KR102547565B1 - 호염기구 활성화 검사 방법 - Google Patents

호염기구 활성화 검사 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102547565B1
KR102547565B1 KR1020180091151A KR20180091151A KR102547565B1 KR 102547565 B1 KR102547565 B1 KR 102547565B1 KR 1020180091151 A KR1020180091151 A KR 1020180091151A KR 20180091151 A KR20180091151 A KR 20180091151A KR 102547565 B1 KR102547565 B1 KR 102547565B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
basophil
basophils
ligand
activated
allergen
Prior art date
Application number
KR1020180091151A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20190016446A (ko
Inventor
그룬 쥴리아
세즈만 헤닝
바이만 앨프
Original Assignee
유로이뮨 메디지니쉐 라보디아그노스티카 아게
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from EP17001352.8A external-priority patent/EP3441763A1/de
Application filed by 유로이뮨 메디지니쉐 라보디아그노스티카 아게 filed Critical 유로이뮨 메디지니쉐 라보디아그노스티카 아게
Publication of KR20190016446A publication Critical patent/KR20190016446A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102547565B1 publication Critical patent/KR102547565B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G01N33/6869—Interleukin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/41—Detecting, measuring or recording for evaluating the immune or lymphatic systems
    • A61B5/411—Detecting or monitoring allergy or intolerance reactions to an allergenic agent or substance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5091—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing the pathological state of an organism
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5094—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for blood cell populations
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56972—White blood cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/24—Immunology or allergic disorders

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Ecology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Rehabilitation Therapy (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)

Abstract

본 발명은 알레르기 진단 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 알레르겐을 통해 호염기구의 활성화가 허용되는 조건에서 적어도 20 부피%의 수용액에 대한 전혈(whole blood)의 체적 비율을 갖는 그러한 전혈의 존재하에서 수용액에 있는 알레르겐과 환자의 전혈 샘플로부터 추출된 호염기구를 접촉시키는 단계, a)로부터 호염기구를 증식시키는 단계 및 활성화된 호염기구를 검사하는 단계를 포함하며, 이때 이러한 검사는 활성화된 호염기구의 특징적인 유전자 표지자(marker)의 발현이 화학 발광(chemiluminescence)을 통해 검출됨으로써 달성되며; 또한 본 발명은 키트(kit)를 포함하며, 상기 키트는 상기 호염기구와 알레르겐을 접촉시키기 위한 용기, 이때 용기는 바람직하게는 미량 정량 판(micro titer plate)이 제공되고, 또한 상기 키트는 선택적으로 알레르겐 및 활성화된 호염기구에 특징적인 유전자 표지자를 화학 발광을 통해 검출하기 위한 제제를 포함하고, 이때 바람직하게는 유전자 표지자에 대한 화학 발광할 수 있는 표시가 제공된 리간드가 제공되고, 상기 리간드는 바람직하게는 단클론 항체(momoclonal antibody)이며, 또한 상기 키트는 선택적으로 상기 호염기구의 활성화를 중단시키기 위한 제제 및 선택적으로 고정 가능한 리간드, 즉 호염기구의 활성화 상태와 무관하게 상기 호염기구의 세포 표면에 있는 폴리펩타이드와 결합하고, 바람직하게는 이러한 리간드는 폴리펩타이드에 대해 단클론 항체인 그러한 리간드를 포함하고, 선택적으로 적혈구를 용해 및/또는 제거하기 위한 제제를 포함하는 것을 특징으로 한다.

