CN1146724A

CN1146724A - 用于治疗脓毒症的肝素结合蛋白质及其制备方法

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Publication number: CN1146724A
Application number: CN95192688A
Authority: CN
Inventors: H·J·H·夫罗德加尔德; P·B·拉斯姆森
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Loyco Tech A/S
Priority date: 1994-04-21
Filing date: 1995-03-17
Publication date: 1997-04-02
Also published as: CZ308296A3; WO1995028949A1; DE69530689T2; DE69530689D1; NO964465D0; ATE239494T1; CA2188395A1; FI964227A; CZ289439B6; RU2200573C2; PL316935A1; JPH09512168A; HU221638B1; EP0762889B1; HUT75557A; NZ332683A; EP0762889A1; HU9602895D0; AU2303395A; AU703963B2

Abstract

公开了用于预防或治疗与脂多糖(LPS)诱导细胞因子级联相关之疾病或病理状况的药物组合物，该组合物包含由多形核白细胞的嗜天青颗粒产生的、糖基在形式的、表现分子量为28KD(在还原条件下经SDS-PAGE测得的)的肝素结合蛋白质(HBP)，以及医药上可接受的载体或稀释剂。肝素结合蛋白质是在含有编码N末端延伸之HBP或编码HBP的DNA序列的缩主细胞中产生的，其中所说的DNA序列前面接有并融合有编码另一种蛋白质的DNA序列。另外还公开了生产HBP的方法，其中培养基含有硫酸化的多糖。

Description

用于治疗脓毒症的肝素结合蛋白质及其制备方法

发明的领域

本发明涉及含有肝素结合蛋白质的药物组合物，及其在治疗由细菌内毒素引起之疾病或病理状况中的应用。

发明的背景

在过去的50年里面对严重感染的全身反应引起的脓毒性休克的发生率不断增加，并且目前是美国特别医疗单位中病人死亡的最常见原因。据信脓毒性休克的这种增强和高发病率的原因是不断增加了对血管内导管等侵入性装置的使用，增加了细胞毒性和免疫抑制药物的使用，增加了易于发生脓毒症之病人的寿命，以及增加了由抗生素抗性生物体引起的感染。

与脓毒症相关联的疾病是以阴性血液培养物为特征的茵血症(也称为败血症)；脓毒症的特征是表现为呼吸急促、心动过速、体温过高或过低的对感染的全身性反应；脓毒症综合病征中有脓毒症的临床症状和改变了的器官灌注征象，表现形式为乳酸盐水平异常增加，尿少或精神状态的急性改变；早期脓毒性体克中有脓毒症综合病征的监床症状，以及持续不到1小时的低血压和对常规治疗有反应；而无反应性脓毒性休克中则有脓毒症综合病征的临床症状，并且尽管进行常规治疗仍有持续达1小时以上的低血压。

脓毒症的已知介体或细胞因子以复杂的方式相互作用，在感染或损伤部位(如腹腔)发生吸联反应以形成脓毒症。细胞因子级联(其为革兰氏阴性茵血症中引起脓毒症的常见原因)的引发物是细菌在感染或炎症部位释放的内毒素(也称为脂多糖，缩写为LPS)，其在该部位诱导由巨噬细胞或其他细胞释放肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素-1、白细胞介素-6、白细胞介素-8和血小板活化因子(PAF)。在释放FNFα、白细胞介素-1及PAF后，花生四烯酸被代谢转化为白三烯、凝血烷A2和前列腺素。白细胞介素-1和白细胞介素-6激活T细胞以产生γ-干扰素、白细胞介素-2、白介素-4及粒细胞-单核细胞集落刺激因子。嗜中性白细胞可直接被其中大多部介体激活。因此嗜中性白细胞诱导的损伤可发生在因释放氧自由基和溶酶体酶类所致的脱颗粒期间，即其在感染或炎症部位聚集期间。

虽然内毒素或其他介体在感染或炎症部位的存在很可能引发细胞因子级联，但因为细胞因子级联具有某些对抗细胞因子收联无控制活化的固有保护机制，所以其本身不一定导致脓毒症。因此，前列腺素可抑制细胞因子从巨噬细胞中释放，并且巨噬细胞也可解抑制T细胞。当释放了太多的内毒素或其他介体时，或者当不存在能移干扰细胞因子级联的介体时，即当免疫系统被削弱时才会发生脓毒症的临床症状(有关脓毒症的预后和参与其中的合体物质可详见R.C.Bone，“The Pathogenesis ofsepsis”，Ann.Inf.Med.115，1995，pp.457-469)。

革兰氏阴性脓毒症所致的这种持续高的死亡率和发病率促使人们去深入寻找能够对抗循环细菌的LPS之潜在致死作用的治疗剂。许多文章报导了静脉内投用高剂量免疫球蛋白的显著治疗效果。但治疗中需要使用得自供体血浆的IgG，因而须筛选那些天然产生高水平抗核心LPS抗体的供体，或需要得自庞大的供体库(＞1000)的IgG。也有人提出使用抗LPS的单克隆抗体治疗菌血症(如参见WO88/03211)，但结果表明其作用很小或没有作用，这可能是因为它们并不抑制由LPS诱导的细胞因子级联。

目前已确定了从人和猪的外周嗜中性白细胞中分离之两种密切相关蛋白质的共价结构(参见H.Flodgaard et al.，Eur.J.Biochem.197，1991，pp.535-547；J.Pohl et al.，FEBS Lett.272，1990，pp.200 ff.)。两种蛋白质显示出与嗜中性白细胞弹性蛋白酶有高度相似性，但由于活性丝氨酸195和组氨酸57(胰凝乳蛋白酶编号)的选择性突变(B.S.Hartley，“Homologies in Serine Proteinases”，Phil.Trans.Boy.Soc.Serines257，1970，pp.77ff.)而使得这两种蛋白质缺乏蛋白酶活性。由于其对肝素的高度亲合性，已将它们分别定名为h肝素结合蛋白质(hHBP)和猪肝素结合蛋白质(pHBP)；又鉴于其抗微生物活性，所以Schafer等人(W.M.Schafer et al.，Infect.Immun.53，1986，pp.651 ff.)将其称为阳离子抗微生物蛋白质(CAP37)。也已显示该蛋白质在1.3×10^-9M-10^-8M范围内是对单核细胞有趋化性的(H.A.Pereira et al.，J.ChinInvest.85，1990，pp.1468 ff.)，此与Flodgaard等人(引文同上)的结果相一致。

此外，当加入到内皮细胞和成纤维细胞的单层培养物中时，可见HBP介导这些细胞的脱附和收缩。HBP还刺激单核细胞存活和血小板反应蛋白分泌(E.Dstergaard and H.flodgaard，J.LeukocyteBiol.51，1992，p.316 ff.)。

也已从嗜天青颗粒中分离出一种前20个N末端氨基酸残基与hHBP和称为azurocidin之CAB37的相应序列完全相同的蛋白质(J.E.Gabayet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，1989，p.5610；C.G.Wilde et al.J.Biol.Chem.256，1990，p.2038)，并已报导了其抗微生物性质(D.Campanelliet al.JClin，Invest.85，1990，p.904 ff.)。

