JP2000513209A

JP2000513209A - 抗微生物ペプチドと使用方法

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Publication number: JP2000513209A
Application number: JP09529458A
Authority: JP
Inventors: イー．セルステッド、マイケル
Original assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Current assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Priority date: 1996-02-16
Filing date: 1997-02-13
Publication date: 2000-10-10
Also published as: WO1997029765A1; US6696559B1; AU720405B2; ZA971259B; CA2242660A1; KR19990082383A; AU2122897A; EP0880356A1; EP0880356A4; US6008195A

Abstract

(57)【要約】ウシおよびネズミの好中球から新規な抗微生物ペプチドが提供される。ウシ顆粒球ペプチドＡ（ＢＧＰ−Ａ）およびネズミ顆粒球ぺプチドＡ（ＭＧＰ−Ａ）と称するこのペプチドは、末梢血顆粒球から均質になるまで精製された。。ＢＧＰ−ＡおよびＭＧＰ−Ａのアミノ酸およびヌクレオチド配列もまた提供される。ＢＧＰ−ＡおよびＭＧＰ−Ａの合成型もまた提供される。精製ＢＧＰ−Ａペプチドは、天然のＢＧＰ−Ａの抗微生物活性と区別がつかない抗微生物活性を有することが示された。ＢＧＰ−ＡおよびＭＧＰ−Ａの合成カルボキサミド化アナログ（それぞれＢＧＰ−Ａ−アミドおよびＭＧＰ−Ａ−アミド）もまた提供される。

Description

【発明の詳細な説明】抗微生物ペプチドと使用方法本発明は、アメリカ予防衛生研究所によって付与されたグラントNo.AI22931号に基づき政府の支援を受けて達成された。合衆国政府は本発明に関し一定の権利を有する。１．発明の分野本発明は一般に抗微生物ペプチドに関し、より具体的には、ウシ顆粒球ペプチド−Ａ（ＢＧＰ−Ａ）、ウシ顆粒球ペプチドＡ−アミド（ＢＧＰ−Ａ−アミド）、ネズミ顆粒球ペプチド−Ａ（ＭＧＰ−Ａ）およびネズミ顆粒球ペプチド−Ａ− アミド（ＭＧＰ−Ａ−アミド）並びにそれらの使用方法に関する。２．発明の背景多形核白血球（好中球、顆粒球、ＰＭＮ）の細胞質顆粒は、取り込んだ微生物標的をこれらの細胞に”酸素非依存性”と考えられるメカニズムによって不活化させる抗微生物ペプチドを含む(R.Lehrerら、Blood,76:2169-2181(1990))。これらの顆粒タンパクは、ディフェンシン(defensin)(M.E.Selstedら、Trends in Ce ll Biology,5:114-119(1995))、β−ディフェンシン(M.E.Selstedら、J.Biol.Ch em.，268:6641-6648(1993))、インドリシジン（M.E．Selstedら、J．Biol．Chem .，267:4292-4295(1992))、および他の広域抗生物質ペプチドを含む備蓄部を構成し、これらは食胞融解小体の融合時に食胞中に遊離される。現在までのところ、ディフェンシン族に属する物質が、ヒト(T．Granzら、J．Clin．Invest.,76:1 427-1435(1985))、ウサギ(M.E.Selstedら、J.Biol.Chem.,260:4579-4584(1985)) 、ラット(P.Eisenhauerら、Immun.,58:3899-3902(1987))の好中球から、さらについ最近にはマウス小腸のパーネト細胞(M.E．