TW202238131A - 測量無細胞核蛋白染色質片段之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及檢測或測量血清或血漿樣本中無細胞核蛋白染色質片段之方法，其中該血清或血漿樣本在分析之前進行離心。

Description

測量無細胞核蛋白染色質片段之方法
本發明涉及一種檢測和測量無細胞染色質片段的存在之方法以及這種測量方法在疾病的檢測和診斷之用途。
核小體(nucleosome)是染色質結構的基本單位，由八個高度保守性的核心組蛋白(histones)組成的蛋白質複合物(包含組蛋白H2A、H2B、H3和H4各一對)。在這個複合物周圍包裹著約146個鹼基對的DNA。另一種組蛋白H1或H5充當連接子並參與染色質壓縮(chromatin compaction)。DNA纏繞在連續的核小體上，這種結構通常被稱為「繩珠」(beads on a string)，並且形成了開放或真染色質的基本結構。在壓縮或異染色質中，該繩珠是螺旋及超螺旋形成封閉且複雜的結構(Herranz和Esteller, 2007)。
體內正常的細胞更新涉及透過細胞分裂產生新細胞以替換凋亡的細胞。細胞凋亡可以透過創傷以及各種公認的機制發生，包括細胞凋亡(apoptosis)、壞死(necrosis)、壞死性凋亡(necroptosis)、自體吞噬(autophagy)、鐵依賴型細胞死亡(ferroptosis)、依賴性細胞凋亡(parthonatos)、發炎性細胞凋亡(pyroptosis)、NETosis等。在細胞凋亡過程中，染色質被分解成蛋白質和核蛋白片段。最常見的核蛋白染色質片段是單核小體(mononucleosomes)和寡核小體(oligonucleosomes)。在正常情況下，染色質片段被代謝，據報導在健康主體中發現的循環無細胞核小體的量較低。在患有多種疾病的主體中發現了升高的量，該疾病包括許多癌症、自體免疫疾病、發炎性疾病(inflammatory conditions)、中風和心肌梗塞在內(Holdenrieder & Stieber, 2009)。報導了其他無細胞循環蛋白和核蛋白染色質片段，包括包含轉錄因子(transcription factors)或其他非組蛋白染色質蛋白片段的片段，這些片段可以自由循環或與其他染色質組分(包括DNA和/或核小體)結合(WO 2017/162755)。
可以透過多種方法檢測單核小體和寡核小體。最常用的方法是免疫測定法，例如酵素免疫測定法(Enzyme-Linked ImmunoSorbant Assay, ELISA)。已經報導了數種ELISA方法(Salgame等人, 1997; Holdenrieder等人, 2001; van Nieuwenhuijze等人, 2003)。最常使用的核小體ELISA方法是羅氏細胞凋亡測定法(Roche Cell Death assay)，它使用抗-組蛋白抗體作為捕獲抗體，並使用抗-DNA抗體作為檢測抗體。
核小體ELISA方法用於細胞培養，主要用作檢測細胞凋亡的方法(Salgame等人, 1997; van Nieuwenhuijze等人, 2003)，也常用於測量血清和血漿中的循環無細胞核小體(Holdenrieder等人, 2001)。
據報導，循環無細胞核小體的表觀遺傳組成在其組蛋白修飾、組蛋白變體(histone variant)(或同功異形體(isoform))、DNA修飾和加合物(adduct)含量方面可用作多種疾病的血液生物標記物(biomarkers)，包括癌症、自體免疫疾病、發炎性疾病、與妊娠相關的病症和與NETosis相關的疾病，參見WO 2005/019826、WO 2013/030577、WO 2013/030579、WO 2013/084002和GB 2016403.4。
也可以測量循環無細胞蛋白質染色質片段。本領域已知的蛋白質染色質片段的實例，包括但不限於，髓過氧化酶(myeloperoxidase)和嗜中性白血球彈性蛋白酶(neutrophil elastase)。這些蛋白質染色質片段可用於檢測循環嗜中性白血球胞外捕捉網或其代謝物。
我們現在提出一種準確測定無細胞核小體和其他核蛋白或蛋白質染色質片段之方法，該方法可大大提高生物標記物的性能。
根據本發明的第一態樣，提供
細胞凋亡時染色質斷裂，無細胞核小體和其他染色質片段釋放到循環中。健康主體的循環無細胞核小體量較低。在患有多種疾病的主體中發現了升高的量，該疾病包括許多癌症、自體免疫疾病、發炎性疾病、中風和心肌梗塞在內(Holdenrieder & Stieber, 2009)。許多感染，例如病毒和細菌感染，透過多種機制引發細胞凋亡，該機制包括細胞結合和進入、活化內體TLR3和基因表達，從而增加血液中循環核小體的數量。
循環無細胞染色質和核小體的另一來源是嗜中性白血球細胞(neutrophil cell)產生的嗜中性白血球胞外捕捉網(NETs)，作為免疫反應的一部分，例如對NETosis感染或炎症的反應。NETosis是一種細胞凋亡的調節形式，其中嗜中性白血球細胞將染色質與抗菌蛋白一起擠出到胞外空間。構成NET的染色質包含長的DNA纖維，它們以「繩珠」核蛋白結構纏繞在連續的核小體上。組成的組蛋白對病原體具有毒性，且NETs染色質也裝飾有抗病原體酶，包括髓過氧化酶和嗜中性白血球彈性蛋白酶。擠出的染色質纖維做為一張網絡，可以捕獲並殺死細菌和其他病原體，以防止它們傳播。因此，除了吞噬病原體和產生針對病原體的抗體外，NETosis也是免疫反應的重要組分。
因此，NETs和NETs代謝物對樣本中測量的總無細胞核小體有貢獻。當NETs升高時，它們可能是循環無細胞核小體混合物中的主要組分，它們可能包括大的核蛋白染色質片段。
