JPH09507501A

JPH09507501A - 殺菌性／透過性が向上したタンパク質の機能領域に由来する生物学的に活性なペプチドおよびその使用

Info

Publication number: JPH09507501A
Application number: JP7519010A
Authority: JP
Inventors: ロジャー，ジー．ザセカンドリトル，
Original assignee: ゾーマコーポレイション
Priority date: 1994-01-14
Filing date: 1994-09-15
Publication date: 1997-07-29
Also published as: US5733872A; US6495516B1; AU681453B2; CN1141637A; CA2181150A1; US7045500B2; US20040024179A1; US5763567A; US6228834B1; CN1071759C; CA2181150C; WO1995019372A1; AU7956094A

Abstract

(57)【要約】本発明は、ヘパリン結合性、ヘパリン中和、LPS 結合性、LPS 中和あるいは殺菌活性などのBPI の生物学的活性の少なくとも一つを備えた、ヒトの殺菌性／透過性が増大したタンパク質(BPI)機能領域のアミノ酸配列、そのサブ配列、およびそのアミノ酸配列あるいはサブ配列の変異配列であるところのアミノ酸配列からなるぺプチドを提供する。本発明は、様々な治療用途のためのペプチドならびにそのペプチドからなる薬剤組成物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】『殺菌性／透過性が向上したタンパク質の機能領域に由来する生物学的に活性なペプチドおよびその使用』本願出願は、1993年３月12日に出願された米国特許出願 No. 08/030,644 の一部継続出願である、1993年７月15日に出願された米国特許出願 No．08/093,202 の一部継続出願である、1994年１月14日に出願された米国特許出願 No．08/183, 222 の一部継続出願である、1994年３月11日に出願された米国特許出願 No．08/ 209,762 の一部継続出願である。発明の背景本発明は、殺菌性／透過性が向上したタンパク質由来あるいは当該タンパク質に基づいたペプチドならびにかようなペプチドの治療的用途に関する。殺菌性／透過性が向上したタンパク質(BPI)は、微生物の侵入から哺乳類を保護する上で必須の血液細胞である、哺乳類多形核好中球(PMNs)の顆粒から単離したタンパク質である。ヒトBPI は、イオン交換クロマトグラフィー(Elsbach，19 79，J．Biol．Chem，254：11000)あるいはE．coli親和性クロマトグラフィー(We iss et al.，1987，Blood，69: 652)のいずれかと酸抽出を組み合わせてPMNsから単離され、多様なグラム陰性細菌に対して強い殺菌性を示す。ヒトBPI の分子量は、約55,000ダルトン(55kD)である。ヒトBPI の完全なアミノ酸配列ならびに BPI をコードするDNA のヌクレオチド配列は、本願にて参考までに採用した、Gr ay et al.，1989，J．Biol．Chem．264，9505によって解明されている（Gray et alの図１を参照のこと）。 BPI の殺菌効果は、感受性のグラム陰性細菌に対して高い特異性が認められる。BPI がグラム陰性細菌を殺傷する正確な機構は未だ定かではないが、BPI が感受性のグラム陰性細菌の表面にまず接触することが知られている。細菌へのBPI によるこの最初の結合は、塩基性（すなわち、正に帯電した）タンパク質である BPI とリポ多糖(LPS)の負に帯電した部位との間での静電気作用も関与している。LPS は、炎症性応答を刺激することから、「内毒素」として知られている。LP S は、不可逆的な内毒素ショックをもたらす宿主炎症性細胞による媒介体の遊離を促す。BPI は、LPS の最大の毒性要素であり、また最大の生物学的活性要素であるリピドＡに結合する。 BPI は、BPI に結合するLPS の内毒素要素を中和することもできる。グラム陰性細菌に対する殺菌力ならびにLPS に結合して中和する能力がために、菌血症、内毒素血症および敗血症を含めた、グラム陰性細菌による疾患にかかった哺乳類の治療にBPI を利用することができる。BPI に関するこれら二面的特徴は、BPI の治療用途への応用を、特に有益かつ有利にする。ヒトBPI のアミノ末端部分に対応するタンパク質分解断片は、LPS 結合活性ならびに中和活性、および自然に得られた55kDのヒトのホロタンパク質の抗菌活性を有している。アミノ末端部分と対照的に、単離したヒトBPI のカルボキシ末端部分は、かすかに検出可能な抗菌活性を示すに過ぎない(Ooi et al.，1991、J． Exp．Med．174: 649)。ヒトBPI ホロタンパク質の最初の約 199子のアミノ酸残基を含む、「rBPI₂₃」と称する、あるBPI アミノ末端断片（Gazzano-Santoro et al.，1992，Infect．Immun．60: 4754-4761を参照のこと）は、組換え手法によって、23kDのタンパク質として生成される。rBPI₂₃は、ヒトに対する臨床応用の段階にある。内毒素に対する前炎症応答は、rBPI₂₃とLP S を同時に投与した場合に、顕著に改善された。内毒素に結合および中和する他のペプチドも、当該技術分野では知られている。一例として、カブトガニ変形細胞に由来するLimulus 抗リポ多糖因子(LALF)がある（Waren et aL.，1992，Infect．Immunol．60: 2506-2513）。他の例として、ポリミキシンB₁と命名された、Bacillus Polymyxa に由来する環状のカチオン性リポペプチドがある。ポリミキシンB₁は、六つのα、γ−ジアミノ酪酸残基、一つのD-フェニルアラニン、一つのロイシン、一つのスレオニン、および6-メチルオクタノイル部分から構成されており(Morrison and Jacobs，1976，Immunoch em．13: 813-818)、殺菌性も備えている。LPS への結合力は保持しているものの、明確な殺菌活性を有していない、脂肪酸部分が欠如したポリミキシン類似体も知られている(Danner et al.，1989，Antimicrob．Agents Chemother．33: 1428 -1434)。同様の特性が、合成した環状ポリミキシン類似体にも認められている(R ustici et al.，1993，Science．259: 361-365)。公知の抗菌性ペプチドとして、セクロピンとマガイニィンがある。セクロピンは、鱗翅目の昆虫の血リンパにて認められる抗菌性ペプチドの科であり(Wade et al.，1990，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87: 4761-4765)、マガイニィンは、X enopus科の皮膚および胃粘膜にて認められる抗菌性ペプチドの科である(Zasloff et al.，1988，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85: 910-913)。これらペプチドは線状であり、約20から約40個のアミノ酸の長さを有している。ブタの腸粘膜に由来する、やや活性の小さな哺乳類セクロピン、セクロピンP1が報告されている(Boman et al.，1993，Infect．Immun．61: 2978-2984)。殺菌性に関して、セクロピンは、一般にマガイニィンより勝っているが、哺乳類細胞の細胞毒性については劣る旨が報告されている。セクロピンとマガイニィンは、殺菌性のためには必須の連続した両親媒性のα−フェリックス領域によって特徴付けられる。今日までに同定された最も強力なセクロピンは、セクロピンＡである。セクロピンＡの最初の10個のアミノ酸の配列は、BPI アミノ酸配列90−99とある程度の相同性がある。しかしながら、セクロピンＡの他の27個のアミノ酸は、その殺菌性のためには必須のものであり、これら27個のアミノ酸に関して BPIとはほとんど相同性が認められない。マガイニィンは、BPI 配列とはほとんど相同性が認められない。本願と関連性があると思われるものに、(1)殺菌性と(2)内毒素中和活性を示さないとされる、BPI とアニオン性化合物を含む組成物に関する、PCT 国際出願 N o．PCT/US91/05758 による開示がある。アニオン性化合物として、好ましくは、血清アルブミンのようなタンパク質であるが、ヘパリンのような多糖類も使用できる。加えて、Weiss et al．(1975，J．Clin．Invest．55: 33-42)は、ヘパリン硫酸とLPS が、BPI の浸透性増大活性の発現をブロックすることを開示している。しかしながら、いずれの先行技術も、BPI がヘパリンの生物学的活性を中和することは開示していない。ヘパリン中和においてヘパリンによる結合は必ずしも必要ではない。例えば、ヘパリン結合増大因子(HBFG)の科は、生物学的応答を引き出すための共因子としてヘパリンを必要とする。HBFGの例として、繊維芽細胞成長因子(FGF-1，FGF-2)と、内川細胞成長因子(ECGF-1，ECGF-2)がある。カスケードプロテアーゼの凝固を阻害する抗トロンビンIII は、活性のためにヘパリンを必要とし、明らかにヘパリンを中和しない、ヘパリン結合タンパク質の他の例である。ヘパリンを正に中和するヘパリン結合タンパク質（例えば、血小板因子IV、プロタミン、およびトロンボスポンディン）は、一般的に、ヘパリンを共因子として用いるヘパリン結合タンパク質によって誘発した活性を阻害する。 BPI （そのアミノ末端を含む）、多くの他の重要な生物学的活性を有する。例えば、本明細書に参考までに採用した、係属中で共同所有に係る、1993年３月12 日に出願された米国特許出願 No．08/030,644 および1993年７月15日に出願された一部継続の米国特許出願 No．08/093,202 にあるように、BPI はヘパリン結合活性とヘパリン中和活性を有している。これら、BPI によるヘパリン結合活性とヘパリン中和活性は、ヘパリンの現在の臨床上の重要性からして非常に意味がある。ヘパリンは、心肺バイパス、心臓カテーテル法、および血液透析などの外科的処置を行う間の血液凝固を防ぐために、通常、400単位/Kgまでの用量が投与される。手術中に抗凝固薬としてヘパリンを投与した場合、通常の凝固作用を回復せしめるために、ヘパリンの効果を迅速に解消することは、術後処置において重要である。現在のところ、ヘパリンを中和するために、プロタミンが使用されている。プロタミンは、薬剤に分類された、富アルギニン、強塩基性および低分子量のタンパク質である。単独投与することで、プロタミン（通常はプロタミン硫酸の形態）は、抗凝固効果を呈する。ヘパリンの存在下でこれを投与すれば、安定な複合体が形成され、双方の薬剤の抗凝固活性は消失する。しかしながら、プロタミンの顕著な降圧ならびにアナフィラキシー効果は、臨床用途では限界がある。よって、そのヘパリン結合活性ならびにヘパリン中和活性が故に、プロタミンの有用性を制限する臨床上の有害な副作用を呈さずに、ヘパリン中和のためのプロタミンの代用物としてBPI は有用である。BPI の抗菌効果ならびに抗内毒素効果も、プロタミンと比較した場合、術後のヘパリン中和におけるBPI の有用性と利便性を後押ししている。さらに、BPI は、そのヘパリン結合活性ならびにヘパリン中和活性が部分的に作用して、血管形成を阻害する上で有用である。成人の場合、血管成長因子は、血管の損傷（傷の治癒）、免疫刺激（自己免疫疾患）、炎症媒体（プロストグランジン）の結果、あるいは腫瘍細胞から放出される。これら因子は、ヘパリン依存性レセプター結合の機構を介して、（血管形成において必須の）内皮細胞の増殖を誘発する(Yayon et al.，1991，Cell 64: 841-848を参照のこと)。血管形成は、様々な腫瘍の成長、増殖および転移；糖尿性網膜症、水晶体後繊維増殖症、新血管新生性緑内障、乾癬、血管線維腫；リュウマチ性関節炎、アテローム性動脈硬化症プラークでの毛細血管増殖、血管腫、子宮内膜症、およびカポジ肉腫を含む免疫性ならびに非免疫性炎症を含めた他の多くの病理学的条件とも関連している。このように、これら症例ならびに他の症例での血管形成を阻害することが望ましく、また、その上でBPI のヘパリン結合活性ならびにヘパリン中和活性が有用である。血管形成を阻害するために、いくつかの他のヘパリン中和タンパク質が知られている。例えば、プロタミンは、腫瘍が関連している血管形成とその後の腫瘍の成長を阻害することが知られている〔Folkman et al.，1992，Inflammation: Ba sic Principles and Clinical Correlates，2d ed.，(Galin et al.，eds.，Rev iew Press，N.Y.)，Ch．40，pp．821-839 を参照のこと〕。第二のヘパリン中和タンパク質である血小板IVも、血管形成を阻害する（すなわち、血管の成長を止める）。コラゲナーゼ阻害剤も、血管形成を阻害することが知られている（前出のFolkma n et al.，1992の文献を参照のこと）。他の公知の血管形成阻害剤であるトロンボスポンディンは、元のアミノ酸部分と代えた、セリン／トリプトファンの繰り返し部分でヘパリンに結合する（Guo et al.，1992，J．Biol．Chem．267: 1934 9-19355を参照のこと）。 BPI の他の有用性は、通常、血管形成によって引き起こされる慢性炎症に関連する病理学的条件にも関与する。慢性炎症に関連したヒトの疾患の一例として、末梢関節の炎症を含んだ関節炎がある。リュウマチ性関節炎において、炎症は免疫が関与するが、反応性関節炎では、化膿性細菌あるいは他の感染症因子による滑液組織の感染と炎症は関連している。上掲のFolkman et al.，1992の文献も、関節部の炎症侵潤物によって支配された段階から、新生血管のパンヌスが関節部に侵入して軟骨を破壊し始める段階までの、関節炎の様々な進行の態様を記している。関節炎において血管形成が疾患あるいは付帯徴候の原因要素であるかどうかは不明であるが、リュウマチ性関節炎での滑膜炎の維持において、血管形成が必須であるとの根拠はある。公知の血管形成阻害剤の一つである、AGM1470 は、関節炎の進行を防止し、コラーゲン誘発した関節炎のモデルにて関節炎を阻害することを立証している(Peacock et al.，1992，J．Exp．Med．175: 1135-1138) 。非ステロイド系の抗炎症薬、コルチコステロイド、および他の治療薬が、関節炎の治療効果を改善するために提供されてきたが、当該技術分野では依然として、関節炎ならびに他の炎症性疾患のより効果的治療が要望されているのである。当該技術分野では、殺菌薬ならびに内毒素中和薬として使用でき、また、（正常あるいは病理的な）血管形成でのヘパリン中和およびヘパリン阻害のための、新規の物質と方法が待望されている。この要望を満たすための研究の指針の一つは、これら生物学的活性のそれぞれを特定するBPI タンパク質の機能部位を決定することにある。それ故、好適な治療態様では、BPI の活性の一つ以上を備えた、BPI 機能領域を有するペプチドを含むことになる。発明の概要本願発明は、ヘパリンへの結合、ヘパリンの中和、LPS への結合、LPS の中和、あるいは殺菌活性のようなBPI の生物学的活性の少なくとも一つを有する、BP I の機能領域のアミノ酸配列、あるいはそのサブ配列、それらアミノ酸配列あるいはサブ配列の変異配列のであるアミノ酸配列を備えた、小さな容易に生成できるペプチドを提供する。発見され、そして本明細書に記載したBPI の機能領域は、約17位から約45位のアミノ酸に至るBPI のアミノ酸配列を含んだドメインＩ；約65位から約99位のアミノ酸に至るBPI のアミノ酸配列を含んだドメインII；および、約 142位から約 169位のアミノ酸に至るBPI のアミノ酸配列を含んだドメインIIIを含んでいた。このように、BPI 機能領域ペプチドは、ヒトBPI のアミノ末端部分に基づいている。本発明のペプチドには線状および環状ペプチドと、特定のBPI の機能領域アミノ酸配列あるいはそのサブ配列、およびそれらアミノ酸配列あるいはサブ配列の変異配列であるアミノ酸配列が、直鎖状、環状および分枝状の配列の組み合わせからなるペプチドを含む。このような組み合わせによるペプチドは、共有結合したBPI の同一あるいは異なる機能領域の配列あるいはサブ配列、およびそれら配列あるいはサブ配列の変異配列を有するペプチドを含む。特定の配列あるいはそのサブ配列、およびそれら配列あるいはサブ配列の変異配列の二つから約10個のペプチドの組み合わせが、特に包含される。本発明は、限定するものではないが、改変した標的細胞種への特異性を有した殺菌活性を有する、公知のBPI の生物学的活性とは異なる生物学的活性を備えたペプチドも提供する。BPI の生物学的活性と比較して、改善あるいは減退したBPI の特定の生物学的活性を備えたペプチドも提供される。本発明のペプチドには線状および環状ペプチドと、特定のBPI の機能領域アミノ酸配列あるいはそのサブ配列の、線状、環状および分枝状アミノ酸での置換、および他の変異配列からなるペプチドが含まれる。置換変異配列のために、各ペプチドの一つ以上のアミノ酸残基は、特異的なペプチドが由来するBPI 機能領域の位置に対応して認められる（不定のアミノ酸残基を含む）異なるアミノ酸残基と交換される。他の変異配列のために、本明細書にて記載したBPI 機能領域のペプチドアミノ末端あるいはカルボキシ末端のいずれか、あるいは双方に共有結合した約10個までのアミノ酸をさらに含む。かようなアミノ酸は、機能領域に隣接するBPI でのアミノ酸と重複し、あるいはBPI のアミノ酸と関連が無く、そして、不定のアミノ酸を含む。アミノ酸置換および変異ペプチドの線状、環状および分枝状ペプチドの組み合わせにて、上述したBPI 機能領域ペプチドのそれぞれの環状ペプチドとして、本発明のペプチドが提供できる。他の変異配列には、アミン、カルボン酸、アルキルおよびフェニル基のようなアミノ酸側鎖の官能基の誘導体ならびに修飾体が含まれる。本発明は、内毒素を中和し、グラム陰性ならびにグラム陽性細菌および真菌を殺菌し、ヘパリンの抗凝固性を中和し、血管形成を阻害し、腫瘍ならびに内皮細胞の増殖を阻害し、そして慢性炎症疾患状態を治療するための、哺乳類の治療において用いられる薬剤組成物を提供する。この薬剤組成物は、錠剤、丸剤、粉体、薬液あるいは懸濁液などの固形、半固形および液体の形態、および注射ならびに浸出可能な溶液の形態で、本発明のBPI ペプチドの単位用量を含む。機能領域Ｉを含む約17位から約45位のアミノ酸に至るヒトBPI のアミノ酸配列；ならびにそのサブ配列であって、限定するものではないが、例えば、殺菌活性、LPS への結合性、LPS の中和、ヘパリンへの結合性あるいはヘパリンの中和などのBPI の活性の一つ以上を備えたペプチドを、本発明は提供する。本発明のこの態様にて、約17から約45のアミノ酸に至るBPI のアミノ酸配列とそのサブ配列を有する機能領域Ｉペプチドと実質的に同じアミノ酸配列を有するペプチドも提供される。さらに、本発明は、同一あるいは異なるドメインＩペプチドもしくは共有結合したサブ配列ペプチドの一つ以上を含むペプチドも提供する。機能領域IIを含む約65位から約99位のアミノ酸に至るヒトBPI のアミノ酸配列；ならびにそのサブ配列であって、限定するものではないが、例えば、殺菌活性、LPS への結合性、LPS の中和、ヘパリンへの結合性あるいはヘパリンの中和などのBPI の活性の一つ以上を備えたペプチドを、本発明は提供する。本発明のこの態様にて、約65から約99のアミノ酸に至るBPI のアミノ酸配列とそのサブ配列を有する機能領域IIペプチドと実質的に同じアミノ酸配列を有するペプチドも提供される。さらに、本発明は、同一あるいは異なるドメインIIペプチドもしくは共有結合したサブ配列ペプチドの一つ以上を含むペプチドも提供する。