CN108445215A - 一种定量检测髓过氧化物酶的试剂盒及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种定量检测髓过氧化物酶的试剂盒，试剂盒包括髓过氧化物酶校准品、包被有链亲和素的磁微粒、吖啶类衍生物标记的髓过氧化物酶的单克隆抗体、生物素标记髓过氧化物酶的单克隆抗体、化学发光底物、质控品和清洗液。同时，试剂盒的制备方法包括，以过氧化物酶纯品原料配制校准品；制备吖啶类衍生物标记的抗体；制备生物素化抗体；以链亲和素包被磁微粒；分装上述校准品、标记物混合液和化学发光底物；组装为成品。本发明的试剂盒灵敏度高，特异性好，定量检测结果准确度高，使用成本低，更易推广应用。

Description

一种定量检测髓过氧化物酶的试剂盒及制备方法
技术领域
本发明涉及生物医学领域，特别涉及一种定量检测髓过氧化物酶的试剂盒及制备方法。
背景技术
髓过氧化物酶(MPO)是白细胞中的嗜苯胺蓝颗粒中的主要成分，固有免疫中由白细胞活化时分泌。MPO是血色素过氧化物酶超家族的一员，相对分子量140KDAa的糖基化四聚体血红素蛋白，含有两个相同的亚单位，每个亚单位又由一条重链和一条轻链通过二硫键结合形成，MPO以三种亚型存在髓系细胞中，分别为MPOⅠ、MPOⅡ、MPOⅢ，三种亚型结构上的差异主要在重链，最终导致它们在相对分子质量、疏水性等方面的不同，三种亚型在功能上的差异尚无定论。
在心血管疾病的发生发展过程中，从内皮功能障碍的扎起发展到粥样斑块的形成及随后的破裂，MPO催化的反应对潜在的动脉粥样硬化前期有生物活性，MPO催化产生许多反应氧化物及激活物，这些产物能促使脂质过氧化以及对靶蛋白产生大量的翻译修饰后作用，包括氧化、硝基化、氧化交联。
髓过氧化物酶通过产生自由基和多种反应性物质，促进斑块形成和不稳定性增加，加速动脉粥样硬化进展，进而引起多种并发症。冠心病是心血管系统中最常见的疾病，而动脉粥样硬化(AS)又是形成冠心病的重要病理基础。AS发病过程中通常出现氧化低密度脂蛋白，进而巨噬细胞吞噬脂质变成泡沫细胞，泡沫细胞的形成在AS的发生机制中起关键作用。研究发现MPO有促进AS病变形成的作用，MPO通过产生自由基和多种反应性物质，促进斑块形成和不稳定性增加，加速AS进展，进而引起多种并发症如急性冠脉综合征(ACS)。研究发现，MPO缺陷的个体罹患心血管疾病的危险性明显下降。MPO水平的升高不仅与患冠状动脉疾病易感性相关，还可以预测早期患心肌梗死的危险性。MPO促进ACS病变形成，并影响粥样斑块的稳定性，通过增大氧化应激而引起急性冠脉综合征(ACS)。目前的研究表明，MPO是预测ACS患者发生不良心血管事件的一个新的预测因子，特别是在肌钙蛋白T(TnT)水平较低的患者，MPO能够识别那些将来发生心血管事件危险性较高的患者。
现有技术检测方法主要包括金标免疫法、免疫比浊法、酶联免疫法。近十年来标记免疫分析技术的研究和应用发展迅速，已广泛应用于生物医学基础理论研究及临床疾病诊断各领域。但现有技术中对MPO的检测方法一般都有各自的特点及不足：金标免疫法缺点是诊断时间点晚，并不能提前预警；诊断准确性低，溯源性较差；灵敏度低；特异性差。免疫比浊法受制于浊度检测的干扰灵敏度、特异性会受到影响，不能全面反映患者的早期情况，酶联免疫法测定MPO的含量，快速并可定量检测，一般酶联试剂使用辣根过氧化物酶标记抗体，直接使用MPO作为标准品，其检测体系中MPO本身的过氧化物酶属性易可能催化底物造成干扰。
现有技术在MPO免疫分析产品的应用定量检测的技术也存在灵敏度低，特异性差的缺点限制了推广使用，无法广泛地应用于临床诊断和科研工作。
发明内容
本发明提供一种定量检测髓过氧化物酶的试剂盒及制备方法，克服现有技术的灵敏度低，特异性差的缺点。
