定方法、双抗体(或其它结合剂)免疫测定方法、质谱方法、ChIP方法或任何其它合适的分析方法。生物学流体中转录因子/辅因子或其组的存在情况或水平用于指示癌症的存在情况或水平和/或其发展位点。
本领域技术人员将清楚，各种各样的免疫化学和其它分析方法可与本发明结合用于测量包含转录因子-和/或辅因子-核小体加合物的组织特异性染色质片段。各种分子生物学方法也适合结合本发明使用，包括例如但不限于基于染色质免疫沉淀的方法(ChIP)或用于分析染色质材料的其它方法。非免疫化学方法包括任何色谱或质谱方法以及涉及分离组织特异性转录因子-核小体加合物和通过免疫化学、色谱、质谱或其它手段测量分离的组织特异性转录因子的任何方法。用于分离蛋白复合体或加合物和蛋白-核酸复合体或加合物的方法为本领域所熟知，例如但不限于，通过将所述加合物暴露于酸性或碱性pH介质或高盐浓度，或通过机械或超声方法或者通过生物学消化或其它基于酶的方法。因此，根据本发明的进一步的方面，提供用于在受试者中检测癌症的存在情况或测定癌症发展位点的方法，所述方法包括以下步骤：
(i) 从所述受试者获得生物学流体样品；
(ii) 分离组织特异性转录因子或辅因子与其在样品中加合的核小体或染色质片段；
(iii) 检测或定量分离的组织特异性转录因子或辅因子；
其中组织特异性转录因子或辅因子的存在情况或水平用作所述癌症的发展位点的指示。
在本发明的进一步的方面，组织特异性转录因子或辅因子结合DNA，并且DNA-组织特异性转录因子或辅因子加合物在体液中测量并如本文所述用作生物标志。在一个实施方案中，DNA-组织特异性转录因子或辅因子加合物在体液中按照本文所描述的方法使用定向结合组织特异性转录因子或辅因子的结合剂组合定向结合DNA或DNA的任何构成部分的另一种结合剂检测。
直接结合其靶核小体DNA的转录因子在本领域称为先驱转录因子(pioneeringtranscription factor)。然而，许多转录因子仅在存在调节结合并且还可赋予进一步的组织特异性的协同辅因子存在时结合其靶DNA序列。例如，FoxA1为雄激素受体(AR)在前列腺组织中结合雄激素响应元件(ARE)和雌激素受体(ER)在乳腺癌中结合雌激素响应元件(ERE)所需的辅因子。因此，在本发明的一个实施方案中，无细胞核小体结合的(转录因子的)辅因子被测量并用于鉴定癌症的发展位点。转录因子也可，或可不，为与辅因子一起结合核小体。无细胞核小体结合的辅因子可在转录因子存在或不存在下测量。
在一个实施方案中，组织特异性辅因子为FoxA1。如果辅因子为FoxA1，癌症的发展位点可选自：乳腺和前列腺。
在优选的实施方案中，组织特异性转录因子选自：GATA 3、CDX2、TTF-1、PAX8、WT1、NKX3.1、P63 (TP63)或P40。表1列出癌组织中与这些转录因子相关的肿瘤。
表1：癌组织中的组织特异性转录因子及其相关肿瘤的实例
转录因子 相关肿瘤
GATA 3 乳腺、唾液腺、移行细胞癌、皮肤附属器肿瘤
CDX2 结肠直肠、胰腺、胃癌
TTF-1 肺腺癌、甲状腺、神经内分泌癌
PAX8 妇科、甲状腺、肾细胞癌
WT1 卵巢、间皮瘤
NKX3.1 前列腺
P63 (TP63) 鳞状细胞癌、移行细胞癌、胸腺瘤、唾液腺、滋养细胞肿瘤
P40 鳞状细胞癌、移行细胞癌、胸腺瘤、唾液腺、滋养细胞肿瘤
表1中的实例为非详尽的。通过本发明的方法在体液中检出的核小体转录因子加合物水平的组织特异性可能有时与癌组织中的转录因子表达水平不同。
在一个实施方案中，所述组织特异性转录因子为GATA 3，癌症的发展位点选自：乳腺、唾液腺、移行细胞癌和皮肤附属器肿瘤。
在一个实施方案中，所述组织特异性转录因子为CDX2，癌症的发展位点选自：结肠直肠和胃癌。