機能領域IIIを含む約 142位から約 169位のアミノ酸に至るヒトBPI のアミノ酸配列；ならびにそのサブ配列であって、限定するものではないが、例えば、殺菌活性、LPS への結合性、LPS の中和、ヘパリンへの結合性あるいはヘパリンの中和などのBPI の活性の一つ以上を備えたペプチドを、本発明は提供する。本発明のこの態様にて、約 142から約 169のアミノ酸に至るBPI のアミノ酸配列とそのサブ配列を有する機能領域IIIペプチドと実質的に同じアミノ酸配列を有するペプチドも提供される。さらに、本発明は、同一あるいは異なるドメインIIIペプチドもしくは共有結合したサブ配列ペプチドの一つ以上を含むペプチドも提供する。さらに、異なる機能領域あるいはサブ配列およびその変異配列の一つ以上のペプチドが共有結合しているドメインを組み合わせたペプチドが、本発明によって提供される。これらドメインの組み合わせの態様には、線状、環状および分枝状ペプチドの組み合わせがある。本発明のペプチドは、その有用性の一態様として、LPS への結合性、LPS の中和、ヘパリンへの結合性、ヘパリンの中和、およびグラム陰性細菌に対する殺菌活性を含めた、少なくとも一つの公知のBPI の活性を備えている。さらに驚くべきことに、本発明のペプチドの中には、グラム陽性細菌に対する殺菌剤としての有用性を備えたものがある。本発明のペプチドは、グラム陰性細菌によって引き起こされた疾患あるいは病状を伴う哺乳類の治療に有用な、内毒素を中和し、内毒素産生細菌を殺菌するという二つの特性を備えた抗菌物質の新規のクラスを提供する。この二つの活性に加えて、本発明のペプチドは、向上した抗菌スペクトラムを有しており、抗菌薬剤の新規のクラスに属していることを意味する。さらに、本発明のペプチドは、通常の抗生物質には耐性があるが、本発明のペプチドの浸透性が向上した抗菌活性には感受的な微生物株による感染の処置において有用な抗菌薬剤の新たなクラスを提供する。本発明は、ペプチド、あるいは薬学的に許容可能な担体あるいは希釈剤とペプチドからなる組成物を含む、病理学的状態あるいは疾患状態を処置するための方法での使用、あるいは他の適切な治療用途で使用するための、本発明のペプチドを含んだ薬剤組成物も提供する。ヒトを含む哺乳類での病理学的状態あるいは疾患状態を処置するためにこれら薬剤組成物を使用する方法も、本発明によって提供される。さらに、本発明によって、様々な治療用途のための薬剤を製造するために、BPI 機能領域ペプチドの用途も提供される。本発明の好適な態様は、以下の実施例と請求の範囲に関する詳細な説明によって明らかになるであろう。図面の簡単な説明図1aと1bは、臭化シアンとrBPI₂₃のタンパク質分解断片のHPLC吸収スペクトルを示しており；図２は、rBPI₂₃のタンパク質分解断片のLAL 阻害活性の結果を示すグラフであり；図３は、15−マーのBPI ペプチドを用いたヘパリン結合分析の結果を示すグラフであり；図４は、15−マーのBPI ペプチドを用いたLimulus 遊走細胞溶解(LAL)阻害分析の結果を示すグラフであり；図５は、15−マーのBPI ペプチドを用いた放射拡散殺菌性分析の結果を示すグラフであり；図６は、ヘパリン結合性分析でのBPI 機能領域ペプチドの効果を示すグラフであり；図7aと7bは、トロンビンのATIII/ヘパリン阻害に関するBPI 機能領域ペプチドの効果を示すグラフであり；図8aと8bは、LAL 阻害分析でのBPI 機能領域ペプチドの結果を示すグラフであり；図9a、9b、9cおよび9dは、放射拡散殺菌性分析でのBPI 機能領域ペプチドの結果を示すグラフであり；図9eと9fは、E．coli培地分析でのBPI 機能領域ペプチドの結果を示すグラフであり；図10a、10b、10c、10dおよび 10eは、放射拡散殺菌性分析でのBPI 機能領域を結合したペプチドの結果を示すグラフであり；図11a、11b、11c、11d、11e、11f、11g、11h および 11iは、放射拡散殺菌性分析でのBPI 機能領域ペプチドの結果を示すグラフであり；図11j と 11kは、培養培地で成長した細菌細胞に関する殺菌性分析でのBPI 機能領域ペプチドの結果を示すグラフであり；図11l は、ヒトの血清で行った殺菌性分析でのBPI 機能領域ペプチドBPI.30の結果を示すグラフであり；図11m と11n は、グラム陽性細胞を用いた放射拡散殺菌性分析でのBPI 機能領域ペプチドの結果を示すグラフであり；図11oは、S．aureus 細胞を用いた、ゲンタマイシンとバンコマイシンとの比較における、放射拡散殺菌性分析でのBPI 機能領域ペプチドの結果を示すグラフであり；図11p と11q は、培養培地で成長したC．albicans 細胞を用いた細胞毒性分析におけるBPI 機能領域ペプチドの結果を示すグラフであり；図12a、12b、12c、12d、12e、12f および12g は、BPI 機能領域ペプチドを用いたヘパリン中和分析の結果を示すグラフであり；図13は、BPI ドメインIIペプチドBPI.２(BPI配列のアミノ酸配列85−99；配列番号：７)の構造を示す概略図であり；図14は、BPI ドメインIIIペプチドBPI.11(BPI配列のアミノ酸配列 148- 161；配列番号：13)の構造を示す概略図であり；図15a 、15b 、15c 、15d および15e は、BPI 機能領域置換ペプチドを用いたヘパリン結合分析の結果を示すグラフであり；図16は、様々なBPI 機能領域ペプチドを用いたヘパリン結合実験の結果を示すグラフであり；図17a と17b は、合成BPI 機能領域ペプチドと放射標識したrBPI₂₃との間でのリピドＡ結合拮抗活性の結果を示すグラフであり；図18は、血液あるいは燐酸緩衝化生理食塩水での合成BPI.10ペプチドと放射標識したrBPI₂₃との間でのリピドＡ結合拮抗活性の結果を示すグラフであり；図19は、合成BPI ペプチドであるBPI.７、BPI.29およびBPI.30と放射標識した rBPI₂₃との間でのリピドＡ結合拮抗活性の結果を示すグラフであり；図20a と20b は、BPI 機能領域ペプチドと放射標識したrBPI₂₃との間でのリピドＡ結合拮抗活性の結果を示すグラフであり；図21は、HUVEC 細胞に予め結合したBPI 機能領域ペプチドを用いたリピドＡ結合拮抗活性分析の結果を示すグラフであり；図22a 、22b 、22c 、22d 、22e 、22f 、22g および22h は、BPI のLPS 中和活性を測定する細胞性TNF の細胞毒性分析に対して様々なパラメーターが影響することを示すグラフであり；図23a 、23b および23c は、γ−インターフェロンの存在下での一酸化窒素ならびにLPS 刺激したRAW264.7細胞でのLBP の生成依存性、およびrBPI₂₃を用いた一酸化窒素の生成阻害を示すグラフであり；図24a 、24b 、24c 、24d 、24e および24f は、チモサンあるいはLPS で刺激したRAW264.7細胞による一酸化窒素の生成阻害能力が反映されたBPI 機能領域ペプチドによるLPS 中和を示すグラフであり；図24g は、RAW264.7細胞によるチモサンあるいはLPS で刺激した一酸化窒素の生成阻害における合成BPI ペプチドのIC₅₀値を示すグラフであり；図25は、三つの機能領域を示すrBPI₂₃の概要であり；図26a は、rLBPの存在に関して、RAW264.7細胞の増殖のLPS-介在した阻害の依存性を示すグラフであり；図26b と26c は、実施例20D の分析にて用いたBPI 機能領域ペプチドのパターンを示すグラフであり；図27は、実施例20E の分析にて用いた様々なBPI 機能領域ペプチドによる全血でのTNF 阻害の比較を示すグラフであり；および図28は、様々なBPI 機能領域ペプチドを用いた実施例20G に記載のトロンビン凝固時間分析の結果を示すグラフである。図29(a-h)は、実施例27に記載の放射拡散殺菌活性分析におけるBPI 機能領域ペプチドによる結果を示すグラフである。好適な態様の詳細な説明本発明は、BPI の機能領域あるいはそのサブ配列およびその配列あるいはサブ配列の変異配列の少なくとも一つのアミノ酸配列を有するペプチドを提供する。本発明の目的のために、「機能領域」なる語彙は、タンパク質の生物学的活性に寄与するBPI のアミノ酸配列の領域を意図するものである。BPI のこれら機能部位は、15−マーのペプチドと他の合成ペプチドとが重複しているタンパク質開裂断片の活性によって定義される。ドメインＩは、約17位から約45位のアミノ酸を含むBPI のアミノ酸配列であると定義される。このドメインに基づいたペプチドは、LPS 誘発したLAL 活性の阻害ならびにヘパリンへの結合分析の双方にて緩やかな活性があるが、顕著な殺菌活性は認められなかった。ドメインIIは、約65位から約99位のアミノ酸を含むBP I のアミノ酸配列であると定義される。このドメインに基づいたペプチドは、LP S とヘパリンへの強い結合能力が認められ、また殺菌性であった。ドメインIII は、約 142位から約169 位のアミノ酸を含むBPI のアミノ酸配列であると定義される。このドメインに基づいたペプチドは、LPS とヘパリンへの強い結合能力が認められ、また殺菌性であった。本明細書で定義した機能部位は、連続したドメインＩ、IIおよびIII、すなわち、BPI アミノ酸配列の連続部分を有するドメインを含む。しかしながら、本発明は、不連続のBPI のタンパク質、すなわち、BPI 配列が分離されたタンパク質を含むペプチドも意図する。隣接あるいは近接するアミノ酸領域を調製するために、不連続領域のペプチドを共有結合することで本発明のペプチドと同様の構造をとるタンパク質のアミノ酸配列の不連続部分は、本来のタンパク質に折り畳まれることが知られている。 BPI アミノ酸配列の不連続領域を含むペプチドは、本発明によって提供したペプチドの組み合わせの一例である。本発明の目的のために、ペプチドの組み合わせには、同一あるいは異なるBPI の機能領域およびそのサブ配列に由来するアミノ酸配列を有する二つ以上のペプチドを含む線状、環状あるいは分枝状ペプチドが含まれる。２から約10個の機能領域ペプチドあるいはそのサブ配列を含む組み合わせ、好ましくは、二つまたは三つの機能領域ペプチド（例えば、ホモ二量体、ホモ三量体、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体）の組み合わせが、この定義に特に包含されるている。かような組み合わせを含む構成ペプチドのそれぞれは、特定のBPI 機能領域アミノ酸配列あるいはそのサブ配列からのアミノ酸配列を有している。本発明の目的のために、「BPI の生物学的活性」なる語彙は、限定するものではないが、rBPI（配列番号：69）、rBPI₂₃のような BPIのアミノ末端断片、および（本明細書に参考までに採り入れた、係属中で共同所有に係る、1993年２月２日に出願した米国特許出願 No．08/013,801 および1994年２月２日に出願した対応ＰＣＴ出願 No．US94/01235 にて、rBPI(1-193)¹³²と命名された）rBPI₂₁Δcy s のようなBPI の成熟したアミノ末端断片を含んだヒトの殺菌性／浸透性が向上したタンパク質(BPI)の生物学的活性を意図するものである。本明細書に参考までに採り入れた、係属中で共同所有に係る、米国特許出願 No．08/093,202 に開示されているように、 151位のバリンがGTC ではなくGTG で規定され、 185位の (AAGで規定された)リジンが(GAGで規定された)グルタミン酸であることを除けば、Gray et al．（前掲）に開示された、配列番号：69に記載の配列を有するrBPI が生成されている。加えて、前述したGray et al．（前掲）の配列との相違点と、31残基のシグナル配列および rBPIの配列の最初の 199個のアミノ酸を含む発現ベクターを用いて、rBPI₂₃（Ga zzano-Santro et al.，1992，Infect．Immun．60: 4754-4761 も参照のこと）が生成した。かような生物学的活性は、LPS への結合性、LPS の中和、ヘパリンへの結合性、ヘパリンの中和および殺菌活性を含む。本発明のペプチドの生物学的活性とは、BPI あるいはBPI の機能領域に対応する対応ペプチドの活性の0.1 から10倍の活性を含む。「IBPI の生物学的活性」の定義には、例えば、BPI あるいはBPI の全対応ドメインを含む対応ペプチドの活性とは質的に異なる殺菌活性などの生物学的活性を含む。例えば、質的相違としては、BPI の対応する機能領域のアミノ酸配列に効果的で関連のあるペプチドに対して、細菌あるいは他の微生物のスペクトルにおける相違を含む。このように、この定義は、BPI に関して報告されていない、グラム陽性細菌に対する殺菌活性および殺真菌活性のようなペプチド活性を含む。本発明は、ヒトBPI の機能領域の一つのアミノ酸配列あるいはそのサブ配列を有したペプチドを提供する。かようなペプチドには、以下の例示的なドメインＩペプチド〔一文字表記のアミノ酸は、G．Zubay，Biochemistry(2d．ed.)，1988( MacMillen Publishing: N.Y.)，p.33に紹介されている〕：以下の例示的なドメインIIペプチド：そして、以下の例示的なドメインIIIペプチド：が挙げられる。BPI.14、BPI.12およびBPI.55が、付加変異体の例であると認められる。本発明は、ヒトBPI の機能領域の一つのアミノ酸配列あるいはそのサブ配列を有するペプチドの組み合わせである、同一あるいは異なる線状および分枝状ペプチドの組み合わせを提供する。かようなペプチドの態様には、以下に例示するドメインIIペプチド：および、以下に例示するドメインII分枝状ペプチド： MAP.１（β−アラニル−Ｎα、Ｎε−置換− ［Ｎα、Ｎε(BPI.2)リシル］リシンおよび、以下に例示する組み合わせドメインIIIペプチド：および、以下に例示する分枝状ドメインIIIペプチド： MAP.２（β−アラニル−Ｎα、Ｎε−置換− ［Ｎα、Ｎε(BPI.13)リシル］リシンおよび、以下に例示するドメインII−ドメインIII間の組み合わせペプチド：などが挙げられる。各ペプチドの一つ以上の位置でのアミノ酸残基が、特異的なペプチドが誘導されるBPI 機能領域の対応する位置にて認められるアミノ酸とは異なる残基である、アミノ酸置換変異体も提供される。例えば、本発明の一態様では、ペプチドのある位置は、BPI アミノ酸配列での対応する位置のアミノ酸であるアラニン残基で置換する。他の態様では、ペプチドのある位置は、BPI アミノ酸配列での対応する位置のアミノ酸である、例えば、フェニルアラニン、ロイシン、リシン、あるいはトリプトファン残基で置換する。これらペプチドの態様には、以下に例示する置換ドメインIIペプチド：および、以下に例示する置換ドメインIIIペプチド：などが挙げられる。本発明によって提供されるかような単一アミノ酸置換BPI 機能領域の有用性は、ペプチド配列における重要な残基を同定することにあり、これにより、アミノ酸配列における特定位置の置換が、ペプチドの生物学的活性の少なくとも一つに関する効果が確認できるようになる。本発明に包含されるもので、特筆すべきは、得られた置換ペプチドが本明細書で定義したような生物学的活性を有している自然発生もしくは不定型のアミノ酸を用いて、同定された重要な残基が置換されている本発明のペプチドの態様である。複数の置換、すなわち、機能領域アミノ酸配列の二つ以上の異なるアミノ酸残基がそれぞれ、他のアミノ酸で置換されている置換ペプチドも提供される。例えば、二箇所が置換されたペプチドの場合、ペプチド中の双方の位置が、例えば、 BPI アミノ酸配列での対応する位置にあるアミノ酸を、アラニン、フェニルアラニン、あるいはリシン残基で置換される。これらペプチドの例には、複数の置換を含むドメインIIペプチド：および、複数の置換を含む例示のドメインIIIペプチド：および、以下の複数の置換を含む例示の置換ドメインIIの混合ペプチド：および、以下の複数の置換を含む例示の置換ドメインII−ドメインIII間の混合置換ペプチド：が挙げられる。かようなアミノ酸置換変異体の他の態様には、不定型アミノ酸でアミノ酸残基を置換したものがある。本発明のペプチドのこの態様には、向上した安定性、強度、あるいは生物学的利用性をペプチドに付与されるように、D-アミノ酸、修飾あるいは非自然発生型アミノ酸、および改変アミノ酸を含めたペプチドが包含される。これらペプチドの例には、不定型アミノ酸を含む以下の例示的なドメイン IIペプチド：および、不定型アミノ酸を含む例示のドメインIIIペプチド：および、不定型アミノ酸を含む例示の置換ドメインII−ドメインIII間の混合ペプチド：などが挙げられる。複数のドメインで複数の置換をもたらすアミノ酸置換変異ペプチドの線状および分枝状ペプチドの組み合わせも、本発明の態様である。これらペプチドの態様としては、以下の例示的な混合／置換ドメインIIペプチド：などが挙げられる。上記したBPI 機能領域ペプチドそれぞれの二量体および環状体も、本発明によって提供される。これらペプチドの態様として、以下の例示的なシステイン修飾したドメインIIペプチド：などが挙げられる。このように、本発明によれば、グループＩ、グループIIおよびグループIIIとしてそれぞれ分類した、BPI のドメインＩ、IIおよびIIIに基づいた、あるいはこれらドメインに関連するペプチドを新規の化合物として提供する。本発明によれば、グループIVとして分類した、異なるドメインに由来する部分を有したペプチドを提供する。本明細書に記載したBPI 機能領域ペプチドは、グラム陰性細菌に対する抗菌薬として、また、グラム陰性細菌の細胞膜に関連するLPS の作用を中和する上で有用である。本発明のペプチドは、様々な量にて、ヘパリン結合性ならびにヘパリン中和などのグラム陰性細菌感染に直接関連しない活性を含めた他のBPI の活性も呈する。本発明によって提供されたペプチドも、BPI の公知の生物学的活性とは異なる生物学的活性を呈する。例えば、本発明のペプチドのある態様によれば、生物学的活性が及ぶ生物的対象がBPI より広範であり、グラム陰性細菌同様に、グラム陽性細菌にもその生物学的活性が及ぶのである。本発明のある態様では、驚くべきことに、殺真菌活性も得られている。このように、本発明は、異なる抗微生物活性を有するBPI の生物学的機能領域のアミノ酸配列を備えたペプチドを効果的に提供するのである。BPI の抗菌活性ならびに抗内毒素活性を有し、また向上した抗生物質スペクトルを備えた本発明のペプチドは、抗生物質の新規のクラスを構成するものである。本発明のBPI 機能領域ペプチドは、BPI タンパク質生成物を認識する生物学的治療用途において有用である。例えば、共同所有に係る、係属中の、1994年１月 24日に出願された米国特許出願 No．08/188,221 は、ヒトの治療において、循環器系にあるグラム陰性細菌内毒素に、BPI タンパク質生成物をさらすことを述べている。例えば、共同所有に係る、係属中の、1993年３月12日に出願された米国特許出願 No．08/031,145 および1994年３月11日に出願された PCT/US94/02463 は、マイコバクテリウム疾患の治療のために、BPI タンパク質生成物を投与することを述べている。共同所有に係る、係属中の、1993年10月５日に出願された米国特許出願 No．08/132,510 は、抑制された細網内皮系機能条件の改善のために、BPI タンパク質生成物を使用することを述べている。例えば、共同所有に係る、係属中の、1993年９月22日に出願された米国特許出願 No.08/125,651は、BPI タンパク質生成物と抗生物質との相乗的組み合わせを述べている。例えば、共同所有に係る、係属中の、1993年７月14日に出願された米国特許出願 No．08/093, 201 および1994年７月14日に出願された PCT/US94/07834 は、LBP タンパク質生成物の投与による、BPI タンパク質生成物の殺菌活性を強化する方法を述べている。上記した出願の開示は、本発明のBPI 機能領域ペプチドの治療用途での使用のために、本明細書に参考までに採り入れた。本発明のBPI 機能領域ペプチドは、上記した米国特許出願 Nos．08/030,644、08/093,202、 08/183,222 およびその親出願、ならびに1994年３月11日に出願された対応する PCT/US94/02465 に開示されている通り、病理的状態ならびに疾患状態の治療においても有用である。