CN107543927A

CN107543927A - 一种胎盘生长因子的磁微粒化学发光检测试剂盒及制备方法

Info

Publication number: CN107543927A
Application number: CN201711068721.6A
Authority: CN
Inventors: 许殊荣; 程月萍; 李瑶; 杜爱铭; 徐兵
Original assignee: Taiyuan Rui Sheng Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Taiyuan Rui Sheng Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2017-11-03
Filing date: 2017-11-03
Publication date: 2018-01-05

Abstract

本发明公开了一种胎盘生长因子的磁微粒化学发光检测试剂盒及制备方法。该试剂盒包括：偶联有胎盘生长因子捕获抗体的磁微粒、吖啶酯标记的胎盘生长因子检测抗体、胎盘生长因子校准品、化学发光预激发液A、化学发光激发液B以及清洗液。本发明试剂盒以磁分离化学发光技术为检测手段，同时结合吖啶酯标记技术。本发明建立的直接化学发光法灵敏度高、特异性强、准确快速，检测时间短，检测结果具有更高的准确性与重复性，该试剂盒可适用于各种发光检测仪器。

Description

一种胎盘生长因子的磁微粒化学发光检测试剂盒及制备方法

技术领域

本发明属于免疫检测分析技术领域，具体是一种胎盘生长因子的免疫磁微粒化学发光检测试剂盒及制备方法。

背景技术

胎盘生长因子（Placental growth factor，PLGF）的分子结构为糖蛋白同型二聚体分子，其碱基序列与VEGF有高度同源性，53%的蛋白质氨基酸组成与VEGF相同，属于VEGF家族中的新成员。PLGF目前有4种不同蛋白质亚型：PLGF-1、PLGF-2、PLGF-3和PLGF-4，4种亚型均由人类滋养细胞和脐静脉内皮细胞所产生。PLGF在胎盘局部通过自分泌和旁分泌形式调节滋养细胞和内皮细胞的功能。在子宫螺旋动脉重塑过程中，合体滋养层细胞分泌胎盘生长因子（PlGF），促进血管生成，改善血流灌注。妊娠早期胎盘循环未完全建立，胎盘处于相对缺氧状态，此时PIGF水平较低；妊娠10～12周时，绒毛间隙血流建立，胎盘发展至妊娠中期，母体血流增加，氧分压上升，胎盘管生成主要由分支结构向非分支结构转变，而PIGF主要调节非分支血管的生成，PIGF合成也逐渐增加；妊娠28～30周时达到高峰之后胎盘逐渐成熟老化，PIGF水平也随之明显下降。

许多研究表明子痫前期患者PLGF水平较正常妊娠妇女下降，且子痫前期患者的滋养细胞表达PLGF mRNA降低。Rohra等研究结果表明，子痫前期患者血浆中PLGF水平降低，PLGF的合成能力减弱可使滋养细胞增殖和浸润能力减退，造成胎盘缺血、缺氧，导致疾病。子痫前期的临床症状与慢性高血压、肾病, 系统性红斑狼疮、血小板异常性出血、糖尿病血管并发症、妊娠引起的急性脂肪肝等疾病的症状相似，通过检测PLGF水平可以鉴别区分出胎盘源性的子痫前期。

到目前为止，用于检测人血清中胎盘生长因子残留的方法主要有：酶联免疫法（ELISA）、电化学发光法等。但是，酶联免疫法虽然检测价格低廉、快速，但灵敏度不够，只适用于微量物质的检测和鉴定；电化学发光需要使用三个电极才能进行一个未知的、多个电活性样品间复杂反应，电极需要更换而且价格昂贵，由于高浓度的TPA所造成的电化学发光使得电化学发光法具有较高的背景信号等。因此，建立一种有效、快速、简单、灵敏、抗干扰性高的检测胎盘生长因子的方法具有十分重要的意义。