在一个实施方案中，所述组织特异性转录因子为TTF-1，癌症的发展位点选自：肺腺癌、结肠直肠癌、甲状腺和神经内分泌癌。
在一个实施方案中，所述组织特异性转录因子为PAX8，癌症的发展位点选自：妇科、甲状腺和肾细胞癌。
在一个实施方案中，所述组织特异性转录因子为WT1，癌症的发展位点选自：卵巢和间皮瘤。
在一个实施方案中，所述组织特异性转录因子为NKX3.1，癌症的发展位点为前列腺。
在一个实施方案中，所述组织特异性转录因子为P63 (TP63)，癌症的发展位点选自：鳞状细胞癌、移行细胞癌、胸腺瘤、唾液腺和滋养细胞肿瘤。
在一个实施方案中，所述组织特异性转录因子为P40，癌症的发展位点选自：鳞状细胞癌、移行细胞癌、胸腺瘤、唾液腺和滋养细胞肿瘤。
所述方法可使用定向于核小体自身的抗体组合定向结合加合到核小体的组织特异性转录因子的抗体，或者使用定向于核小体组分的抗体再次组合定向结合加合到核小体的组织特异性转录因子的抗体进行。类似地，所述方法可使用定向结合DNA或DNA的任何组分，或者特定核苷酸或修饰的核苷酸例如5-甲基胞嘧啶的抗体进行。
在一个实施方案中，结合核小体或其组分的结合剂定向结合特定的组蛋白、组蛋白修饰、组蛋白变体或同种型或者特定核苷酸。在进一步的实施方案中，结合核小体或其组分的结合剂定向结合DNA或核苷酸，包括修饰的核苷酸例如5-甲基胞嘧啶，并检测DNA结合的转录因子。
术语“结合剂”指能够特异性结合生物标志(即核小体或加合到核小体的组织特异性转录因子)的配体或结合剂，例如天然存在或化学合成的化合物。根据本发明的配体或结合剂可包括能够特异性结合生物标志的肽、抗体或其片段或者合成的配体例如塑料抗体(plastic antibody)或者适体或寡核苷酸。抗体可为多克隆或单克隆抗体或其能够特异性结合靶标的片段。根据本发明的配体或结合剂可用可检测的标志，例如发光的、荧光的、酶或发射性标志标记；备选地或额外地，根据本发明的配体可用亲和标签，例如生物素、抗生物素蛋白、链霉亲和素或His (例如6-His)标签标记。在一个实施方案中，结合剂选自：抗体、抗体片段或适体。在进一步的实施方案中，所使用的结合剂为抗体。术语“抗体”、“结合试剂”或“结合剂”在本文中可交换地使用。
在一个实施方案中，样品为生物学流体(在本文中与术语“体液”可交换地使用)。流体样品可为从受试者获取的任何生物学流体样品，包括但不限于，脑脊液(CSF)、全血、血清、血浆、月经血、子宫内膜液、尿、唾液或其它体液(粪便、泪液、滑液、痰)、呼吸气体(breath)(例如作为凝结的呼吸气体)或来自其的提取物或纯化物或其稀释物。生物学样品还包括来自活受试者的或死后获取的样本。样品可例如适当时经稀释或浓缩制备，并以通常方式储存。在进一步的实施方案中，生物学流体样品选自：血液或血清或血浆。本领域技术人员将清楚，检测体液中的核小体加合物具有为不需活组织检查的最小侵入性方法的优点。
在一个实施方案中，受试者为哺乳动物受试者。在进一步的实施方案中，受试者选自人或动物(例如小鼠)受试者。
在一个实施方案中，核小体为无细胞单核小体或寡核小体。
将理解的是，本发明的用途和方法可体外、离体和/或体内进行。
根据本发明的进一步的方面，提供用于测定或诊断动物或人受试者中原发性肿瘤的性质的方法，所述方法包括以下步骤：
(i) 检测或测量受试者的生物学流体中染色质片段中或加合到核小体的一种或多种组织特异性转录因子或辅因子；和
(ii) 使用染色质片段中或加合到核小体的一种或多种组织特异性转录因子或辅因子的检测以鉴定受试者中原发性肿瘤的性质。
在本发明的一个实施方案中，样品中染色质片段中或加合到核小体的一种或多种组织特异性转录因子的存在情况或水平用于确定对于需要这样的治疗的受试者最佳的治疗方案。本领域技术人员将理解的是，组织特异性染色质片段或转录因子-核小体加合物可用于鉴定癌症的位点、位置和/或器官定位，这可用于确定最佳治疗，即基于癌症的起源/定位。
