CN104698186A - 检测透明质酸的试剂盒及其检测方法和应用 - Google Patents

检测透明质酸的试剂盒及其检测方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测透明质酸的试剂盒及其检测方法和应用，属于体外诊断检测技术领域。该试剂盒包括以下组分：1)磁性微球体系：包括有直接连接或间接连接第一结合剂的磁性微球；2)标记物体系：包括有直接连接或间接连接标记示踪物的第二结合剂。本发明的试剂盒和检测方法，采用化学发光免疫法对透明质酸进行检测，将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，具有灵敏度高和准确性好的特点。

Description

检测透明质酸的试剂盒及其检测方法和应用
技术领域
本发明涉及体外诊断检测技术领域，特别是涉及一种检测透明质酸的试剂盒及其检测方法和应用。
背景技术
肝纤维化是各种慢性肝病所致的肝脏损伤的共同通路。肝纤维化的血清学标志物包括反映细胞外基质生成的直接标志物和体现肝脏合成、代谢、储备功能的间接标志物。各种综合血清学标志物评估模型可确定显著性纤维化和肝硬化，减少不必要的肝脏穿刺活检，可辅助疾病的诊断分期、预后评估、治疗监测。
HA(透明质酸)是一种由粘多糖组成的物质，普遍存在于结缔组织的基质中，其分子结构是双糖的多聚体，基本单位为β-葡萄糖醛酸与N-乙酰氨基葡萄糖，通过氧桥连接。HA是大分子，组织之间的HA大分子大小各异，分子量在105-107道尔顿之间。由间质细胞合成，分泌至淋巴中，然后进入血循环，很快被肝脏内皮细胞摄取后降解为乙酸与乳酸，经肾脏排出。当肝硬化肝损害，内皮细胞同时受损，摄取与分解HA的能力下降，导致HA增多，也可能由于肝间质细胞合成HA明显增加。
血清HA在急肝、慢迁肝时轻度升高；慢活肝时显著升高；肝硬化时极度升高，因而血清HA是目前反映肝病变程度及纤维化程度最灵敏、可靠的生化指标。
对肝病患者而言，HA总体水平依据病损和病理改变程度表现为：肝硬化>慢性活动性肝炎>慢性迁延性肝炎>急性肝炎。可见HA做为反映肝细胞纤维化损害的指标，优于ALT。因为ALT在肝细胞停止破坏，肝内纤维化，肝硬化时反而不见升高。
现在主要的血清透明质酸实验室分析方法有RIA(放射免疫分析法)和ELISA(酶联免疫吸附分析)法，但是RIA方法易受到试剂稳定性、检测限等因素影响，具有放射性污染，检测周期长的缺点，而ELISA方法的重复性不理想。
发明内容
基于此，本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种检测透明质酸的试剂盒，该试剂盒采用化学发光免疫法对透明质酸进行检测，具有灵敏度高和准确性好的特点。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
一种检测透明质酸的试剂盒，包括以下组分：
1)磁性微球体系：包括有直接连接或间接连接第一结合剂的磁性微球；
2)标记物体系：包括有直接连接或间接连接标记示踪物的第二结合剂；
所述第一结合剂和第二结合剂分别为透明质酸抗原和抗透明质酸结合蛋白抗体，或分别为抗透明质酸结合蛋白抗体和透明质酸抗原，或分别为透明质酸结合蛋白和抗透明质酸抗体；
并且，当所述第一结合剂为透明质酸抗原或抗透明质酸结合蛋白抗体时，还包括以下组分：3)游离透明质酸结合蛋白。
即，当磁性微球体系包括有直接连接或间接连接透明质酸抗原(HA)的磁性微球，则标记物体系包括有直接连接或间接连接标记示踪物的抗透明质酸结合蛋白(HABP)抗体；当磁性微球体系包括有直接连接或间接连接抗透明质酸结合蛋白抗体的磁性微球，则标记物体系包括有直接连接或间接连接标记示踪物的透明质酸抗原；当磁性微球体系包括有直接连接或间接连接透明质酸结合蛋白的磁性微球，则标记物体系包括有直接连接或间接连接标记示踪物的抗透明质酸抗体。
上述“直接连接”为直接结合的连接，上述“间接连接”为通过生物素和链霉亲和素，或异硫氰酸荧光素和抗异硫氰酸荧光素抗体等能够相互结合的搭桥物以间接结合的方式连接。所述抗体既可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。