このように、本発明のBPI 機能領域ペプチドは、ヘパリンの抗凝固効果の中和；血管形成（特に、網膜症に関連する血管形成）の阻害；内皮細胞増殖（特に、肥大した卵子の移植に関連した子宮内膜症および増殖）の阻害；悪性腫瘍細胞の増殖（特に、カポジ肉腫の増殖）の阻害；慢性炎症疾患（関節炎、特に、反応性のリューマチ性関節炎）の治療；グラム陰性細菌感染およびその後遺症の治療；循環血液中のグラム陰性内毒素の作用（増大したサイトカイン生成）の処置；グラム陰性細菌の殺菌；抑制された細網内皮系機能（特に、肝臓の物理的、化学的および生物学的損傷の結果としての、抑制された肝臓のクッパー細胞機能を含む）に関連した生理学的効果の改善；（ゲンタマイシン、ポリミキシンＢおよびセファマンドールナフタのような）抗生物質との相乗的組み合わせによるグラム陰性細菌感染およびその後遺症の治療；抗生物質との相乗的組み合わせによるグラム陰性細菌の殺菌；LBP タンパク質生成物との組み合わせによるグラム陰性細菌感染およびその後遺症の治療；LBP タンパク質生成物との組み合わせによるグラム陰性細菌の殺菌；抗生物質および／またはビスマス単独あるいは組み合わせによる Mycobacteria 感染（特に、Mycobacteria tuberculosis、 Mycobacteria l eprae、および Mycobacteria avium による感染）の治療；循環血液中のリポアラビノマンナンの生理学的効果（増大したサイトカイン生成）の改善；リポアラビノマンナンを含んだ流体（血液、血漿、血清および骨髄）の除染；および Hel icobacter 属の細菌による感染に関連した疾患状態（胃炎および消化器官、胃および十二指腸潰瘍など）の治療、において有用である。本発明は、上記した用途での使用において効果的な量のBPI 機能領域ペプチドを含んだ、経口用、非経口用、局所用および噴霧投与の薬剤組成物、および薬学的に許容される希釈剤、補助剤あるいは担体をさらに含んだ薬剤組成物を提供する。 LBP タンパク質生成物との組み合わせたBPI 機能領域ペプチドの使用に関して、本明細書にて以後使用する、「LBP タンパク質生成物」には、天然および組換え生成したリポ多糖結合タンパク質；リポ多糖結合タンパク質の生物学的に活性な天然および組換えポリペプチド断片ならびに誘導体；および、LBP あるいは生物学的に活性なその断片のいずれかの、ハイブリッド融合タンパク質を含む、生物学的に活性なポリペプチド類似体が含まれる。本発明の方法に有用なLBP タンパク質生成物は、共同所有に係る、係属中の、1993年６月17日に出願された米国特許出願 No．08/079,510 、そして共に1994年６月17日に出願された米国特許出願 No．08/261,660 ならびに対応するPCT/US94/06931に記載された形質転換した真核宿主細胞での、rLBPと命名された組換え遺伝子の発現によって生成できるLB Pホロタンパク質を含む。その米国特許出願には、CD14が介在した炎症特性と、C D14レセプターを介してLPS 活性を伝播する能力を欠いた、好ましいLBP タンパク質誘導体も記載されている。CD14が介在した免疫刺激が一般に好ましくないと考えられ、感染した対象においては特にその傾向が顕著であるため、本発明に従って、かようなLBP タンパク質を用いることは好ましい。好ましいLBP タンパク質誘導体は、約25kDの分子量を有したアミノ末端断片によって特徴付けられている。rLBP₂₅と命名された、配列番号：97と98に記載されたLBP のアミノ末端の最初の 197個のアミノ酸によって特徴付けられたLBP アミノ末端断片が最も好ましく、その生成物は、先に述べた、共同所有に係る、係属中の、米国特許出願 Nos．08/079,510、08/261,660 および対応する PCT/US94/06931 に記載されている。25kDよりかなり小さく、またホロLBP 分子のアミノ末端の最初の 197個のアミノ酸より実質的に小さい末端を含んだLBP タンパク質誘導体は、LPS への結合能力を保持しているのであれば、本発明での使用に適している。さらに、配列番号：97と98に記載されたrLBPの最初の 197個のアミノ酸のカルボキシ末端側のアミノ酸を含むホロLBP 分子の最初の 197個のアミノ酸残基より大きな断片を含むLBP タンパク質誘導体は、CD14 が介在した、免疫刺激活性を促進する要素が欠如しておれば、本発明の方法において有用であることが立証されるであろう。また、当業者であれば、そのタンパク質分子の所望の生物学的活性を損失することなく、配列番号：97と98に記載のアミノ酸残基の付加、削除および置換を行いうるものと考える。さらに、LBP タンパク質生成物がLPS 結合活性を維持し、またCD14介在した免疫刺激活性を欠くように、LBPホロタンパク質をコードするDNA 配列を、削除、置換、付加あるいは部位特異的変異を含む変異することで、LBP タンパク質生成物を得ることができる。細菌に対するLBP の親和性の改善および／またはinvivoでの改善された安定性の結果として得られるLBP ハイブリッド分子と二量体分子も、本発明で特に意図されている。これらには、LBP/BPI ハイブリッドタンパク質とLBP-Ig融合タンパク質が含まれる。かようなハイブリッドタンパク質には、二量体の形成を許容するために、ヒトガンマ１あるいはガンマ３ヒンジ領域をさらに用いることを含む。二量体の他の形態として、改善した血清の安定性ならびにCH₂ドメインを欠いたFcを用いた融合体を含む結合親和性、あるいはロイシンまたはヘリックス束を用いたハイブリッドを備えることを意図している。本発明のBPI 機能領域ペプチドは、組換え手法を含む、当該技術分野で公知の手段によって、生成および／または単離することができる。本明細書の参考までに採り入れた、共同所有に係る、1991年７月２日に発効した米国特許 No．5,028,530、共同所有に係る、1993年４月27日に発効した米国特許 N o．5,206,154、および共同所有に係る、係属中の1993年１月28日に出願された米国特許出願 No．08/010,676 は、抗微生物ペプチドを含めたポリペプチドの新規の組換え生成法を開示している。細菌における抗微生物ペプチドの他の組換え生成法が、Piers et al.，1993，Gene 134: 7-13に記載されている。本明細書の参考までに採り入れた、共同所有に係る、係属中の1992年５月19日に出願された米国特許出願 No．07/885,501 および1993年５月19日に出願されたその一部継続出願である米国特許出願 No．08/072,063 および対応する PCT/US93/04752 は、培地中の遺伝子的に形質転換した哺乳類宿主細胞にて発現し、分泌された組換えBP I の精製のための新規の方法が開示している。 BPI 機能領域ペプチドは、かような方法を用いることで効率良く得ることができる。当業者であれば、本発明の各ペプチドをコードする核酸を単離し、あるいは化学的に合成することができる。このような核酸は、転写および／または翻訳制御要素に核酸が結合している組換え発現体の要素として有用であり、これにより、その組換え発現体によって形質転換した原核細胞、好ましくは真核細胞、より好ましくは哺乳類細胞での培養にて、組換え発現体が本発明のペプチドを発現できるようになる。本発明のペプチドは、当該技術分野で公知の化学合成法、特に、例えば、購入可能な自動ペプチド合成機を用いた固相合成法によって効率良く合成することができる。このペプチドは、ペプチドが互いに線状に結合され、そして、選択した配座様式となるように、「スペーサー」アミノ酸による分離の有無にかかわらずにペプチド内にてBPI 配列が繰り返されているペプチドとして提供される。さらに、構成ペプチドが、ペプチドを含むアミノ酸のアミノ酸側鎖にて機能的に共有結合されている分枝状鎖としても提供される。本発明の機能領域ペプチドは、BPI 機能領域ペプチドと少なくとも一つの他のポリペプチドの一部を含む組換えハイブリッド融合タンパク質として提供される。このようなペプチドは、例えば、本明細書の参考までに採り入れた、Theofan et al.による共同所有に係る、係属中の1992年５月19日に出願された米国特許出願 No．07/885,911 および1993年５月19日に出願されたその一部継続出願である米国特許出願 No．08/064,693 および対応する PCT/US93/04754 に記載されている。一般に、当業者であれば、本明細書に記載したペプチドを、非修飾のペプチドと同等の活性、必要であれば他の所望の特性を備えた化合物を生成するために様々な化学的手法で修飾するであろう。例えば、ペプチドのカルボン酸官能基は、カルボキシ末端あるいは側鎖であれ、薬学的に許容されるカチオンの塩として提供され、またはC₁-C₁₆エステルを形成するように制限され、あるいは式 NR₁R₂、式中、R₁とR₂は互いに異なるものであり水素もしくはC₁-C₁₆アルキルであるのアミドに転化され、あるいは５員環あるいは６員環のような複素環を形成するように結合される。ペプチドのアミノ基は、アミノ末端あるいは側鎖であれ、塩酸、臭化水素、酢酸、安息香酸、硫化トルエン、マレイン酸、酒石酸および他の有機塩のような薬学的に許容される酸の塩の形態にて、あるいはC₁-C₁₆アルキルあるいはジアルキルアミノにまで修飾され、あるいはアミドになるまでさらに転化される。ペプチド側鎖の水酸基は、周知の方法を用いて、C₁-C₁₆アルコキシあるいはC₁-C₁₆エステルまで転化される。ペプチド側鎖のフェニルあるいはフェノール環は、フッ素、塩素、臭素あるいはヨウ素などの一つ以上のハロゲン原子、あるいはC₁-C₁₆アルキル、C₁-C₁₆アルコキシ、カルボン酸およびそのエステル、あるいはカルボン酸のようなアミドで置換される。ペプチド側鎖のメチレン基は、相同なC₂-C₄アルキレンまで伸長される。チオールは、アセトアミド基のような周知の保護基の一つで保護できる。当業者であれば、改善された結合性および／または安定性をもたらす構造に見合う立体配座を選択および提供するために、本発明のペプチドに環状構造を導入する方法も想到するであろう。例えば、カルボキシ末端あるいはアミノ末端システイン残基をペプチドに付加でき、よって酸化したペプチドがジスルフィド結合を含んだ場合には、環状ペプチドが生成することになる。他のペプチドの環状化方法として、チオエーテル、およびカルボキシならびにアミノ末端アミドとエステルの形成がある。仮想ペプチドならびに仮想有機体も本発明の範疇に属し、かような仮想ペプチドならびに仮想有機体の化学構造の三次元構造は、ペプチドの三次元構造とペプチドの構成アミノ酸側鎖を真似ているものであり、これにより、本発明のペプチドの仮想ペプチドならびに仮想有機体は、実質的な生物学的活性を備えることになる。BPI の活性の各々に関する薬作用発生団の存在も示唆されている。薬作用発生団は、生物学的活性のために求められる構造の理想的な三次元構造を採る。仮想ペプチドならびに仮想有機体は、コンピューター設計用ソフトウェア（薬剤設計のためのコンピューター）を用いて、薬作用発生団に適合するように設計することができる。薬作用発生団の特異的な活性相互の重複の程度を、決定する必要がある。 BPI 機能領域ペプチドは、好ましくは、BPI 機能領域ペプチドならびに薬学的に許容される希釈剤、補助剤あるいは担体を含む薬剤組成物として投与される。 BPI 機能領域ペプチド組成物は、公知の抗生物質、界面活性剤、あるいは他の化学療法薬を必要に応じて併用して投与される。かような組み合わせの例は、本明細書の参考までに採り入れた、共同所有に係る、係属中の1993年２月２日に出願された米国特許出願 No．08/012,360 および1994年２月２日に出願されたその一部継続出願である米国特許出願 No．08/190,869 および1994年２月２日に出願された対応する PCT/US94/01239 に記載されている。殺菌活性、ヘパリンの抗凝固活性の一部あるいは全部中和、LPS の一部あるいは全部中和、および本明細書に開示した他の効果を得るためのBPI 機能領域ペプチドの有効用量は、当業者であれば、例えば、被投与体の大きさ、細菌感染の程度と性質、内毒素ショックの程度と性質、および被投与体に投与されたヘパリンの量ならびにヘパリンが投与されてから経過した時間を含めた、生物学的活性に関連する公知のパラメーターから、容易に決定できる。当業者であれば、本明細書にて言及する治療用途に本発明のペプチドに用いるにあたって、同様の決定を行い得るものと思われる。本発明の薬剤は、経口投与用、注射用、あるいは他の非経口的方法に適合するように調製でき、好ましくは、当業者に公知の薬学的に許容される担体、補助剤および対抗イオンを含むようにする。この薬剤は、錠剤、丸剤、粉体、薬液あるいは懸濁液などの、固形、半固形および液体、および注射ならびに浸出可能な溶液の形態とするのが好ましい。約 100μg/体重kgから約 100mg/ 体重kgの有効用量範囲が、意図されている。以下の実施例には、本発明の態様とその用途についての記載がなされている。実施例１には、BPI のタンパク質分解断片の調製方法が記載されており；実施例２には、実施例１のタンパク質分解断片の殺菌性の検定結果が記載されており；実施例３には、実施例１のタンパク質分解断片を用いたヘパリン結合性検定の結果が記載されており；実施例４には、実施例１のタンパク質分解断片のLPS 結合活性を検定するための、Limulus 遊走細胞溶解物を用いた実験の結果が記載されており；実施例５には、BPI の15マー・ペプチドの調製が記載されており；実施例６には、実施例５の15マー・ペプチドを用いたヘパリン結合性検定の結果が記載されており；実施例７には、実施例５の15マー・ペプチドを用いたLimulus 遊走細胞溶解物の検定の結果が記載されており；実施例８には、実施例５の15マー・ペプチドを用いた殺菌性検定の結果が記載されており；実施例９には、別個のBPI 機能領域ペプチドの調製が記載されており；実施例10には、実施例９の別個のBPI 機能領域ペプチドを用いたヘパリン結合性検定の結果が記載されており；実施例11には、実施例９の別個のBPI 機能領域ペプチドを用いたヘパリン中和検定の結果が記載されており；実施例12には、実施例９の別個の BPI 機能領域ペプチドを用いたLPS 中和活性のLimulus 遊走細胞溶解物分析の結果が記載されており；実施例13には、実施例９の別個のBPI 機能領域ペプチドを用いた殺菌性分析の結果が記載されており；実施例14には、混合BPI 機能領域ペプチドの調製が記載されており；実施例15には、実施例14の混合BPI 機能領域ペプチドの殺菌性分析の結果が記載されており；実施例16には、実施例14の混合BP I 機能領域ペプチドの他の殺菌性分析の結果が記載されており；実施例17には、実施例14の混合BPI 機能領域ペプチドを用いたin vivo およびin vitroヘパリン中和分析の結果が記載されており；実施例18には、BPI 置換変異機能領域ペプチドの調製ならびに殺菌活性、ヘパリン結合活性、およびLPS 中和活性分析の機能性分析が記載されており；実施例19には、代表的なBPI 機能領域ペプチドを用いた殺菌性ならびにヘパリン結合分析の結果の要旨が記載されており；実施例20には、様々な結合性ならびに中和検定におけるBPI 機能領域ペプチドの分析が記載されており；実施例21には、ヘパリン中和分析が記載されており；実施例22には、コラーゲンのモデル系および慢性炎症疾患状態を示す細菌で誘発した関節炎動物モデル系へのBPI 機能領域ペプチドの投与が記載されており；実施例23には、マウスの悪性腫瘍転移のモデル系での血管静止効果に関する BPI 機能領域ペプチドの試験が記載されており；実施例24には、内皮細胞増殖に関するBPI 機能領域ペプチドの効果が記載されており；実施例25には、動物モデル系でのBPI 機能領域ペプチドの分析が記載されており；そして、実施例26には、ヒトにおける本発明のBPI 機能領域ペプチドの抗内毒素効果をin vivo で試験するためのプロトコールが記載されており；実施例27には、抗生物質耐性株に対する抗菌効果を試験するためのBPI 機能領域ペプチドの投与が記載されている。実施例１ BPI タンパク質分解断片の調製組換えBPI タンパク質の様々な大きさのタンパク質分解断片を生成するために、rBPI₂₃に化学開裂ならびに酵素消化の処理を施した。 rBPI₂₃タンパク質は、臭化シアン(CNBr)あるいはエンドプロテイナーゼAsp-N によるタンパク分解に先駆けて、還元およびアルキル化処理した。タンパク質を、冷（４℃）アセトン(1:1v/v)を添加して一晩沈殿させて脱塩し、沈殿したタンパク質を10分間（5000×ｇ）で遠心分離してペレット化することで復元せしめた。rBPI₂₃タンパク質ペレットを、冷アセトンで２回洗浄し、窒素の流れる下で乾燥した。rBPI₂₃溶液は、８Ｍ尿素／0.1M Tris-塩酸(pH 8.1)中の1mgタンパク質/ ml の最終濃度にまで再調整され、そして、3.4mM ジチオスレイトール（Calbioc hem社、サンディエゴ、カリフォルニア州）を、37℃で、90分間かけて添加することで還元した。最終濃度が5.3ミリモーラーになるまでイオドアセタミド（Sig ima Chemical社、セントルイス、モンタナ州）を添加し、室温で、暗黒下で30分間インキュベートすることで、アルキル化を行った。還元およびアルキル化したタンパク質を、アセトンで沈殿させ、遠心分離し、上記したようにして洗浄し、そして、ペレットを臭化シアンあるいはAsp-N 消化のいずれかのために、下記したようにして再溶解せしめた。臭化シアン触媒したタンパク質の断片化のために、最終タンパク質濃度が５mg /ml になるまで、70％トリフルオロ酢酸(TFA)（タンパク質配列決定用、Sigima ChemiCal 社、セントルイス、モンタナ州）でまず溶解した。70％ TFAに溶解した臭化シアン（ベーカー分析した試薬、VWR ScientifiC社、サンフランシスコ、カリフォルニア州）を、タンパク質に対して臭化シアンが 2:1(w/w)の最終比率になるように添加した。反応物を窒素で清浄し、室温で、暗黒下で、24時間反応を進行せしめた。９倍量の蒸留水を加えて反応を停止し、凍結して(-70℃ )、凍結乾燥した。エンドプロテイナーゼ消化のために、還元およびアルキル化したrBPI₂₃を、８Ｍ尿素／0.1M Tris-塩酸(pH 8.1)中の5.0mg/mlの濃度で可溶化した。５Ｍ尿素／ 0.1M Tris-塩酸(pH 8.1)中の最終条件が2.5mg/mlになるように、等量の0.1M Tri s-塩酸(pH 8.1)を添加した。Pseudomonas fragi（Boehringer-Mannheim社、インディアナポリス、インディアナ州）からのエンドプロテイナーゼ Asp-Nを、1: 1000(w/w、酵素：基質)の比率で加え、37℃で、６時間、反応を進行せしめた。T FA の最終濃度が 0.1％になるまで添加することで反応を停止し、そして試料を逆相HPLCで分画化した。臭化シアンおよび Asp-N断片混合物を、ZorbaxプロテインプラスC₃カラム（4. 6×250mm、300Å孔径、MACMOD Analytical社、チャストフォード、ペシルバニア州）で精製した。0.1％TFA 中の５％アセトニトリルから0.1 ％TFA 中の80％アセトニトリルまでの勾配を、1.0ml/分の流速で、２時間の溶出時間にわたってこのカラムに適用した。断片溶出液を、Beckman System Gold HPLC（Beckman Scie ntific Instruments社、サンラモン、カリフォルニア州）を用いて、220nmでモニターした。カラム加熱装置を35℃に維持し、そして、画分を手で回収し、−70 ℃で凍結し、次いで Speed Vac濃縮装置で乾燥した。使用に先駆けて、20mM酢酸ナトリウム(pH 4.0)/0.5M 塩化ナトリウムの溶液にて可溶化した。小児科病院−オークランド研究所のCedric Shackleton博士の研究室に所属している Francis Bitsch 博士ならびに JohnKim 氏によって、V G Bio-Q質量スペクトル分析器にて、電子噴射イオン化質量スペクトル(ESI-MS) が行われた。データの数学的換算によって分子質量が得られた。 rBPI₂₃のDNA 配列は成熟したタンパク質の１−199 アミノ酸残基をコードするものの、生成したタンパク質の重要な部分は、ESI-MSで決定されたように、Leu- 193 およびVal-195 にて切断されていた。