根据本发明的进一步的方面，提供用于评估动物或人受试者对医学治疗的适合性的方法，所述方法包括以下步骤：
(i) 检测或测量受试者的生物学流体中染色质片段中或加合到核小体的一种或多种组织特异性转录因子或辅因子；和
(ii) 使用所检测的染色质片段中或加合到核小体的组织特异性转录因子或辅因子的类型以确定受试者的合适治疗。
根据本发明的进一步的方面，提供用于监测动物或人受试者的治疗的方法，所述方法包括以下步骤：
(i) 检测或测量受试者的生物学流体中染色质片段中或加合到核小体的一种或多种组织特异性转录因子或辅因子；
(ii) 一次或多次重复检测或测量受试者的生物学流体中染色质片段中或加合到核小体的一种或多种组织特异性转录因子或辅因子；和
(iii) 使用所检测的染色质片段中或加合到核小体的一种或多种组织特异性转录因子或辅因子的水平的任何变化作为受试者病况的任何变化的参数。
检验样品中组织特异性染色质片段或转录因子-或辅因子-核小体加合物的水平相对于早期从同一受试者获取的先前检验样品中的水平的变化可指示所述疗法对病症或疑似病症的有益效果，例如稳定或改善。此外，一旦治疗已经完成，本发明的方法可周期性地重复以便监测疾病的复发。
在一个实施方案中，组织特异性的染色质片段或转录因子核小体加合物作为一组测量之一检测或测量。例如，组织特异性转录因子核小体加合物可与对同一组织特异的其它生物标志一起测量，例如与Kandalaft和Gown, 2015中所描述的组织特异性标志组合。
在本发明的进一步的实施方案中，提供用于检测或诊断癌症疾病的类型以评估药物或其它治疗选项应靶向的最佳癌症类型的方法，包括作为一组检验的一部分，检验取自已经诊断患有癌症的受试者的样品中加合到核小体的组织特异性转录因子的存在情况或水平。
因此，这样的检验组可，例如，由包含不同组织特异性转录因子的核小体加合物的两个或更多个或多重测量组成。
由于本文所描述的组织特异性染色质片段和转录因子核小体加合物指示疾病的定位，这些加合物可用于在体外和/或体内测定中鉴定新的治疗化合物。因此，本发明的核小体加合物可用在用于筛选调节核小体加合物的水平并因此能够靶向特定癌症类型的化合物的方法中。
因此，提供鉴定能够靶向受试者中的特定癌症类型的物质的方法，包括给予受试者动物检验物质和检测和/或定量来自受试者的检验样品中存在的组织特异性染色质片段或转录因子核小体加合物的水平。
有效的差异癌症类型诊断和监测方法通过建立正确的诊断，允许快速鉴定最适当的治疗(因此减少不必要的对有害药物副作用的暴露)和降低复发率，提供非常有力的具有改善预后潜能的“患者方案”。
将理解的是，鉴定和/或定量可通过适合鉴定特定蛋白在来自患者的生物学样品或者生物学样品的纯化物或提取物或其稀释物中的存在情况和/或量的任何方法进行。在本发明的方法中，定量可通过测量一种或多种样品中生物标志的浓度进行。可在本发明的方法中检验的生物学样品包括如上文中所定义的那些。样品可，例如适当时经稀释或浓缩制备，并以通常的方式储存。
鉴定和/或定量生物标志可通过检测生物标志或其片段，例如具有C端截短或N端截短的片段进行。片段适当地大于4个氨基酸长，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸长。
生物标志可例如通过SELDI或MALDI-TOF直接检测。备选地，生物标志可经由与能够特异性结合生物标志的一种或多种配体例如抗体或其生物标志结合片段，或者其它肽或配体例如适体或寡核苷酸的相互作用直接或间接检测。配体或结合剂可具有可检测的标记，例如发光的、荧光的或放射性标记，和/或亲和标签。