本发明的检测透明质酸的试剂盒，当所述第一结合剂为透明质酸结合蛋白；所述第二结合剂相应的为抗透明质酸抗体时，利用透明质酸结合蛋白和抗透明质酸抗体与待测样本中的透明质酸结合，形成“三明治”型的夹心结构，进行测定。当所述第一结合剂为透明质酸抗原、或抗透明质酸结合蛋白抗体，所述第二结合剂相应的为抗透明质酸结合蛋白抗体、或透明质酸抗原，并采用游离透明质酸结合蛋白配合检测时，是使待测样本中的透明质酸与经标记的透明质酸(包被磁性微球或标记了标记示踪物的HA)竞争结合游离透明质酸结合蛋白，即以先竞争再结合固定相的方案进行测定。
并且，本发明人在对化学发光免疫发检测透明质酸的研究中发现，将HABP以游离状态使用，即以先竞争再固定的方案进行测定，具有更好的检测灵敏度和准确性。本发明人经过了大量的研究后发现，可能是由于将HABP包被于磁性微球上，配合标记抗HA抗体的标记示踪物进行测定的方案，或将HABP标记上标记示踪物，配合包被HA抗原或抗HA抗体的磁性微球进行测定的方案中，反应物表面由于连接了磁性微球或示踪标记物等，导致表面空间位阻较大，干扰了免疫反应的效率。因此，利用游离态的HABP后，由于空间位阻较小，可以充分的和待测样本中HA以及包被与磁性微球上的HA、或标记了示踪标记物的HA反应，极大的提高了免疫反应的效率，从而提高了检测灵敏度和准确性。
在上述技术方案中，磁性微球体系中，磁性微球的工作浓度可以为0.1mg/ml-2mg/ml，透明质酸抗原的工作浓度可以为1-20μg/ml，抗透明质酸结合蛋白抗体的工作浓度可以为20-100μg/ml；标记物体系中，标记示踪物(如N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺，即ABEI)的工作浓度可以为50ng/ml-5000ng/ml，抗透明质酸结合蛋白抗体的工作浓度可以为20ng/ml-100ng/ml，透明质酸抗原的工作浓度可以为1-20μg/ml；游离透明质酸结合蛋白的工作浓度可以为50-1000ng/ml。将各试剂成分的浓度设定在此范围内，既能避免由于浓度过低导致光信号低，影响试剂检测的灵敏度；又能避免浓度过高所造成的成本浪费。可根据具体情况调整。
可以理解的，为了达到定量测定的目的，该试剂盒还可以包括透明质酸浓度为20-50ng/ml的校准品溶液和浓度为1000-1400ng/ml的校准品溶液。
同样可以理解的，该试剂盒中的各组分均含有牛血清白蛋白(BSA)和防腐剂，BSA的浓度为0.01-0.5g/ml，防腐剂为山梨酸钾、苯甲酸钠、叠氮钠、亚硝酸钠、Proclin系列中的任一种或两种以上混合物。
上述标记示踪物包括以下几种：1、化学发光免疫分析使用的能够直接发光的标记物，如鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺或其衍生物、吖啶酯等；2、化学发光酶免疫分析使用的配合相应底物可以发光的标记物，如碱性磷酸酶或过氧化物酶等。
在其中一个实施例中，所述标记示踪物为发光标记物，选自：金刚烷、鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺及其衍生物、吖啶酯，优选N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)，与上述发光标记物配合的氧化系统包括H2O2-微过氧化物酶、H2O2-过氧化氢酶、H2O2-乳过氧化物酶、H2O2-次氯血红素、H2O2-氯化血红素、次氯酸盐-CoCl2、过硫酸盐、过氧化钾、高碘酸钠、H2O2-K3Fe(CN)6、黄嘌呤-次黄嘌呤氧化酶、叔丁醇钾中的至少一种。
上述发光标记物是指在发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物，该化合物能够经催化剂的催化和氧化剂的氧化，形成一个激发态的中间体，当这种激发态中间体回到稳定的基态时，同时发射出光子(hM)。
在其中一个实施例中，所述标记示踪物为化学发光催化剂，选自：碱性磷酸酶、过氧化物酶。使用时，配合相应的化学发光底物即可发光被定量检测，所述化学发光底物包括NaOH和H2O2，还包括金刚烷、鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺或其衍生物中的至少一种，优选N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)。