一方面，本发明提供了一种定量检测髓过氧化物酶的试剂盒，本发明的试剂盒包括：
（1）髓过氧化物酶校准品；
（2）包被有链亲和素的磁微粒；
（3）吖啶类衍生物标记的髓过氧化物酶的单克隆抗体
（4）生物素标记髓过氧化物酶的单克隆抗体；
（5）化学发光底物；
（6）质控品；
（7）清洗液。
另一方面，本发明提供了一种定量检测髓过氧化物酶的试剂盒的制备方法，该方法包括：
（1）以髓过氧化物酶纯品原料配制校准品 ；
（2）制备吖啶类衍生物标记的抗体；
（3）制备生物素化抗体；
（4）以链亲和素包被磁微粒 ；
（5）分装上述校准品、标记物混合液和化学发光底物；
（6）组装为成品。
在上述根据本发明的试剂盒及其制备方法中，所述磁微粒载体还可以为固相载体、微孔板、塑料管或塑料珠；
在其中一个实施例中，所述载体优选为磁性微粒：由于其表面积大及结合蛋白能力强，所述磁微粒为粒径2.5～3μm，所述活性基团为氨基或羧基，所述磁微粒的使用浓度为10mg/mL。
所述吖啶类衍生物标记物可以为吖啶酯 ，吖啶酮类化合物，吖啶磺酰胺类化合物或吖啶基氨基乙酸；
在其中一个实施例中，标记物还可以为磺酸丙基吖啶酸-NHS酯。
所述化学发光底物A由H2O2和HNO3 组成；所述化学发光底物B由聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100） 和NaOH。
在根据本发明的方法中，其中所述步骤（2）中的制备吖啶类衍生物标记的抗体可以包括以下过程：
（1）称取MPO单抗适量，使用0.05mol/L pH 9.5 碳酸盐缓冲液（CB） 调正至1mg/mL；
（2）吖啶类衍生物与抗体按照1:15摩尔计算，溶于二甲基甲酰胺（DMF），将两者混合，室温反应30min；
（3）反应液移至透析袋(截留分子量8000～12000)，使用0.01M pH 7.2的磷酸盐缓冲液（PBS）透析24小时；
（4）加入等体积甘油和体积比0.1％ 生物防腐剂ProClin 300 (PC-300）。
在根据本发明的方法中，其中所述步骤（3）中的制备生物素化抗体可以包括以下过程：
（1）称取MPO单抗适量，0.01MpH7.2的磷酸盐缓冲液（PBS）透析纯化；
（2）加入15倍（摩尔比）已活化的长链磺化生物素（Sulfo‐NHS‐LC‐Biotin），2～8℃ 反应2小时后再转入室温继续反应30分钟 ；
（3）反应液移至透析袋(截留分子量8000～12000)，使用0.01MpH7.2的PBS透析24小时；
（4）加入等体积甘油和体积比0.1％的PC-300。
在根据本发明的方法中，其中所述步骤（4）中的以链亲和素包被磁微粒可以包括以下过程：
（1）100mL 0.05mol/L 2-吗啉乙磺酸溶液，依次加入 10 mg 磁性微粒和3 mg链酶亲和素；
（2） 然后加入10mg/mL 碳二亚盐酸盐溶液4μL ，反应2小时，在磁场作用下移去上清液；
（3）加入0.01M pH 7.2的PBS 10 mL，混匀，移去上清液；
（4）使用0.01M pH 7.2的PBS 重复洗涤3次，稀释至0.75mg/mL。
在本发明的过程中，发明人发现，髓过氧化物酶抗体原料的筛选，对髓过氧化物酶定量检测的灵敏度有较大影响；
在本发明的其中一个实施例中，髓过氧化物酶（MPO）不同配对的生物素化单克隆抗体和标记单克隆抗体要求这些髓过氧化物酶单克隆抗体，纯度不低于90％；
其中，生物素化抗体浓度为0.23μg/ mL，低或高于于此浓度，会使MPO定量检测的灵敏度偏低 ；
