CN111693719A - 一种肌红蛋白测定试剂盒及其测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肌红蛋白测定试剂盒,其原料按重量份数如下:包括R1试剂、R2试剂和胶乳与抗体的偶联剂。本发明严格控制该肌红蛋白测定试剂盒及其测定方法,通过严格控制肌红蛋白测定试剂盒的各组份的占比以及制备工艺参数,通过生物素亲和素系统,肌红蛋白抗体与胶乳微球的偶联效率提高了四倍左右,检测灵敏度同时也提高了四倍左右;通过选择更大粒径的胶乳微球,检测灵敏度也得到了提高;大分子量聚乙二醇或其他具有更高促聚效果的促聚剂的使用,同样提高了检测灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及肌红蛋白测定技术领域,具体为一种肌红蛋白测定试剂盒,同时本发明还涉及一种肌红蛋白测定试剂盒的测定方法。
背景技术
肌红蛋白(Mb)是一种氧结合血红素蛋白,分子量为17800道尔顿,主要分布于心肌和骨骼肌组织,此储氧色素对于高水平的氧化磷酸化是必需的。它位于细胞浆,约占肌肉蛋白总量的2%。在急性心梗(AMI)时,心肌细胞坏死,Mb释放入血液中。在症状出现约2~3小时后,血中Mb超出正常上限,9~10小时达到峰值,24~36小时后恢复正常。Mb在急性心梗早期诊断和监测中可以及时的为临床提供依据。
目前,肌红蛋白测定试剂盒均由R1和R2双试剂组成。R1为缓冲液,大部分采用聚乙二醇作为促聚剂,另外还有一定量的吐温20等表面活性剂及防腐剂;R2为胶乳试剂,主要成分为胶乳颗粒与肌红蛋白抗体的偶联物,另外还有一定量的蛋白保护剂和防腐剂。
试验时,全自动生化仪按照设定的程序先将R1和样品加入生化仪的比色杯中,样品和R1在比色杯中37℃孵育一定时间后,加入R2试剂并开始测试吸光度值A1,一定时间后测试吸光度值A2,计算吸光度差值ΔA=A2-A1。通过校准品定标可以得出ΔA与浓度的关系式,即可进行肌红蛋白的定量测定。
现有技术的缺点:现有的肌红蛋白测定试剂盒检测灵敏度较低,与化学发光法试剂对比,临床标本的符合率不足。
目前,由于方法学的局限性,免疫比浊法试剂检测灵敏度达不到化学发光法的水平,但检测的目的是为了临床需要。所以,如果能通过一定的方法使免疫比浊法试剂的临床符合率达到化学发光法的水平,即能满足临床需要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肌红蛋白测定试剂盒及其测定方法,以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:一种肌红蛋白测定试剂盒,其原料按重量份数如下:包括R1试剂、R2试剂和胶乳与抗体的偶联剂。
本发明还提供一种肌红蛋白测定试剂盒的测定方法,包括以下步骤:
S1:将羧基胶乳微球用PBS缓冲液稀释至5-500mM浓度,羧基胶乳微球的粒径为150-400nm;
S2:按一定比例加入现配现用的EDC溶液,室温活化0.4-0.6小时,离心,弃掉上清液,用PBS缓冲液将沉淀复溶至S1中的浓度;
S3:按比例加入亲和素,室温活化8-12小时,离心,弃掉上清液,用PBS缓冲液将沉淀复溶至S1的液体浓度;
S4:将肌红蛋白抗体用PBS缓冲液稀释至5-500mM浓度,备用;
S5:在步骤S4的试剂中按比例加入NHS溶液,室温活化0.4-0.6h,再次按比例加入生物素,室温活化1.5-2.5小时,离心,弃掉上清液,用PBS缓冲液将沉淀复溶至S4的液体浓度;