在其中一个实施例中，所述1)磁性微球体系中，所述间接连接第一结合剂的磁性微球由生物素标记的第一结合剂，和链霉亲和素包被的磁性微球组成；或所述间接连接第一结合剂的磁性微球由异硫氰酸荧光素标记的第一结合剂，和抗异硫氰酸荧光素抗体包被的磁性微球组成。
具体来说，当第一结合剂为透明质酸抗原，所述间接连接透明质酸抗原的磁性微球由生物素标记的透明质酸抗原，和链霉亲和素包被的磁性微球组成；或所述间接连接透明质酸抗原的磁性微球由异硫氰酸荧光素标记的透明质酸抗原，和抗异硫氰酸荧光素抗体包被的磁性微球组成。
当第一结合剂为抗透明质酸结合蛋白抗体，所述间接连接抗透明质酸结合蛋白抗体的磁性微球由生物素标记的抗透明质酸结合蛋白抗体，和链霉亲和素包被的磁性微球组成；或所述间接连接抗透明质酸结合蛋白抗体的磁性微球由异硫氰酸荧光素标记的抗透明质酸结合蛋白抗体，和抗异硫氰酸荧光素抗体包被的磁性微球组成。
当第一结合剂为透明质酸结合蛋白，所述间接连接透明质酸结合蛋白的磁性微球由生物素标记的透明质酸结合蛋白，和链霉亲和素包被的磁性微球组成；或所述间接连接透明质酸结合蛋白的磁性微球由异硫氰酸荧光素标记的透明质酸结合蛋白，和抗异硫氰酸荧光素抗体包被的磁性微球组成。
在其中一个实施例中，所述2)标记物体系中，所述间接连接标记示踪物的第二结合剂由生物素标记的第二结合剂，和链霉亲和素标记的标记示踪物组成；或所述间接连接标记示踪物的第二结合剂由异硫氰酸荧光素标记的第二结合剂，和抗异硫氰酸荧光素抗体标记的标记示踪物组成。
具体来说，当第二结合剂为抗透明质酸结合蛋白抗体，所述间接连接标记示踪物的抗透明质酸结合蛋白抗体由生物素标记的抗透明质酸结合蛋白抗体，和链霉亲和素标记的标记示踪物组成；或所述间接连接标记示踪物的抗透明质酸结合蛋白抗体由异硫氰酸荧光素标记的抗透明质酸结合蛋白抗体，和抗异硫氰酸荧光素抗体标记的标记示踪物组成。
当第二结合剂为透明质酸抗原，所述间接连接标记示踪物的透明质酸抗原由生物素标记的透明质酸抗原，和链霉亲和素标记的标记示踪物组成；或所述间接连接标记示踪物的透明质酸抗原由异硫氰酸荧光素标记的透明质酸抗原，和抗异硫氰酸荧光素抗体标记的标记示踪物组成。
当第二结合剂为透明质酸抗体，所述间接连接标记示踪物的抗透明质酸抗体由生物素标记的抗透明质酸抗体，和链霉亲和素标记的标记示踪物组成；或所述间接连接标记示踪物的抗透明质酸抗体由异硫氰酸荧光素标记的透明质酸抗体，和抗异硫氰酸荧光素抗体标记的标记示踪物组成。
上述抗异硫氰酸荧光素抗体既可以为单克隆抗体，也可以为多克隆抗体。
上述方案丰富了检测所使用的标记物体系和磁性微球体系，可根据不同需求灵活选择。例如可以在磁性微球体系中直接将透明质酸抗原(或抗透明质酸结合蛋白抗体，或透明质酸结合蛋白)连接磁性微球，也可以通过上述的间接搭桥方式连接透明质酸抗原(或抗透明质酸结合蛋白抗体，或透明质酸结合蛋白)和磁性微球。同样，可以在标记物体系中将标记示踪物直接连接抗透明质酸结合蛋白抗体(或透明质酸抗原，或抗透明质酸抗体)，也可以通过上述的间接搭桥方式连接标记示踪物和抗透明质酸结合蛋白抗体(或透明质酸抗原，或抗透明质酸抗体)。并且，上述磁性微球体系和标记物体系中采用何种连接方式(直接连接或间接连接)并无相互影响或限定，既可在磁性微球体系和标记物体系中同时采用直接连接方式或同时采用间接连接方式，也可磁性微球体系选用直接连接，标记物体系采用间接连接，或者磁性微球体系选用间接连接，标记物体系采用直接连接。可以理解的，上述间接搭桥连接方式还可采用其它间接标记体系进行间接连接。
适用于本发明的磁性微球也称为磁珠或磁球，可以是本领域中常用的磁性微球。优选的是，本发明使用的磁球，是将纳米级的Fe2O3或Fe3O4磁性粒子和有机高分子材料进行复合，形成具有超顺磁性和极大量蛋白吸附容量的微米级的固相微球，具有在外加磁场作用下可迅速被磁化，在撤走磁场后剩磁为零的属性。其中，所述有机高分子材料的种类没有特别限制，可根据需要进行选择。
本发明所使用的磁性微球应能满足直径为0.1-5μm，磁性微球还可以通过表面改性而带有多种活性功能基团，包括但不限于-OH、-COOH、-NH2。
