CN110907641B

CN110907641B - 一种透明质酸检测试剂盒及检测方法

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Publication number: CN110907641B
Application number: CN201911308600.3A
Authority: CN
Inventors: 谢茜; 尹伊; 许可
Original assignee: Autobio Diagnostics Co Ltd
Current assignee: Autobio Diagnostics Co Ltd
Priority date: 2019-12-18
Filing date: 2019-12-18
Publication date: 2022-05-03
Anticipated expiration: 2039-12-18
Also published as: CN110907641A

Abstract

本发明涉及医学分析技术领域，具体涉及一种透明质酸检测试剂盒及检测方法。该试剂盒包括结合HA衍生物的固相载体，HA结合蛋白，酶标记的HA结合蛋白抗体；所述HA衍生物由HA的末端与偶联蛋白偶联而成。本发明试剂盒准确性好、灵敏度高、特异性好、检测速度快，40分钟可出结果。本发明试剂盒与肝活检结果符合度极高，克服了放免试剂和酶免试剂的诸多不足，适于在产业上有效地推广应用，同时稳定性好，2‑8℃可稳定存放一年。

Description

一种透明质酸检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及医学分析技术领域，具体涉及一种透明质酸检测试剂盒及检测方法。

背景技术

透明质酸(HA)广泛分布于细胞外间隙，是由重复的二糖单位组成的线状多聚体，分子量为10～10000kD。

HA主要由组织中纤维母细胞合成，通过淋巴系统进入血循环，并由肝脏快速清除。肝内皮细胞是HA摄取、降解的场所。HA在循环中的半衰期是2.5～5.5min。由于体内存在有效的HA清除机制，因此，正常人血清中仅有低水平的HA。多种原因导致的肝病均可使血清HA水平上升，主要与肝脏清除功能下降、肝脏内成纤维细胞(肝星状细胞)合成增加有关。在肝纤维化时，肝星状细胞合成HA水平大大升高，且内皮细胞清除HA能力亦有下降，双重原因导致肝纤维化中HA水平上升。

肝纤维化的形成是由于肝脏控制基质形成与沉积和基质降解与清除之间平衡的丧失，从而引起结缔组织的过度沉积进而纤维化。肝纤维化是慢性肝病的共同病理学基础，随着各种不同的慢性肝脏疾病的进展可逐渐形成肝纤维化。

就目前的临床研究而言，HA是目前众多纤维化生化指标中最为敏感和特异的指标(80％以上)，若与其他指标联合应用，其诊断敏感度和特异性可进一步提高。因此，透明质酸的定量检测对监测人体肝脏纤维化的发生及预后都有重要意义。

目前临床常用的透明质酸检测方法有Elisa测定、放射免疫测定、化学发光免疫。Elisa测定方法一般用于半定量的测定，测定准确度、灵敏度、精密度较差，而且操作比较繁琐，不利于在临床中广泛应用；放射免疫测定方法因为试剂有放射性污染和试剂有效期短暂(半衰期)等缺陷在逐渐被淘汰；化学发光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay，CLIA)是近十年来在世界范围内发展非常迅速的非放射性免疫分析，是继放射免疫分析(RIA)和酶免疫分析(EIA)之后发展起来的一种超高灵敏度的微量测定技术，具有高灵敏度、检测范围宽、操作简便快速、标记物稳定性好、无污染、仪器简单经济等优点，是放射性免疫分析与普通酶免疫分析的取代者，是目前免疫定量分析比较理想的方法。然而，目前已报道的用于检测透明质酸的化学发光试剂盒仍存在准确性较低、线性范围不够宽的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种透明质酸试剂盒及检测方法。该透明质酸检测试剂盒准确性好、灵敏度高、特异性好、线性范围宽，且检测速度快，40分钟可出结果。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供一种透明质酸检测试剂盒，一种透明质酸检测试剂盒，其特征在于，包括：包被有HA衍生物的磁微粒，HA结合蛋白，酶标记的HA结合蛋白抗体；

所述HA衍生物由HA的末端羧基与偶联蛋白经EDC-NHS活化偶联而成。

一些实施方案中，所述偶联蛋白为鱼明胶、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白重的一种或多种。