例如，检测和/或定量可通过选自以下的一种或多种方法进行：SELDI (-TOF)、MALDI (-TOF)、基于1-D凝胶的分析、基于2-D凝胶的分析、质谱(MS)、反相(RP) LC、尺寸渗透(凝胶过滤)、离子交换、亲和、HPLC、UPLC和其它基于LC或LC MS的技术。适当的LC MS技术包括ICAT® (Applied Biosystems, CA, USA)或iTRAQ® (Applied Biosystems, CA,USA)。也可使用液相色谱(例如高压液相色谱(HPLC)或低压液相色谱(LPLC))、薄层色谱、NMR (核磁共振)光谱学。
根据本发明的癌症的差异诊断或监测的方法可包括通过SELDI TOF或MALDI TOF分析样品以检测生物标志的存在情况或水平。这些方法也适合于预后、监测疗法结果、鉴定最有可能响应特定治疗性治疗的患者，用于药物筛选和开发，和鉴定药物治疗的新靶标。
鉴定和/或定量分析物生物标志可使用免疫学方法进行，所述方法涉及能够特异性结合生物标志的抗体或其片段。合适的免疫学方法包括夹心免疫测定例如夹心ELISA(其中分析物生物标志的检测使用识别分析物生物标志上的不同表位的两种抗体进行)、放射免疫测定(RIA)、直接、间接或竞争性酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)、蛋白质印迹、免疫沉淀和任何基于颗粒的免疫测定(例如使用金、银或胶乳颗粒、磁性颗粒或Q点)。免疫学方法可例如以微量滴定板或条带(strip)形式进行。
本发明的免疫测定包括利用酶检测方法的免疫测量测定(例如ELISA)、荧光标记的免疫测量测定、时间分辨荧光标记的免疫测量测定、化学发光免疫测量测定、免疫比浊测定、颗粒标记的免疫测量测定以及免疫放射测定和竞争性免疫测定方法(包括标记的抗原和标记的抗体竞争性免疫测定方法，采用各种标记类型，包括放射性、酶、荧光、时间分辨荧光和颗粒标记)。一些免疫测定利用方法以直接检测抗体结合而不使用任何标记部分。所有所述免疫测定方法为本领域所熟知，参见例如Salgame等人, 1997和van Nieuwenhuijze等人, 2003。
根据本发明的进一步的方面，提供用于检测加合到核小体的组织特异性转录因子或辅因子的试剂盒，其包含对组织特异性转录因子特异的配体或结合剂和对核小体或其构成部分特异的另一配体或结合剂，连同依照本文所描述的方法使用试剂盒的说明书。
根据本发明的进一步的方面，提供用于检测组织特异性染色质片段的试剂盒，其包含对第一转录因子或辅因子特异的配体或结合剂和对第二转录因子或辅因子特异的另一配体或结合剂，连同依照本文所描述的方法使用试剂盒的说明书。
根据本发明的进一步的方面，提供在有需要的个体中治疗癌症的方法，其中所述方法包括下列步骤：
(a) 根据本文所描述的方法检测或诊断个体中的癌症；接着
(b) 给予所述个体适合所述癌症的抗癌疗法、手术或药剂。
根据本发明的进一步的方面，提供在有需要的个体中治疗癌症的方法，其中所述方法包括下列步骤：
(a) 根据本文所描述的方法诊断个体中的癌症发展位点；接着
(b) 给予所述个体适合所述发展位点的抗癌疗法、手术或药剂。
对于本文所描述的测定，我们使用抗组蛋白抗体作为检测抗体，联合使用适当的特定抗组织特异性转录因子抗体作为捕获抗体。我们已经使用测定表明包含特定组织特异性转录因子的核小体结合物可在取自具有癌症的受试者的血液样品中测量，并且对于用作非侵入性或最小侵入性生物标志是有识别力的。
本领域技术人员将清楚，本发明的用途和方法可用于检测或测量可能附着或结合核小体的任何组织特异性转录因子或辅因子。
我们得出结论，本发明的方法是用于检测和测量组织特异性染色质片段和组织特异性转录因子-核小体加合物的成功方法，并且该方法为用于非侵入性检测受试者中的癌症和/或鉴定通过另一种癌症检测方法(例如通过ctDNA序列方法)检出的或CUP中的原发性肿瘤的优越方法。