嗜中性白细胞中存在hHBP，以及当白细胞吞噬金黄色葡萄球菌时释放出89％的CAP37(其与hHBP相同)的这一事实(H.A.Peveira etal.，引文同上)表明，hHBP的功能可能是其参予炎症过程，因为这种蛋白质明显地是从被活化的嗜中性细胞释放的。Pereira等人(引文同上)提示，CAP37是在炎症部位发挥其功能，其可在这里特异地吸引单核细胞，因而是负责在炎症的第二个高潮中单核细胞流入的因素之一。Фstergaardt Flodgaard(引文同上)提示，除了对单核细胞聚集很重要外，HBP可能还在嗜中性细胞作用机理及单核细胞外渗上起着关键性作用。

WO89/08666中H.Flodgactrd等人的文章中已说明了HBP的结构。有时也将HBP称为CAP37(参见WO91/00907)和azurocidin(参见C.G.Wilde et al.，J.Biol.Chem.265，1990，p.2038)。

发明的概要

以前还没有提示可将HBP用于治疗因炎症或损伤部位存在细菌内毒素所致的疾病或病理状况。

因此，本发明涉及用于预防或治疗与脂多糖(LPS)诱导细胞因子级联有关之疾病或病理状况的药物组合物，该组合物包含一种糖基化形式的，具有28KD表现分子量(如在还原条件下经SDS-PAGE测定的)的肝素结合蛋白质-该蛋白质是在多形核白细胞的嗜天青颗粒中产生的，连同一种医药上可接受的载体或稀释剂。

已发现HBP具有结合LPS的能力(参见H.A.Pereira etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，1993，pp.4733-4737)，而这种能力是与蛋白质的抗菌作用相联系的。有人报导在PH7(即生理pH)条件下HBP的杀菌效果降低。此外，脓毒性状况并不是由这样的革兰氏阴性茵引起的，而是由激活单核细胞上的CD14受体进而诱导细胞因子级联反应的死亡细菌的细胞释放的内毒素引起的。因此可看出，HBP的抗茵效应对于治疗脓毒性状况并不重要。在这方面，应注意到LPS结合本身不是中和内毒素的细胞因子级联诱导效应之能力的指征，抗LPS抗体在这方面几乎没有或完全没有作用这一事实即证明了这一点(参见E.Th.Rietscheland M.Schlaak，Immun.Infect.21，1993，pp.25-36)。

虽然以前发表的一些对抗脓毒性状况的工作主要集中于中和脓毒症病人循环中的内毒素上(例如WO93/19087中提到的，其中提示CAP37(即HBP)通过结合并清除循环中的LPS来治疗内毒素血症)，但因为脓毒症病人一般都没有增加循环内毒素的水平，所以其中大多数的努力都徒劳的。然而，在脓毒性症状显露出来之后，即在内素血症发生之后的过程中，HBP可能在局部炎症或感染部位是有效的。目前推测HBP可能不仅通过以高亲和力与脂质A(LPS的毒性部分)特异性结合进而阻止继续诱导细胞因子级联发挥其有益作用，而且还通过阻止单核细胞因应力损伤造成的编程性细胞死亡发挥其作用，其中所说的应力损伤是由于作为身体对抗损伤和感染之防御机制的一部分从吞噬细胞(如嗜中性细胞、单核细胞，巨噬细胞)释放氧自由基和细胞因子而引起的。

单核细胞迁移到损伤或感染部位，并在该部位吞噬感染性微生物和有害物质例如内毒素。HBP也可刺激单核细胞的吞噬作用。HBP调动单核细胞的能力似乎取决于其以一种尚不清楚的方式结合LPS的能力。

此外，已令人惊奇地证实，HBP在37-45℃(即正常体温至高烧体温)下与LPS不可逆地结合。这一事实也可能对HPB中和LPS有所影响。

另一方面，本发明涉及预防或治疗与LPS诱导细胞因子级联反应相关的疾病或病理状况的方法，该方法包括给需要这种治疗的病人投用有效量的糖基化形式的、表现分子量为28KD(如在还原条件下经SDS-PAGE测得的)的肝素结合蛋白质(HBP)，其中所说的蛋白质是在多形核白细胞的嗜天青颗粒中产生的。

再一方面，本发明涉及使用糖基化形式的，表现分子量为28KD(如在还原条件下经SDS-PAGE测得的)的肝素结合蛋白质(HBP)制造用于预防或治疗与LPS诱导细胞因子级联反应相关之疾病或病理状况的药物。

发明的详细描述

HBP可以是哺乳动物，特别是人或猪来源的。具体地说，HBP是具有序列表中SEQ ID No：1所示之氨基酸序列的人HBP，或者是具有序列表中SEQ ID NO：2所示之氨基酸序列的猪HBP，或者是其能够结合LPS之脂质A部分的功能类似物或肽片段。这类功能类似物的例子包括经在天然蛋白质的C和/或N末端加入一个或多个氨基酸残基，在天然蛋白质的一个或两个末端取代一个或多个氨基酸残基、在天然蛋白质的一个或两个末端或氨基酸序列内的一个或多个位点缺失一个或多个氨基酸残基、或在天然氨基酸序列的一个或多个位点插入一个一个或多个氨基酸残基所得到的天然蛋白质的衍生物。该术语特别是指包括HBP的肽片段，特别是那些具有如天然HBP的减少LPS诱导之人单拉细胞中细胞因子级联之相似能力的片段。这种能够结合LPS之脂质A部分的片段实例是包括SEQ ID No：1中的氨基酸残基20-53，特别是氨基酸残基26-42，或SEQ ID NO：2中的氨基酸残基20-53的肽片段。

可以按照已建立的标准方法，例如S.L.Beaucage和M.H.Cancthers(Tetrahedron Letters 22，1981，pp.1859-1869)所述的磷酰胺酸法，或Matthes等人(EMBO J.3，1984，pp.801-805)所述的方法合成制备编码HBP的DNA序列。根据磷酰胺酸法，例如可在自动DNA合成仪中合成寡核苷酸，然后纯化、退火、连接并在适当的载体中克隆之。

DNA序列也可以是基因组成cDNA来源的，例如可以制备基因组或cDNA文库，并按照标准技术(例如参见Sambrook et al.MolecularCloning：A Laboratory Manual.2nd Ed.Cold Spring Harbor，1989)，使用合成的寡核苷酸探针经杂交筛选编码全部或部分HBP的DNA序列，以制得所说的DNA序列。也可以例如按照US 4,683,202或R.K.Saikiet al.，Seience 239，1988，pp.487-491中所述的方法，使用特异性引物经聚合酶链反应制得该DNA序列。

然后将DNA序列插入到重组表达载体中，所说的载体可以是常规进行重组DNA操作的任何载体。对载体的选择常常取决于将向其中导入该载体的宿主细胞。因此，该载体可以是自动复制载体，即作为染色体外实体存在的，其复制不依赖于染总体复制的载体，例如可以是质粒。另外，载体可以是当被导入宿主细胞中时即整合到宿主细胞基因组中并与它所整合进去的染色体一起复制的载体。

