JP3571371B2 - オプソニン活性を有する新規な蛋白質 - Google Patents
オプソニン活性を有する新規な蛋白質 Download PDFInfo
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Description
【産業上の利用分野】
本発明はオプソニン活性を有する新規なヒト血漿由来蛋白質、それをコードするDNA、当該蛋白質の製造方法、および当該蛋白質を含有する感染症予防治療剤に関する。
【0002】
【従来技術】
細菌などの病原微生物に付着して、好中球、単球、マクロファージなどの貪食細胞による貪食作用を受けやすくする物質をオプソニンと呼び、このような貪食作用を増強する活性をオプソニン活性という。免疫グロブリンや補体成分であるC3bはオプソニン活性を有する。これは貪食細胞の表面にFcレセプターやC3bレセプターがあるためである。血清蛋白の一つであるC反応性蛋白(CRP)も肺炎球菌に対してオプソニン活性を有している。
【0003】
オプソニン活性は感染防御機構として特に重要である。例えば、肺炎球菌の多糖体抗原、サルモネラのO抗原、Vi抗原、レンサ球菌のM蛋白に対する特異抗体は、オプソニン活性が強く、好中球、マクロファージによる貪食を高め、病原体の感染抑制に働くことから感染防御抗体と呼ばれている。菌体表層に貪食作用に抵抗する莢膜がある場合でも、これらの特異抗体が菌体に結合することによって貪食細胞による貪食が著しく容易になる。細菌などの病原微生物による感染症に対してはオプソニン活性が最も重要な生体防御反応である。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、感染症の予防または治療に有用な、オプソニン活性を有する新規蛋白質、ならびにその製造方法を提供することにある。
また本発明の目的は、この新規蛋白質を遺伝子工学手法により製造するために、当該蛋白質のアミノ酸配列を明らかにし、当該蛋白質をコードするDNAを提供することにある。
さらに本発明の目的は、新規な感染症予防治療剤を提供することにある。
【0005】
【課題を解決するための手段】
糖鎖に結合する動物レクチンの中でマンノースとN−アセチルグルコサミンを認識するC型レクチンであるマンノース結合蛋白質(MBP)とコングルチニンは、生体防御機構において重要な働きをしている。これらのレクチンはコラーゲン様構造を有し、コレクチンと呼ばれるファミリーを形成している。
【0006】
本発明者らは、MBPの精製過程で、ヒト血漿中からマンナンに結合し、N−アセチルグルコサミンで溶出される新規な蛋白質を見出し、この蛋白質が、貪食細胞の貪食能を活性化するオプソニン活性を有することを見出した。
さらに本発明者らは、当該蛋白質をコードするcDNAのクローニングを行い、そのcDNAの塩基配列から当該新規蛋白質のアミノ酸配列を明らかにした。
【0007】
本発明は、実質的に式(I)に示されるアミノ酸配列を有してなる蛋白質に関する。
【0008】
【化6】
【0009】
当該蛋白質は、少なくとも式(I)に示されるアミノ酸配列を含んでいればよい。式(I)はコラーゲン様ドメインを示す。このコラーゲン様ドメインは、Gly −X−Y(Gly はグリシンを表し、XとYはグリシン以外のアミノ酸を表す)で表される繰り返しパターンを含む。好ましくは当該蛋白質は、式(V)に示されるコラーゲン様ドメインを含む。
【0010】
【化7】
【0011】
上記式(V)のアミノ酸配列は、Gly −X−Y(Gly,XおよびYは前記の通り)で表される繰り返しパターンの間に1つ以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列が挿入されていてもよい。具体的には当該蛋白質は、式(VI)に示されるコラーゲン様ドメインを含む。
【0012】
【化8】
【0013】
上記式(VI)のアミノ酸配列には、6アミノ酸(式(VI) 中の下線部分)をはさんで2回と15回のGly −X−Yの繰り返しパターンが存在する。
【0014】
本発明は、実質的に式(II)に示されるアミノ酸配列を有してなる蛋白質に関する。
【0015】
【化9】
【0016】
当該蛋白質は、少なくとも式(II)に示されるアミノ酸配列を含んでいればよい。式(II)はフィブリノーゲン様ドメインを示す。このフィブリノーゲン様ドメイン中には、Ca結合に関与するEFhandに類似した配列(式(II)中の破線部分)が含まれている。これは本発明蛋白質がCaイオンと結合する可能性を示唆する。
【0017】
本発明は、実質的に上記式(I)に示されるアミノ酸配列および実質的に上記式(II)に示されるアミノ酸配列を有してなる蛋白質に関する。(I)と(II)の配列の順序は限定されないが、好ましくはN末端側に(I)の配列を、C末端側に(II)の配列を含む蛋白質である。当該蛋白質は(I)の配列と(II)の配列の間に1つ以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【0018】
