CZ289439B6

CZ289439B6 - Farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčbu sepse

Info

Publication number: CZ289439B6
Application number: CZ19963082A
Authority: CZ
Inventors: Hans Jokob Hem Flodgaard; Poul Baad Rasmussen
Original assignee: Novo Nordisk A/S
Priority date: 1994-04-21
Filing date: 1995-03-17
Publication date: 2002-01-16
Also published as: NO964465D0; AU2303395A; FI964227A0; JPH09512168A; FI964227L; RU2200573C2; NO964465L; FI964227A7; HUT75557A; DE69530689T2; HU221638B1; HU9602895D0; EP0762889A1; NZ332683A; CZ308296A3; PL316935A1; ATE239494T1; CA2188395A1; NZ284434A; CN1146724A

Abstract

e en se t²k farmaceutick ho prost°edku ur en ho pro prevenci nebo l bu chorob a stav spojen²ch s indukc cytokinov kask dy lipopolysacharidem (LPS), obsahuj c ho heparin- vazebn² protein (HBP), kter² v glykosylovan form m molekulovou hmotnost 28 (ur eno pomoc SDS-PAGE za redukuj c ch podm nek) a kter² je produkov n v azurofiln ch granul ch polymorfonukle rn ch leukocyt , spole n s farmaceuticky vhodn²m nosi em nebo rozpou t dlem. Heparin- vazebn² protein se produkuje v hostitelsk²ch bu k ch obsahuj c ch DNA sekvenci koduj c N-koncov prodlou en² HBP nebo k duj c HPB f·zovanou s DNA sekvenc k duj c dal protein.\

Description

Farmaceutický prostředek pro prevenci nebo léčbu sepse

Oblast techniky

Vynález se týká farmaceutického prostředku obsahujícího heparin-vazebný protein a jeho užití pro léčbu chorob nebo stavů způsobených bakteriálním endotoxinem.

Dosavadní stav techniky

Výskyt septického šoku jako odpovědi na vážné infekce se v posledních 50 letech velmi zvyšuje a je zřejmě jednou z nejběžnějších příčin úmrtí na jednotkách intenzivní péče v USA. Důvody pro častější výskyt septického Šoku jsou pravděpodobně zvýšení používání invazivních léčebných nástrojů jako jsou intravaskulámí katétry, zvýšené používání cytotoxických a imunosupresivních prostředků, zvýšená dlouhověkost pacientů náchylných k vývinu sepsí a vzrůst infekcí způsobených organismy rezistentními vůči antibiotikům.

Poruchy spojené se sepsí jsou bakteriemie (také známá jako septisemie) charakterizované pozitivními krevními kulturami; sepse charakterizované systémovou odpovědí na infekci ve formě tachykardie, hypertermie nebo hypotermie; septický syndrom, při kterém se vyskytují klinické důkazy sepse a známky změněné orgánové perfuze ve formě abnormálně zvýšené hladiny laktátu, oligurie nebo akutně změněného mentálního statusu; časný septický šok, při kterém se vyskytují klinické důkazy septického syndromu a hypotenze trvající méně než jednu hodinu a který odpovídá na konveční terapii, a refraktomí septický šok, při kterém se vyskytují klinické důkazy septického syndromu a hypotenze trvající více než jednu hodinu navzdory konvenční terapii.

Známé mediátory sepse interagují v komplexu způsobujícím tvorbu sepse nebo vcytokinové kaskádě iniciované v místě infekce nebo poranění. Iniciátor cytokinové kaskády (v gramnegativních bakteriích, které jsou obvyklou příčinou sepse) je endotoxin (jinak také známý jako iipopolysacharid, označovaný zkratkou LPS) uvolňovaný bakteriemi v místě infekce či zánětu, kde indukuje tvorbu a uvolňování tumor-nekrotického faktoru a (TNFa), interleukinu-1, interleukinu-6, interleukinu-8 a aktivačního faktoru PAF z makrofágů a dalších buněk. Po uvolnění TNFa, interleukinu-1 a PAF se arachidonová kyselina metabolizuje a vytváří leukotieny, tromboxan A₂ a prostaglandiny. Interleukin-1 a interleukin-6 aktivují T-buňky a ty produkují interferon g, interleukin-2, interleukin-4 a faktor stimulující tvorbu kolonií granulocytů a monocytů. Neutrofilní leukocyty mohou být aktivovány přímo většinou z těchto mediátorů. Poškození indukované neutrofily tak může nastat během degranulace uvolněním kyslíkových volných radikálů a lysozomálních enzymů během agregace v místě infekce nebo zánětu.

Přítomnost endotoxinu nebo jiných mediátorů sepse v místě infekce nebo zánětu (i když je potencionálně schopná spustit cytokinovou kaskádu) nemusí sama o sobě vést k sepsi. Cytokinová kaskáda má určité vlastní obranné mechanismy zabraňující její nekontrolovatelné aktivaci. Např. prostaglandin může inhibovat uvolnění cytokinů z makrofágů a makrofágy mohou být schopné suprimovat T buňky. Klinické symptomy sepse by nastaly, pokud by došlo k uvolnění příliš velkého množství endotoxinu nebo jiných mediátorů, nebo pokud by mediátory schopné interference s cytokinovou kaskádou nebyly přítomné, tj. v případě oslabeného imunitního systému. Detailnější popis vzniku septických poruch a mediátorů účastnících se v tomto procesuje uveden v vide R. C. Bone, „The Pathogenesis of Sepsis“, Ann. Int. Med. 115, 1991,457-469.

Postupující vysoká úmrtnost přisuzovaná gram-negativním sepsím podnítila intenzivní výzkum terapeutických prostředků schopných zasáhnout v případě potencionálně letálních účinků

-1 CZ 289439 B6 bakteriálního LPS. Rada zpráv popisuje významný terapeutický účinek vysokých dávek intravenózně podávaného imunoglobulinu. Léčba však vyžaduje IgG z plazmy dárců, kteří byli testováni na přirozeně se vyskytující vysoké hladiny protilátek proti jádru LPS, nebo z velmi velkého počtu dárců (více než 1000). Monoklonální protilátky proti LPS, které také byly navrhovány pro léčbu bakteriemie (např. WO 88/03 211), ukázaly malý nebo žádný účinek, pravděpodobně proto, že neinhibují cytokinovou kaskádu indukovanou LPS.

Nedávno byla určena kovalentní struktura dvou blízce příbuzných proteinů izolovaných z periferních neutrofilních leukocytů lidského a prasečího původu (H. Flodgaard a spol. Eur. J. Biochem. 197, 1991, 535-547; J. Pohl a spol. FEBS Lett. 272, 1990, 200). Oba proteiny vykazují vysokou podobnost kneutrofílní elastáze, ale díky selektivním mutacím na aktivním šeřinu 195 a histidinu 57 (B. S. Hartley, „Homologies in Serine Proteinases“, Phil Trans. Roy. Soc. Series 257, 1970, 77) proteiny postrádají proteázovou aktivitu. Proteiny byly nazvány jako protein vázající lidský (resp. prasečí) heparin (human (resp.) porcine heparin-binding protein = hHBP, pHBP) díky své vysoké afinitě k heparinu (W. M. Schafer a spol., Infect. Immun. 53, 1986, 651), a nebo jako kationický antimikrobiální protein (cationic antimicrobial protein) (CAP37) díky své antimikrobiální aktivitě. Proteiny také vykazují chemotaktické vlastnosti vůči monocytům více než 1,3χ10⁹ Μ - ΙΟ“⁸ Μ (H. A. Pereira a spol., J. Clin. Invest. 85, 1990, 1468), což odpovídá výsledkům podle Flodgaara a spol.

Dále se ukázalo, že HBP zprostředkuje připojení a kontrakci endoteliálních buněk a fíbroblastů, pokud se přidá k těmto buňkám rostoucím vjednovrstevné kultuře. HBP také stimuluje přežití monocytů a sekreci trombospondinu (E. Ostergaard a H. Flodgaard. J. Leukocyte Biol. 51, 1992, 316).