本发明现在将参考下列非限制性实施例更详细地描述。
实施例1
血清样品从1个健康受试者、2个具有乳腺癌的受试者和2个具有泌尿道上皮膀胱癌(已知在GATA 3癌组织表达检验中给出阳性结果的移行细胞癌)的受试者获取。购买市售可得的用于GATA 3的96孔的仅研究用ELISA试剂盒，其包含包覆到微量滴定孔的固相GATA 3转录因子抗体。GATA 3为在所有或多数取自乳腺癌的活组织检查材料样品中表达的组织特异性转录因子，其在移行细胞癌和皮肤附属器肿瘤中也为阳性，但在多数来自其它癌的样品中不是阳性。固相GATA 3抗体在如下的用于无细胞核小体结合GATA3的双抗体ELISA中与生物素基化的抗核小体抗体一起使用：将血清样品(50 μl)和测定缓冲液(50 μl)加入包覆抗GATA 3抗体的孔，并在室温(大约20 ℃)摇动孵育2.5小时。然后将样品移除，加入生物素基化的抗核小体抗体(100 μl)并孵育1.5 小时。将生物素基化的抗体溶液移除，将孔用洗涤缓冲液(200 μl)洗涤3次。将链霉亲和素-HRP缀合物溶液加入孔中并孵育30分钟。将孔进一步洗涤3次，加入HRP底物溶液(100 μl 2,2'-连氮基双[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二铵盐溶液)并孵育20分钟。加入终止(STOP)溶液(50 μl)，孔的光密度(OD)在405 nm 处测定。
对于从3个具有乳腺癌的受试者中的2个获取的样品，观察到比来自健康受试者或阴性对照更高的ELISA信号和更高水平的循环无细胞核小体-GATA 3加合物。2个具有移行细胞癌的受试者中的一个也具有比健康受试者升高的OD水平。结果在图1中示出，说明血清核小体-GATA 3加合物测定可用于检测癌症和/或鉴定未知原发性发展位点的癌症(其中该癌症为乳腺癌)，并且核小体-GATA 3加合物可用作用于该目的的生物标志。
实施例2
血清样品取自2个具有甲状腺癌的受试者、3个具有肺癌的受试者和1个健康受试者。购买市售可得的用于TTF-1的96孔的仅研究用ELISA试剂盒，其包含包覆到微量滴定孔的固相TTF-1 (甲状腺转录因子 1)抗体。TTF-1为在所有或多数取自甲状腺和肺癌的活组织检查材料样品中表达的组织特异性转录因子，但在多数来自其它癌症的样品中不表达。固相TTF-1抗体在如实施例1中所描述的用于无细胞核小体结合TTF-1的双抗体ELISA中与生物素基化的抗核小体抗体一起使用。
对于从甲状腺癌患者获取的样品，观察到比来自健康受试者或阴性对照更高的ELISA信号和更高水平的循环无细胞核小体-TTF-1加合物。肺癌患者的血液中的循环无细胞核小体-TTF-1加合物的水平轻微提高。结果在图2中显示。
在后续实验中，测定来自3个健康受试者的血清样品以及来自诊断患有甲状腺癌、肺癌、胰腺癌、直肠癌、结肠癌和乳腺癌的受试者的样品中的循环无细胞核小体-TTF-1加合物水平以查明测定的组织特异性。所测定的单个甲状腺癌患者的结果为强阳性。所有4个肺癌患者、所有3个胰腺癌患者和3个乳腺癌患者中的2个中的水平较低。意外地，水平在所有6个结肠直肠癌患者中提高，表明循环无细胞核小体-TTF-1加合物水平可用于将未知原发的癌症鉴定为结肠直肠原发癌。这表明血液中循环无细胞核小体-转录因子加合物水平的组织特异性可能不一定与活组织检查时移除的癌组织中转录因子表达水平的特异性相同。结果在图3中示出。
本领域技术人员将清楚，核小体-TTF-1加合物测定可用于检测癌症或鉴定未知原发性发展位点的癌症(其中该癌症为甲状腺癌或结肠直肠癌)，并且核小体-TTF-1加合物可用作用于该目的的生物标志。
实施例3
