CN107632163A - 一种超敏c反应蛋白的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种超敏C反应蛋白的检测方法，包括以下步骤：通过样本稀释液将标准品制成标准测试样本，得到其发光信号值，然后以标准品浓度为横坐标，信号值为纵坐标绘制成标准曲线；制备链霉亲和素磁珠、标记物缓冲液、生物素标记的hs‑CRP抗体和吖啶酯标记的hs‑CRP抗体；再取适量的待测血清样品加入全自动发光免疫分析仪的反应杯中，并加入适量的步骤2)制备的生物素标记抗体、吖啶酯标记抗体、链霉亲和素磁珠温浴，测试发光值，得出待测血清样品中的超敏C反应蛋白的浓度，即得。

Description

一种超敏C反应蛋白的检测方法

技术领域

本发明涉及一种C反应蛋白的检测方法，具体涉及一种超敏C反应蛋白的检测方法，属于生物检测技术领域。

背景技术

C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)因其能和肺炎双球菌的细胞壁的C多糖起沉淀反应而得名,是相对分子质量为115-140KD的血清β球蛋白。CRP持续增高提示机体存在慢性炎症或自身免疫疾病，CRP在病毒感染时不会升高，其变化不受患者的个体差异、机体状态和治疗药物的影响。近年来，随着检测技术的进步，采用超敏感方法检测到的CRP被称为超敏CRP(hs-CRP)。大量的文章研究显示，它在冠心病、中风、周围血管栓塞等疾病诊断和预测中发挥越来越重要的作用，甚至被认为是心血管病危险评估的“金标准”。

在许多的国家，冠状动脉心脏疾病(CHD)仍然是发病率和死亡率最高的疾病，但是常规的危险因子诊断将会漏掉相当数量的会得心肌梗塞的患者。事实上，在Framingham心脏研究中心进行治疗的心肌梗塞患者中，仅有50％的血清中的胆固醇的含量明显的升高。幸运的是，在过去的10年中，我们所认识的由于动脉硬化症引起的冠状动脉疾病的诊断得到了很大的提高，并且越来越多的证据表明C反应蛋白是冠状动脉疾病诊断的非常好的指示物。以前，我们认为冠状动脉疾病仅仅是由于脂肪沉积在动脉壁上引起的。但是，今天，这种疾病被认为是多种因素共同参与的一个过程，其中慢性炎症起着重要的作用。最近的研究表明C反应蛋白是炎症的非常好的指示物，当显著增加时，它也是冠状动脉疾病的很好的指示物。事实上，几个美国和欧洲的预期的研究表明C反应蛋白的浓度在正常参考范围内时，在明显健康的个体中，可以预测将来发生冠状动脉疾病的可能性。

超敏C反应蛋白是临床实验室采用了超敏感检测技术，能准确的检测低浓度C反应蛋白，提高了试验的灵敏度和准确度，是区分低水平炎症状态的灵敏指标,血清hs-CRP水平与动脉粥样硬化及急性脑梗死(ACI)的发生、严重程度及预后密切相关。有研究显示,在急性脑梗死老年患者中,CRP升高者预后不佳；hs-CRP含量与梗死面积、神经功能缺损程度相关,是脑梗死患者病变程度的指标之一；而且CRP也参与了血栓形成和动脉硬化的病理过程,是脑卒中的危险因素之一。动脉粥样硬化斑块的炎症反应是斑块破裂和不稳定的重要原因,在动脉粥样硬化斑块的形成过程中,CRP、补体复合物和泡沫细胞等沉积在动脉壁内,CRP可与脂蛋白结合,激活补体系统,产生大量炎症介质,释放氧自由基,造成血管内膜损伤、血管痉挛及不稳定斑块脱落,加重动脉粥样硬化所致的管腔狭窄以及ACI的发生。近年来越来越多的证据表明,低水平CRP与心血管疾病的其他危险因素密切相关,如高血压、高脂血症；同时,CRP升高可增加高血压患者心脏病、脑卒中的发病率；因此,CRP是与动脉粥样硬化发生、演变和发展都有关的促炎因子。流行病学调查也显示,hs-CRP水平升高者发生急性脑卒中的几率是正常健康人的2倍,发生心肌梗死的几率是正常者的3倍。2003年欧洲高血压防治指南(ESH/ESC)正式推荐,高血压患者需检测hs-CRP水平。超敏C反应蛋白的临床指导作用主要表现在对心血管疾病，新生儿细菌感染，肾移植等方面。