これらカルボキシ末端の切断部の存在は、ESI-MSで配列決定ならびに解析されたカルボキシ末端のトリプシンによって生じたペプチドを単離することで証明された。 rBPI₂₃には、第56、70、100、111、170および 196位に、６つのメチオニン残基があり、臭化シアンの化学的開裂で予想された６つの腫瘍なペプチド断片が生成した。臭化シアン開裂実験の結果を、表１にまとめた。その断片を、逆相(C₃) HPLC（図1a）によって単離し、そのアミノ末端配列を Edman消化によって決定した。最も大きな二つの断片（C1とC5）は、C₃HPLCカラムでは分解せず、イオン交換クロマトグラフィーを試みたが結果は芳しくなく、これは両者が長さと等電点が同様であることによるものと考えられる。混合物中のC1とC5の同定を、ESI-MS で決定した。臭化シアン開裂反応におけるカルボキシ末端メチオニンのホモセリンへの転換の結果から、30a.m.u.の損失を考慮して、C1の推定質量は6269（表１）とされた。観察された6251.51±0.34の質量は、ホモセリンラクトン中間体での水分子の損失(18a.m.u.)と符合しており、C1断片C-末端アミノ酸の疎水性からして、ホモセリンの形成に有利である。C5断片の推定質量は6487であり、観察された質量は6285.84±0.39であった（表１）。C5断片に関して、C-末端アミノ酸は疎水性であり、ホモセリンラクトン中間体の加水分解に有利である。アミノ末端配列決定と質量スペクトルの双方のデータから、C1/C5 混合体の約10から25％はC5の成分であることが認められた。臭化シアン C1/C5混合体に含まれる領域の他の断片を得るために、エンドプロテイナーゼ Asp-Nを用いたダンパク質開裂を行った。rBPI₂₃には、第15、36、39 、57、 105および 116位に、６つのアスパラギン酸残基があった。C3 HPLC によって単離した６つの主要 Asp-N断片（図1b）を配列決定し、その質量をESI-MS で決定した（表１）。非特異性の開裂、特に、グルタミン酸残基を解消するために、1:1000(w/w、酵素：基質)の比率で短時間消化を行った。Asp 残基（15位と3 5位のアミノ酸）が開裂しているところで、ある断片(1-38)が単離したので、消化が完全に進行していなかった。Asp-N 断片の質量スペクトルは、各断片の推定した質量と符合していた。臭化シアン開裂とは異なり、カルボキシ末端断片がわずかに分解しているところでは、第 116位のアミノ酸からカルボキシ末端までの Asp-N 断片は、他のAsp-N 断片のすべてからも十分に回収されていた。実施例２ BPI タンパク質分解断片の殺菌効果実施例１に従って生成したBPI タンパク質分解断片を、変異E．coli J5細菌を用いて、放射拡散分析にて殺菌効果についてスクリーニングした。具体的には、 E．coli J5細菌を終夜培養したものを、新鮮なトリプシン処理した大豆培地で1: 50にまで希釈し、培養細菌が対数増殖期に至るまで、37℃で、３時間培養した。そして、Sorvall RT6000B 遠心分離（Sorvall Instruments 社、ニュートン、コネチカット州）を用いて、細菌を、3,000rpmで、５分間、遠心分離してペレットとした。10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.4)の５mlを添加し、そして調製物を再度ペレット化した。上清を移して、５mlの新鮮な緩衝液を添加し、細菌を再懸濁し、そして、その濃度を590nmでの吸光度の測定（この波長での吸光度値1.0は、懸濁液中の1.25×10⁹ CFU/mlの濃度に等しい）により決定した。10mlの溶解した下層のアガロース（約45℃）で細菌を４×10⁶ CFU/mlにまで希釈し、常套手段である、15mlのポリプロピレン製チューブの反転を繰り返すことでこれを混合した。そして、そのチューブの中身すべてを、平底ペトリ皿に注ぎ、皿を万遍なく均等に振ることで均質に分布させた。30秒もしない内に固まったアガロースは、約１mmの均質厚みになった。真空装置に接続された滅菌済の３mmパンチを用いて、固まったアガロースの一連のウェルを設けた。パンチは100％アルコールで滅菌処理しており、細菌の培地を汚染しないように、使用時の直前に乾燥させた。 BPI 断片の５もしくは10μl を、各ウェルにピペットで移した。負の対照として、希釈緩衝液(pH 8.3)を分離したウェルに添加し、５μg/mlおよび１μg/mlの濃度のrBPI₂₃も正の対照として添加された。各プレートを、37℃で、３時間インキュベートし、そして、10mlの溶解した上層のアガロース（約45℃）を平底ペトリ皿に添加し、固化せしめて、次いで、37℃で、終夜インキュベートした。翌日、殺菌活性を有する細菌を置いたウェルには清澄な部分が認められた。この部分を視覚的により確認しやすくするために、（0.002 ％クーマシーブリリアントブルー、27％メタノール、15％ホルムアルデヒド（37％倍液）および水からなる）希釈したクーマシー溶液を寒天上に注ぎ、染色するために24時間置いた。マイクロメーターを用いて、細菌部分を測定した。 25pmol／ウェルにまで増量して試験した場合でも、臭化シアンあるいはAsp-N 消化して生成したrBPI₂₃断片に関しては殺菌活性は認められなかった。これに対して、この分析では、0.75pmol／ウェルという低い量でも、rBPI₂₃を用いることで測定可能な殺菌活性が検出された。一方、アルキル化rBPI₂₃がrBPI₂₃と同等の殺菌活性を保持しているににかかわらず、還元およびアルキル化したrBPI₂₃でも100pmol／ウェルにまで増量しても殺菌性は認められなかった。実施例３ BPI タンパク質分解断片によるヘパリン結合実施例１にて生成したrBPI₂₃とBPI タンパク質分解断片を、本明細書にて参考までに採り入れた、1993年７月15日に出願した係属中の米国特許出願 No．08/09 3,202 の実施例１に記載の方法に従ったヘパリン結合性分析にて評価した。要約すれば、各断片を、底にジフッ化ポリビニリデン膜（Immobilon-P、ミリポア社、ベッドフォード、マサチューセッツ州）を備えた、96ウェルマイクロタイタープレートのウェルに添加した。臭化シアン断片のヘパリン結合を、³H−ヘパリン（20μg/ml）の飽和濃度で、ウェル当たり100pmolの各断片を用いて計測した。正の対照のウェルには、様々な量のrBPI₂₃を入れた。ウェルを乾燥し、次いで、燐酸緩衝化生理食塩水、pH 7.4（ブロッキング緩衝液）中の 0.1％ウシ血清アルブミン(BSA)でブロックした。ブロッキング緩衝液で³H−ヘパリン（0.30-20μCi /ml、平均分子量15,000: DuPont-NEN 、ウィルミントン、デラウエア州）の希釈液を作り、 BPIペプチドを含むウェルにて、４℃で、１時間インキュベートした。液体シンチレーション計測（Model 1217、LKB 社、ガイザーバーグ、メリーランド州）での定量のために、未結合のヘパリンを吸引し、ウェルをブロッキング緩衝液で３回洗浄し、乾燥し、そして除去した。ブロッキング緩衝液中のBSA は、小さな親和性とヘパリンへの小さな結合力を示したが、これは生理学的要因によるものではなく、その背景は試験化合物シグナルが減じたものと考えられる。断片−ヘパリン結合の特異性は、放射標識したヘパリンが、100倍の過剰の放射標識していないヘパリンにより完全に阻害されたということ（データ示さず）から明らかである。表２（二つのウェルの平均値±は、二つの値の値域を示す）の結果は、アミノ酸71-100(C3)と1-56ならびに112-170(C1,C5)を含んだヘパリンに結合した臭化シアン断片は、同程度の結果を示した。臭化シアン断片171-196 も、対照タンパク質（同様の分子量のタンパク質であるrBPI₂₃に作用する、タウマチン）よりも、ヘパリンに顕著に結合した。 Asp-N 断片も、rBPI₂₃にて複数のヘパリン結合領域が認められた。表２にあるように、57-104 Asp-N断片が最も多量のヘパリンと結合し、1-38ならびい116-19 3 断片がこれに続いている。臭化シアン断片データとつきあわせて、これらデータは、化学的あるいは酵素的に生成したrBPI₂₃の断片によって実証されたように、残基71-100での最高のヘパリン結合力をはじめとして、rBPI₂₃には少なくとも三つの独立したヘパリン結合領域があることを示している。実施例４ LAL 分析に関するBPI タンパク質分解断片の効果実施例１に従って生成したBPI タンパク質分解断片を、これら断片のLPS 結合特性を決定するために、Limulus 遊走細胞溶解(LAL)阻害検定に適用した。具体的には、各断片を、所定濃度のE．coli 0113 LPS(最終濃度、４ng/ml)と共にエッペンドルフ管にて混合し、そして、時々振盪しながら、37℃で、３時間インキュベートした。0.05μg/mlのrBPI₂₃を含む対照についても試験した。インキュベーションに続いて、LAL 分析のために200pg/mlのLPS 濃度を得るために、360μl のダルベッコの燐酸緩衝化生理食塩水（D-PBS: Grand Island Biological社(GI BCO)、ロングアイランド、ニューヨーク州）をチューブごとに添加した。各試料を、ウェル当たり50μl の量のイムロンIIストリップ（Dynatech社、チャティリー、バージニア州）に移した。 Limulus 遊走細胞溶解物（発色定量 LALキット、Whitaker Bioproducts社、ウォーカーズビル、メリーランド州）を、ウェル当たり50μl 添加し、そのウェルを、室温にて、25分間インキュベートした。発色体を、ウェル当たり100μl 添加し、そして、ウェルを混合した。室温での20から30分間のインキュベーション後、100μl の25％(v/v)酢酸を添加して反応を停止した。405nm での光学密度を、マルチプレート計測器（Model Vmax、Molecular Dynamics社、メンロパーク、カリフォルニア州）で測定し、LPS 阻害率としてその結果を図２に示した。この図において、黒丸はrBPI₂₃を；白丸はAsp-N 断片A3を；×はAsp-N 断片A2を；黒四角はAsp-N 断片A4を；黒三角はAsp-N 断片A1A2を；白四角はAsp-N 断片A6a を；小さな白三角は臭化シアン断片C3を；そして、小さな黒四角は臭化シアン断片 C1/C5 を示している。アミノ三断片1-56と112-170 を含む臭化シアン消化画分は、約100nMのIC₅₀で、LPS 誘発したLAL 反応を阻害した。このIC₅₀は、同じ検定における無傷のrBPI₂₃ (9nM)のIC₅₀よりも、約10倍高い値である。他の臭化シアン消化画分は、非阻害性であることが判明した。 Asp-N 消化により生成した断片に、LAL 分析において三つの断片が阻害的であるとする若干異なる結果が得られた。アミノ酸116-193 に対応する断片は、15nM にてLPS 誘発したLAL 反応を完全に阻害するなど、無傷のrBPI₂₃と同様のLAL 阻害活性を示した。アミノ酸57-104ならびに1-38に対応する断片も、LAL 検定にて阻害を呈したが、約10倍の量を必要とした。臭化シアン消化によるデータとつきあわせて、これらデータは、116-193 のアミノ酸断片での最高の中和活性をはじめとして、 rBPI₂₃分子の少なくとも三つの領域には、LAL 反応でのLBS 活性の中和力があるとする、前述した実験結果をさらに支持するものである。実施例１に記載のrBPI₂₃のタンパク質分解断片での免疫反応性の研究を、ELIS A 検定を用いて行った。この検定にて、rBPI₂₃タンパク質分解断片を得るために、rBPI₂₃殺菌活性とLAL 阻害活性をブロックすることができるウサギポリクローナル抗rBPI₂₃抗体を用いた。このポリクローナル抗体は、116-193ならびに57-10 4 Asp-N断片および1-56ならびに112-170 臭化シアン断片とは免疫反応性があったが、マウスモノクローナル抗体は、rBPI₂₃の1-14残基に対応する Asp-N断片としか反応しなかった。実施例５ BPI の15-merペプチドの調製実施例１−４に記載のBPI 断片分析にて検出された生物学的活性のドメインをさらに研究するために、BPI の23kDアミノ末端断片のアミノ酸配列から誘導した 15個のアミノ酸を含む15-mer の合成ペプチドを調製し、ヘパリン結合活性、Lim ulus 遊走細胞溶解(LAL)検定、および殺菌活性について評価した。具体的には、一組47個の合成ペプチドを二つずつ調製するものであり、各ペプチドは15個のアミノ酸を含み、また、前述した係属中の、1993年７月15日に出願された米国特許出願 No．08/093,202 にある配列に基づいた、隣接するペプチドの11個の連続したアミノ酸と重複するアミノ酸を備えるようにペプチドを合成した。ペプチドを、Coselco Mimotopes 社のライセンス下にあるCambridge Research Biochemicals 社の固相法を利用して、 MaeJi et al.，（1990，Immunol．Methods 134: 23-33）ならびにGammon et al. ，(1991，J．Exp．Med．173: 609-617)の方法に従って同時に合成した。すなわち、rBPI₂₃(1-199)の配列を、rBPI₂₃の線状配列に沿って５個ずつアミノ酸をずらして分割を開始することで、47個の15-merペプチドを得た。このペプチド合成法は、96ウェル板での分離したペプチドの端断片に関する、複数のペプチドの小規模合成も同時に行える。このようにして、94個の端断片が合成され、残りの二つの端断片(B,B)は、活性化したFMOCアミノ酸の添加をせずに、他の端断片と同じ工程に適用した。固相の端断片支持体からの15-merペプチドの最終開裂では、基本緩衝液(炭酸ナトリウム、pH8.3)を使用した。端断片への独特な結合は、これら条件下でジケトピペラジン環化を進行せしめ、開裂したペプチドにのカルボキシ末端にてシクロ（リシルプロピル）部分をもたらすことになる。アミノ末端はアセチル化されず、よって、遊離アミノ基はアニオン結合反応に寄与することになる。ウェル当たりで、各15-merペプチドの平均約15μｇが得られた。実施例６ BPI の15-merペプチドによるヘパリン結合実施例５に記載のBPI 15-merペプチドを、実施例３に記載の方法に従ったヘパリン結合検定に適用した。その結果を図３に示し、図において、結合したcpm の総数から、ブロッキング緩衝液のみを使用した対照ウェルに結合したcpm を差し引いた値を示している。これら結果は、rBPI₂₃配列における個別のヘパリン結合性機能領域を示す、三つの異なるヘパリン結合性ペプチドの存在を示唆するものである。BPI 配列において、最初のドメインは約21位のアミノ酸から約55位のアミノ酸にまで至り：二番目のドメインは約65位のアミノ酸から約 107位のアミノ酸にまで至り：そして、三番目のドメインは約 137位のアミノ酸から約 171 位のアミノ酸にまで至っている。ブランク対照での端断片からの物質には、ヘパリン結合効果が認められなかった。実施例７ Limulus 遊走細胞溶解(LAL)検定での BPI の15-merペプチドの効果実施例５に記載の15-merペプチドを、実施例４に記載のLAL 検定を用いて、そのLPS 結合活性について分析を行った。これら実験の結果を、図４に示した。図４の結果は、顕著なLAL 阻害に至る LPS 結合活性を有するrBPI₂₃タンパク質の三つの異なるドメインの存在を示唆する、少なくとも三つの主要な領域を示している。最初のドメインは約17位のアミノ酸から約55位のアミノ酸にまで至り：二番目のドメインは約73位のアミノ酸から約99位のアミノ酸にまで至り：そして、三番目のドメインは約 137位のアミノ酸から約 163位のアミノ酸にまで至っている。加えて、図に示したように、他のペプチドでもLAL 阻害が認められた。これに対して、ブランク対照での端断片からの物質では、LAL 検定にて測定されるLPS 中和効果は認められなかった。実施例８ BPI の15-merペプチドの殺菌効果実施例５に記載の15-merペプチドを、実施例２に記載の放射拡散分析にてE．c oli 細菌(J5)に対する殺菌効果について試験した。ブランク端断片（B,B）からの生成物を、負の対照として試験した。分析の結果を図５に示した。殺菌活性が認められた15-merペプチドは、BPI タンパク質のアミノ酸85-99 に対するペプチドのみであった。図５に見られるように、様々な量のrBPI₂₃を含む正の対照ウェルでも殺菌活性が認められたが、緩衝液ならびにブランク対照端断片においてはかような活性は認められなかった。上記実施例に記載したヘパリン結合性ならびにLAL 分析にならった、これら殺菌活性検定の結果は、BPI タンパク質には三つの異なる機能領域があることを示している。実施例１−８にて得られた結果は、rBPI₂₃は、分子の全生物学的活性に寄与する少なくとも三つの機能領域を含んでいることを示している。最初のドメインは、約17位と約45位の間のアミノ酸の配列中にあり、38位の残基でのAsp-N 開裂により破壊される。このドメインは、LPS 誘発したLAL 活性ならびにヘパリン結合活性の双方において緩慢な活性を呈する。二番目の機能性ドメインは、約65位と約99位の間のアミノ酸の領域中にあり、LPS 誘発したLAL 活性の阻害力は、70位の残基での臭化シアン開裂により消失する。このドメインは、最大のヘパリン結合活性を示し、殺菌性ペプチド、85-99を含んでいる。約 142位と約 169位のアミノ酸の間にある、三番目の機能性ドメインは、LPS 誘発したLAL 刺激検定での阻害において活性であり、また、ヘパリン結合力は三つの領域の中で最も小さかった。実施例９ BPI 機能領域ペプチドの調製実施例５−８に記載の一連の重複したペプチドの試験結果に基づいて、BPI タンパク質の機能的に定義された各領域に由来するBPI 機能領域ペプチドを、Applid Biosystems社のModel432 ペプチド合成機を用いて、Merrif ield，1963，J．Am．Chem．Soc．85: 2149ならびにMerrifield et al，1966，An al．Chem．38: 1905-1914 の方法に従って、固相ペプチド合成によって調製した。BPI 機能領域ペプチドは、以下の表３に記載したように、BPI のアミノ酸残基 1-199 の一部のアミノ酸を有するように調製され、BPI.２からBPI.５およびBPI. ８と命名した。実施例10 BPI 機能領域ペプチドによるヘパリン結合活性実施例３に記載の方法に従って、BPI 機能領域ペプチドBPI.２、BPI.３、BPI. ８およびrBPI₂₁Δcys のヘパリン結合活性について検定した。図６に示した結果から、BPI.３とrBPI₂₁Δcys では緩慢なヘパリン結合活性が認められたが、BPI. ２とBPI.８では、ほとんどあるいは全くヘパリン結合活性は認められなかった。実施例11 BPI 機能領域ペプチドによるヘパリン中和活性 BPI 機能領域ペプチドBPI.２、BPI.３、BPI.４、BPI.５、 BPI.６および正の対照としてのrBPI₂₃を、本明細書に参考までに採り入れた、19 93年７月15日に出願された、係属中の、共同所有に係る米国特許出願 No．08/09 3,202 の実施例３に記載の方法に従って、ATIII/ヘパリン複合体によるトロンビン不活性化に関するそれらの効果について検定を行った。具体的には、血漿中の ATIII/ヘパリン複合体による精製したトロンビンの阻害を見るために、Chromost rate（登録商標）抗トロンビン分析キット（Organon Teknika社、ダーハム、ノースカロライナ州）を用いた。すなわち、分析は、ウェル当たりの最終容量が200μl になるように調製した9 6ウェルマイクロタイタープレートで、三度実施した。1.0μg/mlから 100μg/ml の範囲でBPI 機能領域ペプチドの濃度を変更して分析を進め、予め調製していた ATIII/ヘパリン複合体の存在下でトロンビンの阻害効果を決定した。分析のための試薬の添加順序は以下の通りである。