在其中一个实施例中，所述磁性微球为Fe2O3或Fe3O4磁性纳米粒子与有机高分子材料的复合体，并具有0.1-5μm的粒径，并且，所述磁性微球任选地通过表面改性而带有一种或多种活性功能基团。
本发明还公开了一种透明质酸的检测方法，采用上述的试剂盒，包括以下步骤：
1)反应：将待测样本与上述的试剂盒中各组分混合，温育，得到反应产物；
2)检测：外加磁场将所述反应产物沉淀，去除上清液，并以缓冲液清洗后，加入化学发光激发物，检测发出的相对光强度，通过计算得到透明质酸的含量。
在其中一个实施例中，所述试剂盒中，所述第一结合剂和第二结合剂分别为透明质酸抗原和抗透明质酸结合蛋白抗体，或分别为抗透明质酸结合蛋白抗体和透明质酸抗原；
步骤1)反应中，将待测样本与磁性微球体系、游离透明质酸结合蛋白和标记物体系混合，温育，使待测样本中的透明质酸与经标记的透明质酸竞争结合游离透明质酸结合蛋白，得到反应产物。
上述透明质酸的检测方法，在采用化学发光免疫竞争法进行检测时，将HABP(透明质酸结合蛋白)以游离状态加入，利用其表面空间位阻较小的特点，提高了免疫反应的效率，从而提高了检测灵敏度高和准确性。
在其中一个实施例中，步骤1)反应中，先将待测样本与磁性微球体系、游离透明质酸结合蛋白混合，温育，使待测样本中的透明质酸与经标记的透明质酸抗原竞争结合透明质酸结合蛋白后，再外加磁场清洗后，加入标记物体系混合，温育。
在检测中，本发明人还发现，如在待测样本中加入磁性微球体系和游离透明质酸结合蛋白温育后，先进行一次清洗，去除多余的透明质酸结合蛋白，再进行二次加样，加入标记物体系，则可避免示踪标记物与多余的透明质酸结合蛋白结合，进一步的提高了免疫反应的效率，进一步提升了检测灵敏度和准确性。
本发明还公开了一种上述的检测透明质酸的试剂盒在化学发光分析仪中的应用。将该试剂盒应用于化学发光平台，具有操作规范，无人为引入误差及全自动化的优点。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的检测透明质酸的试剂盒，采用化学发光免疫法对透明质酸进行检测，将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，具有灵敏度高和准确性好的特点。
特别是，将HABP以游离状态使用，并配合抗HABP抗体，利用游离态的HABP空间位阻较小，可以充分的和待测样本中HA以及包被与磁性微球上的HA，或标记了示踪标记物的HA反应，极大的提高了免疫反应的效率，从而提高了检测灵敏度和准确性。
本发明的透明质酸的检测方法，采用化学发光免疫法对透明质酸进行检测，将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，具有灵敏度高和准确性好的特点。
特别是，在采用化学发光免疫竞争法进行检测时，将透明质酸结合蛋白以游离状态加入，利用其表面空间位阻较小的特点，提高了免疫反应的效率，从而提高了检测灵敏度高和准确性。
并且，该检测方法还在待测样本中加入磁性微球体系和游离透明质酸结合蛋白温育后，先进行一次清洗，去除多余的透明质酸结合蛋白，再进行二次加样，加入标记物体系，则可避免示踪标记物与多余的透明质酸结合蛋白结合，进一步的提高了免疫反应的效率，进一步提升了检测灵敏度和准确性。
本发明的检测透明质酸的试剂盒在化学发光分析仪中的应用，将上述试剂盒应用于化学发光平台，具有操作规范，无人为引入误差及全自动化的优点。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步的说明，但并不对本发明造成任何限制。
以下实施例中：
透明质酸，来源：Sigma公司。
抗透明质酸结合蛋白单克隆抗体，来源：中科京达公司。
透明质酸结合蛋白，来源：中科京达公司。
抗透明质酸抗体，来源：上海贝西生物科技有限公司。
磁性微球、ABEI：为深圳新产业生物医学股份有限公司生产。
生物素：购自美国Biosources公司。
实施例1
一种检测透明质酸的试剂盒，包括以下组分：
1)磁性微球体系：包被透明质酸抗原(HA抗原)的磁性微球溶液。
其中，磁性微球的工作浓度：0.5mg/ml，HA抗原的工作浓度：2μg/ml。