Protein s prvními 20 N-koncovými aminokyselinami identickými k hHBP a CAP37 byl izolován z azurofilních granulí a nazván azurocidin (J. E. Gabay a spol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86, 1989, 5610; C. G. Wilde a spol., J. Biol. Chem. 265, 1990, 2038). Byly popsány také jeho antimikrobiální vlastnosti (D. Campanelli a spol., J. Clin. Invest. 85, 1990,904).

Přítomnost hHBP v neutrofilních leukocytech a fakt, že 89 % CAP37 (který je identický s hHBP) je uvolňováno, když leukocyty fagocytují Staph. aureus (H. A. Pereira a spol., viz výše), naznačují, že funkcí hHBP by mohla být jeho účast v zánětlivých procesech, neboť protein je evidentně uvolňován z aktivovaných neutrofilů. Pereira a spol, viz výše, naznačují, že funkce CAP37 je v místě zánětu, kde specificky přitahuje monocyty, a tak je jedním z faktorů odpovědných za přítomnost monocytů v druhé vlně zánětlivého procesu. Ostergaard a Flodgaard, viz výše, naznačují, že kromě zvýšení pohotovosti monocytů, HBP může hrát klíčovou roli v mechanismu neutrofílní i monocytové extravasace.

Struktura HBP se objevuje v WO 89/08 666 a H. Flodgaard a spol, viz výše. HBP je jinak nazýván CAP37 (WO 91/00 907) a azurocidin (C. G. Wilde a spol., J. Biol. Chem. 265, 1990, 2038).

Podstata vynálezu

Dosud nebylo známo, že HBP se může použít při léčbě chorob nebo stavů způsobených přítomností bakteriálního endotoxinu v místě infekce nebo poranění.

Předkládaný vynález se týká farmaceutického prostředku pro preventivní použití nebo pro léčbu chorob nebo stavů spojených s indukcí cytokinové kaskády lipopolysacharidem (LPS), prostředku obsahujícího heparin-vazebný protein (HBP), který v glykosylované formě má molekulovou hmotnost 28 (určeno SDS-PAGE za redukujících podmínek) a který je produkován v azurofilních granulích a v prostředku se vyskytuje společně s farmaceuticky vhodným nosičem nebo rozpouštědlem.

-2CZ 289439 B6

HSP se také váže k LPS (H. A. Pereira a spol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90, 1993,4733-4737) a tato schopnost vazby je spojena sjeho antibakteriálním účinkem. Je popsáno, že baktericidní účinek HBP je redukován při pH 7 (tj. fyziologické pH). Septické podmínky nejsou způsobeny gram-negativními bakteriemi jako takovými, ale endotoxinem uvolňovaným z mrtvých bakterií, který aktivuje CD 14 receptor monocytů, a tím indukuje cytokinovou kaskádu. Zdálo by se proto, že antibakteriální účinek HBP není důležitý pro léčbu septických stavů. V tomto kontextu by mělo být poznamenáno, že navázání LPS samo o sobě neukazuje žádnou schopnost neutralizovat cytokinovou kaskádu indukovanou efekty endotoxinu (jak je ukázáno faktem, že protilátky získané proti LPS mají v tomto ohledu malý nebo žádný účinek, E. T. Rietschel a M. Schlaak, Immun. Infect, 21, 1993, 25-36).

Dříve uváděné práce zaměřené na léčbu septických stavů se soustřeďovaly na neutralizaci endotoxinu v oběhu septických pacientů (např. WO 93/19 087, kde CAP37 (tj. HBP) je navržen pro léčbu endotoxemie navázáním a tím tedy odstraněním LPS z oběhu). Většina těchto prací nebyla úspěšná, neboť septičtí pacienti obecně neměli zvýšenou hladinu cirkulujícího endotoxinu. HBP však může být účinný v místních zánětlivých a infekčních ložiscích po objevení septických příznaků, které jsou postendotoxickými jevy. V současnosti se ukazuje, že HBP může zvyšovat svůj účinek nejen specifickou vazbou s vysokou afinitou k lipidu A (toxická složka LPS), a tím tedy inhibici další indukce cytokinové kaskády, ale také ochranou monocytů vůči apoptose, vyplývající z uvolňování kyslíkových volných radikálů a cytokinů z fagocytů (tj. neutrofilů, monocytů, makrofágů) jako součásti obranných mechanismů proti poranění a infekci.

Monocyty migrují do místa poranění nebo infekce, kde fagocytují infekční mikroorganismy a škodlivé látky, jako je endotoxin. HBP může také stimulovat fagocytický efekt monocytů. Schopnost HBP mobilizovat monocyty by se mohla zdát závislá na jeho schopnosti vázat PLS způsobem, který dosud nebyl objasněn.

Překvapivě bylo ukázáno, že HBP se váže ireverzibilně kLPS při teplotách 37 až 45 °C (tj. normální až hypertermická tělesná teplota). To také může mít vliv na neutralizaci LPS pomocí HBP.

V dalším pohledu se vynález týká použití heparin-vazebného proteinu (HBP), který v glykosylované formě má molekulovou hmotnosti 28 (určeno SDS-PAGE za redukujících podmínek) a který je produkován v azurofilních granulích polymorfonukleámích leukocytů, pro přípravu prostředku pro prevenci nebo léčbu chorob a stavů asociovaných s indukcí cytokinové kaskády.

HBP může být výhodně savčího původu (lidský nebo prasečí HBP). HBP je lidský HBP s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v seznamu sekvencí jako SEQ ID No:l, nebo prasečí s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v seznamu sekvencí jako SEQ ID No:2, nebo funkční analog nebo jeho peptidový fragment schopný vazby na LPS (resp. jeho toxickou složku, lipid A). Příklady takových funkčních analogů zahrnují deriváty přirozeného proteinu získané přidáním jedné nebo více aminokyselin kjednomu nebo oběma koncům jeho molekuly, substitucí jedné nebo více aminokyselin na jednom nebo obou koncích jeho molekuly, delece jedné nebo více aminokyselin na jednom nebo obou koncích jeho molekuly, nebo inzerce jedné nebo více aminokyselin na jedno nebo více míst v původní aminokyselinové sekvenci. Snaha je získat peptidové fragmenty HBP, zvláště fragmenty s podobnou schopností jako přirozené HBP redukovat LPS-indukovatelnou cytokinovou kaskádu z lidských jednojademých buněk. Příklad takového fragmentu schopného vázat lipid A je peptidový fragment obsahující aminokyselinové zbytky 20 až 53, resp. aminokyselinové zbytky 26 až 42 podle sekvence SEQ ID No:l, nebo aminokyselinové zbytky 20 až 53 podle sekvence SEQ ID No:2.

DNA sekvence kódující HBP se může připravit synteticky podle zavedených standardních metod, např. fosfoamiditovou metodou popsanou S. L. Beaucage a Μ. H. Caruthers, Tetrahedron Letters22, 1981, 1859-1869, nebo metodou popsanou Matthes a spol., EMBO Joumal 3, 1984,

-3CZ 289439 B6

801-805. Podle fosfoamiditové metody se syntetizují oligonukleotidy např. v automatickém DNA syntezátoru, purifikují, párují se, ligují a klonují se do vhodných vektorů.

DNA sekvence také může být genomového nebo cDNA původu, např. získaná přípravou genomové nebo cDNA knihovny a vyhledáváním DNA sekvence kódující celý nebo Část HBP hybridizací za použití syntetických oligonukleotidových sond podle standardních technik (Sambrook a spol., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor, 1989). DNA sekvence také může být připravena polymerázovou řetězovou reakcí za použití specifických primerů, např. popsaných v US 4 683 202 nebo R. K. Saiki a spol. Science 239, 1988,487-491.