1)最終容量が50μl になるようにPBS で希釈し、最終濃度が 100、50、25、10および１μg/ウェルに調製した、1-BPI₂₃ 、あるいはBPI 機能領域ペプチド、あるいはタウマチンの一連の希釈液、2)製造業者によって調製された緩衝液で、 1:1000に希釈した50μl 血漿水、3)製造業者によって調製された緩衝液中にある１nKat/ml の濃度にある50μl トロンビン、および4)水中で１μmol/mlの濃度にある50μl 発色基質、である。反応を37℃ で10分間進行せしめ、5０μl の0.1Mクエン酸を添加して停止した。実施例３に記載のマイクロプレート計測器で、発色反応を定量した。これら分析の結果を、試料濃度を重量あるいはモル濃度で記した図7aと7bに示した。BPI 機能領域ペプチドBPI.３とBPI.５が、最大のヘパリン中和活性を示した。これら分析にて、対照タンパク質であるタウマチンは中和活性を示さず、いずれのタンパク質濃度においても緩衝液対照と等価の活性を示したに過ぎなかった。実施例12 BPI 機能領域ペプチドによるLAL 分析でのLPS 中和活性 BPI 機能領域ペプチドBPI.２、BPI.３、BPI.８および正の対照としてのrBPI₂₃ を、実施例４に記載の方法に従って、これらペプチドのLPS 結合性ならびにLPS 阻害性を決定するために、LAL 分析にて評価した。実施例３に記載の方法にならって実験を進め、その結果を、試料濃度を重量あるいはモル濃度で記した図8aと 8bに示した。得られた結果から、BPI.３は緩慢なLPS 阻害活性を有しているのに対し、BPI.２とBPI.８では目立ったLPS 阻害活性は認められなかった。実施例13 BPI 機能領域ペプチドの殺菌活性 BPI 機能領域ペプチドBPI.２、BPI.３、BPI.８および正の対照としてのrBPI₂₃ を、実施例２の方法に従って、放射拡散分析にて、E．coli J5（ラフ）およびE ．coli 0111:B4（スムース）細菌に対する殺菌効果を試験した。その結果を、図 9a−9dに記した。これら結果は、BPI 機能領域ペプチドBPI.２とBPI.３は、殺菌活性を示したものの、BPI.８ではほとんどあるいは全く殺菌活性が認められない結果を示した。殺菌活性を示した各殺菌性ペプチドは、スムースE．coli 株よりむしろラフ株に対して効果的であった。ある種のBPI ペプチドの殺菌活性をさらに決定するために、他の実験にて、培地抗細菌分析を実施した。具体的には、寒天プレートでの単一コロニーから、E．coli J5（ラフ）あるいはE．coli 0111:B 4（スムース）細菌のいずれかを選択し、５mlのMueller Hinton肉汁を接種し、振とうしながら、37℃で一晩インキュベートした。終夜培養したものを、５mlの新しい肉汁で希釈し（〜1:50）、対数増殖期まで37℃でインキュベート（〜３時間）した。５分間、3000rpm で遠心分離して、細菌をペレット化した。細菌ペレットを５mlのPBS で再懸濁し、Mueller Hinton肉汁で、２×10⁶細胞/ml にまで希釈した（10D₅₇₀単位は、1.25×10⁹ CFU/mlに相当する）。試験を行うBPI 機能領域ペプチドを、肉汁で200μg/mlにまで希釈し、96ウェル培養プレート（100μ l 容量）で２倍まで連続的に希釈した。いずれの試料も２倍の最終濃度とし、実験を３回実施した。細菌を100μl/ウェルになるまで添加し、振とう機中にて、3 7℃で、20時間インキュベートした。そして、プレートを、ELISA プレートマルチプル計測器にて、590nm で測定した。各ペプチド濃度での３つのウェルの一つを、コロニー形成単位（CFU）決定のために選択した。270μl のPBS に30μl の部分試料を加え、さらに、10倍の連続希釈を実施した。そして、50μl の部分試料をトリプシン処理した大豆寒天上に置き、一晩インキュベートした。コロニーを計測し、最終細菌濃度を決定した。これらの分析の結果を、図9e（E．coli J5 ）と図9f（E．coli 0111:B4）に示した。これら図に見られる通り、BPI 機能領域ペプチドBPI.３は、E．coli J5細菌に対して強い抗菌活性を示したのに対して、E．coli 0111.B4に対してはほとんど活性が認められなかった。実施例14 BPI 機能領域混合ペプチドの調製実施例９に記載の固相化学法を用いて混合ペプチドを調製した。これらペプチドの配列を、以下の表４に示した。BPI.７、BPI.９、BPI.10と命名したペプチドは、あるBPI 配列の一部あるいは偶数個の反復を表していることが伺える。具体的には、アミノ酸90-99 を含む20-merを含むBPI.７は、一つの線状ペプチド鎖に二つが含まれている。BPI.10は、一つの線状ペプチド鎖に、アミノ酸残基 94-99 、 90-99、 90-99ならびに 93-99、 90-99、 90-99それぞれを含む（BPI.10.1と命名した、配列番号：55の）25-merと（BPI.10.2と命名した、配列番号：65の） 26-merの約50：50の混合物を含む。BPI.９は、一つの線状ペプチド鎖に、アミノ酸残基 94-99に続いて残基 90-99を含んだ16-merを含む。これらペプチドを、上記した実施例10−13に記載したBPI 活性検定に適用した。実施例10ならびに図６に記載したヘパリン結合検定にて、BPI.７は非常に高いヘパリン結合力を示した。実施例11ならびに図7aと7bに記載したヘパリン中和検定にて、BPI.７は、rBPI₂₃と比較して、非常に高いヘパリン中和効果を示した。実施例12ならびに図8aと8bに記載したLAL 検定にて、BPI.７は高いLPS 阻害特性を示した。実施例13ならびに図9a-9dに記載した放射拡散プレートを用いた殺菌性検定にて、BPI.７、BPI.９、BPI.10.1およびBPI.10.2は殺菌活性を示し、そして、培地検定におけるE．coli のラフならびにスムース双方の様々な株に対して、BPI.７、BPI.９、BPI.10.1およびBPI.10.2は強い殺菌活性を示した。BPI.10ペプチドは、いずれの細菌株に対しても、最も強い殺菌活性を示した。ペプチドBPI.７とBPI.10で認められたこれら殺菌活性の結果は、BPI ドメイン IIペプチド KWKAQRRFLK（すなわち、BPI.８、配列番号：８）の線状マルチマー( BPI.10.1およびBPI.10.2) の混合物と線状二量体(BPI.7)は、E．coli 株J5に対して殺菌活性を有したのに対し、単量体(BPI.8)は実質的に殺菌活性が無かったことを示している。さらに、アミノ酸94-99 、90-99を含むBPI.９の二量体ペプチドならびに多量体ペプチドは、より強い殺菌活性を示した。これら結果に基づいて、実施例９に記載の方法を用いて、表４に示した他のペプチドを合成した。実施例15 機能領域混合ペプチドの殺菌活性実施例14に記載のBPI 機能領域混合ペプチドを、前記実施例２ならびに13に記載の放射拡散分析に用いた。その結果を、図10a-10e に示した。図10aに示した結果は、ドメインIIペプチド(アミノ酸90-99)の一つのコピーを含むBPI.８は、1 000μg/mlの濃度で、E．coli J5細胞に対して検出可能な殺菌活性は有していなかった。これとは対照的に、ドメインII1ペプチド(アミノ酸148-161)の一つのコピーを含むBPI.13は、30μg/mlを超える濃度で、相当の殺菌活性を示した。ドメイン III単量体BPI.13の二つのコピーを含むBPI.29は、より大きな殺菌活性をし、また、ドメインIIペプチドBPI.８とドメインIIIペプチドBPI.13の混合線状ペプチドは、J5細胞に対して、BPI とほぼ同等の最も高い殺菌活性を示した。図10bには、BPI.８、BPI.７およびBPI.10を含むドメインIIペプチドを用いた実験の結果を示している。（表８の要約も参照のこと。）BPI.８は、1000μg/ml の濃度で、E．coli J5細胞に対して殺菌活性は有していなかったが、BPI.７とBP I.10の混合ペプチドは、高レベルの殺菌活性を示した。これらBPI 機能領域ペプチドの殺菌性範囲を研究するために、標的細胞として様々な他の細菌を用いて、他の実験を行った。図10cは、E．coli 株 07-K1を用いた放射拡散実験の結果を示すものである。これら実験にて、rBPI₂₃は、100μg /mlの濃度で殺菌活性は認められず、1000μg/mlの濃度でも低い殺菌活性しか認められなかった。同様に、ドメインII(DII)単量体を含むペプチドBPI.８ならびにドメインIII(DIII)単量体を含むペプチドBPI.13は、BPI.13の活性の量ががrBP I₂₃のそれより大きいにもかかわらず、低レベルの殺菌活性しか認められなかった。驚くべきことに、ドメインII(DII)二量体BPI.７とドメインII−ドメインIII (DII-DIII)ヘテロ二量体BPI.30は高い殺菌活性を示し、そして、ドメインIII二量体BPI.29は緩慢な殺菌活性を示した。これら結果は、ここで同定されたBPI 機能領域のペプチドが、BPI 分子の殺菌活性とは質的に異なる殺菌活性を有していることを実証している。図10d と10e は、本明細書に記載したホモ−ならびにヘテロ二量体が、感受性細菌とは質的にも量的にも異なる殺菌活性スペクトルを有していることをさらに実証している。図10d は、Klebsiella Pneumoniae 細菌を用いた放射拡散分析の結果を示している。DII-DIIIヘテロ二量体BPI.30は、この細菌に対して最高の殺菌活性を示し、DIIIホモ二量体BPI.29は、緩慢な活性レベルを示し、また、DII 二量体(B PI.7)とDIII単量体(BPI.13)は低レベルの活性を示した。DII 単量体を含むBPI. ８は、800μg/mlの濃度でも殺菌活性を示さず、このことは試験したE．coli株で見られたこのペプチドの殺菌活性の欠如と符合するものである。図10e は、グラム陽性細菌であるStaphylococcus aureus を用いた放射拡散実験で認められた殺菌活性のレベルを示している。DII-DIIIヘテロ二量体BPI.30は、この細菌に対して最高の殺菌活性を示し、DIIIホモ二量体BPI.29は、緩慢な活性レベルを示し、また、DII 二量体(BPI.7)とDIII単量体(BPI.13)は低レベルの活性を示した。DII 単量体を含むBPI.８は、800μg/mlの濃度でも殺菌活性を示さず、このことは試験した他の細菌で見られたこのペプチドの殺菌活性の欠如と符合するものである。これら結果は、本明細書で開示したホモ−ならびにヘテロ二量体が、殺菌活性が検出されるために必要なペプチドの活性量ならびに最小有効濃度の双方に関して変化する、様々な程度の殺菌活性を呈することを示している。また、これら結果は、BPI の殺菌活性とは量的に、そして驚くべきことに質的にも相違する活性であることを示している。実施例16 BPI 機能領域混合ペプチドの他の殺菌活性実施例15に開示した実験結果を考慮し、他の細菌ならびに微生物に対するドメインII−ドメインIII混合ペプチドの殺菌活性を、BPI ドメインIIペプチドならびにBPI ドメインIIIペプチドの殺菌活性と比較した。上述した以下のBPI 機能領域ペプチドを、放射拡散殺菌活性（実施例２）および上記実施例15にも記載した培地殺菌活性（実施例13 ）に用いた。これら結果を、図11a-11q に記載した。これら図面には、以下の細菌株を用いた殺菌性検定の結果を記されている。これら実験の結果を、以下にまとめた。試験したBPI ペプチドのいずれにも、 Serratia marcescens(図11f)あるいは Protus mirabilis(図11g)に対する殺菌活性は認められなかった。BPI.８は、約2000pmolにまで濃度を上げても、試験した生物に対する殺菌活性は認められなかった。BPI.13とBPI.30では、Pseudomonas aeruginosa(図11a)、E．coli 018:K1:H7(図11b)、Klebsiella Pneumoniae(図11c )およびE．coli 075(図11d)に対する殺菌活性は認められなかった。さらに、BPI.30は、Salmonel la typhurium(図11h)、そして培地検定にてE．coli 086a:K51(図11j)とE．coli 04:K12(図11k)に対して殺菌活性を呈した。BPI.23は、放射拡散分析にて、E．co li 086a:K61(図11i)に対して殺菌活性を呈した。また、BPI.30は、ヒトの血清にて、E．coli 086a:K61(図111)に対して殺菌活性を呈した。本発明によって提供されたBPI ペプチドの殺菌力を、グラム陽性細菌に対しても試験した（表８Ａ参照）。驚くべきことに、試験したBPI ペプチドは、約20から約2000pmolの範囲の量にて、Staphylococcus aureus(図11e)、Streptococcus pneumonia (図11m)、Bacillus megaterium(図11n)を用いた放射拡散分析にてある程度の殺菌活性を示した。これら結果は、抗生物質ゲンタマイシンならびにバンコマイシン（図11o)の殺菌活性と匹敵していた。加えて、対数増殖期にあるS ．aureus ATCC 19640のような増殖期中のグラム陽性細菌に対する効果についてもペプチドを試験した。BPI.13、BPI.10、BPI.48およびBPI.120は、これら増殖期にある細菌に対して活性を呈する代表的なペプチドである。最も驚くべきことに、あるペプチドBPI.13は、Candida albicans(図11p と11q )を用いた培地検定にて、殺真菌活性を示した。これら図面にあるように、BPI.1 3の活性は、BPI.２、BPI.29、BPI.30およびBPI.48よりもさらに低いレベルと明確に識別できる。表８Ｂに示した通り、他のペプチドにおいてC．albicans に対する活性が認められている。これら結果は、本発明のBPI 機能領域ペプチドが、天然BPI に関して先に報告された活性とは、質的に異なる抗微生物活性を有することを実証している。実施例17 BPI 機能領域混合ペプチドのヘパリン中和活性実施例14で調製したBPI 機能領域混合ペプチドのin vitroならびにin vivo でのヘパリン中和力を、ヘパリン処置した血液および血漿の凝固時間に関するヘパリンの阻害効果を中和するこれらペプチドの性能を検定することにより決定した。 In vitroにて、BPI 機能領域混合ペプチドの効果を、活性化局部トロンビン活性化時間(APTT)のヘパリン介在による伸長に関して決定した。APTTは、治療のために投与したヘパリンのような、トロンビン形成の内因性あるいは外因性阻害体の存在によって長くなる。このように、ヘパリンの抗凝固効果を中和する薬剤は、試験によって測定したAPTTを短縮するであろう。クエン酸化したヒトの血漿(2 00ml)を、15μl の希釈剤(0.15M塩化ナトリウム、0.1M Tris-HCl 、pH 7.4)あるいは25μg/mlのヘパリン(187単位/mg)も含む15μl の希釈剤のいずれかと共に、 37℃で、１分間インキュベートした。15μl の様々な濃度(0.0から56μg/ml)のr BPI₂₃、rBPI₂₁Δcys、あるいはBPI 混合ペプチドBPI.29（DIIIホモ二量体）およびBPI.30(ヘテロ二量体 DII+DIII)を添加し、即座に、トロンビン試薬（カタログ No.845-4 、Shigma Chemical 社、セントルイス、ミズーリ州）の 100μl を添加した。BBL Fibrometer（Becton Dickenson Microbiology System 社、コッキィースビル、メリーランド州）を用いて凝固時間（トロンビン時間）を測定した。その結果を、図12a 、12b および12e に示した。図12a は、ヘパリンにより伸長したAPTTに、rBPI₂₃あるいはrBPI₂₁Δcys の様々な量を添加して生じた相対減少を示している。これら結果は、これらBPI-関連タンパク質のそれぞれが、AP TTのヘパリン介在による伸長を支持するものである。図12b は、BPI 混合ペプチドBPI.29とBPI.30も、APTTのヘパリン介在による伸長を阻害することを示している。図12e は、非対数目盛でのBPI.30によって得られた結果を示す。図12g は、この検定におけるヘパリン処置した血液の凝固時間に関して、BPI.29 、BPI.30およびBPI.７が最大の効果を呈することを示している。この検定におけるヘパリン処置した血液の凝固時間の減少に関して、BPI.３とrBPI₂₃ではわずかなに、また、BPI.14、BPI.２、BPI.４、BPI.５、BPI.７、rBPI₂₅、rBPIおよびrB PI₂₁Δcys のすべてでは、ほとんど効果が認められなかった。ヘパリン処置したラットでのAPTTに関する例示したBPI 混合ペプチドのzn viv o効果を決定し、rBPI₂₃でのin vivo効果と比較した。APTTは、治療のために投与したヘパリンのような、トロンビン形成の内因性あるいは外因性阻害体の存在によって長くなる。ヘパリンの抗凝固効果を中和する薬剤は、この試験によって測定したAPTTを短縮するであろう。NIH のガイドラインに沿って飼育したSprague- Dawleyラットに、尾の静脈から丸薬の点滴静注によって 100単位/kgのヘパリンを投与し、rBPI₂₃と比較して量を変化させた試験タンパク質あるいは対照タンパク質を５分後に投与した。試験タンパク質あるいは対照タンパク質を投与して２分後に、腹部大動脈から採取した血液試料からAPTTを決定した。未処置動物ならびにBPI ペプチドでのみ処置した動物のAPTTも決定した。図12c では、局部トロンボプラスチン時間のヘパリン介在により伸長のrBPI₂₃阻害の用量依存性を示し、約５mg/kg の投与によれば、ヘパリン処置とBPI-処置した動物のAPTTは、未処置対照動物のそれとほとんど同等であることを示している。BPI.10ペプチドの投与は、ヘパリン処置した動物でのAPTTが、BPI.10のみで処置した対照動物でのAP TTと実質的に同等であった。BPI.30を用いて同様の結果が得られた(図12f)。これら結果は、BPI 機能領域混合ペプチド（例えば、BPI.10とBPI.30）および rBPI₂₃が、凝固プロテアーゼのヘパリン阻害を効率良く中和することを示している。これら特徴に基づいて、本発明のBPI 機能領域混合ペプチドは、プロタミン硫酸に関して推薦された一般的な用量にて、ヘパリン抗凝固効果を臨床的に中和する上で有用であると考えられるが、その物質が、降圧効果ならびにアナフィラキシー様効果までをも備えることは期待できない。実施例18 BPI 機能領域置換変異ペプチドの調製ならびに機能活性分析機能領域IIおよびIIIから得たペプチドに関して得られた結果は、これらペプチドでの機能的に重要なアミノ酸をさらに決定する動機付けとなった。従って、ドメインIIおよびIIIのアミノ酸配列を含む一連のペプチドを、アラニン残基で置換した。置換実験に用いたドメインペプチドの詳細を、図13（ドメインII：IK ISGKWKAQKRFLK、配列番号：７）と図14（ドメインIII:KSKVGWLIQLFHKK、配列番号：13）に示した。これら一連のペプチドを、先の実施例ですでに述べた、Limu lus 遊走細胞溶解検定(LAL)にて、ヘパリン結合親和性(K_d )、ヘパリン結合性(H ep-CAP)およびLPS 中和活性を、そして、同じく先の実施例ですでに述べた、放射拡散分析(RAD)を用いたE．coli J5に対する殺菌活性を決定するために試験を行った。表５（ドメインII）ならびに表６(ドメインIII)に示した結果は、BPI 機能領域IIならびに機能領域IIIペプチドとそのアラニン置換変異ペプチドとの間での、これら分析（相対的相違としているLAL 分析を除く）での活性の倍数単位の相違に関して表現してある。ドメィンIIペプチドでは、ほとんどのアラニン置換ペプチドで、放射拡散分析での殺菌活性が、約２から10倍減少した。この総合的なパターンの例外として、 BPI.19(Gly₈₉→Ala₈₉)、BPI.22(Lys₉₂→Ala₉₂)、BPI.23(Gln₉₄→Ala₉₄)、および BPI.24(Lys₉₅→Ala₉₅)がある。これとは対照的に、LAL 分析では、ほとんどのアラニン置換ペプチドでは大差はなかったが、BPI.17(Ile₈₇→Ala₈₇)、およびBPI. 