在载体中，编码HBP的DNA序列应被可操作地连接到适当的启动子序列上。启动子可以是在选择的宿主细胞中显示有转录活性的任何DNA序列，并可衍生于编码与宿主细胞同源或异源之蛋白质的基因。指导编码HBP的DNA在哺乳动物细胞中转录的适当启动子的例子是SV40启动子(Subramani et al.，Mol.Cell Biol.1，1981，pp.854-864)、MT-1(金属硫蛋白基因)启动子(Palmiter et al.，Science 222，1983，pp.809-814)或腺病毒2主要脱期启动子。一个适于在昆虫细胞中使用的启动子是多角体启动子(Vasuvdan et al.，FEBS Lett.，311，1992，pp.7-11)。适于在酵母宿主细胞中使用的启动子包括酵母糖酵群基因(Hitzermanet al.，J.Biol.Chem.255，1980，pp.12073-12080；Alber and Kawasaki，J.Mol.Appl.Gren.1，1982，pp.419-434)或乙醇脱氢酶基团(young etal.，in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals(Hollaender et al.eds.)，Plenum Press，New York，1982)或TPI1(US4,599,311)或ADH2-4C(Russel et al.，Nature 304，1983，pp.652-654)启动子。适用于丝状真菌宿主细胞的适当启动子例如是ADH3启动子(Mcknight et al.，The EMBO J.4，1985，pp.2093-2099)或tpiA启动子。

也可以将编码HBP的DNA序列可操作地连接到适当的终止子如人生长激素终止子(Plmiter et al.，引文同上)或(适于真菌宿主的)TPI1(Alber and Kawasaki，引文同上)，或ADH3(Mcknight et al.，引文同上)启动子上。载体还可含有聚腺苷酸化信号(例如来自SV40或腺病毒5E1b区域)、转录增强子序列(例如SV40增强子)及翻译增强子序列(例如编码腺病毒VA RNA的增强子序列)等元件。

重组表达载体可进一步含有使载体能够在有关宿主细胞中复制的DNA序列。这种序列(当宿主细哺乳动物细胞时)的一个例子是SV40复制原点。载体还可以含有可选择标志，例如其表达产物能够补偿宿主细胞中缺陷的基因，如编码二氢叶酸还原酶(DHFR)的基因，或赋予抗药物如新霉素或潮霉素抗性的基因。

用来分别连接编码HBP的DNA序列、启动子和终止子的方法，以及将其插入含有复制所需信息之适当载体中的方法是本领域技术人员已知的(例如参见Sambrook et al.引文同上)。

可在其中导入表达载体的宿主细胞可以是能够产生HBP的任何细胞并且较好是真核细胞，如无椎脊动物(昆虫)细胞或脊椎动物细胞，例如非洲爪蟾(Xepopus leavis)卵母细胞或哺乳动物细胞，特别是昆虫和哺乳动物细胞。适用的哺乳动物细胞系的例子是COS(例如ATCCCRL 1650)、BHK(例如ATCC CRL 1632，ATCC CCL10)或CH0(例如ATCC CCL61)细胞系。例如在Kaufman andSharp，J.Mol.Biol.159，1982，pp.601-621；Southern and Berg，J.Mol.Appl.Genet.1，1982，pp.327-341；Loyter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79，1982，pp.422-426；Wigler et al.，Cell 14，1978，pp.725；Corsaro and Pearson，Somatic Cell Genetics 7，1981，p.603；Graham and van der Eb，Virology，52，1973，p.456；和Neumann et al.，EMBO J.1，1982，pp.841-845中描述了转化哺乳动物细胞及表达导入细胞中之DNA序列的方法。

另外，也可使用真菌细胞(包括酵母细胞)作为宿主细胞。适用的酵母细胞的例子包括酵母属数种或裂殖酵母属数种的细胞，特别是酿酒酵母的菌株。其他真菌细胞的例子是丝状真菌细胞，例如曲霉属数种或链孢霉属数种特别是米曲霉和黑曲霉的菌株。例如EP238023中描述了使用曲霉属数种真菌表达蛋白质。

用于培养细胞的培养基可以是适于培养哺乳动物细胞的任何常规培养基，例如含血清培养基或含有适当添加剂的无血清培养基，或适于培养昆虫、酵母或真菌细胞的培养基。可以从供应商处购得或按照已公布的配方(例如见美国典型培养物保藏中心的目录)制备适用的培养基。

然后用常规方法从培养基中回收由细胞产生的HBP，包括通过离心或过滤从培养基中分离出宿主细胞，借助盐例如硫酸铵沉淀出上清液或滤液中的蛋白质成分，并列用各种层析方法，例如离子交换层析、亲和层析等纯化HBP。

已令人惊奇地发现，当作为前HBP表达HBP时，可得到特别好的HBP产率。因此在一个特定实施方案中，本发明涉及生产HBP的方法，其中包括在允许表达HBP的条件下，在适当培养基中培养含有编码前面按有N末端延伸部分之成熟HBP的DNA序列的宿主细胞，并从培养基中回收所得到的作为N末端延伸之HBP的HBP产物。

N末端延伸部分可以是大约有5至25个氨基酸残基，特别是有大约8至15个氨基酸残基的序列。一般认为N末端序列中氨基酸残基的性质不是很关键的。N末端延伸部分可以是带有氨基酸序列Gly-Ser-Ser-Pro-Leu-Asp的HBP前肽。

为了有利于成熟HBP的产生，编码N末端延伸之HBP的DNA序列一般较好包括编码蛋白酶切割位点的DNA序列，所说的DNA序列位于编码N末端延伸部分的DNA序列和编码成熟HBP的DNA序列之间。适当的蛋白酶切割位点的例子是带有氨基酸序列(Asp)₄-Lys的肠激酶切割位点或带有氨基酸序列Ile-Glu-Gly-Arg的因子Xa切割位点。

从培养基中回收后，可以用适当的蛋白酶切割N末端延HBP，以产生出成熟(有活性的)HBP。适用的酶是肠激酶或因子Xa。

用于生产HBP的宿主细胞有利地是昆虫细胞，例如鳞翅目(Lepidoptera)或果蝇属(Qrosophila)昆虫的细胞。在此情况下，可用例如US4,745,051或WO92/01801中所述杆状病毒载体转染细胞。

另外还发现，较好于肝素或另一种硫酸化多糖存在下产生HBP，以避免HBP与存在于培养基中的脂多糖结合。因此，在一特定实施方案中，本发明涉及生产HBP的方法，其中包括在允许表达HBP的条件下，在含有硫酸化多糖的适当培养基中培养包含编码HBP之DNA序列的宿主细胞，然后从培养基中回收所得到的HBP。HBP将与存在于培养基中的硫酸化多糖结合，然后即可在适当条件下，例如用氯化钠等盐洗脱以从多糖中释放出所需的HBP。

硫酸化多糖较好是肝素，但也可以使用其他硫酸化多糖，例如硫酸肝素、硫酸葡聚糖、硫酸皮肤素、多硫酸戊聚糖或硫酸鱼精蛋白。最好将硫酸化多糖固定在惰性载体上，以有利于从培养基中分离与多糖结合的HBP。惰性载体例如可以是琼脂糖(如Sepharose)。

