ES2904354T3 - Procedimiento para la detección de la activación de los basófilos - Google Patents

Procedimiento para la detección de la activación de los basófilos Download PDF

Info

Publication number
ES2904354T3
ES2904354T3 ES18187647T ES18187647T ES2904354T3 ES 2904354 T3 ES2904354 T3 ES 2904354T3 ES 18187647 T ES18187647 T ES 18187647T ES 18187647 T ES18187647 T ES 18187647T ES 2904354 T3 ES2904354 T3 ES 2904354T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
basophils
ligand
allergen
detection
marker
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES18187647T
Other languages
English (en)
Inventor
Julia Gruhne
Henning Seismann
Alf Weimann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG
Original Assignee
Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from EP17001352.8A external-priority patent/EP3441763A1/de
Application filed by Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG filed Critical Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG
Application granted granted Critical
Publication of ES2904354T3 publication Critical patent/ES2904354T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G01N33/6869—Interleukin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/41—Detecting, measuring or recording for evaluating the immune or lymphatic systems
    • A61B5/411—Detecting or monitoring allergy or intolerance reactions to an allergenic agent or substance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5091—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing the pathological state of an organism
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5094—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for blood cell populations
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56972—White blood cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/24—Immunology or allergic disorders

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Ecology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Rehabilitation Therapy (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Virology (AREA)

Abstract

Procedimiento de diagnóstico de una alergia que comprende los pasos: a) Poner en contacto los basófilos de una muestra de sangre total de un paciente con un alérgeno en una solución acuosa en presencia de la sangre total, con una fracción de volumen de la sangre total en la solución acuosa de al menos el 20 % en volumen en condiciones que permitan la activación de los basófilos por medio del alérgeno, b) Enriquecimiento de los basófilos de a) y c) Detección de basófilos activados, en donde la detección en el paso c) se logra detectando mediante quimioluminiscencia un marcador de basófilos situado en la superficie de los basófilos, en donde en el paso b) los basófilos se enriquecen mediante la unión a un ligando que se une específicamente a un polipéptido que es un marcador característico de los basófilos activados, y/o la detección en el paso c) se logra detectando mediante quimioluminiscencia un marcador característico de los basófilos activados.