一些优选实施方案中，所述偶联蛋白为鱼明胶、牛血清白蛋白、人血清白蛋白中的一种。

本发明试剂盒中，所述磁微粒的粒径为0.1-10μm。

本发明试剂盒在使用时，所述HA结合蛋白由缓冲液和保护蛋白制成HA结合蛋白溶液，所述缓冲液为0.01M-1M的PH6-PH8的磷酸盐、Tris-HCl、Hepes或Mops缓冲液，所述保护蛋白为含0.5％-10％的BSA、鱼明胶、Casein、的新生牛血清。

一些实施方案中，所述偶联采用的偶联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、二环己基碳二亚胺、乙二醇双[琥珀酰亚胺基丁二酸]、N-羟基琥珀酰亚胺、过碘酸钠、硼氢化钠、氰基硼氢化钠、戊二醛、马来酰亚胺中的一种或多种。

一些实施方案中，所述偶联采用的偶联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺。

一些实施方案中，所述酶标记的透明质酸结合蛋白抗体为辣根过氧化物酶标记的透明质酸结合蛋白抗体。

一些实施方案中，所述化学发光底物为包括A液和B液，其中A液为鲁米诺溶液，B液为过氧化氢溶液。

本发明提供的透明质酸检测试剂盒，还包括透明质酸校准品，所述透明质酸校准品的浓度为0～1000ng/ml。

本发明试剂盒在使用时，所述透明质酸校准品由缓冲液和保护蛋白制成透明质酸标准品溶液。以0.01M-1M，PH6-PH8的磷酸盐、Tris-HCl、Hepes或Mops为缓冲液，以0.5％-10％的BSA、鱼明胶、Casein、新生牛血清为保护蛋白制备而成。

本发明还提供一种利用所述透明质酸检测试剂盒检测叶酸含量的方法，包括：

取待测样本，加入HA结合蛋白，37℃温育30分钟后加入酶结合物，37℃温育30分钟，再加入化学发光底物A液和B液，混匀，1～5分钟后检测发光强度，获得透明质酸含量。

本发明试剂盒的检测原理为：样本中的透明质酸与磁微粒上包被的透明质酸衍生物竞争酶标记的透明质酸结合蛋白，磁微粒上包被的透明质酸衍生物与酶标记的透明质酸结合蛋白结合形成复合物，该复合物催化化学发光底物发光，发光强度与样本中HA的含量成反比，从而定量分析待测样本中透明质酸的含量。

本发明还提供一种利用所述透明质酸检测试剂盒检测透明质酸含量的方法，包括：

取待测样本，加入HA结合蛋白，37℃温育30分钟后加入酶标记的HA结合蛋白抗体，37℃温育30分钟，再加入化学发光底物A液和B液，混匀，1～5分钟后检测发光强度，获得透明质酸含量。

本发明提供的透明质酸检测试剂盒，包括：包被有HA衍生物的磁微粒，HA结合蛋白，酶标记的HA结合蛋白抗体；所述HA衍生物由HA的末端羧基与偶联蛋白经EDC-NHS活化偶联而成。本发明试剂盒将HA的特定位点与指定蛋白进行偶联，不仅保证与磁微粒的包被效果可以满足检测需求，同时将HA充分暴露，保证其和结合蛋白的特异性反应不会受到大分子蛋白位阻效应的影响，保证了检测的准确性，具有如下优势：

(1)经临床实验证明，本发明试剂盒操作简便，灵敏度高，特异性好，与肝活检结果符合度极高，克服了放免试剂和酶免试剂的诸多不足，适于在产业上有效地推广应用。

(2)本发明试剂盒检验速度快，40分钟可出结果，在没有磁场存在的情况下，磁性微粒悬浮在液体中，使得抗原抗体反应类似于均相反应，磁性微粒在外加磁场的作用下可方便地分离，洗涤快速.