本発明は、実質的に式(III)に示されるアミノ酸配列を有してなる蛋白質に関する。
【0019】
【化10】
【0020】
ここで「実質的に」とは、本発明の蛋白質は式(I)、(II)又は(III) の各式に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質に限定されず、当該アミノ酸配列を有する蛋白質と同様な生物学的性質(オプソニン活性)を有する限り、当該アミノ酸配列中のアミノ酸の幾つかについて欠失、置換、もしくは付加があってもよいことを意味する。
【0021】
本発明の蛋白質は、上記アミノ酸配列を有してなるポリペプチドにさらに糖が結合したものであってもよい。
上記式中で用いた略号は次の意味を有する。
A Ala アラニン
R Arg アルギニン
N Asn アスパラギン
D Asp アスパラギン酸
C Cys システイン
Q Gln グルタミン
E Glu グルタミン酸
G Gly グリシン
H His ヒスチジン
I Ile イソロイシン
L Leu ロイシン
M Met メチオニン
K Lys リジン
F Phe フェニルアラニン
P Pro プロリン
S Ser セリン
T Thr スレオニン
W Trp トリプトファン
Y Tyr チロシン
V Val バリン
【0022】
本発明の蛋白質の好適な例として、次の性質を有するヒト血漿由来の蛋白質P35が挙げられる。
▲1▼ヒト血漿をマンナンに接触させ、N−アセチルグルコサミン溶液で溶出することにより得ることができる。
▲2▼還元下のSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定した分子量が約35kDaである。
▲3▼N末端に式(IV)に示されるアミノ酸配列を有する。
【0023】
【化11】
【0024】
▲4▼等電点:6.3
蛋白質P35は、N−アセチルグルコサミンと特異的に結合する。P35は、N−アセチルグルコサミンを介して糖と結合すると考えられる。即ち、N−グリコシド型糖鎖の高マンノース型には結合せず、複合型、混合型には結合する。
【0025】
本発明の新規蛋白質は、ヒト血漿から精製することにより、あるいは組換えDNA技術、ポリペプチド合成法などの常法によって調製することができる。
【0026】
本発明の蛋白質をヒト血漿から調製する場合は、イオン交換クロマトグラフィー、限外濾過、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィー、吸着剤処理、塩析、等電点沈澱法、ポリエチレングリコール分画法などの公知の血漿蛋白質の精製法を適宜組合せることに得ることができる。好ましくは、ヒト血漿をマンナンに接触させ、N−アセチルグルコサミン溶液で溶出することにより調製することができる。
【0027】
以下に本発明の蛋白質の好適な調製方法を示す。
マンナンに接触させるヒト血漿画分は、ヒト血清をポリエチレングリコール分画処理した沈澱画分が好ましい。詳細には、常法に従ってヒト血漿からフィブリンを除去して調製したヒト血清に、分子量4000のポリエチレングリコールを終濃度7%になるように添加し、沈澱画分を回収する。このポリエチレングリコール分画処理は2〜8℃好ましくは4℃付近で行う。
【0028】
得られた沈澱画分を緩衝液に溶解してマンナンに接触させる。緩衝液は塩濃度0.1〜2M、pH6〜8が好ましく、具体的には1〜1.5M塩化ナトリウム含有20〜100mM Tris−塩酸またはリン酸緩衝液(pH7〜8)が例示される。マンナンは、不溶性担体にマンナンを結合したものが好適に使用され、例えばマンナン−セファロース、マンナンアフィゲルなどのカラムが用いられる。次いで、マンノース溶液でマンノース結合蛋白質を溶出させた後、N−アセチルグルコサミン溶液で溶出することにより、本発明蛋白質を含有する画分が得られる。マンノース溶液は、好ましくは0.1〜0.5M、より好ましくは0.3Mのマンノースを含有する緩衝液であり、緩衝液としては前記のものが好適に使用される。N−アセチルグルコサミン溶液は、好ましくは0.1〜0.5M、より好ましくは0.3MのN−アセチルグルコサミンを含有する緩衝液であり、緩衝液としては前記のものが好適に使用される。
本発明蛋白質を含有する溶出画分は、好ましくは抗IgM、抗IgGを不溶性担体に結合させたカラムを通して不純物成分のIgM、IgGを除去する。
【0029】
組換えDNA技術により本発明の蛋白質を調製する場合には、常法に従って、本発明蛋白質をコードするDNA(後述)を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培地中で培養し、該培養物から本発明蛋白質を採取することによって調製することができる。
【0030】
宿主細胞としては、微生物〔細菌(例えば、大腸菌、枯草菌)、酵母(例えば、サッカロミセス属)〕、動物細胞(例えば、COS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞)、昆虫細胞(例えば、S.f.細胞)などが使用できる。