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento para la detección de la activación de los basófilos
En el presente documento se desvela un procedimiento para el diagnóstico de una alergia, que comprende los pasos de poner en contacto los basófilos de una muestra de sangre total de un paciente con un alérgeno en una solución acuosa, en presencia de la sangre total con una fracción de volumen de la sangre total en la solución acuosa de al menos el 20 % en volumen en condiciones que permiten la activación de los basófilos por medio del alérgeno, enriquecer los basófilos de a) y detectar los basófilos activados, en donde la detección se consigue detectando por medio de quimioluminiscencia un marcador característico de los basófilos activados; y un kit que comprende un recipiente para poner en contacto los basófilos con el alérgeno, siendo el recipiente preferentemente una placa de microtitulación, opcionalmente un alérgeno, medios para la detección por medio de quimioluminiscencia de un marcador característico de los basófilos activados, siendo preferentemente un ligando provisto de una etiqueta quimioluminiscente frente al marcador, y siendo el ligando más preferentemente un anticuerpo monoclonal, opcionalmente un medio para detener la activación de los basófilos, un ligando opcionalmente inmovilizable que se une a un polipéptido situado en la superficie celular de los basófilos independientemente de su estado de activación, en donde el ligando es preferentemente un anticuerpo monoclonal frente al polipéptido, y opcionalmente un medio para lisar y/o eliminar los eritrocitos.
La presente invención se refiere a un procedimiento según la reivindicación 1, un kit según la reivindicación 16 y un uso según la reivindicación 17.
Para el diagnóstico de las alergias de tipo inmediato, también conocidas como alergias de tipo I, que se basan en una reacción inmunitaria mediada por IgE, después de una anamnesis detallada se llevan a cabo principalmente pruebas cutáneas, tales como las pruebas de punción o las pruebas de provocación, que son el patrón de oro para el diagnóstico de las alergias. Como complemento, se usan pruebas in vitro para detectar la presencia de anticuerpos IgE específicos frente a uno o varios alérgenos definidos.
Para una detección de este tipo, los alérgenos se unen a matrices tales como esponjas, membranas o perlas y se ponen en contacto con el suero del paciente. A continuación, se determina la cantidad de IgE unida mediante un anticuerpo anti-IgE humana marcado.
Las ventajas de la determinación de IgE específica in vitro incluyen su facilidad de realización, estandarización y escalabilidad. Sin embargo, a menudo no es posible distinguir entre una alergia clínicamente relevante y una mera sensibilización.
Otras desventajas son la escasa disponibilidad de algunos antígenos y un posible cambio de conformación del alérgeno debido a su acoplamiento a una matriz, lo cual puede cambiar la afinidad al anticuerpo IgE que se quiere detectar. En muchos casos, los extractos de alérgenos solo pueden normalizarse con dificultad o no pueden normalizarse en absoluto. Los alérgenos más pequeños también deben unirse a moléculas portadoras tales como la albúmina de suero. Además, la especificidad para los alérgenos de los anticuerpos IgE en el suero y los anticuerpos IgE unidos a la membrana en las células efectoras, tales como los basófilos y los mastocitos, no tiene por qué coincidir, ya que solo se produce un lento intercambio de IgE solubilizada y unida. Por último, hay otros factores que no se pueden visualizar en una prueba in vitro para la detección de anticuerpos IgE específicos que determinan si realmente se desencadena una reacción alérgica celular, por ejemplo, la proporción global de IgE total e IgE específica en la sangre o la afinidad de los anticuerpos.
Especialmente cuando las pruebas de IgE y de la piel dan resultados poco claros, es recomendable por lo tanto como complemento usar un sistema de prueba celular tal como la prueba de degranulación de basófilos o la prueba de activación de basófilos (BAT). Normalmente, el término "BAT" se usa con referencia a las pruebas de citometría de flujo.
La ventaja particular de los ensayos celulares frente a los ensayos de anticuerpos IgE específicos, que solo determinan el contenido de IgE disuelta y biológicamente inactiva en el suero, es que detectan la reacción biológica celular real desencadenada por la unión del alérgeno a los anticuerpos IgE unidos al receptor en la superficie celular de los basófilos y su reticulación. Las pruebas celulares también permiten determinar el umbral de capacidad de degranulación. Además, se necesitan especialmente después de la inmunoterapia para controlar el éxito de la terapia del paciente.
Básicamente, las pruebas celulares se realizan de tal manera que primero se pone en contacto la sangre del paciente con un alérgeno. Si el paciente estaba previamente sensibilizado, el alérgeno se une a los anticuerpos IgE específicos del alérgeno unidos al receptor, que están situados en la superficie celular de los basófilos. Esto conduce a una reticulación de los receptores de IgE, lo cual desencadena a su vez la degranulación de los granulocitos basófilos y, por lo tanto, la liberación de mediadores de los gránulos intracelulares. Estos mediadores, como por ejemplo la histamina, los leucotrienos y la triptasa, pueden cuantificarse en el sobrenadante mediante inmunoensayos enzimáticos. La liberación de los mediadores va acompañada de un aumento de la concentración en la superficie celular de marcadores tales como el CD63 o el CD203c, que antes se encontraban en las membranas de los gránulos intracelulares y, por lo tanto, también muestran una reacción celular. La liberación de los mediadores indica así una reacción celular al alérgeno.
Esta aumento de la concentración superficial se ha detectado hasta ahora en diagnósticos rutinarios mediante citometría de flujo, usando anticuerpos frente a los marcadores de superficie celular específicos de la activación que están acoplados a un fluoróforo. Las células a examinar fluyen individualmente una tras otra en un chorro de líquido a través de una fina cámara de medición y pasan a través de varios rayos láser de diferentes longitudes de onda, con lo que se genera una luz dispersa característica de cada tipo de célula y al mismo tiempo, dependiendo de la respectiva longitud de onda y siempre que haya células activadas, se excitan los fluoróforos acoplados a los anticuerpos. La luz emitida por el fluoróforo excitado y la luz dispersa son detectadas por detectores.
Las desventajas de este sistema de prueba son los elevados costes de adquisición de un citómetro de flujo, la complejidad de los resultados de la prueba, que solo pueden ser interpretados por personal especialmente formado, y la dificultad de estandarización. Además, con un dispositivo solo se puede medir una muestra a la vez.
Otro problema subyacente a la invención se refiere a la calidad de las muestras que comprenden basófilos activables. La calidad de las muestras y, por lo tanto, su idoneidad para los procedimientos de diagnóstico depende de que la recogida, el transporte y el almacenamiento se hayan realizado de forma profesional. Por ejemplo, la exposición de las muestras al calor o a tampones inadecuados puede provocar la muerte de las células.
Si la calidad es insuficiente, pueden producirse resultados falsos negativos, es decir, un resultado negativo no se debe al hecho de que el paciente no sea alérgico, sino a que la muestra procedente de él es de calidad insuficiente, más concretamente no contiene basófilos activables o contiene muy pocos.
Resulta especialmente ineficaz si la mala calidad de una muestra solo se detecta cuando se lleva a cabo un procedimiento elaborado, tal como la citometría de flujo.
Por consiguiente, se necesita un procedimiento, y que además se pueda usar para determinar de manera eficiente la calidad de una muestra, es decir, un procedimiento que sea adecuado para un alto rendimiento. Aunque un procedimiento de este tipo no se realiza con un alérgeno y, por lo tanto, no proporciona un resultado útil para el diagnóstico, permite predecir si la calidad de la muestra es adecuada para un procedimiento de diagnóstico realizado en un enfoque separado. Este procedimiento puede realizarse antes, después o en paralelo al procedimiento de diagnóstico. Este procedimiento o los reactivos usados en él pueden emplearse para determinar el número o la proporción de los basófilos activables en una preparación celular, preferentemente en una muestra.
El documento DE10235310 divulga un ensayo en el que la activación de los basófilos se detecta con ayuda de un colorante de calcio fluorescente. La sangre fraccionada se usa mediante centrifugación en gradiente de densidad.
Los documentos WO2012/044756, US2009/0246805, WO98/32014 y EP2037269 dan a conocer ensayos de citometría de flujo para detectar la activación de los basófilos.
En este contexto, un objetivo en el que se basa la presente invención consiste en proporcionar un procedimiento y reactivos adecuados para este fin, con los que se puedan superar las desventajas antes mencionadas de los procedimientos descritos en la técnica anterior, en particular una prueba de activación de basófilos que pueda realizarse con un sistema distinto de un citómetro de flujo.
En particular, un objetivo consiste en crear un sistema que permita el procesamiento simultáneo de un gran número de muestras en un proceso de alto rendimiento. Además, hay que garantizar la reproducibilidad y la capacidad de estandarización.
Estos y otros objetivos se consiguen por medio del objeto de la presente invención, en particular por medio del objeto de las reivindicaciones independientes adjuntas, por lo que las formas de realización preferentes resultan de las reivindicaciones dependientes.
Se divulga aquí un procedimiento para el diagnóstico de una alergia, preferentemente un procedimiento adecuado para un alto rendimiento, que comprende los pasos de:
a) Poner en contacto los basófilos de una muestra de sangre total de un paciente, con un alérgeno en una solución acuosa, en presencia de la sangre total con una fracción de volumen de la sangre total en la solución acuosa de al menos el 20 % en volumen en condiciones que permitan la activación de los basófilos por el alérgeno,
b) Enriquecimiento de los basófilos de a) y
c) Detección de basófilos activados,
en donde la detección en el paso c) se consigue detectando mediante quimioluminiscencia un marcador característico de los basófilos activados.
En un primer aspecto, el problema subyacente a la invención se resuelve mediante un procedimiento para el diagnóstico de una alergia, que comprende los pasos de:
a) Poner en contacto los basófilos de una muestra de sangre total de un paciente, con un alérgeno en una solución acuosa, en presencia de la sangre total con una fracción de volumen de la sangre total en la solución acuosa de al menos el 20 % en volumen en condiciones que permitan la activación de los basófilos por el alérgeno,
b) Enriquecimiento de los basófilos de a) y
c) Detección de basófilos activados,
en donde la detección en el paso c) se consigue detectando mediante quimioluminiscencia un marcador situado en la superficie de los basófilos,
en donde en el paso b) los basófilos se enriquecen mediante la unión a un ligando que se une específicamente a un polipéptido, que es un marcador característico de los basófilos activados, y/o la detección en la etapa c) se consigue detectando mediante quimioluminiscencia un marcador característico de los basófilos activados.
En una forma de realización preferente, la sangre total es sangre total sin procesar.
En otra forma de realización preferente, el paso a) se lleva a cabo en una solución acuosa que tiene un contenido de sangre total de al menos el 30 %, preferentemente el 35 %, más preferentemente el 40 %, incluso más preferentemente el 45 % en volumen.
En otra forma de realización, el procedimiento comprende el paso de detener la activación de los basófilos, preferentemente antes del paso b).
En otra forma de realización, los basófilos se enriquecen en el paso b) mediante la unión a un ligando que se une específicamente a un polipéptido situado en la superficie celular de los basófilos. Este polipéptido puede ser un polipéptido que está situado en la superficie celular de los basófilos, independientemente de su estado de activación, y/o un marcador característico de los basófilos activados, preferentemente un marcador adicional característico de los basófilos activados, que es diferente del marcador detectado por quimioluminiscencia según la invención. En una forma de realización particularmente preferente, es un polipéptido que está situado en la superficie celular de los basófilos, independientemente de su estado de activación.
En otra forma de realización, el ligando que se une específicamente a un polipéptido situado en la superficie celular de los basófilos, independientemente de su estado de activación, es un anticuerpo monoclonal frente al polipéptido.
En una forma de realización preferente, los basófilos son inmovilizados en el paso b).
En una forma de realización preferente, los basófilos son inmovilizados en una perla en el paso b), preferentemente una perla magnética.
En una forma de realización preferente, los basófilos son lavados después de la inmovilización.
En una forma de realización preferente, los eritrocitos son lisados y eliminados en el paso b).
En una forma de realización preferente, los eritrocitos son eliminados por centrifugación antes de la inmovilización de los basófilos.
En una forma de realización preferente, la detección en el paso c) se realiza usando un ligando provisto de una etiqueta quimioluminiscente frente al marcador situado en la superficie de los basófilos, preferentemente un marcador característico de los basófilos activados.
En una forma de realización preferente, el ligando provisto de una etiqueta quimioluminiscente es un anticuerpo monoclonal que en sí mismo tiene una etiqueta quimioluminiscente o se une a un anticuerpo secundario que tiene una etiqueta quimioluminiscente.
En una forma de realización preferente, los pasos a), b) y c) se llevan a cabo en una placa de microtitulación. En una forma de realización preferente, el paso a) se realiza antes de los pasos b) y c).
En un aspecto adicional, el objetivo subyacente a la invención se consigue mediante un kit según la reivindicación 16, a saber, un kit que comprende un recipiente para poner en contacto los basófilos con el alérgeno, en donde el recipiente es preferentemente una placa de microtitulación, opcionalmente un alérgeno, un ligando, que se une específicamente a un polipéptido situado en la superficie celular de los basófilos, para el enriquecimiento de los basófilos y un ligando frente a un marcador situado en la superficie de los basófilos para la detección, en donde el ligando que se une específicamente al marcador situado en la superficie de los basófilos tiene una etiqueta quimioluminiscente para la detección, en donde el ligando, que se une específicamente a un polipéptido situado en la superficie celular de los basófilos, se inmoviliza en un soporte sólido, en donde la etiqueta quimioluminiscente puede ser una enzima que cataliza una reacción quimioluminiscente o una molécula que genera por sí misma en condiciones adecuadas una señal quimioluminiscente, en donde la enzima en el primer caso está contenida en el kit en combinación con una solución de sustrato quimioluminiscente, y en donde el polipéptido situado en la superficie celular de los basófilos y/o el marcador situado en la superficie de los basófilos son característicos de los basófilos activados, opcionalmente un medio para detener la activación de los basófilos, opcionalmente un medio para lisar y/o eliminar los eritrocitos. En el caso del ligando frente al marcador provisto de una etiqueta con capacidad quimioluminiscente según la invención se trata preferentemente de un anticuerpo monoclonal. El ligando inmovilizado, que se une a un polipéptido situado en la superficie celular de los basófilos independientemente de su estado de activación, es preferentemente un anticuerpo monoclonal frente al polipéptido.
Los reactivos contenidos en un kit según la invención también pueden usarse con o sin un recipiente para poner en contacto los basófilos con el alérgeno para preparar un kit para diagnosticar una alergia.
El problema se resuelve en otro aspecto mediante un uso según la reivindicación 17, a saber, un uso de un ligando que se une específicamente a un polipéptido situado en la superficie celular de los basófilos, para el enriquecimiento de los basófilos junto con un ligando que para la detección se une a un marcador situado en la superficie de los basófilos, para el diagnóstico de una alergia o para la preparación de un kit para el diagnóstico de una alergia o para el cribado de medicamentos candidatos para la terapia de una alergia a un alérgeno, en donde para la detección el ligando tiene una etiqueta con capacidad quimioluminiscente frente al marcador situado en la superficie de los basófilos, en donde la etiqueta quimioluminiscente puede ser una enzima que cataliza una reacción quimioluminiscente o una molécula que en condiciones adecuadas genera por sí misma una señal quimioluminiscente, usándose la enzima en el primer caso en combinación con una solución de sustrato quimioluminiscente, en donde el ligando que se une específicamente a un polipéptido situado en la superficie celular de los basófilos está inmovilizado en un soporte sólido, y en donde el polipéptido situado en la superficie celular de los basófilos y/o el marcador situado en la superficie de los basófilos es característico de los basófilos activados.