除了在健康主體中可測量的循環核小體的背景值外，還有多種來源的無細胞核小體可能構成在樣本中測量的總核小體，包括但不限於，由癌細胞或其他受損或患病細胞的凋亡、壞死或其他受調節的細胞凋亡產生的核小體，以及由嗜中性白血球細胞擠出的 NETs和NETs消化產生的代謝物。這種循環無細胞核小體的混合物在染色質片段大小和結構方面是異質的。因此，循環核小體可包括單核小體以及包含一串2、3、4個等核小體的寡核小體和包含許多核小體的大核蛋白染色質片段。相似地，不同類型的循環核小體的表觀遺傳結構也有所不同，例如它們所加合的蛋白質及其轉譯後修飾的組蛋白含量。例如，NETs來源的染色質可能包括抗病原體酶，並且據報導含有大量的瓜胺酸化組蛋白(citrullinated histones)。與源自健康細胞的核小體相比，癌細胞來源的循環核小體可能含有更少的連接子DNA(WO 2021/038010)。
因此，循環染色質片段包含核小體和其他具有多種來源和結構的核蛋白的複合混合物。這種複雜性提供了豐富的生物標記物部分，大大增加了循環核小體作為任何特定疾病或病症的生物標記物的有用性，因此分離不同結構或來源的循環核小體是有用的。然而，這種複雜性也對混合物中可用作疾病生物標記物的不同組分的測量造成技術挑戰。本發明人已經開發了一種改善臨床核小體測量性能之方法，該方法通常用於核小體生物標記物和含有特定表觀遺傳結構的核小體亞型作為疾病的生物標記物。
在目前的實務中，用於核小體分析所採集的血液樣本被處理為以相關實驗室用於其他常規血液測試的正常方式所採集的血液樣本。因此，本領域不同工作者使用的樣本是使用典型的血液樣本製備程序所製備，根據當地採集樣本的程序(例如，採血管的選擇、離心前全血的儲存時間和離心的時間和力等)而有所不同。沒有使用特殊的樣本製備程序。對於血清樣本，通常將全靜脈血從主體收集到普通的玻璃或塑膠血清收集管中。讓管凝固至少20分鐘(通常長達24小時)，然後通常以1500-3000的相對離心力(RCF)(或1500-3000 x g)離心約10-15分鐘。然後從沉澱中取出透明血清並轉移到儲存管中。血清樣本可以立即分析或冷藏或冷凍儲存以供以後分析。對於血漿樣本，通常將全靜脈血從主體收集到普通的玻璃或塑膠血漿收集管中。將試管以1500-3000 RCF(或1500-3000 x g)離心約10-15分鐘。然後從沉澱中取出透明血漿並轉移到儲存管中。血漿樣本可以立即分析或冷藏或冷凍儲存以供日後分析。
用於分析核小體而收集的血清或血漿樣本目前在分析前不進行離心。相似地，用於分析核小體而收集的血液樣本目前在異常高的RCF下進行離心以分離血液。其原因包括(i)認為沒有必要且本領域已知的方法沒有提及需要先離心血清或血漿樣本，(ii)用於血液樣本收集的離心機通常不能實現高RCF 和(iii)高RCF離心對於標準收集管來說是危險的，特別是在使用玻璃收集管的情況下。Holdenrieder等人，2004年描述了癌症樣本的典型樣本收集程序。
相似地，用於分析循環NETs和NETs代謝物的血液樣本是使用標準收集程序所收集，包括約1500-3000 x g的單次離心步驟。
發明人已經發現，核蛋白染色質片段生物標記物性能的顯著改善是透過在分析核蛋白染色質片段之前離心血清或血漿樣本產生的。因此，本文所述的方法包括在分析之前透過離心處理血清或血漿樣本的步驟。這與目前的做法不同，在目前的做法中，從主體身上提取全血並離心以產生血清或血漿樣本，然後直接對其進行分析而無需進一步處理。因此，根據本發明的第一態樣，提供了一種檢測或測量取自一主體的一血清或血漿樣本中無細胞核蛋白染色質片段之方法，該方法包括以下步驟： (i)                離心血清或血漿樣本；以及 (ii)             分析上清液中的一無細胞核蛋白染色質片段。
於一較佳實施例中，無細胞核蛋白染色質片段包括一核小體。
當在體液樣本中檢測到「核小體」時，可能指的是「無細胞核小體」。應當理解的是，貫穿本文的術語無細胞核小體旨在包括任何含有一或多個核小體的無細胞染色質片段。於一實施例中，無細胞核蛋白染色質(或無細胞核小體)是嗜中性白血球胞外誘捕網(NET)的一部分或衍生自嗜中性白血球胞外誘捕網(NET)。
應當理解的是，無細胞核小體可以透過與其組分結合來檢測。如本文所用的術語「其組分」是指核小體的一部分，即不需要檢測整個核小體。無細胞核小體的組分可以選自：組蛋白(即組蛋白H1、H2A、H2B、H3或H4)、組蛋白轉譯後修飾、組蛋白變體或同功異形體、結合至核小體的蛋白質(即核小體-蛋白質加合物)、與核小體相關的DNA片段和/或與核小體相關的修飾核苷酸。例如，其組分可以是組蛋白(同功異形體)H3.1或DNA。
本發明的方法可以測量(無細胞)核小體本身的量。提及的「核小體本身」是指樣本中存在的總核小體量或濃度，無論核小體可能包括或不包括任何表觀遺傳特徵。總核小體量的檢測通常涉及檢測所有核小體共有的組蛋白，例如組蛋白H4。因此，核小體本身可以透過檢測核心組蛋白(例如組蛋白H4)來測量。如本文所述，組蛋白形成稱為核小體的結構單元，其用於在真核細胞中包裝DNA。
於一實施例中，核小體包含表觀遺傳特徵。應當理解的是，術語「表觀遺傳訊號結構」和「表觀遺傳特徵」在本文中可互換使用。它們指的是可以檢測到的核小體的特定特徵。於一實施例中，核小體的表觀遺傳特徵選自：轉譯後組蛋白修飾、組蛋白變體或同功異形體、修飾的核苷酸和/或與核小體-蛋白質加合物中的核小體結合的蛋白質。
術語「組蛋白變體」和「組蛋白同功異形體」在本文中可以互換使用。核小體的結構也可以透過包含不同的基因或剪接產物並具有不同胺基酸序列的替代組蛋白同功異形體或變體來改變。許多組蛋白同功異形體是本領域已知的。它們可以分為許多家族，這些家族又細分為單獨的類型。大量組蛋白同功異形體的核苷酸序列是已知的並且可在例如國家人類基因組研究所NHGRI組蛋白數據庫中公開獲得(Mariño-Ramírez等人。The Histone Database: an integrated resource for histones and histone fold-containing proteins. Database Vol.2011. 以及 http://genome.nhgri.nih.gov/histones/complete.shtml)、GenBank(NIH基因序列)數據庫、EMBL核苷酸序列數據庫和日本DNA數據庫(DDBJ)。例如，組蛋白H2的同功異形體包括H2A1、H2A2、mH2A1、mH2A2、H2AX和H2AZ。於另一實例中，H3的組蛋白同功異形體包括H3.1、H3.2和H3t。於一實施例中，組蛋白同功異形體是H3.1。