然而，目前的超敏C反应蛋白的检测方法，类似的采用仪器测试各类方法学试剂中，酶联免疫法大约30-120min，胶乳免疫比浊法约15-30min，酶促化学发光法约15-60min；检测时间长，并且灵敏度不高，不能准确地检测患者的超敏C反应蛋白的含量，从而不能准确判断其患病情况，延误了时机。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种超敏C反应蛋白的检测方法，从而能够提高检测灵敏度，缩短检测时间，准确地确定检测患者的超敏C反应蛋白的含量。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种超敏C反应蛋白的检测方法，包括以下步骤：

1)通过样本稀释液将标准品制成标准测试样本，得到其发光信号值，然后以标准品的浓度为横坐标，信号值为纵坐标绘制成标准曲线；

2)制备链霉亲和素磁珠、标记物缓冲液、生物素标记的hs-CRP抗体和吖啶酯标记的hs-CRP抗体，所述标记物缓冲液为2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液；

3)再取适量的待测血清样品加入全自动发光免疫分析仪的反应杯中，并加入适量的步骤2)制备的生物素标记抗体、吖啶酯标记抗体、链霉亲和素磁珠温浴，测试发光值，得到待测血清样品的信号值，同时将适量的标准测试样本加入反应杯中作为对照进行测试；优选地，于37℃温浴3-9min，优选5-6min；

4)然后将待测样品的信号值与步骤1)的标准曲线比对，得出待测血清样品中的超敏C反应蛋白的浓度，即得。

优选地，在步骤1)中，所述2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中添加有活性剂，所述活性剂为月桂醇聚氧乙烯醚，将活性剂月桂醇聚氧乙烯醚(Brig35)加入反应体系，有效的抑制非特异性反应，并降低背景信号，从而大大的提高了灵敏度。

优选地，所述2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液的pH为6.0，浓度为0.05Mol/L。

优选地，所述2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液含有以下组分：0.5体积％牛血清白蛋白(BSA)，1质量％蔗糖，0.1体积％吐温-20(Tween-20)、0.1体积％月桂醇聚氧乙烯醚(Brig35),0.1体积％生物防腐剂(ProClin300)。

优选地，在步骤2)中，所述链霉亲和素磁珠的粒径为0.5～3.0μm，优选为1.0μm，选用合适直径的磁珠作为捕获固相，在均相溶液里更容易且更多的捕获抗体，以获得更多的信号。

优选地，在步骤2)中，所述生物素标记的hs-CRP抗体的浓度为0.1～0.5mg/L，优选0.3mg/L。

优选地，所述生物素标记的hs-CRP抗体通过包括以下步骤的方法制成：

先将hs-CRP抗体用磷酸盐缓冲液透析，再将已活化的生物素加入纯水溶解，得到生物素溶液；然后将透析后的hs-CRP抗体与生物素溶液混合后，将混合液于室温放置后，再用磷酸盐缓冲液透析；然后用标记物缓冲液将透析后的混合液稀释备用。

优选地，所述已活化的生物素与hs-CRP抗体以1:5～1:20的质量比混合，优选以按1:10的质量比混合。

优选地，在步骤2)中，所述吖啶酯标记的hs-CRP抗体的浓度为0.05～0.5mg/L，优选0.1mg/L。

优选地，所述吖啶酯标记的hs-CRP抗体通过包括以下步骤的方法制成：

先将hs-CRP抗体用磷酸盐缓冲液透析，再将已活化的吖啶酯加入纯水溶解，得到吖啶酯溶液；然后将透析后的hs-CRP抗体与吖啶酯溶液混合后，将混合液于室温放置后得到混合液，再用磷酸盐缓冲液透析，得到透析后的混合液；然后用标记物缓冲液将透析后的混合液稀释备用。