Selstedら、J．Cell Biol.，118: 929-936(1992))から分離された。β−ディフェンシンは、ウシの好中球(M.E．Se lstedら、J．Biol．Chem.,268:6641-6648(1993))、ウシの気管上皮（G.M．Diamo ndら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:3952-3956(1991)）およびヒト血漿(K.W.Bens chら、FEBS Lett.,368:331-335)の大型顆粒から分離された。さらにインドリシジンはウシＰＭＮの大型顆粒の成分である(R.J.Van Abelら、Int.J.P eptide Protein,45:401-409(1995))。反芻獣の顆粒球の固有の特性は最初ジェンナーロとバギオリーニおよび共同研究者らによって報告された(M.Baggioliniら、Lab.Invest.,52:151-158(1985);R. Gennaroら、J.Cell Biol.,96:1651-1661(1983))。彼らは、ウシ、ヤギ、ヒツジおよびアルプスアイベックスの好中球は、古典的なアズール好性で特異的な顆粒と区別される多くの異常に大きい細胞質顆粒を有することを明らかにした。その後の研究によって、ウシ好中球の抗菌ペプチドの大半はこれら固有の細胞小器官に含まれることが確定された。ロメオとジェンナーロは、ウシ好中球の大型顆粒は、構造的にディフェンシンと異なる強力な殺菌ペプチドを含むことを明らかにした(R.Gennaroら、Infect.Immun.,57:3142-3146(1989);D.Romeoら、J.Biol.Che m.,263:9573-9575(1988))。これらは３つのアルギニン富裕ペプチド（バクテネシンと称される）を含み、これらペプチドはいくつかのグラム陽性およびグラム陰性細菌をインビトロで効果的に殺す。最近、新規なトリデカペプチドアミドであるインドリシジンのウシ好中球からの分離と性状が報告された(M.E.Selstedら、J.Biol.Chem.,267:4292-4295(1992))。この陽イオンペプチドは、異常にトリプトファンに富み、大腸菌および黄色ブドウ球菌に対して強力な殺菌活性を有することが示された。さらに最近、ウシ好中球から１３のβ-ディフェンシンが分離され、これらのペプチドはディフェンシンと共有結合の形で異なっているが、一方同様な折り畳み構造を有することが明らかになった(M.E.Selstedら、J.Biol .Chem.,268:6641-6648(1993))。発明の要旨本発明は抗微生物物質として有用なペプチドを提供する。本発明は、ウシの末梢血顆粒球から新規なトリデカペプチドが発見されたことに端を発する。精製ペプチドおよびそれらのカルボキサミド類似体は強力な抗菌、抗ウイルス、抗原虫および抗真菌活性を有する。これらのペプチド（ＢＧＰ-ＡおよびＭＧＰ−Ａと称する）は、例えばヒトおよび／または獣医用医薬として、または農業、食品科学、もしくは産業分野での薬剤として使用する場合に有効な化合物である。本発明の好ましい実施例の詳細は添付の図面および下記の記述で説明する。一旦本発明の詳細が理解されるに伴い、当業者にはまた別の多くの工夫および改変が可能であることが明らかとなろう。図面の簡単な説明図１は、ＢＧＰ−Ａ精製のクロマトグラフを示す。図１ａは、ウシ好中球顆粒抽出物のゲル濾過クロマトグラフィーを示す。図１ｂは、ピークＥ分画の逆相ＨＰＬＣを示す。図２は、精製ＢＧＰ−Ａの分析を示す。図２ａは分析ＲＰ−ＨＰＬＣを示す。図２ｂは精製ＢＧＰ−Ａの酸尿素ゲルを示す。図３は精製ＢＧＰ-ＡおよびＢＧＰ−Ａ−アミドの酸尿素ＰＡＧＥを示す。図４は、ＢＧＰ−ＡのｃＤＮＡヌクレオチド配列（配列番号：２）および推定されるその前駆体アミノ酸ペプチド配列（配列番号：３）を示す。