在该实施方案中，编码成熟HBP的DNA序列前面可接有如上文所述的N末端延伸部分。

在另一实施方案中，本发明涉及生产HBP的方法，其中包括在允许表达HBP和其他蛋白质之融合蛋白质的条件下，在适当的培养基中培养含有前面接有编码为一蛋白质之DNA序列并与之融合的成熟HBP之DNA编码序列的宿主细胞，并从培养基中回收所得到的融合蛋白质。其他蛋白质例如可以是因子VIII轻链(编码因子VIII轻链的DNA序列例如可以是按照EP232112中所述的方法制得的)。

在该实施方案中，较好在N末端延伸部分和成熟HBP之间导入如上文所述的编码蛋白酶切割位点的DNA序列。

可以按已建立的配制药物组合物的方法，例如Remington’sPharmaceutical Scienc，1985中所述的方法配制含HBP的药物组合物。组合物一般可以是适于局部或全身注射或输注给药之形式的，并可用无菌水或等渗盐水或葡萄糖溶液进行配制。可用本领域已知的常规灭菌技术对组合物进行灭菌处理。可以包装所得到的含水溶液备用，或在无菌条件下过滤并冻干，用药前将冻干的制剂与无菌水溶液合并。必要时，组合物可含有药学上可接受的辅助物质，以使之接近生理条件，例如可含有缓冲剂、离子强度调节剂等，其可以是乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙等。HBP的浓度可以从小于0.5％，例如从1％到15-20％(重量)。组合物的单位剂量一般可含有大约10ml至1g HBP。

本发明的药物组合物可优先适用于治疗目的，例如用于治疗脓毒症，脓毒性休克、弥漫性血管内凝血或脑膜炎球菌性脑膜炎。如上文所指出的，本组合物特别适于在炎症或感染部位(如腹腔)局部用药。因为这对于阻止单核细胞迁移到这些部位并确保它们能够使内毒素和感染菌内在化是极为重要的。依据被治疗的病理状况的严重程度和病人状态，目前HBP的每日剂量定为每公斤体重0.1-100mg是适宜的。

本发明的组合物还可包括治疗致病茵感染的抗微生物剂。适用的抗微生物剂的例子是β-内酰胺抗生素(如青霉素)、氨基糖苷、四环素、杆菌肽，多粘菌素、磺胺、硝基呋喃、萘啶酮酸等。对了全身用药，组俣物中也可含有肝素或另一种硫酸化的葡糖胺聚糖作抗凝剂，因为已令人惊奇地发现肝素并不抑制HBP结合LPS的能力。除了作抗凝剂外，肝素的存在也可能导致HBP有更长的血浆半衰期，因为它可阻止HPB与血管内皮上的葡糖胺聚糖结合。

附图的简要说明

以下借助实施例并参考附图进一步描述本发明。所说的附图中：

图1显示质粒pKFN-1783之编码hHBP的901bp EcoRI-XbaI片段的DNA序列和由之推导的氨基酸序列；

图2显示插入到质粒pSX221中之编码hHBP的772bp BamHI-Hiad III片段的DNA序列和由之推导的氨基酸序列。

图3是图解显示在10mg/ml LPS存在下，用10μg/ml HSA或不同浓度的HBP处理之血液单核细胞中的细胞因子水平；

图4是图解显示在100μg/ml LPS存在下，用10μg/ml HSA或不同浓度的HBP处理的血液单核细胞中的细胞因子水平。

实施例1

从酵母菌株KFN-1775产生人肝素结合蛋白质

一般方法

按照已描述的常规方法(Sambrook，J.，Fritch，E.F.，andManiatis，T.(1989)Molecular Cloning：A Labortory Manual，2ndedn.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，Ny)进行标准DNA操作。使用市售的试剂在自动DNA合成仪(380B，AppliedBiosystems)上制备合成的寡核苷酸。用二脱氧链终止技术(Sanger，F.，Mieklen，S.，and Coulson，A.R.，Proc.Natl.Acad.Sci.USa74(1977)，5463-5467)进行DNA序列测定。在DNA热循环仪(PerkinLemer Cetus)上进行聚合酶链反应(PCR)。

使用Applied Biosystems477A气相序列仪，以自动Edman降解汉测得N末端氨基酸序列。进行联机反相HPLC分析，以检测并定量从各序列分析循环中释放的PTH氨基酸。在含有各100pmole引物NOR-3176(GTTGGAATTCAT(A/T/C)CA(A/G)AA(T/C)CA(A/G)GGN(A/C/G)和NOR-3174(CA(T/C)TG(A/G)TC(T/C)TCNGGNGT)(其中N是所有四种核苷酸的混合物)的PCR反应中，使用1μg(10⁶pfu)人骨髓cDNA文库(Clontech，PaloAlto，CA，U.S.A.)作为模板。正向引物NOR-3176的5’部分含有EORI位点且3’部分相当于hHBP之氨基酸序列中氨基酸残基no.18-23，而反向引物NOR-2174则相当于氨基酸残基no.149-154(Floodgaard，H.，Фstergaard，E.，Bayne，S.，Svendsen，A.，Thomsen，J.Engels，M.，andWollmer，A.(1991)Eur.J.Biochem.197，535-547)。

使用商品试剂盒(Geneamp.Perkin Elmer Cetus)和下列热循环，以100μl体积进行PCR反应：94℃，1分钟；50℃，2分钟；和72℃，3分钟。35次循环后，在72℃保持10分钟以完成最后的循环。在1％琼脂糖凝胶上电泳分离PCR产物，即420bp片段。

在PCR反应中使用如上文所述的相似引物NOR-3173(ACNCCNGA(A/G)GA(T/C)CA(A/G)TG)和NOR-3175(GGTTTCTAGATTATCCCGG(A/G)TT(A/G)TTNA(A/G)NACNCC)和相同的cDNA模板。正向引物NOR-3173互补于NOR-2174，反向引物NOR-3175相当于HBP之氨基酸序列中的氨基酸残基215-221，且其后是终止密码子和XbaI位点。按上述方法进行PCR反应并以琼脂糖凝胶电泳法分离232bp片段。

使用NOR-3176和NOR-3175作为末端引物，以重叠延伸PCR(Horton，R.M.，Hunt，H.D.，Ho，S.N.，Pullen，J.K.and Pease，L.R(1989)Gene 77，61-68)连接上述两个PCR片段。分离所得到的635bp片段，然后用EcoRI和Xbai消化得到621bp片段，将此片段连接到质粒pTZ19R(Mead，D.A.，Szczesna-Skorupa，E.andKemper，B.，Prot.Engin，1(1986)67-74)的2.8kb EcoRI-XbaI片段上。

用连接混合物转化感受态大肠杆菌菌株(r^-，m⁺)并基于氨苄青霉素抗性选择之。DNA测序显示从所得集落之-分离的质粒pKFN-1726编码预期的hHBP_18-221氨基酸序列。用PstI和XbaI消化质粒PKFN-1726，分离所得到的329bp片段并按后述方法使用之。