Description

호염기구 활성화 검사 방법{METHOD FOR VERIFICATION BASOPHIL ACTIVATION}
본 발명은 알레르기 진단 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 알레르겐(allergen)을 통해 호염기구의 활성화가 허용되는 조건에서 적어도 20 부피%의 수용액에 대한 전혈(whole blood)의 체적 비율을 갖는 그러한 전혈의 존재하에서 수용액에 있는 알레르겐과 환자의 전혈 샘플(whole blood sample)로부터 추출된 호염기구를 접촉시키는 단계, a)로부터 호염기구를 증식시키는 단계 및 활성화된 호염기구를 검사하는 단계를 포함하며, 이때 이러한 검사는 활성화된 호염기구의 특징적인 유전자 표지자(marker)가 화학 발광(chemiluminescence)을 통해 검출됨으로써 달성되며; 또한 본 발명은 키트(kit)를 포함하며, 상기 키트는 상기 호염기구와 알레르겐을 접촉시키기 위한 용기, 이때 용기는 바람직하게는 미량 정량 판(micro titer plate)이 제공되고, 또한 상기 키트는 선택적으로 알레르겐 및 활성화된 호염기구에 특징적인 유전자 표지자를 화학 발광을 통해 검출하기 위한 제제를 포함하고, 이때 바람직하게는 유전자 표지자에 대한 화학 발광할 수 있는 표시가 제공된 리간드가 제공되고, 상기 리간드는 바람직하게는 단클론 항체(momoclonal antibody)이며, 또한 상기 키트는 선택적으로 상기 호염기구의 활성화를 중단시키기 위한 제제 및 선택적으로 고정 가능한 리간드, 즉 호염기구의 활성화 상태와 무관하게 상기 호염기구의 세포 표면에 있는 폴리펩타이드와 결합하고, 바람직하게는 이러한 리간드는 폴리펩타이드에 대해 단클론 항체인 그러한 리간드를 포함하고, 선택적으로 적혈구를 용해 및/또는 제거하기 위한 제제를 포함한다.
IgE-매개 면역 반응(immune response)에 기반을 둔 I-알레르기로도 불리는 즉시형 알레르기(immediate-type allergy)를 진단하기 위해, 상세한 병력(anamnesis)에 따라 피부 단자 테스트(skin-prick-test) 또는 유발 테스트(provocation test)와 같은 피부 테스트가 우선적으로 실행되며, 상기 테스트는 알레르기 진단을 위한 금본위제(gold standard)이다. 추가 테스트로서 in vitro-테스트(체외 진단 테스트)가 사용되며, 이러한 테스트에 의해 하나 또는 하나 초과의 정해진 알레르겐에 대한 특정 IgE-항체의 존재가 검사된다.
그러한 검사를 위해, 알레르겐은 스폰지, 멤브레인(membrane) 또는 비드(bead)와 같은 매트릭스(matrix)와 결합하고, 환자 혈청과 접촉하게 된다. 이어서, 결합한 IgE의 양은 표시된 항-인체-IgE 항체(anti-human-IgE antibody)를 통해 측정된다.
상기 in vitro-테스트에서 특정 IgE-측정은 용이한 실행, 표준화 가능성 및 확장 가능성을 포함하는 장점이 있다. 물론, 임상학적으로 관련된 알레르기와 단순한 감응(sensitization)의 차이가 종종 구분되지 않는다.
또 다른 단점은 많은 항체의 빈약한 사용 가능성 및 매트릭스와 알레르겐의 결합에 의한 상기 알레르겐의 구조적 변화 가능성이며, 이로 인해 검사될 IgE-항체의 친화성이 변할 수 있다. 종종, 알레르겐 추출물은 난해한 상황에서 표준화될 수 있거나, 또는 전혀 표준화될 수 없다. 또한, 더욱 작은 알레르겐은 예를 들어 혈청 알부민(serum albumin)과 같은 운반 분자(carrier molecule)에 결합 될 수 있다. 또한, 혈청 및 멤브레인과 결합한 IgE-항체에서 이러한 IgE-항체의 알레르겐에 대한 특이성이 호염기구 및 비만 세포(mast cell)와 같은 효과기 세포(effector cell)에서 일치할 필요가 없으며, 그 이유는 분리 및 결합 된 IgE의 교환이 단지 서서히 진행되기 때문이다. 마지막으로, 특이 IgE-항체를 검사하기 위한 in vitro-테스트에서 세포성 알레르기 반응이 실제로 유발되는 지의 여부가 설명될 수 없는 추가 요소는 예를 들어, 혈액 내의 특이 IgE에 대한 전체 IgE의 전체 비율 또는 항체의 친화성을 결정한다.
특히, IgE-테스트 및 피부 테스트가 불확실한 결과를 제공할 경우, 호염기구-탈 과립 테스트 또는 호염기구-활성화 테스트(BAT)와 같은 세포 테스트 시스템을 보완하는 것이 권장될 수 있다. 일반적으로, 용어 "BAT"는 유세포 분석-테스트(flow cytometry test)와 관련하여 사용된다.
혈청에서 용해된, 생물학적으로 비활성 IgE-비율만 결정하는 특이 IgE-항체 결정에 대한 세포 테스트는 특히, 수용체-결합 IgE-항체와 알레르겐의 결합으로 인해 호염기구의 세포 표면과 이러한 세포 표면의 교차 결합에서 상기 세포 테스트가 유발되는 장점이 있다. 또한, 이러한 세포 테스트는 탈 과립 능력의 한계를 결정할 수 있게 한다. 이를 위해, 특히 환자의 치료 성공을 모니터링하기 위한 면역 요법이 필요할 수 있다.
기본적으로, 상기 세포 테스트는 우선 환자의 혈액이 알레르겐과 접촉하는 방식으로 실시된다. 환자가 이미 사전에 감응된 적이 있다면, 상기 호염기구의 세포 표면에 있는 수용체 결합 된 알레르겐 특이 IgE-항체에 알레르겐이 결합한다. 이것은 IgE-수용체의 교차 결합을 야기하며, 상기 IgE-수용체는 다시 호염기구 과립구의 탈 과립 및 세포 내의 과립으로부터 매개체의 방출을 유발한다. 예를 들어, 히스타민, 류코트리엔 및 트립타제와 같은 매개체는 상층 액(supernatant)에서 효소 면역 측정법을 통해 정량화될 수 있다. 상기 매개체 방출은 CD63 또는 CD203c와 같은 유전자 표지자의 세포 표면에서 농도 증가를 동반하며, 상기 유전자 표지자는 사전에 세포 내의 과립 멤브레인에 있었던 것으로서 마찬가지로 세포 반응을 보여준다. 이로써, 상기 매개체의 방출은 알레르겐에 대한 세포 반응을 보여준다.
지금까지의 진단 경로에서 증가한 이러한 표면 농도는 활성화 특이 세포 표면 유전자 표지자에 대한 항체를 통해 유세포 분석으로 검사되었으며, 상기 세포 표면 유전자 표지자는 형광 단(fluorophore)과 결합 되어 있다. 검사할 세포는 얇은 측정 챔버를 지나 액체 빔(liquid beam)에서 차례대로 유동하고, 서로 다른 파장의 복수의 레이저 빔을 통과하며, 모든 세포 유형에 특징적인 산란 광(scattered light)이 생성되고, 동시에 활성화된 세포가 존재하는 한, 각각의 파장에 따라 상기 항체에 결합 된 형광 단이 자극을 받게 된다. 자극을 받은 형광 단은 빛을 발광하고, 산란 광이 탐지기에 의해 포착된다.
이러한 테스트 시스템의 단점은 높은 가격의 유세포 분석기, 단지 특별히 숙련된 전문가에 의해서만 해석될 수 있는 테스트 결과의 복잡성 및 어려운 표준화 가능성에 있다. 또한, 하나의 장치로 하나의 샘플만 측정될 수 있다.
상기 발명의 또 다른 문제는 활성화될 수 있는 호염기구를 포함하는 샘플의 품질(quality)이다. 이러한 샘플의 품질 및 진단 방법에 대한 적합성은 획득, 운반 및 저장이 전문적으로 실시되었는지에 따라 좌우된다. 예를 들어, 샘플이 열에 노출되거나, 또는 부적합한 버퍼(buffer)는 세포의 사멸을 초래할 수 있다.
충분한 샘플 품질이 제공되지 않을 경우, 잘못된 부정적인 결과를 초래할 수 있으며, 이러한 부정적인 결과는 환자가 알레르기 반응을 보이지 않는 것에 이유가 있는 것이 아니라, 오히려 불충분한 샘플의 품질, 정확하게 표현하면 활성화될 수 있는 호염기구를 포함하지 않거나, 또는 너무 적은 호염기구를 포함하는 샘플이 제공됨으로써 그러한 부정적인 결과가 초래된다.
특히, 비효율적인 것은 유세포 분석과 같이 비용이 많이 소요되는 방법을 실행할 때 품질이 미달 된 샘플이 확인될 경우이다.
따라서, 효율적으로, 즉 대량 신속 처리에 적합한 방법으로 샘플의 품질을 확인하기 위한 방법이 필요하고 또한 유용하다. 그러한 방법은 알레르겐으로 실시되고, 따라서 진단에 유용한 결과를 제공하지 않지만, 샘플 품질이 별도의 접근법으로 진행된 진단 방법에 적합한지가 예측될 수 있다. 이러한 방법은 진단 방법 전, 후 또는 이러한 진단 방법과 병행하여 실시될 수 있다. 이러한 방법 또는 사용된 시약은 활성화될 수 있는 호염기구 수량 또는 비율을 세포 준비 과정, 바람직하게는 샘플에서 결정하기 위해 사용될 수 있다.
DE10235310은 호염기구 활성화가 형광 칼슘 염료에 의해 검사되는 테스트를 공지하고 있다. 이것은 밀도 구배 원심 분획 혈액을 통해 실시된다.
WO2012/044756, US2009/0246805, WO98/32014 및 EP2037269는 호염기구 활성화를 검사하기 위한 유세포 분석 테스트를 공지하고 있다.
이러한 배경하에서, 본 발명의 목적은 선행 기술에 공지된 방법의 전술한 단점이 극복될 수 있는 방법 및 이를 위해 적합한 시약, 특히 유세포 분석기와 다른 시스템으로 실시될 수 있는 호염기구-활성화 테스트를 제공하는 것이다.
특히, 본 발명의 목적은 대량 신속 처리(high throughput) 방법에서 다수의 샘플을 동시에 처리할 수 있는 시스템을 제공하는 것이다. 또한, 반복성과 표준화 가능성이 보장될 수 있다.
본 발명에 따른 상기 목적과 또 다른 목적은 본 발명의 대상, 특히 첨부된 독립항의 대상을 통해 해결되며, 바람직한 실시 형태는 종속항에서 설명된다.
첫 번째 측면에서, 본 발명의 근본적인 문제는 알레르기 진단 방법, 바람직하게는 대량 신속 처리에 적합한 방법을 통해 해결되며, 상기 방법은 아래의 단계:
a) 알레르겐을 통해 호염기구의 활성화가 허용되는 조건에서, 적어도 20 부피%의 수용액에 대한 전혈의 체적 비율을 갖는 그러한 전혈의 존재하에서 수용액에 있는 알레르겐과 환자의 전혈 샘플로부터 추출된 호염기구를 접촉시키는 단계,
b) a)로부터 호염기구를 증식시키는 단계 및,
c) 활성화된 호염기구를 검사하는 단계를 포함하며,
단계 c)에서 검사는 활성화된 호염기구에 특징적인 유전자 표지자가 화학 발광을 통해 검출됨으로써 달성된다.
선택적으로, 상기 첫 번째 측면의 문제는 알레르기 진단 방법을 통해 해결되며, 상기 방법은 아래의 단계:
a) 알레르겐을 통해 호염기구의 활성화가 허용되는 조건에서, 적어도 20 부피%의 수용액에 대한 전혈의 체적 비율을 갖는 그러한 전혈의 존재하에서 수용액에 있는 알레르겐과 환자의 전혈 샘플로부터 추출된 호염기구를 접촉시키는 단계,
b) a)로부터 호염기구를 증식시키는 단계 및,
c) 활성화된 호염기구를 검사하는 단계를 포함하며,
단계 c)에서 검사는 호염기구 표면에 제공된 유전자 표지자가 화학 발광을 통해 검출됨으로써 달성되며, 단계 b)에서 호염기구는 활성화된 호염기구에 특징적인 유전자 표지자에 해당하는 폴리펩타이드와 특이 결합한 리간드에 상기 호염기구가 결합함으로써 증식,
및/또는 단계 c)에서 검사는 활성화된 호염기구에 특징적인 유전자 표지자가 화학 발광을 통해 검출됨으로써 달성된다.
바람직한 실시 형태에서, 전혈(whole blood)은 가공되지 않은 전혈로 제공된다.
또 다른 바람직한 실시 형태에서, 단계 a)의 수용액은 적어도 30 부피%, 바람직하게는 35 부피%, 특히 바람직하게는 40 부피%, 특히 더 바람직하게는 45 부피%의 전혈 비율로 실시된다.
또 다른 바람직한 실시 형태에서, 상기 방법은 바람직하게는 단계 b) 전에 상기 호염기구가 활성화되는 것을 중단시키는 단계를 포함한다.
또 다른 실시 형태에서, 상기 호염기구는 단계 b)에서 이러한 호염기구가 리간드와 결합함으로써 증식되며, 상기 리간드는 호염기구의 세포 표면에 놓여 있는 폴리펩타이드와 특이 결합하고 있다. 이러한 폴리펩타이드는 호염기구의 활성화 상태와 무관하게 상기 호염기구의 세포 표면에 놓여 있는 폴리펩타이드, 및/또는 활성화된 호염기구에 특징적인 유전자 표지자, 바람직하게는 활성화된 호염기구에 특징적인 또 다른 유전자 표지자일 수 있으며, 상기 또 다른 유전자 표지자는 본 발명에 따라 화학 발광으로 검출되는 유전자 표지자와 구별된다. 특히 바람직한 실시 형태에서, 상기 폴리펩타이드는 호염기구의 활성화 상태와 무관하게 이러한 호염기구의 세포 표면에 위치할 수 있다.
또 다른 실시 형태에서, 상기 리간드는 폴리펩타이드에 대한 단클론 항체이며, 호염기구의 활성화 상태와 무관하게 상기 호염기구의 세포 표면에 위치하는 폴리펩타이드와 특이하게 결합하고 있다.
바람직한 실시 형태에서, 상기 호염기구는 단계 b)에서 고정된다.
바람직한 실시 형태에서, 상기 호염기구는 단계 b)에서 비드(bead), 바람직하게는 자석 비드(magnetic bead)에 고정된다.
바람직한 실시 형태에서, 상기 호염기구는 고정 이후에 증식된다.
바람직한 실시 형태에서, 적혈구는 단계 b)에서 용해되고 제거된다.
바람직한 실시 형태에서, 적혈구는 호염기구가 고정되기 전에 원심 분리를 통해 제거된다.
바람직한 실시 형태에서, 단계 c)에서 검사는 호염기구의 표면에 놓여 있는 유전자 표지자, 바람직하게는 활성화된 호염기구에 특징적인 그러한 유전자 표지자에 대해 화학 발광할 수 있는 표시가 제공된 리간드를 통해 실시된다.
바람직한 실시 형태에서, 화학 발광할 수 있는 표시가 제공된 리간드는 단클론 항체이며, 상기 단클론 항체는 자체로 화학 발광할 수 있는 표시를 구비하거나, 또는 화학 발광할 수 있는 표시를 포함하는 이차 항체(secondary antibody)와 결합한다.
바람직한 실시 형태에서, 단계 a), b) 및 c)는 미량 정량 판에서 실시된다.
바람직한 실시 형태에서, 단계 a)는 단계 b) 및 c) 전에 실시된다.
또 다른 측면에 따른 본 발명의 상기 목적은 키트(kit)를 통해 해결되며, 상기 키트는 알레르겐과 호염기구를 접촉시키기 위한 용기를 포함하고, 이러한 용기는 바람직하게는 미량 정량 판이 제공되며, 또한 상기 키트는 선택적으로 알레르겐 및 활성화된 호염기구에 특징적인 유전자 표지자를 화학 발광을 통해 검출하기 위한 제제를 포함하며, 이때 바람직하게는 유전자 표지자에 대해 화학 발광할 수 있는 표시가 제공된 리간드가 제공되고, 상기 리간드는 바람직하게는 단클론 항체(momoclonal antibody)이며, 또한 상기 키트는 선택적으로 상기 호염기구의 활성화를 중단시키기 위한 제제 및 선택적으로 고정 가능한 리간드, 즉 호염기구의 활성화 상태와 무관하게 상기 호염기구의 세포 표면에 있는 폴리펩타이드와 결합하고, 바람직하게는 이러한 리간드는 폴리펩타이드에 대해 단클론 항체인 그러한 리간드를 포함하고, 또한 상기 키트는 선택적으로 적혈구를 용해 및/또는 제거하기 위한 제제를 포함한다.
선택적으로, 또 다른 측면에 따른 문제는 알레르겐과 호염기구를 접촉시키기 위한 용기를 포함하는 전술한 키트를 통해 해결되며, 이러한 용기는 바람직하게는 미량 정량 판이 제공되며, 상기 키트는 선택적으로 알레르겐 및 호염기구를 증식시키기 위해 호염기구의 세포 표면에 놓여 있는 폴리펩타이드에 대한 리간드와 검출을 위해 호염기구의 표면에 놓여 있는 유전자 표지자에 대한 리간드를 포함하며, 이때 상기 리간드는 검출을 위해 호염기구의 표면에 놓여 있는 유전자 표지자에 대해 화학 발광할 수 있는 표시를 구비하고, 화학 발광할 수 있는 표시는 효소(enzym), 또는 적합한 조건하에서 자체로 화학 발광-신호를 생성하는 분자일 수 있으며, 첫 번째 경우에 효소는 화학 발광할 수 있는 기질 용액(substrate solution)과 결합한 상태로 상기 키트에 포함되어 있으며, 상기 호염기구의 세포 표면에 놓여 있는 폴리펩타이드 및/또는 상기 호염기구의 표면에 놓여 있는 유전자 표지자는 활성화된 호염기구에 특징적이다. 선택적으로, 상기 키트는 호염기구의 활성화를 중단시키기 위한 제제를 포함한다. 선택적으로, 상기 키트는 적혈구를 용해 및/또는 제거하기 위한 제제를 포함한다.
본 발명에 따른 키트에 포함된 시약(reagent)은 알레르겐과 호염기구를 접촉시키기 위한 용기로 또는 이러한 용기 없이 알레르기 진단을 위한 키트를 제조하기 위해 사용될 수 있다.
또 다른 측면에 따른 문제는 검출을 위해 호염기구의 표면에 놓여 있는 유전자 표지자에 대한 리간드와 함께 호염기구를 증식시키기 위해 상기 호염기구의 세포 표면에 놓여 있는 폴리펩타이드에 대한 리간드 사용을 통해 해결되며, 이러한 리간드 사용은 알레르기 진단 또는 키트 제조, 즉 알레르기를 진단하거나, 또는 알레르겐에 대한 알레르기 치료용 후보 유효성분의 스크리닝(screening)을 위한 그러한 키트를 제조하기 위한 것으로서, 이때 검출을 위해 호염기구 표면에 놓여 있는 유전자 표지자에 대한 리간드는 화학 발광할 수 있는 표시를 구비하며, 화학 발광할 수 있는 표시에 화학 발광-반응을 촉진하는 효소 또는 적합한 조건하에서 자체로 화학 발광-신호를 생성하는 분자가 제공되며, 첫 번째 경우에 효소는 화학 발광할 수 있는 기질 용액과 결합한 상태로 사용되며, 상기 호염기구의 세포 표면에 놓여 있는 폴리펩타이드 및/또는 상기 호염기구의 표면에 놓여 있는 유전자 표지자는 활성화된 호염기구에 특징적이다.
또 다른 측면에 따른 문제는 알레르기 진단 또는 키트 제조, 즉 알레르기를 진단하거나, 또는 알레르겐에 대한 알레르기 치료용 후보 유효성분의 스크리닝을 위한 그러한 키트를 제조하기 위해 활성화된 호염기구에 특징적인 리간드에 대한 리간드, 즉 화학 발광할 수 있는 표시를 구비한 그러한 리간드 사용을 통해 해결된다.
바람직한 실시 형태에서, 감응성 증가를 위해 바람직하게는 대량 신속 처리 방법이 사용된다.
본 발명은 알레르기를 진단하기 위한 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 우선 환자의 전혈 샘플로부터 수용액에 있는 알레르겐과 호염기구를 접촉시키는 단계 (a)를 포함한다. 전혈 샘플의 경우, 바람직하게는 항응고 작용하는 물질을 포함하는 전혈이 제공된다. 상기 호염기구와 알레르겐이 접촉하기 전에 수용액에 대한 이러한 전혈의 체적 비율은 적어도 20 부피%, 바람직하게는 25 부피%, 30 부피%, 35 부피%, 40 부피%, 45 부피%, 50 부피%, 55 부피%, 60 부피%, 65 부피%, 70 부피%, 75 부피% 또는 80 부피%에 해당하는 양으로 상기 수용액에 첨가된다. 전혈의 존재는 상기 호염기구와 알레르겐의 접촉이 거의 생리적 조건에서 진행되도록 한다.