(3)本发明试剂盒稳定性好，2-8℃可稳定存放一年本发明试剂盒特异性好，和同系列的层连蛋白(HA)、Ⅲ型前胶原N端肽(PⅢNP)、Ⅳ型胶原(ColⅣ)无交叉；各项制备均达到同类试剂盒的分析法水平。

具体实施方式

本发明公开了一种透明质酸试剂盒及检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

对所公开的实施例的说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

本发明提供的透明质酸检测试剂盒中所用材料或试剂均可由市场购得。其中，全自动磁微粒化学发光仪(AutoLumo A2000Plus)由郑州安图生物工程股份有限公司提供。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1本发明试剂盒的制备

1、制备HA衍生物

1.1BSA偶联前洗涤：在偶联容器中，加入2倍体积的PBS缓冲液，再精确称取3mgBSA，震荡5分钟，混匀后，过滤弃去上清，一次洗涤结束；重复洗涤5次；

1.2BSA表面活化：将洗涤过的BSA转入小容器中，弃上清加入1.65倍体积的EDC溶液，随即加入1.65倍体积的NHS溶液，震荡混匀后，室温在微量振荡器上振荡反应2h；

1.3BSA表面活化：反应结束后，过滤弃去上清，将活化后的BSA再转入大容器中，加入33倍BSA体积的醋酸缓冲液，震荡5分钟，混匀后，过滤弃去上清液，一次洗涤结束；重复洗涤2次；

1.4透明质酸与BSA的偶联：将洗涤过的活化BSA转入小容器中，弃上清后，加入定量的透明质酸(使用醋酸缓冲液稀释到2倍BSA体积)，震荡混匀后，室温在微量振荡器上振荡反应20h；

2、制备结合有HA衍生物的磁性微粒

2.1磁微粒包被前混匀：将磁微粒包装瓶在垂直混合仪或振荡器上混合10-30分钟，使之充分混匀；

2.2磁微粒包被前洗涤：在包被容器中，加入33倍磁微粒原液体积的缓冲液A，再精确吸取30μL磁微粒，用1ml加样枪反复抽吸混匀后，在多功能搅拌器上搅拌5分钟，然后用磁架磁分离至上清澄清，弃去上清液，一次洗涤结束；重复洗涤5次；

2.3磁微粒表面活化：将洗涤过的磁微粒转入小容器中，弃上清加入1.65倍磁微粒原液体积的EDC溶液，随即加入1.65倍磁微粒原液体积的NHS溶液，加样枪反复抽吸混匀后，室温在微量振荡器上振荡反应2h；

2.4磁微粒表面活化后洗涤：反应结束后，先在磁架分离5分钟，弃去上清，将活化后的磁微粒再转入大容器中，加入33倍磁微粒原液体积的醋酸缓冲液，加样枪反复抽吸混匀后，在多功能搅拌器上搅拌5分钟，然后用磁架磁分离至上清澄清，弃去上清液，一次洗涤结束；重复洗涤2次；

2.5磁微粒包被过程：将洗涤过的活化磁微粒转入小容器中，弃上清后，加入定量的HA衍生物(使用醋酸缓冲液稀释到3.3倍磁微粒原液体积)，加样枪反复抽吸混匀后，室温在微量振荡器上振荡反应14-18h；

2.6磁微粒包被后封闭：反应完成后，在磁分离架上磁分离至上清澄清，弃去上清，将包被后的磁微粒转入大容器中，加入33倍磁微粒原液体积的磁微粒封闭保存液，加样枪反复抽吸混匀后，在微型振荡器上振荡10分钟，然后用磁架磁分离至上清澄清，弃去上清液，一次洗涤结束。重复封闭4次；

2.7磁微粒包被后储存：加入100倍磁微粒原液体积的磁微粒封闭保存液，加样枪反复抽吸至底部无磁微粒凝集块，在多功能搅拌器上搅拌均匀后储存于2～8℃待检。

3、制备酶结合物

采用过碘酸钠法将辣根过氧化物酶和HA结合蛋白(HABP)抗体共价偶联在一起，制备成辣根过氧化物酶标记的HA结合蛋白(HABP)抗体；使用时用以0.01M-1M，PH6-PH8的磷酸盐、Tris-HCl、Hepes或Mops为缓冲液，以0.5％-10％的BSA、鱼明胶、Casein、新生牛血清为保护蛋白配制的稀释液稀释至工作浓度而成。