En una forma de realización preferente, el uso es para aumentar la sensibilidad, preferentemente en un procedimiento de alto rendimiento.
La presente invención se refiere a un procedimiento para el diagnóstico de una alergia, que comprende inicialmente el paso de a) poner en contacto los basófilos de una muestra de sangre total de un paciente con un alérgeno en una solución acuosa. La muestra de sangre completa es preferentemente sangre total con sustancias anticoagulantes. La sangre total se añade a la solución acuosa antes del contacto real de los basófilos con el alérgeno en una cantidad tal que su fracción volumétrica final de la solución acuosa sea al menos del 20, más preferentemente del 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 u 80 por ciento en volumen. La presencia de la sangre completa significa que el contacto de los basófilos con el alérgeno tiene lugar en condiciones casi fisiológicas.
El proceso es preferentemente un proceso adecuado para un alto rendimiento. En una forma de realización preferente, esto se entiende como un proceso que permite el procesamiento en paralelo de una pluralidad de muestras, por ejemplo, al menos 2, 4, 8, 16 o 32 muestras, por lo que los pasos del proceso que requieren al menos el 50 %, más preferentemente el 60, 70, 80 o 90 % del tiempo de procesamiento de una sola muestra pueden tener lugar sustancialmente de forma simultánea con las muestras. Se incluyen los procedimientos en los que el proceso de medición propiamente dicho se lleva a cabo mediante un dispositivo de medición sucesivamente en todas las muestras, pero el procesamiento individual y no paralelo de una muestra no supera los 5, preferentemente los 4, 3, 2, 1 minuto o 30 segundos. Los procedimientos adecuados para un alto rendimiento incluyen, por ejemplo, la medición por quimioluminiscencia en placas de microtitulación adecuadas para este fin. En cambio, la citometría de flujo, por ejemplo, no es un procedimiento adecuado para un alto rendimiento.
En el caso de la sangre total se trata preferentemente de sangre total sin procesar. En una forma de realización preferente, con el término "sangre total no procesada", tal y como se usa aquí, se entiende que aunque la sangre puede ser diluida o se le pueden añadir sustancias químicas para su conservación, preferentemente sustancias anticoagulantes tal como la heparina, no se fracciona, por ejemplo, mediante centrifugación, como la centrifugación en gradiente de densidad.
El paso a) también puede llevarse a cabo con más de un alérgeno y/o un alérgeno en más de una concentración en diferentes enfoques, procesados en paralelo. En particular, el antígeno se pueda usar en dos o más, preferentemente tres o más, concentraciones diferentes en un número correspondiente de preparaciones paralelas. Preferentemente, también se llevan un control positivo y un control negativo. En una forma de realización preferente, el alérgeno es un material seleccionado del grupo que consiste en cultivos de ácaros y heces de ácaros del grupo taxonómico principal Animalia Arthropoda; escamas, pelo, saliva, heces u otras secreciones derivadas del grupo taxonómico principal Animalia Chordata; esporas o partículas derivadas del grupo taxonómico principal Funghi Ascomycetes; polen derivado del grupo taxonómico principal Corniferopsida, polen derivado del grupo taxonómico principal Plantae Magnoliopsidae, polen derivado del grupo taxonómico principal Plantae Liliopsidae; veneno o secreciones derivadas del grupo taxonómico principal Animalia Arthropoda; caucho o productos que comprenden dicho caucho derivados de árboles del grupo taxonómico principal Plantae Magnoliopsidae. En una forma de realización preferente, el alérgeno es una sustancia farmacológica seleccionada del grupo que comprende antibióticos, más preferentemente p-lactámicos, incluso más preferentemente del grupo que comprende penicilina G, penicilina V, PPL, MDM, amoxicilina y ampicilina; Cefalosporinas, más preferentemente seleccionadas del grupo que consiste en cefazolina, cefamandol, cefaclor, cefonaxima, ceftazidima, cefotaxima, ceftazidima, cefepima;carbapenems, monobactams, inhibidores de la p-lactamasa, más preferentemente el ácido clavulánico; macrólidos, aminoglucósidos, rifamicinas, glucopéptidos, polipéptidos, tetraciclinas, imidazoles, quinolonas, pirazolonas, más preferentemente sulfometoxazol; estreptograminas, nitrofuranos, isoniazidas, pentamidinas; antisépticos, más preferentemente clorhexidina, fungicidas, antivirales, antimaláricos, analgésicos, inhibidores de la COX-2 y antiinflamatorios no esteroideos, preferentemente seleccionados del grupo formado por aspirina, lis-aspirina, luprofeno, ketoprofeno, diclofenaco, naproxeno, paracetamol, dipirona, indometacina, ácido mefenámico, fenilbutazona y propifenazona; bloqueadores neuromusculares, preferentemente seleccionados del grupo que consiste en suxametonio, atracurio, cis-atracurio, mivacurio, pancuronio, rocuronio, vecuronio y succinilcolina; hipnóticos y anestésicos locales, preferentemente seleccionados del grupo que consiste en midazolam, propofol, tiopental, fentanilo y lidocaína; tranquilizantes; opioides; agentes de contraste radioeléctricos, preferentemente seleccionados del grupo que consiste en agentes de contraste yodados iónicos, agentes de contraste yodados no iónicos, azul isosulfán, azul patente y azul de metileno; inhibidores de la bomba de protones; anticonvulsivos y neurolépticos, preferentemente del grupo que comprende la carbamazepina, la fenitoína y el ácido valproico; agentes antipsicóticos; antidepresivos; dopamina; antihistamínicos; corticosteroides y glucocorticoides; agentes quimioterapéuticos e inmunosupresores; diuréticos; anticoagulantes; vasoconstrictores y vasodilatadores; fármacos cardíacos, preferentemente del grupo que comprende: estatinas, inhibidores de la ECA, bloqueadores de los receptores alfa, bloqueadores de los receptores beta, antagonistas del calcio y antihipertensivos; fármacos (anti)ulcerosos; fármacos (anti)tiroideos; estrógenos; heparinas y derivados; insulinas; estreptocinasas y urocinasas;
En una forma de realización preferente, el alérgeno es un coloide, un expansor de plasma o un adyuvante, seleccionado preferentemente del grupo que comprende la albúmina, el dextrano, la gelatina, el hetastarch, el pentastarch, la sinistrina, el polidocanol 600 (etoxiesclerol), la lactosa, la carboximetilcelulosa, la hidroxipropilcelulosa, la protamina y la aprotinina.
En una forma de realización preferente, el alérgeno es un aditivo alimentario, preferentemente seleccionado del grupo que consiste en conservantes alimentarios, colorantes alimentarios, potenciadores alimentarios, antioxidantes y emulsionantes.
En una forma de realización preferente, el alérgeno es un agente ambiental o contaminante, seleccionado preferentemente del grupo que comprende los isocianatos, las isotiazolinonas, el formaldehído, el óxido de etileno, el anhídrido Itálico, la cloramina T, el DMSO, el látex y las enzimas usadas en las industrias de la panificación, el procesamiento de alimentos y la lavandería.
En una forma de realización preferente, el alérgeno es un material seleccionado del grupo que comprende un cultivo y/o heces de un ácaro seleccionado del grupo que consiste en ácaros de los géneros Acarus, Glycyphagus, Lepidoglyphus, Tryophagus, Blomia, Dermatophagoides, Euroglyphus, Blatella y Periplaneta; Escamas, pelo, saliva o heces de un animal de un género seleccionado entre Canis, Felis o Equus; levaduras, mohos u hongos de un género seleccionado entre el grupo de Cladosporium, Aspergillus, Penicillium, Alternaria y Candida; Polen de un género seleccionado del grupo formado por Chamaecyparis, Cryptomeria, Cupressus, Juniperus, Anthoxanthum, Cynodon, Dactylis, Festuca, Holcus, Hordeum, Lolium, Oryza, Paspalum, Phalaris, Phleum, Poa, Secale, Sorghum, Triticum, Zea, Ambrosia, Artemisia, Alnus, Betula, Corylus, Fraxinus, Olea y Platanus; Veneno de un insecto de un género seleccionado del grupo de Apis Bombus, Dolichovespula, Polistes, Polybia, Vespa y Vespula; caucho o productos que comprenden dicho caucho derivados del género Hevea.
En una forma de realización preferente, el alérgeno es un material seleccionado del grupo que consiste en camarones o un alimento que contenga camarones del grupo taxonómico principal Animalia Arthropoda; langosta o un alimento que contenga langosta del grupo taxonómico principal Animalia Arthropoda; Frutas, legumbres, cereales o frijoles originarios del grupo taxonómico principal Plantae Liliopsidae o un producto alimenticio que comprenda dichas frutas, legumbres, cereales y/o habas; frutas, legumbres, cereales o habas originarios del grupo taxonómico principal Plantae Magnoliopsidae o un producto alimenticio que comprenda dichas frutas, legumbres, cereales y/o habas; frutos secos o un alimento que contenga frutos secos del grupo taxonómico principal Plantae Magnoliopsidae.
En una forma de realización preferente, el alérgeno es un material seleccionado del grupo que comprende la leche de vaca, los alimentos que contienen leche de vaca, la clara de huevo de pollo, los alimentos que contienen clara de huevo de pollo, el pescado o los alimentos que contienen pescado.
En una realización preferente, el alérgeno es un material seleccionado del grupo que comprende Hordeum, Oryza, Secale, Triticum, Zea, Arachis, Corylis, Juglans, Prunus, Anacardium, Pistacia y Glycine.
En una forma de realización preferente, el alérgeno es un polipéptido que comprende un antígeno o una variante del mismo seleccionado del grupo que consiste en Aca s 13, Gly d 2, Lep d 2, Lep d 5, Lep d 7, Lep d 10, Lep d 13, Tyr p 2, Tyr p 3, Tyr p 10, Tyr p 13, Tyr p 24, Blo t 1, Blo t 2 Blo t 3, Blo t 4, Blo t 5, Blo t 6, Blo t 10, Blo t 11, Blo t 12, Blo t 13, Blo t 19, Blo t 21, La f 1, La f 2, La f 3, La f 6, La f 7, La f 10, La f 11, La f 13, La f 14, La f 15, La f 16, La f 17, La f 18, La f 22, La m 1, La p 1, La p 2, La p 3, La p 4, La p 5, La p 6 La p 7, La p 8, La p 9, La p 10, La p 11, La p 14, La p 20, La p 21, La p 23, Eur m 1, Eur m 2, Eur m 3, Eur m 4, Eur m 14, Bla g 1, Bla g 2, Bla g 4, Bla g 5, Bla g 6, Bla g 7, Bla g 8, Per a 1, Per a 3, Per a 6, Per a 7, Per a 9, Per a 10, Can f 1, Can f 2, Can f 3, Can f 4, Can f 5, Can f 6, Fel d 1, Fel d 2, Fel d 3, Fel d 4, Fel d 5w, Fel d 6w, Fel d 7, Fel d 8, Equ c 1, Equ c 2, Equ c 3, Equ c 4 y Equ c 5, Cla c 9m, Cla c 14, Cla h 2, Cla h 5, Cla h 6, Cla h 7, Ca h 8, Cla h 9, Cla h 10, Cla h 12, Asp fl 13, Asp f 1, Asp f 2, Asp f 3, Asp f 4, Asp f 5, Asp f 6, Asp f 7, Asp f 8, Asp f9, Asp f 10, Asp f 11, Asp f 12, Asp f 13, Asp f 15, Asp f 16, Asp f 17, Asp f 18, Asp f 22, Asp f 23, Asp f 27, A5p f 28, A5p f 29, Asp f 34, Asp n 14, Asp n 18, Asp n 25, Asp o 13, Asp o 21, Pen b 13, Pen b 26, Pen ch 13, Pen ch 18, Pen ch 20, Pen ch 31, Pen ch 33, Pen ch 35, Pen c 3, Pen c 13, Pen c 19, Pen c 22, Pen c 24, Pen C 30, Pen c 32, Pen o 18, Fus c 1, Fus c 2, Alt a 1, Alt a 3, Alt a 4, Alt a 5, Alt a 6, Alt a 7, Alt a 8, Alt a 10, Alt a 12, Alt a 13, Cand a 1, Cand a 3 y Cand b 2, Cha o 1, Cha o 2, Cup a 1, Cup s 1, Cup s 3, Jun a 1, Jun a 2, Jun a 3, Jun o 4, Jun s 1, Jun v 1 y Jun v 3, Ant o 1, Cyn d 1, Cyn d 7, Cyn d 12, Cyn d 15, Cyn d 22w, Cyn d 23, Cyn d 24, Dac g 1, Dac g 2, Dac g 3, Dac g 4, Dac g 5, Fes p 4, Hol I 1, Hol I 5, Hor v 1, Hor v 5, Lol p 1, Lol p 2, Lol p 3, Lol p 4, Lol p 5, Lol p 11, Pas n 1, Pha a 1, Pha a 5, Phl p 1, Phl p 2, Phl p 4, Phl p 5, Phl p 6, Phl p 7, Phl p 11, Phl p 12, Phl p 13, Poa p 1, Poa p 5, Sec c 1, Sec C 5, Sec c 20, Sor h 1, Tri a 15, Tri a 21, Tri a 27, Tri a 28, Tri a 29, Tri a 30, Tri a 31, Tri a 32, Tri a 33, Tri a 34, Tri a 35, Zea m 1, Zea m 12, Amb a 1, Amb a 2, Amb a 3, Amb a 4, Amb a 5, Amb a 6, Amb a 7, Amb a 8, Amb a 9 y Amb a 10, Amb p 5, Amb t 5, Art v 1, Art v 2, Art v 3, Art v 4, Art v 5, Art v 6, Aln g 1, Aln g 4, Bet v 1, Bet v 2, Bet v 3, Bet v 4, Bet v 6, Bet v 7, Cor a 10, Fra e 1, Ole e 1, Ole e 2, Ole e 3, Ole e 4, Ole e 5, Ole e 6, Ole e 7, Ole e 8, Ole e 9, Ole e 10, Ole e 11, Pla a 1, Pla a 2, Pla a 3, Pla o 1, Pla o 2 y Pla o 3, Api c 1, Api d 1, Api m 1, Api m 2, Api m 3, Api m 4, Api m 5, Api m 6, Api m 7, Api m 8, Api m 9, Api m 10, Api m 11, Bom p 1, Bom p 4, Bom t 1, Bom t 4, Dol a 5, Dol m 1, Dol m 2, Dol m 5, Pol a 1, Pol a 2 y Pol a 5, Pol d 1, Pol d 4, Pol d 5, Pol e 1, Pol e 4 y Pol e 5, Pol f 5, Pol g 1, Pol g 5, Poly p 1, Poly s 5, Vesp c 1, Vesp c 5, Vesp ma 2, Vesp ma 5, Vesp m 1, Vesp m 5, Ves g 5, Ves m 1, Ves m 2, Ves m 5, Ves p 5, Ves s 1, Ves s 5, Ves vi 5, Ves v 1, Ves v 2, Ves v 3, Ves v 5, Hev b 1, Hev b 2, Hev b 3, Hev b 4, Hev b, 5, Hev b 6, Hev b 7, Hev b 8, Hev b 9, Hev b 10, Hev b 11, Hev b 12, Hev b 13 y Hev b 14, Hor v 12, Horv 15, Hor v 16, Hor v 17, Hor v 21, Ory s 12, Sec c 20, Tri a 12, Tri a 14, Tn a 18, Tri a 19, Tri a 21, Tri a 25, Tri a 26, Tri a 36, Zea m 14, Zea m 25, Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3, Ara h 4, Ara h 5, Ara h 6, Ara h 7, Ara h 8, Ara h 9, Ara h 10, Ara h 11, Cor a 1, Cor a 2, Cor a 8, Cor a 9, Cor a 11, Cor a 12, Cor a 13, Cor a 14, Jug n 1, Jug n 2, Jug r 1, Jug r 2, Jug r 3, Jug r 4, Pru du 3, Pru du 4, Pru du 5, Pru du 6, Ana o 1, Ana o 2, Ana o 3, Pis v 1, Pis v 2, Pis v 3, Pis v 4, Pis v 5, Gly m 1, Gly m 2, Gly m 3, Gly m 4, Gly m 5 y Gly m 6.
El paso a) se puede realizar en un recipiente para poner en contacto los basófilos con el alérgeno. En una forma de realización preferente, el recipiente es una placa de microtitulación. En otra forma de realización preferente, el alérgeno o los alérgenos se presentan en el recipiente en forma liofilizada y cambian a la fase líquida cuando se añaden la solución acuosa y la muestra de sangre completa.
En una forma de realización preferente, es el antígeno Ara h 7 isotipo 7.0201 (EP17000245). En forma de otra realización preferente, el antígeno es el descrito en el documento EP16000165.7, el antígeno de la nuez de macadamia. Los polipéptidos modificados también pueden usarse como antígenos, por ejemplo las construcciones de oleosina divulgadas en el documento EP 15001277.1.
En una forma de realización preferente, el procedimiento comprende el paso de detener la activación de los basófilos, preferentemente antes del paso b). El experto conoce varios medios para detener la reacción de activación, por ejemplo, mediante la adición de agentes aglutinantes de calcio, tales como el EDTA, la adición de azida, preferentemente azida de sodio, o el enfriamiento de la muestra, preferentemente a una temperatura de 4 °C o menos.