바람직하게는, 전술한 방법은 대량 신속 처리를 위해 적합한 방법이다. 전술한 방법은 바람직한 실시 형태에서 다수의 샘플, 예를 들어 적어도 2, 4, 8, 16 또는 32개의 샘플을 동시에 처리하는 방법으로 이해할 수 있으며, 개별 샘플을 위한 처리 시간의 적어도 50%, 바람직하게는 60%, 70%, 80% 또는 90%를 필요로 하는 방법 절차는 일반적으로 샘플과 동시에 실시될 수 있다. 모든 샘플에 차례대로 적용되는 측정 과정은 측정 장치를 통해 실시되지만, 하나의 샘플에 대한 개별, 비-동시적 처리는 5분, 바람직하게는 4분, 3분, 2분, 1분 또는 30초를 초과하지 않는 그러한 방법이 제공된다. 대량 신속 처리에 적합한 방법을 위해, 예를 들어 화학 발광 측정은 전술한 방법에 적합한 미량 정량 판을 포함한다. 이와 반대로, 예를 들어 유세포 분석은 대량 신속 처리에 적합한 방법이 아니다.
전혈은 바람직하게는 가공되지 않은 전혈이 제공된다. 바람직한 실시 형태에서, 본 발명에 사용된 용어 "가공되지 않은 전혈"은 혈액이 묽을 수 있거나, 또는 보관을 위해 화학 물질, 바람직하게는 헤파린과 같이 항응고 작용하는 물질이 상기 혈액에 첨가될 수 있지만, 예를 들어 밀도 구배 원심 분획과 같은 원심 분리를 통해 분류되지 않은 것으로 이해할 수 있다.
단계 a)는 서로 다른 병렬로 처리된 합성에서 하나 초과의 알레르겐 및/또는 하나 초과의 농도에 제공된 하나의 알레르겐으로 실시될 수도 있다. 특히, 두 개 또는 두 개 초과의 농도, 바람직하게는 세 개 또는 세 개 초과의 농도에 제공된 항원은 병렬 접근 방식에 대응하는 수량으로 사용될 수 있다. 바람직하게는, 양성 조절(positive control) 또는 음성 조절(negative control)이 추가로 진행된다. 바람직한 실시 형태에서, 알레르겐은 분류학적 주요 분류군 Animalia Arthropoda의 진드기 배양 및 진드기 배설물을 포함하는 군(group), 즉; 비듬, 머리카락, 타액, 배설물 또는 분류학적 주요 분류군 Animalia Chordata에서 유래하는 분비물; 분류학적 주요 분류군 Funghi Ascomycetes에서 유래하는 포자 또는 입자; 분류학적 주요 분류군 Corniferopsida에서 유래하는 꽃가루; 분류학적 주요 분류군 Plantae Magnoliopsidae에서 유래하는 꽃가루; 분류학적 주요 분류군 Plantae Liliopsidae에서 유래하는 꽃가루; 독 또는 분류학적 주요 분류군 Animalia Arthropoda에서 유래하는 분비물; 고무 또는 분류학적 주요 분류군 Plantae Magnoliopsidae의 나무에서 유래하는 그러한 고무를 포함하는 제품군으로부터 선택된 물질이다.
바람직한 실시 형태에서, 알레르겐은 항생제, 바람직하게는 β-락탐을 포함하는 기(group), 바람직하게는, 페니실린 G, 페니실린 V, PPL, MDM, 아목시실린 및 암피실린을 포함하는 기; 바람직하게는, 세파졸린, 세파만돌, 세파클러, 세포 낙심, 세프타지딤, 세포탁심, 세프타지딤, 세페핌을 포함하는 기 세팔로스포린; 카바페넴, 모노박탐, β-락탐제-억제제, 바람직하게는 클라불란산; 마크롤라이드, 아미노글리코시드, 리파마이신, 글리코펩타이드, 폴리펩타이드, 테트라사이클린, 이미다졸, 퀴놀론, 피라졸론, 바람직하게는 설파메톡사졸; 스트렙토그라민, 니트로푸란, 이소니아지드, 펜타미딘; 방부제, 더 바람직하게는 클로르헥시딘, 살진균제, 항바이러스제, 항-말라리아제, 해열 진통제, COX-2-억제제 및 비스테로이드 항염증제를 포함하는 기, 바람직하게는, 아스피린, Lys-아스피린, 이브프로펜, 케토프로펜, 디클로페낙, 나프록센, 파라세타몰, 다이파이론, 인도메타신, 메페남산, 페닐부타존 및 이소프로필안티피린; 신경근육 차단제를 포함하는 기, 바람직하게는, 수사메토니움, 아트라쿠리움, Cis-아트라쿠리움, 미바쿠리움, 판쿠로늄, 로쿠로늄, 베쿠로늄 및 숙시닐콜린, 수면제 및 국소 마취약을 포함하는 기, 바람직하게는, 미다졸람, 프로포폴, 티오펜탈, 펜타닐 및 리도카인; 진정제; 오피오이드; Radio-조영제를 포함하는 기, 바람직하게는, 이온성 조영제, 비이온성 요오드화 조영제, 이소설파블루, 페턴트블루 및 메틸렌블루; 양성자 펌프 억제제, 진정제 및 신경 이완제를 포함하는 기, 바람직하게는, 카바마제핀, 페니토인 및 발프로산; 항정신병제; 항우울제; 도파민; 항히스타민제; 코르티코스테로이드 및 글루코코르티코이드; 화학 치료제 및 면역 억제제; 이뇨제; 혈액 응고 억제제; 혈관 수축약 및 혈관 확장제; 심장약을 포함하는 기, 바람직하게는, 스타틴, ACE-억제제, Alpha-수용제 차단제, Beta-수용제 차단제, 칼슘 길항제 및 항고혈압제; (Anti-)궤양약; (Anti-)갑상선제; 에스트로겐; 헤파린 및 파생물; 인슐린; 스트렙토키나제; 우로키나제를 포함하는 기로부터 선택된 약제 물질이다.
바람직한 실시 형태에서, 알레르겐은 콜로이드 확장제, 혈장 확장제 또는 보조제이며, 바람직하게는 알부민, 덱스트란, 젤라틴, 헤타스타치, 펜타스타치, 시스틴린, 폴리도카놀 600(에톡시스크레롤), 락토오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필셀룰로오스, 프로타민 또는 아프로티닌을 포함하는 기로부터 선택된다.
바람직한 실시 형태에서, 알레르겐은 바람직하게는 식품 방부제, 식품 착색제, 항산화제 및 유화제를 포함하는 기로부터 선택된 식품 첨가물이다.
바람직한 실시 형태에서, 알레르겐은 바람직하게는 이소시아네이트, 이소티아졸리논, 포름알데히드, 산화에틸렌, 프탈산무수물, 클로라민 T, DMSO, 라텍스 및 제과점, 식품 가공 및 세탁 산업에서 사용되는 효소를 포함하는 기로부터 선택된 환경물질 또는 유해물질이다.
바람직한 실시 형태에서, 알레르겐은 진드기의 배양 및/또는 Acarus, Glycyphagus, Lepidoglyphus, Tryophagus, Blomia, Dermatophagoides, Euroglyphus, Blatella 및 Periplaneta 속(genus)에 속하는 진드기로 구성된 군(group)으로부터 선택된 진드기의 배양 및/또는 배설물; Canis, Felis 또는 Equus로부터 선택된 종에 속하는 동물의 비듬, 머리카락, 타액 또는 배설물; 효모, 사상균 또는 Cladosporium, Aspergillus, Penicillium, Alternaria 및 Candida로 구성된 군으로부터 선택된 종에 속하는 곰팡이; Chamaecyparis, Cryptomeria, Cupressus, Juniperus, Anthoxanthum, Cynodon, Dactylis, Festuca, Holcus, Hordeum, Lolium, Oryza, Paspalum, Phalaris, Phleum, Poa, Secale, Sorghum, Triticum, Zea, Ambrosia, Artemisia, Alnus, Betula, Corylus, Fraxinus, Olea 및 Platanus로 구성된 군으로부터 선택된 종에 속하는 꽃가루; Apis Bombus, Dolichovespula, Polistes, Polybia, Vespa 및 Vespula로 구성된 군으로부터 선택된 종에 속하는 곤충의 독; 고무 또는 Hevea 속으로부터 유래하는 그러한 고무를 포함하는 제품을 포함하는 군으로부터 선택된 물질(material)이다.
바람직한 실시 형태에서, 알레르겐은 새우(shrimp) 또는 분류학적 주요 분류군 Animalia Arthropoda에 속하는 새우를 함유한 음식물; 과일, 깍지가 있는 열매, 곡물 또는 분류학적 주요 분류군 Plantae Liliopsidae에서 유래하는 콩 또는 그러한 과일, 깍지가 있는 열매, 곡물 및/또는 콩을 포함하는 식료품; 과일, 깍지가 있는 열매, 곡물 또는 분류학적 주요 분류군 Plantae Magnoliopsidae에서 유래하는 콩 또는 그러한 과일, 깍지가 있는 열매, 곡물 및/또는 콩을 포함하는 식료품; 견과 또는 분류학적 주요 분류군 Plantae Magnoliopsidae에 속하는 견과를 함유한 음식물을 포함하는 군으로부터 선택된 물질이다.
바람직한 실시 형태에서, 알레르겐은 우유, 우유를 함유한 음식물, 달걀 흰자위, 달걀 흰자위를 포함하는 음식물, 생선 또는 생선을 함유한 음식물을 포함하는 군으로부터 선택된 물질이다.
바람직한 실시 형태에서, 알레르겐은 Hordeum, Oryza, Secale, Triticum, Zea, Arachis, Corylis, Juglans, Prunus, Anacardium, Pistacia 및 Glycine을 포함하는 군으로부터 선택된 물질이다.
바람직한 실시 형태에서, 알레르겐은 항원 또는 Aca s 13, Gly d 2, Lep d 2, Lep d 5, Lep d 7, Lep d 10, Lep d 13, Tyr p 2, Tyr p 3, Tyr p 10, Tyr p 13, Tyr p 24, Blo t 1, Blo t 2 Blo t 3, Blo t 4, Blo t 5, Blo t 6, Blo t 10, Blo t 11, Blo t 12, Blo t 13, Blo t 19, Blo t 21, Der f 1, Der f 2, Der f 3, Der f 6, Der f 7, Der f 10, Der f 11, Der f 13, Der f 14, Der f 15, Der f 16, Der f 17, Der f 18, Der f 22, Der m 1, Der p 1, Der p 2, Der p 3, Der p 4, Der p 5, Der p 6 Der p 7, Der p 8, Der p 9, Der p 10, Der p 11, Der p 14, Der p 20, Der p 21, Der p 23, Eur m 1, Eur m 2, Eur m 3, Eur m 4, Eur m 14, Bla g 1, Bla g 2, Bla g 4, Bla g 5, Bla g 6, Bla g 7, Bla g 8, Per a 1, Per a 3, Per a 6, Per a 7, Per a 9, Per a 10, Can f 1, Can f 2, Can f 3, Can f 4, Can f 5, Can f 6, Fel d 1, Fel d 2, Fel d 3, Fel d 4, Fel d 5w, Fel d 6w, Fel d 7, Fel d 8, Equ c 1, Equ c 2, Equ c 3, Equ c 4 and Equ c 5, Cla c 9m, Cla c 14, Cla h 2, Cla h 5, Cla h 6, Cla h 7, Ca h 8, Cla h 9, Cla h 10, Cla h 12, Asp fl 13, Asp f 1, Asp f 2, Asp f 3, Asp f 4, Asp f 5, Asp f 6, Asp f 7, Asp f 8, Asp f 9, Asp f 10, Asp f 11, Asp f 12, Asp f 13, Asp f 15, Asp f 16, Asp f 17, Asp f 18, Asp f 22, Asp f 23, Asp f 27, A5p f 28, A5p f 29, Asp f 34, Asp n 14, Asp n 18, Asp n 25, Asp o 13, Asp o 21, Pen b 13, Pen b 26, Pen ch 13, Pen ch 18, Pen ch 20, Pen ch 31, Pen ch 33, Pen ch 35, Pen c 3, Pen c 13, Pen c 19, Pen c 22, Pen c 24, Pen C 30, Pen c 32, Pen o 18, Fus c 1, Fus c 2, Alt a 1, Alt a 3, Alt a 4, Alt a 5, Alt a 6, Alt a 7, Alt a 8, Alt a 10, Alt a 12, Alt a 13, Cand a 1, Cand a 3 and Cand b 2, Cha o 1, Cha o 2, Cup a 1, Cup s 1, Cup s 3, Jun a 1, Jun a 2, Jun a 3, Jun o 4, Jun s 1, Jun v 1 and Jun v 3, Ant o 1, Cyn d 1, Cyn d 7, Cyn d 12, Cyn d 15, Cyn d 22w, Cyn d 23, Cyn d 24, Dac g 1, Dac g 2, Dac g 3, Dac g 4, Dac g 5, Fes p 4, Hol l 1, Hol l 5, Hor v 1, Hor v 5, Lol p 1, Lol p 2, Lol p 3, Lol p 4, Lol p 5, Lol p 11, Pas n 1, Pha a 1, Pha a 5, Phl p 1, Phl p 2, Phl p 4, Phl p 5, Phl p 6, Phl p 7, Phl p 11, Phl p 12, Phl p 13, Poa p 1, Poa p 5, Sec c 1, Sec C 5, Sec c 20, Sor h 1, Tri a 15, Tri a 21, Tri a 27, Tri a 28, Tri a 29, Tri a 30, Tri a 31, Tri a 32, Tri a 33, Tri a 34, Tri a 35, Zea m 1, Zea m 12, Amb a 1, Amb a 2, Amb a 3, Amb a 4, Amb a 5, Amb a 6, Amb a 7, Amb a 8, Amb a 9 and Amb a 10, Amb p 5, Amb t 5, Art v 1, Art v 2, Art v 3, Art v 4, Art v 5, Art v 6, Aln g 1, Aln g 4, Bet v 1, Bet v 2, Bet v 3, Bet v 4, Bet v 6, Bet v 7, Cor a 10, Fra e 1, Ole e 1, Ole e 2, Ole e 3, Ole e 4, Ole e 5, Ole e 6, OIe e 7, Ole e 8, Ole e 9, Ole e 10, Ole e 11, Pla a 1, Pla a 2, Pla a 3, Pla or 1, Pla or 2 and Pla or 3, Api c 1, Api d 1, Api m 1, Api m 2, Api m 3, Api m 4, Api m 5, Api m 6, Api m 7, Api m 8, Api m 9, Api m 10, Api m 11, Bom p 1, Bom p 4, Bom t 1, Bom t 4, Dol a 5, Dol m 1, Dol m 2, Dol m 5, Pol a 1, Pol a 2 and Pol a 5, Pol d 1, Pol d 4, Pol d 5, Pol e 1, Pol e 4 and Pol e 5, PoI f 5, Pol g 1, Pol g 5, Poly p 1, Poly s 5, Vesp c 1, Vesp c 5, Vesp ma 2, Vesp ma 5, Vesp m 1, Vesp m 5, Ves g 5, Ves m 1, Ves m 2, Ves m 5, Ves p 5, Ves s 1, Ves s 5, Ves vi 5, Ves v 1, Ves v 2, Ves v 3, Ves v 5, Hev b 1, Hev b 2, Hev b 3, Hev b 4, Hev b, 5, Hev b 6, Hev b 7, Hev b 8, Hev b 9, Hev b 10, Hev b 11, Hev b 12, Hev b 13 and Hev b 14, Hor v 12, Hor v 15, Hor v 16, Hor v 17, Hor v 21, Ory s 12, Sec c 20, Tri a 12, Tri a 14, Tn a 18, Tri a 19, Tri a 21, Tri a 25, Tri a 26, Tri a 36, Zea m 14, Zea m 25, Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3, Ara h 4, Ara h 5, Ara h 6, Ara h 7, Ara h 8, Ara h 9, Ara h 10, Ara h 11, Cor a 1, Cor a 2, Cor a 8, Cor a 9, Cor a 11, Cor a 12, Cor a 13, Cor a 14, Jug n 1, Jug n 2, Jug r 1, Jug r 2, Jug r 3, Jug r 4, Pru du 3, Pru du 4, Pru du 5, Pru du 6, Ana o 1, Ana o 2, Ana o 3, Pis v 1, Pis v 2, Pis v 3, Pis v 4, Pis v 5, Gly m 1, Gly m 2, Gly m 3, Gly m 4, Gly m 5 and Gly m 6을 포함하는 기로부터 그러한 항원의 변이형을 포함하는 폴리펩타이드이다.
단계 a)는 상기 알레르겐과 호염기구를 접촉시키기 위한 용기에서 실시될 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 이러한 용기는 미량 정량 판이다. 또 다른 바람직한 실시 형태에서, 상기 용기에 알레르겐 또는 복수의 알레르겐은 감압하에 동결 건조(lyophilize)된 형태로 제공되며, 수용액과 전혈 샘플이 첨가될 때 액상으로 변화한다.
특히 바람직한 실시 형태에서, 항원 Ara h 7은 아이소타입(isotyp) 7.0201(EP17000245)이다. 또 다른 바람직한 실시 형태에서, 항원은 EP16000165.7에 공지된 마카다미아-견과(macadamia-nut)의 항원이다. 또한, 변형된 폴리펩타이드는 항원, 예를 들어 EP15001277.1에 공지된 올레오신-구조로서 사용될 수 있다.
바람직한 실시 형태에서, 상기 방법은 단계 b) 전에 호염기구의 활성화를 중단시키는 단계를 포함한다. 당업자는 활성화 반응을 중단시키기 위해 서로 다른 수단, 예를 들어 EDTA와 같은 칼슘 결합제의 첨가, 아지드 화합물, 바람직하게는 아지드화 나트륨 첨가, 또는 4℃를 넘지 않는 온도로 샘플을 냉각하는 그러한 수단을 알고 있다.