核小體的結構可能因組蛋白的轉譯後修飾(PTM)而異。組蛋白的PTM通常主要發生在核心組蛋白的尾部，常見的修飾包括賴胺酸殘基(lysine residues)的乙醯化、甲基化或泛素化(ubiquitination)，以及精胺酸殘基(arginine residues)的甲基化或瓜胺酸化以及絲胺酸殘基(serine residues)的磷酸化等。許多組蛋白修飾在本領域中是已知的，並且隨著鑑定出新的修飾，數量正在增加(Zhao和Garcia (2015) Cold Spring Harb Perspect Biol, 7: a025064)。因此，於一實施例中，無細胞核小體的表觀遺傳特徵可以是組蛋白轉譯後修飾(PTM)。組蛋白PTM 可以是核心核小體的組蛋白PTM，例如H3、H2A、H2B或H4，特別是H3、H2A或H2B。特別是，組蛋白PTM是組蛋H3 PTM。這種PTM的實例在WO 2005/019826中有所描述。
例如，轉譯後修飾可以包括乙醯化、甲基化，其可以是單甲基化、二甲基化或三甲基化、磷酸化、核糖苷化(ribosylation)、瓜胺酸化、泛素化、羥基化、醣化(glycosylation)、亞硝基化、谷胺醯胺化(glutamination)和/或異構化(參見 Ausio (2001))生化細胞生物 79:693)。於一實施例中，組蛋白PTM選自瓜胺酸化或甲基化。於再一實施例中，組蛋白PTM是H3瓜胺酸(H3cit)或H4瓜胺酸(H4cit)。於再另一實施例中，組蛋白PTM是H3R8cit。
於一實施例中，核小體的表觀遺傳特徵包括一或多種DNA修飾。除了由核小體組蛋白同功異形體和PTM組成介導的表觀遺傳訊號外，核小體的核苷酸和修飾的核苷酸組成也不同。一些核小體可以包含比其他核小體更多的5-甲基胞嘧啶殘基(或5-羥甲基胞嘧啶殘基或其他核苷酸或修飾的核苷酸)。於一實施例中，DNA修飾選自5-甲基胞嘧啶或5-羥甲基胞嘧啶。
於一實施例中，核小體的表觀遺傳特徵包括一或多種蛋白質-核小體加合物或複合物。另一種循環核小體亞群是核小體蛋白加合物。多年來已知染色質包含大量與其組成DNA和/或組蛋白結合的非組蛋白。這些染色質相關蛋白的種類繁多，具有多種功能，包括轉錄因子、轉錄增強因子、轉錄抑制因子、組蛋白修飾酶、DNA損傷修復蛋白等等。本領域描述了這些染色質片段，包括核小體和其他非組蛋白染色質蛋白或DNA和其他非組蛋白染色質蛋白。
於一實施例中，與核小體加成的蛋白質選自：轉錄因子、高遷移率族蛋白質或染色質修飾酶。提及的「轉錄因子」是指與DNA結合並透過促進(即活化劑)或抑制(即抑制劑)轉錄來調節基因表現的蛋白質。轉錄因子包含一或多個DNA結合結構域(DBD)，它們附著在與其調節的基因相鄰的特定DNA序列上。
本文所述的所有循環核小體和核小體部分、類型或亞組可用於本發明。此外，應當理解的是，在本發明的方法中可以檢測到多於一種無細胞核小體的表觀遺傳特徵。多個表觀遺傳特徵可以用作組合的生物標記物。
於一實施例中，血清或血漿樣本在高相對離心力下離心。術語「相對離心力」(RCF)在本文中用於描述在離心機中施加到樣本的加速度力。RCF是以地球表面重力引起的標準加速度的倍數(g-力或 x g)測量。因此，RCF和g力可以互換使用。離心機產生的RCF由離心機的旋轉速度(例如以每分鐘轉數或RPM表示)和旋轉的離心臂的半徑(R，例如以mm表示)根據以下公式確定：RCF或g-力 = 1.12 x R x (RPM/1000)²。
我們已經發現，透過在分析之前對待測量的血清或血漿樣本進行離心步驟，可以大幅提高測量的循環核小體作為任何特定疾病或病症的生物標記物的有用性。特別是，在核小體測量之前使用14000 x g(或14000 RCF)的高g力離心2分鐘。
我們測量了取自82名健康主體和74名診斷為非霍奇金淋巴瘤(NHL)主體的血漿樣本中含有組蛋白同功異形體H3.1的核小體的量。我們發現，在測定前離心血漿樣本對健康主體中測量的核小體量的範圍有顯著影響(許多樣本降低＞90%)，但對診斷患有癌症的主體中測量的量影響很小或沒有影響。這顯著縮小了對健康主體觀察到的結果範圍，大幅增加了健康和患病主體之間測量的循環無細胞核小體量的差異，並大幅增加了受試者工作特徵(receiver operating characteristic, ROC)曲線的曲線下面積(AUC)(圖1和圖2)。在樣本分析之前包括樣本離心步驟的這一發現改進了生物標記物性能，其係透過差異降低在健康主體中測量到的量，這是出乎意料的，因為干擾源通常會影響所有樣本或隨機影響一些樣本。
我們先前已經表明，患有COVID-19的患者具有極高量的循環核小體，這與NET的過度產生有關。因此，我們測量了取自32名被診斷為COVID-19的主體的血漿樣本中含有組蛋白同功異形體H3.1的核小體量，這些血漿樣本有先進行高速離心和未離心。在大多數COVID-19樣本中發現的量高於測定法中使用的最高標準(1500 ng/ml)。在可測量的樣本中，未顯示出在高g力離心後含有組蛋白同功異形體H3.1的核小體量的顯著降低(圖3a)。因此，我們以相對光單位(RLU)觀察了測定法本身產生的原始訊號輸出，發現先前的高g力離心導致32個測試樣本中的2個的訊號減少了約一半(圖3b)。
然後，我們測量了取自32名被診斷為COVID-19的主體以及取自19名健康主體的樣本中在組蛋白H3(H3R8-Cit)的第8位點精胺酸殘基的瓜胺酸化修飾的核小體的量，這些樣本有先進行高g-力離心和未離心。結果顯示，先進行高g-力離心導致19個健康樣本中有14個訊號降低＞50%，19個健康樣本中有8個訊號降低＞90%，19個健康樣本中有4個訊號降低＞99%(圖4a)。相比之下，先進行高g-力離心導致32個COVID-19樣本中的3個(圖4b中的樣本11、13和14)的訊號變化超過 50%。
正如在NHL中觀察到的那樣，這種效應導致使用含有組蛋白同功異形體H3.1或H3R8-Cit作為生物標記物的循環核小體的量檢測患者COVID-19的ROC曲線顯著改善。