DNA sekvence se pak vloží do rekombinantního expresního vektoru, kteiým může být jakýkoliv konvenčně užívaný vektor pro práci s rekombinantní DNA. Volba vektoru bude Často závislá na hostitelských buňkách, do kterých má DNA být zavedena. Vektor může být autonomně se replikující, tj. vektor, který existuje v extrachromozomálním stavu a jeho replikace je nezávislá na replikaci chromozómové; např. plazmid. Alternativně se vektor může po zavedení do hostitelské buňky integrovat do jejího genomu a replikuje se společně s chromozomem, do kterého se integroval.

Ve vektoru by měla být DNA sekvence kódující HBP připojena k vhodné promotorové sekvenci. Promotorem může být jakákoliv DNA sekvence, která vykazuje transkripční aktivitu v hostitelské buňce a může být odvozena z genů kódujících proteiny homologní nebo heterologní vzhledem k hostitelské buňce. Příklady vhodných promotorů pro řízení transkripce DNA kódující HBP v savčích buňkách jsou SV 40 promotor (Subramami a spol., Mol. Cell Biol. 1, 1981, 854864), MT-1 promotor (metalothioneinový gen) (Palmiter a spol., Science 222, 1983, 809-814) nebo adenovirový- 2 hlavní pozdní promotor. Vhodným promotorem pro použití v hmyzích buňkách je polyhedrinový promotor (Vasuvedan a spol., FEBS Lett. 311, 1992, 7-11). Vhodnými promotory pro použití v kvasinkových hostitelských buňkách jsou promotory kvasinkových glykolytických genů (Hitzeman a spol. J. Biol. Chem. 255, 1980, 12073-12080, Alber aKawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1, 1982, 419—434), nebo alkoholdehydrogenázových genů (Young a spol., Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollaender a spol.), Plenům Press, New York, 1982) nebo TPI1 promotory (US 4 599 311 nebo ADH2-4c (Russel a spol. Nátuře 304, 1983, 652-654). Vhodnými promotory pro použití v buňkách vláknitých hub jsou např. ADH3 promotor (McKnight a spol. The EMBO J. 4, 1985, 2093-2099) nebo tpiA promotor.

DNA sekvence kódující HBP může být také připojena na vhodný terminátor, např. terminátor lidského růstového hormonu (Palmiter a spol., viz výše) nebo (pro buňky hub) na TPII (Alber a Kawasaki, viz výše) nebo ADH3 promotory (McKnight a spol., viz výše). Vektor může dále obsahovat prvky jako polyadenylační signály (např. zSV 40 nebo oblast Elb adenoviru), transkripční enhancerové sekvence (např. enhancer viru SV 40) nebo translační enhancerové sekvence (např. enhancerové sekvence kódované adenovirovými VA RNA).

Rekombinantní expresní vektor může dále obsahovat DNA sekvenci zajišťující replikaci vektoru v daných hostitelských buňkách. Jako příklad takovéto sekvence (v případě, že hostitelské buňky jsou buňky savčí) je počátek replikace viru SV 40. Vektor dále může obsahovat selekční prvky, např. geny, jejichž produkty jsou schopné komplementovat defekt hostitelské buňky, např. gen kódující dihydrofolát reduktázu (DHFR), nebo geny, jejichž produkty udělují buňce rezistenci k různým látkám, např. neomycinu či hygromycinu.

Metody používané pro ligaci DNA sekvencí kódující HBP, promotorů, terminátorů a pro jejich inzerci do vhodných vektorů, obsahujících informaci nezbytnou pro replikaci, jsou obecně používané a velmi známé (např. Sambrook a spol., viz výše).

-4CZ 289439 B6

Hostitelská buňka, do které je zaveden expresní vektor, může být jakákoliv buňka, která je schopná produkce HBP a je s výhodou eukaryotická, jako např. buňky bezobratlých (hmyzí buňky) nebo buňky obratlovců, např. oocyty Xenopus laevis nebo savčí buňky. Příklady vhodných savčích buněčných linií jsou COS (např. ATCC CRL 1650), BHK (např. ATCC CRL 1632, ATCC CCL 10) nebo CHO (např. ATCC CCL 61). Metody transfekce savčích buněk a exprese DNA sekvencí zavedených do buněk jsou popsány v Kaufman a Sharp, J. Mol. Biol., 159, 11982, 601-621, Southema a Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1, 1982, 327-341, Loyter a spol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 79, 1982, 422-426, Wigler a spol., Cell 14, 1978, 725, Corsaro aPearson, Somatic Cell Genetics 7, 1981, 603, Graham a van der Eb, Virology, 1973, 456, Neumann a spol., EMBO J. 1,1982, 841-845.

Alternativně lze také jako hostitelské buňky použít buňky' hub (včetně kvasinkových buněk). Příklady vhodných kvasinkových buněk zahrnují buňky Saccharomyces spp. nebo Schizosaccharomyces spp., zvláště Saccharomyces cerevisiae. Jako příklady dalších buněk hub jsou buňky vláknitých hub, např. Aspergillus spp. nebo Neurospora spp., zvláště kmeny Aspergillus oryzae nebo Aspergillus niger. Použití Aspergillus spp. pro expresi proteinů je popsáno např. v ÉP 238 023.

Médium používané pro pěstování buněčných kultur může být jakékoliv konvenční médium vhodné pro růst savčích buněk, např. sérum-obsahující a sérum-neobsahující médium, doplněné o vhodné přídavné látky, nebo vhodné médium pro pěstování hmyzích, kvasinkových nebo houbových buněk. Vhodná média jsou dostupná od komerčních dodavatelů, nebo mohou být připravována podle publikovaných návodů (např. v katalozích Američan Type Culture Collection).

HBP produkovaný buňkami může být zpětně získáván z média konvenčními metodami včetně separace hostitelských buněk z média centrifugací nebo filtrací, precipitací proteinových složek ze supematantu nebo filtrací pomocí solí, např. amonium sulfátu, purifikací různými chromatografickými metodami, např. iontovou výměnnou chromatografií, afínitní chromatografií apod.

Překvapivě bylo zjištěno, že zvláště dobré výtěžky HBP se získávají, pokud je HBP exprimován jako pro-HBP. V jedné části předkládaného vynálezu se popisuje způsob přípravy HBP, kde hostitelské buňky obsahují DNA sekvenci kódující maturovaný HBP, které předchází N-koncová prodloužená sekvence, jsou kultivovány ve vhodném médiu za podmínek dovolujících expresi HBP a výsledný HBP je získáván z média jako N-koncově prodloužený HBP.

N-koncové prodloužení může být sekvence o délce 5 až 25 aminokyselinových zbytků, zvláště 8 až 15. Původ aminokyselinových zbytků v N-koncové sekvenci se nepovažuje za kritický. Nkoncové prodloužení může výhodně být propeptid HBP s aminokyselinovou sekvencí Gly-SerSer-Pro-Leu-Asp.

Aby se usnadnila produkce maturovaného HBP, obvykle se dává přednost tomu, aby DNA sekvence kódující N-koncově prodloužený HBP obsahovala DNA sekvenci kódující štěpící místo pro proteázy, umístěné mezi DNA sekvencí kódující N-koncové prodloužení a DNA sekvencí kódující maturovaný HBP. Příkladem vhodného štěpícího místa pro proteázy jsou enterokinázová místa s aminokyselinovou sekvencí (Asp)4-Lys nebo štěpící místo Faktoru Xa s aminokyselinovou sekvencí Ile-Glu-Gly-Arg.

Po získání z růstového média N-koncově prodloužený HBP může být výhodně štěpen s vhodnou proteázou tak, aby se získal maturovaný (a aktivní) HBP. Příklady vhodných enzymů jsou enterokináza nebo Faktor Xa.