바람직하게는, 단계 a) 이후에 호염기구는 단계 b)에서 증식된다. 바람직한 실시 형태에서, 본 발명에 사용된 용어 "증식"은 모든 세포의 전체 수량 또는 백혈구 수, 바람직하게는 백혈구 수에 대한 호염기구의 수가 전혈 샘플에서 바람직하게는 적어도 2, 5, 10, 20, 50, 100 또는 1000, 특히 바람직하게는 적어도 1000 인자(factor)로 증가 된 것으로 이해할 수 있다. 전술한 것은 바람직하게는 상기 호염기구가 리간드를 결합함으로써 발생하며, 상기 리간드는 제1 결합 지점을 통해 폴리펩타이드와 특이 결합하고, 이러한 폴리펩타이드는 호염기구의 활성화 상태에 따라 또는 호염기구의 활성화 상태와 무관하게, 바람직하게는 이러한 호염기구의 활성화 상태와 무관하게 호염기구에서 발현되고, 이러한 호염기구의 세포 표면에 놓이는 반면, 상기 폴리펩타이드는 또 다른 세포 또는 다수의 또 다른 세포에 단지 미세하게 존재하거나, 또는 바람직하게는 전혀 존재하지 않는다. 이러한 폴리펩타이드는 세포의 전체 수량에 대해 호염기구를 전혈 샘플에서 증식시키기 위해 적합한 선택제이어야 한다. 증식이 완전하게 이루어지는 것이 아니라, 다른 세포, 예를 들어 소량의 수지상 세포(dendritic cell)가 샘플에 남아 있는 경우는 받아들일 수 있다. 바람직하게는, 폴리펩타이드는 호염기구의 활성화 상태와 무관하게 상기 호염기구의 세포 표면에 놓여 있는 폴리펩타이드, 즉 CD123 (데이터 뱅크 코드 NM_002183), CD193 (NP_001828), FcεRI (NM_002001), IgE, CD203c (NM_005021) 및 CRTH2 (NM_004778)를 포함하는 그러한 폴리펩타이드 기로부터 선택되며, 바람직하게는 CD123 또는 IgE, 특히 바람직하게는 CD123이다. 본 발명의 공보에 적용된 전체 데이터 뱅크 코드(data bank code)는 시퀀스(sequence)와 관련된 것이며, 상기 시퀀스는 우선권 주장 출원의 출원일 시점을 위해 번호로 지정된 데이터 뱅크에 온-라인(online)으로 접근할 수 있다. 상기 리간드는 바람직하게는 폴리펩타이드에 대한 단클론 항체, 바람직하게는 CD123 또는 IgE, 특히 바람직하게는 CD123(Agis, H., Fuereder, W., Bankl, H. C., Kundi, M., Sperr, W. R., Willheim, M., ... & Valent, P. (1996). Comparative immunophenotypic analysis of human mast cells, blood basophils and monocytes. Immunology, 87(4), 535-543.; Sainte-Laudy, J. Sabba, A., Vallon C, Guerin JC (1998). Analysis of anti-IgE and allergen induced human basophil activation by flow cytometry. Comparison with histamine release. Inflamm Res. 47(10), 401-8.)에 대한 단클론 항체이다. 바람직한 실시 형태에서, 분리된 단클론 항체가 사용된다. 또 다른 바람직한 실시 형태에서, 상기 호염기구는 하나 초과의 리간드와 결합하며, 이러한 리간드는 제1 결합 지점을 통해 폴리펩타이드와 특이 결합하고, 이러한 폴리펩타이드는 호염기구의 활성화 상태에 따라, 또는 호염기구의 활성화 상태와 무관하게, 바람직하게는 호염기구의 활성화 상태와 무관하게 호염기구에서 발현되고, 이러한 호염기구의 세포 표면에 존재하며, 상기 폴리펩타이드는 바람직하게는 호염기구의 활성화 상태와 무관하게 상기 호염기구의 세포 표면에 놓여 있는 폴리펩타이드, 즉 CD123 (데이터 뱅크 코드 NM_002183), CD193 (NP_001828), FcεRI (NM_002001), IgE, CD203c (NM_005021) 및 CRTH2 (NM_004778), 바람직하게는 두 개 또는 세 개의 리간드를 포함하는 그러한 폴리펩타이드 기로부터 선택되며, 특히 바람직하게는 리간드 가운데 하나의 리간드는 CD123이다. 호염기구의 활성화 상태에 따라 호염기구에서 발현되고, 상기 호염기구의 세포 표면에 존재하는 폴리펩타이드는 바람직하게는, 바소 과립소(Mqochizuki A, McEuen AR, Buckley MG, Walls AF. The release of basogranulin in response to IgE-dependent and IgE-independent stimuli: validity of basogranulin measurement as an indicator of basophil activation. J. Allergy Clin. Immunol. 2003 Jul;112(1):102-8.)], 2D7 Antigen [C L Kepley, S S Craig and L B Schwartz. Identification and partial characterization of a unique marker for human basophils. J Immunol June 15, 1995, 154 (12) 6548-6555;), Avidin bindender Mediator (Joulia R, Valitutti S, Didier A, Espinosa E. Direct monitoring of basophil degranulation by using avidin-based probes. J Allergy Clin Immunol.2017 ), CD13 (NM_001150), CD45 (NM_001150), CD63 (NP_001244318.1), CD107a (NM_00556), CD11b (NM_000632), CD62L (NM_000655), CD11c (XM_011545852), CD164 (NM_001142401), CD45 (NM_001267798) 및 CD203c (NM_005021)을 포함하는 기로부터 선택되며, 바람직하게는 CD63 (Knol, E. F., Mul, F. P., Jansen, H., Calafat, J., & Roos, D. (1991). Monitoring human basophil activation via CD63 monoclonal antibody 435. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 88(3), 328-338)이다.
바람직하게는, 상기 리간드는 제2 결합 지점을 구비하며, 상기 결합 지점은 리간드를 고체 캐리어에 고정하기 위해 이용될 수 있으며, 바람직하게는 캐리어가 상호 보완적인 결합력을 구비할 경우, 정확하게 표현하면 상기 캐리어가 리간드와 특이 결합할 수 있는 능력을 구비할 경우에 해당한다. 바람직하게는, 상기 리간드는 결합력을 갖는 분자를 구비하며, 상기 분자는 비오틴, 스트렙타비딘, His Tag, GST, 아비딘, 뉴트라비딘, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, S-Tag 및 MBP를 포함하는 기로부터 선택된다. 바람직하게는, 고정 캐리어는 비드, 바람직하게는 자석 비드, 미량 정량 판, 플라스틱으로 구성된 반응 용기 및 유리로 구성된 반응 용기를 포함하는 군으로 구성된 그러한 캐리어가 제공된다. 특히 바람직한 실시 형태에서, 상기 캐리어는 비드, 바람직하게는 자석 비드가 제공되며, 비드를 포함하는 수용액은 상기 미량 정량 판의 벽에 존재한다. 바람직한 실시 형태에서, 수용액은 단계 a) 및/또는 단계 b)에서 예를 들어 교반(agitation) 또는 셰이킹(shaking)을 통해 지속적으로 혼합된다.
바람직한 실시 형태에서, 적혈구의 용해 및 이어지는 제거는 바람직하게는 단계 b)에서 실시된다. 당업자는 적혈구를 용해하기 위한 수단을 알고 있으며, 예를 들어 그러한 수단은 US4902613, US6143567 또는 WO85/05640에 공지되어 있다. 예를 들어, 저장성 용해(hypotonic lysis)는 단지 물로만 또는 다이에틸렌클라이콜, 포름알데히드 및 구연산의 존재하에서 실시될 수 있다(US4902613).
상기 적혈구 제거는 바람직하게는 원심 분리를 통해 실시된다.
본 발명에 따라, 호염기구의 활성화는 활성화에 특징적인 유전자 표지자의 표면 농도가 화학 발광을 통해 검출됨으로써 확인된다. 바람직하게는, 상기 유전자 표지자는 바소 과립소(Mochizuki A, McEuen AR, Buckley MG, Walls AF. The release of basogranulin in response to IgE-dependent and IgE-independent stimuli: validity of basogranulin measurement as an indicator of basophil activation. J. Allergy Clin. Immunol.2003 Jul;112(1):102-8.)], 2D7 Antigen [C L Kepley, S S Craig and L B Schwartz. Identification and partial characterization of a unique marker for human basophils. J Immunol June 15, 1995, 154 (12) 6548-6555;), Avidin bindender Mediator (Joulia R, Valitutti S, Didier A, Espinosa E. Direct monitoring of basophil degranulation by using avidin-based probes. J Allergy Clin Immunol.2017 ), CD13 (NM_001150), CD45 (NM_001150), CD63 (NP_001244318.1), CD107a (NM_00556), CD11b (NM_000632), CD62L (NM_000655), CD11c (XM_011545852), CD164 (NM_001142401), CD45 (NM_001267798) 및 CD203c (NM_005021)를 포함하는 기로부터 선택되며, 바람직하게는 CD63(Knol, E. F., Mul, F. P., Jansen, H., Calafat, J., & Roos, D. (1991), Monitoring human basophil activation via CD63 monoclonal antibody 435. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 88(3), 328-338.)이다. 이러한 하나 초과의 유전자 표지자를 검출하는 가능성이 존재한다. 전술한 것을 위해, 바람직하게는 활성화된 호염기구에 특징적인 유전자 표지자에 대해 리간드, 바람직하게는 단클론 항체에 화학 발광할 수 있는 표시가 제공되는 것이다. 특히 바람직한 실시 형태에서, 분리된 단클론 항체가 사용된다.
화학 발광할 수 있는 표시는 화학 발광-반응을 촉진하는 효소 및 적합한 조건하에서 자체로 화학 발광-신호를 생성하는 분자, 바람직하게는 후자에 해당하는 분자, 특히 바람직하게는 아크리디늄에스테르 또는 아크리니늄술폰아미드가 제공될 수 있다. 단계 a) 전에 실행된 단계에서 활성화된 호염기구에 특징적인 유전자 표지자에 대해 상기 리간드는 화학 발광할 수 있는 표시와 연결될 수 있다. 예를 들어, 단클론 항체는 아크리디늄에스테르(AE)와 혼합될 수 있다. AE 화합물은 이미 임상 진단을 위한 자동화된 분석에서 사용되고 있는(I Weeks, I Beheshti, F McCapra, A K Campbell, J S Woodhead. Acridinium esters as high specific activity labels in immunoassay. Clin Chem 29: 1474-1479(1983) 매우 민감한 표시이다. 항체에 AE 화합물 연결이 주류를 형성하고 있고, 페놀링의 N-하이드록시숙신미딜(NHS)과 같은 작용기를 통해 달성된다. 이러한 목적을 위해, 정제된 항체는 실온에서 정해진 시간 동안 AE(예를 들어, Heliosense회사의 NSP-SA-NHS, NSP-DMAE 또는 NSP-DMAE-NHS)와 반응시킨다. 이어서, 표시된 항체는 칼럼(column) 또는 HPLC와 같은 다른 정제 방법을 통해 미반응된 AE로부터 분리된다.
바람직한 실시 형태에서, 아크리디늄에스테르는 다음과 같은 공식, 즉:
Figure 112018077322846-pat00001
을 갖고, 이때 R1은 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴 및 R2와 R3는 수소, 알킬, 치환된 알킬, 할로겐, 시안화물, 하이드록시, 알콕시, 티올, 알킬메르캅토를 포함하는 기로부터 서로 독립적으로 선택되며, Y는 바람직하게는 pKa<12를 갖는 이탈기(leaving group)이며, 아릴옥시, 치환된 아릴옥시, 치환된 알콕시, 메르캅토, 치환된 메르캅도, 설폰아미딜, 치환된 설폰아미딜, N-하이드록실아미드, 치환된 N-하이드록실아미드를 포함하는 기로부터 선택되고, 상기 아크리디늄에스테르는 이러한 아크리디늄에스테르를 폴리펩타이드, 바람직하게는 항체와 연결할 수 있는 또는 연결되어 있는 기, 바람직하게는 N-하이드록시숙신미딜(NHS)-기를 포함한다. 적합한 화합물과 방법은 WO2012/028167에 공지되어 있다.
검출을 위해, 화학 발광-검출 키트(예를 들어, Invitron회사 제품)가 사용될 수 있다. 결합하지 않은 항체의 세정 이후에, 두 개의 트리거(각기 100㎕; 트리커 1: 과산화수소를 포함; 트리거 2: 수산화나트륨을 포함)가 광도계(lumino meter)에서 차례대로 자동 첨가된다. 아크리디늄에스테르-화합물은 알칼리성 조건하에서 산화되며, 빛을 방출하는 아크리돈이 생성된다. 신호는 일반적으로 1 내지 5초 동안 지속되는 플래시(플래시-발광) 형태로 노출된다. 짧은 방출 시간은 검출기에서 직접 반응을 개시하고 측정할 수 있다. 적합한 광도계는 미량 정량 판에서 자동 트리거 첨가 및 검출을 가능하게 한다. 강도가 높을 경우, 일반적으로 전체 신호는 측정 간격을 통해 적분 된다.
선택적으로, 항체와 효소의 연결은 바람직하게는 페록시다아제, 알칼리성 포스파타아제 및 β-유당 분해 효소를 포함하는 기로부터 선택되며, 이러한 유당 분해 효소는 화학 발광할 수 있는 기질(substrat)를 변환시킬 수 있다(Kricka L J. (2003).Clinical applications of chemiluminescence. Analytica chimica acta, 500(1): 279-286). 효소에 따라, 순환하는 디아실히드라지드, 루미놀 또는 이소루미놀, 아크리딘, 디옥세탄 및 상기 디옥세탄의 유도체 기로부터 선택된 기질이 사용된다. 전술한 것을 위해, 가장 빈번하게 사용된 효소는 겨자 무과 산화효소(horseradish peroxidase, (HRP))이며, 상기 겨자 무고 산화효소는 과산화수소의 존재하에서 루미놀의 산화를 촉진한다. 방출된 빛은 425nm의 파장으로 감지될 수 있다. 가능한 방법은 Neupert, W., Oelkers, R., Brune, K., Geisslinger, G.A new reliable chemiluminescence immunoassay (CLIA) for prostaglandin E2 using enhanced luminol as substrate.Prostaglandins. 1996 Nov;52(5):385-401에 기재되어 있다.
또 다른 선택은, 전기적(electric generated) 화학 발광의 사용이다. 이미, Tris(2,2-bipyridyl)ruthenium(ll)가 몇몇 면역 측정법(immunoassay)에서 사용되고 있다(Xiaoming Zhou, Debin Zhu, Yuhui Liao, Weipeng Liu, Hongxing Liu, Zhaokui Ma&Da Xing (2014). Synthesis, labeling and bioanalytical applications of a tris(2,2-bipyridyl)ruthenium(II)-based electrochemi-luminescence probe. Nature ProtocolsVolume 9, Pages:1146-1159). 전압이 공급되고 난 후, 트리프로필아민(TPA)과 루테늄 발생체(ruthenium complexes)가 반응할 때, 화학 발광은 주변 매질로부터 최대 620nm으로 방출된다. 바람직하게는, 화학 발광할 수 있는 표시는 화학 발광할 수 있는 금속 복합물, 바람직하게는 루테늄을 포함하는 그러한 복합물이 제공된다.
바람직한 실시 형태에서, 전술한 화학 발광할 수 있는 표시는 또 다른 기로 인해 방출이 촉진되거나, 또는 자체 방출은 400nm 또는 초과, 바람직하게는 400nm 내지 650nm, 특히 바람직하게는 400nm 내지 550nm, 특히 더 바람직하게는 405nm 내지 500nm, 특히 더 바람직하게는 405nm 내지 490nm, 특히 더 바람직하게는 410nm 내지 490nm, 특히 더 바람직하게는 410nm 내지 450nm, 특히 가장 바람직하게는 415nm 내지 445nm의 파장 길이로 최대 방출된다. 적합한 화합물과 방법은 Natrajan et al. (2010) Enhanced immunoassay sensitivity using chemiluminescent acridinium esters with increased light output, Analytical Biochemistry, 27 July 2010)에 기재되어 있다.
바람직하게는, 다수의 반응은 상기 미량 정량 판의 서로 다른 벽에서 동시에 실시되고, 화학 발광-신호는 시중에서 구입할 수 있는(예를 들어, Berthold Technologies회사 제품) 광도계 플레이트를 통해 검출된다. 호염기구의 활성화 정도는 비-자극 제어에 대해 화학 발광-신호의 강도 또는 증가와 관련된다. 긍정적인 평가를 위해, 테스트 물질에 따른 한계 값, 즉 당업자가 일반적으로 확인할 수 있는 그러한 한계 값이 초과 되어야 한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 방법은 순서대로, 즉 우선 단계 a), 이어서 단계 b) 및 마지막으로 단계 c)의 순서대로 실시된다. 또한, 우선 단계 b)를 실행하고, 이어서 단계 a) 및 그런 다음 단계 c)가 실시될 수도 있다. 선택적으로 단계 b) 및 단계 c)는 동시에 또는 중첩된 상태로 실시될 수 있다.