由於與COVID-19相關的過度​​NETosis導致的NETs量過高的主體所採集的樣本沒有觀察到的影響相比，這裡觀察到健康主體的樣本的差異效應(differential effect)是更為令人驚訝的，因為預計NETs會包含較大的核蛋白染色質片段，與健康樣本中存在的較小核蛋白染色質片段相比，這些片段在分析前更容易透過離心去除。此外，我們還觀察到類似的效果，即在從患有嚴重敗血症(sepsis)(另一種與過度NETosis相關的疾病)的主體採集的樣本中測量的核小體的量極度升高，並且不會因先14000 x g離心而減弱。
於一實施例中，樣本在大於1000 x g，例如大於2000 x g的相對離心力下離心。於一較佳實施例中，樣本在高相對離心力下離心，例如高於5000  x g，或高於6000 x g，或高於7000 x g，或高於8000 x g，或高於9000 x g，或高於10000 x g，或高於11000 x g，或高於 12000 x g，或高於 13000 x g，或高於 14000 x g。於再一實施例中，樣本在5000-18000 x g，例如6000-15000 x g，特別是10000-14000 x g的相對離心力下離心。
於一實施例中，將樣本離心至少1分鐘，例如1至10分鐘。於再一實施例中，將樣本離心1至5分鐘，例如2至5分鐘。於再另一實施例中，將樣本離心約2分鐘。
於一較佳實施例中，樣本在6000和15000 x g之間的相對離心力下離心約2分鐘。
由於目前的做法包括將從主體收集的全血樣本離心以產生血清或血漿，本發明的方法可以包括兩個離心步驟，包括全血的第一次離心和源自全血的血清或血漿樣本的第二次離心。因此，於一實施例中，該方法還包括：離心從主體獲得的全血樣本以從血清或血漿中分離出血球，並在進一步離心之前(即在方法的(i)步驟之前)將血清或血漿樣本轉移到單獨容器(separate container)中。
根據本發明的另一態樣，提供一種檢測或測量取自主體的血清或血漿樣本中的循環無細胞核蛋白染色質片段之方法，該方法包括以下步驟： (i) 離心從主體獲得的全血樣本，以從液體血清或血漿中分離血球， (ii) 將步驟(i)中獲得的血清或血漿樣本轉移到單獨容器中， (iii) 離心單獨容器中的血清或血漿樣本；以及 (iv)分析在步驟(iii)中獲得的離心血清或血漿樣本的上清液中的循環無細胞核蛋白染色質片段。
於一實施例中，血清或血漿樣本的離心在大於1000 x g，例如大於2000 x g的相對離心力下進行。於一較佳實施例中，血清或血漿樣本在高相對離心力下離心，例如5000 x g以上，或6000 x g以上，或7000 x g以上，或8000 x g以上，或9000 x g以上，或10000 x g以上，或以上11000 x g，或高於 12000 x g，或高於 13000 x g，或高於 14000 x g。於再一實施例中，血清或血漿樣本在5000-18000 x g，例如6000-15000 x g，特別是10000-14000 x g的相對離心力下離心。
於一實施例中，將血清或血漿樣本離心至少1分鐘，例如1-10分鐘。於再一實施例中，將血清或血漿樣本離心1至5分鐘，例如2至5分鐘。於再另一實施例中，將血清或血漿樣本離心約2分鐘。
於一實施例中，全血樣本的離心在大於1500 x g的相對離心力下進行。於再一實施例中，全血樣本以1500-3000 x g的相對離心力離心。
於一實施例中，將全血樣本離心至少1分鐘，例如1至15分鐘。於再一實施例中，將全血樣本離心5至15分鐘。於再另一實施例中，將全血樣本離心約10分鐘。
於本發明的一典型實施例中，血清或血漿是透過使用1500-3000 x g的g-力將全血樣本離心約10分鐘來製備的。然後使用6000-15000 x g的g-力將血清或血漿樣本離心約2分鐘。
本發明的方法包括離心，因此用於樣本的容器必須適用於離心機。容器(例如管)較佳由生物相容性和在高離心力下穩定的材料構成。合適的容器在本領域中是已知的且是可獲得的，例如THERMO SCIENTIFIC NALGENE Oak Ridge高速聚碳酸酯離心管。於一實施例中，樣本被保留在由聚碳酸酯材料構成的容器中。
血清或血漿樣本可以在離心和分析之前冷凍。這允許存儲樣本。 因此，於一實施例中，將血清或血漿樣本冷凍並隨後在步驟(iii)之前解凍。
於一替代實施例中，使用的血清或血漿樣本可以是新鮮樣本(即未冷凍過的)。實施例8中的結果表明，與新鮮樣本相比，冷凍樣本中核小體的量的人為升高的更多，因此新鮮樣本可做為用於提供核蛋白染色質片段生物標記物性能改進的替代樣本類型。
於一較佳實施例中，循環的無細胞核蛋白染色質片段是無細胞核小體。本領域已知的任何方法都可用於分析上清液中的核小體或其他核蛋白染色質片段。於較佳實施例中，使用免疫測定法分析液體的核小體。於一最佳實施例中，免疫測定法是雙抗體或「三明治」免疫測定法，其使用與核小體或其他核蛋白染色質片段上存在的表位(epitopes)結合的兩種結合劑。於較佳實施例中，結合劑直接對存在於核蛋白染色質片段中的表位結合，包括直接結合核小體、DNA、組蛋白轉譯後修飾(PTM)、組蛋白同功異形體或其他非核小體染色質組分(例如，直接與轉錄因子結合)的抗體或其他結合劑或此類抗體或結合劑的任何配對。可以使用任何特定的結合劑。於一較佳實施例中，結合劑是抗體。
診斷和監測方法
循環無細胞核小體和其他循環無細胞核蛋白染色質片段的量可用於多種疾病狀態中的多種臨床目的。據報導，循環無細胞核小體的量及其在組蛋白修飾、組蛋白變體、DNA修飾和加合物組成方面的表觀遺傳結構可用作多種疾病的血液生物標記物，該疾病包括癌症、自體免疫疾病、發炎性疾病、 與妊娠相關的疾病和與NETosis相關的疾病，參見WO 2005/019826、WO 2013/030577、WO 2013/030579、WO 2013/084002和GB 2016403.4。因此，根據本發明的一態樣，提供一種評估或檢測一主體的一疾病狀態之方法，該方法包括進行如本文所述的用於檢測或測量無細胞核蛋白染色質片段之方法。
根據本發明的再一態樣，提供一種評估或檢測一主體的一疾病狀態之方法，包括以下步驟： (i) 離心取自該主體的一血清或血漿樣本； (ii) 分析離心後的該血清或血漿樣本的上清液中的一核蛋白染色質片段；以及 (iii) 使用該核蛋白染色質片段之存在或數量作為該主體的該疾病狀態之指標。