4、制备HA结合蛋白溶液

以0.01M-1M，PH6-PH8的磷酸盐、Tris-HCl、Hepes或Mops为缓冲液，以0.5％-10％的BSA、鱼明胶、Casein、新生牛血清为保护蛋白，添加HA结合蛋白配制而成。

5、配制透明质酸校准品

以0.01M-1M，PH6-PH8的磷酸盐、Tris-HCl、Hepes或Mops为缓冲液，以0.5％-10％的BSA、鱼明胶、Casein、新生牛血清为保护蛋白，添加天然纯化或重组的透明质酸抗原配制成0ng/mL、60ng/mL、180ng/mL、360ng/mL、1000ng/mL的系列浓度。

6、配制化学发光底物

发光底物A液为鲁米诺；

发光底物B液为双氧水。

实施例2本发明试剂盒的使用方法

1、实验前准备

1.1将实施例1的试剂盒从冷藏环境中取出，放置室温(18～25℃)平衡20～30分钟；

1.2取一包洗液用500ml纯化水溶解后备用；

1.3将恒温水浴锅温度调节到37℃。

2、实验操作

2.1在反应容器中(以下简称“孔”)分别加入校准品(用于定标)或样本，加样量均为100μl/孔；

2.2每孔分别加入磁微粒混悬液20μl；

2.3每孔分别加入HA结合蛋白溶液20μl；

2.4每孔分别加入酶结合物20μl；

2.5混匀后37℃温育34分钟；

2.6洗液洗涤5次；

2.7每孔加入发光底物A和发光底物B各50μl；

2.8混匀后1～5分钟检测发光强度；

实施例3本发明试剂盒的性能检测

1、分析特异性

分析特异性主要是用于控制该试剂盒的所检测的物质为某一特定物质而非其他，尤其该测试针对与被测物质有相似结构的物质，会因抗体的特异性不够而产生测定的误差。

为了避免与肝纤项目的另外三项发生交叉反应，LN、PⅢNP、CⅣ应作为检测HA特异性检验的指标。由于所用试剂都来自同一厂家，所以其试验方法是用一批产品分别测定1000ng/ml LN和CⅣ、100ng/ml PⅢNP即可，并观察其有无交叉反应性。实验结果如下表1所示。

表1特异性检测结果

由表1试验结果可知，对于LN、PⅢNP、CⅣ的测定结果均小于30.0ng/ml。由于选用的测定浓度均远远高于生理浓度，因此在临床测定中不会影响测定结果的准确性。

2、精密度检测

2.1分析内精密度

分析内精密度试验，是指在同一次分析测定中，测定结果的变异情况。为此我们用高、低两种质控品，分别进行了多次分析内精密度的测定(n＝10)，即同一标本在同一次试验中重复测定10孔。结果如下表2所示。

表2分析内精密性测定结果

由表2试验数据可以看出，三批产品测定结果分析内变异均小于6％，且并无显著差异，在预期要求范围内。

2.2分析间精密度

分析间精密性试验，是指在不同次的分析测定中，测定结果的变异情况。为此我们用高、低两种质控品，同一次试验中重复测定10孔，同一试验每天做一次，做3天，计算其变异系数。本实验选用一批产品进行测定，试验结果如下表3所示。

表3分析间精密性测定结果

由表3试验数据可以看出，分析间变异略高于分析内变异，但测定结果分析间变异均在8％以内，且无显著差异，表明分析间精密度良好。

2.3批间精密度

批间精密度测定，即将精密度参考品在同一次试验中用三个批号的试剂盒同时进行测定，每个批号重复10孔，计算30孔回算浓度值的平均值(X)和标准差(SD)，变异系数(CV％)＝SD/X*100％。本实验选用三批产品两个机型进行测定，试验结果如下表4所示。

