CN110726846B - Hbp蛋白作为川崎病的诊断标志物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种HBP蛋白作为川崎病的诊断标志物的应用，并公开了HBP蛋白作为川崎病的诊断标志物在制备川崎病诊断产品中的应用以及诊断川崎病的试剂盒。通过实验结果表明，与健康儿童及一般感染发烧患者相比，急性期川崎病患者血浆HBP水平显著升高，且更高的HBP浓度与川崎病冠脉损伤显著相关；IVIG治疗不敏感患者中HBP水平较IVIG治疗敏感患者更高。本发明发现血浆HBP可用于川崎病与感染发烧患者鉴别，其ROC曲线下面积(area under the curve,AUC)为0.88，最佳诊断阈值为52.5pg/mL，灵敏度为88.3％，特异性为74.0％。因此，患者血浆HBP蛋白可用作川崎病与感染发烧患者进行判别诊断的潜在标志物。

Description

HBP蛋白作为川崎病的诊断标志物的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，是一种川崎病相关的血浆蛋白标志物及其应用。

背景技术

川崎病(Kawasaki disease，KD)是一种免疫介导的急性全身中小血管炎，川崎病高发于亚洲地区，多发于5岁以下婴幼儿。早期即可累及心包、心肌、心内膜和冠状动脉，由其导致的心血管损伤发生率约为25.4％，最严重的是冠状动脉损伤(CAL)，约占心血管损伤的68％，包括冠状动脉扩张、狭窄、冠状动脉瘤的形成，严重者甚至发生心肌梗死。近年来KD呈逐年增加的趋势，目前已成为儿童获得性心脏病的主要病因，同时也是中青年冠状动脉病变的重要原因。早期给与大剂量的静脉丙种球蛋白(IVIG)冲击联合阿斯匹林口服治疗可以把冠状动脉损伤发生率从25％降到4％左右。因此，及时准确确诊并给与丙种球蛋白(IVIG)治疗是预防冠脉损伤的关键因素。川崎病的诊断主要依据临床特征及一般炎症指标，但是不完全川崎病的临床特征不明显，给临床诊断提出巨大挑战。有研究表明，KD发病初期到免疫球蛋白(IVIG)初始治疗之间的天数与患者冠状动脉病变率变呈正相关。目前川崎病无特异性实验室检查，影像学检查确诊冠脉损伤具有滞后性。因此，寻找一种早期诊断川崎病灵敏的实验室指标对减少冠脉损伤、改善川崎病的预后十分迫切。

肝素结合蛋白(Heparin-Binding Protein，HBP)主要存在于中性粒细胞的嗜苯胺蓝颗粒中，发生细菌感染时，HBP可以快速从迁移的中性粒细胞中释放出来。HBP能诱发白细胞和上皮细胞的多种炎症效应，导致血管渗漏和组织水肿，进而血管屏障功能失调以及细胞炎症反应又会导致器官功能障碍。目前川崎病的病因和发病机制，认为由内外源性因素诱导机体的免疫系统大量激活，导致血管内皮细胞和其他细胞功能障碍，形成的中小血管为主的全身炎症反应。许多研究表明KD的发病机制与异常的免疫活化、血管内皮功能紊乱较为密切。HBP具有多种生物学功能，如杀菌驱化、调节单核/巨噬细胞功能、调节细胞凋亡、增加血管内皮细胞通透性及快速释放等特性。HBP在正常人血中含量一般不超过10μg/L，当机体受到感染时，中细粒细胞快速释放，从而导致血中HBP含量升高。这些特点使得HBP在疾病诊断与治疗方法的开发应用上具有广阔的前景。

然而，到目前为止，HBP研究大多致力于感染方向，包括脓毒性症早期诊断预后、急性呼吸窘迫征(ARDS)的早期诊断、脑膜炎鉴别诊断等。HBP作为分子标志物用于川崎病诊断中的应用报道至今没有。HBP在血液循环中的稳定性及便利性，是一类微创且有效的川崎病的标志物。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

为了解决以上现有存在的问题，本发明的目的在于提供一种HBP作为川崎病早期诊断和预后标志物的用途，为川崎病的诊断和治疗提供参考依据，同时，提供上述血浆HBP蛋白在制备川崎病诊断或辅助诊断试剂盒中的应用。