2)标记物体系：抗透明质酸结合蛋白单克隆抗体(HABP单抗)标记的ABEI溶液。
其中：抗透明质酸结合蛋白单克隆抗体的工作浓度：25μg/ml，ABEI的工作浓度：100ng/ml。
3)游离透明质酸结合蛋白溶液。
其中：透明质酸结合蛋白的工作浓度：600ng/ml。
4)校准品溶液：透明质酸浓度为35.566ng/ml的低点校准品溶液和浓度为1124.68ng/ml的高点校准品溶液。
上述各组分均含有牛血清白蛋白(BSA)和防腐剂，BSA的浓度为0.1g/ml，防腐剂主要成分为NaN3，浓度为0.2g/ml。
本实施例的检测透明质酸的试剂盒的制备方法中，除以下试剂外，其余均按照常规方法制备。
一、磁性微球体系的制备(包被HA抗原的磁性微球溶液)。
1)配制pH为3.6的醋酸缓冲液：
称取2.55g三水合乙酸钠用4500ml纯化水溶解后再加入14ml乙酸混匀后，定容至5000ml，即得pH为3.6的醋酸缓冲液。
2)磁性微球连接(磁性微球连接CMC法)：
往磁性微球中加入5倍于包被体积的上述pH3.6醋酸缓冲液悬浮，其中磁性微球浓度为20mg/mL，再加入浓度为10mg/ml的1-环已基-2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸盐(CMC)，按1mg磁性微球加入2μg纯化的HA抗原，组成反应体系。
将上述反应体系放入恒温震荡水浴箱中37℃反应24小时。
3)磁性微球的清洗：
磁珠清洗液的配制：在0.05M PBS中溶入BSA，使BSA的浓度为0.5g/ml，即为磁珠清洗液。
清洗：将反应好的反应体系倒入烧杯中，然后置于磁铁上沉淀后，倒掉上清，加入5倍体积的磁珠清洗液搅拌清洗，然后放置在磁铁上，待上清液清亮后倒掉上清液。
4)磁性微球的悬浮：
磁珠悬浮液的配制:在0.05M PBS中溶入BSA和甲基纤维素(MC)，使BSA的浓度为0.5g/ml，MC的浓度为0.4g/ml，即为磁珠悬浮液。
清洗完毕后，加入包被体积的磁珠悬浮液，悬浮浓度为20mg/ml，即得到包被HA抗原的磁性微球溶液。
二、标记物体系的制备。
1)透析液的配制：在5000ml烧杯中加入Na2CO314.31g，NaHCO326.46g，加水定容至4500ml，即得0.1mol/L的碳酸缓冲液。
2)取1mg HABP单抗用透析液调整到1ml，放入透析液中，室温搅拌透析2小时，加入300μg ABEI-半琥珀酰胺酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(ABEI-hemisuccinimide N-Hydroxysuccinimide)，37℃反应2小时。
3)以G-25凝胶柱纯化上述反应得到的标记ABEI的HABP单抗。
4)在纯化后的标记ABEI的HABP单抗溶液中加入等体积的5g/ml的BSA保护液，即得。
采用本实施例的试剂盒检测透明质酸的方法(二次清洗法)，包括以下步骤：
1)反应：
A、将40μl待测样本(血清)，高、低浓度校准品分别加入到反应杯中，然后再加入20μl包被HA抗原的磁性微球溶液，同时加入100μl游离透明质酸结合蛋白溶液，37℃温浴10min，使待测样本中的HA与连接有磁性微球的HA抗原竞争结合透明质酸结合蛋白，置于磁环境下清洗3次，去除与待测样本中HA结合的透明质酸结合蛋白(即未被磁性微球固定的透明质酸结合蛋白)。
B、加入100μl HABP单抗标记的ABEI溶液，37℃温浴5min，使其与反应体系中剩余的被磁性微球固定的HABP结合。
2)检测：外加磁场将上述反应产物沉淀，去除上清液，并以缓冲液清洗后，加入化学发光激发物(NaOH和H2O2)，检测发出的相对光强度，通过计算得到透明质酸的含量。
实施例2
一种检测透明质酸的试剂盒，与实施例1的试剂盒相同。
本实施例的检测透明质酸的方法(一次清洗法)，包括以下步骤：
1)反应：将40μl待测样本(血清)、高、低浓度校准品分别加入到反应杯中，然后再加入20μl包被HA抗原的磁性微球溶液，同时加入100μl游离透明质酸结合蛋白溶液以及100μl HABP单抗标记的ABEI溶液，37℃温浴15min，使待测样本中的HA与连接有磁性微球的HA抗原竞争结合透明质酸结合蛋白。