表4批间精密性测定结果

表4结果可以看出，测定结果批间变异系数小于8％，精密度良好。

2.4准确度

采用测回收率的方式来评估准确度。选择高值样本10份，按照1：9的比例分别加入到10份低值样本/基质样本中，制成回收样本，加入高值样本的体积不得超过总体积的10％。每个回收样本重复检测3次求均值，计算回收率。比较回收率偏差与试剂盒允许偏倚(行标正确度的允许偏倚，无行标的项目一般设定为10％)的大小，若回收率偏差小于等于试剂盒允许偏倚，则回收准确性符合要求，否则不符合要求。

回收率R＝[C×(V₀+V_S)-C₀×V₀]/(C_S×V_S)×100％

式中：R—回收率；

V₀—低值样本/基质样本的体积；

V_S—加入的高值样本的体积；

C—回收样本的检测浓度；

C₀—低值样本/基质样本的检测浓度；

Cs—高值样本的浓度。

表5回收率测定结果

表5结果可以看出，测定结果回收准确性符合要求。

2.5线性范围

准备1份浓度接近预期线性范围上限(1000ng/mL)130％左右的临床高值样本记为H(由可靠的方法测得其浓度值)，准备1份浓度接近于0的临床低值样本(或临床上可能得到的最低值)记为L(由可靠的方法测得其浓度值)。将两份样本按照不同比例互相混合，制备出一系列浓度的样本(一般为9-11个)，方法如表6。

共考核10组(高值H与低值L为1组)以上样本的线性范围。

表6利用临床高值和低值样本制备系列线性样本

表7线性范围结果汇总

由表6～7结果可以看出，线性范围为60～1000ng/ml。

采用公开号为CN102692408、发明名称为透明质酸一步法化学发光定量检测试剂盒的专利中实施例1的方法制备试剂盒，准备1份浓度接近预期线性范围上限(600ng/mL)130％左右的临床高值样本记为H(由可靠的方法测得其浓度值)，准备1份浓度接近于0的临床低值样本(或临床上可能得到的最低值)记为L(由可靠的方法测得其浓度值)。将两份样本按照不同比例互相混合，制备出一系列浓度的样本(一般为9-11个)，方法同表6。

共考核10组(高值H与低值L为1组)以上样本的线性范围。

表8利用临床高值和低值样本制备系列线性样本

表9线性范围结果汇总

	直线	R<sup>2</sup>
			样本1	y＝0.9476x-0.8013	0.9942
样本2	y＝1.009x-0.4128	0.9968
			样本3	y＝0.9829x+0.016	0.9993
样本4	y＝0.9489x+2.6373	0.9931
			样本5	y＝0.9441x+2.8879	0.9929
样本6	y＝0.936x+2.5853	0.9975
			样本7	y＝0.9726x+2.8843	0.9864
样本8	y＝1.0211x+1.1113	0.9962
			样本9	y＝1.0288x+1.0091	0.9968
样本10	y＝0.924x-1.315	0.9922

由表8～9结果可以看出，线性范围为40～600ng/ml，明显小于本试剂盒60～1000ng/ml线性范围。

实施例4不同偶联蛋白制备的试剂盒的性能差异

1、精密度检测

1.1分析内精密度

分析内精密度试验，是指在同一次分析测定中，测定结果的变异情况。为此我们用高、低两种质控品，对使用不同蛋白制备的HA衍生物的固相载体分别进行了多次分析内精密度的测定(n＝10)，即同一标本在同一次试验中重复测定10孔。结果如下表10所示。

表10分析内精密性测定结果

从表10结果可以看出，卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白测定低值质控、高值质控的精密性均差于鱼明胶，牛血清白蛋白，人血清白蛋白。

2、稳定性检测

稳定性评估主要有三个用途：一是用于评估试剂盒在运输、储存、使用过程中的效期；二是用加速实验预估试剂盒储存效期；三是对比某种改变(如材料、配方等)前后的稳定性差异。

EP25-A给出了稳定性评估的一般原则，以及利用加速实验预估试剂盒的储存有效期的实验设计和数据处理方式，在此仅作为参考。

2.1加速稳定性

表11加速稳定性测定结果

从表11结果可以看出，卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白加速热稳定性降幅均大于鱼明胶，牛血清白蛋白，人血清白蛋白。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种透明质酸检测试剂盒，其特征在于，包括：包被有HA衍生物的磁微粒，HA结合蛋白，酶标记的HA结合蛋白抗体；