특히 바람직한 실시 형태에서, 단계 a) 이후, 호염기구의 활성화 상태와 무관하게 상기 호염기구의 세포 표면에 놓여 있는 폴리펩타이드와 특이 결합하는 리간드가 제공될 뿐만 아니라, 활성화된 호염기구에 특징적인 유전자 표지자에 대해 화학 발광할 수 있는 표시가 제공된 리간드가 상기 호염기구를 포함하는 수용액에 제공된다. 바람직하게는, 전술한 것은 캐리어의 존재하에서 실시되며, 상기 리간드는 호염기구의 활성화 상태와 무관하게 상기 호염기구의 세포 표면에 놓여 있는 폴리펩타이드와 특이 결합하며, 바람직하게는 비드와 같은 고체 캐리어에 고정되어 있거나, 또는 고정된다. 이어서, 수용액이 교체되고, 고정된 호염기구가 세정 될 수 있으며, 초과한 리간드 및 결합 되지 않은 세포는 제거된다. 전술한 것이 존재할 경우, 호염기구의 활성화 상태와 무관하게 상기 호염기구의 세포 표면에 놓여 있는 폴리펩타이드와 특이 결합한 리간드를 통해 호염기구는 캐리어에 고정된 상태로 남아 있다. 이러한 고정된 호염기구 중에서 알레르겐과 접촉함으로써 실제로 활성화된 호염기구는 활성화된 호염기구에 특징적인 유전자 표지자에 대해 리간드가 상기 호염기구에 결합 되어 있는 것을 통해 특징 된다. 마지막 리간드에 화학 발광할 수 있는 표시가 제공되지 않을 경우, 선택적으로 초과한 리간드를 제거하기 위한 세정 단계 이후에, 화학 발광할 수 있는 표시를 포함하며, 마지막으로 언급된 리간드와 결합한 이차 항체가 필요할 경우 다음 단계에서 첨가될 수 있으며, 이러한 리간드는 단지 활성화된 호염기구와 결합한 상태로 남아 있으며, 활성화되지 않은 호염기구와는 결합하지 않는다. 또 다른 세정 단계에서 초과한 이차 항체가 제거될 수 있다.
그런 다음, 화학 발광이 측정된다. 활성화를 검사할 때, 호염기구의 적은 비율에도 이러한 방법, 특히 적혈구 제거와 결합 된 방법을 통해 감응성이 달성되며, 이러한 감응성은 유세포 분석을 이용하는 방법과 비교될 수 있다.
본 발명에 따른 방법 및, 또는 본 발명에 따른 키트 또는 본 발명의 키트에 포함될 수 있는 하나 또는 하나 초과의 시약은 후보 유효성분의 스크리닝을 위해 사용될 수 있으며, 이것은 후보 유효성분의 선택하에서 치료에 효과적인 작용물질을 식별하기 위한 것이다. 이 경우, 후보 유효성분과 호염기구의 접촉 이후에 단계 a)가 실시된다. 치료에 효과적인 작용물질에서, 후보 유효성분을 포함하지 않거나, 또는 효과적이지 않은 후보 유효성분을 포함하는 접근법에서 적은 활성화가 확인될 수 있다.
바람직한 실시 형태에서, 본 발명에 사용된 용어 "후보 유효성분"은 화합물로 이해할 수 있으며, 이러한 화합물로부터 바람직하게는 화합물이 알레르기 반응을 완화 시키거나 또는 억제한다는 의미에서 상기 화합물이 환자에게 치료 작용을 갖는지의 문제가 가정되거나 또는 이러한 문제가 분석되어야 한다. 바람직한 실시 형태에서, 선택적으로 단지 알레르기로 고통받는 환자의 하위 그룹에만 사용되는 이미 언급된 하나 또는 하나 초과의 작용물질이 특정 환자에게 치료 효과가 있는지 분석된다.
본 발명은 알레르기 진단 또는 알레르기 진단을 위한 키트를 제조하기 위해 활성화된 호염기구에 특징적인 리간드에 대해 화학 발광할 수 있는 표시를 구비하는 리간드의 사용에 관한 것이다. 마찬가지로, 알레르기 진단을 위해 본 발명에 따른 키트가 사용될 수 있다. 제조는 화학 발광할 수 있는 표시를 리간드에 연결하는 것을 포함할 수 있다. 키트 또는 조성물 또는 폴리펩타이드와 특이 결합하는 리간드와 상기 화학 발광할 수 있는 리간드가 결합하여 사용될 수 있으며, 이때 폴리펩타이드는 호염기구의 활성화 상태와 무관하게 상기 호염기구의 세포 표면에 존재한다.
본 발명에 따른 키트는 시약을 포함할 수 있으며, 상기 시약은 알레르겐의 존재와 무관하게 호염기구를 활성화 시킨다. 그러한 시약은 선행 기술에 공지 및 포함되어 있으며, 포르밀-메틸오닐-류실-페닐알라닌(fMLP), 로노마이신, 12-미리스트산염-13-아세트산염(PMA), fMLP 및 A23187, 항-인체-IgG, 항-IgE-수용체-항체 C40/80 및 시노메닌에 제한되지 않는다. 바람직하게는, fMLP 및/또는 항-Fc Epsilon-RI, 특히 바람직하게는 fMLP가 제공된다.
또한, 본 발명은 방법 및 상기 방법에 적합한 시약에 관한 것이며, 이것은 대량 신속 처리에 적합한 방법에서 샘플의 품질을 효율적으로 확인하기 위해 제공된다. 그러한 방법은 알레르겐으로 실시되지 않고, 따라서 진단에 유용한 결과를 제공하지 않지만, 샘플의 품질이 별도의 접근법으로 진행된 진단 방법에 적합한지 예측할 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 이러한 목적을 달성하기 위해 실시되며, 알레르겐은 활성화될 수 있는 호염기구가 상기 알레르겐의 존재와 무관하게 활성화되는 것으로 알려진 시약으로 대체된다.
추가 또는 선택적인 양성 조절(positive control)로서 환자의 샘플 대신 알레그겐 또는 시약과 결합한 호염기구 조제(basophile preparation)가 사용되며, 시약은 활성화될 수 있는 호염기구가 알레르겐의 존재와 무관하게 활성화되는 것으로 알려져 있고, 상기 호염기구 조제는 이러한 호염기구 조제가 충분히 반응하는 것, 즉 알레르겐을 통해 활성화될 수 있는 것으로 알려졌다. 상기 호염기구 조제는 단독적으로 또는 알레르겐 또는 시약과 결합하여 사용되며, 시약은 이러한 시약이 본 발명에 따른 키트를 포함할 수 있는 알레르겐의 존재와 무관하게 활성화될 수 있는 호염기구를 활성시키는 것으로 알려졌다.
이러한 방법은 진단 방법 전, 후 또는 이러한 진단 방법과 병행하여 실시될 수 있거나, 또는 이러한 진단 방법과 무관하게 독립적으로 실시될 수 있다.
또한, 본 발명은 호염기구 활성화를 검사하기 위한 방법의 신뢰성을 확인 또는 검증하기 위해, 또는 상기 호염기구를 포함하는 샘픔의 품질, 바람직하게는 샘플에 포함된 호염기구의 활성화 가능성을 확인하기 위한 비-진단 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 아래의 단계, 즉:
a) 알레르겐을 통해 호염기구의 활성화를 허용하는 조건하에서 알레르겐의 존재와 무관하게 호염기구를 활성화 시키는 시약과 환자의 전혈 샘플로부터 추출된 호염기구를 접촉시키는 단계,
b) a)로부터 호염기구를 증식시키는 단계 및,
c) 활성화된 호염기구가 검사되는 단계를 포함하며,
단계 c)에서 검사는 활성화된 호염기구에 특징적인 유전자 표지자가 화학 발광을 통해 검출됨으로써 달성된다.
알레르겐의 존재와 무관하게 호염기구를 활성화 시키는 시약으로서 포르밀-메틸오닐-류실-페닐알라닌(fMLP; 예를 들어, Sigma, St Louis, MO) 및/또는 항-IgE-수용체-항체가 제공될 수 있다.
본 발명은 실시 예에 근거를 둔 도면과 관련하여 아래와 같이 상세하게 설명된다. 기재된 실시 형태는 모든 관점에서 단지 예에 해당하며, 제한적인 것으로 파악될 수 없으며, 본 발명의 범위는 설명된 특징의 서로 다른 결합을 포함한다.
도 1은 플래시 화학 발광으로 측정된 본 발명에 따른 결과를 청결도 측정 단위(RLU; 도 1a-d 참조)로 도시하고 있다. 서로 다른 농도(10㎍ - 1ng) 또는 실험군(anti-FcεRI 및 fMLP)이 제공된 알레르겐 추출물(t2: 앨더 꽃가루 추출물; t3: 자작나무 꽃가루 추출물; t4: 개암나무 꽃가루 추출물)로 꽃가루 알레르기 체질인 사람의 50㎕의 전혈을 자극하였고, 호염기구 활성화는 화학 발광 테스트를 통해 측정하였다. 막대그래프는 알레르겐 농도 또는 실험군에 따른 절대 RLU 측정값을 나타낸다. 측정값은 막대그래프를 통해 추가로 표시되었다. 도 1a는 비-자극 실험군(음성 조절(negative control)) 및 anti-FcεRI 및 fMLP에 의한 자극 실험군의 반응을 도시하고 있다. 도 1b는 서로 다른 농도(10㎍/ml, 1㎍/ml, 100ng/ml, 10ng/ml)의 앨런 꽃가루 추출물로 자극받은 샘플의 반응을 도시하고 있다. 도 1c는 서로 다른 농도(1㎍/ml, 100ng/ml, 10ng/ml, 1ng/ml)의 자작나무 꽃가루 추출물로 자극받은 샘플의 반응을 도시하고 있다. 도 1d는 서로 다른 농도(10㎍/ml, 1㎍/ml, 100ng/ml, 10ng/ml)의 개암나무 꽃가루 추출물로 자극받은 샘플의 반응을 도시하고 있다. 측정은 삼중으로 실시되었다. 평균값 및 표준 편차가 계산되었다. 도 1 e-h는 도 1 a-d에 도시된 샘플을 위한 (평균값 RLU 활성화 샘플)/(평균값 RLU 음성 조절)을 통해 계산된 자극지수(SI)를 도시하고 있다.
도 2는 활성화된 호염기구의 유세포 분석 측정에 의한 호염기구 활성화 테스트를 %(도 2a-d) 또는 평균 형광 강도(MFI; 도 2e-h)로 도시하고 있다. 서로 다른 농도(10㎍ - 1ng) 또는 실험군(anti-FcεRI 및 fMLP)이 제공된 도 1의 실험과 동일한 알레르기 추출물(t2: 앨더 꽃가루 추출물; t3: 자작나무 꽃가루 추출물; t4: 개암나무 꽃가루 추출물)로 꽃가루 알레르기 체질인 사람의 50㎕의 전혈을 자극하였고, 호염기구 활성화는 유세포 분석을 통해 측정하였다. 각각의 막대그래프는 알레르겐 농도 및 실험군에 따른 활성화된 호염기구의 비율을 도시하고 있다. 측정값은 막대그래프를 통해 추가로 표시되었다. 도 2a는 비-자극 실험군(음성 조절) 및 anti-FcεRI 및 fMLP에 의한 자극 실험군의 반응을 도시하고 있다. 이때, 두 양성 조절에서 호염기구의 대략 30%가 활성화되었다. 10% 초과의 자극부터 반응은 긍정적인 것으로 평가되었다. 도 2b는 서로 다른 농도(10㎍/ml, 1㎍/ml, 100ng/ml, 10ng/ml)의 앨런 꽃가루 추출물로 자극받은 샘플의 반응을 도시하고 있다. 도 2c는 서로 다른 농도(1㎍/ml, 100ng/ml, 10ng/ml, 1ng/ml)의 자작나무 꽃가루 추출물로 자극받은 샘플의 반응을 도시하고 있다. 도 2d는 서로 다른 농도(10㎍/ml, 1㎍/ml, 100ng/ml, 10ng/ml)의 개암나무 꽃가루 추출물로 자극받은 샘플의 반응을 도시하고 있다. CD123+/HLA-DR-표현형(phenotype)을 갖는 세포는 호염기구로 확인되었으며, 활성화는 anti-CD63-Vio-Blue를 통해 검출되었다.
호염기구의 최대 반응성은 사용된 최고 농도에서 꽃가루 추출물에 따라 80-88%였으며, 알레르겐 추출물의 희석화로 인해 계속해서 감소하였다.
도 3은 플래시 화학 발광으로 측정된 본 발명에 따른 결과를 청결도 측정 단위(RLU; 도 3a-d 참조)로 도시하고 있다. 서로 다른 농도(10㎍ - 1ng) 또는 실험군(anti-FcεRI 및 fMLP)이 제공된 알레르겐 추출물(f49: 사과 추출물; g6: 티모시 꽃가루 추출물; t3: 자작나무 꽃가루 추출물)로 꽃가루 알레르기 체질인 사람의 50㎕의 전혈을 자극하였고, 호염기구 활성화는 화학 발광 테스트를 통해 측정하였다. 막대그래프는 알레르겐 농도 또는 실험군에 따른 절대 RLU의 측정값을 나타낸다. 측정값은 막대그래프를 통해 추가로 표시되었다. 도 3a는 비-자극 실험군(음성 조절) 및 anti-FcεRI 및 fMLP에 의한 자극 실험군의 반응을 도시하고 있다. 도 3b는 서로 다른 농도(10㎍/ml, 1㎍/ml, 100ng/ml, 10ng/ml)의 사과 추출물로 자극받은 샘플의 반응을 도시하고 있다. 도 3c는 서로 다른 농도(1㎍/ml, 100ng/ml, 10ng/ml, 1ng/ml)의 티모시 꽃가루 추출물로 자극받은 샘플의 반응을 도시하고 있다. 도 3d는 서로 다른 농도(1㎍/ml, 100ng/ml, 10ng/ml, 1ng/ml)의 자작나무 꽃가루 추출물로 자극받은 샘플의 반응을 도시하고 있다. 측정은 삼중으로 실시되었다. 평균값 및 표준 편차가 계산되었다. 도 3 e-h는 도 3 a-d에 도시된 샘플에 대한 (평균값 RLU 활성화 샘플)/(평균값 RLU 음성 조절)을 통해 계산된 자극지수(SI)를 도시하고 있다.
도 4는 활성화된 호염기구의 유세포 분석 측정에 의한 호염기구 활성화 테스트를 %(도 4a-d) 또는 평균 형광 강도(MFI; 도 4e-h)로 도시하고 있다. 서로 다른 농도(10㎍ - 1ng) 또는 실험군(anti-FcεRI 및 fMLP)이 제공된 알레르기 추출물(f49: 사과 추출물; g6: 티모시 꽃가루 추출물; t3: 자작나무 꽃가루 추출물)로 꽃가루 알레르기 체질인 사람의 50㎕의 전혈을 자극하였고, 호염기구 활성화는 유세포 분석을 통해 측정하였다. 각각의 막대그래프는 알레르겐 농도 및 실험군에 따른 활성화된 호염기구의 비율을 도시하고 있다. 측정값은 막대그래프를 통해 추가로 표시되었다. 도 4a는 비-자극 실험군(음성 조절) 및 anti-FcεRI 및 fMLP에 의한 자극 실험군의 반응을 도시하고 있다. 이때, 두 양성 조절에서 호염기구의 대략 30%가 활성화되었다. 10% 초과의 자극부터 반응은 긍정적인 것으로 평가되었다. 도 4b는 서로 다른 농도(10㎍/ml, 1㎍/ml, 100ng/ml, 10ng/ml)의 사과 추출물로 자극받은 샘플의 반응을 도시하고 있다. 도 4c는 서로 다른 농도(1㎍/ml, 100ng/ml, 10ng/ml, 1ng/ml)의 티모시 꽃가루 추출물로 자극받은 샘플의 반응을 도시하고 있다. 도 4d는 서로 다른 농도(1㎍/ml, 100ng/ml, 10ng/ml, 1ng/ml)의 자작나무 꽃가루 추출물로 자극받은 샘플의 반응을 도시하고 있다. CD123+/HLA-DR-표현형(phenotype)을 갖는 세포는 호염기구로 확인되었으며, 활성화는 anti-CD63-Vio-Blue를 통해 검출되었다.
호염기구의 최대 반응성은 사용된 최고 농도에서 꽃가루 추출물에 따라 96-65%였으며, 알레르겐 추출물의 희석화로 인해 계속해서 감소하였다.
도 5는 플래시 화학 발광으로 측정된 본 발명에 따른 방법의 결과를 청결도 측정 단위(RLU; 도 5a-d 참조)로 도시하고 있다. 서로 다른 농도(10㎍ - 1ng) 또는 실험군(anti-FcεRI 및 fMLP)이 제공된 알레르겐 추출물(e94: rFeld d 1; t3: 자작나무 꽃가루 추출물; w6: 쑥 꽃가루 추출물)로 꽃가루 알레르기 체질인 사람의 50㎕의 전혈을 자극하였고, 호염기구 활성화는 화학 발광 테스트를 통해 측정하였다. 막대그래프는 알레르겐 농도 또는 실험군에 따른 절대 RLU 측정값을 나타낸다. 측정값은 막대그래프를 통해 추가로 표시되었다. 도 5a는 비-자극 실험군(음성 조절) 및 anti-FcεRI 및 fMLP에 의한 자극 실험군의 반응을 도시하고 있다. 도 5b는 서로 다른 농도(1㎍/ml, 100ng/ml, 10ng/ml, 1ng/ml)의 rFeld d 1로 자극받은 샘플의 반응을 도시하고 있다. 도 5c는 서로 다른 농도(10㎍/ml, 1㎍/ml, 100ng/ml, 10ng/ml)의 자작나무 꽃가루 추출물로 자극받은 샘플의 반응을 도시하고 있다. 도 5d는 서로 다른 농도(10㎍/ml, 1㎍/ml, 100ng/ml, 10ng/ml)의 쑥 꽃가루 추출물로 자극받은 샘플의 반응을 도시하고 있다. 측정은 삼중으로 실시되었다. 평균값 및 표준 편차가 계산되었다. 도 5 e-h는 도 5 a-d에 도시된 샘플에 대한 (평균값 RLU 활성화 샘플)/(평균값 RLU 음성 조절)을 통해 계산된 자극지수(SI)를 도시하고 있다.
도 6은 활성화된 호염기구의 유세포 분석 측정에 의한 호염기구 활성화 테스트를 %(도 6a-d) 또는 평균 형광 강도(MFI; 도 6e-h)로 도시하고 있다. 서로 다른 농도(10㎍ - 1ng) 또는 실험군(anti-FcεRI 및 fMLP)이 제공된 알레르기 추출물(e94: rFeld d 1; t3: 자작나무 꽃가루 추출물; w6: 쑥 꽃가루 추출물)로 꽃가루 알레르기 체질인 사람의 50㎕의 전혈을 자극하였고, 호염기구 활성화는 유세포 분석을 통해 측정하였다. 각각의 막대그래프는 알레르겐 농도 및 실험군에 따른 활성화된 호염기구의 비율을 도시하고 있다. 측정값은 막대그래프를 통해 추가로 표시되었다. 도 6a는 비-자극 실험군(음성 조절) 및 anti-FcεRI 및 fMLP에 의한 자극 실험군의 반응을 도시하고 있다. 이때, 두 양성 조절에서 대략 40%의 호염기구가 활성화되었다. 10% 초과의 자극부터 반응은 긍정적인 것으로 평가되었다. 도 6b는 서로 다른 농도(1㎍/ml, 100ng/ml, 10ng/ml, 1ng/ml)의 rFel d 1로 자극받은 샘플의 반응을 도시하고 있다. 도 6c는 서로 다른 농도(10㎍/ml, 1㎍/ml, 100ng/ml, 10ng/ml)의 자작나무 꽃가루 추출물로 자극받은 샘플의 반응을 도시하고 있다. 도 6d는 서로 다른 농도(10㎍/ml, 1㎍/ml, 100ng/ml, 10ng/ml)의 쑥 꽃가루 추출물로 자극받은 샘플의 반응을 도시하고 있다. CD123+/HLA-DR-표현형(phenotype)을 갖는 세포는 호염기구로 확인되었으며, 활성화는 anti-CD63-Vio-Blue를 통해 검출되었다.
호염기구의 최대 반응성은 사용된 최고 농도에서 추출물에 따라 73-12%였다.
도 7은 플래시 화학 발광으로 측정된 본 발명의 방법의 결과를 청결도 측정 단위(RLU; 도 7a-d 참조)로 도시하고 있다. 서로 다른 농도(10㎍ - 1ng) 또는 실험군(anti-FcεRI 및 fMLP)이 제공된 알레르겐 추출물(e2: 개털 추출물; i3: 벌 독 추출물; i209: rVes v 5)로 꽃가루 알레르기 체질인 사람의 50㎕의 전혈을 자극하였고, 호염기구 활성화는 화학 발광 테스트를 통해 측정하였다. 막대그래프는 알레르겐 농도 또는 실험군에 따른 절대 RLU 측정값을 나타낸다. 측정값은 막대그래프를 통해 추가로 표시되었다. 도 7a는 비-자극 실험군(음성 조절) 및 anti-FcεRI 및 fMLP에 의한 자극 실험군의 반응을 도시하고 있다. 도 7b는 서로 다른 농도(10㎍/ml, 1㎍/ml, 100ng/ml, 10ng/ml)의 개털 추출물로 자극받은 샘플의 반응을 도시하고 있다. 도 7c는 서로 다른 농도(10㎍/ml, 1㎍/ml, 100ng/ml, 10ng/ml)의 벌 독 추출물로 자극받은 샘플의 반응을 도시하고 있다. 도 7d는 서로 다른 농도(10㎍/ml, 1㎍/ml, 100ng/ml, 10ng/ml))의 rVes v 5로 자극받은 샘플의 반응을 도시하고 있다. 측정은 삼중으로 실시되었다. 평균값 및 표준 편차가 계산되었다. 도 7 e-h는 도 7 a-d에 도시된 샘플에 대한 (평균값 RLU 활성화 샘플)/(평균값 RLU 음성 조절)을 통해 계산된 자극지수(SI)를 도시하고 있다.