本发明采用方法为直接化学发光法，采用吖啶酯作为化学发光标记物具有明显优势，主要表现在：反应不需要催化剂，只要碱性环境即可进行，反应迅速，可以完全捕捉反应产生的光子，背景发光低，信噪比高，干扰因素少，试剂稳定性好，体系简单，激发液成本低，吖啶酯易与蛋白质联结，且联结后光子产率不减少。本发明建立的磁微粒化学发光法灵敏度高、特异性强、准确快速、检测时间短、检测结果具有更高的准确性与重复性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种灵敏度更高、反应时间短、操作简单、抗干扰性高的胎盘生长因子的磁微粒化学发光检测试剂盒及制备方法。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种胎盘生长因子的磁微粒化学发光检测试剂盒及制备方法，本发明所提供的磁微粒化学发光方法检测胎盘生长因子的试剂盒，采用磁微粒偶联胎盘生长因子捕获抗体，吖啶酯标记胎盘生长因子检测抗体。试剂盒还包括胎盘生长因子校准品、上述吖啶酯作用的化学发光预激发液A、化学发光激发液B以及清洗液。

作为本发明进一步的方案，所述的磁微粒可直接与胎盘生长因子捕获抗体偶联，也可将磁微粒与链霉亲和素偶联，同时采用生物素标记胎盘生长因子捕获抗体。

作为本发明进一步的方案，所述磁微粒的表面修饰基团为一种或多种活性功能基团，包括但不限于羧基、氨基、对甲苯磺酰基或链霉亲和素-生物素。

作为本发明进一步的方案，所述的化学发光标记物为吖啶酯，如NSP-DMAE-NHS、NSP-SA-NHS等。

作为本发明进一步的方案，所述的吖啶酯标记的是胎盘生长因子检测抗体。

作为本发明进一步的方案，所述的吖啶酯标记胎盘生长因子检测抗体的缓冲液是pH 8.0-11.0、浓度为0.01-0.20 mol/L的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液。

作为本发明进一步的方案，所述的捕获抗体与检测抗体均为单克隆抗体。

作为本发明进一步的方案，所述的校准品是用含有0.5-5.0% BSA的Tris或PBS或HEPES缓冲液为基质，加入胎盘生长因子纯品配置而成，校准品形态为液态。

作为本发明进一步的方案，所述的胎盘生长因子校准品溶液浓度分别为：0 pg /mL、5.0 pg /mL、20.0 pg /mL、200.0 pg /mL、1000.0 pg /mL、2000.0 pg /mL。

作为本发明进一步的方案，所述的化学发光预激发液A为H₂O₂和HNO₃的混合液，其中H₂O₂的质量分数为0.01-5.0%，HNO₃的浓度为0.01-1.0 mol/L。

作为本发明进一步的方案，所述的化学发光激发液B为Triton X-100和NaOH的混合液，其中Triton X-100的质量分数为0.01-2.0%，NaOH的浓度为0.05-1.0 mol/L。

作为本发明进一步的方案，所述的清洗液为：pH 7.0-9.0、浓度为5.0-50.0 mmol/L的Tris或HEPES或其它溶液，其中含有质量分数为0.01-0.25%的Tween-20。

本发明的原理是将抗体-抗原反应的高度特异性与吖啶酯发光的高度灵敏性结合起来，利用吖啶酯捕捉反应产生的光子以检测产物浓度。

本发明的优点在于采用双抗体夹心法联合磁微粒化学发光技术，测定胎盘生长因子含量。吖啶酯作为标记物的直接化学发光具有明显优势，主要表现在：反应不需要催化剂，只要碱性环境即可进行，反应迅速，可以完全捕捉反应产生的光子，背景发光低，信噪比高，干扰因素少，试剂稳定性好，体系简单，激发液成本低，吖啶酯易与蛋白质联结，且联结后光子产率不减少。