Preferentemente, después del paso a), se enriquecen los basófilos en el paso b). En una forma de realización preferente, con el término “enriquecimiento", tal como se usa aquí, se entiende que el aumento del número de basófilos en relación con el recuento total de células o el recuento de leucocitos, preferentemente el recuento de leucocitos en la muestra de sangre total, preferentemente por un factor de al menos 2, 5, 10, 20, 50, 100 o 1000, más preferentemente al menos 1000. Esto se hace preferentemente mediante la unión de un ligando que se une específicamente a través de un primer sitio de unión a un polipéptido que se expresa en los basófilos de forma dependiente o independiente, preferentemente de manera independiente, de su estado de activación y que está situado en su superficie celular, mientras que en otras células o al menos en la mayoría de las otras células se encuentra allí solo en pequeña medida o, preferentemente, no está situado allí en absoluto. Por lo tanto, este polipéptido debe ser adecuado como agente de selección para enriquecer los basófilos en relación con el número total de células de una muestra de sangre. Es aceptable si el enriquecimiento no logra un éxito completo, pero una pequeña parte de las otras células permanece en la muestra, por ejemplo las células dendríticas. Preferentemente, el polipéptido se selecciona del grupo de polipéptidos situados en la superficie celular de los basófilos, independientemente del estado de activación de los basófilos, que comprende CD123 (código de base de datos NM_002183), CD193 (NP_001828), FcsRl (NM_002001), IgE, CD203c (NM_005021) y CRTH2 (NM_004778), y es preferentemente CD123 o IgE, más preferentemente CD123. Todos los códigos de bases de datos usados en esta solicitud se refieren a la secuencia que era accesible en línea en la base de datos definida en el momento de la fecha de presentación por el número de la solicitud de establecimiento de prioridad más antigua. El ligando es preferentemente un anticuerpo monoclonal frente al polipéptido, preferentemente un anticuerpo monoclonal frente a CD123 o IgE, más preferentemente frente a CD123 (Agis, H., Füreder, W., Bankl, H. C., Kundi, M., Sperr, W. R., Willheim, M., ... & Valent, P. (1996). Comparative immunophenotypic analysis of human mast cells, blood basophils and monocytes („Análisis inmunofenotípico comparativo de mastocitos, basófilos sanguíneos y monocitos humanos”)), Immunology 87(4), 535-543. Sainte-Laudy, J. Sabba, A., Vallon C, Guerin JC (1998). Analysis of anti-lgE and allergen induced human basophil activation by flow cytometry. Comparison with histamine release. („Análisis de la activación de los basófilos humanos inducida por anti-lgE y alérgenos mediante citometría de flujo. Comparación con la liberación de histamina”). Inflamm Res. 47(10), 401­ 8.). En una forma de realización aún más preferente, se usa un anticuerpo monoclonal aislado. En otra forma de realización preferente, los basófilos se unen a más de un ligando que se une específicamente a través de un primer sitio de unión a un polipéptido que se expresa en los basófilos de forma dependiente o independiente, preferentemente independientemente de su estado de activación, y situado en su superficie celular, donde dicho polipéptido se selecciona preferentemente del grupo de polipéptidos situados en la superficie celular de los basófilos independientemente de su estado de activación, que comprende CD123 (código de base de datos NM_002183), CD193 (NP_001828), FcsRl (NM_002001), IgE, CD203c (NM_005021) y CRTH2 (NM_004778), más preferentemente dos o tres ligandos, incluso más preferentemente uno de dichos ligandos es CD123. Un polipéptido expresado en los basófilos en función de su estado de activación y situado en su superficie celular se selecciona preferentemente del grupo formado por la basogranulina (Mochizuki A, McEuen AR, Buckley MG, Walls AF. The release of basogranulin in response to IgE-dependent and IgE-independent stimuli: validity of basogranulin measurement as an indicator of basophil activation. („La liberación de basogranulina en reacción a estímulos dependientes e independientes de la IgE: validez de la medición de la basogranulina como indicador de la activación de los basófilos”). J. Allergy Clin. Inmunol. 2003 Jul;112(1):102-8.), el antígeno 2D7 [C L Kepley, S S Craig y L B Schwartz. Identification and partial characterization of a unique marker for human basophils (“ Identificación y caracterización parcial de un marcador único para los basófilos humanos”). J Immunol 15 de junio de 1995, 154 (12) 6548-6555], el mediador de unión a la avidina (Joulia R, Valitutti S, Didier A, Espinosa E. Direct monitoring of basophil degranulation by using avidin-based probes. („Monitorización directa de la degranulación de los basófilos mediante el uso de sondas basadas en avidina). J Allergy Clin Immunol. 2017), CD13 (NM_001150), CD45 (NM_001150), CD63 (NP_001244318.1), CD107a (NM_00556), CD11b (NM_000632), CD62L (NM_000655), CD11c (XM_011545852), CD164 (NM_001142401), CD45 (NM_001267798) y CD203c (NM_005021), y es preferentemente CD63 (Knol, E. F., Mul, F. P., Jansen, H., Calafat, J., & Roos, D. (1991). Monitoring human basophil activation via CD63 monoclonal antibody 435 („Seguimiento de la activación de los basófilos humanos mediante el anticuerpo monoclonal CD63 435”). Journal of Allergy and Clinical Immunology, 88(3), 328-338.).
Preferentemente, el ligando tiene un segundo sitio de unión que se pueda usar para inmovilizarlo a un soporte sólido, preferentemente de forma específica si el soporte tiene una capacidad de unión complementaria, más concretamente, la capacidad de unirse específicamente al ligando. Preferentemente, el ligando tiene una molécula con capacidad de unión seleccionada del grupo que comprende biotina, estreptavidina, etiqueta His, GST, avidina, neutravidina, proteína A, proteína G, proteína L, etiqueta S y MBP. El soporte sólido es preferentemente un soporte seleccionado del grupo que consiste en una perla, preferentemente una perla magnética, una placa de microtitulación, un recipiente de reacción de plástico y un recipiente de reacción de vidrio. En una forma de realización particularmente preferente, el portador es una perla, preferentemente una perla magnética, y la solución acuosa que comprende la perla está en un pocillo de una placa de microtitulación. En una forma de realización preferente, la solución acuosa se mezcla de forma continua en la etapa a) y/o en la etapa b), por ejemplo, mediante agitación.
En una forma de realización preferente, el lisado y la posterior eliminación de los eritrocitos, preferentemente en el paso b). Los medios para lisar los eritrocitos son conocidos por el experto, por ejemplo se describen en los documentos US4902613, US6143567 o WO85/05640. Por ejemplo, la lisis hipotónica puede realizarse con agua sola o en presencia de dietilenglicol, formaldehído y ácido cítrico (US4902613).
La eliminación de los eritrocitos se realiza preferentemente por medio de centrifugación.
Según la invención, la activación de los basófilos se detecta por medio de la quimioluminiscencia mediante la detección de la concentración superficial de un marcador característico de la activación. Preferentemente, el marcador se selecciona del grupo que comprende la basogranulina (Mochizuki A, McEuen AR, Buckley MG, Walls AF. The release of basogranulin in response to IgE-dependent and IgE-independent stimuli: validity of basogranulin measurement as an indicator of basophil activation (“La liberación de basogranulina en reacción a estímulos dependientes e independientes de la IgE: validez de la medición de la basogranulina como indicador de la activación de los basófilos”). J. Allergy Clin. Inmunol. 2003 Jul;112(1):102-8.), el antígeno 2D7 [C L Kepley, S S Craig y L B Schwartz. Identification and partial characterization of a unique marker for human basophils (“Identificación y caracterización parcial de un marcador único para los basófilos humanos. J Immunol 15 de junio de 1995, 154 (12) 6548-6555), el mediador de unión a la avidina (Joulia R, Valitutti S, Didier A, Espinosa E. Direct monitoring of basophil degranulation by using avidin-based probes (“Monitorización directa de la degranulación de los basófilos mediante el uso de sondas basadas en avidina”). J Allergy Clin Immunol. 2017 ), CD13 (NM_001150), CD45 (NM_001150), CD63 (NP_001244318.1), CD107a (NM_00556), CD11b (NM_000632), CD62L (NM_000655), CD11c (XM_011545852), CD164 (NM_001142401), CD45 (NM_001267798) y CD203c (NM_005021), y es preferentemente CD63 (Knol, E. F., Mul, F. P., Jansen, H., Calafat, J., & Roos, D. (1991). Monitoring human basophil activation via c D63 monoclonal antibody 435 (..Seguimiento de la activación de los basófilos humanos mediante el anticuerpo monoclonal CD63 435”). Journal of Allergy and Clinical Immunology, 88(3), 328-338.). Es posible detectar más de uno de estos marcadores. Preferentemente, un ligando frente a un marcador característico de los basófilos activados, preferentemente un anticuerpo monoclonal, está provisto de una etiqueta quimioluminiscente para este fin. En una forma de realización aún más preferente, se usa un anticuerpo monoclonal aislado.
La etiqueta quimioluminiscente puede ser una enzima que cataliza una reacción quimioluminiscente o una molécula que en condiciones adecuadas genera por sí misma una señal quimioluminiscente, preferentemente esta última molécula, más preferentemente un éster de acridinio o una sulfonamida de acrinio. En un paso realizado antes del paso a), se puede acoplar un ligando frente a un marcador característico de los basófilos activados con una etiqueta quimioluminiscente. Por ejemplo, se puede añadir un éster de acridinio (AE) al anticuerpo monoclonal. Los compuestos AE son etiquetas muy sensibles que ya se usan en ensayos automatizados para el diagnóstico clínico (I Weeks, I Beheshti, F McCapra, A K Campbell, J S Woodhead. Acridinium esters as high specific activity labels in immunoassay (“Ésteres de acridinio como etiquetas de alta actividad específica en inmunoensayos”). Clin Chem 29: 1474-1479 (1983). El acoplamiento de los compuestos AE a los anticuerpos está bien establecido y suele conseguirse a través de grupos funcionales tales como el N-hidroxisuccinimidilo (NHS) en el anillo de fenol. Para ello, el anticuerpo purificado se hace reaccionar con AE (por ejemplo, NSP-SA-NHS, NSP-DMAE o NSP-DMAE-NHS de Heliosense) a temperatura ambiente durante un tiempo determinado. A continuación, se separa el anticuerpo marcado del EA libre sin reaccionar mediante columnas u otros procedimientos de purificación tales como la HPLC.
En una forma de realización preferente, el éster de acridinio tiene la fórmula:
Figure imgf000009_0001
en la que R1 es alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, y R2 y R3 se seleccionan independientemente del grupo formado por hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, halógeno, cianuro, hidroxi, alcoxi, tiol, alquilmercapto, y en la que Y es un grupo saliente, preferentemente con un pKa<12, seleccionado preferentemente del grupo que comprende ariloxi, ariloxi sustituido, alcoxi sustituido, mercapto, mercapto sustituido, sulfonamidilo, sulfonamidilo sustituido, N-hidroxilamida, N-hidroxilamida sustituida, y en donde el éster de acridinio contiene un grupo a través del cual puede acoplarse a un polipéptido, preferentemente a un anticuerpo, preferentemente una N-hidroxilamida. preferentemente un grupo N-hidroxisuccinimidilo (NHS). Los compuestos y procedimientos adecuados se describen en el documento WO2012/028167.
Para la detección se puede usar un kit de detección por quimioluminiscencia (por ejemplo, de la empresa Invitron). Después de lavar los anticuerpos no unidos, se añaden automáticamente los dos activadores (10o^l cada uno; activador 1: contiene peróxido de hidrógeno; activador 2: contiene hidróxido de sodio) uno tras otro en el luminómetro. El compuesto de éster de acridinio se oxida en condiciones alcalinas, lo que produce una acridona que emite luz. La señal se libera en forma de un destello de luz (luminiscencia flash), que suele durar entre 1 y 5 segundos. La corta duración de la emisión requiere la iniciación y la medición de la reacción directamente en el detector. Los luminómetros adecuados permiten la adición automática de disparos y la detección de la señal en la placa de microtitulación. Para una mayor intensidad, se suele integrar toda la señal a lo largo del intervalo de medición.
Una alternativa es acoplar el anticuerpo con una enzima, preferentemente seleccionada del grupo que comprende la peroxidasa, la fosfatasa alcalina y la p-galactosidasa, que es capaz de convertir un sustrato quimioluminiscente (Kricka L J. (2003). Clinical applications of chemiluminescence (“Aplicaciones clínicas de la quimioluminiscencia”). Analytica chimica acta, 500(1): 279-286). Dependiendo de la enzima, se usa un sustrato del grupo de las diacilhidrazidas cíclicas, preferentemente luminol o isoluminol, acridina, dioxetano y sus derivados. La enzima más usada para ello es la peroxidasa de rábano picante (HRP), que cataliza la oxidación del luminol en presencia de peróxido de hidrógeno. La luz liberada en el proceso puede detectarse a una longitud de onda de 425 nm. Un posible enfoque se describe en Neupert, W., Oelkers, R., Brune, K., Geisslinger, G. A new reliable chemiluminescence immunoassay (CLIA) for prostaglandin E2 using enhanced luminol as substrate (“Un nuevo inmunoensayo de quimioluminiscencia (CLIA) fiable para la prostaglandina E2 usando luminol mejorado como sustrato”). Prostaglandins. 1996 Nov;52(5):385-401 .
Otra alternativa es el uso de la quimioluminiscencia electrogenerada. El tris(2,2-bipiridioI)rutenio(II) ya se usa en algunos inmunoensayos (Xiaoming Zhou, Debin Zhu, Yuhui Liao, Weipeng Liu, Hongxing Liu, Zhaokui Ma y Da Xing (2014). Synthesis, labeling and bioanalytical applications of a tris(2,2-bipyridyl)ruthenium(II)-based electrochemiluminescence probe (“Síntesis, etiquetado y aplicaciones bioanalíticas de una sonda de electroquimioluminiscencia a base de tris(2,2-bipiridilo) rutenio(II)”). Nature Protocols Volumen 9, Páginas: 1146­ 1159). Tras aplicar un voltaje, la reacción del complejo de rutenio con la tripropilamina (TPA) libera quimioluminiscencia del medio circundante con un máximo de emisión de 620 nm. Preferentemente, la etiqueta quimioluminiscente es un complejo metálico quimioluminiscente, que preferentemente comprende rutenio.
En una forma de realización preferente, la etiqueta quimioluminiscente cataliza la emisión por otro grupo o emite ella misma a un máximo de emisión a una longitud de onda de 400 nm o más, preferentemente de 400 nm a 650 nm, más preferentemente de 400 nm a 550 nm, aún más preferentemente de 405 nm a 500 nm, aún más preferentemente de 405 nm a 490 nm, aún más preferentemente de 410 a 450 nm, más preferentemente de 415 a 445 nm. Los compuestos y procedimientos adecuados se describen en Natrajan et al. (2010) Enhanced immunoassay sensitivity using chemiluminescent acridinium esters with increased light output (“Sensibilidad mejorada del inmunoensayo usando ésteres de acridinio quimioluminiscente con producción aumentada de luz”), Analytical Biochemistry, 27 de julio de 2010).
Preferentemente, se llevan a cabo en paralelo una pluralidad de reacciones en diferentes pocillos de una placa de microtitulación y las señales de quimioluminiscencia se detectan usando un luminómetro de placa como el que está disponible comercialmente (por ejemplo, de Berthold Technologies). El grado de activación de los basófilos se correlaciona con la intensidad o el aumento de la señal de quimioluminiscencia en relación con un control no estimulado. Para una evaluación positiva, debe superarse un valor umbral dependiente de la sustancia de ensayo, que puede ser determinado de manera rutinaria por un experto.
Preferentemente, el procedimiento se lleva a cabo en el orden en que primero se realiza el paso a), luego el paso b) y finalmente el paso c). Sin embargo, también es posible realizar primero el paso b) y luego el paso a) y después el paso c). Alternativamente, la etapa b) y la etapa c) pueden realizarse simultáneamente o superponerse.
En una forma de realización particularmente preferente, después del paso a), a la solución acuosa con los basófilos se añaden tanto un ligando que se une específicamente a un polipéptido situado en la superficie celular de los basófilos, independientemente de su estado de activación, como un ligando provisto de una etiqueta quimioluminiscente frente a la etiqueta que es característica de los basófilos activados. Más preferentemente, esto se hace en presencia de un soporte, en donde el ligando que se une específicamente a un polipéptido situado en la superficie celular de los basófilos, independientemente de su estado de activación, está o estará inmovilizado en un soporte sólido tal como una perla. A continuación, se puede intercambiar la solución acuosa y lavar los basófilos inmovilizados, eliminando el exceso de ligandos y las células no unidas. Lo que queda, si está presente, son los basófilos inmovilizados en el soporte a través del ligando, que se une específicamente a un polipéptido que, en los basófilos, está situado en su superficie celular independientemente de su estado de activación. De estos basófilos inmovilizados, los que se activan realmente por contacto con el alérgeno se caracterizan por tener el ligando unido a ellos frente al marcador característico de los basófilos activados. Si este último ligando no está provisto de una etiqueta quimioluminiscente, opcionalmente después de una etapa de lavado para eliminar el exceso de ligando, se le puede añadir en una etapa posterior, si es necesario, un anticuerpo secundario con una etiqueta quimioluminiscente, que se une a este último ligando, por lo que éste permanece unido solo a los basófilos activados, no a los no activados. En un paso adicional de lavado, se puede eliminar el exceso de anticuerpo secundario.
Posteriormente, se mide la quimioluminiscencia. Con la ayuda de este procedimiento, especialmente en combinación con la eliminación de eritrocitos, se puede conseguir una sensibilidad comparable a los procedimientos que usan la citometría de flujo, a pesar de la baja proporción de basófilos en la detección de la activación.
El procedimiento según la invención y o el kit según la invención, o uno o más de un reactivo, tal como pueden estar contenidos en el kit según la invención, también se pueda usar para el cribado de agentes candidatos para identificar agentes terapéuticamente activos entre una selección de agentes candidatos. En este caso, el paso a) se realiza después de poner en contacto los basófilos con un fármaco candidato. En el caso de un principio activo candidato terapéuticamente eficaz, se observa una menor activación en relación con un enfoque sin principio activo candidato o con un principio activo candidato ineficaz.