优选地，所述已活化的吖啶酯与hs-CRP抗体以1:10～1:50的质量比混合，优选以1:20的质量比混合。

优选地，在步骤2)中，所述链霉亲和素磁珠的浓度为0.3～1.0g/L，优选0.45g/L。

本发明的有益效果是：采用了磁分离系统使用全自动化学发光免疫分析仪，只需添加上样本，6～15min即可得到测试结果，方便快捷；采用链霉亲和素生物素放大系统，使磁珠上的每一个链霉亲和素能结合4个生物素抗体，大大的提高了捕获能力，从而使得到的信号增强；通过使用MES(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)缓冲液作为反应体系，能有效的提高抗原抗体的反应强度，从而增强信号；并且通过试验表明，本发明的检测方法，测试十分灵敏度，有效的检测下限可达0.005mg/L，分析灵敏度可至0.001mg/L。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1是本发明的超敏C反应蛋白的测试标准曲线；

图2是本发明的检测方法中已活化的生物素与hs-CRP抗体以不同的质量比混合后检测低浓度的hs-CRP血清样本的试验结果；

图3是本发明的检测方法中已活化的生物素与hs-CRP抗体以不同的质量比混合后检测高浓度的hs-CRP血清样本的试验结果；

图4是本发明的检测方法中已活化的吖啶酯与hs-CRP抗体以不同的质量比混合后检测低浓度的hs-CRP血清样本的试验结果；

图5是本发明的检测方法中已活化的吖啶酯与hs-CRP抗体以不同的质量比混合后检测高浓度的hs-CRP血清样本的试验结果；

图6是本发明的检测方法中以不同粒径的链霉亲和素磁珠检测低浓度的hs-CRP血清样本的试验结果；

图7是本发明的检测方法中以不同粒径的链霉亲和素磁珠检测高浓度的hs-CRP血清样本的试验结果。

具体实施方式

现在结合附图对本发明作进一步详细的说明。这些附图均为简化的示意图，仅以示意方式说明本发明的基本结构，因此其仅显示与本发明有关的构成。

除非特别指明，以下实施例中的试剂均可从正规渠道商购获得。

除非特别指明，以下实施例中的标准品为国际标准物质(NIBSCcode:85/506)。

实施例1

1)链霉亲和素磁珠制备：取一定量的磁珠，置于磁场中分离上清液，后用含有0.1体积％BSA、1质量％蔗糖、0.15体积％Tween-20、0.1体积％生物防腐剂(ProClin300)的磷酸盐缓冲液(浓度为0.01Mol/L，pH为7.4)清洗3次，后再用此缓冲液将磁珠复溶到0.45g/L。

2)标记物缓冲液制备：配制0.05Mol/L的2-(N-啉)乙磺酸(MES)缓冲液，调PH至6.0，将各组分调节至以下重量百分比含量，0.5体积％牛血清白蛋白(BSA)，1质量％蔗糖，0.1体积％吐温-20(Tween-20)、0.1体积％月桂醇聚氧乙烯醚(Brig35),0.1体积％生物防腐剂(ProClin300)，用0.2μm的过滤膜过滤后，2-8℃下保存备用。

3)生物素标记抗体制备：将hs-CRP抗体用0.02M的磷酸盐缓冲液在2-8℃透析过夜；将已活化的生物素加入纯水溶解，使终浓度为20mg/ml；将hs-CRP抗体与生物素按1:10的质量比混合，室温放置0.5h，后使用0.2M、0.1M、0.05M、0.02M的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)在2-8℃下进行梯度透析，每种缓冲液透析4h。后收集，用标记缓冲液稀释至0.3mg/L备用。