2)检测：外加磁场将上述反应产物沉淀，去除上清液，并以缓冲液清洗后，加入化学发光激发物(NaOH和H2O2)，检测发出的相对光强度，通过计算得到透明质酸的含量。
实施例3
一种检测透明质酸的试剂盒，与实施例1的试剂盒基本相同，不同之处在于：
1)磁性微球体系：
包被链霉亲和素(SA)的磁性微球溶液。
其中，磁性微球的工作浓度：0.5mg/ml，SA抗原的工作浓度：1μg/ml。
生物素(Biotin)标记的透明质酸抗原溶液。
其中，Biotin的工作浓度：200ng/ml，HA抗原的工作浓度：2000ng/ml。
本实施例的检测透明质酸的试剂盒的制备方法，参照实施例1中的制备方法，除以下步骤外，其余均与实施例1中的方法相同。
一、磁性微球体系的制备。
1、包被链霉亲和素(SA)的磁性微球溶液的制备。
和上述实施例1中包被HA抗原的磁性微球溶液的制备方法相同，仅是将其中的HA抗原替换为链霉亲和素，且是按1mg磁性微球加入12μg纯化的链霉亲和素即可。
2、标记生物素(Biotin)的HA抗原溶液的制备。
取HA抗原用0.1M，pH9.5的NaHCO3缓冲液透析2h。将活化的生物素溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，按照生物素与HA抗原的摩尔比为20:1的比例将二者混合，37℃反应2h；再将反应后的液体用0.1mol/L PBS于4℃透析24小时，即制成生物素标记的HA抗原溶液。
采用本实施例的试剂盒检测透明质酸的方法(二次清洗法)与实施例1的检测方法基本相同，不同之处在于：
1)反应：
A、将40μl待测样本(血清)、高、低浓度校准品分别加入到反应杯中，然后再加入20μl包被链霉亲和素的磁性微球溶液，20μl生物素标记的透明质酸抗原溶液，同时加入100μl游离透明质酸结合蛋白溶液，37℃温浴10min，使待测样本中的HA与生物素标记的HA抗原竞争结合透明质酸结合蛋白，该生物素标记的HA抗原通过链霉亲和素与磁性微球间接连接，随后置于磁环境下清洗3次，去除与待测样本中HA结合的透明质酸结合蛋白(即未被磁性微球固定的透明质酸结合蛋白)。
实施例4
一种检测透明质酸的试剂盒，与实施例3的试剂盒相同。
本实施例的检测透明质酸的方法(一次清洗法)与实施例2的检测方法基本相同，不同之处在于：
1)反应：将40μl待测样本(血清)、高、低浓度校准品分别加入到反应杯中，然后再加入20μl包被链霉亲和素的磁性微球溶液，20μl生物素标记的透明质酸抗原溶液，同时加入100μl游离透明质酸结合蛋白溶液以及100μl HABP单抗标记的ABEI溶液，37℃温浴15min，使待测样本中的HA与间接连接有磁性微球的HA抗原竞争结合透明质酸结合蛋白。
实施例5
一种检测透明质酸的试剂盒，包括以下组分：
1)磁性微球体系：包被透明质酸结合蛋白(HBAP)的磁性微球溶液。
其中，磁性微球的工作浓度：0.5mg/ml，HBAP的工作浓度：1μg/ml。
2)标记物体系：抗透明质酸单克隆抗体(HA单抗)标记的ABEI溶液。
其中：HA单抗的工作浓度：50μg/ml，ABEI的工作浓度：100ng/ml。
3)校准品溶液：透明质酸浓度为35.566ng/ml的低点校准品溶液和浓度为1124.68ng/ml的高点校准品溶液。
上述各组分均含有牛血清白蛋白(BSA)和防腐剂，BSA的浓度为0.1g/ml，防腐剂主要成分为NaN3，浓度为0.2g/ml。
本实施例的检测透明质酸的试剂盒的制备方法，参照实施例1中的制备方法，除以下步骤外，其余均与实施例1中的方法相同。
一、磁性微球体系的制备。
1、包被透明质酸结合蛋白(HBAP)的磁性微球溶液的制备。
和上述实施例1中包被HA抗原的磁性微球溶液的制备方法相同，仅是将其中的HA抗原替换为HBAP，且是按1mg磁性微球加入12μg纯化的HBAP即可。
2、标记ABEI的HA单抗溶液的制备。
和上述实施例1中标记ABEI的HABP单抗的制备方法相同，仅是将其中的HABP单抗替换为HA单抗即可。
本实施例的检测透明质酸的方法，包括以下步骤：
1)反应：将40μl待测样本(血清)、高、低浓度校准品分别加入到反应杯中，然后再加入20μl包被HBAP的磁性微球溶液，同时加入100μl HA单抗标记的ABEI溶液，37℃温浴15min。