於一實施例中，該方法還包括：離心取自主體的全血樣本以從血清或血漿中分離血球，並在進一步離心之前(即在方法的(i)步驟之前)將血清或血漿樣本轉移到單獨容器中。
於本發明的一實施例中，該方法使用含有特定表觀遺傳結構的核蛋白染色質片段之存在或數量作為主體的疾病狀態之指標。
於一較佳實施例中，無細胞核蛋白染色質片段包括核小體。核小體可以包含表觀遺傳結構。於一實施例中，表觀遺傳結構是包含在核蛋白染色質片段中的組蛋白修飾、組蛋白變體(或同功異形體)、DNA修飾或非組蛋白。
使用本發明的方法測量或檢測的無細胞核蛋白染色質片段可以用作生物標記物。術語「生物標記物」是指過程、事件或狀態獨特的生物學或生物學衍生指標。生物標記物可用於診斷方法，例如臨床篩檢、預後評估和監測治療結果，確定最有可能對特定治療、藥物篩選和開發產生反應的患者。生物標記物及其用途對於識別新的藥物治療和發現藥物治療的新標的是有價值的。
本發明的方法也可用於監測主體中疾病的進展或進程以確定是否需要醫學干預。例如，如果確定主體患有輕度疾病階段或處於緩解期，則本發明可用於監測疾病進展以用於未來復發的發展。例如，如果該方法包括來自被確定為患有輕度疾病階段的主體的樣本，那麼可以在另一個時間點重複測量生物標記物的量以確定生物標記物的量是否已經改變。
於一實施例中，疾病狀態是選自癌症、感染、自體免疫疾病或發炎性疾病。於再一實施例中，疾病狀態為癌症。本發明的方法可以用於任何癌症，包括例如乳癌、膀胱癌、結腸直腸癌、皮膚癌(例如黑色素瘤)、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、腸癌、肝癌 、子宮內膜癌、淋巴瘤、口腔癌、頭頸癌、白血病和骨肉瘤。特別是，癌症可以是血液癌症(haematological cancer)，例如白血病或淋巴瘤。
於一替代實施例中，疾病狀態是感染，例如病毒、細菌、真菌或微生物感染。本文的實施例提供的證據表明該方法也可用於檢測感染，例如呼吸道感染，例如COVID-19，或細菌感染，例如敗血症。
如本文所用的術語「檢測」或「診斷」涵蓋疾病狀態的鑑定、確認及/或表徵。量化樣本中存在的生物標記物的量可以包括確定樣本中存在的生物標記物的濃度。根據本文所述的本發明的檢測、監測和診斷方法可用於確認疾病的存在、透過評估發作及進程來監測疾病的發展、或評估疾病的改善或復原。檢測方法也可用於評估臨床篩檢、預後、治療的選擇、評估治療效益的方法，即用於藥物篩選及藥物開發。
檢測或測量可包括免疫測定、免疫化學、質譜，色譜、染色質免疫沉澱或生物感測器方法。特別是，檢測和/或測量可包括用於核小體部分的2位點免疫測定法。這種方法較佳用於核小體或含有表觀遺傳特徵的核小體的原位測量，其係使用兩種抗-核小體結合劑或一種抗-核小體結合劑和抗-組蛋白修飾或抗-組蛋白變體或抗-DNA修飾或抗-加合蛋白偵測結合劑。而且，檢測和/或測量可包括2位點免疫測定，例如使用標記或固定的組合：抗-核小體、抗-組蛋白修飾、抗-組蛋白變體/同功異形體、抗-DNA修飾或抗-加合蛋白結合劑。
可以使用一或多種試劑，例如合適的結合劑，來檢測或測量生物標記物的量。舉例來說，一或多種結合劑可以包括對所需生物標記物具有特異性的配體或結合劑，該所需生物標記物諸如核小體或其組分部分、核小體的表觀遺傳特徵、核小體或其組分部分的結構/形狀模擬物。
對於本領域技術人員將清楚的是，本文所用的術語「抗體」、「結合劑」或「配體」不限於但旨在包括能夠結合特定分子或實體的任何結合劑，並可以在本發明的方法中使用任何適合的結合劑。還將清楚的是，術語「核小體」旨在包括單核小體、寡核小體、NETs和可以在流體介質中分析的任何蛋白質-DNA染色質片段。
檢測生物標記物的方法是本領域眾所皆知的。試劑可以包括一或多種配體或結合劑，例如，天然存在或化學合成的化合物，其能夠與所需的標靶特異性結合。配體或結合劑可以包括能夠與所需標靶特異性結合的胜肽、抗體或其片段、或合成的配體(例如，塑性抗體)、或適體或寡核苷酸。該抗體可為單株抗體或其片段。應當理解的是，如果使用抗體片段，則其保留結合生物標記物的能力，使生物標記物可被測得(根據本發明)。配體/結合劑可以用可檢測標記物來標記，例如發光、螢光、酵素或放射性標記物；替代性地或額外地，可用親和標幟來標記本發明的配體，該親和標幟諸如生物素、抗生物素蛋白、鏈黴親和素或His(例如hexa-His)標幟。或者是，可以使用例如ForteBio Inc.的無標記技術測定配體結合。
在本文中提及到的「主體」或「患者」可互換使用。主體可以是人類或動物主體。於一實施例中，主體是人類。於一實施例中，主體是(非人)動物。本文所述的組(panels)和方法可以在體外、體內或離體進行。
可以將分析期間生物標記物的檢測和/或量化與臨界量進行比較。可以透過分析來自多個患者和對照組的結果預先決定臨界值，且決定用於將主體分為患有或不患有該疾病的合適值。舉例來說，對於患有該疾病的患者中生物標記物量較高的疾病，如果檢測到的量高於臨界值，則表明該患者患有該疾病。或者是，對於患有該疾病的患者中生物標記物量較低的疾病，若檢測到的量低於臨界值，則表明該患者患有該疾病。使用簡單的臨界值的優點包括臨床醫生能夠輕鬆理解測試內容，並且不需任何軟體或其他輔助手段即可解釋測試結果。可以使用本領域已知的方法確定臨界量。
還可以將分析期間生物標記物的檢測和/或定量與對照進行比較。本領域技術人員將清楚的是，對照主體可以在多種基礎上進行選擇，例如可以包括已知沒有疾病的主體或可以是患有不同疾病的主體(例如，鑑別診斷調查)。「對照組」可以包括健康主體。
與對照組進行比較在診斷領域是眾所周知的。在對照組中發現的數值範圍可以作為正常或健康或參考範圍，可以將測試主體發現的值與之進行比較。應當理解的是，沒有必要在每種情況下都為了比較的目的而測量對照量。舉例來說，對於健康/未患病的對照組，一旦確定了「正常範圍」，就可以將其作為所有後續測試的基準。透過從多個沒有疾病的對照主體中獲取樣本並測試生物標記物的量，可以建立正常範圍。然後可以檢查疑似患有該疾病的主體的結果(即生物標記物量)，以查看它們是否落在相應的正常範圍內或之外。使用「正常範圍」是檢測疾病的標準做法。