図５は、ＭＧＰ−ＡのｃＤＮＡヌクレオチド配列（配列番号：４）および推定されるその前駆体アミノ酸ペプチド配列（配列番号：５）を示す。図６は、成熟ＢＧＰ−Ａ（配列番号：６）およびＭＧＰ−Ａ（配列番号：７）のアミノ酸配列を示す。斜線領域は、ＢＧＰ−ＡとＭＧＰ−Ａとの間で保存されている同一アミノ酸を示す。コンセンサスペプチドアミノ酸配列は配列番号：１と同じものである。図７は、天然および合成ＢＧＰ−Ａ並びに合成ＢＧＰ−Ａ−アミドの殺微生物活性を示す。発明の詳細な説明本核酸およびアミノ酸の配列、本組成物、試薬および方法並びのその使用を述べる前に、本発明は本明細書に開示した特定の組成物、試薬、配列および方法論に限定されないことは理解されるべきである。なぜならばそのような組成物、試薬、配列および方法論は変化させることができるからである。さらにまた、本明細書で用いられる用語は単に個々の実施態様を述べることを目的としており、添付の請求の範囲によってのみ制限される本発明の範囲を限定しようとするものではないことはまた理解されるべきである。本明細書および添付の請求の範囲で用いられるように、単数形の”ａ”、”ａｎ”および”ｔｈｅ”は、文脈から明らかにまた別のものを示唆していない限り、複数の指示物も含む。したがって、例えば”１つの試薬”といえば、そのような種々の試薬の１つまたは２つ以上を含み、”１つの抗体”といえば、そのような種々の抗体の１つまたは２つ以上を含む。さらに”該方法”といえば、本明細書に記載されている方法のために改変され、または代りとなりえる同等な工程および当業者に既知の複数の方法が含まれる。また別に規定しない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語および学術用語は、本発明が適合する分野で通常の技術を有する者が通常理解する意味と同じ意味を有する。本明細書で述べたものと同様または同等ないずれの方法、組成物、試薬、配列も本発明を実施またはテストするために用いることができるが、好ましい方法および材料が本明細書に記載されている。本明細書で述べる全ての刊行物は、関連する個々の情報を説明し開示するために、全ての写真、グラフ、等式、イラストおよび図面を含めて本明細書に包含される。上記にいう刊行物は、もっぱら本出願の出願日前の情報開示のために提供される。先行する発明を理由として本発明がそのような開示より日時が先行する資格を持たないということを受け入れたと解されるべきではない。本明細書の記載を通して、提示した好ましい実施態様および実施例は、本発明についての限定というよりはむしろ代表例と解されるべきである。ウシ顆粒球のβ−ディフェンシンの精製中に、以前に性状を明らかにされたものとは異なる小型のペプチドに付随する抗微生物活性が検出された。本明細書に提示するものは、ＢＧＰ−Ａ（ウシ顆粒球で発現される１３残基のペプチド抗生物質）の精製、配列決定、合成、ｃＤＮＡ分離および抗微生物特住である。マウスにおけるＢＧＰ−ＡのホモログのｃＤＮＡ（マウス骨髄より分離、ＭＧＰ−Ａと称する）もまた提示する。推定されるＭＧＰ−Ａ前駆体はＢＧＰ−Ａのそれと極めて類似していた。本発明はまた、ＢＧＰ−Ａ−アミドおよびＭＧＰ−Ａ−アミド（これらはそれぞれＢＧＰ−ＡおよびＭＧＰ−Ａのアナログである）の合成おび抗微生物特性もまた開示する。本発明は、ぺプチド分子（ウシ顆粒球ペプチド−Ａ（ＢＧＰ−Ａ）およびマウス顆粒球ペプチド−Ａ（ＭＧＰ−Ａ）と称される）およびその合成カルボキサミド（ＢＧＰ−Ａ−アミドおよびＭＧＰ−Ａ−アミドと称される）を提供する。これらは、広範囲の抗微生物および抗原虫活性を示し、したがって効果的な抗微生物物質である。ＢＧＰ−ＡおよびＭＧＰ−Ａをコードするポリヌクレオチドは、新規な種類の抗微生物ペプチド遺伝子である。反芻獣とゲッ歯類のこの前駆体構造における高度の保存によって明らかなように、この遺伝子族は顕著に保存されているようである。