Hostitelské buňky používané pro produkci HBP jsou výhodně také hmyzí buňky, např. buňky Lepidoptera nebo Drosophila. V tomto případě buňky mohou být výhodně transfektovány baculovirovým vektorem, např. popsaným v US 4 745 051 nebo WO 92/01 801.

-5CZ 289439 B6

Dále bylo zjištěno, že je výhodné produkovat HBP v přítomnosti heparinu nebo jiných sulfátových polysacharidů, aby se zabránilo vazbě HBP na lipopolysacharidy přítomné v růstovém médiu. V jedné části předkládaného vynálezu se popisuje způsob přípravy HBP, kde hostitelské buňky obsahují DNA sekvenci kódující HBP jsou kultivovány ve vhodném růstovém médiu, které obsahuje sulfátové polysacharidy, za podmínek dovolujících expresi HBP a HBP je pak získáván z růstového média. HBP se bude vázat na sulfátové polysacharidy přítomné v růstovém médiu a následně by měl být uvolňován z těchto polysacharidů za vhodných podmínek, např. elucí HBP v přítomnosti solí, jako např. chloridu sodného.

Sulfátový polysacharid je s výhodou heparin, ačkoliv další sulfátové polysacharidy jako heparan sulfát, dextran sulfát, dermatan sulfát, pentosan sulfát nebo protamin sulfát také mohou být použity. Sulfátový polysacharid je s výhodou imobilizován na inertním nosiči, aby se usnadnilo oddělení HBP navázaného na polysacharid z růstového média. Inertním nosičem může být např. agaróza (např. Sepharose).

V této části lze také použít DNA sekvenci kódující maturovaný HBP, kterému předchází Nkoncová prodloužená sekvence (viz výše).

V další části předkládaného vynálezu se popisuje způsob přípravy HBP, kde hostitelské buňky obsahující DNA sekvenci kódující maturovaný HBP, s kterou je fúzována sekvence kódující jiný protein, jsou kultivovány ve vhodném růstovém médiu za podmínek dovolujících expresi fúzního proteinu složeného z HBP a dalšího proteinu a výsledný protein je získáván z média. Jako proteiny vhodné pro fúzi mohou být např. lehký řetězec faktoru VIII (DNA sekvence kódující tento protein byla získána podle EP 232 112).

V této části vynálezu také může být s výhodou zavedena DNA kódující štěpící místo pro proteázu, umístěná mezi N-koncovým prodloužením a sekvencí kódující maturovaný HBP.

Do farmaceutického prostředku může být HBP zaveden podle jakékoliv popsané metody pro přípravu farmaceutických prostředků, např. uvedených v Remingtonů Pharmaceutical Sciences, 1985. Prostředek může být ve formě vhodné pro lokální nebo systémovou injikaci nebo infuzi, a jako takový může být obsažen v destilované vodě nebo izotonickém solném nebo glukózovém roztoku. Prostředek se může sterilizovat konvenčními běžně používanými sterilizačními technikami. Výsledný vodný roztok může být skladován přímo pro použití a nebo se filtruje za aseptických podmínek a lyofilizuje se. Lyofilizovaný prostředek se před vlastním použitím kombinuje se sterilním vodným roztokem. Prostředek může obsahovat farmaceuticky vhodné pomocné látky, které vyhovují přibližným fyziologickým podmínkám, jako jsou pufrovací látky, tonická adjustační činidla apod., např. acetát sodný, laktát sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý atd. Koncentrace HBP může být v širokém rozsahu, tj. od méně než 0,5 % až do 15 až 20% hmotnostních. Jednotka dávkování prostředku může obsahovat od 10 mg až do lgHBP.

Farmaceutický prostředek podle předloženého vynálezu může být s výhodou. použit pro terapeutické aplikace při léčbě sepsí, septického šoku, intravaskulámích koagulací nebo meningokokových meningitidách. Jak je naznačeno výše, předkládaný prostředek může být vhodný pro lokální aplikaci v místě zánětu nebo infekce, neboť je nezbytný pro ochranu monocytů migrujících do těchto míst a zajišťuje tak, že jsou schopné intemalizovat endotoxin a infekční bakterie. Denní dávka HBP 0,1 až lOOmg/kg tělesné hmotnosti je uvažována jako vhodná, v závislosti na závažnosti léčeného případu a na stavu pacienta.

Prostředek podle předloženého vynálezu může přídavně obsahovat antimikrobiální složku pro léčbu případných bakteriálních infekcí. Příklady vhodných antibakteriálních látek jsou betalaktamová antibiotika (např. penicilín), aminoglykosidy, tetracykliny, bacitracin, polymyxin, sulfonamidy, nitrofuany, nalidixová kyselina apod. Pro systémovou aplikaci prostředek také

-6CZ 289439 B6 může obsahovat heparin nebo jiný sulfátový glukosaminoglykam jako antikoagulační složku, protože jak bylo překvapivě zjištěno, heparin neinhibuje schopnost HBP vázat LPS. Kromě antikoagulační funkce heparin také pomáhá prodlužovat střední dobu životnosti plazmového HBP tím, že zabraňuje HBP se vázat na glukosaminoglykany ve vaskulámím endotelinu.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 a, b ukazuje DNA sekvenci a odvozenou aminokyselinovou sekvenci EcoRI-Xbal fragmentu o délce 901 bp plazmidu pKFN-1783, kódujícího hHBP.

Obr. 2 a, b ukazuje DNA sekvenci a odvozenou aminokyselinovou sekvenci BamHI-HindlII fragmentu o délce 772 bp vloženého do plazmidu pSX221, kódujícího hHBP.

Obr. 3 je graf znázorňující hladinu cytokinů v krevních jednojademých buňkách ošetřených s 10 mg/ml HSA nebo měnící se hladinu HBP v přítomnosti 10 ng/ml LPS.

Obr. 4 je graf znázorňující hladinu cytokinů v krevních jednojademých buňkách ošetřených s 0 mg/ml HSA nebo měnící se hladinu HBP v přítomnosti 100 ng/ml LPS.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Produkce proteinu vázajícího lidský heparin v kvasinkovém kmenu KFN-1775

Obecné metody

Standardní DNA techniky se prováděly podle popisovaných metod (Sambrok, J., Fritch, E. F., Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Syntetické oligonukleotidy se připravovaly na automatickém DNA syntetizátoru (380B, Applied Biosystems) za použití komerčně dostupných reagencií. DNA sekvenace se prováděla pomocí dideoxyterminační techniky (Sanger, F., Micklen, S., Coulson, A. R., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 74, (1977) 5463-5467). Polymerázová řetězová reakce se prováděla na DNA Thermal Cycler (Perkin Elmer Cetus).

Analýza N-koncové aminokyselinové sekvence se získala automatizovanou Edmanovou degradací za použití Applied Biosystems 477A plynového sekvenátoru. Analýza reverzní fáze HPLC se prováděla pro detekci a kvantifikaci uvolněných aminokyselin z každého sekvenčního cyklu.

ml (10⁶ pfu) cDNA knihovny lidské kostní dřeně (Clontech, Palo Alto, CA, USA) se použila jako matrice pro PCR reakci obsahující 100 pmol každého z primerů NOR-3176 (GTTGGATTAT(A/T/C)CA(A/G)AA(T/C)CA(A/G)GGN(A/C)G) a NOR-3174 (CA(T/C)TG(A/G)TC(T/C)TCNGGNGT), kde N je směs všech čtyř nukleotidů.

5-konec přímého primeru NOR-3176 obsahuje EcoRI místo a 3-konec odpovídá aminokyselinovým zbytkům 18 až 23 a reverzní primer NOR-2174 odpovídá aminokyselinovým zbytkům 149 až 154 v aminokyselinové sekvenci hHBP. (Flodgaar, H., Ostergaard, E., Bayne, S., Svendsem, A., Thomsen, J., Engels, M., Wollmer, A. (1991) Eur. J. Biochem. 197, 535-547).