En una forma de realización preferente, con el término "agente candidato", tal como se usa aquí, se entiende un compuesto que se cree o que se pretende probar para determinar si tiene un efecto terapéutico en un paciente, preferentemente en el sentido de que alivia o previene la reacción alérgica. En una forma de realización preferente, se analizan una o más sustancias activas ya conocidas, que opcionalmente solo responden en un subgrupo de los pacientes que sufren la alergia, para determinar si son terapéuticamente eficaces en un paciente concreto.
La invención se refiere al uso del ligando que tiene una etiqueta quimioluminiscente frente a un ligando característico de los basófilos activados para el diagnóstico de la alergia o para la preparación de un kit para el diagnóstico de la alergia. El kit según la invención también se pueda usar para el diagnóstico de una alergia. La preparación puede comprender el acoplamiento de una etiqueta quimioluminiscente al ligando. El ligando se pueda usar en un kit o en una composición u otra combinación con el ligando que se une específicamente a un polipéptido que está situado en la superficie celular de los basófilos, independientemente de su estado de activación.
Un kit según la invención puede contener un reactivo que active los basófilos independientemente de la presencia de un alérgeno. Dichos reactivos se describen en el estado de la técnica e incluyen, pero no se limitan a, la formilmetionil-leucilfenilalanina (fMLP), la lonomicina, el 12-miristato-13-acetato (PMA), la fMLP y el A23187, la IgG antihumana, un anticuerpo del receptor C40/80 de la IgE y las sinomeninas. Preferentemente, es fMLP y/o anti-Fc épsilon RI, más preferentemente fMLP.
La presente invención se refiere además a un procedimiento y a reactivos adecuados para determinar eficazmente la calidad de una muestra, es decir, en un procedimiento adecuado para un alto rendimiento. Aunque este procedimiento no se realiza con un alérgeno y, por lo tanto, no proporciona un resultado útil para el diagnóstico, permite predecir si la calidad de la muestra es adecuada para un procedimiento de diagnóstico realizado en un enfoque separado.
Con este fin se lleva a cabo el procedimiento según la invención, en donde el alérgeno se sustituye por un reactivo conocido por activar los basófilos activables independientemente de la presencia de un alérgeno.
Como control positivo adicional o alternativo, se pueda usar una preparación de basófilos en combinación con un alérgeno o con un reactivo que se sabe que activa los basófilos activables independientemente de la presencia de un alérgeno, en lugar de la muestra del paciente, siendo la preparación de basófilos conocida por ser suficientemente reactiva, es decir, activable por los alérgenos. Se puede usar solo o en combinación con un alérgeno o con un reactivo conocido por activar los basófilos activables independientemente de la presencia de un alérgeno, contenido en un kit según la invención.
Este procedimiento puede realizarse antes, después o en paralelo con el procedimiento de diagnóstico, o independientemente de él.
La invención se refiere además a un procedimiento no diagnóstico para validar o verificar la fiabilidad de un procedimiento de detección de la activación de los basófilos o para determinar la calidad de la muestra que contiene basófilos, preferentemente la capacidad de activación de los basófilos contenidos en la muestra, que comprende las etapas:
a) Poner en contacto los basófilos de una muestra de sangre total del paciente con un reactivo que active los basófilos independientemente de la presencia de un alérgeno, en condiciones que permitan la activación de los basófilos por el alérgeno,
b) Enriquecimiento de los basófilos de a) y
c) Detección de basófilos activados,
en donde la detección en el paso c) se realiza detectando mediante quimioluminiscencia un marcador característico de los basófilos activados.
En el caso del reactivo que activa los basófilos independientemente de la presencia de un alérgeno, se puede tratar de la formilmetionil-leucilfenilalanina (fMLP; por ejemplo, de Sigma, St. Louis, MO) y/o de un anticuerpo del receptor anti-lgE.
A continuación, se explicará la invención con referencia a las figuras mediante ejemplos de realización. Las formas de realización descritas son, en todos los aspectos, meramente a modo de ejemplo y no deben interpretarse como limitantes, y las diversas combinaciones de las características enumeradas se engloban dentro del alcance de la invención.
La Fig. 1 muestra los resultados del procedimiento según la invención medidos en unidades luminosas relativas de quimioluminiscencia flash (RLU; Fig. 1a-d). Cada 50 jl de sangre total de una persona alérgica al polen se trataron con extractos de alérgenos (t2: Extracto de polen de aliso; t3: Extracto de polen de abedul; t4: extracto de polen de avellano) a diferentes concentraciones (10|jg - 1ng) o controles (anti-FcsRl y fMLP) y se determinó la activación de los basófilos mediante un ensayo de quimioluminiscencia. Los gráficos de barras muestran los valores absolutos de RLU medidos en función de las concentraciones de alérgenos y de los controles. Los valores medidos se indican adicionalmente encima de las barras. La Fig. 1a muestra la reacción del control no estimulado (Ktrl. neg.), así como la estimulación de control con anti-FcsRI y fMLP. La Fig. 1b muestra la reacción de las muestras estimuladas con diferentes concentraciones (10 jg/ml, 1 jg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml) de extracto de polen de aliso. La Fig. 1c muestra la reacción de las muestras estimuladas con diferentes concentraciones (1 jg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml, 1 ng/ml) de extracto de polen de abedul. La Fig. 1d muestra la reacción de las muestras estimuladas con diferentes concentraciones (10 jg/ml, 1 jg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml) de extracto de polen de avellano. La determinación se llevó a cabo con el triple enfoque. Se calcularon los valores medios y las desviaciones estándar. La Fig. 1 e-h muestra el índice de estimulación (SI) calculado por (media de RLU de la muestra activada)/(media de RLU del control negativo) para las muestras mostradas en la Fig. 1 a-d.
La Fig. 2 muestra un ensayo de activación de basófilos con determinación citométrica de flujo de basófilos activados en % (Fig. 2a-d) o como intensidad de fluorescencia media (MFI; Fig. 2e-h). En cada caso se estimularon 50 jl de sangre total de una persona alérgica al polen con los mismos extractos de alérgenos que en el experimento de la Fig. 1 (t2: Extracto de polen de aliso; t3: Extracto de polen de abedul; t4: Extracto de polen de avellano) a diferentes concentraciones (10jg - 1ng) o controles (anti-FcsRI y fMLP) y se determinó la activación de los basófilos por citometría de flujo. Los gráficos de barras muestran las proporciones de basófilos activados en relación con las concentraciones de alérgenos y los controles. Los valores medidos se indican adicionalmente encima de las barras. La Fig. 2a muestra la reacción del control no estimulado (control negativo), así como la estimulación de control con anti-FcsRI y fMLP. En ambos controles positivos, se activaron aproximadamente el 30 % de los basófilos. A partir de una estimulación superior al 10 %, la reacción se evaluó como positiva. La Fig.
2b muestra la reacción de las muestras estimuladas con diferentes concentraciones (10 jg/ml, 1 jg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml) de extracto de polen de aliso. La Fig.2c muestra la reacción de las muestras estimuladas con diferentes concentraciones (1 jg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml, 1 ng/ml) de extracto de polen de abedul. La Fig. 2d muestra la reacción de las muestras estimuladas con diferentes concentraciones (10 jg/ml, 1 jg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml) de extracto de polen de avellano. Las células con un fenotipo CD123+/HLA-DR- se identificaron como basófilos, la activación se detectó mediante anti-CD63-Vio-Blue.
En función del extracto de polen, la reactividad máxima de los basófilos fue del 80-88 % en la concentración más alta usada y disminuyó de manera constante con el aumento de la dilución de los extractos de alérgenos.
La Fig. 3 muestra los resultados del procedimiento según la invención medidos en unidades luminosas relativas de quimioluminiscencia flash (RLU; Fig. 3a-d). Cada 50 jl de sangre total de una persona alérgica al polen se estimularon con extractos de alérgenos (f49: Extracto de manzana; g6: Extracto de polen de hierba Timothy; t3: Extracto de polen de abedul) a diferentes concentraciones (10jg - 1ng) o controles (anti-FcsRl y fMLP) y se determinó la activación de los basófilos mediante un ensayo de quimioluminiscencia. Los gráficos de barras muestran los valores absolutos de RLU medidos en función de las concentraciones de alérgenos y de los controles. Los valores medidos se indican adicionalmente encima de las barras. La Fig. 3a muestra la reacción del control no estimulado (Ktrl. neg.), así como la estimulación de control con anti-FcsRI y fMLP. La Fig.
3b muestra la reacción de las muestras estimuladas con diferentes concentraciones (10 jg/ml, 1 jg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml) de extracto de manzana. La Fig. 3c muestra la reacción de las muestras estimuladas con diferentes concentraciones (1 jg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml, 1 ng/ml) de extracto de polen de hierba Timothy. La Fig.
3d muestra la reacción de las muestras estimuladas con diferentes concentraciones (1 jg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml, 1 ng/ml) de extracto de polen de abedul. La determinación se llevó a cabo con el triple enfoque. Se calcularon los valores medios y las desviaciones estándar. La Fig. 3 e-h muestra el índice de estimulación (SI) calculado por (media de RLU de la muestra activada)/(media de RLU del control negativo) para las muestras mostradas en la Fig. 3 a-d.
La Fig. 4 muestra un ensayo de activación de basófilos con determinación citométrica de flujo de basófilos activados en % (Fig. 4a-d) o como intensidad de fluorescencia media (MFI; Fig.4e-h). Cada 50 jl de sangre total de una persona alérgica al polen se trató con extractos de alérgenos (f49: Extracto de manzana; g6: Extracto de polen de hierba Timothy; t3: Extracto de polen de abedul) se estimularon a diferentes concentraciones (10jg -1ng) o controles (anti-FcsRI y fMLP) y se determinó la activación de los basófilos por citometría de flujo. Los gráficos de barras muestran las proporciones de basófilos activados en relación con las concentraciones de alérgenos y los controles. Los valores medidos se indican adicionalmente encima de las barras. La Fig.
4a muestra la reacción del control no estimulado (control negativo), así como la estimulación de control con anti-FceRI y fMLP. En ambos controles positivos, se activaron aproximadamente el 30 % de los basófilos. A partir de una estimulación superior al 10 %, la reacción se evaluó como positiva. La Fig. 4b muestra la reacción de las muestras estimuladas con diferentes concentraciones (10 |jg/ml, 1 |jg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml) de extracto de manzana. La Fig. 4c muestra la reacción de las muestras estimuladas con diferentes concentraciones (1 jg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml, 1 ng/ml) de extracto de polen de hierba de Timothy. La Fig. 4d muestra la reacción de las muestras estimuladas con diferentes concentraciones (1 jg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml, 1 ng/ml) de extracto de polen de abedul. Las células con un fenotipo CD123+/HLA-DR- se identificaron como basófilos, la activación se detectó mediante anti-CD63-Vio-Blue.
En función del extracto, la reactividad máxima de los basófilos fue del 96 % al 65 % en la concentración más alta usada y disminuyó de manera constante con el aumento de la dilución de los extractos de alérgenos.
La Fig. 5 muestra los resultados del procedimiento según la invención medidos en unidades luminosas relativas de quimioluminiscencia flash (RLU; Fig. 5a-d). Se estimuló cada 50 jl de sangre total de una persona alérgica al polen con extractos de alérgenos (e94: rfield d 1; t3: Extracto de polen de abedul; w6: Extracto de polen de artemisa) estimulado a diferentes concentraciones (10jg - 1ng) o controles (anti-FcsRI y fMLP) y la activación de los basófilos determinada por el ensayo de quimioluminiscencia. Los gráficos de barras muestran los valores absolutos de RLU medidos en función de las concentraciones de alérgenos y de los controles. Los valores medidos se indican adicionalmente encima de las barras. La Fig. 5a muestra la reacción del control no estimulado (Ctrl. neg.), así como la estimulación de control con anti-FcsRI y fMLP. La Fig. 5b muestra la reacción de las muestras estimuladas con diferentes concentraciones (1 jg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml, 1 ng/ml) de rFel d 1. La Fig. 5c muestra la reacción de las muestras estimuladas con diferentes concentraciones (10 jg/ml, 1 jg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml) de extracto de polen de abedul. La Fig. 5d muestra la reacción de las muestras estimuladas con diferentes concentraciones (10 jg/m l, 1 jg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml) de extracto de polen de artemisa. La determinación se llevó a cabo con el triple enfoque. Se calcularon los valores medios y las desviaciones estándar. La Fig. 5 eh muestra el índice de estimulación (SI) calculado por (media de RLU de la muestra activada)/(media de RLU del control negativo) para las muestras mostradas en la Fig. 5 a-d.
La Fig. 6 muestra un ensayo de activación de basófilos con determinación citométrica de flujo de basófilos activados en % (Fig. 6a-d) o como intensidad de fluorescencia media (MFI; Fig. 6e-h). Se estimularon cada 50 jl de sangre total de una persona alérgica al polen con extractos de alérgenos (e94: rfield d 1; t3: Extracto de polen de abedul; w6: Extracto de polen de artemisa) a diferentes concentraciones (10jg - 1ng) o controles (anti-FcsRI y fMLP) y se determinó la activación de los basófilos por citometría de flujo. Los gráficos de barras muestran las proporciones de basófilos activados en relación con las concentraciones de alérgenos y los controles. Los valores medidos se indican adicionalmente encima de las barras. La Fig.6a muestra la reacción del control no estimulado (control negativo), así como la estimulación de control con anti-FcsRI y fMLP. Se activaron aproximadamente el 40 % de los basófilos en ambos controles positivos. A partir de una estimulación superior al 10 %, la reacción se evaluó como positiva. La Fig. 6b muestra la reacción de las muestras estimuladas con diferentes concentraciones (1 jg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml, 1 ng/ml) de rFel d 1. La Fig. 6c muestra la reacción de las muestras estimuladas con diferentes concentraciones (10 jg/m l, 1 jg/m l, 100 ng/ml, 10 ng/ml) de extracto de polen de abedul. La Fig.
6d muestra la reacción de las muestras estimuladas con diferentes concentraciones (10 jg/ml, 1 jg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml) de extracto de polen de artemisa. Las células con un fenotipo CD123+/HLA-DR- se identificaron como basófilos, la activación se detectó mediante anti-CD63-Vio-Blue.
La reactividad máxima de los basófilos fue del 73 % al 12 % según el extracto.
La Fig. 7 muestra los resultados del procedimiento según la invención medidos en unidades luminosas relativas de quimioluminiscencia flash (RLU; Fig. 7a-d). Cada 50 jl de sangre total de una persona alérgica al polen se estimularon con extractos de alérgenos (e2: Extracto de pelo de perro; i3: Extracto de veneno de avispa; i209: rVes v 5) estimuladas a diferentes concentraciones (10jg - 1ng) o controles (anti-FcsRI y fMLP) y se determinó la activación de los basófilos por medio del ensayo de quimioluminiscencia. Los gráficos de barras muestran los valores absolutos de RLU medidos en función de las concentraciones de alérgenos y de los controles. Los valores medidos se indican adicionalmente encima de las barras. La Fig.7a muestra la reacción del control no estimulado (Ctrl. neg.), así como la estimulación de control con anti-FcsRI y fMLP. La Fig. 7b muestra la reacción de las muestras estimuladas con diferentes concentraciones (10 jg/ml, 1 jg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml) de extracto de pelo de perro. La Fig. 7c muestra la reacción de las muestras estimuladas con diferentes concentraciones (10 jg/ml, 1 jg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml) de extracto de veneno de avispa. La Fig. 7d muestra la reacción de las muestras estimuladas con diferentes concentraciones (10 jg/ml, 1 jg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml) de rVes v 5. La determinación se llevó a cabo con el triple enfoque. Se calcularon los valores medios y las desviaciones estándar. La Fig. 7 eh muestra el índice de estimulación (SI) calculado por (media de RLU de la muestra activada)/(media de RLU del control negativo) para las muestras mostradas en la Fig. 7 a-d.