インドリシジンの生成（M.E.Selstedら、「ペプチド、その化学と生物学(Peptides:Chemistry and Biology，ESCOM J.A．Smith & J.E．Riv er，1992,pp.905-907)と類似の態様で、このペプチドをはるかに大きなプレプロペプチドとして合成し、続いてタンパク分解処理による成熟生成物として顆粒中に封入した。ＢＧＰ−ＡおよびＭＧＰ−Ａペプチドの分離と精製に用いた方法は、先にディフェンシン様ペプチドで用いたものと同様である。そのような方法は米国特許出願番号4453252、4659692、4705777、および5242902号に開示されている（これらの文献は参照により本明細書に含まれる）。本明細書で用いられるように、”抗微生物活性”という用語は微生物の増殖を抑制または不可逆的に防止する化合物の能力を指す。そのような抑制または防止は殺菌（殺微生物）作用または静菌（静微生物）作用によるものであろう。したがって本明細書で用いられる、”殺微生物的抑制”または”微生物増殖の抑制” という用語は、抗微生物ペプチドの標的生物を死滅させるか、または、死滅させないが回復不能の損傷を与える能力を指す。殺微生物的または静微生物的抑制は、現在微生物の増殖が明らかな環境（すなわち治療的処置）またはそのような増殖を支持もしくは維持する危険性を有する環境（すなわち防止または予防）に利用することができる。本明細書で用いられる、”微生物の増殖を支持または維持することができる環境”という用語は、微生物を増殖させることができるか、または微生物が存在することができる液体、組織、空間、器官、表面の物質または生物を指す。そのような環境は、例えば動物の組織、皮膚もしくは体液、水および他の液体、食物、食品もしくは食物抽出物、食物表面、収穫物、およびある種の無生物体であろう。当該環境は必ずしも微生物の増殖を促進するものとは限らず、微生物の存続は許容するのみでもありうる。ＢＧＰ−ＡまたはＭＧＰ−Ａの抗微生物（または抗菌）活性は、当技術分野の通常の技術の１つを用いて種々の病原体に対して測定することができる。微生物を適切な濃度に増殖させ、適切な培地（例えばアガローストリプチカーゼ大豆培地）と混合し、ＢＧＰ-ＡまたはＭＧＰ−Ａと接触させる。適切に保温した後、抗微生物活性は抗菌サンプル周囲の透明帯から明瞭にわかる。透明帯はペプチド濃度に依存する。抗微生物活性決定のまた別の方法は、本明細書の実施例５および”材料および方法”の表題の項に記載するが、当業者には周知である。また、抗微生物活性を達成するＢＧＰ−ＡおよびＭＧＰ−Ａの最少抑制濃度( ＭＩＣ)は、標準的技術にしたがって多数の異なる微生物について決定できる。簡単に記せば、細胞を適切な細菌用培地で一晩約３７℃で増殖させ、同じ培地で希釈して約１０⁴から１０⁵ＣＦＵ／ｍｌの濃度を得る。ブロスの希釈は、例えば連続的に希釈した微生物とペプチドの組合せを混合して９６穴（ウェル）のマイクロタイタープレートで設定される。連続希釈ペプチド濃度を含む連続希釈細菌または他の微生物を添加した後、プレートを約３７℃で一晩保温する。次の日、ウェル中の微生物の有無についてプレートのスコアを調べて、当該スコアからＭＩＣを決定する。本明細書で用いられるように、ＢＧＰ−Ａ、ＢＧＰ−Ａ−アミド、ＭＧＰ−ＡおよびＭＧＰ−Ａ−アミドという用語は、正味の陽性荷電をもつ鎖を作る一般に約８から２０アミノ酸を有するペプチドまたはペプチド模造物を指す。言い換えれば、これらは陽イオンペプチドである。本発明のペプチドは、好ましくは１つまたは２つ以上の芳香族アミノ酸を有する。実例となるペプチド配列は図４〜６に提示され、配列番号：１、３、５、６および７で説明されている通りである。完全な長さのＢＧＰ−ＡｃＤＮＡは長さが６８８ヌクレオチド（配列番号：２）で、１９０残基で構成される２１ｋＤの予想前駆体（配列番号：３）を含む。