PCR reakce se prováděla ve 100 ml objemu za použití standardního kitu (GeneAmp, Perkin Elmer Cetus) a při následujících cyklech: 94 °C - 1 minuta, 50 °C - 2 minuty, 72 °C - 3 minuty.

-7CZ 289439 B6

Tento cyklus se opakoval 35 krát a na závěr proběhl jeden cyklus při teplotě 72 °C po dobu 10 minut. PCR produkt, fragment o délce 420 bp, se izoloval elektroforeticky v 1% agarózovém gelu.

Podobně primery NOR-3173 (ACNCCNGA(A/G)GA(T/C)CA(A/G)TG) a NOR-3175 (GGTTTCTAGATTATCCCGG(A/G)TT(A/G)TTNA(A/G)NACNCC) se použily se stejnou DNA matricí jako u popisu předcházející PCR reakce. Přímý primer NOR-3273 je komplementární kNOR-2174 a reverzní primer NOR-3175 odpovídá aminokyselinovým zbytkům 215 až 221 v aminokyselinové sekvenci HBP následované stop kodónem a Xbal je místem. PCR reakce se prováděla podle postupu uvedeného výše a produkt o délce 232 bp se izoloval elektroforeticky v agarózovém gelu.

Dva PCR fragmenty popsané výše se propojily prodlužovací překryvnou PCR (Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. (1989) Gene ΊΊ, 61-68) za použití NOR-3176 a NOR-3175 jako koncových primerů. Výsledný 635 bp fragment se izoloval a pak štěpil EcoRI a Xbal za vzniku 621 bp fragmentu, který se ligoval do 2,8 kb EcoRI-Xbal fragmentu z plazmidu pTZ19R (Mead, D. A., Szczesna-Skorupa, E., Kemper, B., Prot. Engin. 1 (1986) 67-74).

Ligační směs se použila pro transformaci kompetentních buněk E.coli (kmen r”, m⁺), které byly selektovány na rezistenci na ampicilin. DNA sekvencování ukázalo, že plazmid pKFN-1726 z jedné z výsledných kolonií kóduje očekávanou hHBP₁₈_₂₂i aminokyselinovou sekvenci.

Plazmid pKFN-1726 se štěpil Pstl a Xbal a výsledný 329 bp fragment se izoloval a použil podle níže uvedeného popisu.

N-koncová část HBP se izolovala jako 379 bp fragment pomocí PCR za použití stejné cDNA matrice jako u příkladů popsaných výše a primerů MHJ-206 (GCTGAGAGATTGGAGAAGAGAATCGTTGGCGGCCGGAAGGCGAG) a MHJ-200 (CGGCTTCCACCGTGGCGTTCTG). 3-koncová část MHJ-206 je identická sN-koncovou kódující částí lidského genu HBP a 5koncová část MHJ-206 je identická s C-koncovou částí hybridního kvasinkového řídicího genu popsaného dříve (Thim, L., Norris, F., Nielson, P. F., Bjom, S. E., Christensen, Petersen, J. (1993) FEBS Lett. 318,345-352).

Fúze ve fázi hybridního řídicího genu a 379 bp PCR fragmentu kódujícího N-koncovou část HBP se získala prodlužovací překryvnou PCR (Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. (1989) Gene 77, 61-68). Produkt se štěpil EcoRI a Pstl a izoloval se 572 bp fragment.

EcoRI-Pstl fragment o délce 572 bp a Pstl-Xbal fragment o délce 329 bp popsaný výše se ligovaly do 2,8 kb EcoRI-Xbal fragmentu z plazmidu pTZ19R (Mead, D. A., Szczesna-Skorupa, E., Kemper, B., Prot. Engin. 1 (1986) 67-74). Ligační směs se užila pro transformaci kompetentních buněk E.coli (kmen r“, m⁺), které byly selektovány na rezistenci na ampicilin. Plazmid pKFN-1780 z jedné z výsledných kolonií se selektoval pro další použití.

Plazmid pKFN-1780 se štěpil EcoRI a Xbal. Výsledný fragment o délce 901 bp se ligoval do 9,5 kb Ncol-Xbal fragmentu zpMT636 a 1,4 kb fragmentu zpMT636. Plazmid pMT636 je popsán v Mezinárodní patentové přihlášce WO 89/01 968.

pMT636 je pendlující vektor pro E.coli a S.cerevisiae obsahující TPI gen ze Schizosaccharomyces pombe (POT) (Russel, P. R. Gene 40 (1985) 125-130), promotor triosefosfát izomerázy ze S.cerevisiae a terminátor TPI_p a TPI_T (Alber, T., Kawasaki, G. J. Mol. Appl. Gen 1 (1982) 419-434).

Ligační směs se použila pro transformaci kompetentních buněk E.coli (kmen r, m⁺), které byly selektovány na rezistenci na ampicilin. DNA sekvencování ukázalo, že výsledné kolonie

-8CZ 289439 B6 obsahovaly správnou DNA sekvenci pro lidský HBP správně fúzovanou do syntetického kvasinkového genu pro signální vedoucí sekvenci.

Jeden z plazmidů pKNF-1783 byl selektován pro další použití.

Expresní kazeta plazmidů pKNF-1783 obsahuje následující sekvenci:

TPIp - signální vedoucí sekvence - HBP -TPI_T

DNA sekvence fragmentu EcoRI-Xbal o délce 901 bp z plazmidů pKFN-1783 je zobrazena na obr. 1

Kvasinková transformace: S.cerevisiae kmen MT663 (E2-7B XE11-36 a/a, Dtpi/Dtpi, pep 43/pep 4-3) byl pěstován na YPGal (1% bakteriální a kvasničný extrakt, 2% bakteriální pepton, 2% galaktóza, 1% laktát) do O.D.₆oo 0,6.

100 ml kultury se po zcentrifugování promylo 10 ml vody, znovu zcentrifugovalo a resuspendovalo v 10 ml roztoku obsahujícím 1,2 M sorbitol, 25 mM Na₂EDTA pH= 8,0 a 6,7 mg/ml dithiotreitol. Suspenze se inkubovala ve 30 °C po dobu 15 minut, zcentrifugovala a buňky se resuspendovaly v 10 ml roztoku obsahujícím 1,2 M sorbitol, lOmM Na₂EDTA, 0,1 M citrát sodný, pH = 5,8 a 2 mg Novozym 234. Suspenze se inkubovala ve 30 °C po dobu 30 minut, buňky se zcentrifugovaiy, promyly v 10 ml 1,2 M sorbitolu a 10 ml CAS (1,2 M sorbitol, 10 mM CaCl₂, 10 mM Tris HC1 (Tris = Tris(hydroxymethyl)aminomethan) pH = 7,5) a resuspendovaly ve 2 ml CAS. Pro transformaci se 0,1 ml CAS-resuspendovaných buněk smíchalo s přibližně 1 ml plazmidů pKFN-1783 a inkubovalo při teplotě místnosti po dobu 15 minut. Přidal se 1 ml směsi obsahující 20% polyethylenglykol 4000, 20 mM CaCl₂, 10 mM Tris HC1 pH 7,5) a směs se inkubovala dalších 30 minut při teplotě místnosti. Po zcentrifugování se peleta resuspendovala v 0,1 ml SOS (1,2 M sorbitol, 33 % obj. YPD, 6,7 mM CaCl₂, 14 mg/ml leucin) a inkubovala ve 30 °C po dobu dvou hodin. Po zcentrifugování se peleta resuspendovala v 0,5 ml 1,2 M sorbitolu. Poté se přidalo 6 ml svrchního agaru (SC médium, Sherman a spol., (Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)) obsahujícího 1,2 M sorbitol o teplotě 52 °C a suspenze se nalila na misky obsahující totéž agarové médium, obsahující sorbitol.