本发明“髓过氧化物酶化学发光免疫分析定量测定试剂盒”可以准确地定量检测出病人髓过氧化物酶（MPO）的含量，可以根据MPO含量，对心血管疾病的病情进行监测、疗效评价和预后的判断有重要意义。它具有高特异性、高灵敏度、高精确性、高准确性、简便快速等优点。根据本发明的试剂盒，吖啶脂标记的MPO单抗与载体上包被的MPO单抗和被测样品的MPO抗原形成双抗体夹心的结构，因此本发明采用的“双抗体夹心一步法”反应模式，既有效地利用了化学发光技术原理、又确保了检测的灵敏性。
进一步地，本发明中对原料进行了筛选及优化，原料的筛选将影响包括标记抗体与包被抗体的活性、载体的吸附性能和变异大小等；最终影响试剂盒的灵敏度和特异性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是试剂盒校准曲线图，以校准品浓度为横坐标，RLU值为纵坐标绘出标准曲线，采用双对数进行曲线拟合，其中线性方程为y=0.9544x+3.1025，r= 0.9999；
图2为试剂盒制备方法的流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 MPO吖啶脂标记单抗的制备
1）称取MPO单抗适量，使用0.05mol/L pH 9.5 碳酸盐缓冲液（CB） 调整至1mg/mL；
2） 吖啶脂与抗体按照1:15摩尔计算，溶于DMF，将两者混合，室温反应30min；
3）反应液移至透析袋(截留分子量8000～12000)，使用0.01M pH 7.2的PBS透析24小时；
4）加入等体积甘油和0.1％ PC-300。
所述吖啶酯标记物可以为吖啶酮类化合物，吖啶磺酰胺类化合物或吖啶基氨基乙酸。
实施例2 制备本发明的MPO定量测定试剂盒
一、吖啶脂抗体制备
1. 吖啶脂标记单抗稀释液Buffer A :
Buffer A： 0.01-0.1M PBS pH 7.2，0.1%-1%BSA，0.2% PC-300
2. 吖啶脂标记单抗浓度选定：
吖啶脂标记单抗的工作浓度大于0.45μg/ mL。
二、MPO校准品的制备
用0.01M PBS pH 7.2，0.5%BSA 稀释液稀释MPO抗原，配制标准品浓度为0、5、25、100、500、2000ng/mL 五种浓度的校准品。
三、吖啶类衍生物标记的抗体制备：
1）称取MPO单抗适量，使用0.05mol/L pH 9.5 CB 调正至1mg/mL；
2） 吖啶类衍生物与抗体按照1:15摩尔计算，溶于DMF，将两者混合，室温反应30min；
3） 反应液移至透析袋(截留分子量8000～12000)，使用0.01M pH 7.2的PBS透析24小时；
4）加入等体积甘油和0.1％ PC-300。
所述吖啶类衍生物标记物可以为吖啶酯，吖啶酮类化合物，吖啶磺酰胺类化合物或吖啶基氨基乙酸。
四、生物素化抗体制备：
1）称取MPO单抗适量，0.01M pH 7.2的PBS 缓冲液透析纯化；
2）加入15倍（摩尔比）已活化的长链磺化生物素（Sulfo‐NHS‐LC‐Biotin） ，2～8℃ 反应2h后再转入室温继续反应30min ；
3）反应液移至透析袋(截留分子量8000～12000)，使用0.01M pH 7.2的PBS透析24小时；
4）加入等体积甘油和0.1％ PC-300。
五、链亲和素包被磁微粒：
1）100mL 0.05mol/L 2-吗啉乙磺酸溶液，依次加入 10 mg 磁性微粒和3 mg链酶亲和素；
2） 然后加入10mg/mL 碳二亚盐酸盐溶液4μL ，反应2小时，在磁场作用下移去上清液；
3）加入0.01M pH 7.2的PBS 10 mL，混匀，移去上清液；
4）使用0.01M pH 7.2的PBS 重复洗涤3次，稀释至0.75mg/mL。
六、质控品制备：
用0.01M PBS pH 7.2，0.5% 牛血清白蛋白（BSA）校准品稀释液稀释MPO抗原，配制质控品浓度为10、200ng/mL 2种浓度的质控品。
七、化学发光底物液制备：
化学发光液A:
