ES2826394T3 - Ensayo de activación para el diagnóstico de una trombocitopenia inducida por heparina - Google Patents

Ensayo de activación para el diagnóstico de una trombocitopenia inducida por heparina Download PDF

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Abstract

Procedimiento para la deteccion de anticuerpos anti-complejo de PF4/heparina en una muestra de liquido corporal, que comprende el procedimiento las etapas: i. facilitar una mezcla de reaccion mediante mezclado de la muestra con un reactivo que contiene trombocitos y con un polisacarido no ramificado, de union a PF4 o con un polianion de union a PF4; ii. incubar la mezcla de reaccion; y entonces iii. determinar la cantidad de PF4 en la mezcla de reaccion; iv. comparar la cantidad asi determinada de PF4 en la mezcla de reaccion con un valor de referencia predeterminado para la cantidad de PF4 en mezclas de reaccion que contienen muestras de liquido corporal de donadores, que como es sabido no contienen anticuerpos anti-complejo de PF4/heparina; y v. detectar la presencia de anticuerpos anti-complejo de PF4/heparina en la muestra, cuando la cantidad de PF4 determinada en la mezcla de reaccion sobrepasa el valor de referencia.

Description

DESCRIPCIÓN
Ensayo de activación para el diagnóstico de una trombocitopenia inducida por heparina
La presente invención se encuentra en el campo del diagnóstico in vitro y se refiere a un ensayo funcional, fácilmente automatizable para la determinación de una trombocitopenia inducida por heparina.
La trombocitopenia inducida por heparina (HIT) es una enfermedad trombótica, que puede producirse en el contexto de una terapia con heparina y puede originar complicaciones tromboembólicas amenazantes para la vida. Los pacientes afectados producen anticuerpos que se unen a un complejo de heparina y factor plaquetario 4 (PF4), los denominados anticuerpos anti-complejo de PF4/heparina. In vivo se une el complejo de PF4/heparina unido a anticuerpo a la superficie de trombocitos y origina una activación de los trombocitos. Debido a ello se produce una reducción del número de trombocitos y un aumento del riesgo de tromboembolias.
Para el diagnóstico de HIT se usan esencialmente dos principios de ensayo. El primer principio de ensayo se basa en la detección directa de anticuerpos anti-complejo de PF4/heparina en una muestra de líquido corporal de un paciente. Para ello se lleva a contacto una muestra con complejo de PF4/heparina o un complejo de PF4 y otro polianión adecuado (tal como por ejemplo poli(sulfonato de vinilo), y se detecta la unión de posibles anticuerpos anti-complejo de PF4/heparina existentes en la muestra con procedimientos de ensayo inmunológicos convencionales (por ejemplo ELISA) (véase por ejemplo Warkentin, T.E. et al.: The use of well-characterized sera for the assessment of new diagnostic enzyme-immunoassays for the diagnosis of heparin-induced thrombocytopenia. Journal of Thrombosis and Haemostasis, vol 8 (1) 2010, 216-218 o Eichler, P. et al.: The new IDheparin/PF4 antibody test for rapid detection of heparin-induced antibodies in comparison with functional and antigenic assays. British Journal of Haematology, vol 116 (4) 2002, 887-891). Sin embargo es desventajoso que si bien la detección de anticuerpos anti-complejo de PF4/heparina es sensible, sin embargo no es suficientemente específica, es decir la detección de los anticuerpos no es suficiente para un diagnóstico de HIT positivo, mientras que un resultado negativo excluye una HIT de manera suficientemente segura. Por tanto se recomienda la verificación mediante un ensayo funcional a base de un segundo principio de ensayo (véase por ejemplo Vengal, L.: Testing for heparin-induced thrombocytopenia. 2016, URL: https://clevelandcliniclabs.com/ wp-content/uploads/2016/04/anti-platelet-31311.pdf o Albrecht, L. et al.: Laboratory diagnosis of heparin-induced thrombocytopenia and monitoring of alternative anticoagulants. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, vol 10 (5) 2003, 731-740).
El segundo principio de ensayo funcional se basa en la detección de la acción de activación de trombocitos de los anticuerpos de los anticuerpos anti-complejo de PF4/heparina. En este principio de ensayo se mezclan trombocitos adultos de uno o varios donadores normales con una muestra de plasma o suero de un paciente y con heparina, y se mide la activación de trombocitos por medio de marcadores de activación conocidos, tal como por ejemplo por medio de la cantidad de serotonina liberada (ensayo de liberación de serotonina), o por medio de la reacción de agregación de los trombocitos visualmente distinguible (ensayo HIPA). Si una muestra de paciente contiene anticuerpo anti­ complejo de PF4/heparina, puede detectarse una activación de trombocitos elevada frente a una muestra normal (sin anticuerpos de este tipo).
Los dos principios de ensayo funcionales mencionados no pueden realizarse hasta ahora en laboratorios convencionales y no de manera automatizada, ya que requieren una realización manual compleja y por tanto pueden realizarse sólo por personal formado. Además requiere el ensayo de liberación de serotonina la separación de los trombocitos mediante una etapa de centrifugación y el uso de material radioactivo.
La presente invención se basa en el objetivo de facilitar un procedimiento funcional para la detección de anticuerpos anti-complejo de PF4/heparina en una muestra de líquido corporal, en el que se eviten los inconvenientes mencionados anteriormente.
Se encontró que mediante la determinación cuantitativa de PF4 en una mezcla de reacción, que contiene la muestra que va a someterse a estudio, trombocitos y heparina (o un polisacárido de unión a PF4 o polianión, funcionalmente equivalente), puede determinarse si la muestra contiene anticuerpos anti-complejo de PF4/heparina. Las muestras que contienen anticuerpos anti-complejo de PF4/heparina, originan en la mezcla de reacción mencionada de manera evidente una descarga de PF4 en los trombocitos, de modo que una cantidad de PF4 elevada en la mezcla de reacción indica la presencia de anticuerpos anti-complejo de PF4/heparina y con ello la existencia de una trombocitopenia inducida por heparina.
Por tanto, el objeto de la presente invención es un procedimiento para la detección de anticuerpos anti-complejo de PF4/heparina en una muestra de líquido corporal. El procedimiento comprende las etapas:
i. facilitar una mezcla de reacción mediante mezclado de la muestra con un reactivo que contiene trombocitos y con un polisacárido no ramificado, de unión a PF4 o con un polianión de unión a PF4;
ii. incubar la mezcla de reacción; y entonces
iii. determinar la cantidad de PF4 en la mezcla de reacción;
iv. comparar la cantidad así determinada de PF4 en la mezcla de reacción con un valor de referencia predeterminado para la cantidad de PF4 en mezclas de reacción que contienen muestras de líquido corporal de donadores, que como es sabido no contienen anticuerpos anti-complejo de PF4/heparina; y
v. detectar la presencia de anticuerpos anti-complejo de PF4/heparina en la muestra, cuando la cantidad de PF4 determinada en la mezcla de reacción sobrepasa el valor de referencia.
La muestra de líquido corporal procede preferentemente de un ser humano. preferentemente se trata de una muestra de líquido corporal esencialmente libre de trombocitos, en particular de plasma o suero.
El reactivo que contiene trombocitos necesario para la facilitación de la mezcla de reacción es preferentemente una suspensión de trombocitos humanos lavados y resuspendidos. Los trombocitos proceden preferentemente de uno o varios donadores sanos, que como es sabido no contienen anticuerpos anti-complejo de PF4/heparina. Para la preparación de un reactivo que contiene trombocitos adecuado se centrifugan por ejemplo muestras de sangre total con citrato, a las que se añadieron preferentemente también hirudina, para obtener plasma rico en plaquetas. Al plasma rico en plaquetas se añade otra vez solución de citrato y apirasa, se centrifuga de nuevo, y a continuación se descarta el sobrenadante libre de células. Los trombocitos sedimentados se suspenden finalmente en una solución de suspensión tamponada.
La muestra de líquido corporal se mezcla además con un polisacárido no ramificado de unión a PF4 o con un polianión de unión a PF4. Se conoce una pluralidad de sustancias de unión a PF4, que con PF4 forman un complejo que se une por los anticuerpos anti-complejo de PF4/heparina que van a detectarse. Los polisacáridos no ramificados adecuados son por ejemplo heparina, heparina no fraccionada (UFH), heparina fraccionada (LM-WH), sulfato de dextrano y fucoidan. Los polianiones adecuados son por ejemplo poli(sulfato de vinilo), poli(sulfonato de vinilo), poli(fosfato de vinilo), poli(fosfonato de vinilo), poli(sulfato de estireno) y poli(sulfonato de estireno).
Antes de la determinación de la cantidad de PF4 en la mezcla de reacción se incuba la mezcla de reacción durante un espacio de tiempo, para permitir la formación de complejo entre el polisacárido no ramificado, de unión a PF4 o polianión y la proteína PF4 existente en muestra, la unión de los anticuerpos anti-complejo de PF4/heparina supuestamente contenidos en la muestra al complejo producido y finalmente la activación de los trombocitos mediante la unión del complejo unido a anticuerpo a la superficie de trombocitos. Una duración de incubación típica asciende a entre 5 y 10 minutos, preferentemente a 37 °C.
Tras la incubación suficiente se realizan etapas para determinar la cantidad de PF4 en la mezcla de reacción. La determinación de la cantidad de PF4 en la mezcla de reacción puede realizarse de manera distinta. Se prefieren ensayos de unión en los que para la determinación de la cantidad de PF4 en la mezcla de reacción se lleva a contacto al menos un asociado de unión a PF4, tal como por ejemplo un anticuerpo anti-PF4 o heparina o un polisacárido no ramificado de unión a PF4 o un polianión de unión a PF4, con la mezcla de reacción. Esto puede realizarse por ejemplo debido a que la mezcla de reacción se lleva a contacto (total o parcialmente) con un asociado de unión a p F4 asociado a una fase sólida. Las partes constituyentes que no se han unido se separan mediante lavado, y con ayuda de un segundo asociado de unión a PF4, marcado se determina la cantidad de la proteína PF4 unida a la fase sólida (técnica ELISA). Los anticuerpos anti-PF4 especialmente adecuados son anticuerpos monoclonales o policlonales con especificidad para PF4 libre, es decir con especificidad para PF4 que no se ha unido a heparina o un polisacárido o polianión funcionalmente equivalente, o anticuerpos monoclonales o policlonales que se unen a proteína PF4 tanto libre como también complejada.
Se prefieren especialmente ensayos inmunológicos homogéneos, con los que pueden prescindirse de la separación de partes constituyentes que no se han unido y con ello de etapas de lavado. Para ello se mezcla la mezcla de reacción (total o parcialmente) con un primer y un segundo anticuerpo anti-PF4 y con un primer y un segundo componente de un sistema formador de señales. Los componentes del sistema formador de señales interactúan de modo que se produce una señal detectable, cuando el primer y el segundo componente del sistema formador de señales se aproximan espacialmente uno con respecto a otro. A este respecto está asociado el primer anticuerpo anti-PF4 con el primer componente del sistema formador de señales o se asocia durante la incubación de la mezcla de reacción con ésta, y el segundo anticuerpo anti-PF4 está asociado con el segundo componente del sistema formador de señales o se asocia durante la incubación de la mezcla de reacción con ésta.
En una forma de realización de un ensayo inmunológico de PF4 homogéneo se trata en el caso de los componentes del sistema formador de señales de fases sólidas particulares, por ejemplo partículas de látex, cuya aglutinación se determina de manera turbidimétrica o nefelométrica. Para ello, el primer componente del sistema formador de señales está constituido por una primera fase sólida particular, que se ha creado de modo que está asociada o puede asociarse con el primer anticuerpo anti-PF4. La primera fase sólida particular puede estar unida con el primer anticuerpo anti-PF4 a través de un enlace covalente o a través de un par de unión X/Y o puede unirse a través de un par de unión X/Y en la mezcla de reacción. Además, el segundo componente del sistema formador de señales está constituido por una segunda fase sólida particular, que se ha creado de modo que está asociada o puede asociarse con el segundo anticuerpo anti-PF4. La segunda fase sólida particular puede estar unida con el segundo anticuerpo anti-PF4 a través de un enlace covalente o a través de un par de unión A/B o puede unirse a través de un par de unión A/B en la mezcla de reacción. Los ensayos inmunológicos basados en el principio de la dispersión de luz reforzada con partículas se conocen desde aproximadamente 1920 (para la visión general véase Newman, D. J. et al., Particle enhanced light scattering immunoassay. Ann Clin Biochem 1992; 29: 22-42). Preferentemente se usan partículas de poliestireno con un diámetro de 0,1 a 0,5 |jm, de manera especialmente preferente con un diámetro de 0,15 a 0,35 |jm. Preferentemente se usan partículas de poliestireno con funciones amino, carboxilo o aldehido. Además preferentemente se usan partículas de envoltura/núcleo. La síntesis de las partículas y el enlace covalente de ligandos se ha descrito por ejemplo en Peula, J.M. et al., Covalent coupling of antibodies to aldehyde groups on polymer carriers. Journal of Materials Science: Materials in Medicine 1995; 6: 779-785.
En otra forma de realización de un ensayo inmunológico de PF4 homogéneo comprende el sistema formador de señales al menos un primer y un segundo componente, que interactúan de modo que se produce una señal detectable cuando se aproximan espacialmente uno con respecto a otro y debido a ello pueden entrar en interacción entre sí. Por una interacción entre los componentes ha de entenderse en particular una transferencia de energía - o sea la transferencia de energía directa entre los componentes, por ejemplo mediante radiación de luz o electrones así como a través de moléculas químicas reactivas, tal como por ejemplo oxígeno singulete de vida corta. La transferencia de energía puede realizarse de uno a otro componente, sin embargo es posible también una cascada de distintas sustancias a través de la cual pasa la transferencia de energía. Por ejemplo, en el caso de los componentes puede tratarse de un par de un donador de energía y un receptor de energía, tal como por ejemplo fotosensiblizador y agente quimioluminiscente (documento EP-A2-0515194, LOCI® Technologie) o fotosensibilizador y fluoróforo (documento WO 95/06877) o yodo<125> radiactivo y fluoróforo (Udenfriend et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 8672 - 8676) o fluoróforo y extinguidor de fluorescencia (documento US 3.996.345). De manera especialmente preferente, el primer componente del sistema formador de señales es un agente quimioluminiscente y el segundo componente del sistema formador de señales es un fotosensibilizador o a la inversa, y se mide la quimioluminiscencia en la mezcla de reacción.
El primer componente y/o el segundo componente del sistema formador de señales, que entran en interacción entre sí, pueden estar asociados con una fase sólida particular de manera covalente o a través de interacción específica o pueden estar introducidos en ésta. Por el término fase sólida particular ha de entenderse partículas no celulares, que pueden suspenderse, tal como por ejemplo soles metálicos, partículas de sílice, partículas de imán o de manera especialmente preferente partículas de látex. Se prefieren partículas con un diámetro de 0,01 - 10 jm , en particular se prefieren partículas con un diámetro de 0,1 - 1 jm .
El primer componente del sistema formador de señales, cuyos componentes interaccionan de modo que se produce una señal detectable cuando se aproximan espacialmente uno con respecto a otro y debido a ello pueden entrar en interacción entre sí, se ha creado de modo que está asociado o puede asociarse con el primer anticuerpo anti-PF4. El primer componente del sistema formador de señales puede estar asociado directamente con el primer anticuerpo anti-PF4 o puede asociarse. Preferentemente, el primer componente del sistema formador de señales está asociado indirectamente con el primer anticuerpo anti-PF4 o puede asociarse. Para ello, el primer componente del sistema formador de señales está asociado con una fase sólida particular, que adicionalmente está asociado con el primer anticuerpo anti-PF4 de manera covalente o a través de un par de unión X/Y o puede asociarse a través de un par de unión X/Y.
El segundo componente del sistema formador de señales, cuyos componentes interaccionan de modo que se produce una señal detectable cuando se aproximan espacialmente uno con respecto a otro y debido a ello pueden entrar en interacción entre sí, se ha creado de modo que está asociado o puede asociarse con el segundo anticuerpo anti-PF4. El segundo componente del sistema formador de señales puede estar asociado directamente con el segundo anticuerpo anti-PF4 o puede asociarse. Preferentemente, el segundo componente del sistema formador de señales está asociado indirectamente con el segundo anticuerpo anti-PF4 o puede asociarse. Para ello, el segundo componente del sistema formador de señales está asociado con una fase sólida particular, que está asociada adicionalmente con el ligando de manera covalente o a través de un par de unión A/B o puede asociarse a través de un par de unión A/B.
Los "asociados de unión X y Y" o bien los "asociados de unión A y B" son en cada caso dos moléculas distintas, que se reconocen y se unen entre sí de manera específica. Ejemplos de reconocimiento y unión específicos son interacciones de anticuerpo-antígeno, interacciones de polinucleótidos etc.
Los pares de unión X/Y o bien A/B adecuados son sobre todo combinaciones de antígeno/anticuerpo, siendo el asociado de unión X o A un epítopo antigénico del anticuerpo anti-PF4. El epítopo antigénico puede ser un epítopo de secuencia o estructura natural del anticuerpo. El epítopo antigénico puede ser también un epítopo de secuencia o estructura heterólogo de un anticuerpo anti-PF4 modificado. Ejemplos de epítopos de secuencia o estructura heterólogos son etiquetas FLAG o HIS o de fluoresceína, que se usan en particular para la marcación de péptidos o proteínas. Otros pares de unión X/Y o bien A/B adecuados son polinucleótidos complementarios X y Y o bien A y B. Los pares de unión X/Y o bien A/B especialmente preferentes son etiqueta FLAG/anticuerpo anti-etiqueta FLAG, etiqueta de HIS/anticuerpo anti-etiqueta de HIS, fluoresceína/anticuerpo anti-fluoresceína, biotina/avidina y biotina/estreptavidina.
Se encontró que con los ensayos inmunológicos homogéneos descritos puede prescindirse de una etapa de centrifugación para la separación de los trombocitos en la mezcla de reacción. Esto representa una simplificación del desarrollo de procedimiento, de manera que se posibilita una terminación automática del procedimiento en aparatos de análisis usuales. En una forma de realización preferente del procedimiento de acuerdo con la invención, la mezcla de reacción facilitada no se somete a ninguna etapa de centrifugación para la sedimentación o separación de los trombocitos.
Después de que se haya determinado la cantidad de PF4 en la mezcla de reacción, se compara la cantidad de PF4 así determinada con un valor de referencia determinado previamente. Como valor de referencia es adecuada la cantidad de PF4 que se determina (o se ha determinado previamente) con el mismo procedimiento en mezclas de reacción que contienen muestras de líquido corporal de donadores que como es sabido no contienen anticuerpos anti­ complejo de PF4/heparina. Habitualmente, para la determinación de un valor de referencia en una pluralidad de muestras de donadores sanos, que como es sabido no presentan anticuerpos anti-complejo de PF4/heparina, se determina la cantidad de PF4 y entonces se compara con la cantidad de PF4 de una pluralidad de muestras de donadores enfermos con HIT, que presentan anticuerpos anti-complejo de PF4/heparina. Un valor de referencia puede ser, por ejemplo, entonces un valor límite que permite la diferenciación de muestras con y muestras sin anticuerpos anti-complejo de PF4/heparina. Si la cantidad de PF4 determinada en una mezcla de reacción sobrepasa el valor de referencia, esto permite la detección de la presencia de anticuerpos anti-complejo de PF4/heparina en la muestra. Cuando la cantidad de PF4 determinada en la mezcla de reacción, por el contrario, se queda por debajo del valor de referencia, esto permite la detección de la ausencia de anticuerpos anti-complejo de PF4/heparina en la muestra.
Otro objeto de la presente invención es un procedimiento para el diagnóstico de una trombocitopenia inducida por heparina, en el que se detecta con un procedimiento de acuerdo con la invención la presencia de anticuerpos anti­ complejo de PF4/heparina en una muestra de líquido corporal de un paciente.
Aún otro objeto de la presente invención es un kit de ensayo para la realización de un procedimiento de acuerdo con la invención. El kit de ensayo contiene al menos los siguientes componentes:
a. un primer reactivo que contiene trombocitos;
b. un segundo reactivo que contiene un polisacárido no ramificado de unión a PF4 o un polianión de unión a PF4; y
c. uno o varios reactivos para la detección de PF4, en el que al menos un reactivo contiene un anticuerpo anti-PF4.
El reactivo que contiene trombocitos es preferentemente una suspensión de trombocitos humanos lavados y resuspendidos. Los trombocitos proceden preferentemente de uno o varios donadores sanos, que como es sabido no contienen anticuerpos anti-complejo de PF4/heparina. Para la preparación de un reactivo que contiene trombocitos adecuado se centrifugan por ejemplo muestras de sangre total con citrato, a las que se añadieron preferentemente también hirudina, para obtener plasma rico en plaquetas. Al plasma rico en plaquetas se añade otra vez solución de citrato y apirasa, se centrifuga de nuevo, y a continuación se descarta el sobrenadante libre de células. Los trombocitos sedimentados se suspenden finalmente en una solución de suspensión tamponada. Un reactivo que contiene trombocitos adecuado contiene al menos 300 x 109 trombocitos por litro.
El segundo reactivo contiene o bien
• un polisacárido no ramificado de unión a PF4, preferentemente del grupo de heparina, heparina no fraccionada, heparina fraccionada, sulfato de dextrano y fucoidan; o
• un polianión de unión a PF4, preferentemente del grupo de poli(sulfato de vinilo), poli(sulfonato de vinilo), poli(fosfato de vinilo), poli(fosfonato de vinilo), poli(sulfato de estireno) y poli(sulfonato de estireno).
El primer y el segundo reactivo se han previsto para la facilitación de la mezcla de reacción con la muestra de líquido corporal.
El kit de ensayo contiene además uno o varios reactivos para la detección de PF4, en el que al menos un reactivo contiene un anticuerpo anti-PF4. En el caso de un reactivo que contiene un anticuerpo anti-PF4, puede tratarse de un anticuerpo asociado a fase sólida, por ejemplo de un anticuerpo unido a partículas de látex o en la cavidad de una placa de microtitulación. Dependiendo del formato del ensayo, un kit de ensayo contiene componentes adicionales para la detección cuantitativa de PF4 unida a anticuerpos anti-PF4, tal como por ejemplo un reactivo que contiene un anticuerpo secundario marcado con una etiqueta detectable.
Un kit de ensayo preferente contiene un reactivo que contiene un primer anticuerpo anti-PF4 y otro reactivo que contiene un segundo anticuerpo anti-PF4. El primer y/o el segundo anticuerpo anti-PF4 pueden estar asociados con una fase sólida y/o un primer o bien segundo componente de un sistema formador de señales, cuyos componentes interaccionan de modo que se produce una señal detectable cuando se aproximan espacialmente uno con respecto a otro.
Los reactivos de un kit de ensayo de acuerdo con la invención pueden facilitarse en forma líquida o liofilizada. Para el caso de que algunos o todos los reactivos del kit de ensayo se encuentren como liofilizado, puede contener el kit de ensayo adicionalmente los disolventes necesarios para la solución de los liofilizados, tal como por ejemplo agua destilada o tampón adecuado.
Los siguientes ejemplos sirven para la ilustración de la presente invención y no ha de entenderse como limitación.
Ejemplos
Ejemplo 1: Inmunoensayo homogéneo para la detección de anticuerpos anti-complejo de PF4/heparina
La tecnología LOCI® usada en este caso se basa en que un compuesto quimioluminiscente acoplado a partículas de látex (Chemibeads) y un fotosensibilizador acoplado a partículas de látex (Sensibeads) se aproximan espacialmente uno con respecto a otro mediante la unión simultánea a un analito, de modo que el oxígeno singlete, que se genera por el fotosensibilizador, puede excitar el compuesto quimioluminiscente.
Se mezclaron 2 |jl de una muestra de plasma humano, inactivado con calor (a 56 °C, 30 min) con 7,5 |jl de una suspensión que contiene trombocitos humanos, lavados de 6 donadores sanos (aprox. 300 x 109 trombocitos/l) y 10 j l de una solución tampón que contiene 0,2 Ul/ml de heparina y se incubaron a 37 °C. Tras 10 minutos se añadieron a la mezcla de reacción lo siguientes componentes:
• 50 j l de una solución de "Chemibead" que contiene en una solución de tampón partículas de látex, que están revestidas con un compuesto quimioluminiscente (2-(4-(N,N, di-tetradecil)-anilino-3-fenil tioxeno) y un primer anticuerpo anti-PF4 monoclonal (MAK-23/064), que se une a proteína PF4 tanto libre como también complejada, (50 jg/ml);
• 50 j l de una solución de anticuerpo que contiene un segundo anticuerpo anti-PF4 monoclonal biotinilado (MAK-23/074)), que se une a proteína PF4 tanto libre como también complejada (5 jg/ml); y
• 100 j l de una solución "Sensibead" que contiene en una solución de tampón partículas de látex, que están revestidas con un compuesto fotosensibilizador (bis-(trihexil)-silicon-t-butil-ftalocianina) y estreptavidina (50 jg/ml).
Después de aproximadamente 10 minutos se midió la señal de quimioluminiscencia [kcounts].
Con el procedimiento de acuerdo con la invención (a continuación denominado también "liberación de PF4") se midieron muestras de plasma de 10 pacientes con HIT, en los que se había diagnosticado por medio de criterios clínicos (puntuación 4T, en parte con acontecimiento trombótico) una HIT y se había detectado la existencia de anticuerpos anti-complejo de PF4/heparina con dos inmunoensayos independientes, que pueden obtenerse comercialmente (HemosIL® AcuStar HIT-Ab(PF4-H), Instrumentation Laboratories y Asserachrom® HPIA-IgG, Diagnostica Stago).
Con el procedimiento de acuerdo con la invención se midieron además muestras de plasma de 7 donadores sanos (que no presentaban ningún criterio clínico de HIT y tampoco ningún anticuerpo anti-complejo de PF4/heparina) y una combinación de plasma normal (de por ejemplo 20 plasmas de donadores sanos, "FNP").
Como "control del 100 %" para el ensayo de liberación de PF4 se usó en lugar de una muestra de plasma, una solución de anticuerpos que contiene un anticuerpo anti-complejo de PF4/heparina de activación de trombocitos (50 jg/ml) para determinar la descarga de PF4 máxima posible con el reactivo que contiene trombocitos usado. Para la determinación de la descarga de PF4 en % (liberación de PF4 [%]) se relacionaron los valores brutos medidos en kcounts con respecto al valor bruto del control del 100 %.
Las muestras mencionadas se midieron para fines de comparación además con el ensayo de liberación de serotonina [14C] (a continuación denominado también "SRA"), según Sheridan, D. et al. (1986) A diagnostic test for heparininduced thrombocytopenia. Blood 67(1): 27-30, que se aplica como patrón oro.
En la tabla 1 están resumidos los resultados de ensayo.
Tabla 1: Comparación del ensayo de liberación de PF4 de acuerdo con la invención con el ensayo SRA para el diagnóstico de HIT
Figure imgf000007_0001
Se muestra que los resultados del procedimiento de acuerdo con la invención se correlacionan muy bien con los resultados del ensayo de patrón oro de SRA. En todas las mezclas de reacción que contienen muestras de pacientes con HIT puede detectarse una concentración de PF4 elevada significativamente en comparación con donadores sanos. Como valor límite (Cut-Off) para la diferenciación de muestras, que contienen anticuerpos anti-complejo de PF4/heparina, de aquellas que no contienen pudo fijarse un valor de liberación de PF4 de > 15 % o también > 20 % (Cut-Off de ensayo de SRA: > 20 %). Para una fijación estadísticamente más exacta del valor de Cut-Off es necesario sin embargo un número claramente más alto de mediciones de muestras.

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento para la detección de anticuerpos anti-complejo de PF4/heparina en una muestra de líquido corporal, que comprende el procedimiento las etapas:
i. facilitar una mezcla de reacción mediante mezclado de la muestra con un reactivo que contiene trombocitos y con un polisacárido no ramificado, de unión a PF4 o con un polianión de unión a PF4;
ii. incubar la mezcla de reacción; y entonces
iii. determinar la cantidad de PF4 en la mezcla de reacción;
iv. comparar la cantidad así determinada de PF4 en la mezcla de reacción con un valor de referencia predeterminado para la cantidad de PF4 en mezclas de reacción que contienen muestras de líquido corporal de donadores, que como es sabido no contienen anticuerpos anti-complejo de PF4/heparina; y
v. detectar la presencia de anticuerpos anti-complejo de PF4/heparina en la muestra, cuando la cantidad de PF4 determinada en la mezcla de reacción sobrepasa el valor de referencia.
2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el reactivo que contiene trombocitos contiene trombocitos humanos de uno o varios donadores sanos, que como es sabido no contienen anticuerpos anti-complejo de PF4/heparina.
3. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 y 2, en el que para la determinación de la cantidad de PF4 en la mezcla de reacción se lleva a contacto al menos un anticuerpo anti-PF4 con la mezcla de reacción.
4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que
• un primer y un segundo anticuerpo anti-PF4 y
• un primer y un segundo componente de un sistema formador de señales, que interactúan de modo que se produce una señal detectable cuando el primer y el segundo componente del sistema formador de señales se aproximan espacialmente uno con respecto a otro,
se mezclan con la mezcla de reacción y en el que el primer anticuerpo anti-PF4 está asociado con el primer componente del sistema formador de señales o se asocia durante la incubación de la mezcla de reacción y en el que el segundo anticuerpo anti-PF4 está asociado con el segundo componente del sistema formador de señales o se asocia durante la incubación de la mezcla de reacción.
5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el primer y el segundo componente del sistema formador de señales comprenden en cada caso una fase sólida particular, y en el que se mide la aglutinación de las fases sólidas particulares en la mezcla de reacción.
6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el primer componente del sistema formador de señales es un agente quimioluminiscente y el segundo componente del sistema formador de señales es un fotosensibilizador o a la inversa y en el que se mide la quimioluminiscencia en la mezcla de reacción.
7. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 4 a 6, en el que la mezcla de reacción facilitada no se somete a ninguna etapa de centrifugación para la separación de los trombocitos.
8. Procedimiento para el diagnóstico de una trombocitopenia inducida por heparina en el que con un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7 se detecta la presencia de anticuerpos anti-complejo de PF4/heparina en una muestra de líquido corporal de un paciente.
9. Kit de ensayo para la realización de un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8, que contiene los siguientes componentes:
a. un primer reactivo que contiene trombocitos;
b. un segundo reactivo que contiene un polisacárido no ramificado de unión a PF4 o un polianión de unión a PF4; y
c. uno o varios reactivos para la detección de PF4, en el que al menos un reactivo contiene un anticuerpo anti-PF4.
10. Kit de ensayo de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el segundo reactivo
• contiene un polisacárido no ramificado de unión a PF4 del grupo de heparina, heparina no fraccionada, heparina fraccionada, sulfato de dextrano y fucoidan; o ^ contiene un polianión de unión a PF4 del grupo de poli(sulfato de vinilo), poli(sulfonato de vinilo), poli(fosfato de vinilo), poli(fosfonato de vinilo), poli(sulfato de estireno) y poli(sulfonato de estireno).
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