Transformované kolonie byly izolovány po 3 dnech růstu ve 30 °C, reizolovány a použity k přípravě startovací tekuté kultury. Jedna z těchto transformant KFN-1775 byla selektována pro další charakterizaci.

Fermentace: Kvasinkový kmen KFN-1775 se pěstoval na YPD médiu (1% kvasničný extrakt, 2% pepton, (Difco Laboratories), 3% glukóza). 1 litr kultury se inkuboval za stálého třepání ve 30 °C do optické denzity O.D.₆₅o = 24. Po centrifugaci se izoloval supematant.

HBP se purifíkoval ze supematantu podle WO 89/08 666. Aminokyselinová sekvenční analýza aminokyselinových zbytků 1 až 20 ukázala identitu s N-koncovou sekvencí SEQ ID.No:l.

Příklad 2

Pro zajištění exprese HBP (jako proformy) v hmyzích buňkách za použití baculovirového systému byly vytvořeny následující PCR primery:

MHJ 2087: 5 - AAA AAG GAT CCA CCA TGA CCC GGC TGA CCC GGC TGA CAG TCC TGG CCC TGC TGG CTG GTC TGC TGG CGT CCT CGA GGG CCG GCT CCA GCC CCC TTT TGG ACA TCG TTG GCG GCC GGA AGG C - 3

-9CZ 289439 B6

MHJ 2089: 5 - AAA AAA GCT TCC TAG GCT GGC CCC GGT CCC GGA TTG TTT AAA ACGCCATC-3

MHJ 2087 kóduje BamHI místo, iniciační kodón a prepro-část lidské cDNA (Morgan, J. G. aspol. (1991), J-Immun., 147 (3210-3214) následovaný prvními 20 nukleotidy zpočátku maturované části genu neseného na plazmidu pKFN1780.

MHJ 2089 je komplementární k posledním 8 kodónům z kódující části HBP genu neseného plazmidem pKFN1780 a obsahuje dále dva kodóny podle cDNA sekvence citované výše. Je zakončen HindlII místem.

PCR se prováděla za použití těchto dvou primerů a plazmidu pKFN1780 jako templátu podle následujícího schématu:

cykly 95 °C 60 s, 50 °C 120 s, 72 °C 120 s, cyklů 95 °C 30 s, 65 °C 60 s, 72 °C 90 s.

PCR produkt, fragment o délce 760 bp, se izoloval elektroforeticky v 1% agarózovém gelu, štěpil BamHI a HindlII a vložil se do pSX221, který byl naštěpen stejnými enzymy. (pSX221 je odvozen od pUC19 (Yannish-Perron, C. a spol. (1985) Gene 33, 103-119). Klonovaná DNA se ověřovala sekvencováním a BamHI-HindlII fragment (viz obr. 2) se po vyštěpení a izolaci vložil do pBlueBacIII (Invitrogen Corporation), který zajistí expresi v hmyzích buňkách. Výsledný plazmid byl nazván pSX556.

Aby se vytvořil rekombinantní baculovirus exprimující HBP, použil se MAXBAC kit od Invitrogen Corp. (San Diego, CA) a všechny následné manipulace se prováděly podle Baculovirus Expression Systém Manual (verse 1.5.5), Zkráceně, lmg linearizované AcMNPV DNA a 3mg pSX556 se kontransfektovaly do SF9 hmyzích buněk (2x10⁶ buněk v 60 mm miskách). Po 7 dnech byl shromážděn supematant výsledné kultury. Čerstvé buňky SF9 rostoucí v jedné vrstvě na 100 mm miskách se infikovaly virovým supematantem v různém ředěné a překryly 1,5% agarózou obsahující kompletní TNM-FH médium s 150 mg/ml X-Gal. Po 8 dnech se identifikovalo 6 předpokládaných rekombinantních plaků podle jejich modrého zbarvení a ty se použily na infekci šestijamkové misky obsahující SF9 buňky. Po 5 dnech se odpovídající virová DNA purifikovala a použila pro PCR reakci s přímým a reverzním primerem, které hraničily s místem rekombinace virové DNA. Po vyhodnocení PCR produktu na agarózovém gelu se odpovídajíc nejčistší rekombinantní virus vystavil dalšímu kolu plakové purifikace, aby bylo možné zajistit, že konečný roztok rekombinantních virů neobsahuje žádné viry divokého typu. Produkce rekombinantního HBP se prováděla v hmyzích buňkách (SF9 aSF21), které mohly růst na médiu SF900-II neobsahujícím sérum (Gibco BRL/LifeTechnologies). Obvykle třepaná kultura (5 1) nebo fermentor o objemu 10 1, v obou typech buňky o hustotě lxl0⁶/ml, se infikovaly sMOI = 1 a médium se shromažďovalo 3 dny po infekci. Purifikace HBP se prováděla podle WO 89/08 666.

Příklad 3

HBP bez prosekvence:

Oligonukleotidový linker (viz níže) se připravil pokrytím prvních 99 bp sekvence na obr. 2 (od BamHI do Eagl) s vyloučením úseku obsahujícího prosekvenci (od 73 do 87, italika) a tato část se nahradila původním BamHi-Eagl úsekem v pSX556 za vzniku pSX559. Očekává se, že konstrukce bude produkovat maturovaný HBP, pokud bude exprimována v baculovirovém systému.

-10CZ 289439 B6

Linker se skládá ze 4 oligonukleotidů párově spojených za vzniku následujících duplexů:

MHJ2568/LWN5746:

- GATCCACCA TGACCCGGCTGACAGTCCTGGCCC - 3

- GTGGTACTGGGCCGACTGTCAGGACCGGGACGACC - p-5

LWN5745/MHJ2566:

- P - TGCTGGCTGGTCTGCTGGCGTCCTCGAGGGCCATCGTTGGC -3

- GACCAGACGACCGCAGGAGCTCCCGGTAGCAACCGCCGG- 5

Příklad 4

Exprese HBP derivátu se štěpícím místem pro hovězí enterokinázu, umístěným mezi propeptid a maturovaný HBP

Hmyzí buňky infikované baculovirovým vektorem kódujícím HBP (signální sekvence propeptid - maturovaný HBP) nejsou schopné odštěpit propeptid. Hmyzí buňky infikované virem kódujícím HBP bez propeptidové sekvence (signální sekvence je fúzovaná přímo s maturovaným HBP) produkující maturovanou formu, ale ve velmi malém množství. Aby se zajistila zvýšená hladina exprese HBP, byl vytvořen baculovirový vektor kódující HBP derivát, který obsahuje štěpící místo pro hovězí enterokinázu (Asp₄-Lys), přičemž toto místo je vloženo mezi propeptid a maturovaný HBP. Tím se umožnilo získat maturovaný HBP in vitro způsobem, který produkuje prodlouženou formu HBP.

cDNA fragment kódující úsek signální sekvence-Gly-Ser-Ser-Pro-Leu-Leu-Asp-Asp₃-Lysmaturovaný HBP byl vytvořen pomocí PCR s Pfu polymerázou a primery PBRa 241 (CCGGGGATCCGATGACCCGGCTGACAGTCCTGGCCCTGCTGGCTGGTCTGCTGGCGT CCTCGA

GGGCCGGCTCCAGCCCCCTTTTGGACGACGACGACAAGATCGTTGGCGGC a

PBRa 246 (CCGGGGATCCAACTAGGCTGGCCCCGGTCCCGG). PCR produkt se štěpil BamHI a klonoval do pVL1393 transfekčního vektoru (Invitrogen, San Diego, CA). Příprava rekombinantního baculoviru a produkce proteinu se prováděla tak, jak je uvedeno v příkladu 2 (v tomto případě se však předpokládané rekombinantní plaky identifikovaly na základě jejich negativního fenotypu pro vznik okluzí.).