具体实施方式

本发明提供一种胎盘生长因子的磁微粒化学发光检测试剂盒及制备方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加明确、清楚，以下对本发明进一步详细说明。

本发明提供一种胎盘生长因子的磁微粒化学发光检测试剂盒及制备方法，其中，本发明所提供的磁微粒化学发光方法检测胎盘生长因子的试剂盒，采用磁微粒偶联胎盘生长因子捕获抗体，吖啶酯标记胎盘生长因子检测抗体。试剂盒还包括胎盘生长因子校准品、上述吖啶酯作用的化学发光预激发液A、化学发光激发液B以及清洗液。

具体地，本发明所述的磁颗粒偶联悬浮液由胎盘生长因子捕获抗体偶联的磁颗粒和试剂缓冲液组成，其中胎盘生长因子捕获抗体的浓度为0.1-2.0 mg/mL。

具体地，本发明所述磁珠的内核为四氧化三铁，所述的磁微粒可直接与胎盘生长因子捕获抗体偶联，也可将磁微粒与链霉亲和素偶联，同时采用生物素标记胎盘生长因子捕获抗体。磁珠使用前固相的不完全沉降会影响精确度，因此选择时应选分散性好，沉降速度慢的磁珠。

具体地，本发明在制备磁微粒混悬液时，所述偶联抗体缓冲液为pH 5.0-6.0，浓度为20-200 mmol/L 的MES缓冲液。

具体地，本发明在制备磁微粒混悬液时，所述封闭缓冲液为含1%BSA的缓冲液。

具体地，本发明在制备标记液相试剂时，所述标记缓冲液是pH 8.0-11.0、浓度为0.01-0.20 mol/L的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液。

具体地，本发明所述校准品是用含有0.5-5.0% BSA的Tris或PBS或HEPES缓冲液为基质，加入胎盘生长因子纯品配置而成，校准品形态为液态。

具体地，本发明所述的化学发光预激发液A为H₂O₂和HNO₃的混合液，其中H₂O₂的质量分数为0.01-5.0%，HNO₃的浓度为0.01-1.0 mol/L。

具体地，本发明所述化学发光激发液B为Triton X-100和NaOH的混合液，其中Triton X-100的质量分数为0.01-2.0%，NaOH的浓度为0.05-1.0 mol/L。

具体地，本发明所述清洗液为：pH 7.0-9.0、浓度为5.0-50.0 mmol/L的Tris或HEPES或其它溶液，其中含有质量分数为0.01-0.25%的Tween-20。

下面通过实施例对本发明进行详细说明。

实施例1：所述的一种检测胎盘生长因子的磁微粒化学发光试剂盒的组建及制备方法，包括以下步骤：

1. 试剂盒的组建：

组建一种检测胎盘生长因子的磁微粒化学发光试剂盒，使其含有下列组分：

磁微粒偶联的胎盘生长因子单克隆抗体；

吖啶酯标记的另一株胎盘生长因子单克隆抗体；

胎盘生长因子系列标准品溶液；

化学发光预激发液A和化学发光激发液B；

清洗液。

2. 偶联有胎盘生长因子单克隆抗体的磁微粒混悬液的制备

（1）取1 mg羧基磁微粒于0.5 mL离心管中，加入200 μL浓度为0.1 mol/L的MES缓冲液，涡旋混匀，置于磁力架上，静置5 min使磁微粒与液体分开，弃去上清，洗涤3次，再加入200μL的MES（pH为6.0）缓冲液，涡旋。