S6:将S3中的液体和S5中的液体进行混合,室温活化1.5-2.5小时,离心,弃掉上清液,用Tris缓冲液复溶至S1中的羧基胶乳微球浓度,即得胶乳与抗体的偶联物;
S7:称取配制体积75-85%的纯化水,并称量体积3-5%Tris缓冲液、体积3-5%氯化镁、体积3-5%聚乙二醇、体积3-5%吐温20、体积3-5%蛋白保护剂和体积3-5%防腐剂物料,依次加入纯水中搅拌溶解并混匀;
S8:调节pH至6-8,补充纯水至S7中的配制体积,即得R1试剂;
S9:称取配制体积75-85%的纯化水,并称量体积4-7%Tris缓冲液、体积4-7%吐温20、体积4-7%蛋白保护剂和体积4-7%防腐剂,依次加入纯水中搅拌溶解并混匀;
S10:调节S9中的pH至6-8,并补充纯水至S9中的配制体积,按比例加入S6中制备的胶乳与抗体的偶联物,即得R2试剂;
S11:将S8中的R1试剂和S10中的R2试剂进行混合反应,形成的可溶性免疫复合物在缓冲液体系中的促聚剂的作用下,形成微粒,使反应液出现浊度,当抗体浓度固定时,形成的免疫复合物的量随着样本中抗原量的增加而增加,反应液的浊度也随之增加;
S12:通过测定反应液的浊度与一系列标准品对照,即可计算出样本中抗原的含量。
优选的,所述PBS缓冲液也可以为MES缓冲液和CB缓冲液中的任意一种。
优选的,所述Tris缓冲液也可以为MES缓冲液和CB缓冲液中的任意一种。
优选的,所述步骤S7中的聚乙二醇也可以为聚乙二醇8000和聚乙二醇10000中的任意一种。
优选的,所述PBS缓冲液和Tris缓冲液的浓度在5-500mM。
优选的,所述吐温20也可以为吐温80和Triton X100中的任意一种。
优选的,所述蛋白保护剂为牛血清白蛋白,所述防腐剂为ProClin300,所述防腐剂也可以为叠氮钠和硫柳汞中的任意一种。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:本发明严格控制该肌红蛋白测定试剂盒及其测定方法,通过严格控制肌红蛋白测定试剂盒的各组份的占比以及制备工艺参数,通过生物素亲和素系统,肌红蛋白抗体与胶乳微球的偶联效率提高了四倍左右,检测灵敏度同时也提高了四倍左右;通过选择更大粒径的胶乳微球,检测灵敏度也得到了提高;大分子量聚乙二醇或其他具有更高促聚效果的促聚剂的使用,同样提高了检测灵敏度。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合具体实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
实施例1
一种肌红蛋白测定试剂盒,其原料按重量份数如下:包括R1试剂、R2试剂和胶乳与抗体的偶联剂。
本发明还提供一种肌红蛋白测定试剂盒的测定方法,包括以下步骤:
S1:将羧基胶乳微球用PBS缓冲液稀释至5mM浓度,羧基胶乳微球的粒径为150nm;
S2:按比例加入现配现用的EDC溶液,室温活化0.4小时,离心,弃掉上清液,用PBS缓冲液将沉淀复溶至S1中的浓度;
S3:按比例加入亲和素,室温活化8小时,离心,弃掉上清液,用PBS缓冲液将沉淀复溶至S1的液体浓度;
S4:将肌红蛋白抗体用PBS缓冲液稀释至5mM浓度,备用;
S5:在步骤S4的试剂中按比例加入NHS溶液,室温活化0.4h,再次按比例加入生物素,室温活化1.5小时,离心,弃掉上清液,用PBS缓冲液将沉淀复溶至S4的液体浓度;
S6:将S3中的液体和S5中的液体进行混合,室温活化1.5小时,离心,弃掉上清液,用Tris缓冲液复溶至S1中的羧基胶乳微球浓度,即得胶乳与抗体的偶联物;