2)检测：外加磁场将上述反应产物沉淀，去除上清液，并以缓冲液清洗后，加入化学发光激发物(NaOH和H2O2)，检测发出的相对光强度，通过计算得到透明质酸的含量。
对比例1
一种检测透明质酸的试剂盒，包括以下组分：
1)磁性微球体系：包被抗透明质酸单克隆抗体(HA单抗)的磁性微球溶液。
其中，磁性微球的工作浓度：0.5mg/ml，HA单抗的工作浓度：1μg/ml。
2)标记物体系：透明质酸结合蛋白(HBAP)标记的ABEI溶液。
其中：HBAP的工作浓度：50μg/ml，ABEI的工作浓度：200ng/ml。
3)校准品溶液：透明质酸浓度为35.566ng/ml的低点校准品溶液和浓度为1124.68ng/ml的高点校准品溶液。
上述各组分均含有牛血清白蛋白(BSA)和防腐剂，BSA的浓度为0.1g/ml，防腐剂主要成分为NaN3，浓度为0.2g/ml。
本对比例的检测透明质酸的试剂盒的制备方法，参照实施例1中的制备方法，除以下步骤外，其余均与实施例1中的方法相同。
一、磁性微球体系的制备。
1、包被抗透明质酸单克隆抗体(HA单抗)的磁性微球溶液的制备。
和上述实施例1中包被HA抗原的磁性微球溶液的制备方法相同，仅是将其中的HA抗原替换为HA单抗，且是按1mg磁性微球加入12μg纯化的HA单抗即可。
2、标记ABEI的HBAP溶液的制备。
和上述实施例1中标记ABEI的HABP单抗的制备方法相同，仅是将其中的HABP单抗替换为HBAP即可。
本对比例的检测透明质酸的方法，包括以下步骤：
1)反应：将40μl待测样本(血清)、高、低浓度校准品分别加入到反应杯中，然后再加入20μl包被HA单抗的磁性微球溶液，同时加入100μl HBAP标记的ABEI溶液，37℃温浴15min。
2)检测：外加磁场将上述反应产物沉淀，去除上清液，并以缓冲液清洗后，加入化学发光激发物(NaOH和H2O2)，检测发出的相对光强度，通过计算得到透明质酸的含量。
对比例2
一种检测透明质酸的试剂盒，包括以下组分：
1)磁性微球体系：包被透明质酸(HA抗原)的磁性微球溶液。
其中，磁性微球的工作浓度：0.5mg/ml，HA抗原的工作浓度：2μg/ml。
2)标记物体系：透明质酸结合蛋白(HBAP)标记的ABEI溶液。
其中：HBAP的工作浓度：50μg/ml，ABEI的工作浓度：200ng/ml。
3)校准品溶液：透明质酸浓度为35.566ng/ml的低点校准品溶液和浓度为1124.68ng/ml的高点校准品溶液。
上述各组分均含有牛血清白蛋白(BSA)和防腐剂，BSA的浓度为0.1g/ml，防腐剂主要成分为NaN3，浓度为0.2g/ml。
本对比例的检测透明质酸的试剂盒的制备方法，参照实施例1和对比例2中的制备方法。
本对比例的检测透明质酸的方法，包括以下步骤：
1)反应：将40μl待测样本(血清)、高、低浓度校准品分别加入到反应杯中，然后再加入20μl包被HA抗原的磁性微球溶液，同时加入100μl HBAP标记的ABEI溶液，37℃温浴15min。
2)检测：外加磁场将上述反应产物沉淀，去除上清液，并以缓冲液清洗后，加入化学发光激发物(NaOH和H2O2)，检测发出的相对光强度，通过计算得到透明质酸的含量。
实验例
采用上述实施例和对比例中的试剂盒及其检测方法进行实验对比。使用深圳市新产业生物医学工程股份有限公司研发生产的Maglumi 2000全自动化学发光分析仪检测。
一、功能灵敏度实验
1、方法。
取HA校准品(2.5mg/ml)用稀释液稀释至1ng/ml、2ng/ml、3ng/ml、4ng/ml、6ng/ml、8ng/ml、10ng/ml七个浓度的标准品点，用上述实施例1-5和对比例1-2的方法分别检测20次，计算出CV值，CV≤20％即为工艺可以达到的功能灵敏度。
2、结果如下表所示。
表1实施例1的功能灵敏度
表2实施例2的功能灵敏度
表3实施例3的功能灵敏度
表4实施例4的功能灵敏度
表5实施例5的功能灵敏度
表6对比例1的功能灵敏度
表7对比例2的功能灵敏度
从上述结果中可以看出，对比例1-2的功能灵敏度比较低，只能达到10ng/ml。而实施例1的功能灵敏度为2ng/ml，实施例2-4的灵敏度可以达到6ng/ml，即本发明实施例1-4的功能灵敏度均高于对比例的功能灵敏度。