为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

HBP蛋白作为川崎病的诊断标志物在制备川崎病诊断产品中的应用。

进一步的，所述川崎病包括川崎病并发冠脉损伤和丙种球蛋白无反应型川崎病。

进一步的，所述HBP蛋白为血浆标志物。

进一步的，所述的诊断产品的检测样本为血浆。

进一步的，所述的诊断产品为诊断试剂盒。

一种诊断川崎病的试剂盒，所述的试剂盒包含特异检测本发明所述HBP蛋白的检测试剂。

有益效果：本发明提供了一种HBP蛋白作为川崎病的诊断标志物的应用，其有益效果主要体现在以下几个方面：

1.本发明提供的HBP分子标志物通过研究发现在与健康对照组及感染发烧患者相比，急性期川崎病患者血浆中HBP显著升高，因此本发明中提供的HBP标志物可以作为标志物用于川崎病的早期诊断，为川崎病早期诊断提供了一定的应用价值。

2.本发明发现血浆HBP能有效鉴别川崎病与一般感染性疾病，预测川崎病的最佳诊断阈值为52.5pg/mL，灵敏度为88.3％，特异性为74.0％。具有灵敏度高，准确性强的优点，血浆HBP是川崎病诊断中优于CRP、ESR的诊断标志物，提示HBP有可能作为Harada评分的补充指标。

3.本发明发现血浆HBP浓度与川崎病冠脉损伤显著相关，且作为预测川崎病冠脉损害的指标具有较好的敏感性，可作为川崎病冠脉损伤的又一预测性指标。

4.本研究发现血浆HBP对IVIG治疗不敏感性有预测作用，可作为川崎病治疗的参考指标。

附图说明

图1为血浆HBP在川崎病急性期的表达水平图；

图2为血浆HBP诊断川崎病ROC曲线图；

图3为实施例2的结果分析图；

图4为实施例3的结果分析图；

图5为血浆HBP在川崎病急性期和恢复期的表达水平图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

下面结合具体的实施例对本发明做进一步地说明，以更好地理解本发明。

下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。

一、实验材料与方法

1.1病例选择

1.1.1诊断标准

诊断根据日本MCLS研究会提出的诊断标准确诊为川崎病。

1.2病例资料

本研究自2018年8月-2019年8月共收集符合纳入川崎病患者197例，全部病例来源于南京市儿童医院。患者年龄1-13岁，中位年龄2.5岁。细菌感染发热组100人，健康对照组100例，年龄1-14岁，中位年龄2.5岁，均来自于南京市儿童医院儿保科健康自愿者。该研究方案符合人体试验伦理学标准，并得到伦理委员会的批准，受试者在受试前已知情，且获得书面同意。HBP采用ELISA方法检查，在南京市儿童医院检验科完成。用彩超仪测定患儿安静状态下左右冠状动脉内径，确定冠脉是否扩张。

1.3分组设计

川崎病组、细菌感染发热组及健康对照组。

1.4主要仪器及试剂耗材

超低温冰箱(日本SANYO公司)、小型台式离心机(美国Sigma公司)、移液器(10μL、20μL、200μL、1000μL，德国Eppendorf公司)、HBP酶联免疫吸附(ELISA)检测试剂盒(中翰盛泰)。

1.5实验方法与技术

1.5.1取材

按照本课题专用临床观察表进行临床观察记录。川崎病患儿入院后，明确诊断后空腹取材。由经过培训的课题组专人取血样，4-5mL，常温1h内，3,000rpm离心10min，收集上层血浆，置于冻存管液氮保存后转至-80℃冰箱保存待用。实验时取出样本，冰上解冻，所有检测血液样本均1次冻融。

1.5.2血浆HBP表达水平检测

1.5.2.1实验流程

(1)酶联免疫吸附(ELISA)检测试剂盒测定HBP在血浆中的表达

1.准备试剂、样品和标准品；

2.添加100微升样品和标准品至反应孔中，37度孵育2小时；

3.去除反应孔中液体，加入100微升检测试剂A，37度孵育1小时；

4.去除反应孔中液体，漂洗液漂洗3次；

5.加入100微升检测试剂B，37度孵育30分钟；

6.去除反应孔中液体，漂洗液漂洗5次；

7.加入90微升底物，37度孵育10-20分钟；

8.加入90微升终止液，立即450nm读取吸光值。

1.6统计分析

本研究数据分析采用SPSS16.0软件进行。数据分析前各组数据均采用Kolmogorov-Smirnov法检验其分布特征，偏态数据经对数转换后再行分析。计量资料两两组间比较采用成组设计的独立样本t检验；计数资料两两组间比较采用卡方检验。ROC曲线分析血浆HBP对川崎病的预测诊断价值及敏感度和特异性I。以P<0.05为差异有统计学意义。