S7:称取配制体积75%的纯化水,并称量体积4%Tris缓冲液、体积4%氯化镁、体积4%聚乙二醇、体积4%吐温20、体积4%蛋白保护剂和体积5%防腐剂物料,依次加入纯水中搅拌溶解并混匀;
S8:调节pH至至6,补充纯水至S7中的配制体积,即得R1试剂;
S9:称取配制体积75%的纯化水,并称量体积4%Tris缓冲液、体积4%吐温20、体积4%蛋白保护剂和体积5%防腐剂,依次加入纯水中搅拌溶解并混匀;
S10:调节S9中的pH至6,并补充纯水至S9中的配制体积,按比例加入S6中制备的胶乳与抗体的偶联物,即得R2试剂;
S11:将S8中的R1试剂和S10中的R2试剂进行混合反应,形成的可溶性免疫复合物在缓冲液体系中的促聚剂的作用下,形成微粒,使反应液出现浊度,当抗体浓度固定时,形成的免疫复合物的量随着样本中抗原量的增加而增加,反应液的浊度也随之增加;
S12:通过测定反应液的浊度与一系列标准品对照,即可计算出样本中抗原的含量。
所述PBS缓冲液也可以为MES缓冲液和CB缓冲液中的任意一种,所述Tris缓冲液也可以为MES缓冲液和CB缓冲液中的任意一种,所述步骤S7中的聚乙二醇也可以为聚乙二醇8000和聚乙二醇10000中的任意一种,所述PBS缓冲液和Tris缓冲液的浓度在5-500mM,所述吐温20也可以为吐温80和Triton X100中的任意一种,所述蛋白保护剂为牛血清白蛋白,所述防腐剂为ProClin300,所述防腐剂也可以为叠氮钠和硫柳汞中的任意一种。
实施例2
一种肌红蛋白测定试剂盒,其原料按重量份数如下:包括R1试剂、R2试剂和胶乳与抗体的偶联剂。
本发明还提供一种肌红蛋白测定试剂盒的测定方法,包括以下步骤:
S1:将羧基胶乳微球用PBS缓冲液稀释至250mM浓度,羧基胶乳微球的粒径为275nm;
S2:按比例加入现配现用的EDC溶液,室温活化0.5小时,离心,弃掉上清液,用PBS缓冲液将沉淀复溶至S1中的浓度;
S3:按比例加入亲和素,室温活化10小时,离心,弃掉上清液,用PBS缓冲液将沉淀复溶至S1的液体浓度;
S4:将肌红蛋白抗体用PBS缓冲液稀释至250mM浓度,备用;
S5:在步骤S4的试剂中按比例加入NHS溶液,室温活化0.5h,再次按比例加入生物素,室温活化2小时,离心,弃掉上清液,用PBS缓冲液将沉淀复溶至S4的液体浓度;
S6:将S3中的液体和S5中的液体进行混合,室温活化2小时,离心,弃掉上清液,用Tris缓冲液复溶至S1中的羧基胶乳微球浓度,即得胶乳与抗体的偶联物;
S7:称取配制体积80%的纯化水,并称量体积3%Tris缓冲液、体积3%氯化镁、体积3%聚乙二醇、体积3%吐温20、体积4%蛋白保护剂和体积4%防腐剂物料,依次加入纯水中搅拌溶解并混匀;
S8:调节pH至7,补充纯水至S7中的配制体积,即得R1试剂;
S9:称取配制体积80%的纯化水,并称量体积5%Tris缓冲液、体积5%吐温20、体积5%蛋白保护剂和体积5%防腐剂,依次加入纯水中搅拌溶解并混匀;
S10:调节S9中的pH至7,并补充纯水至S9中的配制体积,按比例加入S6中制备的胶乳与抗体的偶联物,即得R2试剂;
S11:将S8中的R1试剂和S10中的R2试剂进行混合反应,形成的可溶性免疫复合物在缓冲液体系中的促聚剂的作用下,形成微粒,使反应液出现浊度,当抗体浓度固定时,形成的免疫复合物的量随着样本中抗原量的增加而增加,反应液的浊度也随之增加;