Aby se zajistila produkce N-koncově prodloužené formy HBP, zcentrifúgovaly se 4x10⁸ SF9 buněk rostoucích v SF900II médiu bez přídavku séra (Gibco) a typu buňky se resuspendovaly ve vzorku virového roztoku tak, aby výsledná MOI (multiplicita infekce) byla 1. Buňky s virem se přenesly do Bellco Spinner lahví (# 1965-00500) a přidalo se čerstvé SF900II médium do konečného objemu 400 ml. Na závěr se přidalo 1,5 g sepharózy s navázaným heparinem, která byla předem autoklávována v 25 ml sterilního 0,9% NaCl. Kultura se inkubovala ve 27 °C po dobu 3 dnů.

Pro izolaci heparin-sepharózy od hmyzích buněk se 400 ml fermentačního média rozdělilo do 850ml zkumavek a centrifugovalo 3 min při otáčkách 300 rpm (Sorvall Instruments TECHNOSPIN R centrifúge). Supematant obsahující buňky se odsál a peleta (heparinsepharóza) se resuspendovala v 30 ml sterilního NaCl (pro oddělení zbývajících buněk, které mohly kontaminovat prvotní peletu a opět zcentrifúgovat při 300 rpm. Celý postup se opakoval dvakrát. Peleta se nakonec promyla 20 ml sterilního 5M NaCl, byla shromážděna v jedné zkumavce v malém objemu 5 M sterilního NaCl (20 až 30 ml) a přenesena do sterilní skleněné

-11CZ 289439 B6 fíltrovací nálevky. Po vyschnutí se rHBP eluoval s 30 ml sterilního 3 M NaCl. HBP se purifíkoval z 3 M NaCl eluátu podle metody popsané ve WO 89/08 666.

200 mg purifikovaného HBP obsahujícího prosekvenci a enterokinázové štěpící místo mezi prosekvencí a maturovaným proteinem se rozpustilo v 50 mM Na-acetátovém pufru obsahujícím 25 mM CaCl₂, pH 5,1. 400 jednotek enterokinázy (Biozyme Laboratories Limited GB Batch 18x2 Code EK3) se přidalo v objemu 1,2 ml a směs se inkubovala po dobu 1 hodiny při teplotě 37 °C. HBP se purifíkoval zinkubační směsi pomocí RL HPLC podle metody popsané v WO 89/08 666. Vzorek purifikovaného HBP (1 nmol) byl podroben N-koncovému sekvencování, které ukázalo, že hlavní sekvence reprezentuje správný maturovaný HBP, jehož sekvence začínala Ile, což naznačuje, že štěpení bylo úspěšné.

Příklad 5

Exprese HBP derivátů s štěpícími místy pro Faktor X, umístěnými mezi propeptid a maturovaný HBP

Alternativní strategií pro získání maturovaného HBP bylo použití faktoru X pro in vitro štěpení produkovaného materiálu. Rozpoznávacího a štěpící místo pro X faktor je lle-Glu-Gly-Arg. Podle TJ. Gardella a spol. (J. Biol. Chem. 26, 15854-15859, 1990) bylo popsáno, že umístění tří malých aminokyselin (Gly-Gly-Ser) N-koncově na rozpoznávací místo faktoru X pravděpodobně minimalizovalo možné negativní sterilní efekty, a tím umožňovalo zvýšení účinnosti štěpení faktorem X. Aby bylo možné získat cDNA fragmenty kódující úseky: signální sekvencepropeptid-Ile-Glu-Gly-Arg-maturovaný HBP a signální sekvence- propeptid-Gly-Gly-SerIle-Glu-Gly-Arg-maturovaný HBP, syntetizovaly se následující dva primery:

PBRa 249 (CCGGGGATCCGATGACCCGGCTGACAGTCCTGGCCCTGCTGGCTGGTCTGCTGGCGT CCTCGA

GGGCCGGCTCCAGCCCCCTTTTGGACATCGAGGGTAGGATCGTTGGCGGC)

PBRa 250 (CCGGGGATCCGATGACCCGGCTGACAGTCCTGGCCCTGCTGGCTGGTCTGCTGGCGT CCTCGA

GGGCCGGCTCCAGCCCCCCTTTTGGACGGTGGTTCCATCGAGGGTAGGATCGTTGGC GGC). Společně s primerem PBRa 246 (viz příklad 4) se tyto primery použily pro PCR reakce sPfu polymerázou. Dva fragmenty se štěpily BamHI a vložily do pVL1393. Příprava rekombinantního baculoviru a produkce proteinů se prováděla podle postupu popsaného v příkladu 4.

Příklad 6

Periferní krevní jednojademé buňky (peripheral blood mononuclear cells BMNC) se připravovalo ze zdravých dospělých krevních dárců (Blood Bank, Rigshospitalet) centrifugací v citrátovém antikoagulačním pufru na Lymphoprepech (Nycomed, Oslo, Norsko). V některých případech se BMNC preinkubovaly s PTX po dobu 1 hodiny před přidáním lipopolysacharidu (LPS) (E. coli 055:B5, Difco Laboratories, Detroit, MI) ve finální koncentraci 1 mg/ml, nebo s PHA (Difco) ve finální koncentraci 20 mg/ml, nebo s purifikovaným proteinovým derivátem tuberkulinu (PPD) (Statě Sérum Institute, Copenhagen, Dánsko) ve finální koncentraci 25 mg/ml. Inkubace se prováděla ve RPMI-1640 (BLR-Gibco, Roskilde, Dánsko) obsahující 3% normální lidské sérum (NHS), inaktivované teplem v 56 °C po dobu 30 minut a doplněné 0,8 mM glutaminem a penicilinem/streptomycinem (BRL-Gibco, Dánsko) 20 IE/ml. Po inkubaci se suspenze

-12CZ 289439 B6 zcentrifugovala a supematant se okamžitě zmrazil v -20 °C, buněčná peleta se rychle zmrazila v tekutém dusíku a uchovávala v 80 °C nejdéle 1 týden před vlastní extrakcí RNA.

Obsah IL-la, IL—lb, IL-2, IL-6, IFNt, TNFa a TNFb se měřil pomocí metody ELISA za použití monospecifíckých polyklonálních králičích protilátek proti purifikovaným rekombinantním cytokinům (M.B. Hansen a spol., Immunol. Lett. 30, 1991, 156). Na Immuno-maxisorp misky (Nunc, Roskilde, Dánsko) se navázal proteinem-A afinitně čištěný IgG. Nenavázaná místa se blokovala 5% lidským sérumalbuminem ve fosfátovém pufru (PBS). Vzorky se rozpustily v PBS doplněným o 2% normální králičí sérum (Dako, Glostrup, Dánsko), 10 mM EDTA, aprotinim 2000 KIE/ml a 5mM DL-dithiotreitol. Měření se kalibrovala podle mezinárodních standardů pro jednotlivé cytokiny (National Institute for Biological Standards and Controls, Potter Bar, Hertfordshike, UK). Biotinylované polyklonální protilátky se použily jako detekční protilátky spolu se straptavidin-peroxidázou (Kirkegaard a Perry La., Gaithersburg, MD). Vyvíjení reakce se provádělo s 1,2-phenylendiamin, dihydrochloridem a měřilo při 492 nm. Koeficient variability pro koncentrace v rozmezí 8pg/ml až 1 ng/ml byl menší než 15%. Práh citlivosti pro takto prováděn ELISA metody byl 8 až 10 pg/ml.

BMNC se rozmrazily a ošetřily s lidským sérum albuminem v množství lOmg/ml a 100 mg/ml, stejně jako BHP v množství 0,2 mg/ml, 2 mg/ml a 20 mg/ml v přítomnosti 10 a 100 ng/ml LPS. Výsledky jsou zobrazeny na obrázcích 3 a 4. Podle dosažených výsledků je zřejmé, že uvolňování cytokinů z BMNC je signifikantně redukováno v přítomnosti HBP.