由H2O2 和HNO3 组成，H2O2 质量分数1.6%，HNO3 浓度为0.1 mol/L 用棕色瓶分装室温保存；
化学发光液B:
由Triton X-100 和NaOH 组成，Triton X-100 浓度为0.1 mol/L ，NaOH浓度为0.36mol/L用粽瓶分装室温保存。
八、清洗液：
0.02M pH 7.2的Tris-HCl 溶液；
Tween -20 质量分数0.05%；
NaCl 浓度为0.15 mol/L。
九、成品组成。
实施例3 缓冲液Buffer
缓冲液作为本发明的重要组成，其是稀释生物素化抗体、吖啶类衍生物标记的抗体、链亲和素包被磁微粒的缓冲液，使用BSA、海藻糖与酪蛋白的组合配方，改善磁微粒非特异性物理吸附免疫球蛋白的情况，进一步降低特异结合，提高试剂的分析灵敏度。
Buffer A：0.01-0.1M PBS pH 7.2，质量比0.1%-1%BSA，体积比0.2% PC-300；
Buffer B：0.01-0.1M PBS pH 7.2，质量比0.1%-1%BSA，质量比0.1%-5% 海藻糖，质量比0.5%-1% 酪蛋白，体积比0.2% PC-300。
分析灵敏度=2* (0值 RLU SD)* 5/(校准品RLU mean - 0值 RLU mean)
使用Buffer B 作为吖啶酯‐MPO抗体结合物（AE-MPO）2#、AE-MPO4#(2#、4#为抗体编号)、磁微粒‐链酶亲和素(M)试剂的稀释液，其分析灵敏度为0.083ng/mL，Buffer B 缓冲液起到降低非特异结合，提高试剂的分析灵敏度，提高临床低值样本测定值的准确性。
实施例4 MPO原料修饰及筛选
MPO抗体原料的筛选，对MPO定量检测的灵敏度有较大影响；
本发明中，发明人对多种MPO单克隆抗体进行筛选，抗体的选择，将直接影响本发明试剂盒的灵敏度和准确性。
首选对MPO单克隆抗体进行水解和纯化，MPO单抗进行水解得到F(ab’)2片段：
1.F(ab’)2片段的制备方法：
1）MPO抗体用pH 5.5的0.1 mol/L乙酸钠-乙酸缓冲液透析过夜；
2）将木瓜蛋白酶用缓冲液配成10 mg/ml，并加2 mmol/L乙二胺四乙酸（ EDTA）及1mmol/L半胱氨酸，37℃孵育30 min激活木瓜蛋白酶；
3）激活的木瓜蛋白酶过葡聚糖凝胶G-25（Sephadex G-25）层析柱纯化木瓜蛋白酶；
4）将抗体与纯化后的酶按5：1(质量比)混合，水浴15 h后加20 mmol／L碘乙酰胺避光冰浴1.5h终止反应，用pH 7.5的10 mmol/L PB透析过夜。
2.F(ab’)2片段的纯化
pH 7.5的10 mmol/L磷酸盐（ PB）平衡纤维素52（DEAE-52）离子交换树脂柱。透析后的F(ab’)2片段上样，用pH 7.5的10 mmol/L PB淋洗，然后用0-0.2 mol／L氯化钠梯度洗脱收集样品，280 nm波长处检测，首峰样品为F(ab’)2片段。收集样品，用0.2μm膜除菌后约15%聚乙二醇20000（PEG 20000）浓缩回原体积。
选择4 株水解纯化后的MPO单克隆抗体编号记为MPO1-4#，4株单抗分别进行标记吖啶脂和生物素化，配制吖啶脂抗体浓度为0.6μg/ml，生物素化抗体浓度为0.3μg/ml，用0.01M PBS pH 7.2，0.5%BSA 稀释液稀释及5、25、100、500、2000ng/mL 五种浓度的校准品个浓度重复测定2 次，采用棋盘格滴定法，共12组试验，通过化学发光仪进行检测，并得出RLU值。
使用吖啶脂标记MPO2#单抗与生物素化MPO4#配对效果最佳，试验结果证实水解并纯化后的MPO单抗具有高亲和力的免疫结合能力，符合免疫定量试剂的要求，且非特异性结合低，可切实提高试剂的分析灵敏度水平。