使用如上文所述的同样cDNA模板和引物MHJ-206(GCTGAGAGATTGGAGAAGAGAATCGTTGGCGGCCGGAAGGCGAG)和MHJ-200(CGGCTTCCACCGTGGCGTTCTG)经PCR分离作为379bp片段的HBP的N末端部分。MHJ-206的3’部分相同于人HBP基因的N末端编码部分，MHJ-206的5’部分相同于以前描述过的杂合酵母前导基因的C末端部分(Thim，L.，Norris，K.，Norris，F.，Nielsen，P.F.，BjФrn，S.E.，Christensen，and Petersen，J.EEBS Lett.(1993)318，345-352)。

经重叠延伸PCR(Horton，R.M.，Hunt，H.D.，Ho，S.H.，Pullen，J.K.，and Pease，L.R.(1989)Gene 77，61-68)得到杂合前导基因和编码HBP的N末端部分之379bp PCR片段的符合读框的融合。用EcoRI和PstI消化该产物并作为572bp片段分离之。

将上述572bp EcoRI-PstI片段和329bp PStI-XbaI片段连接到来自质粒pT219R(Mead，D.A.，Szczesna-Shorupa，E.and Kemper，B.，Brot.Engin.1(1986)67-74)的2.8Kb EcoRI-XbaI片段上。用连接混合物转化根据氨苄青霉素抗性选择的感受态大肠杆菌菌株(r^-，m^-)。从所得到的茵落之一中选择质粒pKFN-1780备用。

用EcoRI和XbaI消化质粒pKFN-1780。将所得到的901bp片段连接到来自pMT636的9.5Kb NcoI-XbaI片段和来自pMT636的1.4Kb NcoI-EcoRI片段上。国际专利申请No.WO89/01968中描述了质粒pMT636。

pMT636是含有梭酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces Pombe)TPI基因(POT)(Russell，P.R.，Gene 40(1985)125-130)、酿酒酵母丙糖磷酸异物酶启动子和终止子，TPI_P和TPI_T的大肠杆菌-酿酒酵母穿梭载体(Alber，T.，and Kawasaki，G.，J.Mol.Appl.Gen.1(1982)，419-434)。

用连接混合物转化可根据氨苄青霉素抗性选择的感受态大肠杆菌株(r^-，m⁺)。DNA测序显示由所得茵落分离的质粒含有与合成的酵母信号前导基因正确融合的编码人HBP的正确DNA序列。

选择一个质粒pKFN-1783备用。

质粒pKFN-1783的表达弹夹含有下列序列：

TPI_P-信号前导序列-HBP-TPI_T

图1中显示了来自pKFN-1783之901bp EcoRI-XbaI片段的DNA序列。

酵母转化：使酿酒酵母茵性MT663(E2-7B XE11-36a/α，△tpi/△tpi，pep4-3/pep4-3)在ypGaL(1％Bacto酵终提取物，2％Bacto蛋白胨，2％半乳糖、1％乳酸盐)上生长至600mm的0.D.值为0.6。

离心收集100ml培养物，用10ml水洗涤，再次离心并重新悬浮在含1.2M山梨醇、25mM Na₂EDTA(pH8.0)和6.7mg/ml二硫苏糖醇的10ml溶液中。将悬液于30℃保温15分钟，离心并重新悬浮在含有1.2M山梨醇、10mM Na₂EDTA、0.1M柠檬酸钠(pH5.8)和2mgNovozym^234的10ml溶液中。将悬液于30℃保温30分钟，离心收集细胞，在10ml1.2M山梨醇和10mlCAS(1.2M山梨醇、10mM CaCl₃、10mM Tris-HCl，pH7.5)中洗涤，然后重新悬浮在2ml CAS中。为了进行转化，将0.1ml CAS重新悬浮的细胞与大约1μg质粒pKFN-1783混合并在室温下放置15分钟。加入1ml含20％聚乙二醇4000、20mMCaCl₂、10mM CaCl₂、10mM Tris-HCl，pH7.5的混合物，并将所得混合物继续室温放置30分钟。离心该混合物，将沉淀物重新悬浮在0.1mlSOS(1.2M山梨醇、33％(V/V)YPD、6.7mM CaCl₂、14μg/ml亮氨酸)中并于30℃保温2小时。然后离心该悬液并将沉淀饼重新悬浮在0.5ml 1.2M山梨醇中。然后于52℃加入6ml顶层琼脂(含有1.2M山梨醇加2.5％琼脂的Sherman等人(Methods in yeast Genetics，ColdSpring Harbor Laboratory(1982))的SC培养基)，并将悬液倒到含有同样的琼脂固化的，含山梨醇培养基之平板的顶面上。

30℃培养3天后挑取转化的菌落，再次分离并用以制备液体培养物。选择一个这样的转化株KFN-1775用于进一步的表征。

发酵：使酵母菌株KFN-1775生长于YPD培养基(1％酵母提取物、2％蛋白胨(Difco Laboratories)和3％葡萄糖)。将1升该茵株培养物于30℃振荡培养至650nm光密度为24。离心后分离上清液。

基本上按照WO89/08666中所述的方法从上清液中纯化HBP。对残基1-20的氨基酸序列分析表明N末端序列与SEQ ID NO：1中所示者完全相同。

实施例2

为了使用杆状病毒系统在昆虫细胞中表达HBP(为前体形式)，制得下列PCR引物：MHJ 2087：5′-AAA AAG GAT CCA CCA TGA CCC GGC TGA CAG TCC TGG

CCC TGC TGG CTG GTC TGC TGG CGT CCT CGA GGG CCG

GCT CCA GCC CCC TTT TGG ACA TCG TTG GCG GCC GGA

AGG C-3′MHJ 2089：5′-AAA AAA GCT TCC TAG GCT GGC CCC GGT CCC GGA TTG

TTT AAA ACG CCA TC-3′

MHJ2087编码Bam HI位点、起始密码子和人cDNA的前原部分(Morgan，J.G.et al.，(1991)，J.Immun.，147，3210-3214)，然后是从pKFN1780上基因之成熟部分开始的前20个核苷酸。

MHJ2089互补于pKFN 1780上HBP基因之编码部分的后8个密码子加上根据上列cDNA序列的两个额外的密码子。其终止在Hind III位点。

按下列程序使用这两个引物和作为模板的pKFN1780进行PCR：

3次循环 95℃60秒 50℃120秒 72℃120秒

12次循环 95℃30秒 65℃60秒 72℃90秒

在1％琼脂糖凝胶上电泳分离作为760bp片段的PCR产物，用BamHI和Hind III切割，并插入到用同样两种酶切割的PSX221中(PSX221是PUC19(Yannisch-Perron，C.et al.，(1985)Gene 33，103-119)的衍生质粒)。经序列测定证实克隆的DNA并切掉Bam HI-Hind III片段(如图2中所示)，分离后将其插入到用于在昆虫细胞内表达的pBlueBac III(Invitrogen Corporation)中。将所得质粒称为pSX556。