所述HA衍生物由HA的末端羧基与偶联蛋白经EDC-NHS活化偶联而成；

所述试剂盒中各组分如以下方法制得：

步骤1、制备HA衍生物

1.1 BSA偶联前洗涤：在偶联容器中，加入2倍体积的PBS缓冲液，再精确称取3mg BSA，震荡5分钟，混匀后，过滤弃去上清，一次洗涤结束；重复洗涤5次；

1.2 BSA表面活化：将洗涤过的BSA转入小容器中，弃上清加入1.65倍体积的EDC溶液，随即加入1.65倍体积的NHS溶液，震荡混匀后，室温在微量振荡器上振荡反应2h；

1.3 BSA表面活化：反应结束后，过滤弃去上清，将活化后的BSA再转入大容器中，加入33倍BSA体积的醋酸缓冲液，震荡5分钟，混匀后，过滤弃去上清液，一次洗涤结束；重复洗涤2次；

1.4 透明质酸与BSA的偶联：将洗涤过的活化BSA转入小容器中，弃上清后，加入定量的使用醋酸缓冲液稀释到2倍BSA体积的透明质酸，震荡混匀后，室温在微量振荡器上振荡反应20h；

步骤2、制备结合有HA衍生物的磁性微粒

2.2磁微粒包被前洗涤：在包被容器中，加入33倍磁微粒原液体积的缓冲液A，再精确吸取30 µL磁微粒，用1ml加样枪反复抽吸混匀后，在多功能搅拌器上搅拌5分钟，然后用磁架磁分离至上清澄清，弃去上清液，一次洗涤结束；重复洗涤5次；

2.5磁微粒包被过程：将洗涤过的活化磁微粒转入小容器中，弃上清后，加入定量的使用醋酸缓冲液稀释到3.3倍磁微粒原液体积的HA衍生物，加样枪反复抽吸混匀后，室温在微量振荡器上振荡反应14-18h；

2.6磁微粒包被后封闭：反应完成后，在磁分离架上磁分离至上清澄清，弃去上清，将包被后的磁微粒转入大容器中，加入33倍磁微粒原液体积的磁微粒封闭保存液，加样枪反复抽吸混匀后，在微型振荡器上振荡10分钟，然后用磁架磁分离至上清澄清，弃去上清液，一次洗涤结束；重复封闭4次；

2.7磁微粒包被后储存：加入100倍磁微粒原液体积的磁微粒封闭保存液，加样枪反复抽吸至底部无磁微粒凝集块，在多功能搅拌器上搅拌均匀后储存于2~8℃待检；

步骤3、制备酶标记的HA结合蛋白抗体

采用过碘酸钠法将辣根过氧化物酶和HA结合蛋白抗体共价偶联在一起，制备成辣根过氧化物酶标记的HA结合蛋白抗体；使用时用以0.01M -1M，PH6-PH8的磷酸盐、Tris-HCl、Hepes或Mops为缓冲液，以0.5%-10%的BSA、鱼明胶、新生牛血清、Casein分别为保护蛋白配制的稀释液稀释至工作浓度而成；

步骤4、制备HA结合蛋白溶液

以0.01M -1M，PH6-PH8的磷酸盐、Tris-HCl、Hepes或Mops为缓冲液，以0.5%-10%的BSA、鱼明胶、Casein、新生牛血清为保护蛋白，添加HA结合蛋白配制而成；

步骤5、配制透明质酸校准品

以0.01M -1M，PH6-PH8的磷酸盐、Tris-HCl、Hepes或Mops为缓冲液，以0.5%-10%的BSA、鱼明胶、Casein、新生牛血清为保护蛋白，添加天然纯化或重组的透明质酸抗原配制成0ng/mL、60ng/mL、180ng/mL、360ng/mL、1000ng/mL的系列浓度；

步骤6、配制化学发光底物

发光底物A液为鲁米诺；

发光底物B液为双氧水。

2.根据权利要求1所述的透明质酸检测试剂盒，其特征在于，所述磁微粒的粒径为0.1-10μm。