提供了用於執行本發明方法的診斷或監測套組。這樣的套組將適當地包括一或多種用於檢測和/或量化根據本發明的生物標記物的配體，選擇性地包括套組的使用說明。於一實施例中，該套組包括一或多個適用於高相對離心力的容器。
根據本發明的再一態樣，提供了一種套組，該套組包括一或多種用於檢測和/或定量血清或血漿樣本中的無細胞核蛋白染色質片段的配體以及一或多個適用於高相對離心力的容器。
根據本發明的再一態樣，提供了用於檢測和/或定量無細胞核蛋白染色質片段的套組的用途，該套組包括一或多種用於檢測和/或定量無細胞核蛋白染色質片段的配體以及一或多個適用於高相對離心力的容器。於再一實施例中，在血清或血漿樣本中檢測到無細胞核蛋白染色質片段。
應當理解的是，本文描述的實施例可以應用於本發明的所有態樣，即針對方法描述的實施例可以同樣地應用於要求保護的套組等。
本發明現在參考以下非限制性實施例進行說明。
實施例 1
EDTA血漿樣本從82名健康主體和74名由生物庫根據標準化方案診斷為NHL的主體所收集。全血樣本收集在標準EDTA血漿採血管中。在靜脈穿刺後2小時內，將每個採血管以1500 x g離心15分鐘。將液體血漿上清液轉移至冷凍管並在-80°C冷凍直至解凍用於分析。
為了確定先前離心對觀察到的核小體量的結果的影響，將每個冷凍血漿樣本解凍並(i)在未進一步處理的情況下測定含有組蛋白變體H3.1的核小體和(ii)在14000 x g下離心2分鐘並測定上清液中含有組蛋白變體H3.1的核小體。
使用自動免疫測定儀器透過免疫測定法對含有組蛋白變體H3.1的核小體進行測定測量。簡而言之，將校準物或樣本(50µl)與吖啶酯(acridinium ester)標記的抗-核小體抗體(50µl)和測定緩衝液(100µl)在37°C下培養1800秒。添加塗有抗-組蛋白H3.1抗體(20μl)的磁珠，並將混合物再培養900秒。然後分離磁珠，洗滌3次，並透過超過7000毫秒的發光輸出確定磁性結合的吖啶酯。
我們發現先前的樣本離心對健康主體測量的核小體量的範圍(正常範圍)有顯著影響，但對診斷患有癌症的主體測量的量的影響很小或沒有影響。
在測量取自82個健康樣本的樣本中含有組蛋白同功異形體H3.1的核小體之前以14000 x g離心2分鐘，導致測試的82名主體中有41名的觀察結果減少了50%以上，在測試的82名受試者中有24名減少了90%以上(圖1a)。相比之下，在取自74名診斷為NHL的主體的樣本中測量的含有組蛋白同功異形體H3.1的核小體的量相對不受影響，74份樣本中只有2份的量降低了50%以上(圖1b中的樣本2和62)。如圖2a所示，這種效應顯著增加了健康和患病主體之間測量的循環無細胞核小體量的差異，並顯著增加了受試者工作特徵(ROC)曲線的曲線下面積 (AUC)(圖2b)。例如，檢測NHL的臨床靈敏度增加了30%以上，特異性為90%。觀察到取自健康主體的樣本中測量的核小體量的差異影響與對於取自癌症患者的樣本的小得多的影響相比，是出乎意料之外的，因為預期所有樣本或隨機都會消除背景干擾因素。例如，由於採樣技術不佳而可能發生的任何污染都可能是隨機發生的。
實施例 2
血漿樣本取自32名被診斷為COVID-19的主體，並在-80°C下冷凍保存。將樣本解凍用於分析，並透過免疫測定法測定含有組蛋白變體H3.1的核小體，先在14000 x g下離心2分鐘或不離心，如實施例1所述。在大多數樣本中發現的量高於測定中使用的最高標準(1500 ng/ml)。在發現量＜1500ng/ml的樣本中，沒有一個顯示在高g力離心後含有組蛋白同功異形體H3.1的核小體的量顯著降低(圖3a)。因此，我們還以相對光單位(RLU)觀察了測定法本身產生的原始訊號輸出，發現先前的高g力離心導致32個測試樣本中的2個(圖3b中的樣本13和14)訊號減少約一半。
實施例 3
為了研究觀察到的效果是否對含有組蛋白同功異形體H3.1的核小體的測量具有特異性，我們還測量了含有不同表觀遺傳訊號的核小體的量。我們選定了在組蛋白H3(H3R8Cit)殘基8處含有瓜胺酸精胺酸(citrullinated arginine)的核小體作為COVID-19樣本的另一種測量方法。我們使用固定化抗-H3R8Cit抗體結合標記的抗-核小體抗體，透過免疫測定法測量了含有H3R8Cit的核小體，這些核小體取自被診斷為COVID-19的主體的32個樣本以及取自健康受試者的19個樣本，先以14000 x g離心2分鐘及未離心。所有樣本在-80°C冷凍保存並解凍用於分析。
結果顯示，先前的高g力離心導致19個健康樣本中有14個訊號降低＞50%，19個健康樣本中有8個訊號降低＞90%，且19個健康樣本中有4個訊號降低＞99%(圖4a)。相比之下，先前的高g力離心導致32個COVID-19樣本中有3個的訊號變化超過50%(圖4b中的樣本11、13和14)。
實施例 4
我們透過使用取自健康主體的血漿樣本進行實驗，進一步研究了樣本離心對核小體的結果的影響，這些樣本在未先進行高g力離心的情況下進行免疫測定法時為陽性(即發現含有大量的血漿核小體)，但在先進行高g力離心之後為陰性(即具有非常低的核小體量)。樣本在-80°C冷凍保存並解凍用於分析。
於第一個實驗中，我們將1ml健康樣本以14000 x g離心2分鐘，並測量了含有組蛋白同功異形體H3.1的血漿核小體，小心地從上清液的頂部250μl中取出50μl，從第二個250μl中取出50μl，從第三個250μl中取出50μl和小心地從管中上清液的底部250 µl中取出50 µl(其中包括離心沉澱)。在沒有先離心的情況下測得的血漿核小體量＞1500ng/ml。離心血漿樣本的第一、第二和第三上清液部分均含有少於40ng/ml的核小體。發現包含沉澱的底部部分含有1293ng/ml。因此，在底部250 µl中進行的核小體測量會受到離心沉澱(centrifugation pellet)的干擾。我們得出結論，存在於血漿樣本中的干擾部分被離心去除，該干擾部分是存在於沉澱中。我們還得出結論，如果沉澱在收集過程中受到干擾，則沉澱材料可能會無意中包含在上清液樣本中。
實施例 5