【0031】
ベクターとしては、pBR322, pBR325, pUC12, pUC13などの大腸菌由来のプラスミド、pUB110, pTP5, pC194 などの枯草菌由来のプラスミド、pSH19, pSH15などの酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、バキュロウイルス(核多角体ウイルス)などの昆虫ウイルスなど、公知の入手可能なベクターを使用することができる。
【0032】
本発明はまた、式(I)に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むDNAに関する。
当該DNAは、上記塩基配列を含んでいればいかなるDNAであってもよいが、少なくとも式(I)に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNAである。
式(I)に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列としては、式(I)に示されるアミノ酸配列をコードしうる塩基配列であれば特に限定されないが、具体的には図2、3に示される塩基配列中5’末端から数えて塩基番号161〜295で示される塩基配列が例示される。
【0033】
本発明は、式(II)に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むDNAに関する。
当該DNAは、上記塩基配列を含んでいればいかなるDNAであってもよいが、少なくとも式(II)に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNAである。
式(II)に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列としては、式(II)に示されるアミノ酸配列をコードしうる塩基配列であれば特に限定されないが、具体的には図2、3に示される塩基配列中5’末端から数えて塩基番号296〜949で示される塩基配列が例示される。
【0034】
更にまた本発明は、式(I)に示されるアミノ酸配列および式(II)に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むDNAに関する。
当該DNAは、上記塩基配列を含んでいればいかなるDNAであってもよいが、少なくとも式(I)に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列および式(II)に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNAである。
式(I)に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列または式(II)に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列としては、上述した塩基配列が例示される。
【0035】
また、本発明は、式(III)に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むDNAに関する。
当該DNAは、上記塩基配列を含んでいればいかなるDNAであってもよいが、少なくとも式(III) に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNAである。
式(III) に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列としては、式(III) に示されるアミノ酸配列をコードしうる塩基配列であれば特に限定されないが、具体的には図2、3に示される塩基配列中5’末端から数えて塩基番号86〜949で示される塩基配列が例示される。
また、当該DNAは、その5’末端に、シグナルペプチドをコードする塩基配列を含有していてもよい。シグナルペプチドの由来は特に限定されず、マンノース結合蛋白等が例示されるが、好ましくはヒト血漿のオプソニン活性を有する蛋白質に由来するものである。具体的には、図2中の下線で示されるアミノ酸配列(アミノ酸番号1〜25で示される配列)をコードするDNAであり、より具体的には図2、3に示される塩基配列中5’末端から数えて塩基番号11〜85で示される塩基配列が例示される。
【0036】
一般に、遺伝子組換えの技術分野では、遺伝暗号の縮重に従い、遺伝子から産生される蛋白質のアミノ酸配列を変えることなくその遺伝子のDNA配列の少なくとも一つの塩基を他の塩基に置換することができる。従って、本発明のDNAは図2、3に示される塩基配列に特定されず、当該図2、3で示される塩基配列を遺伝暗号に基づく置換によって変化させた塩基配列を有するものをも包含する。
【0037】