21(Trp₉₁→Ala₉₁)では、この分析にて、活性の緩やかな減少と大幅な減少が認められた。BPI.21では、これら結果は、このペプチドの殺菌活性が10倍以上減少したことと符合するものであり、また、91位のアミノ酸（自然配列でのトリプトファン残基）が、ペプチドの生物学的活性において特に重要であることを示すものである。たいていの場合、ヘパリン結合性と結合力に関するアラニン置換の効果は、未置換ペプチドの２倍程度に満たないものである。一つの例外として、未置換ペプチドよりも４倍もの減少を示したBPI.21のヘパリン結合能力がある。このことは、これらペプチドの様々な活性の一つであるTrp₉₁での置換に対する感受性に係る初期の結果を支持するものである。たいていの場合、ヘパリン結合性ならびにヘパリン結合力双方のK_d に関する効果は同様であり、また同じ大きさであった。ある事例では、K_d がわずかに増大したり(BPI.18;Ser₈₈→Ala₈₈)、あるいはわずかに減少したり(BPI.24)したものの、置換ペプチドのヘパリン結合力は減少した。K_d が増大したり（BPI.20;Lys₉₀→Ala₉₀)あるいは減少したり(BPI.19)しても、その結合力に変化が無かった事例もある。ある事例では、親和性が何らの影響も受けずに残存し、結合力がほぼ２倍減少したものがあった(BPI.25;Arg₉₆→A la₉₆)。これら結果は、ドメインII配列(Trp₉₁)に少なくとも一つの重要な残基があり、ドメインIIペプチドの活性が、他のドメインIIアミノ酸残基のアラニン置換によって、ほとんどの部分が、最小限の影響しか受けていないことを示している。ドメインIIIペプチドでは、ほとんどのアラニン置換ペプチドで、放射拡散分析での殺菌活性が、約２から５倍減少した。この総合的なパターンの例外として、BPI.35（Gly₁₅₂→Ala₁₅₂）、BPI.39(Gln₁₅₆→Ala₁₅₆)、BPI.42（His₁₅₉→Ala₁ ₅₉ ）、およびBPI.44（Lys₁₆₁→Ala₁₆₁）がある。LAL 分析では、ほとんどのアラニン置換ペプチドでは大差はなかったが、BPI.31（Lys₁₄₈→Ala₁₄₈）、BPI.32（ Trp₁₄₉→Ala₁₄₉）、BPI.33（Lys₁₅₀→Ala₁₅₀）、およびBPI.34（Val₁₅₁→Ala₁₅₁ ）では、この分析にて緩やかなLPS 結合活性が、また、BPI.36（Trp₁₃₃→Ala₁₃₃ ）およびBPI.40（Leu₁₅₇→Ala₁₅₇）では、この分析にて大きなLPS 結合活性が認められた。BPI.36とBPI.40双方では、これら結果は、これらペプチドの殺菌活性が５倍以上減少したことと符合するものであり、また、自然配列での疎水性のTr p₁₅₃とLeu₁₅₇が、ペプチドの生物学的活性において特に重要であることを示すものである。ヘパリン結合性と結合力に関するアラニン置換の効果は、未置換ペプチドの５倍程度に満たない大きさである。ドメインIIアラニン置換ペプチドでの知見とは異なり、たいていの場合、ヘパリン結合性ならびにヘパリン結合力双方のK_d に関するアラニン置換による効果のタイプは同様であり、また同じ大きさであった。ある事例（BPI.42;His₁₅₉→Ala₁₅₉）では、K_d がわずかに減少しても（1.2倍）、ヘパリン結合力に変化が無かった。ある一つの事例のみで、ヘパリン結合性ならびにヘパリン結合力双方のK_d はわずかに増大し（BPI.35;Gly₁₅₂→ Ala₁₅₃）、その増加率はわずか10％であった。ドメインIIアラニン置換ペプチドでの結果と同様、ドメインIII 配列に少なくとも一つの重要な残基（Trp₁₅₃）があり、また他に少なくとも一つの残基（Leu₁ ₅₇ ）の重要性が残されている。ドメインIIアラニン置換ペプチドとは異なり、この結果は、置換したもののほぼ半分が、試験で得られた活性において少なくとも２倍の差異があることを示している。６つの事例において、試験した４つの活性がすべて減少しており、また、10個の殺菌活性での事例において、ヘパリン結合性ならびにヘパリン結合力のK_d が減少した。一つの事例（BPI.35;Gly₁₅₂→Ala₁ ₅₂ ）のみに、殺菌力、ヘパリン結合性K_d 、およびヘパリン結合力において、わずかではあるが、その活性の増大が認められた。これら結果は、疎水性アミノ酸残基Trp₉₁、Trp₁₅₃およびLeu₁₅₇のアラニン置換が、これらBPI 機能領域置換ペプチドの活性に大きな効果を付与することを示すものである。この結果は、rBPI₂₃のカチオン特性からして、予期できないものである。実際のところ、リシンがアラニンもしくはフェニルアラニンで置換されたドメインIIアラニン置換ペプチド（例えば、BPI.24、BPI.73）は、劇的な活性の向上を呈している。表６Ｂに示したように、殺菌活性は呈するものと考えられるが、トリプトファン(Trp₁₅₃)の置換は真菌の殺菌活性には影響を及ぼさなかった。放射拡散試験での置換（BPI.39;Gln₁₅₆→Ala₁₅₆）にて８倍以上の測定値減少によって実証されたように、グルタミンは真菌の殺菌活性において重要な役割を担うものであると考えられる。実施例19 BPI 機能領域ペプチドの生物学的活性の要旨ペプチドの構成種類別の分布を、以下の表７に記した。本発明のBPI 機能領域ペプチドあるいはその典型的なサブペプチドを、以下の生物学的活性、すなわち、グラム陰性ならびにグラム陽性細菌、および他の特定の微生物に対する殺菌活性、LPS 結合性ならびにLPS 中和活性、およびヘパリン結合性ならびにヘパリン中和活性について分析した。 BPI 機能領域ペプチドを、実施例８および６のそれぞれに記載したE．coli J5 細菌に関する殺菌活性ならびにヘパリン中和活性について分析した。グラム陰性細菌E．coli J5（ラフ）ならびにE．coli 0113（スムース）およびグラム陽性細菌S．aureusに対する、本発明の例示的に示したペプチドに関する分析の結果を表８Ａに示した。殺菌活性は、30mm²の殺菌面積を生成するに必要なペプチドの量(pmol/ウェルおよびμg/ウェル)として表現した。既定変数としての殺菌活性および予定変数としてのヘパリン結合力と親和性(K_d )を用いて多重回帰解析を行って、代表的なBPI 機能領域ペプチド間の関連性を研究した。この解析にて、ヘパリン結合力のみが、殺菌活性と顕著に関連していること（ヘパリン結合力、ｐ＝0.0001、およびヘパリン親和性、ｐ＝0.6007）が示された。換言すれば、ペプチドが最大量結合するヘパリンの量（すなわち、結合力）は、殺菌活性と密接な関連性を有しており、また、ヘパリン滴定（すなわち、親和性）にて50％飽和に達するまでの時間と関連しないのである。LPS 結合拮抗性ならびに中和活性に関するデータから、ヘパリン結合力から殺菌活性が最も容易に予測できることも明らかとなった。例えば、BPI.７、BPI.29、BPI.30 、BPI.46、BPI.47、BPI.48、BPI.63、BPI.65（還元）、BPI.69、BPI.73、BPI.58 、MAP.１およびMAP.２は、非常に大きなヘパリン結合力を呈するだけでなく、高い殺菌活性も有していた。多重抗原性ペプチド（MAPペプチド）は、Posnett and Tam，1989，Methods in Enzymology 178，739-746に記載された分枝リシン核に関する多重結合のペプチドである。これとは逆に、BPI.２、BPI.４、 BPI.８、BPI.14、BPI.53およびBPI.54のヘパリン結合力は小さく、よって、殺菌活性はほとんどあるいは全く認められない。 BPI 機能領域混合ペプチドBPI.30（ドメインII−ドメインIIIペプチドを含む）ならびにBPI.74（ドメインIII-ドメインIIペプチドを含む）を、グラム陰性ならびにグラム陽性細菌に対する殺菌活性、およびヘパリン結合性ならびに中和活性に関して比較を行った。これらの結果は、混合ペプチドの構成順序を変えることで、相対活性レベルの変化が確認された。例えば、BPI.74は、BPI.30と比較して、殺菌活性が大きく減少していた。具体的には、BPI.74はE．coli J5 細菌に対する殺菌活性が10倍も低く、E．coli 0111:B4細菌に対する殺菌活性では50倍の低さ、そして、S．aureus に対する殺菌活性は 3.5倍の低さであった。ヘパリン結合力が２倍低下したこと、ならびにヘパリン親和性が２倍増大したことも観察された。他の殺菌性ならびに内毒素結合性タンパク質も、ヘパリン結合力について試験した。セクロピンＡ、マガイニンIIアミド、ポリミキシンＢペプチド、およびLi mulus 抗-LPS因子(LALF)を、実施例３に記載の直接ヘパリン結合検定法にて分析した。マガイニンIIアミド(Sigma社、セントルイス、ミズーリ州)は、セクロピンＡ(Sigma社、242ng/２μg，K_d=395nM)、LALF(Assoc．of Cape Cod、ウッズホール、マサチューセッツ州、195.3ng/２μg ペプチド，K _d=1.29μM)、およびPM Bペプチド(Bachem Biosciences 社、フィラデルフィア、ペンシルベニア州、58. 0ng/２μg ペプチド，K _d=309mM)と比較して、極めて高いヘパリン結合力を示した(437.7ngヘパリン／２μg ペプチド、K_d=3.17μM)。マガイニンIIアミドは、第８、13および15位がアラニンで置換された、マガイニン天然配列の置換変異体である。マガイニンIIアミドは、その天然配列よりも、小さな溶血活性を有していると報告されている。上記した結果は、BPI ペプチドのデータにより実証されたヘパリン結合性、LP S 結合性、および殺菌活性との間の関連性を示唆するものであり、他のLPS 結合性タンパク質もヘパリンに結合することを示唆するものである。より活性な殺菌性タンパク質である、セクロピンＡとマガイニンIIアミドは相応じて、他の一連のLPS 結合性タンパク質の中でも最高のヘパリン結合力を有している。 BPI 機能領域ペプチドの付加変異体のあるタイプは、BPI 機能領域ペプチドのアミノあるいはカルボキシ末端のいずれかに、D-アラニン-D- アラニンを組み込んだものである。この方法によれば、D-アラニンを付加することで、グラム陽性細菌に大きな殺菌活性を付与できる。グラム陽性細菌での細胞壁の生合成は、D- アラニン-D- アラニンに特異的に結合し、利用するトランスペプチド反応を含む。ペニシリンのようなβ−ラクタム抗生物質は、効率良くこれと同じ反応を阻害する。活性殺菌性ペプチドへのD-アラニン-D- アラニン組み込みは、グラム陽性細菌の活発の成長している細胞壁をペプチドの目標とすべきである。 BPI 機能領域ペプチドのドメインII置換において、Ly₉₅をアラニンで置換することにより(BPI.24)、予想もしない改善が認められた。引き続いて第95位のフェニルアラニンを置換することで(BPI.73)、アラニン置換体と比較して改善された活性が認められた。驚くべきことに、D-Phe で95位を置換したもの(BPI.76)は、出発ペプチド(BPI.2)よりも低レベルの活性にまで、劇的に減少した。この異性体効果は、このペプチドの相互作用が立体特異的であり、BPI.73がBPI.76と比較してより活性な立体配座に適合できることを示すものである。かような立体特異性、特に、他の残基でこの現象が研究された後でのこの立体特異性は、薬作用発生団の開発のための重要な決定を促す。本明細書で定義したBPI の機能領域から誘導したペプチドは、疎水性アミノ酸（特に、トリプトファン）が至適活性を得る上で最も重要であると決定するための利用されてきた。この知見は、BPI のカチオン性からして予想できないものである。実際のところ、ドメインIIでは、リシンがアラニンあるいはフェニルアラニンで置換された場合、そお活性は劇的に増大する（BPI.24、BPI.73）。機能領域ペプチドを組み合わせることで、最も活性のある置換ペプチドを三つのドメインから選択したものの組み合わせを含めて、各ペプチドの活性強度は増大される。新たに合成したペプチドそれぞれの純度を、VYDAC C-18カラム（25cm×4.6mm 、５μm 粒径、30nm孔径、Separation Group社、ヘスペリア、カリフォルニア州）を用いた分析用逆相HPLCによって決定した。水中の５％アセトニトリル/0.1％トリフルオロ酢酸(TFA)を移動相Ａとし、また、80％アセトニトリル/0.065％TFA を移動相Ｂとして、HPLCを実施した。溶出物を、分光光度計を用いて、220nm にて測定した。流速は、1.0ml/分であった。勾配溶出条件は、各ペプチドが好適に分解されるように選択した。純度を、全ピーク面積に占める主要ピークの面積の割合で表現した（表10参照）。新たに合成したペプチドの純度と同定を、VG B iotech Bio-Q質量分析計を用いて電子噴射イオン化質量分析によって決定した。表10には、質量分析ならびにHPLCによる、例示的に示した本発明のペプチドの純度解析の結果のまとめを示した。 BPI.13ならびに他の選択したペプチドを、半調製逆相 VYDAC C-18カラム（25cm×10mm、10μm 粒径、30nm孔径）を用いて精製した。BPI を精製するために、以下の勾配を用いた。すなわち、流速2.0ml/分にて、26.7％Ｂ〜 33％Ｂ／30分。BPI.13を移動相Ａに8.8mg/mlの濃度で溶解し、0.5ml の量を注入した。注射を３回実施し、各注射での主要ピークを回収した。回収物をまとめ、 SpeedVacを用いて蒸発乾燥した。得られた物質（精製したものをBPI.13と称する）の純度を、解析用逆相システムと上述した勾配溶出条件を用いて決定した。この解析にて、BPI.13は98％の純度であった。BPI.13の純度と同定を、VG Biotech Bio-Q質量分析計を用いて電子噴射イオン化質量分析によって決定した。見かけの分子量は、1711.0（推定分子量は、1711.1）であった。質量分析にて、不純物は検出されなかった。BPI.13の復元率は55％であり、出発物質の69％が所望のペプチドであったものと考えられる。上述したようにして、本発明のペプチドをさらに精製した場合、ペプチド、例えば、BPI.13P とBPI.30P の生物学的活性の大きさは、化学純度が増大した時に、増大することが認められた。このことは、観察された生物学的活性がペプチドそれ自体によるものであることを示すものである。特に、ペプチド調製物の純度が98％にまで増大することで、約69％の純度のBPI.13による Candida albicans （実施例16を参照のこと）の完全に新規で予想だにしなかった抗真菌活性はさらに改善された。実施例20 結合性分析ならびに中和分析を用いた BPI 機能領域ペプチドの解析Ａ．LPS 結合性分析 BPI 機能領域ペプチドをLPS 結合性分析に適用した。まず、これら分析を、Gazzano-Santro et al.,前出に記載されているようにして行った。すなわち、E．coli 株J5リピドＡの懸濁液を超音波処理し、0.2μg/m lの濃度になるまでメタノールで希釈し、その50μl をウェル（Immulon 2 Remov awell Strips、Dynatech社）に吸収させた。37℃での一晩のインキュベートに続いて、37℃で、３時間、D-PBS/0.1% BSAの溶液215μl でウェルをブロッキングした。その後、ブロッキング緩衝液を廃棄し、ウェルをD-PBS(D-PBS/T)中の0.05 ％ Tween-20の溶液で洗浄し、D-PBS/T 中の[¹²⁵I]-rBPI₂₃の溶液50μl を用いて、４℃で、一晩インキュベートし（9.9μCi／μg の比活性で、234,000 cpm の総数）、そして、BPI 機能領域ペプチドの濃度を増大した。このインキュベーションの後、D-PBS/Tでウェルを３回洗浄し、結合した放射能をガンマカウンターを用いて計測した。D-PBS/BSA で処置した処置したウェルへの結合は、非特異的なバックグラウンドの結合と考えられ、これは特異的に結合した放射能を生成するために各ウェルに結合した全放射能から差し引かれる。これら実験の結果を、図17a(各ペプチドの濃度をnMで示した)と図17b(各ペプチドの濃度をμg/mlで示した)に示した。未標識rBPI₂₃を用いた拮抗実験を、比較のために示した。これらの結果は、試験したペプチドのすべてが、rBPI₂₃により、程度は異なるものの、LPS 結合性を拮抗することを示した。二倍量の[¹²⁵I]-rBPI₂₃(10μCi／μg の比活性で、454,000cpm の総数)を用いて、全血の有無の下で、rBPI₂₃によるBPI.10のLPS 結合親和性と比較しながら、この実験を繰り返した。図18に示した結果にあるように、モル基準にて、BPI.10 が、この分析で放射標識したrBPI₂₃で拮抗したrBPI₂₃と同等の強度である２の因子に属することが実証された。総数225,000 cpm の[¹²⁵I]-rBPI₂₃が用いられたこと、リピドＡが 0.5mg/ml の濃度で使用されたことを除いて、上述した実験と同様にして、ペプチドBPI.７、BPI.29およびBPI.30を用いて実験を繰り返した。図19に示した結果にあるように、モル基準にて、これらペプチドが、リピドＡに結合した未標識のrBPI₂₃よりも、６から10倍劣った強度しか有していないことが実証された。 BPI 機能領域ペプチドBPI.２、BPI.３、BPI.４、BPI.５、BPI.７、BPI.13、BP I.14、BPI.29、BPI.30およびBPI.48、ならびにこれら分析での対照としてのrBPI 、rBPI₂₁Δcys およびrLBP₂₅を用いた拮抗試験にて、放射標識した組換えLPS 結合タンパク質([¹²⁵I]-rLBP)を放射標識したrBPI₂₃に代えて使用したことで、第二の結合検定を実施した。これら実験にて、リピドＡを、メタノール中で0.7μg /mlの濃度でウェルに吸収させた。放射標識したrLBP（3.45μCi／μg の比活性で、 650,000 cpmの総数）のインキュベーションを、連続的に増大せしめた濃度のBPI ペプチドの存在下で、37℃で、2.5時間実施した。これらの結果を、図20a と図 20b に示した。IC₅₀値（すなわち、放射標識したrLBP₂₅のリピドＡ結合が、ペプチドが無い場合に達成した値の半分にまで阻害される濃度）を、表11に示した。三番目の結合分析にて、ヒトの内皮細胞(HUVEC)でインキュベーションした、放射標識したLPS へ結合するBPI 機能領域ペプチドの能力を試験した。この検定では、HUVEC 細胞にBPI ペプチドが一旦結合した LPSへの結合力を測定した。HU VEC 細胞を、D-PBS/BSA の500μl の溶液にて、１μg/mlあるいは３μg/mlのいずれかの濃度の様々なBPI ペプチドの存在下、４℃で、３時間インキュベートした。このインキュベーションに続いて、細胞を氷冷したD-PBS/BSA で二回洗浄し、D-PBS/BSA中の[¹²⁵I]-RaLPS(4.6×10⁶cpm／μg の比活性で、340,000 cpmの総数)の500μl の溶液にて、４℃で、さらに 2.5時間インキュベートした。ウェルをD-PBS/BSA で三回洗浄し、１Ｍの水酸化ナトリウムの 500μl で可溶化し、そして溶解物をガンマーカウンターで計測した。図21に示したこれら結果は、BPI.29とBPI.30がHUVEC 細胞に結合する一方で、LPS への結合力を保持していることを示している。Ｂ．TNF 細胞毒性を用いたBPI 機能領域ペプチドの LPS 中和活性スクリーニング分析腫瘍壊死因子(TNF)細胞毒性分析を用いて、LPS 中和活性のためのスクリーニング検定を行った。ビタミンＤを補充した培地で成長したヒト単球細胞系（THP- 1:受託No．TIB202、American Type Culture Collection、ロックヴィル、メリーランド州）は、LPS で刺激することで、TNF を用量依存性で生成する。マウス繊維芽細胞(L929 細胞；ATCC No．CCL1)は、TNF-媒介した細胞の殺傷に感受性があり、この細胞殺傷性も用量依存性である。このように、L929細胞の細胞殺傷性の程度は、THP-1 細胞と接触する遊離LPS の量の感受性の指標でもある、THP-1 細胞でのTNF 誘発の程度に関する感受性分析を提供するものである。BPI 機能領域ペプチドあるいはrBPI₂₃によるLPS 結合性および中和は、標準化した分析にてL9 29細胞の量を減らすのみならず、生成したTNF の量も減らすTHP-1 細胞に接触した遊離LPS の量を減少せしめる。