도 8은 활성화된 호염기구의 유세포 분석 측정에 의한 호염기구 활성화 테스트를 %(도 8a-d) 또는 평균 형광 강도(MFI; 도 8e-h)로 도시하고 있다. 서로 다른 농도(10㎍ - 1ng) 또는 실험군(anti-FcεRI 및 fMLP)이 제공된 알레르기 추출물(e2: 개털 추출물; i3: 벌 독 추출물; i209: rVes v 5)로 꽃가루 알레르기 체질인 사람의 50㎕의 전혈을 자극하였고, 호염기구 활성화는 유세포 분석을 통해 측정하였다. 각각의 막대그래프는 알레르겐 농도 및 실험군에 따른 활성화된 호염기구의 비율을 도시하고 있다. 측정값은 막대그래프를 통해 추가로 표시되었다. 도 8a는 비-자극 실험군(음성 조절) 및 anti-FcεRI 및 fMLP에 의한 자극 실험군의 반응을 도시하고 있다. 이때, 두 양성 조절에서 대략 30%의 호염기구가 활성화되었다. 10% 초과의 자극부터 반응은 긍정적인 것으로 평가되었다. 도 8b는 서로 다른 농도(1㎍/ml, 100ng/ml, 10ng/ml, 1ng/ml)의 개털 추출물로 자극받은 샘플의 반응을 도시하고 있다. 도 8c는 서로 다른 농도(1㎍/ml, 100ng/ml, 10ng/ml, 1ng/ml)의 벌 독 추출물로 자극받은 샘플의 반응을 도시하고 있다. 도 8d는 서로 다른 농도(10㎍/ml, 1㎍/ml, 100ng/ml, 10ng/ml))의 rVes v 5로 자극받은 샘플의 반응을 도시하고 있다. CD123+/HLA-DR-표현형(phenotype)을 갖는 세포는 호염기구로 확인되었으며, 활성화는 anti-CD63-Vio-Blue를 통해 검출되었다.
호염기구의 최대 반응성은 사용된 최고 농도에서 추출물에 따라 25-8%였다.
도 9는 플래시 화학 발광으로 측정된 본 발명에 따른 방법의 결과를 청결도 측정 단위(RLU; 도 9a-d 참조)로 도시하고 있다. 서로 다른 농도(10㎍ - 100ng) 또는 실험군(anti-FcεRI 및 fMLP)이 제공된 알레르겐 추출물(w8: 민들레 꽃가루 추출물; f17: 개암나무 열매 추출물; f49: 사과 추출물; e94: rFel d 1)로 꽃가루 알레르기 체질인 사람의 50㎕의 전혈을 자극하였고, 호염기구 활성화는 화학 발광 테스트를 통해 측정하였다. 각각의 막대그래프는 알레르겐 농도 또는 실험군에 따른 절대 RLU 측정값을 나타낸다. 측정값은 막대그래프를 통해 추가로 표시되었다. 도 9a는 비-자극 실험군(음성 조절) 및 anti-FcεRI 및 fMLP에 의한 자극 실험군의 반응을 도시하고 있다. 도 9b는 서로 다른 농도(10㎍/ml, 1㎍/ml, 100ng/ml)의 민들레 꽃가루 추출물로 자극받은 샘플의 반응을 도시하고 있다. 도 9c는 서로 다른 농도(10㎍/ml, 1㎍/ml, 100ng/ml)의 개암나무 열매 추출물로 자극받은 샘플의 반응을 도시하고 있다. 도 9d는 서로 다른 농도(10㎍/ml, 1㎍/ml, 100ng/ml)의 사과 추출물로 자극받은 샘플의 반응을 도시하고 있다. 도 9e는 서로 다른 농도(10㎍/ml, 1㎍/ml, 100ng/ml)의 rFel d 1로 자극받은 샘플의 반응을 도시하고 있다. 측정은 삼중으로 실시되었다. 평균값 및 표준 편차가 계산되었다. 도 9 f-j는 도 9 a-d에 도시된 샘플에 대한 (평균값 RLU 활성화 샘플)/(평균값 RLU 음성 조절)을 통해 계산된 자극지수(SI)를 도시하고 있다.
도 10은 활성화된 호염기구의 유세포 분석 측정에 의한 호염기구 활성화 테스트를 %(도 10a-e) 또는 평균 형광 강도(MFI; 도 10f-j)로 도시하고 있다. 서로 다른 농도(10㎍ - 100ng) 또는 실험군(anti-FcεRI 및 fMLP)이 제공된 알레르기 추출물(w8: 민들레 꽃가루 추출물; f17: 개암나무 열매 추출물; f49: 사과 추출물; e94: rFel d 1)로 꽃가루 알레르기 체질인 사람의 50㎕의 전혈을 자극하였고, 호염기구 활성화는 유세포 분석을 통해 측정하였다. 각각의 막대그래프는 알레르겐 농도 및 실험군에 따른 활성화된 호염기구의 비율을 도시하고 있다. 측정값은 막대그래프를 통해 추가로 표시되었다. 도 10a는 비-자극 실험군(음성 조절) 및 anti-FcεRI 및 fMLP에 의한 자극 실험군의 반응을 도시하고 있다. 이때, 두 양성 조절에서 대략 30%의 호염기구가 활성화되었다. 10% 초과의 자극부터 반응은 긍정적인 것으로 평가되었다. 도 10b는 서로 다른 농도(10㎍/ml, 1㎍/ml, 100ng/ml)의 민들레 꽃가루 추출물로 자극받은 샘플의 반응을 도시하고 있다. 도 10c는 서로 다른 농도(10㎍/ml, 1㎍/ml, 100ng/ml)의 개암나무 열매 추출물로 자극받은 샘플의 반응을 도시하고 있다. 도 10d는 서로 다른 농도(10㎍/ml, 1㎍/ml, 100ng/ml)의 사과 추출물로 자극받은 샘플의 반응을 도시하고 있다. 도 10e는 서로 다른 농도(10㎍/ml, 1㎍/ml, 100ng/ml)의 rFel d 1로 자극받은 샘플의 반응을 도시하고 있다. CD123+/HLA-DR-표현형(phenotype)을 갖는 세포는 호염기구로 확인되었으며, 활성화는 anti-CD63-Vio-Blue를 통해 검출되었다.
호염기구의 최대 반응성은 사용된 최고 농도에서 추출물에 따라 89-37%였다.
도 11은 서로 다른 검출 시스템으로 fMLP 또는 비-자극 실험군(음성 조절)을 자극한 후에, 환자의 샘플 결과를 도시하고 있다. 도 11a는 플래시 화학 발광으로 측정된 본 발명에 따른 방법의 결과를 청결도 측정 단위(RLU)로 도시하고 있다. 도 11b는 형광 강도(FI)로서 측정된 형광-표시 항체(anti-CD63-FITC; 2μg/ml)의 검출 이후에 본 발명에 따른 방법으로 실시된 호염기구 증식의 결과를 도시하고 있다. 도 11c는 유세포 분석으로 활성화된 호염기구를 측정한 호염기구 활성화 상태를 도시하고 있다. fMLP로 알레르기 체질인 사람의 50㎕의 전혈을 자극하였고, 전혈을 자극 없이(음성 조절) 그냥 두었다. 이어서, 호염기구 활성화는 전술한 방법을 통해 측정되었다. 각각의 막대그래프는 절대 측정값을 RLU(도 11a) 또는 FI(도 11b) 및 호염기구 활성화는 %로(도 11c) 도시하고 있다.
도 12는 호염기구의 증식 및 검사를 위해 서로 다른 항체 결합을 이용한 상태에서 fMLP 또는 비-자극 실험군(음성 조절)을 자극한 후에, 환자의 샘플 결과를 도시하고 있다. 알레르겐은 사용되지 않았다. 도 12a는 플래시 화학 발광으로 측정된 본 발명에 따른 방법의 결과를 청결도 측정 단위(RLU)로 도시하고 있다. 도 12b는 도 12a에 도시된 샘플에 대한 (평균값 RLU 활성화 샘플)/(평균값 RLU 음성 조절)을 통해 계산된 자극지수(SI)를 도시하고 있다. 도 12c는 유세포 분석으로 활성화된 호염기구를 측정한 호염기구 활성화 테스트를 도시하고 있다. 도 12d는 anti-CD63-비오틴과 같은 활성화 의존형 유전자 표지자 CD63을 통한 호염기구 증식 결과 및 anti-IgE-NSP-SA에 의한 검사를 도시하고 있다. anti-CD63-비오틴 항체는 0.2㎍/ml 내지 1㎍/ml 농도가 사용되었지만, anti-IgE-NSP-SA 검사 항체는 0.5㎍/ml의 고정 농도가 사용되었다. 도 12e는 도 12d에 도시된 샘플에 대한 (평균값 RLU 활성화 샘플)/(평균값 RLU 음성 조절)을 통해 계산된 자극지수(SI)를 도시하고 있다.
1a. 알레르겐 희석액 준비:
호염기구 활성화를 검출하기 위해 anti-CD63 항체(클론 7G3, BD Bioscience #353014)는 제조 정보에 따라 NSP-SA-NHS 아크레디늄 에스테르(Heliosense Biotechnologies, #199293-83-9)와 공유 결합 되었다. 이어서, 항체는 PD-10 칼럼(GE Healthcare, #383420)을 통해 정제되었다. 동일한 방식으로, Biomol GmbH 사의 IgE가 NSP-SA-NHS로 표시되었다.
1b. 알레르겐 희석액 준비:
T2 앨런 꽃가루 추출물(Squarix, #T-4402), t3 자작나무 꽃가루 추출물((Squarix, #T-4400) 및 t4 개암나무 꽃가루 추출물(Squarix, #T-4404)이 10㎍/ml, 1㎍/ml, 100ng/ml, 10ng/ml, 1ng/ml의 농도로 희석 버퍼(1xHanks Balanced Salt Solution(Thermo Fisher Scientific #14065056), 40mM Hepes, pH 7,4)에서 희석되었다. 음성 조절로서 희석제가 사용되었다. 양성 조절로서 fMLP(Sigma, #F3506-5MG)는 10-6M의 농도가 사용되었고, anti-FcεRI 항체(Klon AER-37, ebioscience, #14-5899-82)는 100ng/ml의 농도가 사용되었다. 또한, 사과 추출물(Squarix # F-2327), 티모시 꽃가루 추출물(Squarix, # G-5501), e94(Rogers et al. (1993) Recombinant Fel d.I: Expression, purification, IgE binding and reaction with cat-allergic human T cells., Molecular Immunology, 30 April 2010 (6), 559-568에 따라 정제됨), 쑥 꽃가루 추출물(Squarix #W-3400), 개털 추출물(Squarix # E-6617), 벌 독 추출물(Squarix # I-7804), i209(Seismann et al. 2010, Clinical and Molecular Allergy, 8:7에 따라 정제됨), 민들레 꽃가루 추출물(Squarix # W-3404) 및 개암나무 열매 추출물(Squarix, #T-4404)이 항원으로 사용되었다.
1c. 자극:
각각 50㎕의 말초 혈액(헤파린 첨가됨)은 각각 50㎕의 알레르겐 희석액 또는 실험군 희석액과 혼합되었고, 온장고에서 37℃로 20분 동안 배양되었다. 반응은 10㎕의 농축된 EDTA-용액(PBS중 100mM EDTA)을 첨가됨으로써 중단되었다.
2a1. 항체 배양:
이어서, 두 개의 항체가 샘플로 제공되었다:
1) anti-CD123-Biotin (Klon H5C6, Biolegend #353014)는 0.5㎍/ml의 최종 농도로 첨가.
2) anti-CD63-NSP-SA(Klon 7G3, BD Bioscience #353014)는 2㎍/ml의 최종 농도로 첨가.
샘플은 혼합되었고, 10분 동안 실온에서 배양되었다.
선택적으로, anti-CD63-Biotin(Biolegend 353017) 및 anti-CD63-FITC (Miltenyi 130-100-160)가 사용되었다.
2a2. 적혈구:
적혈구는 100㎕의 사포닌을 함유한 용해 버퍼(PBS중 0.14%의 사포닌) 첨가 및 실온에서 10분 동안 배양을 통해 용해되었다. 이어서, 미량 정량 판에서 5분 동안 500g이 원심 분리되었고, 잔여물이 제거되었다.
2a3. 비드 배양:
샘플은 각각 10㎍로 스트렙타아비딘 코팅된 자석 비드(Sera-Mag Speedbeads Streptavidin blocked, GE-Healthcare, #21152104010350)와 혼합되었고, 10분 동안 실온에서 배양되었다.
2a4. 세척:
비드와 결합한 세포는 플레이트 세척기, 예를 들어 MBS96 자석을 구비한 Tecan Hydroflex에서 300㎕의 세척 버퍼(0.05% Tween, 2mM EDTA, 150mM NaCl, 0.05% NaN3)로 5회 세척되었다.
2a5. 검출:
이어지는 검출에서, CD63 항체의 NSP-SA 아크레디늄 에스테르는 두 개의 용액으로 인해 유발되었다(H2O2; 0.1 M HNO3 및 0.25M NaOH (Chemiluminescence Detection Reagent Kit, Invitron Ltd., #IV1-001)). 생성된 화학 발광 신호(플래시-발광)는 Berthold Centro 회사의 LB 960 플레이트 광도계에서 425nm의 파장으로 검출되었다.
2a6. 측정:
호염기구 활성화 강도는 화학 발광-신호의 증가를 통해 자극받지 않은 실험군과 비교 속에서 계산되었다. 자극 지수(SI)는 활성화된 샘플의 청결도 측정 단위(RLU)/비-자극 실험군의 RLU로부터 계산될 수 있다. 초과 될 수 있는 한계 값은 테스트 물질에 의해 좌우된다.
2b. 유세포 분석 평가:
유세포 분석 측정을 위해, 샘플은 anti-CD123-PE(Miltenyi Biotec, #130-098-894), anti-HLA-DR-PerCPVio700 (Miltenyi Biotec, #130-103-873) 및 anti-CD63-Vio-Blue (Miltenyi Biotec, #130-100-154) 항체로 활성화되고 난 후, 제조 정보에 따라 조명이 보호된 상태에서 4℃에서 15분 동안 배양되었다.
1ml의 1x FACS-용해-용액(BD Bioscience, #349202) 첨가 및 실온에서 10분 동안 배양 이후, 500g의 샘플은 5분 동안 원심 분리되었고, 잔여물은 제거되었으며, 샘플은 각각 500㎕의 세척 버퍼(Ca2+/Mg2+, 0.5% BSA, 2mM EDTA, 0.05% NaN3없는 PBS)로 다시 세척되었다. 측정은 유세포 분석기, 예를 들어 MACS Quant(Miltenyi Biotec)에서 2시간 이내에 실시되었다. CD123+/HLA-DR-표현형을 갖는 세포는 호염기구로 확인되었다. 호염기구는 CD63 신호가 선택된 한계 값을 초과했을 경우에 활성화되었다.
Figure 112018077322846-pat00002
10%의 전체 활성화는 긍정적인 것으로 평가되었다.
2c. 발광 측정:
anti-CD63-FITC의 발광은 BMG Labtech Fluostar(485nm/520nm)-장치로 측정되었다.
결과:
화학 발광 테스트(도 1)는 자극받은 샘플의 신호가 실험군과 관련하여 두 배로(SI
Figure 112018077322846-pat00003
2) 늘어났을 경우에 긍정적인 것으로 평가되었다. 유세포 분석 측정(도 2) 평가시, 모든 샘플은 긍정적인 것으로 평가되며, 이러한 샘플은
Figure 112018077322846-pat00004
10%의 활성화를 보여주고 있다. 유세포 분석 테스트와 화학 발광 테스트의 비교는 두 테스트 시스템으로 실시된 결과의 우수한 연관성 및 매우 우수한 반복성을 보여주고 있다. 이때, 화학 발광 신호의 역동적인 측정 범위는 형과 신호의 경우보다 현저하게 더 넓다.
유세포 분석 평가시, 활성화 및 비활성화된 세포군(cell population)을 결정하기 위해 분석 윈도우(analysis window)가 설정되어야 하며(Gating), 이러한 분석 윈도우는 모든 개별 환자마다 조절되어야 하고, 개별 평가자에 의해 주관적으로 설정되어야 한다. 이때, 자극된 샘플과 실험군의 비율만 형성되기 때문에 이러한 변형된 평가의 가능성은 화학 발광 테스트에는 주어지지 않는다. 이것은 표준화된 평가를 가능하게 하며, 이러한 평가는 유세포 분석 테스트에서는 불가능하다. 또한, 미량 정량 판에서 샘플 준비, 빠른 측정 및 단순한 평가로 인해, 현저하게 높은 샘플 처리가 가능하다.
또한, 이러한 실험은 검출 시스템으로서 화학 발광을 사용하는 것이 결정적인 장점을 제공한다는 것을 보여준다: 호염기구 및 또 다른 세포는 매우 적은 자가 화학 발광만 보여 준다. 따라서, 측정시 표적 세포(target cell)의 절대적 청결은 불필요하다.
이와 반대로, 특히 죽은 세포 및 과립형 백혈구는 높은 자가 형광(autofluorescence)을 보여주며, 이것은 유세포 분석시 원하는 신호의 오버랩을 야기하고, 따라서 대응하는 게이팅(Gating)을 전제로 한다. 호염기구를 세정하기 위해 CD123-비오틴 항체를 사용할 경우, 특히 적은 비율의 수지상 세포가 샘플에 포함되며, 이때 수지상 세포는 마찬가지로 CD123이 표면에서 발현된다. 물론, 수지상 세포는 CD63을 발현시키지 않으므로, 검출된 anti-CD63은 화학 발광 신호를 단지 호염기구로만 환원할 수 있다. 측정 자체는 표시되지 않은 다른 세포의 존재를 통해 영향을 받지 않는다.
따라서, 검사 방법으로서 화학 발광과 비-분획 전혈 존재의 결합은 고감도 검사 방법을 유도하며, 이러한 고감도 검사 방법으로 인해 다수의 샘플이 최대한 반복적으로, 그리고 가능한 표준화 상태에서 동시에 처리될 수 있다.
도 3-10은 본 발명에 따른 방법이 광범위하게 적용될 수 있는 항원과 샘플 기증자의 광범위한 선택을 나타낸다. 이때, 각각 첫 번째 도면(예를 들어, 도 3)은 화학 발광에 의한 동일한 실험이고, 이어지는 도면(도 4)은 유세포 분석에 따른 실험으로서, 이것은 비교 가능성을 도시하기 위한 것이다. 결과는 후자가 놀랍게도 높은 높게 나타난다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 유세포 분석을 대체할 수 있다.
도 11은 세 가지 검사 방법, 즉 화학 발광, 형광 및 유세포 분석을 직접적으로 비교하고 있다. 이때, 본 발명에 따른 방법이 유세포 분석을 대체할 수 있다는 것을 증명하기 위해 화학 발광은 감응성에서 유세포 분석에 대략 대응하며, 형광보다 더 적합하다는 것을 명확하게 알 수 있다.
마지막으로, 도 12에 도시된 실험은 증식을 위해 활성화에 따른 리간드를 사용하고, 검출을 위해 활성화와 무관한 리간드를 사용할 경우에도 본 발명에 따른 방법이 기능 한다는 것을 보여주며, 또 다른 실험에서처럼 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 신호와 비교시, 화학 발광의 배경이 더 높지만, 신호는 배경과 명확하게 구별될 수 있다.