为了产生表达HBP的重组杆状病毒，使用Invitrogen corp(SanDiego，CA)的MAXBAC试剂盒并按照其中包括的“肝状病毒表达系统手册(1.5.5版本)进行所有操作。简单地说，将1μg线性化的AcMNPVDNA和3μg pSX556共转染到SF9昆虫细胞中(2×10⁶个细胞，60mm平皿)。7天后收集所得到的培养物上清。用不同稀释度的病毒上清液感染100mm平皿中的新鲜SF9细胞单层，然后覆盖以含有完全TNM-FH培养基(其中含150μg/ml X-gal)的1.5％琼脂糖。8天后根据其蓝颜色鉴定6个假定的重组体噬斑并用于感染含有SF9细胞的6孔平板。5天后纯化相应的病毒DNA，并用侧翼接有病毒DNA中重组位点的正向和反向引物进行PCR反应。在琼脂糖凝胶上估测PCR产物后，对相应最纯的重组病毒进行另一轮噬斑纯化，以确保最后的重组病毒储备物中没有野生型病毒。在适应于生长在无血清SF900-II培养基(Gibco BRI/Cife-Technologies)中的昆虫细胞(SF9和SF21)内产生重组HBP。一般说来，以MOI为1的病毒量感染细胞密度均为1×10⁶/ml的5升旋动培养液或10升发酵罐，并在感染后3天收获培养基。按WO89/08666中所述的方法纯化HBP。

实施例3

没有前区域的HBP：

制得覆盖图2中所示序列的前99bp(从Bam HI到EagI)但不包括覆盖前区域之部分(从73至87，斜体字)的寡核苷酸接头(见下文)，以其取代pSX556中的原始Bam HI-Eag I得到pSX559。期望该构建在杆状病毒系统中表达时所能产生成熟的HBP。

接头由配对退火的四种寡核苷酸组成，得到下列两个双链体：MHJ2568/LWN5746：5′-GATCCACCATGACCCGGCTGACAGTCCTGGCCC-3′

3′-GTGGTACTGGGCCGACTGTCAGGACCGGGACGACC-P-5′LWN5745/MHJ2566：5′-P-TGCTGGCTGGTCTGCTGGCGTCCTCGAGGGCCATCGTTGGC-3′

3′-GACCAGACGACCGCAGGAGCTCCCGGTAGCAACCGCCGG-5′

实施例4

表达在前肽和成熟HBP之间加有牛肠激酶切割位点的HBP衍生物

用编码HBP(信号-前肽-成熟HBP)的杆状病毒载体感染的昆虫细胞不能切掉前肽。由编码没有前肽之HBP(直接与成熟HBP序列融合的信号序列)的病毒感染的昆虫细胞可产生成熟形式的HBP，但量很低。为了增加成熟HBP的产率，产生一个编码带有牛肠激酶切割位点(Asp₄-Lys，插入在前肽和成熟HBP之间)之HBP衍生物的杆状病毒载体，这样便有可能经体外加工所产生的延伸形式的HBP而得到成熟的HBP：

用pfu聚合酶和引物241(CCGGG GATCCGATGAC CCG GCTGACAGT CCTGGCCCTGCTGGCTGGTCTGCTGG CGTC CTCGAGGGCCGG CTCCAGCCCCCTTTTGGACGA CGACGAC AA GATCGTTGGCGGC)和PBRa246(CCGGGGATCCAAC TAGG CTGGCCCCGGTCCCGG)，经PCR产生编码信号-Gly-Ser-Ser-Pro-Leu-Leu-Asp-Asp3-Lys-成熟HBP的cDNA片段。用Bam HI消化PCR产物并克隆到pVL1393转移载体(Invitrogen，San Diego，CA)。按照实施例2中所述的方法产生重组杆状病毒并生产蛋白质(但这种情况下根据它们的包含体阴性表型来鉴定推测的重组噬斑)。

为了产生N末端延伸形式的HBP，离心掉生长于SF900II无血清培养基(Gibco)中的10⁸个SF9细胞，并重新悬浮在给出MOI(感染复数)为1之病毒原种的样品中。将带有病毒的细胞转移至0.5升Bellco旋转瓶(#1965-00500)中，并加入新鲜的SF900II培养基至终体积为400ml。最后向培养物中加入已在25ml无茵0.9％NaCl中高压灭菌的1.5g肝素-Sepharose(CL-6B，Pharmacia)。将培养物于27℃保温3天。

为了从昆虫细胞培养物中分离出肝素-Sepharose小珠，将900ml发酵培养基等分成各50ml的8个管，并在Sorvall InstrumentsTECHNOSPIN R离心机中以300rpm离心3分钟。抽吸掉带有细胞的上清液并浮沉淀部分重新悬浮在加至各管内的30ml无菌NaCl中，然后以300rpm离心而将肝素-Sepharose小珠与余留的污染细胞分离开。整个过程重复两次。在加于各管中的20ml无菌0.5M NaCl中仔细洗小珠。然后将小珠收集在一个含小体积0.5M无菌NaCl(20-30ml)的50ml试管中，并转移到无茵玻璃过滤漏斗中。使小珠排出并用30ml无菌的3MNaCl从小珠上仔细洗脱rHBP。按照WO89/08666中所述的方法从3MNaCl洗脱物中纯化HBP。

将200μm包含前序列和位于前序列与成熟蛋白质之间的肠激酶切割位点的纯化的HBP溶解于含有25mM CaCl₂(pH5.1)的50mM乙酸钠缓冲液中。以1.2ml的体积加入400单位肠激酶(BiozymeLaboratonies Limited GB Batch 18×2 Code EK3)，并将混合物于37℃保温1小时。按照WO89/08666中所述的方法经反相高压液相层析(RP HPLC)从保温混合物中纯化出HBP。对1等份纯化的HBP(1mmol)进行N末端序列测定，结果证明主序列代表了以1le开始的正确的成熟HBP，这表明切割是成功的。

实施例5

表达在前肽和成熟HBP之间加有因子Xa切割位点的HBP衍生物

产生成熟HBP的另一个对策是使用因子Xa以体外切割所产生的材料。因子Xa识别/切割位点是Ile-Glu-Gly-Arg。T.J.Gardella等人(J.Biol.Chem.，26，15854-15859，1990)已报导，正好在因子a识别位点的N末端安插三个小氨基酸(Gly-Gly-Ser)也许会减小空间阻碍作用，并因而可增加因子Xa切割的效率。为了产生分别编码信号序列-前肽-Ile-Glu-Gly-Arg-成熟HBP和信号序列-前肽-Gly-Gly-Ser-Ile-Glu-Gly-Arg-成熟HBP的cDNA片段，合成引物PBRa249(CCGGGGATCCGATGACCCGGCTGACAGTCCTGGCCCTGCTGGCTGGTCTGCTGGCGTCCTCGAGGGCCGGCTCCAGCCCCCTTTTGGACATCGAGGGTAGGATCGTTGGCGGC)和PBRa250(CCGGGGATCCGATGACCCGGCTGACAGTCCTGGCCCTGCTGGCTGGTCTGCTGGCGTCCTCGAGGGCCGGCTCCAGCCCCCTTTTGGACGGTGGTTCCATCGAGGGTAGGATCGTTGGCGGC)