このように、以下の分析は、本発明のBPI 機能領域ペプチドのLPS 結合性および中和能力を評価するための鋭敏な方法を提供する。 10％ FCSとビタミンＤを補充したRPMI培地(GIBCO、ロングアイランド、ニューヨーク州)にてTHP-1 細胞を、約 150,000細胞／mlの密度になるまで、３日間、攪拌培養した。そして、細胞を、 150,000細胞／mlの密度で丸底96ウェルカルチャープレートに置き、５ng/ml のE．coli 01113 LPSと共に、FCSとビタミンＤのいずれかを欠いたRPMI培地で、37℃で、６時間インキュベートした。対照ウェルにも、濃度を約 0.1μg/mlから約 100μg/mlに変化させて、rBPI₂₃あるいはBPI 機能領域ペプチドを置いた。このインキュベーションの後、細胞をペレット化するために約600×ｇで遠心分離し、50μl RPMI／10％FCS 中のウェル当たり 50,000 のL 929細胞を並列的に調製した96ウェル平底培養皿に、50μl の上清を添加した。皿当たり約 100万個の密度になるまで、L929細胞をRPMI／10％FCS 培地にて単相増殖させ、実験前日に１：２に分割し、そして実験当日に約70％の集密になるよう一晩成長させる。96ウェルプレートに置く20分前に、この70％集密にアクチノマイシンＤを、最終濃度が１μg/mlになるよう添加する。L929細胞プレートを、哺乳類細胞成長のための標準的条件下で、THP-1上清と共に、37℃で、16時間（一晩）インキュベートした。3-[(4,5-ジメチル)-チオゾール-2- イル]-5-(3- カルボキシメトキシフェニル)-2-(4- スルフォニル)-2H- テトラゾリウム（分子内塩）を含む２mlの CellTitre 96(登録商標)AQ_euous溶液（Promega 社、マジソン、ウィスコンシン州）中の100μl のフェナジンメチルスルフォン酸を希釈することで調製した20μl の溶液を各ウェルに添加した。培養基を、37℃で、２− ４時間インキュベートし、そして、490nm(A490)での吸光度を決定するために、分光測光的に解析した。実験結果を、約10ng/ml から約10mg/ml にまでTNF の量を変化させて作成した半対数標準曲線と相関させて評価した。これら実験の結果を、図22a-22h に示した。図22a には、５ng/ml LPS の有無によるL929細胞の培養におけるA490と TNF濃度との間の関連を示している。これら結果は、分析用培地中のLPS の有無にかかわらず、A490とTNF 濃度との間にはほぼ同じ直線の関係が認められた。図22b には、TNF を増量したヘパリンの存在下でL929細胞と共にイキュベートした実験を示している。これら結果は、１ng/ml と0.1ng/mlの濃度の TNFについて、一定で特徴的なA490を示しており、このことは TNFによるL929細胞の死滅にヘパリンが影響していないことを示すものである。図22c は、５ng/m l LPS の存在下にてTHP-1 培養を表示した濃度でインキュベートした場合、rBPI₂₁ Δcys が、死滅したTNF-媒介L929細胞の量を減少せしめたことを示す対照実験を表している。図22d は、L929細胞の死滅分析により測定した、THP-1 細胞によるLPS 刺激したTNF 生成での BPIが媒介した阻害を阻害することで、ヘパリンが rBPI₂₁Δcys と結合するために、LPS と拮抗することを示している。図22e は、TNF が媒介したL929細胞の死滅分析の測定での、A490とTNF との標準曲線であり、図22g は、約３つの対数（約1000倍）のTNF 濃度範囲にわたる半対数記録での、標準曲線の直線性を示している。図22f は、約100,000 THP-1 細胞と少なくとも５ng/ml の濃度のLPS を用いることで、TNF の検出可能な量が最も容易に作りだせる分析でのTHP-1 細胞の依存性を示している。最後に、図22h は、この分析が LPS刺激に応答したTNF のTHP-1 細胞の生成に依存していること、そして、ヒト組織球リンパ腫細胞(U937: ATCC No.：CRL1593)が、THP-1 細胞のための分析で用いても、検出可能なTNF を生成しなかったことを示している。この分析は、本発明のBPI 機能領域ペプチドのLPS 結合性ならびに中和能力を分析するために用いた。これら結果を、図12に示し、そこでは、試験したペプチドが、TNF 媒介したL929細胞の死滅による測定から、THP-1 細胞でのLPS 刺激したTNF の生成を阻害する能力があることを示すものである。Ｃ．細胞性一酸化窒素生成を用いたBPI 機能領域ペプチドのLPS 中和活性スクリーニング分析 BPI 機能領域ペプチドの他のLPS 中和活性スクリーニング分析を、LPS で処置したマウス細胞での一酸化窒素生成に関する分析を用いて実施した(Lorsbach et al.，1993，J．Biol．Chem．268，1908-1913を参照のこと)。この分析にて、マウスのRAW 264.7細胞(ATCC 受託 No．T1B71)を、細菌性LPSで処置した。その細胞を、96ウェルプレートでインキュベートし、そして、γ−インターフェロン、 rLBP、胎児ウシ血清(FBS)または清浄ヒト血清(NHS)、あるいはrBPI₂₁Δcys の有無の下で、E．coli 0113 LPSあるいはチモサンで、２時間にわたって刺激した。このインキュベーションの後、細胞を新鮮な培地で洗浄し、10％ FCSを含んだ培地で一晩インキュベートした。一酸化窒素は、培地に蓄積した細胞から放出され、そして自然に窒素に変換される。その窒素は、添加したスルファニルアミドの一級アミンと反応し、ジゾアニウム塩を形成する。そして、この塩は添加したナフチルエチレンジアミンと反応し、赤系アゾ染料を形成する。グリース反応を、室温にて、約10分間実施した。生成した一酸化窒素の量を、550nm の波長での分光測光による吸光度で決定したグリース反応の標準曲線から見積もった。この分析の結果を、図23a から23c に示した。図23a は、γ−インターフェロンの存在下での一酸化窒素生成の依存性を示している。このインターフェロン効果は、100単位／mlの濃度で飽和することで認められた。図23b は、精製組換えタンパク質として、あるいは細胞インキュベーション培地のFBS あるいはNHS 補充物の成分のいずれかとして添加したLBP の存在に関するLPS 刺激した一酸化窒素の依存性を示している。図23c は、30-100ng/ml のIC₅₀を有する、LPS 刺激した一酸化窒素の、rBPI₂₃が媒介した阻害を示している。これら結果は、この分析が、BPI および本明細書に開示したBPI 機能領域ペプチドのLPS 中和活性を測定するための簡便で、安価で、生理学的精度の高い分析システムであることを実証している。 BPI 機能領域ペプチドを用いて行った分析の結果を、刺激していない細胞による一酸化窒素のバックグラウドの生成を「NO LPS」と称した図24a-24g に示した。図24a と24b には、チモサンおよびLPS それぞれで刺激した一酸化窒素生成の rBPI、rBPI₂₁Δcys およびrBPI₂₅による阻害を示している。チモサン刺激した一酸化窒素生成の阻害は、いずれのBPI タンパク質濃度でも認められなかった(図2 4a)。これとは対照的に、LPS 刺激した一酸化窒素の生成は、これらrBPI関連タンパク質とのインキュベーションによる濃度依存的方法にて阻害された(図24b) 。図24c(チモサン）および図24d(LPS)は、BPI.２、BPI.３、BPI.４、BPI.７およびBPI.14、そして比較のためのrBPI₂₁Δcys とのRAW 264.7 細胞のインキュベーションによる一酸化窒素の生成効果を示している。天然BPIにて認められるように、チモサン刺激による一酸化窒素の生成は、いずれの BPI 機能領域ペプチドのとのインキュベーションによっても阻害されなかった( 高濃度のBPI.７によるわずかな阻害の可能性を除く；図24c)。一方で、LPS 刺激した一酸化窒素生成は、rBPI₂₁Δcys によって効果的に阻害されたが、BPI.３と BPI.７ではわずかにしか阻害されなかった(図24d)。 BPI.５、BPI.13、BPI.29およびBPI.30、そして並行して比較するためのrBPI₂₁ Δcys を用いて実験を繰り返した。RAW 264.7 細胞によるチモサン刺激した一酸化窒素生成は、高濃度（〜100μg/ml）のBPI.30で阻害されたが、他のBPI 機能領域ペプチドならびにrBPI₂₁Δcys による一酸化窒素の生成阻害は認められなかった(図24e)。LPS 刺激した一酸化窒素の生成はrBPI₂₁Δcys によって効率良く阻害され、また本実験にて試験したすべての機能領域ペプチドにより、様々な、小さな阻害が認められた(図24f)。 BPI タンパク質およびペプチドに関するIC₅₀（すなわち、RAW 264.7 細胞によるチモサンあるいはLPS 刺激した一酸化窒素の生成が、阻害剤を使用しない場合の半分にまで低減した時の阻害剤の濃度）を、これら実験結果から算出し、図24 g に示した。BPI.30の場合を除いて、これら実験でのBPI 機能領域ペプチドあるいはrBPI₂₁Δcys 、rBPIあるいはrLBPのいずれについてもチモサン媒介した一酸化窒素の生成の阻害は認められず、チモサン刺激した一酸化窒素の生成の阻害に関するBPI.30のIC₅₀は、10から 100μg/mlの間であった。この分析にて、BPI.３、BPI.５、BPI.13、BPI.29およびBPI.30は、検出可能なLPS 中和レベルを示し、これらペプチドのIC₅₀相対値を図24g に示した。Ｄ．細胞増殖分析を用いたBPI 機能領域ペプチドの LPS 中和活性スクリーニング分析 BPI 機能領域ペプチドの評価のために、他のLPS中和活性スクリーニング分析を行った。LPS で処置したマウス細胞での細胞増殖の阻害のためのこの感受性試験は、標準曲線との併用でヒト血漿中のLPS レベルの定量にも利用できる。この分析にて、10mM HEPES緩衝液(pH 7.4)、２mMのＬ−グルタミン酸、ペニシリン(100単位/ml)、ストレプトマイシン(100μg/ml)、0.075％重炭酸ナトリウム、0.15M 2-メルカプトエタノール、および10％胎児ウシ血清(Hyclone社、ローガン、ユタ州)を補充したRPMI 1640 培地(GIBCO社)にて維持したRAW 264.7 細胞(A TCC 受託 No．T1B71)を、まず、分析の24時間前に、50単位/ml 組換えマウスγ −インターフェロン(Genzyme社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州)の存在下でのインキュベーションにより誘発した。そして、誘発した細胞を機械的に回収し、500×ｇで、４℃で遠心分離し、50mlのRPMI 1640 培地（補充物を含まない）に再懸濁し、さらに、遠心分離とRPMI 1640培地（補充物を含まない）への懸濁を行った。これら細胞の数を計測し、２×10⁵細胞/ml の濃度に調整し、その1 00μl 分画を96ウェルマイクロ滴定プレートの各ウェルに添加した。血清を含まないRPMI 1640 培地での１ng/ml の濃度（この濃度は、LPS 濃度を50pg/ml から 100ng/mlに変化させた滴定実験による結果から得たものである）である100μl/ ウェル分画に添加されたE．coli 0113 LPS(対照標準、Assoc．of Cape God 、ウッズホール、マサチューセッツ州)と共に、これら細胞を約15時間インキュベートした。このインキュベーションは、25ng/ml から50μg/mlに濃度を変化させた BPI 機能領域ペプチドの有無を含めて実施した。組換えヒト BPIを、１μg/ mlの濃度での正の対照として用いた。この分析を開始して５時間後に、１μCi／ウェル[³H]- チミジンの添加により細胞の増殖を定量的に測定した。15時間のインキュベーションの後、細胞用ハーベスター(Inotech Biosystems 社、INB-384 、試料加工ならびにフィルター計測システム、ランシン、ミシガン州)を用いて、標識した細胞をガラス繊維フィルターに回収した。この分析の結果を、図26a-26c に示した。図26a には、血清成分として、あるいは組換えLBP として（１μg/mlの濃度で）反応混合物に添加したLBPの存在下での、RAW 264.7 細胞増殖のLPS 媒介した阻害の依存性を示している。図26b と 26c は、上記分析にて認められたBPI 機能領域ペプチドの挙動パターンを示している。BPI.５は、 5.3± 0.6μg/mlのEC₅₀（すなわち、LPS の成長阻害効率が50 ％に転じる時のペプチド濃度）を示した。BPI.81は、RAW 264.7 細胞に関するLP S の成長阻害効率を好転することはできなかったが、14± 0.2μg/mlのIC₅₀（すなわち、ペプチドを添加せずとも、RAW 細胞成長が50％以上阻害する時のペプチド濃度）の成長阻害を示した。BPI.98は、0.16±0.08μg/mlのEC₅₀と、16.5± 1 .9μg/mlのIC₅₀を示した。そして、BPI.86は、0.13±0.04μg/mlのEC₅₀と、37.5 ±12.5μg/mlのIC₅₀を示した。この分析で試験した各ペプチドに関する結果を、表13に示した。他の代表的なペプチド、例えば、BPI.99からBPI.169も、この分析試験にて活性を示した。その内の一つのペプチド、BPI.157 は、IC₅₀値は低いものの、BPI.29に匹敵するEC₅₀値を示した。Ｅ．全血でのLPS 誘発したTNF 生成の阻害に基づく LPS 中和活性スクリーニング分析本発明のBPI 機能領域ペプチドのLPS 中和活性を、全血に関して以下のようにして分析した。健康なヒトから採取した新鮮な血液を、吸引チューブ(ACD社、ラザフォード、ニュージャージー州)に回収した。血液の分画(170μl)を、2.5ng/m lのE．coli 0113 LPSを含んだ10μl のカルシウムイオンとマグネシウムイオンを欠いたPBS と共に混合し、そして、0.5 から50μg/mlの範囲で濃度を変化させた本発明によるBPI ペプチドの20μl と共に混合した。これら混合物を、37℃で、４時間インキュベートし、55μl の氷冷したカルシウムイオンとマグネシウムイオンを欠いたPBS を添加して反応を停止し、次いで、 500×ｇで、７分間遠心分離を行った。そして、その上清を汎用のELISA キット(Biokine（登録商標）EL ISA Test、T-cell Sciences社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州)を用いて、 TNF レベルに関して分析を行った。二つの異なる採取源から得た全血試料を用いた代表的なペプチドに係るこれら実験の結果を、図27と表14に示した。図27は、BPI 機能領域ペプチドBPI.７、BP I.13およびBPI.29によるTNF 阻害の比較と、参照のためのrBPI₂₁Δcys を用いた結果を示している。これら結果を、IC₅₀として定量して表14に記載し、また上記Ｃ節で記載したRAW 264.7 細胞による一酸化窒素生成を用いた分析によるLPS 中和活性との比較を行った。Ｆ．トリプトファン蛍光消失を用いた LPS およびヘパリン結合分析約280nm から290nm 、好ましくは、 285nmの波長の光で励起すれば、天然のアミノ酸トリプトファンは、300nm から400nm の波長の光（すなわち、蛍光）を発する。かような蛍光により生じた発光量は、pHおよび緩衝液条件、ならびにタンパク質と他の分子との間の相互結合作用を含めた条件によって作用されることが知られている。ドメインIIとIII から誘導したあるBPI 機能領域ペプチドはトリプトファン残基を含んでおり、トリプトファン蛍光は、本発明のBPI 機能領域ペプチドとLPS あるいはヘパリンとの間の相互結合作用を検定するために用いた。本発明のBPI 機能領域ペプチドのトリプトファン蛍光を、LPS あるいはヘパリンの有無によって、SPEX Fluorolog蛍光計を用いて決定した。0.25nmのスリット幅で 285nmの光で、試料を励起させた。1.25nmのスリット幅を用いて 300nmから 400nm の間にて放出波長を走査した。約５分間隔で３回にわたって実施した決定値の平均としてデータを蓄積した。循環式ウォーターバスを用いて、実験中の試料の温度を25℃あるいは37℃に保った。LPS に結合することでトリプトファン残基固有の蛍光が影響を受けるタンパク質である、カニ内毒素結合タンパク質(CEBP)を正の対照として用いた。(Wainwright et al.，1990，Cellular and Molecular Aspects of Endotoxin Reactions．Nowotny et al.，eds.，Elsevie r Science Publishing B.V.，The Netherlands．pp.315-325を参照のこと) これら実験の結果を、表15に示した。K_d値は、消失データのスキャットカードタイプのスターン−フォルマー・プロットにおけるプロット勾配の逆関数として決定した。BPI.10、BPI.46およびBPI.47に関するテータを比較することで、K_dの減少(LPSへの親和力の増大を示している)と、蛍光消失率の増大が認められた。これらペプチドの間での相違は、BPI.10と比較して、BPI.48にて非極性残基での塩基性および極性アミノ酸の置換があることを意味する。これとは対照的に、ヘパリン結合性のK_dが増大しているので、対応して増大している蛍光消失率は検出されなかった。この結果は、LPS 結合と比較して、ヘパリン結合の部位あるいは性質が根本的に相違するものであることを示唆するものである。Ｆ．ヘパリンが媒介したトロンビン時間の伸長の中和分析ヘパリンが媒介したトロンビン時間の伸長、すなわち、トロンビンと血漿の混合物の凝固に要する時間に関する、BPI 機能領域ペプチドの効果を研究した。治療的に投与されたヘパリンのような、トロンビン形成の内因性あるいは外因性阻害剤の存在によりトロンビン時間は長くなる。ヘパリンの抗凝固効果を中和する薬剤は、この試験で測定されるトロンビン時間を短くするであろう。これら実験にて、MLA Elextra 800 凝固計時器を用いてトロンビン凝固時間を決定した。再調製した血漿(200μl 、Sigma Chemical社、No．855-10)を、反応用キュベットにて、37℃で２分間インキュベートした。トロンビン凝固用試薬(1 00μl 、Baxter Diagnostics社、B4233-50)を、インキュベーションの後に反応用キュベットに添加し、そして凝固時間を測定した。血漿の添加に先行して、ヘパリンナトリウム(13μl 、PBS 中の40μg/ml、Sigma Chemical社、H3393)と、例示的なBPI 機能領域ペプチド(約0.05μg/mlから約10μg/mlまでの様々な希釈液の10μl)を反応用キュベットに添加し、トロンビン凝固時間に関するこれらペプチドの効果を試験した。TCT 凝固時間（トロンビン時間）を、表示したBPI ペプチドを用いて測定し、その結果を図28と表16に示した。図28と以下の表16に示したこれら結果は、トロンビン時間の伸長をもたらすヘパリンが媒介した阻害によって、試験したBPI 機能領域ペプチドがヘパリンを中和したことを実証するものである。この阻害のIC₅₀を定量し、以下の表16に示した。実施例21 Martigel(登録商標)膜基質でのin vivo でのヘパリン /FGF誘発した血管形成の阻害に基づくヘパリン中和分析本発明のBPI 機能領域ペプチドを、マウスにおけるin vivo での、ヘパリン誘発した血管形成を阻害する能力について分析した。液体 Martigel(登録商標)(Co llaborative Biomedical Products社、ベッドフォード、マサチューセッツ州)を４℃で維持し、Passaniti et al.(1992，Lab．Invest．67: 519-528)に記載されているようにして、液体状態のゲルに血管形成因子を添加した。ヘパリン(Sigma 社、セントルイス、ミズーリー州)を、 1,250〜10,000単位/ml の範囲の様々な濃度になるように滅菌したPBS に溶解した。