S12:通过测定反应液的浊度与一系列标准品对照,即可计算出样本中抗原的含量。
所述PBS缓冲液也可以为MES缓冲液和CB缓冲液中的任意一种,所述Tris缓冲液也可以为MES缓冲液和CB缓冲液中的任意一种,所述步骤S7中的聚乙二醇也可以为聚乙二醇8000和聚乙二醇10000中的任意一种,所述PBS缓冲液和Tris缓冲液的浓度在5-500mM,所述吐温20也可以为吐温80和Triton X100中的任意一种,所述蛋白保护剂为牛血清白蛋白,所述防腐剂为ProClin300,所述防腐剂也可以为叠氮钠和硫柳汞中的任意一种。
实施例3
一种肌红蛋白测定试剂盒,其原料按重量份数如下:包括R1试剂、R2试剂和胶乳与抗体的偶联剂。
本发明还提供一种肌红蛋白测定试剂盒的测定方法,包括以下步骤:
S1:将羧基胶乳微球用PBS缓冲液稀释至500mM浓度,羧基胶乳微球的粒径为400nm;
S2:按比例加入现配现用的EDC溶液,室温活化0.6小时,离心,弃掉上清液,用PBS缓冲液将沉淀复溶至S1中的浓度;
S3:按比例加入亲和素,室温活化12小时,离心,弃掉上清液,用PBS缓冲液将沉淀复溶至S1的液体浓度;
S4:将肌红蛋白抗体用PBS缓冲液稀释至500mM浓度,备用;
S5:在步骤S4的试剂中按比例加入NHS溶液,室温活化0.6h,再次按比例加入生物素,室温活化2.5小时,离心,弃掉上清液,用PBS缓冲液将沉淀复溶至S4的液体浓度;
S6:将S3中的液体和S5中的液体进行混合,室温活化2.5小时,离心,弃掉上清液,用Tris缓冲液复溶至S1中的羧基胶乳微球浓度,即得胶乳与抗体的偶联物;
S7:称取配制体积82%的纯化水,并称量体积3%Tris缓冲液、体积3%氯化镁、体积3%聚乙二醇、体积3%吐温20、体积3%蛋白保护剂和体积3%防腐剂物料,依次加入纯水中搅拌溶解并混匀;
S8:调节pH至8,补充纯水至S7中的配制体积,即得R1试剂;
S9:称取配制体积82%的纯化水,并称量体积4%Tris缓冲液、体积4%吐温20、体积5%蛋白保护剂和体积5%防腐剂,依次加入纯水中搅拌溶解并混匀;
S10:调节S9中的pH至8,并补充纯水至S9中的配制体积,按比例加入S6中制备的胶乳与抗体的偶联物,即得R2试剂;
S11:将S8中的R1试剂和S10中的R2试剂进行混合反应,形成的可溶性免疫复合物在缓冲液体系中的促聚剂的作用下,形成微粒,使反应液出现浊度,当抗体浓度固定时,形成的免疫复合物的量随着样本中抗原量的增加而增加,反应液的浊度也随之增加;
S12:通过测定反应液的浊度与一系列标准品对照,即可计算出样本中抗原的含量。
所述PBS缓冲液也可以为MES缓冲液和CB缓冲液中的任意一种,所述Tris缓冲液也可以为MES缓冲液和CB缓冲液中的任意一种,所述步骤S7中的聚乙二醇也可以为聚乙二醇8000和聚乙二醇10000中的任意一种,所述PBS缓冲液和Tris缓冲液的浓度在5-500mM,所述吐温20也可以为吐温80和Triton X100中的任意一种,所述蛋白保护剂为牛血清白蛋白,所述防腐剂为ProClin300,所述防腐剂也可以为叠氮钠和硫柳汞中的任意一种。
本发明提供的一种肌红蛋白测定试剂盒的测定方法中,采用的物料种类多样,替代物料和原物料种类如下表:
综上所述:本发明严格控制该肌红蛋白测定试剂盒及其测定方法,通过严格控制肌红蛋白测定试剂盒的各组份的占比以及制备工艺参数,通过生物素亲和素系统,肌红蛋白抗体与胶乳微球的偶联效率提高了四倍左右,检测灵敏度同时也提高了四倍左右;通过选择更大粒径的胶乳微球,检测灵敏度也得到了提高;大分子量聚乙二醇或其他具有更高促聚效果的促聚剂的使用,同样提高了检测灵敏度。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种肌红蛋白测定试剂盒,其特征在于:其原料按重量份数如下:包括R1试剂、R2试剂和胶乳与抗体的偶联剂。