また、本発明のDNAは、いかなる方法で得られるものであってもよい。例えばmRNAから調製される相補DNA(cDNA)、ゲノムDNAから調製されるDNA、化学合成によって得られるDNA、RNAまたはDNAを鋳型としてPCR法で増幅させて得られるDNAおよびこれらの方法を適当に組み合わせて構築されるDNAをも全て包含するものである。
【0038】
従って、本発明のDNAは、常法に従って本発明の蛋白質のmRNAからcDNAをクローン化する方法、ゲノムDNAを単離してスプライシング処理する方法、化学合成する方法等により取得することができる。
【0039】
(1) 例えば、本発明蛋白質のmRNAからのcDNAクローニングは、常法(Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に従って行うことができる。具体的には、以下の方法が例示される。
まず、ヒト肝臓などヒト由来オプソニン活性を有する蛋白質を培養し、その培養液から該蛋白質をコードするmRNAを調製する。mRNAの調製は、例えばグアニジンチオシアネート法〔Chirgwin, J. M. et al., Biochem., 18, 5294 (1979) 〕、熱フェノール法もしくはAGPC法等の公知の方法を用いて調製した全RNAをオリゴ(dT)セルロースやポリU−セファロース等によるアフィニティクロマトグラフィーにかけることによって行うことができる。次いで得られたmRNAを鋳型として、例えば逆転写酵素を用いる等の公知の方法〔例えばOkayama,H.らの方法{Okayama, H. et al., Mol. Cell. Biol., 2, 161 (1982) 及び同誌 3, 280 (1983)}やGubler,U. とHoffman,B.J.の方法{Gubler, H. and Hoffman, B.J., Gene, 25, 263 (1983)}が例示される。〕でcDNA鎖を合成し、cDNAの二本鎖cDNAへの変換を行う。このcDNAをプラスミドベクターもしくはファージベクターに組み込み、大腸菌を形質転換して、あるいはインビトロパッケージング後、大腸菌に形質移入(トランスフェクト)することによりcDNAライブラリーを作製する。
ここで用いられるプラスミドベクターとしては、宿主内で複製保持されるものであれば特に制限されず、また用いられるファージベクターとしても宿主内で増殖できるものであれば良い。常法的に用いられるクローニング用ベクターとしてpUC119,λgt10,λgt11,λZAP等が例示される。
ただし、後述の免疫学的スクリーニングに供する場合は、宿主内で本発明蛋白質の遺伝子を発現させうるプロモーターを有したベクターであることが好ましい。
【0040】
プラスミドにcDNAを組み込む方法としては、例えば Maniatis, T. ら, モレキュラークローニング,ア・ラボラトリー・マニュアル (Molecular Cloning, A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, p.239 (1982)に記載の方法などが挙げられる。また、ファージベクターにcDNAを組み込む方法としては、Hyunh,T. V. らの方法〔Hyunh,T.V., DNA Cloning, a practical approach,1,49(1985)}などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット(例えば、宝酒造製等)を用いることもできる。このようにして得られる組換えプラスミドやファージベクターは、原核細胞(例えば、E.coliHB101,DH5またはMC1061/P3等)等の適当な宿主に導入する。
【0041】
プラスミドを宿主に導入する方法としては、Maniatis, T.らのモレキュラークローニング,ア・ラボラトリー・マニュアル(Molecular Cloning, A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, p.239 (1982) に記載の塩化カルシウム法または塩化カルシウム/塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。また、ファージベクターを宿主に導入する方法としてはファージDNAをインビトロパッケージングした後、増殖させた宿主に導入する方法等が例示される。インビトロパッケージングは、市販のインビトロパッケージングキット(例えば、ストラタジーン社製,アマシャム社製等)を用いることによって簡便に行うことができる。
【0042】
上記の方法によって作製されたcDNAライブラリーから、本発明の蛋白質をコードするcDNAを単離する方法は、一般的なcDNAスクリーニング法を組み合わせることによって行うことができる。