对比例2中，虽然10ng/ml时浓度的CV值是12.007％，小于20％，但是1ng/m、2ng/m、3ng/m、4ng/m、6ng/m和8ng/ml之间浓度基本没有区分，其灵敏度非常差。
二、精密度实验
1、方法。
取HA校准品(2.5mg/ml)用稀释液稀释至50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml、200ng/ml四个浓度的标准品点，用上述实施例1-5和对比例1-2的方法分别检测20次，计算CV值，CV越小，精密度越高，即检测准确性越高。
2、结果如下表所示。
表8实施例的精密度
表9对比例的精密度
从上述结果中可以看出，实施例1的三种浓度水平标准品的CV均比较小，而其他实施例和对比例均不及实施例1，在实施例1中，在50ng/ml时的精密度可以达到8.55％，100ng/ml时可以达到4.61％，150ng/ml时可以达到4.55％。具有精密度特别优异的特点。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种检测透明质酸的试剂盒，其特征在于，包括以下组分：
1)磁性微球体系：包括有直接连接或间接连接第一结合剂的磁性微球；
2)标记物体系：包括有直接连接或间接连接标记示踪物的第二结合剂；
所述第一结合剂和第二结合剂分别为透明质酸抗原和抗透明质酸结合蛋白抗体，或分别为抗透明质酸结合蛋白抗体和透明质酸抗原，或分别为透明质酸结合蛋白和抗透明质酸抗体；
并且，当所述第一结合剂为透明质酸抗原或抗透明质酸结合蛋白抗体时，还包括以下组分：3)游离透明质酸结合蛋白。
2.根据权利要求1所述的检测透明质酸的试剂盒，其特征在于，所述标记示踪物为发光标记物，选自：金刚烷、鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺及其衍生物、吖啶酯。
3.根据权利要求1所述的检测透明质酸的试剂盒，其特征在于，所述标记示踪物为化学发光催化剂，选自：碱性磷酸酶、过氧化物酶。
4.根据权利要求1所述的检测透明质酸的试剂盒，其特征在于，所述1)磁性微球体系中，所述间接连接第一结合剂的磁性微球由生物素标记的第一结合剂，和链霉亲和素包被的磁性微球组成；或所述间接连接第一结合剂的磁性微球由异硫氰酸荧光素标记的第一结合剂，和抗异硫氰酸荧光素抗体包被的磁性微球组成。
5.根据权利要求1所述的检测透明质酸的试剂盒，其特征在于，所述2)标记物体系中，所述间接连接标记示踪物的第二结合剂由生物素标记的第二结合剂，和链霉亲和素标记的标记示踪物组成；或所述间接连接标记示踪物的第二结合剂由异硫氰酸荧光素标记的第二结合剂，和抗异硫氰酸荧光素抗体标记的标记示踪物组成。
6.根据权利要求1所述的检测透明质酸的试剂盒，其特征在于，所述磁性微球为Fe2O3或Fe3O4磁性纳米粒子与有机高分子材料的复合体，并具有0.1-5μm的粒径；并且，所述磁性微球任选地通过表面改性而带有一种或多种活性功能基团。
7.一种透明质酸的检测方法，其特征在于，采用权利要求1-6任一项所述的试剂盒，包括以下步骤：
1)反应：将待测样本与权利要求1-6任一项所述的试剂盒中各组分混合，温育，得到反应产物；
2)检测：外加磁场将所述反应产物沉淀，去除上清液，并以缓冲液清洗后，加入化学发光激发物，检测发出的相对光强度，通过计算得到透明质酸的含量。
8.根据权利要求7所述的透明质酸的检测方法，其特征在于，所述试剂盒中，所述第一结合剂和第二结合剂分别为透明质酸抗原和抗透明质酸结合蛋白抗体，或分别为抗透明质酸结合蛋白抗体和透明质酸抗原；
步骤1)反应中，将待测样本与磁性微球体系、游离透明质酸结合蛋白和标记物体系混合，温育，使待测样本中的透明质酸与经标记的透明质酸竞争结合游离透明质酸结合蛋白，得到反应产物。
9.根据权利要求8所述的透明质酸的检测方法，其特征在于，步骤1)反应中，先将待测样本与磁性微球体系、游离透明质酸结合蛋白混合，温育，使待测样本中的透明质酸与经标记的透明质酸抗原竞争结合透明质酸结合蛋白后，再外加磁场清洗，加入标记物体系混合，温育。
10.权利要求1-6任一项所述的检测透明质酸的试剂盒在化学发光分析仪中的应用。
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