La Fig. 8 muestra un ensayo de activación de basófilos con determinación citométrica de flujo de basófilos activados en % (Fig. 8a-d) o como intensidad de fluorescencia media (MFI; Fig. 8e-h). Cada 50 jl de sangre total de una persona alérgica al polen se estimularon con extractos de alérgenos (e2: Extracto de pelo de perro; i3: Extracto de veneno de avispa; i209: rVes v 5) a diferentes concentraciones (10jg - 1ng) o controles (anti-FcsRI y fMLP) y se determinó la activación de los basófilos por citometría de flujo. Los gráficos de barras muestran las proporciones de basófilos activados en relación con las concentraciones de alérgenos y los controles. Los valores medidos se indican adicionalmente encima de las barras. La Fig.8a muestra la reacción del control no estimulado (control negativo), así como la estimulación de control con anti-FcsRI y fMLP. En ambos controles positivos, se activaron aproximadamente el 30 % de los basófilos. A partir de una estimulación superior al 10 %, la reacción se evaluó como positiva. La Fig. 8b muestra la reacción de las muestras estimuladas con diferentes concentraciones (1 |jg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml, 1 ng/ml) de extracto de pelo de perro. La Fig.8c muestra la reacción de las muestras estimuladas con diferentes concentraciones (1 jg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml, 1 ng/ml) de extracto de veneno de avispa. La Fig. 8d muestra la reacción de las muestras estimuladas con diferentes concentraciones (10 jg/ml, 1 jg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml) de rVes v 5. Las células con un fenotipo CD123+/HLA-DR- se identificaron como basófilos, la activación se detectó mediante anti-CD63-Vio-Blue.
La reactividad máxima de los basófilos fue del 25 % al 8 % según el extracto.
La Fig. 9 muestra los resultados del procedimiento según la invención medidos en unidades luminosas relativas de quimioluminiscencia flash (RLU; Fig. 9a-d). Cada 50 jl de sangre total de una persona alérgica al polen se estimularon con extractos de alérgenos (w8: Extracto de polen de diente de león; f17: Extracto de avellana; f49: Extracto de manzana; e94 rFel d 1) a diferentes concentraciones (10jg - 100ng) o controles (anti-FcsRI y fMLP) y se determinó la activación de basófilos por medio de ensayo de quimioluminiscencia. Los gráficos de barras muestran los valores absolutos de RLU medidos en función de las concentraciones de alérgenos y de los controles. Los valores medidos se indican adicionalmente encima de las barras. La Fig. 9a muestra la reacción del control no estimulado (Ctrl. neg.), así como la estimulación de control con anti-FcsRI y fMLP. La Fig.
9b muestra la reacción de las muestras estimuladas con diferentes concentraciones (10 jg/ml, 1 jg/ml, 100 ng/ml) de extracto de polen de diente de león. La Fig. 9c muestra la reacción de las muestras estimuladas con diferentes concentraciones (10 jg/ml, 1 jg/ml, 100 ng/ml) de extracto de avellana. La Fig. 9d muestra la reacción de las muestras estimuladas con diferentes concentraciones (10 jg/ml, 1 jg/ml, 100 ng/ml) de extracto de manzana. La Fig. 9e muestra la reacción de las muestras estimuladas con diferentes concentraciones (10 jg/ml, 1 jg/ml, 100 ng/ml) de rFel d 1. La determinación se llevó a cabo con el triple enfoque. Se calcularon los valores medios y las desviaciones estándar. La Fig. 9 f-j muestra el índice de estimulación (SI) calculado por (media de RLU de la muestra activada)/(media de RLU del control negativo) para las muestras mostradas en la Fig. 9 a-e.
La Fig. 10 muestra un ensayo de activación de basófilos con determinación citométrica de flujo de basófilos activados en % (Fig. 10a-e) o como intensidad de fluorescencia media (MFI; Fig. 10f-j). Cada 50 jl de sangre total de una persona alérgica al polen se estimularon con extractos de alérgenos (w8: Extracto de polen de diente de león; f17: Extracto de avellana; f49: Extracto de manzana; e94 rFel d 1) a diferentes concentraciones (10jg -100ng) o controles (anti-FcsRI y fMLP) y se determinó la activación de basófilos por medio de citometría de flujo. Los gráficos de barras muestran las proporciones de basófilos activados en relación con las concentraciones de alérgenos y los controles. Los valores medidos se indican adicionalmente encima de las barras. La Fig.
10a muestra la reacción del control no estimulado (control negativo), así como la estimulación de control con anti-FceRI y fMLP. En ambos controles positivos, se activaron aproximadamente el 30 % de los basófilos. A partir de una estimulación superior al 10 %, la reacción se evaluó como positiva. La Fig. 10b muestra la reacción de las muestras estimuladas con diferentes concentraciones (10 jg/ml, 1 jg/ml, 100 ng/ml) de extracto de polen de diente de león. La Fig. 10c muestra la reacción de las muestras estimuladas con diferentes concentraciones (10 jg/ml, 1 jg/ml, 100 ng/ml) de extracto de avellana. La Fig. 10d muestra la reacción de las muestras estimuladas con diferentes concentraciones (10 jg/ml, 1 jg/ml, 100 ng/ml) de extracto de manzana. La Fig. 10e muestra la reacción de las muestras estimuladas con diferentes concentraciones (10 jg/ml, 1 jg/ml, 100 ng/ml) de rFel d 1. Las células con un fenotipo CD123+/HLA-DR- se identificaron como basófilos, la activación se detectó mediante anti-CD63-Vio-Blue.
La reactividad máxima de los basófilos fue del 89 % al 37 % según el extracto.
La Fig. 11 muestra los resultados de una muestra de paciente después de la estimulación con fMLP o del control no estimulado (Ctrl. neg.) con diferentes sistemas de detección. La Fig. 11a muestra los resultados del procedimiento según la invención medidos en unidades luminosas relativas (RLU) de quimioluminiscencia flash. La Fig. 11b muestra los resultados del enriquecimiento de basófilos realizado según el procedimiento de la invención, tras la detección con un anticuerpo marcado con fluorescencia (anti-CD63-FITC; 2jg/m l) medido como intensidad de fluorescencia (FI). La Fig. 11c muestra una prueba de activación de basófilos con determinación por citometría de flujo de los basófilos activados. En cada caso se estimularon 50 jl de sangre total de una persona alérgica al polen con fMLP o se dejaron sin estimular (neg. ctrl ). A continuación, se determinó la activación de los basófilos mediante los procedimientos indicados anteriormente. Los gráficos de barras muestran los valores absolutos medidos en RLU (Fig. 11a) o FI (Fig. 11b) o la activación de los basófilos en % (Fig. 11c).
La Fig. 12 muestra los resultados de una muestra de un paciente tras la estimulación con fMLP o el control no estimulado (Ctrl. neg.) usando diferentes combinaciones de anticuerpos para el enriquecimiento y la detección de basófilos. No se usó ningún alérgeno. La Fig. 12a muestra los resultados del procedimiento según la invención medidos en unidades luminosas relativas (RLU) de quimioluminiscencia flash. La Fig. 12b muestra el índice de estimulación (SI) calculado por (media de RLU de la muestra activada)/(media de RLU del control negativo) para la muestra mostrada en la Fig. 12a . La Fig. 12c muestra una prueba de activación de basófilos con determinación por citometría de flujo de los basófilos activados. La Fig. 12d muestra los resultados del enriquecimiento de basófilos a través del marcador dependiente de la activación CD63 mediante biotina anti-CD63 y la detección con anti-IgE-NSP-SA. El anticuerpo biotina anti-CD63 se usó en concentraciones de 0,2-1 pg/ml, mientras que el anticuerpo de detección anti-lgE-NSP-SA se usó en una concentración fija de 0,5 pg/ml. La Fig. 12e muestra el índice de estimulación (SI) calculado por (media de RLU de la muestra activada)/(media de RLU del control negativo) para las muestras mostradas en la Fig. 12d .
Ejemplos:
la . Preparación de diluciones de alérgenos:
Para detectar la activación de los basófilos, se acopló covalentemente un anticuerpo anti-CD63 (clon 7G3, BD Bioscience #353014) a un éster de acridinio NSP-SA-NHS (Heliosense Biotechnologies, #199293-83-9) según las instrucciones del fabricante. A continuación, el anticuerpo se purificó usando una columna PD-10 (GE Healthcare, n° 383420). Del mismo modo, Biomol GmbH etiquetó la IgE con NSP-SA-NHS.
lb . Preparación de diluciones de alérgenos:
Se prepararon el extracto de polen de aliso T2 (Squarix, #T-4402), el extracto de polen de abedul t3 (Squarix, #T-4400) y el extracto de polen de avellano t4 (Squarix, #T-4404) a concentraciones de 10 pg/ml, 1 pg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml, 1 ng/ml en tampón de dilución (1*Solución salina equilibrada de Hanks (Thermo Fisher Scientific #14065056), 40mM Hepes, pH 7,4). El tampón de dilución sirvió de control negativo. Los controles positivos fueron fMLP (Sigma, #F3506-5MG) a una concentración de 10'6 M y el anticuerpo anti-FcsRI (clon AER-37, ebioscience, #14-5899-82) a una concentración de 100 ng/ml. Además, los antígenos usados fueron extracto de manzana (Squarix # F-2327), extracto de polen de hierba de Timothy (Squarix,# G-5501), e94 (purificado según Rogers et al. (1993) I.D. Fel recombinante: Recombinant Fel d.I: Expression, purification, IgE binding and reaction with catallergic human T cells. („Expresión, purificación, unión de IgE y reacción con células T humanas alérgicas a los gatos”), Molecular Immunology, 30 de abril de 2010 (6), 559-568), extracto de polen de artemisa (Squarix #W-3400), extracto de pelo de perro (Squarix # E-6617), extracto de veneno de avispa (Squarix # I-7804), i209 (purificado según Seismann et al. 2010, Clinical and Molecular Allergy, 8:7), extracto de polen de diente de león (Squarix # W-3404) y extracto de avellana /Squarix, #T-4404).
lc . Estimulación:
Se mezclaron 50 pl de sangre total periférica (heparinizada) en una placa de microtitulación con 50 pl de dilución de alérgeno y 50 pl de dilución de control y se incubaron durante 20 minutos a 37 °C en una cabina de calefacción. La reacción se detuvo añadiendo 10 pl de una solución concentrada de EDTA (100 mM de EDTA en PBS).
2a1. Incubación de anticuerpos:
A continuación, se añadieron dos anticuerpos a las muestras:
1) anti-CD123-biotina (clon H5C6, Biolegend #353014) a una concentración final de 0,5 pg/ml 2) anti-CD63-NSP-SA (clon 7G3, BD Bioscience #353014) a una concentración final de 2 pg/ml. Se mezclaron las muestras y se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Alternativamente, se usaron biotina anti-CD63 (Biolegend 353017) y FITC anti-CD63 (Miltenyi 130-100-160).
2a2. Eritrólisis:
Se lisaron los eritrocitos añadiendo 100 pl de un tampón de lisis con saponina (0,14 % de saponina en PBS) y se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se centrifuga la placa de microtitulación a 500 g durante 5 minutos y se elimina el sobrenadante.
2a3. Incubación de perlas:
Se mezclaron las muestras con 10pg de cada una de las perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina (Sera-Mag Speedbeads Streptavidin blocked, GE-Healthcare, #21152104010350) y se incubaron durante 10min a TA.
2a4. Lavado:
Se lavaron 5 veces las células unidas a las perlas con 300pl de tampón de lavado (0,05 % de Tween, 2mM de EDTA, 150mM de NaCl, 0,05 % de NaN3) en un lavador de placas, por ejemplo, Tecan Hydroflex equipado con un imán MBS96.
2a5. Detección:
En la detección posterior, se activó el éster de acridinio NSP-SA en el anticuerpo CD63 con dos soluciones (H2O2; 0,1 M HNO3 y 0,25M NaOH (Kit de reactivos de detección de quimioluminiscencia, Invitron Ltd., #IV1-001)). La señal de quimioluminiscencia generada (luminiscencia flash) se detectó en el luminómetro de placa, por ejemplo, Berthold Centro LB 960 a una longitud de onda de 425 nm.
2a6. Evaluación:
La intensidad de la activación de los basófilos se calculó mediante el aumento de la señal de quimioluminiscencia en comparación con el control no estimulado. Se puede calcular un índice de estimulación (SI) a partir de las unidades luminosas relativas (RLU) de la muestra activada/ RLU de la muestra no estimulada. El valor umbral que se debe superar depende de la sustancia de ensayo.
2b. Medición por citometría de flujo:
Para la determinación por citometría de flujo, después de la activación con anticuerpos anti-CD123-PE (Miltenyi Biotec, #130-098-894), anti-HLA-DR-PerCPVio700 (Miltenyi Biotec, #130-103-873) y anti-CD63-Vio-Blue (Miltenyi Biotec, #130-100-154) se incubaron las muestras durante 15 minutos a 4 °C y protegidos de la luz según las instrucciones del fabricante.
Tras la adición de 1 ml de solución de lisado FACS (BD Bioscience, #349202) y la incubación durante 10 minutos a temperatura ambiente, se centrifugaron las muestras a 500 g, 5 minutos, se eliminó el sobrenadante y se lavaron de nuevo las muestras con 500 pl de tampón de lavado (PBS sin Ca2+/Mg2+, 0,5 % BSA, 2 mM EDTA, 0,05 % NaN3). La medición se llevó a cabo en un citómetro de flujo, por ejemplo, MACS Quant (Miltenyi Biotec) en un plazo de 2 horas. Las células con un fenotipo CD123+/HLA-DR se identificaron como basófilos. Los basófilos se activaban cuando la señal de CD63 superaba un umbral seleccionado. Una activación total de > 10 % se consideró positiva.
2c. Medición de la fluorescencia
La fluorescencia del anti-CD63-FITC se midió usando un instrumento BMG Labtech Fluostar (485nm/520nm).
Resultados:
La prueba de quimioluminiscencia (Fig. 1) se consideró positiva si la señal de la muestra estimulada se duplicaba en relación con el control (SI > 2). Al evaluar las determinaciones de citometría de flujo (Fig. 2 ) , todas las muestras que muestran una activación de > 10 % se consideran positivas. La comparación de la prueba de quimioluminiscencia con la prueba de citometría de flujo muestra una buena correlación de los resultados de los dos sistemas de prueba, así como una muy buena reproducibilidad. El rango dinámico de medición de la señal de quimioluminiscencia es significativamente más amplio que el de la señal de fluorescencia.
En la evaluación por citometría de flujo, deben establecerse ventanas de análisis para definir las poblaciones de células activadas y no activadas (gating), que deben ajustarse individualmente para cada paciente y son fijadas subjetivamente por el evaluador respectivo. Esta posibilidad de evaluación de variantes no se da en la prueba de quimioluminiscencia, ya que aquí solo se forma la relación entre la muestra estimulada y el control. Esto permite una evaluación estandarizada, que no puede lograrse de esta manera con una prueba de citometría de flujo. Gracias a la preparación de la muestra en formato de placa de microtitulación, a la rapidez de la medición y a la sencillez de la evaluación, también es posible un rendimiento de muestras significativamente mayor.
Este experimento también demostró que el uso de la quimioluminiscencia como sistema de detección es una ventaja decisiva: los basófilos y otras células solo muestran una autoquimioluminiscenciamuy baja. Por lo tanto, no se requiere una pureza absoluta de las células objetivo durante la medición.
Por el contrario, las células muertas y los granulocitos, en particular, tienen una alta autofluorescencia, lo que provocaría una superposición de la señal deseada en la citometría de flujo y, por lo tanto, requiere una separación adecuada. Cuando se usa el anticuerpo de biotina CD123 para purificar los basófilos, se incluye en las muestras una pequeña proporción de células dendríticas en particular, que también expresan CD123 en la superficie. Sin embargo, éstos no expresan CD63, por lo que la señal de quimioluminiscencia anti-CD63 detectada se debe exclusivamente a los basófilos. La medición en sí no se ve afectada por la presencia de otras células no marcadas.
La combinación de la quimioluminiscencia como procedimiento de detección con la presencia de sangre total no fraccionada conduce, por lo tanto, a un procedimiento de detección altamente sensible con el que se pueden procesar en paralelo un gran número de muestras con la máxima reproducibilidad y estandarización.
En las Figs. 3-10 , con una amplia selección de antígenos y donantes de muestras se demuestra que el procedimiento según la invención es ampliamente aplicable. En cada caso, la primera figura (por ejemplo, la Fig.
3 ) muestra el mismo experimento con quimioluminiscencia y la siguiente (Fig. 4 ) con citometría de flujo para demostrar la comparabilidad. El resultado es sorprendentemente alto. El procedimiento según la invención puede, por lo tanto, sustituir a la citometría de flujo.
En la Fig. 11 se comparan directamente los tres procedimientos de detección: quimioluminiscencia, fluorescencia y citometría de flujo. Queda claro que la quimioluminiscencia es aproximadamente equivalente a la citometría de flujo en términos de sensibilidad y es claramente más adecuada que la fluorescencia, lo que confirma que el procedimiento según la invención puede sustituir a la citometría de flujo.
Finalmente, el experimento mostrado en la Fig. 12 demuestra que el procedimiento según la invención también funciona cuando se usa un ligando dependiente de la activación para el enriquecimiento y un ligando independiente de la activación para la detección, en lugar de viceversa como en los otros experimentos. Aunque en este caso el fondo es mayor con la quimioluminiscencia en comparación con la señal, la señal aún puede distinguirse claramente del fondo.