（2）加入15 μg的胎盘生长因子单克隆抗体，使羧基与抗体的摩尔比为150:1，涡旋，旋转反应管，室温孵育30 min。

（3）加入10 μL浓度为10 mg/mL的偶联试剂EDC，于旋转反应器上涡旋，室温孵育2h。

（4）取200 μL含1%BSA的甘氨酸缓冲液（浓度为50 mmol/L）进行封闭，时间为1h。

（5）去上清，加入200 μL的清洗缓冲液（TBS+0.05%Tween-20），洗涤3次。

（6）将上述制备好的磁微粒混悬液置于500 μL保存液（300 mmol/L甘氨酸、2%甘油、5%蔗糖）中，2-8℃保存。

3. 吖啶酯标记的胎盘生长因子单克隆抗体液相试剂的制备

（1）纯化胎盘生长因子单克隆抗体：将100 μg胎盘生长因子单克隆抗体置于透析袋中，并将透析袋置于不小于1 L的标记缓冲液中透析，期间缓冲液更换5次，最后一次透析过夜，标记缓冲液是pH 9.8、浓度为50 mmol/L的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液。

（2）称取1.7 mg的吖啶酯NSP-DMAE-NHS，溶于447 μL无水二甲基甲酰胺（DMF）中，配成6.5 mmol/L的NSP-DMAE-NHS DMF溶液。

（3）将经透析过后的胎盘生长因子单克隆抗体溶液置于500 μL离心管内，加入200μL标记缓冲液，然后加入759 μL、6.5 mmol/L的NSP-DMAE-NHS DMF溶液（避光反应）使吖啶酯与胎盘生长因子单克隆抗体的摩尔比为7.4:1，振荡混匀，室温下反应1 h，加入100 μL浓度为10 g/L的赖氨酸，静置15 min，使标记反应终止。

（4）标记物NSP-DMAE-NHS-Ab与游离NSP-DMAE-NHS通过Sephadex G-50柱（1×25cm）分离，用纯化缓冲液pH 6.3、浓度为0.1mol/L的PBS平衡并淋洗层析柱。

（5）分离过程中用色谱仪检测蛋白峰，分别测量流出液的化学发光强度和280nm吸光度值。

（6）收集光度值高且吸光度大的洗脱液，加入1% BSA后分装冰冻保存。

4. 胎盘生长因子校准品的制备

用含有2% BSA的Tris-HCl 缓冲液将胎盘生长因子纯品配制成标示浓度为0 pg /mL、5.0 pg /mL、20.0 pg /mL、200.0 pg /mL、1000.0 pg /mL、2000.0 pg /mL共6个浓度的校准品梯度值。

5. 化学发光激发液A、B的制备

（1）化学发光预激发液A由H₂O₂和HNO₃组成。其中，其中H₂O₂的质量分数为1.5%，HNO₃的浓度为0.1 mol/L，用棕色瓶分装成20 mL/支，2-8℃保存备用。

（2）化学发光激发液B由Triton X-100 和NaOH的混合液组成。其中，Triton X-100的质量分数为1.0%，NaOH的浓度为0.4 mol/L，用棕色瓶分装成20 mL/支，2-8℃保存备用。

6. 清洗液的制备

称量3.05g Tris，8.775g NaCl至1000 mL的烧杯中，加入1mL质量分数为0.05% Tween-20，搅拌混匀，定容，将pH调至7.6后保存备用。

实施例2：利用所述的胎盘生长因子的磁微粒化学发光检测试剂盒进行检测的步骤为：

（1）在反应杯中加入待测样本50 μL，再加入磁颗粒偶联悬浮液150 μL，振荡混匀，37℃孵育8 min。

（2）分离，清洗3次，将洗涤后的反应容器充分振荡使磁微粒散开。

（3）向反应杯中加入吖啶酯标记物150 μL，振荡混匀，37℃孵育7 min。

（4）分离，清洗3次，将洗涤后的反应容器充分振荡使磁微粒散开。

（5）加入100 μL化学发光预激发液A，1 s后加入100 μL化学发光激发液B，测量其相对发光强度，样本中胎盘生长因子的含量与其相对发光强度成一定比例关系。

实施例3：试剂盒的性能指标

（1）分析灵敏度

用试剂盒中0 pg/mL校准品作为待测样本，重复测定20次，得出20次测量结果的RLU值（相对发光值），计算其平均值（M）和标准差（SD），得出 M+2SD 所对应RLU值，根据零浓度校准品与相邻校准品之间的浓度-RLU值结果进行两点回归拟合得出一次方程，将 M+2SD 的RLU 值带入上述方程中，求出对应的浓度值。按检测方案中最低检测限检测方法，重复3次实验，最后求出本试剂盒对胎盘生长因子的分析灵敏度为4.1 pg/mL。