我們將冷凍的健康血漿樣本解凍，將樣本以14000 x g離心2分鐘，然後將一部分上清液轉移到另一個管中。我們立即透過免疫測定法測量了含有組蛋白同功異形體H3.1的血漿核小體，並在(另一個)冷凍/解凍循環後的第二天測量。未先離心的量是＞1500ng/ml。離心後立即在上清液中測量的量為40ng/ml。 冷凍/解凍循環後的第二天在上清液中測量的量為32ng/ml。因此，一旦製備好，上清液可在分析前冷凍保存。因此，於本發明的一實施例中，透過本發明的方法處理的體液樣本可以被儲存直到被分析。
實施例 6
我們將冷凍的健康血漿樣本解凍，將樣本以14000 x g離心2分鐘，並透過免疫測定法測量上清液中含有組蛋白同功異形體H3.1的核小體。然後，我們在透過免疫測定法重新分析之前混合樣本。未先離心的血漿核小體量＞1500ng/ml。離心後在上清液中測量的量為40ng/ml。離心樣本混合後測得的量＞1500ng/ml。根據該結果，連同實施例4所描述的結果，我們得出結論，在如以上述實施例5描述的儲存之前，較佳先從沉澱中除去上清液。
實施例 7
兩個健康樣本，其含有組蛋白同功異形體H3.1的核小體的測量量(未先離心)分別為＞1500 ng/ml和438 ng/ml，將其解凍並在2000 x g、3000 x g、5000 x g、7500 x g或14000 x g下離心2分鐘，在對兩個樣本施加的所有g力下，離心後測量的核小體的量顯著降低(表1)。因此，即使使用低g力，在分析染色質片段之前對血清或血漿樣本進行離心也是有效的。
我們還觀察到，隨著離心g力的增加，樣本離心後測量的核小體的量從63到34和從47到30ng/ml進一步降低。在實施例1中為82名健康主體測定的含有組蛋白同功異形體H3.1的核小體的平均量為35ng/ml。因此，在低於5000 x g 的g力下離心產生的更高結果與健康程度相關，並將影響診斷性能。7500或14000 x g離心產生的結果之間的差異似乎很小。我們得出結論，本發明的方法在所有施加的g力下對離心都是有效的，並且透過使用至少5000 x g的離心力獲得了最佳結果。
表1. 血漿樣本在各種g力下離心後的核小體量(ng/ml)
施加的離心力 核小體量 樣本 1 核小體量 樣本 2
未先離心 ＞1500 438
2000 x g 63 47
3000 x g 55 46
5000 x g 44 35
7500 x g 34 31
14000 x g 33 30
實施例 8
實施例1-7中描述的實驗涉及使用冷凍血漿樣本。因此，我們研究了冷凍對EDTA血漿樣本中測量的核小體量的影響。我們從14名健康的人類自願者那裡收集了EDTA血漿樣本，並將每個血漿樣本分成三等份。一份冷藏，一份冷凍在-20 oC，一份冷凍在-80 oC。然後我們測量了每個血漿樣本的所有3個等分試樣中含有組蛋白變體H3.1的核小體的量。我們發現冷凍導致每個樣本測量的核小體量增加，平均增加53%，一些樣本增加了一倍以上(高達144%)。
與圖1、2和圖4中所示的效果相比，這裡在實施例8中描述的效果是影響所有或大多數樣本的較小效果。雖然較小，但與冷凍血漿樣本相比，新鮮血漿樣本中含有組蛋白變體H3.1的核小體的正常範圍較低，因此導致用於疾病檢測的AUC提高。因此，如果可能的話，與冷凍血漿相比，新鮮血漿是用於核小體測試的較佳樣本基質(matrix)。
實施例 9
為了研究新鮮(從未冷凍)的血清和血漿樣本是否也受到同樣的影響，我們將兩隻健康狗的血液樣本放入血清和血漿採血管中。使用獸醫常用的血液處理方法將全血樣本離心以產生血清和血漿樣本。一式兩份測定新鮮血清和血漿樣本中含有組蛋白變體H3.1的核小體，(i)無需進一步處理和(ii)將血清和血漿樣本以14000 x g離心2分鐘，然後測定上清液中含有的核小體組蛋白變體H3.1。
結果(狗1和狗2分別顯示在圖5a和圖5b中)顯示，從兩隻狗製備的新鮮血漿或血清中測量的含有組蛋白變體H3.1的測量核小體的量在先以14000 x g離心後顯著降低。因此，在血清或血漿分析之前的離心步驟的影響通常是血清和血漿樣本的一個特徵，並且不限於冷凍樣本。在測試的2隻健康狗中有2隻發現人為升高的核小體量與在健康人類主體中發現的人為升高的核小體量一致。結果還顯示，這種效果發生在多個物種中，並且不僅限於人類樣本。
實施例 10
將實施例9中從2隻健康狗製備的新鮮血漿和血清樣本冷凍，然後再次測定(i)無需進一步處理和(ii)將血清和血漿樣本以14000 x g離心2分鐘，並測定上清液中的含有組蛋白變體H3.1的核小體。
結果(狗1和狗2分別顯示在圖5c和圖5d中)顯示，從兩隻狗製備的血漿和血清樣本中觀察到的含有組蛋白變體H3.1的核小體的測量量在冷凍/解凍循環後顯著增加。血漿樣本對這種效應特別靈敏，從兩隻狗採集的血漿樣本的冷凍/解凍循環導致觀察到的核小體的量增加了500%以上。這一發現與在實施例1和實施例3中描述的未先預旋(pre-spin)步驟的情況下在冷凍人血漿樣本中觀察到的高的健康核小體量一致。
當將狗的血清或血漿樣本以14000 x g離心2分鐘並測定上清液中含有組蛋白變體H3.1的核小體時，觀察到的測量量降低到與在實施例7中在先預旋步驟後進行測定時觀察到的新鮮(從未冷凍)樣本相同量。
我們得出結論，(i)新鮮和冷凍血漿或血清樣本在未先離心步驟的情況下測量時，可能會產生人為升高的染色質片段量的結果，(ii)增加先離心步驟可以消除干擾並降低測量量，(iii)(第一)新鮮血清或血漿樣本的冷凍和解凍導致樣本中核小體測量量的人為增加，並且增加的大小可能遠大於測量的原始核小體量的大小，以及(iv)根據本發明的方法，增加先離心步驟可消除由冷凍和解凍引起的干擾，並且將測量的量降低到與使用先離心步驟之後的測定法在新鮮樣本中觀察到的量的相同量。
總而言之，循環血清和血漿無細胞核小體測量的潛在臨床生物標記物應用已為人所知多年(Holdenrieder等人，2001)。儘管如此，到目前為止，核小體測量還沒有用於臨床目的。本發明人首次表明，目前進行的無細胞核小體測量會受到人為干擾，並且可以透過在染色質片段測定之前增加離心步驟來消除這種干擾。此外，發明人已經表明，使用本發明的方法去除干擾導致改進的生物標記物性能。