4)吖啶酯标记抗体制备：将hs-CRP抗体用0.02M的磷酸盐缓冲液在2-8℃透析过夜；将已活化的吖啶酯加入纯水溶解，使终浓度为20mg/ml；将hs-CRP抗体与吖啶酯按1:20的质量比混合，室温放置0.5h，后使用0.2M、0.1M、0.05M、0.02M的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)在2-8℃下进行梯度透析，每种缓冲液透析4h。后收集，用标记缓冲液稀释至0.1mg/L备用。

5)样本稀释液制备：配制0.05Mol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液，加入5体积％牛血清、0.1体积％Tween-20、1质量％蔗糖、0.1体积％Proclin300，混匀后用0.2μm的过滤膜过滤，2-8℃下保存备用。

6)校准品配制：将国际标准物质(NIBSC code:85/506)用纯水溶解到浓度20mg/L，后用样本稀释液稀释至10、2、0.4、0.1、0.02、0.005、0.0mg/L,在2-8℃环境下保存备用；以标准品浓度为横坐标，信号值为纵坐标绘制成标准曲线，如图1所示。

7)样本测试：将上述配制的好试剂分装入相应的试剂瓶内，组装后装载于苏州长光华医生物医学有限公司(HYBIOME)生产全自动发光免疫分析仪(型号AE-180)上，同时装载上校准品以及待测的hs-CRP血清样本(两组平行样品，一组高浓度的hs-CRP血清样本，一组低浓度的hs-CRP血清样本)。将试剂测试设置为：在反应杯中加入100μl生物素标记抗体、10μl样本、100μl吖啶酯标记抗体、25μl链霉亲和素磁珠，后于37℃下温浴5min，最后进行清洗并测试发光值。装载及设置完成后，开始测试。

8)测试的结果表明：分析灵敏度<0.001mg/L，相关线性R>0.9995,批内变异<10％,血样测值相关性R>0.9995。

实施例2

试验方法与实施例1相同，不同的为将已活化的生物素与hs-CRP抗体分别以1:2、1：5、1:10、1:15和1:20等不同的质量比混合，结果如图2-3所示，从图中可以看出当生物素与hs-CRP抗体以1:10的质量比混合时，得到的检测信号最强。

实施例3

试验方法与实施例1相同，不同的为将已活化的吖啶酯与hs-CRP抗体分别以1:10、1：20、1:30、1:40和1:50等不同的质量比混合，结果如图4-5所示，从图中可以看出当吖啶酯与hs-CRP抗体以1:20的质量比混合时，得到的检测信号最强。

实施例4

试验方法与实施例1相同，不同的为以粒径为0.2μm、0.5μm、1.0μm、3.0μm的链霉亲和素磁珠进行检测，结果如图6-7所示，从图中可以看出当链霉亲和素磁珠的粒径为1.0μm时，得到的检测信号最强。

实施例5

超敏C反应蛋白的分析灵敏度测试：测试空白样本20次以及检测下限样本5次，计算空白样本的信号均值与标准差，以空白样本以及检测下限样本的浓度和信号均值做最小二乘法拟合，再将空白样本信号均值加2倍的标准差带入方程，计算所得数值即为分析灵敏度，结果如下述表1所示，结果表明其灵敏度小于说明中的0.001mg/L。

表1

实施例6-7

试验方法与实施例1相同，不同的为，步骤1)中，链霉亲和素磁珠的浓度为0.3g/L、1.0g/L；在步骤3)中，生物素标记抗体的浓度为0.1mg/L、0.5mg/L；步骤4)中，吖啶酯抗体使用浓度为0.05mg/L、0.5mg/L。

结果表明，其有效的检测下限均可达0.005mg/L，分析灵敏度均可至0.001mg/L

对比例1

以本发明制备的试剂与北京利德曼生化股份有限公司生产的超敏C-反应蛋白(hs-CRP)定量测定试剂盒(磁微粒化学发光法)进行比对，测试校准品以及血清样本，同时取一例血清样本进行梯度稀释，考察测值情况，结果如下：