在用pfu聚合酶进行的PCR反应中使用这两个引物及前述的引物PBRa246(实施例4)。用Bam HI消化这两个片段并插入到pVI1393中。重组杆状病毒的产生和蛋白质的生产均按实施例4中所述的方法进行。

实施例6

在Lymphoprep^(Nycomed，Uslo，Norway)上离心柠酸酸盐抗凝处理的血沉棕黄色层，以从健康成年人血液供体(BloodBand，Rigshospitalet)制备外周血单核细胞(BMNC)。在某些实验中，将BMNC与PTX预保温1小时，然后加入终浓度为1μg/ml的脂多糖(LPS)(E.col：055：B5；Difco Laboratories，Detroit，MI)，或终浓度20μg/ml的PHA(Difco)，或终浓度为25μg/ml纯化的结核菌素蛋白质衍生物(PPD)(State SerumInstitute，Copenhagen，Denmark)。在含有3％于56℃加热失活30分钟之正常人血清(NHS)，并添加了0.8mM谷氨酰胺、青霉素/链霉素(BRL-Gibco，Denmark)(各20IE/ml)的RPMI-1640培养基(BRL-Gibco，Roskilde，Denmark)中进行保温。保温后收获细胞并立即于-20℃冷冻上清液；在液氮中快速冷冻细胞沉淀物并于-80℃下保存不超过1周，然后提取RNA。

使用抗纯化之重组细胞因子的单特异性多克隆免抗体，以双夹心ELISA法检测IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-6、IFNr、TNFα和TNFβ(M.B.Hansen et al.，Immunol.Lett.30，1991，pp.156)。用蛋白 A 亲合纯化的IgG包被Immuno-Maxisorp平板(Nunc.Roskilde，Denmarle)。用加在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的5％人血清白蛋白封闭未结合的部位。在添加有2％正常兔血清(Dako，Glostrup，Denmark)10mMEDTA、2000KIE/ml抑蛋白酶肽和5mM DL-二硫苏糖醇的PBS中稀释样品。用各细胞因子的国际标准品(National Institute for Biological Standards and Controls，PottersBar，Hevtfordshire，UK)校准测定值。使用生物素化的多克隆免抗体作为检测抗体，同时使用抗生蛋白链菌素-过氧化物酶(Kirkegaard andPerry la.，Gaithersburg，MD)进行检测。用1，2-苯二胺二盐酸化物进行显色并于492mm检测之。在8pg/ml和1mg/ml浓度范围之间的测定间偏离系数小于15％。这些ELISA法的灵敏性限度为8-10pg/ml。

融化BMNC，并分别在10和100mg/ml LPS存在下用10μg/ml和100μg/ml量的人血清白蛋白，以及0.2μg/ml、2μg/ml和20g/ml量的HBP处理之。

附图3和4中显示了检测的结果。从图中可以看出，在HBP存在下，显著降低了BMNC的细胞因子释放。序列表(1)一般信息：(i)申请人：(A)名称：Novo Nordisk A/S(B)街：Novo Alle(C)城市：Bagsvaerd(E)国家：Denmark(F)邮码：(ZIP)：2880(G)电话：+4544448888(H)传真：+4544493256(I)电传：37304(ii)发明名称：用于治疗脓毒症的肝素结合蛋白质(iii)序列数：2(iv)计算机可读形式(A)介质类型：Floppy盘(B)计算机：PC兼容(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS(D)软件：PatentIn Release#1.0，版本#1.25(EPO)(2)SEQ ID NO：1的信息：(i)序列特征：(A)长度：221氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链数：单股(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(vi)原始来源：(A)生物体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：Ile Val Gly Gly Arg Lys Ala Arg Pro Arg Gln Phe Pro Phe Leu Ala1 5 10 15Ser Ile Gln Asn Gln Gly Arg His Phe Cys Gly Gly Ala Leu Ile His

20 25 30Ala Arg Phe Val Met Thr Ala Ala Ser Cys Phe Gln Ser Gln Asn Pro

35 40 45Gly Val Ser Thr Val Val Leu Gly Ala Tyr Asp Leu Arg Arg Arg Glu

50 55 60Arg Gln Ser Arg Gln Thr Phe Ser Ile Ser Ser Met Ser Glu Asn Gly65 70 75 80Tyr Asp Pro Gln Gln Asn Leu Asn Asp Leu Met Leu Leu Gln Leu Asp

85 90 95Arg Glu Ala Asx Leu Thr Ser Asx Val Thr Ile Leu Pro Leu Pro Leu

100 105 110Gln Asx Ala Thr Val Glu Ala Gly Thr Arg Cys Gln Val Ala Gly Trp

115 120 125Gly Ser Gln Arg Ser Gly Gly Arg Leu Ser Arg Phe Pro Arg Phe Val

130 135 140Asx Val Thr Val Thr Pro Glu Asp Gln Cys Arg Pro Asn Asn Val Cys145 150 155 160Thr Gly Val Leu Thr Arg Arg Gly Gly Ile Cys Asn Gly Asp Gly Gly

165 170 175Thr Pro Leu Val Cys Glu Gly Leu Ala His Gly Val Ala Ser Phe Ser

180 185 190Leu Gly Pro Cys Gly Arg Gly Pro Asp Phe Phe Thr Arg Val Ala Leu

195 200 205Phe Arg Asp Trp Ile Asp Gly Val Leu Asn Asn Pro Gly

210 215 22O(2)SEQ ID NO：2的信息：(i)序列特征：(A)长度：219氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链数：单股(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(vi)原始来源：(A)生物体：猪(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：(i)序列特征：(A)长度：219氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链数：单股(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(vi)原始来源：(A)生物体：猪(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Ile Val Gly Gly Arg Arg Ala Gln Pro Gln Glu Phe Pro Phe Leu Ala1 5 10 15Ser Ile Gln Lys Gln Gly Arg Pro Phe Cys Ala Gly Ala Leu Val His

20 25 30Pro Arg Phe Val Leu Thr Ala Ala Ser Cys Phe Arg Gly Lys Asn Ser

35 40 45Gly Ser Ala Ser Val Val Leu Gly Ala Tyr Asp Leu Arg Gln Gln Glu

50 55 60Gln Ser Arg Gln Thr Phe Ser Ile Arg Ser Ile Ser Gln Asn Gly Tyr65 70 75 80Asp Pro Arg Gln Asn Leu Asn Asp Val Leu Leu Leu Gln Leu Asp Arg

85 90 95Glu Ala Arg Leu Thr Pro Ser Val Ala Leu Val Pro Leu Pro Pro Gln

100 105 110Asx Ala Thr Val Glu Ala Gly Thr Asn Cys Gln Val Ala Gly Trp Gly

115 120 125Thr Gln Arg Leu Arg Arg Leu Phe Ser Arg Phe Pro Arg Val Leu Asx

130 135 140Val Thr Val Thr Ser Asn Pro Cys Leu Pro Arg Asp Met Cys Ile Gly145 150 155 160Val Phe Ser Arg Arg Gly Arg Ile Ser Gln Gly Asp Arg Gly Thr Pro