实施例1：川崎病患者急性期血浆HBP水平较高

HBP表达水平在健康对照组、发热组及川崎病组的血浆样本中的检测结果：对照组HBP的相对表达水平为7.6±2.7ng/mL，发热组为33.8±24.8ng/mL，川崎病病组为77.1±27.7ng/mL。对各组样本中HBP的相对表达水平进行统计学分析，发现血浆HBP在正常组VS川崎病组，发烧组VS川崎病组均有显著性差异(p<0.001)，血清HBP水平与KD有统计学意义，可能对KD具有诊断价值(图1)。

以发烧组为对照组，川崎病组为疾病组，对HBP、ESR、CRP的相对表达水平进行ROC曲线分析，AUC值分别为HBP＝0.88,ESR＝0.73,CRP＝0.73。HBP最佳诊断阈值为52.5pg/mL诊断灵敏度88.3％，特异性74.0％,其诊断价值优于ESR与CRP(图2)。

由上述结果可知，血浆HBP可用作发烧患者与川崎病进行鉴别诊断的潜在标志物。进行发烧患儿和川崎病的鉴别诊断时，若待测血浆川崎病的相对表达水平大于或等于52.5ng/mL，则该待测人为或候选为川崎病患者。

实施例2：川崎病患者血浆HBP水平在丙种球蛋白无反应型川崎病患者显著升高。

HBP表达水平在丙种球蛋白反应川崎病组与无反应组的血浆样本中的检测结果：丙种球蛋白反应川崎病组HBP的相对表达水平为平均值±标准差为74.3±26.2ng/mL，无反应组为94.7±30.6ng/mL。血浆HBP在丙种球蛋白反应川崎病组与无反应组有显著性差异(p<0.001)，以丙种球蛋白反应川崎病组为对照组，丙种球蛋白无反应型川崎病组为疾病组，对HBP的相对表达水平进行ROC曲线分析，AUC＝0.71，诊断灵敏度37.0％，特异性93.5％(图3)，其Cutoff值为98.5ng/mL。

实施例3：川崎病患者血浆HBP水平在川崎病冠脉损伤患者显著升高。

HBP表达水平在无冠脉损伤川崎病组与冠脉损伤川崎病组的血浆样本中的检测结果：无冠脉损伤川崎病组HBP平均值±标准差为72.5±25.3，脉损伤川崎病组为96.4±29.3。血浆HBP在无冠脉损伤川崎病组与冠脉损伤组有显著性差异(p<0.001)，以无冠脉损伤川崎病组为对照组，冠脉损伤川崎病组为疾病组，对HBP的相对表达水平进行ROC曲线分析，AUC＝0.78，诊断灵敏度76.3％，特异性75.3％(图4)，其Cutoff值为83ng/mL。

实施例4：川崎病患者恢复期血浆HBP水平显著下降

HBP表达水平在急性期川崎病组与恢复期川崎病组的血浆样本中的检测结果：急性期川崎病组HBP平均值±标准差为77.1±27.7，恢复期川崎病组为11.3±13.6。血浆HBP在川崎病急性期与恢复期有显著性差异(p<0.001)。

综上所述，急性期川崎病患者血浆中可检测到HBP，并且其表达水平明显高于正常儿童，具有诊断川崎病的潜能；川崎病患者血浆HBP的表达水平与川崎病冠脉损伤显著相关；川崎病患者血浆HBP的表达水平与丙种球蛋白治疗反应性相关；高表达的血浆HBP是川崎病患者不良预后的独立影响因素。通过血浆HBP标志物诊断效果显示，HBP具有灵敏度高，准确性强的优点。

Claims (5)

1.HBP蛋白作为川崎病的诊断标志物在制备川崎病诊断产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述川崎病包括川崎病并发冠脉损伤和丙种球蛋白无反应型川崎病。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述HBP蛋白为血浆标志物。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的诊断产品的检测样本为血浆。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的诊断产品为诊断试剂盒。

Images