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento de diagnóstico de una alergia que comprende los pasos:
a) Poner en contacto los basófilos de una muestra de sangre total de un paciente con un alérgeno en una solución acuosa en presencia de la sangre total, con una fracción de volumen de la sangre total en la solución acuosa de al menos el 20 % en volumen en condiciones que permitan la activación de los basófilos por medio del alérgeno,
b) Enriquecimiento de los basófilos de a) y
c) Detección de basófilos activados,
en donde la detección en el paso c) se logra detectando mediante quimioluminiscencia un marcador de basófilos situado en la superficie de los basófilos, en donde en el paso b) los basófilos se enriquecen mediante la unión a un ligando que se une específicamente a un polipéptido que es un marcador característico de los basófilos activados, y/o la detección en el paso c) se logra detectando mediante quimioluminiscencia un marcador característico de los basófilos activados.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la sangre total es sangre total sin procesar.
3. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que la etapa a) se lleva a cabo en una solución acuosa que tiene un contenido de sangre total de al menos el 30 %, preferentemente el 35 %, más preferentemente el 40 %, incluso más preferentemente el 45 % en volumen.
4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende la etapa de detener la activación de los basófilos, preferentemente antes de la etapa b).
5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que en el paso b) los basófilos se enriquecen mediante la unión a un ligando que se une específicamente a un polipéptido, situado en la superficie celular de los basófilos, preferentemente con independencia de su estado de activación.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que el ligando es un anticuerpo monoclonal frente al polipéptido.
7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que en el paso b) se inmovilizan los basófilos.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que los basófilos están inmovilizados en una perla, preferentemente en una perla magnética.
9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 8, en el que los basófilos son lavados después de la inmovilización.
10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que en el paso b) se lisan y se eliminan los eritrocitos.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que se eliminan los eritrocitos por medio de centrifugación antes de la inmovilización de los basófilos.
12. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 11, en el que la detección en el paso c) se lleva a cabo con ayuda de un ligando provisto de una etiqueta quimioluminiscente frente al marcador situado en la superficie de los basófilos, preferentemente un marcador que es característico de los basófilos activados.
13. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que el ligando marcado con quimioluminiscencia es un anticuerpo monoclonal que a su vez tiene una etiqueta quimioluminiscente o al que se une un anticuerpo secundario que tiene una etiqueta quimioluminiscente.
14. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 13, en el que las etapas a), b) y c) se llevan a cabo en un pocillo de una placa de microtitulación.
15. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 14, en el que la etapa a) se realiza antes de las etapas b) y c).
16. Kit que comprende
un recipiente para poner en contacto los basófilos con el alérgeno, siendo el recipiente preferentemente una placa de microtitulación,
opcionalmente un alérgeno,
un ligando que se une específicamente a un polipéptido situado en la superficie celular de los basófilos para el enriquecimiento de basófilos y un ligando frente a un marcador situado en la superficie de los basófilos para la detección,
en donde el ligando que se une específicamente al marcador situado en la superficie de los basófilos tiene una etiqueta quimioluminiscente para su detección,
en donde el ligando que se une específicamente frente a un polipéptido situado en la superficie celular de los basófilos está inmovilizado en un soporte sólido,
en donde la etiqueta quimioluminiscente puede ser una enzima que cataliza una reacción quimioluminiscente o una molécula que en condiciones adecuadas genera por sí misma una señal quimioluminiscente, estando la enzima incluida en el kit, en el primer caso en combinación con una solución de sustrato quimioluminiscente,
y en donde el marcador situado en la superficie de los basófilos es característico de los basófilos activados,
opcionalmente un agente para detener la activación de los basófilos,
opcionalmente un agente para lisar y/o eliminar los eritrocitos.
17. Uso de un ligando que se une específicamente a un polipéptido situado en la superficie celular de los basófilos, junto con un ligando que se une a un marcador situado en la superficie de los basófilos,
para el diagnóstico de una alergia o para la fabricación de un kit para el diagnóstico de una alergia o para el cribado de medicamentos candidatos para la terapia de una alergia a un alérgeno,
en donde el ligando tiene una etiqueta quimioluminiscente frente al marcador situado en la superficie de los basófilos para su detección,
en donde la etiqueta quimioluminiscente puede ser una enzima que cataliza una reacción quimioluminiscente o una molécula que en condiciones adecuadas genera por sí misma una señal quimioluminiscente, usándose la enzima en el primer caso en combinación con una solución de sustrato quimioluminiscente,
en donde el ligando que se une específicamente a un polipéptido situado en la superficie celular de los basófilos está inmovilizado en un soporte sólido,
y en donde el marcador situado en la superficie de los basófilos es característico de los basófilos activados.
ES18187647T 2017-08-08 2018-08-07 Procedimiento para la detección de la activación de los basófilos Active ES2904354T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP17001352.8A EP3441763A1 (de) 2017-08-08 2017-08-08 Verfahren zum nachweis einer basophilenaktivierung
EP17001979 2017-12-05