血清样品取自3个健康受试者、1个诊断患有甲状腺癌的受试者、3个具有肺癌的受试者、3个具有胰腺癌的受试者、6个具有结肠直肠癌的受试者(3个具有结肠癌，3个具有直肠癌)和3个具有乳腺癌的受试者。购买市售可得的用于CDX2的96孔的仅研究用ELISA试剂盒，其包含包覆到微量滴定孔的固相CDX2 (尾型同源框转录因子-2)抗体。CDX2为在所有或多数取自结肠直肠癌的活组织检查材料样品中表达的组织特异性转录因子，但在多数来自其它癌症的样品中不表达。固相CDX2抗体在如实施例1中所描述的用于无细胞核小体结合CDX2的双抗体ELISA中与生物素基化的抗核小体抗体一起使用。
对于从结肠直肠癌患者获取的样品，观察到比来自健康受试者或来自具有其它癌症的受试者或阴性对照更高的ELISA信号和更高水平的循环无细胞核小体-CDX2加合物。1个健康受试者和1个具有乳腺癌的受试者也具有提高的水平，这可能为假阳性结果。结果在图4中示出，表明循环无细胞核小体-CDX2加合物水平可用于检测癌症或鉴定未知原发性发展位点的癌症(其中该癌症为结肠直肠癌)，并且核小体-CDX2加合物可用作用于该目的的生物标志。
我们成功开发了3种原型无细胞核小体-组织特异性转录因子加合物测定，并且所有三种显示临床有用性以鉴定未知原发位点的癌症，其中受试者已经诊断患有癌症。很显然，此为总体效果并且可开发类似的核小体-组织特异性转录因子测定用于鉴定广泛的原发癌疾病，其中癌症被诊断或检测但原发癌的发展位点未知。已知对于许多其它癌症，相似的组织特异性转录因子表达在通过手术或活组织检查移除的癌组织样品中发生(Kandalaft和Gown, 2015)。本领域技术人员将清楚，对于其中这样的转录因子已经鉴定的广泛的癌症和/或其中任何这样的组织特异性转录因子、组织特异性转录辅因子或转录因子和/或辅因子的组织特异性组合表达可鉴定的任何癌症，与实施例1-3中所描述的那些相似的用于适当的组织特异性染色质片段或组织特异性核小体-转录因子或辅因子加合物的类似的基于血液或其它体液的无细胞核小体加合物测定可用于检测癌症或鉴定未知原发位点的癌症。
将理解的是，本文所描述的实施方案可应用于本发明的所有方面。此外，本说明书中引用的所有出版物，包括但不限于专利和专利申请，通过引用结合到本文中，如同其被充分阐述。
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Claims (26)

1.组织特异性转录因子-核小体加合物或转录辅因子-核小体加合物作为生物学流体中的生物标志用于检测或诊断受试者中的癌症的用途。
2.权利要求1的用途，其中组织特异性转录因子-核小体加合物或转录辅因子-核小体加合物用于鉴定受试者中的癌症发展位点。
3.组织特异性转录因子-核小体加合物或转录辅因子-核小体加合物作为生物学流体中的生物标志用于鉴定或诊断先前诊断患有癌症的受试者中的癌症发展位点的用途。
4.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述癌症为原发癌。
5.权利要求1-4中任一项的用途，其中所述受试者为具有未知原发的转移癌的受试者。
6. 权利要求3-5中任一项的用途，其中所述受试者先前使用循环肿瘤DNA (ctDNA)作为生物标志诊断患有癌症。
7.用于在受试者中检测癌症和/或测定癌症发展位点的方法，所述方法包括以下步骤：
(i) 从所述受试者获得生物学流体样品；
(ii) 使样品接触结合核小体或其组分的第一结合剂；
(iii) 使核小体或样品接触结合加合到核小体的组织特异性转录因子或辅因子的第二结合剂；和
(iv) 检测或定量所述第二结合剂与样品中加合的组织特异性转录因子或辅因子的结合；
其中加合到核小体的组织特异性转录因子或辅因子的存在情况或水平用作所述癌症的存在情况和/或发展位点的指示。
8.用于在受试者中检测癌症和/或测定癌症发展位点的方法，所述方法包括以下步骤：