（2）精密度

用胎盘生长因子试剂盒测试浓度为(30.0±1.5) pg/mL和(1500.0±20.0) pg/mL的样本，每个浓度重复测试10次，计算试剂盒精密度，结果表明该试剂盒CV均小于5%。

（3）稳定性

取胎盘生长因子检测试剂盒进行常规贮存稳定性试验，2-8℃放置分别按时间1，3，5，7，9，11，12，13，14，15个月进行检测；开盖稳定性试验分别按2-8℃放置0天、7天、14天、16天、18天、20天、22天、24天、26天、28天、30天、32天进行测定。结果显示胎盘生长因子检测试剂盒贮存于2-8℃、避光环境中，有效期为12个月。开盖贮存于2-8℃、避光环境中，有效期为30天。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims

1.一种胎盘生长因子的磁微粒化学发光检测试剂盒及其组成，其特征在于：包括偶联有胎盘生长因子捕获抗体的磁微粒混悬液、吖啶酯标记的胎盘生长因子检测抗体、校准品、化学发光预激发液A、化学发光激发液B以及清洗液。

2.根据权利要求1所述的一种胎盘生长因子的磁微粒化学发光检测试剂盒及其组成，其特征在于：所述的磁珠的内核为四氧化三铁或三氧化二铁，磁微粒的表面修饰基团为一种或多种活性功能基团，包括但不限于羧基、氨基、对甲苯磺酰基或链霉亲和素-生物素。

3.根据权利要求1所述的一种胎盘生长因子的磁微粒化学发光检测试剂盒及其组成，其特征在于：所述的磁微粒可直接与胎盘生长因子捕获抗体偶联，或将磁微粒与链霉亲和素偶联，同时采用生物素标记胎盘生长因子捕获抗体。

4.根据权利要求1所述的一种胎盘生长因子的磁微粒化学发光检测试剂盒及其组成，其特征在于：所述的化学发光标记物为吖啶酯，如NSP-DMAE-NHS、NSP-SA-NHS等。

5.根据权利要求1所述的一种胎盘生长因子的磁微粒化学发光检测试剂盒及其组成，其特征在于：所述的吖啶酯标记的是胎盘生长因子检测抗体。

6.根据权利要求1所述的一种胎盘生长因子的磁微粒化学发光检测试剂盒及其组成，其特征在于：所述的捕获抗体与检测抗体均为单克隆抗体。

7.根据权利要求1所述的一种胎盘生长因子的磁微粒化学发光检测试剂盒及其组成，其特征在于：所述的校准品是以含有BSA的缓冲液为基质，加入胎盘生长因子纯品配置而成的系列浓度梯度的校准品溶液。

8.根据权利要求1所述的一种胎盘生长因子的磁微粒化学发光检测试剂盒及其组成，其特征在于：所述的化学发光预激发液A由H₂O₂和HNO₃的混合液组成，化学发光激发液B由Triton X-100和NaOH的混合液组成。

9.根据权利要求1所述的一种胎盘生长因子的磁微粒化学发光检测试剂盒及其组成，包括以下步骤：在反应杯中加入一定量的待测样本，再加入磁颗粒偶联悬浮液，混匀，37℃孵育，加入清洗液去掉上清；之后按照一定的比例加入吖啶酯标记物，37℃孵育，加入清洗液去掉上清，加入化学发光预激发液A和激发液B，测定相应的发光强度RLU/s。