組換え繊維芽細胞成長因子(bhFGF; BACHEM Bioscience 社、フィラデルフィア、ペンシルベニア州)を、滅菌したPBS で200ng/mlにまで希釈した。2.5μl の希釈したヘパリン溶液と、2.5μl の組換えbhFGF を、マウス注射単位用量当たり0.5ml の Martigel(登録商標)に添加した。BPI 機能領域ペプチドを、実験用動物当たり10μl/0.5ml の Martigel(登録商標)画分中の 0.5〜50μg/ml（最終濃度）の範囲の様々な濃度になるように、この Martigel(登録商標)混合物に添加した。10μl の滅菌したPBS を、対照動物に注射した Martigel(登録商標)画分中のBPI 機能領域ペプチドと交換した。６〜８週齢のオスのC57BL/6Jマウス(Jackson Laboratory 、バーハーバー、メイン州)に、上述したようにして調製した Martigel(登録商標)の0.5ml の画分を、背中の中線に向けて皮下注射した。注射して７日後、 Martigel(登録商標)ゲルを切り出し、500μl のドラブキンの試薬(Sigma社)中に置いた。全タンパク質ならびにヘモグロビン含有量を、ゲルを機械的に均質化した後にドラブキンの試薬に蓄えられているゲルについて決定した。全タンパク質レベルを、汎用されているキット（DC Protein Assay、Bio-Rad 社、リッチモンド、カリフォルニア州）に組み込まれている、マイクロプレート分析を用いて決定した。ヘモグロビン濃度は、Sigma Procedure #525と、この分析に用いる Sigma社（セントルイス、ミズーリー州）から供給された試薬を用いて測定した。ヘモグロビンレベルは、全タンパク質濃度との相関が認められた。組織染色のために用いるゲルは、ドラブキンの試薬中に置くよりもむしろ、動物から切除して直ちにホルマリン固定した。ホルマリン固定したゲルは、凍結切片のために、Tissue-Tek O.C.T.化合物(Miles社、エルクハート、インディアナ州)に埋設した。凍結切片の薄片を、（Humason，1979，Animal Tissue Techniqu es，4th Ed．W.H．feeman 社、サンフランシスコ、カリフォルニア州、Ch.9，pp .111-131に記載されているようにして）ヘマトキシリンとエオシンで染色した。本発明のBPI 機能領域ペプチドの効果を、BPI ペプチドを用いずに調製した M artigel(登録商標)ゲル薄片での血管形成の阻害に関して、凍結染色した切片について顕微鏡的に観察した。血管形成の阻害の程度を、BPI 機能領域ペプチドを含むゲル薄片にて認められる標準的な量のヘモグロビンを用いて定量した。実施例22 慢性炎症疾患：コラーゲン誘発あるいはコラーゲン反応性モデルでのBPI 機能領域ペプチドの解析コラーゲン誘発した関節炎モデルでの効果をみるために、BPI 機能領域ペプチドを投与した。具体的には、Stuart et al．(1982，J．Clin．Invest．69: 673- 683)の方法に従って、尾の付け根にウシ・タイプIIコラーゲンの皮内免疫処置することで、マウスに関節炎を誘発した。一般に、マウスは、コラーゲンで免疫処置してから21日後に関節炎症状を呈した。処置したマウスの関節炎スコアを、21−25日目のそれぞれに、BP I 機能領域ペプチド、対照rBPI₂₃あるいはrBPI、あるいは緩衝液のいずれかの用量を尾の静脈から静脈注射して処置したマウスを、 120日の期間にわたって盲目的に評価した。具体的には、ウシ・タイプIIコラーゲン(Southern Biotechnology Associates 社、バーミングハム、イリノイ州)を、約20−25ｇの体重のグループに属するオスのマウス(Mouse/DBA/1J)に対して、０日目に、尾の付け根に皮内注射(0.lmg／マウス)して投与した。BPI 機能領域ペプチド、rBPI₂₃およびrBPIを、 0.5M 塩化ナトリウムと20mM酢酸ナトリウム(pH6.0)を含む緩衝液に溶解し、そして、様々な濃度で投与するためにPBS 緩衝液で希釈した。対照には、PBS 緩衝液のみ(0 .1ml)を投与した。コラーゲン誘発した関節炎モデルは、プロタミン硫酸との比較において、BPI 機能領域ペプチドの挙動を評価するためにも用いた。具体的には、上述したようにしてBPI ペプチドをPBS に溶解し、そして、様々な濃度で投与した。他の試験物質も以下の用量で投与した。すなわち、プロタミン硫酸(Sigma Chemical社、セントルイス、ミズーリー州)(0.13mg／マウス)、タウマチン（0.12mg／マウス）、およびPBS 緩衝液(0.1ml)である。コラーゲンを投与して28から32日目の各日に、尾の静脈に静脈注射することで、試験物質あるいは対照物質をマウスの集団に投与した。 BPI 機能領域ペプチドも、Yong et al.，(1988，Microbial Pathogenesis 4: 305-310)の方法に従って、Yersinia anterocolitica 反応性関節炎モデルにおける反応性関節炎を処置するためにも投与した。具体的には、マウスに非敗血症性の関節炎を誘発するように計算した４×10⁸の細菌の用量で予め Yersinia anterocolitica cWA 0:8 T2(すなわち、Y ong et al.，前出による有毒プラスミドを欠いている)を静脈注射した DBA/2J マウスにBPI ペプチドを投与した。マウスの集団には、尾の静脈に静脈注射することで、試験物質あるいは対照物質を投与した。 Borrelia burgdorferiはライム疾患の病原であり、関節炎に関連し、そして、 E．coli の細胞壁とは異なるが、構造的には共通性があるその細胞壁にLPS-様複合体を有している。Limulus 遊走細胞溶解物(LAL)阻害検定での B．burgdorferi LPS の阻害における、BPI 機能領域ペプチドを投与することによる効果を決定した。具体的には、実施例４に記載の方法に従ったLAL 分析を実施し、 2.5μg/ mlの B．burgdorferi LPS および２ng/ml の E．coli 0113 LPS 投与した場合の BPI ペプチドの効果を測定した。実施例23 マウス悪性黒色腫細胞転移モデルでの BPI 機能領域ペプチドの解析 BPI 機能領域ペプチド、プロタミン、あるいは対照用緩衝液を、マウス悪性黒色腫細胞転移モデルでの効果を試験するために投与した。具体的には、C57BL/6J マウスの集団に、０日目に、尾の静脈に10⁵のB16.F10 悪性黒色腫細胞を静脈注射した。様々な濃度のBPI 機能領域ペプチドを、第１、３、６、８、10、13、15 、17および19日目に、尾の静脈から投与した。正の対照としてプロタミン硫酸(0 .13mg/マウス)あるいは負の対照としてPBS 緩衝液(0.1ml／マウス)を、対照マウスの集団に対して同様に投与した。実験動物を、20日目に頸部脱臼によって屠殺し、肺組織を観察した。各肺葉に、気管から３mlの水を注入して灌流させて膨らませた。表面上の腫瘍小結節を顕微鏡で計測し、マウスの集団当たりに見つかった腫瘍の数を、統計学上の有意差について解析した。実施例24 マウス脳毛細血管の内皮細胞増殖分析での BPI 機能領域ペプチドの解析 BPI 機能領域ペプチドを、すべての内皮細胞増殖検定での効果について試験した。これらの実験のために、Bauer（1989,Microvascular Research 37: 148-161 ）に記載されたマウスの脳の毛細血管細胞(EC)を、イーグルの塩、Ｌ−グルタミン酸、および 2.2g/l の重炭酸ナトリウム(GIBCO、グランドアイランド、ニューヨーク州)を含み、加熱して不活性化した10％胎児子ウシ血清(FCS: Irvine Scie ntific 社、イルビン、カリフォルニア州)と１％ペニシリン／ストレプトマイシン(GIBCO)を足した培地 199に移した。融合細胞の回収を、トリプシン−EDTA(GI BCO)を用いた３分間のトリプシン処理によって実施した。増殖分析を、標準平板 96ウェル・マイクロタイタープレートに、新たに回収したECを置いて行った。この分析での各ウェルについて、最終体積を200μl/ウェルに維持した。各ウェルに、総計４×10⁴個のEC細胞と、様々な濃度のBPI ペプチドあるいは対照用緩衝液が添加された。５％二酸化炭素のインキュベーター内での48時間の培養の後、 10μl の培地 199中の１μCiの[³H]チミジンを、各ウェルに添加した。24時間放射物質を適用させた後、トリプシン処理によってEC細胞をガラス微小繊維フィルターに回収し、そして、取り込まれた[³H]チミジンをガス比例式固相ベータ計測器で定量した。 EC細胞に関するBPI ペプチドの直接的な結合の研究を、集密フラスコから10倍量の細胞を回収し、そして、トリプシン処理した細胞を12.5mlの培養培地で再懸濁することで実施した。次いで、細胞懸濁液の0.5ml を、標準24ウェル組織培養プレートの各ウェルに添加し、一晩インキュベートした。カルシムとマグネシウムを含む燐酸緩衝化生理食塩水(GIBCO)中の0.1％ウシ血清アルブミンで、そのプレートを洗浄した。洗浄した後、各ウェルに0.5mlのBSA/PBS を添加した。EC細胞増殖の濃度依存性阻害を、[³H]チミジンの取り込みの減少に関して測定した。実施例25 動物モデルでのBPI 機能領域ペプチドの解析Ａ．マウス内毒素血症モデルでの解析 BPI 機能領域ペプチドを、マウス内毒素血症モデルでの効果について試験した。少なくとも15匹のマウスからなる集団に、LD₅₀の用量(例えば、40mg/kg)で内毒素(例えば、E．coli 0111:B4 、Sigma Chemical社、セントルイス、ミズーリーナ州)の静脈注射によって投与した。これに続いて、約0.1mg/kgから約100mg/k g、好ましくは、約１から50mg/kgの範囲の濃度のペプチドの二回目の静脈注射を行った。ペプチドを含まない緩衝液の注射を、負の対照マウスに対して行った。７日間にわたって実験動物を観察し、死亡率を記録した。本発明のペプチドの効果を、ペプチド投与したマウスと対照マウスとの比較において、内毒素血症に関連する死亡率の減少によって測定した。Ｂ．マウス腹膜炎モデルでの解析 BPI 機能領域ペプチドを、マウス急性腹膜炎モデルでの効果について試験した。少なくとも15匹のマウスからなる集団に、10⁷個の活性 E．coli細菌株 07:K1 を含んだ0.5ml を与え、そして、約0.1mg/kgから約100mg/kgの範囲の濃度のBPI 機能領域ペプチドの1.0ml の溶液で処置した。ペプチドを含まない緩衝液の注射を、負の対照マウスに対して行った。７日間にわたって実験動物を観察し、死亡率を記録した。効果的なBPI 機能領域ペプチドによれば、対照マウスとの比較において、試験区マウスの死亡率の減少をもたらした。Ｃ．マウス Candida albicans モデルでの解析全身系カンジダ症のマウスモデルを、 Candida albicans による感染症治療のための様々な療法の in vivo治療効果を試験するために用いた。TNF-α、このマウスモデルにて防御的役割を果たすことが(Louie，A.，et al.，1994，Infectio n and Immunity，62(7):2761-2772)、また、これに先立って、組換え可溶性IL-4 レセプターが、感染症を治癒することが(Puccetti，P.，et al.，1993，J．Infe c．Diseases，169: 1325-1331)示されている。Candida albicans に対する遺伝的感受性を有し、カンジダ症に罹病していることが確認されたマウスは、カンジダ症を解消する治療方法の効果を試験するためのモデル系として使用することは好適である(Romani，L.，et al.，1993，J．Immunol．150: 925-931)。本発明のペプチドを、前出の Louie et alおよび Puccetti et al に報告した方法に準じた手順に従って、このマウスモデルでの全身系 Candida albicans 感染症に対する効果について試験を行った。適切なマウスを準備し、Hector et al (1982， Infection and Immunity，38(3):1020-1028)が報告した方法に準じて同定した。少なくとも15匹のマウスを擁するグループに、0.5ml中に約10³〜10⁸、好ましくは10⁶〜10⁸の様々な個体数の活性Candida albicans（実施例18で使用した Can dida株、CA-6、B311、88- 689-6 、あるいは他の適切な分離株）を適用し、そして、約0.１〜約100mg/kgの濃度のBPI 機能領域ペプチドの約0.1 〜1.0ml で処置した。ペプチドを含まない緩衝液を注射したマウスを、負の対照マウスとして用いた。マウスの臓器の定量培養（前出の Louie et al）、あるいは生存時間の測定によって分析を行った。本発明の効果的なペプチドは、Candida albicans によって引き起こされる疾患の程度を緩和するだけの活性を有していた。実施例26 ヒト内毒素中和モデルでのin vivo での BPI 機能領域ペプチドの治療的使用細菌性内毒素の静脈注入により内毒素血症にしたヒトにおけるBPI 機能領域ペプチドの効果を調査するために、例えば、1994年１月24日に出願された、共同所有に係る、係属中の米国特許出願 No．08/188,221 に記載されているようにして、二重盲検法を立案し、そして実施した。実施例27 抗生物質耐性細菌に対するＢＰＩペプチドの殺菌活性実施例２に記載の方法に準じて、研究を行った。Ａ．Salmonella TyphimuriumのポリミキシンＢ耐性株ポリミキシンＢ耐性の作用機序と本発明のペプチドによる殺菌活性への耐性との相互作用を研究するために、ポリミキシン勾配プレート（例えば、Ronald et al.，1993，J．Bacteriology，175: 4154-4164を参照のこと）に、10⁸個の野性型 Salmonella Typhimurium（SL3770，Generic Stock Center，カルガリー、カナダ）を置いて、Salmonella Typhimurium のポリミキシンＢ耐性株を単離した。LR-1と命名された、単離されたポリミキシンＢ耐性 Salmonella Typhimurium を一晩培養し、野性株をトリプシン大豆培地で1:50に希釈し、対数増殖期に至るように37℃で、３時間インキュベートした。Salmonella Typhimurium LR-1 の培地に、2.5μg/mlのポリミキシンＢ硫酸塩を追加した。新鮮な培地で細菌を再懸濁し、570nmの吸光度にて濃度を決定した。細菌の個体数が１×10⁶/mlの濃度になるように、融解した寒天に細菌を導入した。rBPI₂₁は、D-PBS 中にて２mg/ml の濃度から２倍ずつの濃度に連続的に希釈した。ポリミキシンＢは、20mg/ml の濃度から等濃度の間隔で希釈した。試験に用いたペプチドは、D-PBS 中にて約１ mg/ml の濃度から２倍ずつの濃度に連続的に希釈した。実施例２に記載したように、ウェル当たり約５μl を注いだ。図29a と図29b は、それぞれ、rBPI₂₁（黒丸）；ポリミキシンＢ（白丸）；BP I.30（黒三角）；BPI.48（白三角）；BPI.69（黒四角）；BPI.105（白四角）の Salmonella Typhimurium 、およびLR-1と命名された Salmonella Typhimurium のポリミキシンＢ耐性株に対する殺菌活性を示している。Ｂ．E．coli の抗生物質耐性株複数の抗生物質耐性を有するE．coli、複数の抗生物質耐性を有するE．coli 1 9536（アンピシリン耐性 16 μg/ml；セフタジダイム耐性＞ 16 μg/ml；セフタリアゾン耐性＞ 16 μg/ml）に対するBPI ペプチドの殺菌活性を試験した。試験に用いた株は、Baxter Microscan（登録商標）ライブラリー（サクラメント、カリフォルニア州）から入手した臨床分離株である。一晩培養したE．coli 19536 を、実施例２と本実施例のＡ．節の記載に準じて試験した。試験に用いたペプチドは、D-PBS 中にて約１mg/ml の濃度から２倍ずつの濃度に連続的に希釈した。 BPI.48、BPI.63、BPI.69およびBPI.188 が、複数の抗生物質耐性を有するE．col iに対して活性を示した代表的な試料であった。図29c と図29d は、それぞれ、rBPI₂₁（黒四角）；セフトリアキソン（白四角）；BPI.48（黒丸）；BPI.63（白丸）；BPI.69（黒三角）、およびBPI.88（白三角）のE．coli(19536)、およびE．coli 0114:B4に対する殺菌活性を示している。Ｃ．Pneumoniae属に関するBPI ペプチドの殺菌活性 Klebsiella pneumoniae の抗生物質耐性株 Klebsiella pneumoniae の抗生物質耐性株、臨床単離された複数の抗生物質耐性を有する 19645株に関して、BPI ペプチドの殺菌活性を試験するために、実施例２と本実施例の上節の記載に準じて試験した。（Klebsiella pneumoniae 1964 5 株は、am＞16；ti＞16；azt ＞16；pi＞64；ak＞16；crm ＞16；caz ＞16；ca x ＞16；cft ＞32；a/s ＞16；grn ＞６；to＞６；cfz ＞16の最小阻止濃度（μ g/ml）を有している。）試験に用いた株は、Baxter Microscan（登録商標）ライブラリー（サクラメント、カリフォルニア州）から入手した臨床分離株である。一晩培養した Klebsiella pneumoniae 19645と非耐性株(ATCC 29011)をトリプシン大豆培地で 1:50に希釈し、対数増殖期に至るように37℃で、３時間インキュベートした。一晩培養した培養物を、実施例２と本実施例のＡ．節の記載に準じて試験した。BP I.７、BPI.48、BPI.63、BPI.69、BPI.103 、BPI.105 およびBPI.119 が、抗生物質耐性 Klebsiella に対して活性を示した代表的な試料であった。図29e と図29f は、 Klebsiella pneumoniae(19645)の抗生物質耐性株に対する代表的なペプチドの殺菌活性を示している。図29e には、BPI.７(白丸);BPI.4 8(黒丸);BPI.63（白三角）；BPI.69（黒三角）、rBPI₂₁（白四角）；セフタジダイム（黒四角）；およびセフトリアキソン（小三角）での結果を示している。図 29f には、BPI.88(白丸);BPI.103(黒丸);BPI.105(白三角)；BPI.119(黒三角)、r BPI₂₁（白四角）；セフタジダイム（黒四角）；およびセフトリアキソン（小三角）での結果を示している。図29g と図29h は、 Klebsiella pneumoniae（ATCC 29011）に対する代表的なペプチドの殺菌活性を示している。図29g には、BPI.７(白丸);BPI.48(黒丸);BP I.63（白四角）；BPI.69（黒四角）、rBPI₂₁（白三角）；セフタジダイム（黒三角）；およびセフトリアキソン（小丸）での結果を示している。図29h には、BP I.88(白丸);BPI.103(黒丸);BPI.105(白四角)；BPI.119(黒四角)、rBPI₂₁（白三角）；セフタジダイム（黒三角）；およびセフトリアキソン（小丸）での結果を示している。これまでの開示は、本発明の特定の態様を説明するものであり、そのすべての変更と同等の改良は、添付の請求の範囲の記載した本発明の趣旨と範疇に属するものであることを理解されたい。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．ペプチドを含む化合物であって、前記ペプチドが、から選択されたペプチドである、ペプチドを含む化合物。２．ペプチドを含む化合物であって、前記ペプチドが、から選択されたペプチドである、ペプチドを含む化合物。３．ペプチドを含む化合物であって、前記ペプチドが、から選択されたペプチドである、ペプチドを含む化合物。４．ペプチドを含む化合物であって、前記ペプチドが、から選択されたペプチドである、ペプチドを含む化合物。