2.一种根据权利要求1所述的肌红蛋白测定试剂盒的测定方法,其特征在于:包括以下步骤:
S1:将羧基胶乳微球用PBS缓冲液稀释至5-500mM浓度,羧基胶乳微球的粒径为150-400nm;
S2:按一定比例加入现配现用的EDC溶液,室温活化0.4-0.6小时,离心,弃掉上清液,用PBS缓冲液将沉淀复溶至S1中的浓度;
S3:按比例加入亲和素,室温活化8-12小时,离心,弃掉上清液,用PBS缓冲液将沉淀复溶至S1的液体浓度;
S4:将肌红蛋白抗体用PBS缓冲液稀释至5-500mM浓度,备用;
S5:在步骤S4的试剂中按比例加入NHS溶液,室温活化0.4-0.6h,再次按一定比例加入生物素,室温活化1.5-2.5小时,离心,弃掉上清液,用PBS缓冲液将沉淀复溶至S4的液体浓度;
S6:将S3中的液体和S5中的液体进行混合,室温活化1.5-2.5小时,离心,弃掉上清液,用Tris缓冲液复溶至S1中的羧基胶乳微球浓度,即得胶乳与抗体的偶联物;
S7:称取配制体积75-85%的纯化水,并称量体积3-5%Tris缓冲液、体积3-5%氯化镁、体积3-5%聚乙二醇、体积3-5%吐温20、体积3-5%蛋白保护剂和体积3-5%防腐剂物料,依次加入纯水中搅拌溶解并混匀;
S8:调节pH至至6-8,补充纯水至S7中的配制体积,即得R1试剂;
S9:称取配制体积75-85%的纯化水,并称量体积4-7%Tris缓冲液、体积4-7%吐温20、体积4-7%蛋白保护剂和体积4-7%防腐剂,依次加入纯水中搅拌溶解并混匀;
S10:调节S9中的pH至6-8,并补充纯水至S9中的配制体积,按比例1∶1加入S6中制备的胶乳与抗体的偶联物,即得R2试剂;
S11:将S8中的R1试剂和S10中的R2试剂进行混合反应,形成的可溶性免疫复合物在缓冲液体系中的促聚剂的作用下,形成微粒,使反应液出现浊度,当抗体浓度固定时,形成的免疫复合物的量随着样本中抗原量的增加而增加,反应液的浊度也随之增加;
S12:通过测定反应液的浊度与一系列标准品对照,即可计算出样本中抗原的含量。
3.根据权利要求2所述的一种肌红蛋白测定试剂盒的测定方法,其特征在于:所述PBS缓冲液也可以为MES缓冲液和CB缓冲液中的任意一种。
4.根据权利要求2所述的一种肌红蛋白测定试剂盒的测定方法,其特征在于:所述Tris缓冲液也可以为MES缓冲液和CB缓冲液中的任意一种。
5.根据权利要求2所述的一种肌红蛋白测定试剂盒的测定方法,其特征在于:所述步骤S7中的聚乙二醇也可以为聚乙二醇8000和聚乙二醇10000中的任意一种。
6.根据权利要求2所述的一种肌红蛋白测定试剂盒的测定方法,其特征在于:所述PBS缓冲液和Tris缓冲液的浓度在5-500mM。
7.根据权利要求2所述的一种肌红蛋白测定试剂盒的测定方法,其特征在于:所述吐温20也可以为吐温80和Triton X100中的任意一种。
8.根据权利要求2所述的一种肌红蛋白测定试剂盒的测定方法,其特征在于:所述蛋白保护剂为牛血清白蛋白,所述防腐剂为ProClin300,所述防腐剂也可以为叠氮钠和硫柳汞中的任意一种。
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