165 170 175Leu Val Cys Asn Gly Leu Ala Gln Gly Val Ala Ser Phe Leu Arg Arg

180 185 190Arg Phe Arg Arg Ser Ser Gly Phe Pne Thr Arg Val Ala Leu Phe Arg

195 200 205Asn Trp Ile Asp Ser Val Leu Asn Asn Pro Pro

210 215

Claims

1.用于预防或治疗与脂多糖(LPS)诱导细胞因子级联相关之疾病或病理状况的药物组合物，该组合物包含糖基化形式的，表现分子量为28KD(如在还原条件下经SDS-PAGE测得的)的肝素结合蛋白质(HBP)，以及药学上可接受的载体或稀释剂，其中该蛋白质是在多形核白细胞的嗜天青颗粒中产生的。

2.根据权利要求1的组合物，其中肝素结合蛋白质是人HBP。

3.根据权利要求2的组合物，其中HBP具有如序列表中SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列，或其能够结合LPS之脂质A部分的类似物或肽片段。

4.根据权利要求3的组合物，其中能够结合LPS之脂质A部分的肽片段是至少包括SEQ ID NO：1中氨基酸残基20-53，特别是氨基酸残基26-42的肽片段。

5.根据权利要求1的组合物，其中肝素结合蛋白质是猪HBP。

6.根据权利要求5的组合物，其中HBP具有如序列表中SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列，或其能够结合LPS之脂质A部分的类似物或肽片段。

7.根据权利要求6的组合物，其中能够结合LPS之脂质A部分的肽片段是至少包含SEQ ID NO：2之氨基酸残基20-53的肽片段。

8.根据权利要求1-7之任何一项的药物组合物，其包含每个单位剂量形式约为10mg至1g量的HBP。

9.预防或治疗与由LPS诱导细胞因子级聪慧相关之疾病或病理状况的方法，该方法包括綸需要这种治疗的病人投用有效量的糖基化形式的，表现分子量为28KD(如在还原条件下经SDS-PAGE测知的)的肝素结合蛋白质，该蛋白质是在多形核白细胞的嗜天青颗粒中产生的。

10.根据权利要求9的方法，其用于预防或治疗革兰氏阴性茵脓毒症，脓毒性休克或弥漫性血管内凝血。

11.根据权利要求9的方法，其用于治疗脑膜炎球菌性脑膜炎。

12.根据权利要求9的方法，其中肝素结合蛋白质是人HBP。

13.根据权利要求12的方法，其中HBP具有如序列表中SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列，或该序列的能够结合LPS之脂质A部分的类似物或肽片段。

14.根据权利要求13的方法，其中能够结合LPS之脂质A部分的肽片段是至少包含SDQ ID NO：1之氨基酸残基20-53，特别是氨基酸残基26-42的肽片段。

15.根据权利要求9的方法，其中肝素结合蛋白质是猪HBP。

16.根据权利要求15的方法，其中HBP具有序列表中SEQ IP NO：2所示的氨基酸序列，或该序列的能够结合LPS之脂质A部分的类似物或肽片段。

17.根据权利要求16的方法，其中能够结合LPS之脂质A部分的肽片段是至少包含SEQ ID NO：2中氨基酸残基20-53的肽片段。

18.根据权利要求9的方法，其中HBP的有效量是在每公斤体重0.1-100mg范围内，较好为每公斤体重0.5-50mg，最好每公斤体重1-25mg。

19.应用肝素结合蛋白质(HBP)制造用于预防或治疗与LPS诱导细胞因子级联相关之疾病或病理状况的药物，其中所说的HBP为糖基化形式的，具有28KD表现分子量的(如在还原条件下经SDS-PAGE测知的)，该蛋白质是在多形核向细胞的嗜天青颗粒中产生的。

20.根据权利要求19的应用，其为应用于预防或治疗革兰氏阴性茵脓毒症，脓毒性休克或弥漫性血管内凝血。

21.根据权利要求19的应用，其为应用于治疗脑膜炎球菌性脑膜炎。

22.根据权利要求19的应用，其中肝素结合蛋白质是人HBP。

23.根据权利要求22的应用，其中HBP具有如序列表中SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列，或该序列的能够结合LPS之脂质A部分的类似物或肽片段。

24.根据权利要求23的应用，其中能够结合LPS之脂质A部分的肽片段是至少包含SEQ ID NO：1中氨基酸残基20-53，特别是氨基酸残基26-42的肽片段。

25.根据权利要求19的应用，其中肝素结合蛋白质是猪HBP。

26.根据权利要求25的应用，其中HBP具有如序列表中SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列，或其能够结合LPS之脂质A部分的类似物或肽片段。

27.根据权利要求26的应用，其中能够结合LPS之脂质A部分的肽片段是至少包含SEQ ID NO：2的氨基酸残基20-53的肽片段。

28.根据权利要求19的应用，其中药物含有大约每个单位剂量形式约10mg至1g量的HBP。

29.生产HBP的方法，其中在允许表达HBP的条件下在适当的培养基中培养包含编码前面接有N末端延伸部分之成熟HBP的DNA-序列的宿主细胞，生成的HBP作为N末端延伸的HBP从培养基中被回收。

30.根据权利要求29的方法，其中编码N末端延伸之HBP的DNA序列包括编码蛋白酶切割位点的DNA序列，其中后者位于编码N末端延伸部分的DNA序列和编码成熟HBP的DNA序列之间。

31.根据权利要求30的方法，其中蛋白酶切割位点是具有氨基酸序列(Asp)₄-Lys的肠激酶切割位点。

32.根据权利要求30的方法，其中蛋白酶切割位点是具有氨基酸序列Ile-Glu-Gly-Arg的因子Xa切割位点。

33.根据权利要求29的方法，其中N末端延伸部分是带有氨基酸序列Gly-Ser-Ser-Pro-Leu-Leu-Asp的HBP的前肽。

34.根据权利要求29的方法，其中宿主细胞是昆虫细胞。

35.根据权利要求30的方法，其中用适当的蛋白酶切割N末端延伸的HBP以产生成熟HBP。

36.生产HBP的方法，其中在允许HBP表达的条件下在含有硫酸化多糖的培养基中培养包含编码HBP之DNA序列的宿主细胞，并从培养基中回收所得到的HBP。

37.根据权利要求36的方法，其中硫酸化多糖是肝素。

38.根据权利要求36的方法，其中硫酸化多糖被固定在惰性载体上。

39.根据权利要求38的方法，其中惰性载体是琼脂糖。

40.根据权利要求36的方法，其中宿主细胞包含编码前面接有N末端延伸部分之成熟HBP的DAN序列。

41.根据权利要求40的方法，其中编码N末端延伸之HBP的DNA序列包括编码蛋白酶切割位点的DNA序列，其中后者位于编码N末端延伸部分的DNA序列和编码成熟HBP的DNA序列之间。

42.生产HBP的方法，其中在允许表达HBP和其他蛋白质之融合蛋白质的条件下，在适当的培养基中培养含有编码成熟HBP之DNA序列的宿主细胞，其中所说的DNA序列前面接有并融合有编码另一种蛋白质的DNA序列。

43.根据权利要求42的方法，其中编码蛋白酶切割位点的DNA序列位于编码其他蛋白质的DNA序列和编码成熟HBP的DNA序列之间。