例えば、別個に本発明蛋白質のアミノ酸配列に対応すると考えられるオリゴヌクレオチドを化学合成したのち、これを32Pでラベルしてプローブとなし、公知のコロニーハイブリダイゼーション法〔Crunstein, M. and Hogness, D.S.: Proc. Natl. Acid. Sci. USA 72, 3961 (1975) 〕またはプラークハイブリダイゼーション法〔Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p.239 (1982) 〕により、目的のcDNAを含有するクローンをスクリーニングする方法、PCRプライマーを作製し、本発明の蛋白質の特定領域をPCR法により増幅し、該領域をコードするDNA断片を有するクローンを選択する方法等が挙げられる。また、cDNAを発現しうるベクター(例えば、λgt11ファージベクター)を用いて作製したcDNAライブラリーを用いる場合には、本発明蛋白質に対する抗体を用いる抗原抗体反応を利用して、目的のクローンを選択することができる。大量にクローンを処理する場合には、PCR法を利用したスクリーニング法を用いることが好ましい。
【0043】
この様にして得られたDNAの塩基配列はマキサム・ギルバート法〔Maxam, A.M. and Gilbert, W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 74, 560 (1977)〕あるいはファージM13を用いたジデオキシヌクレオチド合成鎖停止の方法〔Sanger, f.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 74, 5463−5467 (1977) 〕によって決定することができる。本発明のDNAは、その全部または一部を上記のようにして得られるクローンから制限酵素等により切り出すことにより取得できる。
【0044】
(2) また、ヒト肝臓のゲノムDNAから本発明の蛋白質をコードするDNAを単離することによる調製方法としては、例えば以下の方法が例示される。
ヒト肝臓を好ましくはSDSまたはプロテナーゼK等を用いて溶解し、フェノールによる抽出を反復してDNAの脱蛋白質を行う。RNAを好ましくはリボヌクレアーゼにより消化する。得られるDNAを適当な制限酵素により部分消化し、得られるDNA断片を適当なファージまたはコスミドで増幅しライブラリーを作成する。そして目的の配列を有するクローンを、例えば放射性標識されたDNAプローブを用いる方法等により検出し、該クローンから本発明の蛋白質のDNAの全部または一部を制限酵素等により切り出し取得する。
【0045】
(3) また、化学的合成による本発明のDNAの製造は、図2、3に示される塩基配列をもとにして、常法に従って行うことができる。
【0046】
本発明の蛋白質は、オプソニン活性を有し病原微生物を不活化する作用を有するので、細菌、ウイルス、真菌などの病原微生物による感染症の予防又は治療に有効である。細菌としては、サルモネラ、大腸菌、緑膿菌などのグラム陰性菌、ブドウ球菌、レンサ球菌、肺炎球菌などのグラム陽性菌、ウイルスとしては、ヘルペスウイルス、HIVなど、真菌としては、カンジダ、アスペルギルスなどが挙げられる。これらの病原微生物による感染症としては、急性胃腸炎、食中毒、尿路感染症、膀胱炎、腎盂炎、肺炎、敗血症、ブドウ球菌症、皮膚疾患、ヘルペスウイルス感染症、帯状ほう疹、白癬、カンジダ症などが挙げられる。
【0047】
本発明において、オプソニン活性は貪食細胞(単球、マクロファージ、好中球など)による病原微生物の貪食を増加させる作用を意味する。オプソニン活性は、例えば、貪食細胞により貪食される微生物の数を測定することにより測定することができる。貪食細胞としてはヒト由来の単球、マクロファージ、好中球などが使用できる。
【0048】
本発明の蛋白質は薬理的に許容される添加剤(例えば、担体、賦形剤、希釈剤など)などの製薬上必要な成分と適宜混合し、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、注射剤などの形態で医薬組成物として、経口的又は非経口的(静脈内、筋肉内または局所的)に投与することができる。好ましくは、生理食塩水、注射用蒸留水、滅菌精製水などの希釈剤に溶解した、またはそれを凍結乾燥した注射剤の形態である。投与経路は静脈内投与が好ましい。
【0049】
当該製剤には、安定化剤を配合してもよい。安定化剤は、血漿蛋白製剤の安定化剤として通常使用されるものであれば特に限定されない。例えばショ糖、マルトース、グルコース等の糖類、マンニトール、ソルビトール等の糖アルコール、グリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸等のアミノ酸、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸塩等の塩、リン脂質、アルブミン、ゼラチン、クエン酸、リンゴ酸などを用いることができる。
【0050】
上記製剤中には、本発明の蛋白質の有効量が配合される。投与量は投与経路、患者の症状、体重あるいは年齢などによっても異なるが、例えば成人患者に静脈内投与する場合は10μg〜10mgを1日1〜数回に分けて投与するのが望ましい。
本発明の蛋白質はヒト血漿由来の成分であるため毒性は極めて低く、医薬として安全に投与することができる。
【0051】