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2904354T3 true ES2904354T3 (es) 2022-04-04

Family

ID=63041937

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES18187647T Active ES2904354T3 (es) 2017-08-08 2018-08-07 Procedimiento para la detección de la activación de los basófilos

Country Status (13)

Country Link
US (1) US11119109B2 (es)
EP (1) EP3441765B1 (es)
JP (1) JP7265325B2 (es)
KR (1) KR102547565B1 (es)
CN (1) CN109387636B (es)
AU (1) AU2018213977A1 (es)
BR (1) BR102018015288A2 (es)
CA (1) CA3012989A1 (es)
DE (1) DE102018006212A1 (es)
ES (1) ES2904354T3 (es)
LT (1) LT3441765T (es)
PL (1) PL3441765T3 (es)
SG (1) SG10201806697RA (es)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20210382070A1 (en) * 2020-06-04 2021-12-09 The Chinese University Of Hong Kong Diagnostic biomarkers for shrimp allergy
CN112630423A (zh) * 2020-12-31 2021-04-09 杭州福德敏生物技术有限公司 一种小麦免疫荧光检测试纸条及应用
KR102497904B1 (ko) * 2021-02-10 2023-02-10 재단법인 아산사회복지재단 세포 원심분리 및 농축을 이용한 면역세포 검출 방법 및 면역세포 검출용 칩

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3169833D1 (en) 1980-08-22 1985-05-15 Berthold Lab Prof R Process for performing analytical determinations by means of the chemiluminescent method, and application of this process to immuno assays
US4902613A (en) 1984-05-14 1990-02-20 Becton, Dickinson And Company Lysing agent for analysis of peripheral blood cells
EP0182874B1 (en) 1984-05-31 1993-10-20 Coulter Corporation A reagent system and method for identification, enumeration and examination of classes and subclasses of blood leukocytes
EP0974050B1 (de) 1997-01-20 2002-09-25 ORPEGEN Pharma GmbH Basophilen-degranulationstest
FR2778413B1 (fr) 1998-05-07 2000-08-04 Immunotech Sa Nouveaux reactifs et methode de lyse des erythrocytes
CZ292686B6 (cs) * 2001-09-17 2003-11-12 Imumed S. R. O. Způsob měření aktivace basofilů po stimulaci alergenem pro stanovení přecitlivělosti na tento alergen a příslušný kit
DE10235310B4 (de) 2002-08-01 2012-05-16 Molecular And Clinical Drug Research Verfahren zur Bestimmung allergener Potenz von Produkten
RU2289138C2 (ru) * 2004-12-14 2006-12-10 Научно-исследовательский институт микробиологии Министерства обороны Российской Федерации Способ аллергодиагностики по показателям хемилюминесцентного свечения нейтрофилов
EP2037269B1 (en) 2007-09-11 2014-04-02 Bühlmann Laboratories AG Allergy test based on flow cytometric analysis
JP2009236798A (ja) 2008-03-28 2009-10-15 Sysmex Corp 好塩基球の分類計数方法
US20100167317A1 (en) * 2008-08-05 2010-07-01 Institut Pasteur Process for enriching basophils in a blood sample
WO2012028167A2 (en) 2010-05-20 2012-03-08 Innohyphen Bv Acridinium ester chemiluminescence upon reductive triggering
US20120083007A1 (en) 2010-10-01 2012-04-05 Nadeau Kari C Basophil Activation Based Allergy Diagnostic Test
WO2012105541A1 (ja) * 2011-01-31 2012-08-09 大鵬薬品工業株式会社 新規ヒノキ花粉アレルゲン
WO2014066271A1 (en) * 2012-10-22 2014-05-01 Becton, Dickinson And Company Non-b-lineage cells capable of producing antibody
PL3051928T3 (pl) 2015-01-29 2019-07-31 Kjellberg-Stiftung Palnik plazmowy
CN104677810B (zh) * 2015-01-30 2017-08-22 广东医学院附属医院 嗜碱性粒细胞活化的检测试剂盒及其使用方法
CN104777303B (zh) * 2015-04-29 2017-02-01 何韶衡 一种嗜碱性粒细胞激活、脱颗粒的鉴定方法
HUE047265T2 (hu) 2016-01-25 2020-04-28 Euroimmun Medizinische Labordiagnostika Ag Makadámia allergén
EP3244212A1 (en) 2017-02-15 2017-11-15 Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG An improved assay for the diagnosis of peanut allergy

Also Published As

Publication number Publication date
US20190049461A1 (en) 2019-02-14
KR102547565B1 (ko) 2023-06-26
AU2018213977A1 (en) 2019-02-28
JP2019032317A (ja) 2019-02-28
CN109387636A (zh) 2019-02-26
DE102018006212A1 (de) 2019-02-14
EP3441765A1 (de) 2019-02-13
CA3012989A1 (en) 2019-02-08
CN109387636B (zh) 2023-07-04
BR102018015288A2 (pt) 2021-11-09
SG10201806697RA (en) 2019-03-28
PL3441765T3 (pl) 2022-02-14
JP7265325B2 (ja) 2023-04-26
EP3441765B1 (de) 2021-10-20
LT3441765T (lt) 2022-01-10
US11119109B2 (en) 2021-09-14
KR20190016446A (ko) 2019-02-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2037269B1 (en) Allergy test based on flow cytometric analysis
US11796547B2 (en) Methods of detecting donor-specific antibodies and systems for practicing the same
ES2904354T3 (es) Procedimiento para la detección de la activación de los basófilos
DK2261658T3 (en) IP-10-time based infection diagnosis
JP2009510464A (ja) 慢性関節リウマチの診断における抗ｃｃｐおよび抗核抗体
WO2003081240A1 (fr) Procede de recherche d&#39;infection virale
US20110269162A1 (en) Ubiquitin proteasome system profiling for diagnosis of chronic liver disease
JP4242499B2 (ja) ホスホリルコリンを用いたｃｒｐの測定方法
ES2826394T3 (es) Ensayo de activación para el diagnóstico de una trombocitopenia inducida por heparina
JP5456056B2 (ja) 体液中のｉｆｉ１６の検出
Wyant et al. Whole blood microvolume laser scanning cytometry for monitoring resting and activated platelets
EP3441763A1 (de) Verfahren zum nachweis einer basophilenaktivierung
Pisetsky The Role of Microparticles as Biomarkers in the Development of Therapy for Autoimmune Disease
AU2011233753A1 (en) Method to detect tissue degradation leading to inflammation
UA65142A (en) Method of diagnosing &#34;b&#34; or &#34;c&#34; hepatitis