(i) 从所述受试者获得生物学流体样品；
(ii) 使样品接触结合组织特异性转录因子或辅因子的第一结合剂；
(iii) 使核小体或样品接触结合核小体或其组分的第二结合剂；和
(iv) 检测或定量所述第二结合剂与样品中的核小体或其组分的结合；
其中加合到核小体的组织特异性转录因子或辅因子的存在情况或水平用作所述癌症的存在情况和/或发展位点的指示。
9.权利要求7或权利要求8的方法，其中所述癌症为原发癌。
10.权利要求7-9中任一项的用途，其中所述受试者为具有未知原发的转移癌的受试者。
11.权利要求7-10中任一项的方法，其中受试者先前诊断患有癌症。
12.权利要求7-11中任一项的方法，其中所述结合剂为抗体、抗体片段或适体。
13.权利要求7-12中任一项的方法，其中结合核小体或其组分的结合剂定向结合特定的组蛋白、组蛋白修饰、组蛋白变体或同种型，或者结合DNA或其组分。
14. 用于评估动物或人受试者对药物治疗的适合性的方法，所述方法包括以下步骤：
(i) 如权利要求7-13中任一项的方法中所定义的检测或测量受试者的生物学流体中加合到核小体的组织特异性转录因子或辅因子；和
(ii) 使用所检测的加合到核小体的组织特异性转录因子或辅因子的类型以确定用于受试者的合适的治疗。
15.用于监测动物或人受试者的治疗的方法，所述方法包括以下步骤：
(i) 如权利要求7-13中任一项的方法中所定义的检测或测量受试者的生物学流体中加合到核小体的组织特异性转录因子或辅因子；
(ii) 一次或多次重复检测或测量受试者的生物学流体中加合到核小体的组织特异性转录因子或辅因子；和
(iii) 使用所检测的加合到核小体的组织特异性转录因子或辅因子的水平的任何变化作为受试者病况的任何变化的参数。
16.权利要求7-15中任一项的方法，其中加合到核小体的组织特异性转录因子作为一组测量之一检测或测量。
17. 权利要求1-6中任一项的用途或权利要求7-16中任一项的方法，其中所述组织特异性转录因子选自：GATA 3、CDX2、TTF-1、PAX8、WT1、NKX3.1、P63或P40。
18.权利要求1-6中任一项的用途或权利要求7-17中任一项的方法，其中所述生物学流体选自：血液、血清或血浆。
19. 在有需要的个体中治疗癌症的方法，其中所述方法包括下列步骤：
(a) 根据权利要求7-18中任一项的方法在个体中检测癌症和/或诊断癌症发展位点；接着
(b) 给予所述个体适合所述癌症和/或发展位点的抗癌疗法、手术或药剂。
20.包含两种或更多种转录因子或辅因子的组织特异性组合的染色质片段作为生物学流体中的生物标志用于检测受试者的癌症的用途。
21.权利要求20的用途，其中组织特异性组合用于鉴定受试者中的癌症发展位点。
22.权利要求20或权利要求21的用途，其中受试者先前已诊断患有癌症。
23.权利要求20-22中任一项的用途，其中所述癌症为原发癌。
24.权利要求20-23中任一项的用途，其中所述受试者为具有未知原发的转移癌的受试者。
25. 权利要求22-24中任一项的用途，其中受试者先前使用循环肿瘤DNA (ctDNA)作为生物标志诊断患有癌症。
26.用于在受试者中检测癌症或测定癌症发展位点的方法，所述方法包括以下步骤：
(i) 从所述受试者获得生物学流体样品；
(ii) 使样品接触结合第一转录因子或辅因子的第一结合剂；
(iii) 使样品接触结合第二转录因子或辅因子的第二结合剂；和
(iv) 检测或定量所述第一或第二结合剂在样品中的结合；
其中第一和第二转录因子或辅因子二者的组合在染色质片段中的存在情况和/或片段的水平用作所述癌症的存在情况和/或发展位点的指示。
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