【実施例】
本発明をより詳細に説明するために、実施例を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【0052】
実施例1:P35の精製
ヒトクエン酸加血漿に最終濃度10mMになるように塩化カルシウムを加えて37℃、1時間反応させて凝固させた。これを濾過してフィブリンを除き、9,000rpm、20分間の遠心により得た上清(血清)にポリエチレングリコール4,000 を終濃度7%となるように加え、4℃で1時間、反応させた。9,000rpm、20分間の遠心操作で沈澱画分を得た。これを50mM Tris,1M塩化ナトリウム, 50mM塩化カルシウム含有緩衝液(pH7.8)に溶解後、酵母マンナンセファロースカラムにアプライした。前記緩衝液でカラムを洗浄後、0.3Mマンノースを含有する前記緩衝液でマンノース結合タンパクを溶出させた。その後、0.15M N−アセチルグルコサミンを含む前記緩衝液で本発明の蛋白質P35を溶出させた。P35含有画分には、不純物成分としてIgMとIgGが含まれていたので、抗IgM−セファロースカラムと抗IgGセファロースカラムを用いてそれらを除いてP35を精製した。得られたP35は、還元下のSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(SDS−PAGE)で35kDaのバンドとして認められた。P35はN末端に次式(IV) で示されるアミノ酸配列を有していた。
【0053】
【化12】
【0054】
実施例2:P35のcDNAクローニング
P35のcDNAクローニングは、標準的な方法(Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に従って行なった。λZAPおよびλgt10をベクターとして、ヒト肝臓cDNAライブラリーを構築した。実施例1で精製したP35タンパク質のN末端アミノ酸配列に基づいて、ライブラリースクリーニングのための2種類のオリゴヌクレオチドを合成した。このオリゴヌクレオチドをプローブとして、まずλZAPcDNAライブラリーをスクリーニングした。プラークを転写したナイロンメンブレンとプローブとのハイブリダイゼーションは、5×デンハルツ(Denhardts) ,4×SSC,0.1%SDS,10mM EDTA,40mM Tris−HCl,pH7.5,100μg/mlサケDNAおよび32P標識オリゴヌクレオチドを含む溶液中で37〜42℃、一昼夜行なった。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、1×SSC中室温で50分間、さらに40〜43℃で1〜2時間行なった。2種類のオリゴヌクレオチドプローブの両方に陽性のクローンを選択した結果、1クローンのP35cDNAの断片が得られた。
【0055】
このP35cDNA断片(970bp)をプローブとして、λZAPおよびλgt10cDNAライブラリーを再びスクリーニングした。この時のハイブリダイゼーションは、オリゴヌクレオチドプローブの場合と同様の溶液中で60℃、一昼夜行なった。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、1×SSC中室温で30分間、さらに0.1×SSC中65℃で1〜2時間行なった。この結果、約20万のλZAPおよび約20万のλgt10から、それぞれ4クローンと2クローンのP35cDNAが得られた。これらを制限酵素で切断してpBluescript II KS + にサブクローニングし、Sangerらの方法(Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 74, 5463, 1977) に従って塩基配列を決定した。
【0056】
塩基配列の共通部分を重複させた結果、図2、3に示すようなP35cDNA配列が得られた。図1にP35の制限酵素地図を示す。このcDNAは939bpの長さのORF(転写解読枠)を持ち、25アミノ酸からなるシグナルペプチド(図2中の下線部分)とこれに続く288アミノ酸の成熟P35蛋白質をコードしていた。成熟P35(シグナルペプチドを除く)の分子量は実施例1で単離されたP35の分子量とほぼ一致した。
【0057】
図4にP35のドメイン構造を示す。成熟P35のN端側にはコラーゲン様構造があり、6個のアミノ酸をはさんで2回と15回のGly −X−Yの繰り返しが存在する。この構造はMBPのコラーゲン様構造に類似しており、この部分でオリゴマーを形成していると推定される。P35のC端側には、MBPと異なり、218個のアミノ酸からなるフィブリノーゲン様構造が存在する。データバンクとのホモロジイ検索の結果、P35はブタ子宮の細胞膜から単離されたFicolin αおよびβと高いホモロジイをもつことがわかった(参考文献:Ichijo, H.ら、J. Biol. Chem. 268, 14505−14513 (1993))。フィブリノーゲン様構造をもつ蛋白質はこれまで数種類知られている。これらの蛋白質のフィブリノーゲン様配列から得られたコンセンサス配列とP35を比較してみると、システインの位置ならびに幾つかのアミノ酸が完全に保存されていることがわかった。フィブリノーゲン様構造の中にCa結合に関与するEFhand(Tufty & Kretsinger, Science, 187, 167, 1975) に類似した配列が2カ所認められ(図2、3中の破線部分)、P35がCaイオンと結合する可能性を示唆する。P35はその精製過程からレクチンの一種と考えられるが、P35のアミノ酸配列の中にMBPなどのコレクチンに認められる糖鎖認識ドメイン(CRD)と相同の配列は認められなかった。