Průmyslová využitelnost

Farmaceutický prostředek podle předloženého vynálezu je určený pro prevenci nebo léčbu chorob a stavů spojených s indukcí cytokinové kaskády lipopolysacharidem, jako jsou gramnegativní sepse, septický šok a roztroušená intravaskulámí koagulace.

Seznam sekvencí

1) Obecné informace:

i) přihlašovatel:

(A) NAME: Novo Nordisk A/S (B) STREET: Novo Alle (C) CITY: Bagsvaerd (E) COUNTRY: Denmark (F) POSTÁL CODE (ZIP): 2880 (G) TELEPHONE: +45 4444 8888 (H) TELEFAX: +45 4449 3256 (I) TELEX: 37304 ii) název vynálezu: Heparin-vazebný protein pro léčbu sepsí iii) počet sekvencí: 2 iv) COMPUTE READABLE FORM:

(A) MEDIUM TYPE: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible (C) OPERATING SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (EPO)

-13CZ 289439 B6

2) Sekvence SEQ ID No:l:

i) sekvenční charakteristik} (A) délka: 221 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) řetězec: jednořetězcová (D) topologie: lineární ii) molekulový typ: protein vi) původní zdroj:

(A) organismus: člověk xi) popis sekvence: SEQ ID No: 1:

Ile Val Gly Gly Arg Lys Ala Arg Pro Arg Gin Fhe Pro Fhe Leu Ala 15 1015

Ser Ile Gin Asn Gin Gly Arg His Fhe Cys Gly Gly Ala Leu Ile His 20 2530

Ala Arg Fhe Val Met Ihr Ala Ala Ser Cys Phe Gin Ser Gin Asn Pro 35 4045

Gly Val Ser lhr Val Val Leu Gly Ala Tyr Asp Leu Arg Arg Arg Glu 50 5560

Arg Gin Ser Arg Gin Ihr Fhe Ser Ile Ser Ser Met Ser Glu Asn Gly

70 7580

Tyr Asp Pro Gin Gin Asn Leu Asn Asp Leu Met Leu Leu Gin Leu Asp

9095

Arg Glu Ala Asx Leu Thr Ser Asx Val Thr Ile Leu Pro Ieu Pro Leu 100 105110

Gin Asx Ala Thr Val Glu Ala Gly Thr Arg Cys Gin Val Ala Gly Trp 115 120125

Gly Ser Gin Arg Ser Gly Gly Arg Leu Ser Arg Fhe Pro Arg Fhe Val 130 135140

Asx Val Thr Val Ihr Pro Glu Asp Gin cys Arg Pro Asn Asn Val Cys

145 150 155160

Ihr Gly Val Leu Ihr Arg Arg Gly Gly Ile Cys Asn Gly Asp Gly Gly

165 170175

Thr Ptq Leu Val Cys Glu Gly Leu Ala His Gly Val Ala Ser Fhe Ser 180 185190

-14CZ 289439 B6

Leu Gly Pro Cys Gly Arg Gly Pro Asp Rie Fhe Thr Arg Val Ala Leu 195 200 205

Phe Arg Asp Trp Ile Asp Gly Val Leu Asn Asn Pro Gly 210 215 220

2) Sekvence SEQ ID No:2:

i) sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 218 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) řetězec: jednořetězcová (D) topologie: lineární ii) molekulový typ: protein vi) původní zdroj:

(A) organismus: prase xi) popis sekvence: SEQ ID No:2:

Ile Val Gly Gly Arg Arg Ala Gin Pro Gin Glu Fhe Pro Phe Leu Ala 15 1015

Ser Ile Gin Lys Gin Gly Arg Pro Phe Cys Ala Gly Ala Leu Val His 20 2530

Pro Arg Phe Val Leu Ihr Ala Ala Ser Cys Phe Arg Gly lys Asn Ser 35 4045

Gly Ser Ala Ser Val Val Leu Gly Ala Tyr Asp Leu Arg Gin Gin Glu 50 5560

Gin Ser Arg Gin Ihr Phe Ser Ile Arg Ser Ile Ser Gin Asn Gly Tyr

70 7580

Asp Pro Arg Gin Asn Leu Asn Asp Val Leu Leu Leu Gin Leu Asp Arg

9095

Glu Ala Arg Leu Ihr Pro Ser Val Ala Leu Val Pro Leu Pro Pro Gin 100 105110

Asx Ala Ttir Val Glu Ala Gly Ihr Asn cys Gin Val Ala Gly Trp Gly 115 120125

Ihr Gin Arg Leu Arg Arg Leu Phe Ser Arg Phe Pro Arg Val Leu Asx 130 135140

Val Ihr Val Ihr Ser Asn Pro cys Leu Pro Arg Asp Met Cys Ile Gly

145 150 155160

Val Phe Ser Arg Arg Gly Arg Ile Ser Gin Gly Asp Arg Gly Ihr Pro

165 170175

-15CZ 289439 B6

Leu Val Cys Asn Gly Leu Ala Gin Gly Val Ala Ser Fhe Leu Arg Arg 180 185190

Arg Ihe Arg Arg Ser Ser Gly Fhe Fhe Thr Arg Val Ala Leu Hte Arg 195 200205

Asn Trp lle Asp Ser Val Leu Asn Asn Pro Pro

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití heparin-vazebného proteinu, kterému chybí i) proteázová aktivita, ii) je přítomný v periferních neutrofilních leukocytech a je chemotaktický pro monocyty, pro přípravu prostředku pro prevenci nebo léčbu nemocí nebo stavů spojených s indukcí cytokinové kaskády pomocí lipopolysacharidu.

2. Použití heparin-vazebného proteinu podle nároku 1, kde prostředek je užitečný pro prevenci nebo léčbu sepsí, gram-negativních sepsí, septického šoku nebo roztroušené intravaskulámí koagulace.

3. Použití heparin-vazebného proteinu podle nároku 1 nebo 2, kde prostředek je ve formě vhodné pro místní aplikaci v místech zánětu nebo infekce.

4. Použití heparin-vazebného proteinu podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde prostředek je užitečný pro místní aplikaci v místech zánětu nebo infekce.

5. Použití heparin-vazebného proteinu podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde heparinvazebný protein je lidský heparin-vazebný protein.

6. Použití heparin-vazebného proteinu podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, kde heparin-vazebný protein má aminokyselinovou sekvenci uvedenou v seznamu sekvencí jako SEQ ID No:l, nebo je jeho analog či peptidový fragment schopný vazby lipidu A jako části lipopolysacharidu.

7. Použití heparin-vazebného proteinu podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, kde peptidový fragment schopný vazby lipidu A jako části lipopolysacharidu je peptidový fragment obsahující nejméně aminokyselinové zbytky 20 až 53, zvláště aminokyselinové zbytky 26 až 42 podle SEQ ID No: 1.

8. Použití heparin-vazebného proteinu podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, kde heparin-vazebný protein je prasečí heparin-vazebný protein.

9. Použití heparin-vazebného proteinu podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, kde heparin-vazebný protein má aminokyselinovou sekvenci uvedenou v seznamu sekvencí jako SEQ ID No:2 nebo je jeho analog či peptidový fragment schopný vazby lipidu A jako části lipopolysacharidu.

10. Použití heparin-vazebného proteinu podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, kde peptidový fragment schopný vazby lipidu A jako části lipopolysacharidu je peptidový fragment obsahující aminokyselinové zbytky 20 až 53 podle SEQ ID No:2.

-16CZ 289439 B6

11. Použití heparin-vazebného proteinu podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, kde prostředek obsahuje heparin-vazebný protein v množství od 10 mg do 1 g na jednotku dávky.

5 12. Farmaceutický prostředek obsahující heparin-vazebný protein pro prevenci nebo léčení sepse, septického šoku, gram-negativních sepsí nebo roztroušené intravaskulámí koagulace, vyznačující se tím, že jako aktivní složku obsahuje heparin-vazebný protein s vlastnostmi popsanými v nároku 1.