參考資料Herranz 和 Esteller, DNA methylation and histone modifications in patients with cancer: potential prognostic and therapeutic targets. Methods Mol Biol. 361:25-62, 2007 Holdenrieder 等人, Nucleosomes in serum of patients with benign and malignant diseases. Int. J. Cancer (Pred. Oncol.): 95, 114–120, 2001 Holdenrieder 等人, Circulating nucleosomes predict the response to chemotherapy in patients with advanced Non–Small Cell Lung Cancer. Clinical Cancer Research; 10, 5981–5987, 2004 Holdenrieder 和 Stieber, Clinical use of circulating nucleosomes. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences; 46(1): 1–24, 2009 Salgame 等人, An ELISA for detection of apoptosis. Nucleic Acids Research, 25(3), 680-681, 1997 van Nieuwenhuijze 等人, Time between onset of apoptosis and release of nucleosomes from apoptotic cells: putative implications for systemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis; 62: 10–14, 2003
無
圖1：透過免疫測定法測量的含有組蛋白同功異形體H3.1的核小體的血漿量，血漿樣本先以14000 x g離心2分鐘和未離心。(a)取自健康主體的82個血漿樣本，和(b)取自被診斷患有非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin’s Lymphoma, NHL)的主體的74個血漿樣本。 圖 2：血漿樣本先在14000 x g下離心2分鐘對(a)點圖和(b)ROC曲線的效果，使用含有組蛋白同功異形體H3.1的核小體的量作為生物標記物檢測患有NHL的主體。 圖3：取自被診斷為患有COVID-19的主體的32個血漿樣本，透過免疫測定法測量含有組蛋白同功異形體H3.1的核小體的血漿量，血漿樣本先以14000 x g離心2分鐘和未離心。(a)以濃度(ng/ml)表示的結果和(b)以免疫測定法的訊號輸出表示的結果(相對光單位或RLU)。 圖4：透過免疫測定法測量的含有組蛋白修飾H3R8-Cit的核小體的血漿量，血漿樣本先以 14000 x g 離心2分鐘和未離心。(a)取自健康主體的19個血漿樣本，和(b)取自被診斷患有COVID-19的主體的32個血漿樣本。 圖5：在取自2隻健康狗的血漿和血清樣本中測量含有組蛋白同功異形體H3.1的核小體的量，樣本先以14000 x g離心和未離心。(a)和(b)分別取自狗1和狗2的新鮮(未冷凍)血漿和血清樣本；和(c)和(d)在冷凍/解凍循環的相同樣本。

Claims (13)

  1. 一種檢測或測量取自一主體的一血清或血漿樣本中無細胞核蛋白染色質片段之方法，包括步驟： (i)                離心該血清或血漿樣本；以及 (ii)             分析上清液中的一無細胞核蛋白染色質片段。
  2. 如請求項1所述之方法，其中該無細胞核蛋白染色質片段包括一核小體(nucleosome)。
  3. 如請求項2所述之方法，其中該核小體包括一表觀遺傳結構(epigenetic structure)，選自由組蛋白轉譯後修飾、組蛋白變體(variant)或同功異形體(isoform)、DNA修飾或與該核小體結合的蛋白質。
  4. 如請求項2或請求項3所述之方法，其中該核小體包括選自由H3.1之組蛋白同功異形體及/或選自由H3R8-Cit之組蛋白轉譯後修飾。
  5. 如請求項1至請求項4中任一項所述之方法，其中該血清或血漿樣本以大於5000 x g的一相對離心力離心。
  6. 如請求項1至請求項5中任一項所述之方法，其中該血清或血漿樣本離心1至10分鐘。
  7. 如請求項1至請求項6中任一項所述之方法，其中該血清或血漿樣本以介於5000至15000 x g之間的一相對離心力離心約2分鐘。
  8. 如請求項1至請求項7中任一項所述之方法，其中該方法更包括將取自該主體的一全血樣本離心，以將血球細胞與血清或血漿分離，並在進一步離心之前將血清或血漿轉移至單獨容器內。
  9. 如請求項8所述之方法，其中該全血樣本以介於1500-3000 x g的一相對離心力離心。
  10. 如請求項8或請求項9所述之方法，其中該全血樣本離心5至15分鐘。
  11. 如請求項1至請求項10中任一項所述之方法，其中該血清或血漿樣本於步驟(iii)之前為被冷凍的並隨後解凍。
  12. 一種評估或檢測一主體的一疾病狀態之方法，包括步驟： (i)                離心取自該主體的一血清或血漿樣本； (ii)             分析離心後的該血清或血漿樣本的上清液中的一核蛋白染色質片段(nucleoprotein chromatin fragment)；以及 (iii)           使用該核蛋白染色質片段之存在或數量作為該主體的該疾病狀態之指標。
  13. 如請求項12所述之方法，其中該疾病狀態是選自由癌症、感染、自體免疫疾病或發炎性疾病。
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