Claims (17)

  1. 활성화된 호염기구를 검출하기 위한 방법에 있어서,
    a) 알레르겐을 통해 호염기구의 활성화가 허용되는 조건에서, 수용액에 있는 알레르겐과 호염기구를 포함하는 환자의 전혈 샘플을 접촉시키는 단계,
    b) 상기 호염기구를
    (1) 활성화된 호염기구에 특징적인 제1 세포 표면에 있는 폴리펩타이드와 결합하는 제1 리간드에 결합시키거나,
    (2) 호염기구의 활성화 상태와 무관하게 제1 세포 표면에 있는 폴리펩타이드와 결합하는 제1 리간드에 결합시켜,
    단계 a)로부터 호염기구를 증식시키는 단계 및,
    c) 단계 b)로부터 증식된 호염기구에 존재하는 경우 화학 발광을 통해 활성화된 호염기구를 검출하는 단계를 포함하며,
    (1) 단계 b)의 (1)이 실행되는 경우, 단계 c)는 활성화된 호염기구에 특징적인 제2 세포 표면에 있는 폴리펩타이드와 결합하는 제2 리간드, 또는 호염기구의 활성화 상태와 무관하게 제2 세포 표면에 있는 폴리펩타이드와 결합하는 제2 리간드를 사용하여 상기 활성화된 호염기구를 검출함으로써 실시되거나,
    (2) 단계 b)의 (2)가 실행되는 경우, 단계 c)는 활성화된 호염기구에 특징적인 제2 세포 표면에 있는 폴리펩타이드와 결합하는 제2 리간드를 사용하여 상기 활성화된 호염기구를 검출함으로써 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 전혈은 가공되지 않은 전혈로 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    단계 a)는 적어도 30 부피%의 전혈 비율을 갖는 수용액으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    단계 b) 전에 호염기구의 활성화를 중단시키는 단계를 포함하는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    단계 b)에서 상기 호염기구는 이러한 호염기구가 리간드와 결합함으로써 증식되며, 상기 리간드는 폴리펩타이드와 특이 결합하며, 이러한 폴리펩타이드는 호염기구의 활성화 상태와 무관하게 상기 호염기구의 세포 표면에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 리간드는 상기 폴리펩타이드에 대해 단클론 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    단계 b)에서 상기 호염기구가 고정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 호염기구는 비드에 고정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 호염기구는 고정 이후에 세정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    단계 b)에서 적혈구가 용해 및 제거되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 적혈구는 호염기구의 고정 전에 원심분리를 통해 제거되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    단계 c)에서 검사는 상기 호염기구의 표면에 놓여 있는 유전자 표지자에 대해 화학 발광 표시가 제공된 리간드를 통해 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    화학 발광 표시가 제공된 상기 리간드는 단클론 항체이며, 이러한 단클론 항체는 자체로 화학 발광할 수 있는 표시를 구비하거나, 또는 화학 발광할 수 있는 표시를 구비한 이차 항체와 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 단계 a), b) 및 c)는 미량 정량 판의 벽(wall)에서 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 a)는 단계 b) 및 c) 전에 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 알레르겐과 호염기구를 접촉시키기 위한 용기를 포함하며, 이러한 용기는 미량 정량 판이 제공되고,
    선택적으로, 알레르겐을 포함하며,
    호염기구를 증식시키기 위해 호염기구의 세포 표면에 놓여 있는 폴리펩타이드에 대한 리간드 및 검출을 위해 호염기구의 표면에 놓여 있는 유전자 표지자에 대한 리간드를 포함하며,
    이때, 검출을 위해 상기 호염기구의 표면에 놓여 있는 유전자 표지자에 대한 리간드는 화학 발광할 수 있는 표시를 구비하고, 상기 화학 발광할 수 있는 표시는 화학 발광 반응을 촉진하는 효소 또는 자체로 적합한 조건하에서 화학 발광-신호를 생성하는 분자가 제공될 수 있으며, 첫 번째 경우에 효소는 화학 발광할 수 있는 기질 용액과 결합한 상태로 키트에 포함되어 있고,
    상기 호염기구의 세포 표면에 놓여 있는 폴리펩타이드 및/또는 상기 호염기구의 표면에 놓여 있는 표시는 활성화된 호염기구에 특징적이고,
    선택적으로, 호염기구의 활성화를 중단시키기 위해 제제를 포함하며,
    선택적으로, 적혈구를 용해 및/또는 제거하기 위한 제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  17. 삭제
KR1020180091151A 2017-08-08 2018-08-06 호염기구 활성화 검사 방법 KR102547565B1 (ko)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP17001352.8 2017-08-08
EP17001352.8A EP3441763A1 (de) 2017-08-08 2017-08-08 Verfahren zum nachweis einer basophilenaktivierung
EP17001979 2017-12-05
EP17001979.8 2017-12-05