实施例5 本发明的试剂盒的方法学鉴定
按照该产品的技术标准要求对实施例2中制备的试剂盒进行检定，
（1）试剂盒灵敏度实验
以S0校准品进行20孔重复测定，其平均值加上两倍标准差带入曲线方程所得的浓度值为试剂盒的灵敏度，其灵敏度为0.083 ng/mL。
（2）试剂盒特异性实验
与其类似物作交叉反应实验，交叉反应率<0.01%。
（3）试剂盒精密性实验
批内变异
取10、200ng/mL两水平质控品分别进行10孔平行实验，计算测定值的平均值（）和标准差（s）。按公式CV＝s/×100％计算变异系数，批内变异系数CV分别为4.57%、3.19%。
批间变异
选择5份不同浓度的血清样品对每份血清进行3次重复测定，计算其批间变异系数（CV％），批间变异CV小于5%。
（4）试剂盒准确性实验
将高浓度的校准品原料，用正常人血清稀释成四个不同浓度值，每个浓度做5孔平行实验，分别计算回收率在91-108%范围内。
（5）试剂盒稳定性实验
试剂盒保存温度为2-800C，经过15个月的测定试剂盒的各项指标均满足要求，考虑到运输和使用过程中对试剂盒的影响，我们进行370C ，7天的加速实验，实验结果表明试剂盒的各项指标完全符合要求。
说明“髓过氧化物酶化学发光免疫分析定量测定试剂盒”的灵敏度、特异性、精密性、准确性和稳定性是完全合格的。
本发明“髓过氧化物酶化学发光免疫分析定量测定试剂盒”可以准确地定量检测出病人MPO的含量，可以根据MPO含量，对心血管疾病的病情进行监测、疗效评价和预后的判断有重要意义。它具有高特异性、高灵敏度、高精确性、高准确性、简便快速等优点。根据本发明的试剂盒，吖啶脂标记的MPO单抗与载体上包被的MPO单抗和被测样品的MPO抗原形成双抗体夹心的结构，因此本发明采用的“双抗体夹心一步法”反应模式，既有效地利用了化学发光技术原理、又确保了检测的灵敏性。
进一步地，本发明中对原料进行了筛选及优化，原料的筛选将影响包括标记抗体与包被抗体的活性、载体的吸附性能和变异大小等；最终影响试剂盒的灵敏度和特异性。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种定量检测髓过氧化物酶的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括髓过氧化物酶校准品、包被有链亲和素的磁微粒、吖啶类衍生物标记的髓过氧化物酶的单克隆抗体、生物素标记髓过氧化物酶的单克隆抗体、化学发光底物、质控品和清洗液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述吖啶类衍生物为吖啶酯、吖啶酮类化合物、吖啶磺酰胺类化合物、吖啶基氨基乙酸或磺酸丙基吖啶酸-NHS酯。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述磁性颗粒为2-3μm的磁性微球，磁微粒的使用浓度为10mg/mL。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述标记的髓过氧化物酶的单克隆抗体是其单抗的F(ab’)2片段，所述F(ab’)2片段的制备方法，包括：
（1）髓过氧化物酶抗体用pH 5.5的0.1 mol/L乙酸钠-乙酸缓冲液透析过夜；
（2）将木瓜蛋白酶用缓冲液配成10 mg/ml，并加2 mmol/L 乙二胺四乙酸及1 mmol/L半胱氨酸，37℃孵育30分钟激活木瓜蛋白酶；
（3）激活的木瓜蛋白酶过葡聚糖凝胶G-25层析柱纯化木瓜蛋白酶；
（4）将抗体与纯化后的酶按质量比5：1混合，水浴15 小时后加20 mmol／L碘乙酰胺避光冰浴1.5小时终止反应，用pH 7.5的10 mmol/L磷酸盐透析过夜；
所述F(ab’)2片段的纯化方法，包括：