【0058】
実施例3:オプソニン活性試験
本発明蛋白質のオプソニン活性を示すために、単球の貪食能に対する活性化作用を調べた。
(1) 単球の分離
健康成人から単球を分離した。ヘパリン採血後、Ficoll hypaqueにて単核球の層を取り出し、さらに低張溶菌(hypotonic lysis) にて赤血球を除き、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回洗浄する。RPMI1640+10%ウシ胎児血清(FCS)に浮遊させ、1×107 個/mlに調整する。
上記のように調製した単球浮遊液を8−chamber Lab−Tek slideに500μlずつ分け、37℃のCO2 インキュベーターで培養した。24時間後、付着細胞を0.1%ゼラチンと10mM CaCl 2を含むHBSS(以下、GHBSSという)にて3回洗浄し、これを単球として使用した。
(2) 単球によるサルモネラの貪食
サルモネラは、GHBSS+10mM CaCl 2に浮遊させ、4×108 個/mlに調整する。50μlずつ1.5mlエッペンドルフチューブに入れる。GHBSS+10mM CaCl 2にて20μg/mlに調整したP35を50μl加え、4℃で30分振盪しながら放置する(P35によりサルモネラが凝集するのを防ぐため)。サルモネラはGHBSS+10mM CaCl 2で、1300gで5分、3回洗浄した。200μlのGHBSS+10mM CaCl 2を加えてボルテックスミキサーにより攪拌し、凝集したサルモネラをほぐした。上記のように調製した単球にサルモネラを加えた。37℃で5分、10分、20分、40分培養し、氷冷PBSを追加して貪食を終了させ、さらにPBSで3回洗浄した。May−Giemsa染色し、単球400個に貪食されているサルモネラを数えた。
(3) 結果
結果を図5に示す。─■─はコントロール、─□─はP35の結果を示す。本発明蛋白質P35の添加により単球の貪食能の活性化が認められた。
【0059】
製剤例1(注射剤)
実施例1で得たP35 1mgを滅菌精製水1mlに溶解し、安定化剤としてヒトアルブミンを加え、pHを7.5に調整した。除菌濾過後、バイアル瓶に充填し凍結乾燥して注射剤を調製した。
【0060】
【発明の効果】
本発明の新規蛋白質は、貪食細胞による病原微生物の貪食を活性化するオプソニン活性を有し、細菌、ウイルス、真菌などの病原微生物による感染症の予防又は治療に有用である。
また本発明によれば、当該新規蛋白質をヒト血漿から簡便に、効率よく調製する方法が提供される。
【0061】
さらに本発明は、当該新規蛋白質のアミノ酸配列、および当該蛋白質をコードするDNAの塩基配列を初めて明らかにするものである。かかるアミノ酸配列および塩基配列の解明により、遺伝子工学的手法による本発明蛋白質の製造、それに基づく構造活性相関の研究が可能となる。すなわち、本発明のアミノ酸配列および塩基配列は、当該蛋白質の分子あるいは遺伝子レベルでの物理化学的性状、および生物学的性状の解析に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図1】蛋白質P35のcDNAの制限酵素地図を示す図である。
【図2】蛋白質P35をコードするcDNAの塩基配列およびP35のアミノ酸配列を示す図である(図3に続く)。
【図3】蛋白質P35をコードするcDNAの塩基配列およびP35のアミノ酸配列を示す図である。
【図4】蛋白質P35のドメイン構造を示す図である。
【図5】単球によるサルモネラの貪食に及ぼす蛋白質P35の影響を示すグラフである。
Claims (10)
- 請求項5記載の蛋白質をコードするDNA。
- 図2および図3に示される塩基配列の塩基番号86〜949で示される塩基配列を含む請求項6記載のDNA。
- ヒト血漿をマンナンに接触させ、0.1〜0.5Mマンノース溶液でマンノース結合蛋白質を溶出させた後、0.1〜0.5M N−アセチルグルコサミン溶液で溶出することを特徴とする請求項1〜5のいずれかに記載の蛋白質の製造方法。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の蛋白質を有効成分とする感染症予防治療剤。
- 請求項5記載の蛋白質を有効成分とする感染症予防治療剤。
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