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190016446A KR20190016446A (ko) 2019-02-18
KR102547565B1 true KR102547565B1 (ko) 2023-06-26

Family

ID=63041937

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180091151A KR102547565B1 (ko) 2017-08-08 2018-08-06 호염기구 활성화 검사 방법

Country Status (13)

Country Link
US (1) US11119109B2 (ko)
EP (1) EP3441765B1 (ko)
JP (1) JP7265325B2 (ko)
KR (1) KR102547565B1 (ko)
CN (1) CN109387636B (ko)
AU (1) AU2018213977A1 (ko)
BR (1) BR102018015288A2 (ko)
CA (1) CA3012989A1 (ko)
DE (1) DE102018006212A1 (ko)
ES (1) ES2904354T3 (ko)
LT (1) LT3441765T (ko)
PL (1) PL3441765T3 (ko)
SG (1) SG10201806697RA (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20210382070A1 (en) * 2020-06-04 2021-12-09 The Chinese University Of Hong Kong Diagnostic biomarkers for shrimp allergy
CN112630423A (zh) * 2020-12-31 2021-04-09 杭州福德敏生物技术有限公司 一种小麦免疫荧光检测试纸条及应用
KR102497904B1 (ko) * 2021-02-10 2023-02-10 재단법인 아산사회복지재단 세포 원심분리 및 농축을 이용한 면역세포 검출 방법 및 면역세포 검출용 칩

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003025566A2 (en) 2001-09-17 2003-03-27 Imumed S.R.O. A method and kit for the measurement of the activation of basophils induced by allergen to determine hypersensitivity
WO2012105541A1 (ja) * 2011-01-31 2012-08-09 大鵬薬品工業株式会社 新規ヒノキ花粉アレルゲン

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3132491A1 (de) 1980-08-22 1982-07-01 Laboratorium Prof. Dr. Rudolf Berthold, 7547 Wildbad Verfahren zur durchfuehrung analytischer bestimmungen mittels der chemilumineszenzmethode und anwendung des verfahrens fuer immunassays
US4902613A (en) 1984-05-14 1990-02-20 Becton, Dickinson And Company Lysing agent for analysis of peripheral blood cells
WO1985005640A1 (en) 1984-05-31 1985-12-19 Coulter Electronics, Inc. A reagent system and method for identification, enumeration and examination of classes and subclasses of blood leukocytes
EP0974050B1 (de) 1997-01-20 2002-09-25 ORPEGEN Pharma GmbH Basophilen-degranulationstest
FR2778413B1 (fr) 1998-05-07 2000-08-04 Immunotech Sa Nouveaux reactifs et methode de lyse des erythrocytes
DE10235310B4 (de) 2002-08-01 2012-05-16 Molecular And Clinical Drug Research Verfahren zur Bestimmung allergener Potenz von Produkten
RU2289138C2 (ru) * 2004-12-14 2006-12-10 Научно-исследовательский институт микробиологии Министерства обороны Российской Федерации Способ аллергодиагностики по показателям хемилюминесцентного свечения нейтрофилов
EP2037269B1 (en) * 2007-09-11 2014-04-02 Bühlmann Laboratories AG Allergy test based on flow cytometric analysis
JP2009236798A (ja) 2008-03-28 2009-10-15 Sysmex Corp 好塩基球の分類計数方法
US20100167317A1 (en) * 2008-08-05 2010-07-01 Institut Pasteur Process for enriching basophils in a blood sample
WO2012028167A2 (en) 2010-05-20 2012-03-08 Innohyphen Bv Acridinium ester chemiluminescence upon reductive triggering
US20120083007A1 (en) * 2010-10-01 2012-04-05 Nadeau Kari C Basophil Activation Based Allergy Diagnostic Test
WO2014066271A1 (en) * 2012-10-22 2014-05-01 Becton, Dickinson And Company Non-b-lineage cells capable of producing antibody
EP3051928B1 (de) 2015-01-29 2019-01-16 Kjellberg-Stiftung Plasmabrenner
CN104677810B (zh) * 2015-01-30 2017-08-22 广东医学院附属医院 嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒及其使用方法
CN104777303B (zh) * 2015-04-29 2017-02-01 何韶衡 一种嗜碱性粒细胞激活、脱颗粒的鉴定方法
EP3196209B1 (en) 2016-01-25 2019-10-23 Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG A macadamia allergen
EP3244212A1 (en) 2017-02-15 2017-11-15 Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG An improved assay for the diagnosis of peanut allergy

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003025566A2 (en) 2001-09-17 2003-03-27 Imumed S.R.O. A method and kit for the measurement of the activation of basophils induced by allergen to determine hypersensitivity
JP2005509845A (ja) 2001-09-17 2005-04-14 イムメド エス．アール．オー． ある物質に対する過敏症を判定するための、アレルゲンによって誘起された好塩基球の賦活化の測定のための方法およびキット
WO2012105541A1 (ja) * 2011-01-31 2012-08-09 大鵬薬品工業株式会社 新規ヒノキ花粉アレルゲン

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Blank Simon et al, Journal of Immunology (2010.03.), vol 184(9), pp 5403-5413.
T Saarne et al, Clin Exp Allergy (2005.), vol 35(3), pp 657-663.

Also Published As

Publication number Publication date
JP2019032317A (ja) 2019-02-28
PL3441765T3 (pl) 2022-02-14
BR102018015288A2 (pt) 2021-11-09
SG10201806697RA (en) 2019-03-28
JP7265325B2 (ja) 2023-04-26
CN109387636A (zh) 2019-02-26
ES2904354T3 (es) 2022-04-04
CA3012989A1 (en) 2019-02-08
KR20190016446A (ko) 2019-02-18
CN109387636B (zh) 2023-07-04
EP3441765A1 (de) 2019-02-13
DE102018006212A1 (de) 2019-02-14
EP3441765B1 (de) 2021-10-20
AU2018213977A1 (en) 2019-02-28
LT3441765T (lt) 2022-01-10
US20190049461A1 (en) 2019-02-14
US11119109B2 (en) 2021-09-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2037269B1 (en) Allergy test based on flow cytometric analysis
KR102547565B1 (ko) 호염기구 활성화 검사 방법
EP3435080A1 (en) Methods of detecting donor-specific antibodies
JP4272431B2 (ja) 診断試験法
CN111349683B (zh) 粒细胞群嗜碱性粒细胞作为过敏性疾病诊断标记物的应用
US20200011865A1 (en) Methods and kits for detecting basophil activation
KR20020021774A (ko) 전염성 해면체성 뇌병증 진단 방법
JP2012168012A (ja) 血管内皮障害を検査するための新規な検査方法および検査用キット
US20110269162A1 (en) Ubiquitin proteasome system profiling for diagnosis of chronic liver disease
US20160041185A1 (en) Methods of Detecting Complement Fixing and Non-Complement Fixing Antibodies and Systems for Practicing the Same
JP4242499B2 (ja) ホスホリルコリンを用いたｃｒｐの測定方法
EP1430305A2 (en) A method and kit for the measurement of the activation of basophils induced by allergen to determine hypersensitivity
EP3441763A1 (de) Verfahren zum nachweis einer basophilenaktivierung
US20230349890A1 (en) Method for determination of basophil activation and kits therefore
Masilamani et al. Basophil degranulation assay
US20030022250A1 (en) Functional IgE test methods and compositions
TW202238131A (zh) 測量無細胞核蛋白染色質片段之方法
US10900965B2 (en) Methods and compositions for the detection of Fc receptor binding activity of antibodies
AU2011233753A1 (en) Method to detect tissue degradation leading to inflammation
WO2019234087A1 (en) Complement c4d assay
FR2765341A1 (fr) Methode pour l&#39;analyse de l&#39;activation des basophiles humains par mesure de l&#39;expression membranaire du marqueur cd63

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant