CN111534109A - 一种血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物及其制备方法与应用 - Google Patents

一种血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物及其制备方法与应用。本发明提供了一种血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物，按照包括如下步骤的方法制备得到：将血小板因子4蛋白溶液和所述聚乙烯磺酸盐溶液按照血小板因子4蛋白和聚乙烯磺酸盐摩尔比为1:1至1:50的比例混合后，于2‑8℃搅拌，即得所述血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物。本发明所提供的血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物涉及医用检查检验仪器及服务中的体外诊断用试剂，其物理稳定性和用于检测方面的灵敏度均优于独立的血小板因子4蛋白或者目前常用的血小板因子4蛋白/肝素复合物。本发明使得血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物在医药领域用途更加广泛。

Description

一种血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物及其制备方法与 应用
技术领域
本发明涉及生物医学工程领域，具体涉及一种血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物及其制备方法与应用。
背景技术
血小板因子4(Platelet Factor 4，PF4)属于CXC趋化因子家族，又被称为CXCL4，是一种多功能的分泌型细胞因子。成熟的人PF4蛋白质包含70个氨基酸，单体分子量7.8kDa。PF4的生理功能包括促进凝血与创伤愈合、调节造血功能、免疫调节、抗血管新生等多种生理功能。
临床上，应用肝素治疗后，部分患者会引起肝素诱导血小板减少症(heparin-induced thrombocytopenia，HIT)，HIT是一种特异性药物引起的自身免疫性疾病。目前的发病机制认为，当血循环中出现肝素样化合物时，PF4即以高亲和力与之结合，形成肝素-PF4(H-PF4)复合物。H-PF4复合物形成后，其构象发生改变(在第3、4个半胱氨酸残基间暴露出多个抗原表位，机体内发生免疫反应，产生免疫球蛋白IgG，IgA，IgM)，形成IgG-H-PF4复合物。IgG-H-PF4复合物结合到血小板膜受体上，造成血小板激活及血小板数量下降。血小板广泛激活后，其囊泡内颗粒释放，进而激活凝血系统，凝血酶形成增加。活化的血小板与凝血因子相互作用，最终造成血栓形成。在应用肝素治疗的人群中，HIT的发病率>5％，严重者造成血栓栓塞(心脏栓塞和心肌梗死、肢体血管栓塞和肢体坏死)，死亡率约20-30％。
目前临床尚未形成规范化的HIT诊断和治疗标准。国内临床一般不对血小板减少患者进行相关抗体检测，更不进行血小板功能性测定，造成大量HIT患者难以准确诊断，若误输血小板，可导致严重的动静脉血栓甚至死亡。早期诊断HIT，除密切观察患者临床表现、动态监测血小板数量外，对应用肝素治疗或高度怀疑HIT的患者应进行HIT抗体检测以提供诊断依据。目前HIT抗体相关的检测方法包括功能性测定(检测抗体激活血小板能力)和免疫性测定(检测抗体的滴度、功能性血小板试验包括血小板凝集试验(PAgT)、肝素诱导血小板聚集试验(HIPA)、14C血清素释放试验(SRA)等)。免疫学检测主要包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)、膜吸附酶联免疫滤过测定法(ELIFA)和流式细胞仪测定等。目前西方国家采用的HIT抗体检测试剂主要为ELISA方法，该方法在国外临床筛查中非常普及，但由于需要专业的检测人员，操作复杂，耗费时间长，阳性预测值不高。因此，目前尚缺乏一种实用、简便、快捷、廉价的检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物及其制备方法与应用。
第一方面，本发明要求保护一种血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物。
本发明所要求保护的复合物可按照包括如下步骤的方法制备得到：将血小板因子4蛋白溶液和所述聚乙烯磺酸盐溶液按照血小板因子4蛋白和聚乙烯磺酸盐摩尔比为1:1至1:50的比例混合后，于2-8℃搅拌，即得所述血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物。
进一步地，将所述血小板因子4蛋白溶液和所述聚乙烯磺酸盐溶液按照血小板因子4蛋白和聚乙烯磺酸盐摩尔比为1:2至1:5的比例混合。
在本发明的一个实施例中，具体是将所述血小板因子4蛋白溶液和所述聚乙烯磺酸盐溶液按照血小板因子4蛋白和聚乙烯磺酸盐的摩尔比为1:2的比例混合的。
进一步地，所述聚乙烯磺酸盐的分子量范围可为3000-15000。
更进一步地，所述聚乙烯磺酸盐的分子量范围可为5000-10000。
在本发明的一个实施例中，所述聚乙烯磺酸盐的分子量为5000。
进一步地，所述搅拌的时间为1-2h(如2h)。
进一步地，所述血小板因子4蛋白溶液中除了血小板因子4蛋白外的组分为pH 7.5的缓冲液。所述聚乙烯磺酸盐溶液的容积可为水。
在本发明的具体实施方式中，所述pH7.5的缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度如下：20mmol/L磷酸二氢钠、150mmol/L氯化钠。
在所述方法中，所述血小板因子4蛋白溶液和所述聚乙烯磺酸盐溶液可为等体积混合。
进一步地，所述血小板因子4蛋白溶液中血小板因子4蛋白的浓度可为20μmol/L(约0.6mg/mL)。
在本发明的具体实施方式中，所述聚乙烯磺酸盐具体为聚乙烯磺酸钠。
在本发明，所述血小板因子4蛋白可为商业化产品，可通过人血小板获取，也可由基因工程方法获取。
第二方面，本发明要求保护含有前文所述血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物的制备方法。
第三方面，本发明要求保护含有前文所述血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物的试剂盒。
进一步地，所述试剂盒中还可含有能够与血小板因子4蛋白/肝素复合物抗体特异性结合的酶标二抗和ELISA试剂(如包被液、封闭液、洗涤液、底物显色液和终止液等)。
第四方面，本发明要求保护前文所述的血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物或前文所述的试剂盒在如下任一中的应用：
(A1)制备用于检测血小板因子4蛋白/肝素复合物抗体的产品，或检测血小板因子4蛋白/肝素复合物抗体；
(A2)制备用于诊断或辅助诊断肝素诱导血小板减少症(heparin-inducedthrombocytopenia，HIT)的产品。
在(A1)中，所述检测血小板因子4蛋白/肝素复合物抗体可为非疾病诊断性应用。
本发明所提供的血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物涉及医用检查检验仪器及服务中的体外诊断用试剂，其物理稳定性和用于检测方面的灵敏度均优于独立的血小板因子4蛋白或者目前常用的血小板因子4蛋白/肝素复合物。本发明使得血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物在医药领域用途更加广泛。
附图说明
图1为血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物最佳摩尔比检测。
图2为聚乙烯磺酸钠分子量范围测试实验。
图3为血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物稳定性实验。#表示与PF4组相比P<0.05。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物最佳摩尔比实验
1、血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物的制备
使用缓冲液(溶剂为水，溶质及浓度如下：20mmol/L磷酸二氢钠、150mmol/L氯化钠，pH 7.5)将血小板因子4蛋白(北京舜雷科技有限公司，SL29-001)稀释到20μmol/L(约0.6mg/mL)，分别加入等体积按血小板因子4蛋白与聚乙烯磺酸钠的摩尔比(1:1、1:2、1:5、1:10、1:20、1:50、1:100)配制好的聚乙烯磺酸钠(河南天赋化工有限公司，9002-97-5，平均分子量为5000)水溶液，4℃混匀搅拌2小时，即得血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物。
2、酶联免疫法检测血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物反应性
(1)使用缓冲液(溶剂为水，溶质及浓度如下：20mmol/L磷酸二氢钠、150mmol/L氯化钠，pH 7.5)将血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物稀释约至50μg/mL(以血小板因子4蛋白量计)；
(2)以100μL/孔包被96孔板，4℃，过夜；
(3)用洗涤液(北京舜雷科技有限公司，SL15372)洗涤4次；
(4)每孔加入200μL封闭液(北京舜雷科技有限公司，SL15370)，37℃封闭2小时；
(5)用洗涤液(北京舜雷科技有限公司，SL15372)洗涤3次；
(6)干燥分装，2-8℃保存，待用；
(7)向各加样孔中加入100μL阳性标准品(含血小板因子4蛋白/肝素复合物抗体的血清)室温孵育1小时；
(8)用洗涤液(北京舜雷科技有限公司，SL15372)洗涤4次；
(9)向各加样孔中加入100μL酶标抗体(北京舜雷科技有限公司，SL15373)室温孵育30min；
(10)用洗涤液(北京舜雷科技有限公司，SL15372)洗涤4次；
(11)向各加样孔中加入100μL底物显色液(北京舜雷科技有限公司，SL15374)室温避光孵育15min；
(12)向各加样孔中加入50μL终止液(北京舜雷科技有限公司，SL15371)；
(13)在酶标仪上使用450nm波长进行测定，参比波长为630nm。
3、结果及分析
结果见图1。可见：血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物在摩尔比为1:1-1:50的情况下可以满足要求，最佳摩尔比为1:2-1:5。
实施例2、聚乙烯磺酸钠分子量范围测试实验
1、血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物的制备
使用缓冲液(溶剂为水，溶质及浓度如下：20mmol/L磷酸二氢钠、150mmol/L氯化钠，pH 7.5)将血小板因子4蛋白(北京舜雷科技有限公司，SL29-001)稀释到20μmol/L(约0.6mg/mL)，按照血小板因子4蛋白与聚乙烯磺酸钠的摩尔比1:2分别加入等体积不同平均分子量(1000、3000、5000、7000、10000、15000、20000)的聚乙烯磺酸钠(河南天赋化工有限公司，9002-97-5)水溶液，4℃混匀搅拌2小时，即得血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物。
2、酶联免疫法检测血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物反应性
(1)使用缓冲液(溶剂为水，溶质及浓度如下：20mmol/L磷酸二氢钠、150mmol/L氯化钠，pH 7.5)将血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物稀释约至50μg/mL(以血小板因子4蛋白量计)；
(2)以100μL/孔包被96孔板，4℃，过夜；
(3)用洗涤液(北京舜雷科技有限公司，SL15372)洗涤4次；
(4)每孔加入200μL封闭液(北京舜雷科技有限公司，SL15370)，37℃封闭2小时；
(5)用洗涤液(北京舜雷科技有限公司，SL15372)洗涤3次；
(6)干燥分装，2-8℃保存，待用；
(7)向各加样孔中加入100μL阳性标准品(含血小板因子4蛋白/肝素复合物抗体的血清)室温孵育1小时；
(8)用洗涤液(北京舜雷科技有限公司，SL15372)洗涤4次；
(9)向各加样孔中加入100μL酶标抗体(北京舜雷科技有限公司，SL15373)室温孵育30min；
(10)用洗涤液(北京舜雷科技有限公司，SL15372)洗涤4次；
(11)向各加样孔中加入100μL底物显色液(北京舜雷科技有限公司，SL15374)室温避光孵育15min；
(12)向各加样孔中加入50μL终止液(北京舜雷科技有限公司，SL15371)；
(13)在酶标仪上使用450nm波长进行测定，参比波长为630nm。
3、结果
结果见图2。可见：血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物中聚乙烯磺酸钠分子量范围在3000-15000可以满足要求，最优选5000-10000。
实施例3、血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物稳定性实验
1、血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物的制备
使用缓冲液(溶剂为水，溶质及浓度如下：20mmol/L磷酸二氢钠、150mmol/L氯化钠，pH 7.5)将血小板因子4蛋白(北京舜雷科技有限公司，SL29-001)稀释到20μmol/L(约0.6mg/mL)，按照血小板因子4蛋白与聚乙烯磺酸钠的摩尔比1:2分别加入等体积的聚乙烯磺酸钠(河南天赋化工有限公司，9002-97-5，平均分子量5000)水溶液，4℃混匀搅拌2小时，即得血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物。
2、血小板因子4蛋白/肝素复合物的制备
使用缓冲液(溶剂为水，溶质及浓度如下：20mmol/L磷酸二氢钠、150mmol/L氯化钠，pH 7.5)将血小板因子4蛋白(北京舜雷科技有限公司，SL29-001)稀释到20μmol/L(约0.6mg/mL)，加入等体积30U/mL的肝素注射液(杭州九源基因工程有限公司，0.5mL:5000IU)水溶液，4℃混匀搅拌2小时，即得血小板因子4蛋白/肝素复合物。
3、将血小板因子4蛋白、血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物(步骤1制备)和血小板因子4蛋白/肝素复合物(步骤2制备)分别在-20℃冰箱中进行3次冻融处理，将处理后的样品进行测试。
4、酶联免疫法检测冻融后样品的反应性：
(1)使用缓冲液(溶剂为水，溶质及浓度如下：20mmol/L磷酸二氢钠、150mmol/L氯化钠，pH 7.5)分别将步骤3冻融后的血小板因子4蛋白、血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物和血小板因子4蛋白/肝素复合物稀释约至50μg/mL(以血小板因子4蛋白量计)；
(2)以100μL/孔包被96孔板，4℃，过夜；
(3)用洗涤液(北京舜雷科技有限公司，SL15372)洗涤4次；
(4)每孔加入200μL封闭液(北京舜雷科技有限公司，SL15370)，37℃封闭2小时；
(5)用洗涤液(北京舜雷科技有限公司，SL15372)洗涤3次；
(6)干燥分装，2-8℃保存，待用；
(7)向各加样孔中加入100μL阳性标准品(含血小板因子4蛋白/肝素复合物抗体的血清)室温孵育1小时；
(8)用洗涤液(北京舜雷科技有限公司，SL15372)洗涤4次；
(9)向各加样孔中加入100μL酶标抗体(北京舜雷科技有限公司，SL15373)室温孵育30min；
(10)用洗涤液(北京舜雷科技有限公司，SL15372)洗涤4次；
(11)向各加样孔中加入100μL底物显色液(北京舜雷科技有限公司，SL15374)室温避光孵育15min；
(12)向各加样孔中加入50μL终止液(北京舜雷科技有限公司，SL15371)；
(13)在酶标仪上使用450nm波长进行测定，参比波长为630nm。
5、结果及分析
结果见图3。可见：血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物在冻融稳定性方面优于血小板因子4蛋白和血小板因子4蛋白/肝素复合物(P<0.05)。在商业化生产中，原料一次性使用不完，会经常冻融使用，因此，血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物冻融稳定非常重要。
实施例4、血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物灵敏度实验
1、血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物的制备
使用缓冲液(溶剂为水，溶质及浓度如下：20mmol/L磷酸二氢钠、150mmol/L氯化钠，pH 7.5)将血小板因子4蛋白(北京舜雷科技有限公司，SL29-001)稀释到20μmol/L(约0.6mg/mL)，按照血小板因子4蛋白与聚乙烯磺酸钠的摩尔比1:2分别加入等体积的聚乙烯磺酸钠(河南天赋化工有限公司，9002-97-5，平均分子量5000)水溶液，4℃混匀搅拌2小时，即得血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物。
2、血小板因子4蛋白/肝素复合物的制备
使用缓冲液(溶剂为水，溶质及浓度如下：20mmol/L磷酸二氢钠、150mmol/L氯化钠，pH 7.5)将血小板因子4蛋白(北京舜雷科技有限公司，SL29-001)稀释到20μmol/L(约0.6mg/mL)，加入等体积30U/ml的肝素注射液(杭州九源基因工程有限公司，0.5mL:5000IU)水溶液，4℃混匀搅拌2小时，即得血小板因子4蛋白/肝素复合物。
3、酶联免疫法检测血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物和血小板因子4蛋白/肝素复合物的灵敏度
(1)使用缓冲液(20mmol/L磷酸二氢钠、150mmol/L氯化钠，pH 7.5)分别将血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物和血小板因子4蛋白/肝素复合物稀释约至50μg/mL(以血小板因子4蛋白量计)；
(2)以100μL/孔包被96孔板，4℃，过夜；
(3)用洗涤液(北京舜雷科技有限公司，SL15372)洗涤4次；
(4)每孔加入200μL封闭液(北京舜雷科技有限公司，SL15370)，37℃封闭2小时；
(5)用洗涤液(北京舜雷科技有限公司，SL15372)洗涤3次；
(6)干燥分装，2-8℃保存，待用；
(7)向各加样孔中分别加入20份100μL阳性标准品(含血小板因子4蛋白/肝素复合物抗体的血清)室温孵育1小时；
(8)用洗涤液(北京舜雷科技有限公司，SL15372)洗涤4次；
(9)向各加样孔中加入100μL酶标抗体(北京舜雷科技有限公司，SL15373)室温孵育30min；
(10)用洗涤液(北京舜雷科技有限公司，SL15372)洗涤4次；
(11)向各加样孔中加入100μL底物显色液(北京舜雷科技有限公司，SL15374)室温避光孵育15min；
(12)向各加样孔中加入50μL终止液(北京舜雷科技有限公司，SL15371)；
(13)在酶标仪上使用450nm波长进行测定，参比波长为630nm。
4、结果及分析
结果见表1。可见：血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物在进行临床阳性样本检出率优于血小板因子4蛋白/肝素复合物，灵敏度优于血小板因子4蛋白/肝素复合物。
表1血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物灵敏度实验
Figure BDA0002484015080000081

Claims (10)

1.一种血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物，按照包括如下步骤的方法制备得到：将血小板因子4蛋白溶液和所述聚乙烯磺酸盐溶液按照血小板因子4蛋白和聚乙烯磺酸盐摩尔比为1:1至1:50的比例混合后，于2-8℃搅拌，即得所述血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物。
2.根据权利要求1所述的血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物，其特征在于：将所述血小板因子4蛋白溶液和所述聚乙烯磺酸盐溶液按照血小板因子4蛋白和聚乙烯磺酸盐摩尔比为1:2至1:5的比例混合。
3.根据权利要求1或2所述的血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物，其特征在于：所述聚乙烯磺酸盐的分子量范围为3000-15000。
4.根据权利要求3所述的血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物，其特征在于：所述聚乙烯磺酸盐的分子量范围为5000-10000。
5.根据权利要求1-4中任一所述的血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物，其特征在于：所述搅拌的时间为1-2h。
6.根据权利要求1-5中任一所述的血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物，其特征在于：所述聚乙烯磺酸盐为聚乙烯磺酸钠。
7.权利要求1-6任一中所述的血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物的制备方法。
8.含有权利要求1-6中任一所述的血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物的试剂盒。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有能够与血小板因子4蛋白/肝素复合物抗体特异性结合的酶标二抗和ELISA试剂。
10.权利要求1-6中任一所述的血小板因子4蛋白/聚乙烯磺酸复合物或权利要求8或9所述的试剂盒在如下任一中的应用：
(A1)制备用于检测血小板因子4蛋白/肝素复合物抗体的产品，或检测血小板因子4蛋白/肝素复合物抗体；
(A2)制备用于诊断或辅助诊断肝素诱导血小板减少症的产品。
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