（1）pH7.5的10mmol/L PB平衡纤维素52离子交换树脂柱，透析后的F(ab’)2片段上样，用pH 7.5的10 mmol/L磷酸盐淋洗；
（2）用0-0.2 mol／L氯化钠梯度洗脱收集样品，280 nm波长处检测，首峰样品为F(ab’)2片段，收集样品；
（3）用0.2μm膜除菌后约15%聚乙二醇20000浓缩回原体积。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述所述试剂盒还包括缓冲液，用于稀释生物素化抗体、吖啶类衍生物标记的抗体、链亲和素包被磁微粒，所述缓冲液包括0.01-0.1M pH 7.2的磷酸缓冲盐，质量比0.1%-1% 的牛血清白蛋白，质量比0.1%-5%的海藻糖，质量比0.5%-1%的酪蛋白，体积比0.2 %的生物防腐剂ProClin 300。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的生物素化抗体浓度为0.23μg/ mL。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物由化学发光液A和化学发光液B组成:
所述化学发光液A由质量比1.6% 的H2O2 和浓度为0.1 mol/L 的HNO3 组成；
所述化学发光液B由0.1 mol/L聚乙二醇辛基苯基醚 和0.36 mol/L NaOH 组成。
8.一种制备权利要求1所述试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）以髓过氧化物酶纯品原料配制校准品 ；
（2）制备吖啶类衍生物标记的抗体；
（3）制备生物素化抗体；
（4）以链亲和素包被磁微粒 ；
（5） 分装上述校准品、标记物混合液和化学发光底物；
（6）组装为成品。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述制备吖啶类衍生物标记的抗体包括以下过程：
（1）称取髓过氧化物酶单抗适量，使用0.05mol/L pH 9.5碳酸盐缓冲液调正至1mg/mL；
（2） 吖啶类衍生物与抗体按照1:15摩尔计算，溶于二甲基甲酰胺，将两者混合，室温反应30分钟；
（3） 反应液移至截留分子量8000～12000的透析袋，使用0.01M pH 7.2的磷酸盐缓冲液透析24小时；
（4）加入等体积甘油和体积比0.1％的生物防腐剂ProClin 300；
所述制备生物素化抗体可以包括以下过程：
（1）称取髓过氧化物酶单抗适量，0.01M pH 7.2的磷酸盐缓冲液透析纯化；
（2）加入摩尔比15倍已活化的长链磺化生物素，2～8℃ 反应2小时后再转入室温继续反应30分钟；
（3）反应液移至截留分子量8000～12000的透析袋，使用0.01M pH 7.2的磷酸盐缓冲液透析24小时；
（4）加入等体积甘油和体积比0.1％ 的生物防腐剂ProClin 300；
所述以链亲和素包被磁微粒可以包括以下过程：
（1）100mL 0.05mol/L 2-吗啉乙磺酸溶液，依次加入 10 mg 磁性微粒和3 mg链酶亲和素；
（2） 然后加入10mg/mL 碳二亚盐酸盐溶液4μL ，反应2小时，在磁场作用下移去上清液；
（3）加入0.01M pH 7.2的磷酸盐缓冲液10 mL，混匀，移去上清液；
（4）使用0.01M pH 7.2的磷酸盐缓冲液重复洗涤3次，稀释至0.75mg/mL。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述制备吖啶脂标记单抗的浓度大于0.45μg/ mL。
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