表2

结果表明：利德曼的hs-CRP只能检测到约0.1mg/L，而本发明试剂可以检测到0.005mg/L，灵敏度远远超出。

此外，发明人通过调整各步骤中的试验参数和数据对hs-CRP血清样本检测，结果表明，这些检测方法下有效的检测下限均可达0.005mg/L，分析灵敏度均可至0.001mg/L。

以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。

Claims (10)

1.一种超敏C反应蛋白的检测方法，包括以下步骤：

1)通过样本稀释液将标准品制成标准测试样本，得到其发光信号值，然后以标准品的浓度为横坐标，信号值为纵坐标绘制成标准曲线；

2)制备链霉亲和素磁珠、标记物缓冲液、生物素标记的hs-CRP抗体和吖啶酯标记的hs-CRP抗体，所述标记物缓冲液为2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液；

3)再取适量的待测血清样品加入全自动发光免疫分析仪的反应杯中，并加入适量的步骤2)制备的生物素标记抗体、吖啶酯标记抗体、链霉亲和素磁珠温浴，测试发光值，得到待测血清样品的信号值，同时将适量的标准测试样本加入反应杯中作为对照进行测试；优选地，于37℃温浴3-9min，优选5-6min；

4)然后将待测样品的信号值与步骤1)的标准曲线比对，得出待测血清样品中的超敏C反应蛋白的浓度，即得。

2.根据权利要求1所述的超敏C反应蛋白的检测方法，其特征在于，在步骤1)中，所述2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中添加有活性剂，所述活性剂为月桂醇聚氧乙烯醚。

3.根据权利要求2所述的超敏C反应蛋白的检测方法，其特征在于，所述2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液的pH为6.0，浓度为0.05Mol/L。

4.根据权利要求3所述的超敏C反应蛋白的检测方法，其特征在于，所述2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液含有以下各组分：0.5体积％牛血清白蛋白(BSA)，1％蔗糖，0.1体积％吐温-20(Tween-20)、0.1体积％月桂醇聚氧乙烯醚(Brig35),0.1体积％生物防腐剂(ProClin300)。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的超敏C反应蛋白的检测方法，其特征在于，在步骤2)中，所述链霉亲和素磁珠的粒径为0.5～3.0μm，优选为1.0μm。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的超敏C反应蛋白的检测方法，其特征在于，在步骤2)中，所述生物素标记的hs-CRP抗体的浓度为0.1～0.5mg/L，优选0.3mg/L。

7.根据权利要求6所述的超敏C反应蛋白的检测方法，其特征在于，所述生物素标记的hs-CRP抗体通过包括以下步骤的方法制成：

先将hs-CRP抗体用磷酸盐缓冲液透析，再将已活化的生物素加入纯水溶解，得到生物素溶液；然后将透析后的hs-CRP抗体与生物素溶液混合后得到混合液，将混合液于室温放置后，再用磷酸盐缓冲液透析，得到透析后的混合液；然后用标记物缓冲液将透析后的混合液稀释备用；

优选地，所述已活化的生物素与hs-CRP抗体以1:5～1:20的质量比混合，优选以1:10的质量比混合。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的超敏C反应蛋白的检测方法，其特征在于，在步骤2)中，所述吖啶酯标记的hs-CRP抗体的浓度为0.05～0.5mg/L，优选0.1mg/L。

9.根据权利要求8所述的超敏C反应蛋白的检测方法，其特征在于，所述吖啶酯标记的hs-CRP抗体通过包括以下步骤的方法制成：

先将hs-CRP抗体用磷酸盐缓冲液透析，再将已活化的吖啶酯加入纯水溶解，得到吖啶酯溶液；然后将透析后的hs-CRP抗体与吖啶酯溶液混合后，将混合液于室温放置后，再用磷酸盐缓冲液透析；然后用标记物缓冲液将透析后的混合液稀释备用；

优选地，所述已活化的吖啶酯与hs-CRP抗体以1:10～1:50的质量比混合，优选以1:20的质量比混合。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的超敏C反应蛋白的检测方法，其特征在于，在步骤2)中，所述链霉亲和素磁珠的浓度为0.3～0.9g/L，优选0.45g/L。