前駆体ペプチド内では、最初の２１残基のうち１１は疎水性で、シグナルペプチドと予想される。シグナルペプチドドメインの後に１５６残基を含む介在プロペプチド領域が続く。前駆体の最後の１３残基が成熟ＢＧＰ−Ａペプチド配列(ＹＫＩＩＱＱＷＰＨＹＲＲＶ(配列番号：６))に対応する。完全な長さのＭＧＰ−ＡｃＤＮＡは長さが６７９ヌクレオチド（配列番号：４）で、ＢＧＰ−Ａについて述べたものと同様なシグナルプロペプチドドメインを含む前駆体ペプチド（配列番号：４）が予想される（図５）。ネズミのＭＧＰ−ＡｃＤＮＡによって予想される成熟ペプチド配列は、１３残基のうち７残基がＢＧＰ−Ａと同じである（ＹＱＶＩＱＳＷＥＨＹＲＥ）（図６、配列番号：７）。成熟ＢＧＰとＭＧＰペプチドとの間のコンセンサス配列は図６および配列番号：１で説明されているが、図６では斜線領域はＢＧＰ−ＡとＭＧＰ−Ａ間で保存されている同一アミノ酸を示す。配列番号：１はＹＸＸＩＱＸＷＸＨＹＲのアミノ酸配列を有し、ここでＸはいずれのアミノ酸でもよい。本発明のペプチドは配列番号：１のコンセンサス配列を含む。一般にＣ−末端は、分子が活性を維持できるように正味の陽性荷電を含むべきであると考えられている。例えば、配列番号：１、６および７の全てはアルギニン（Ｒ）残基で終わり、配列番号：６はアルギニン（Ｒ）とバリン（Ｖ）で終わり、さらに配列番号：７はグルタミン酸（Ｅ）で終わる。本発明でマウスとウシの種間コンセンサス配列、および本発明のペプチドをコードする個々のＤＮＡの両方が提供されるならば、本明細書に開示した教示および当技術分野で通常の方法（「分子クローニング：実験室マニュアル（ Molecular Cloning:A Laboratory Manual）」、最新版、Cold Spring Harbor La boratory刊、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、この文献は参照により本明細書に含まれる）を用いてヒト、ブタ、ヒツジなどを含む他の種から相同なＢＧＰ／ＭＧＰ配列を分離するために通常の技術者による過度の実験は必要ではないであろう。ペプチドの抗微生物活性を減じることなくＢＧＰ−ＡまたはＭＧＰ−Ａアミノ酸配列について種々の改変を為しえることは理解されよう。そのような改変（アミノ酸の付加、欠失または置換を含む）を示すＢＧＰ−ＡまたはＭＧＰ−Ａペプチドまたはペプチド模造体も本発明の範囲内に含まれる。本明細書で用いられる、”実質的に同じ配列”という用語は、例えば図４、５および６並びに配列番号：１、３、５、６および７で示すようにＢＧＰ−ＡまたはＭＧＰ−Ａと同一であるか、または顕著な相同性を有する配列を指す。機能の強化をもたらす限定的な改変を当該ペプチドに対して実施できることは理解されるところである。同様に、ペプチドの生物学的機能を破壊せずに限定的改変を為しえること、さらに活性に影響を与えるためには完全な一次構造の単に一部分のみが必要とされることもまた理解されるところである。例えば、完全にはその活性を破壊しないこれら配列の僅かな改変もこの定義およびそのような請求の範囲の化合物の定義に含まれる。改変には例えばアミノ酸残基の付加、欠失または置換、アミノ酸構造または機能を模倣する化合物による置換の他にアミノ基およびアセチル基のような化学的部分の付加が含まれる。改変は意図的でも、または偶発的（例えば抗微生物活性を示すＢＧＰ−ＡまたはＭＧＰ−Ａペプチドを産生するホストの突然変異によって）でもよい。当該ペプチドがその抗微生物活性を保持するかぎり、これら改変の全てが包含される。ある場合には、本発明の合成ペプチド中に１つまたは２つ以上の非天然アミノ酸を含むことが所望されるであろう。可能な非天然アミノ酸は、通常は少なくともＮ−末端およびＣ−末端を有し、さらに天然のアミノ酸対応物と同一であるかまたは化学的に改変または置換された側鎖を有するであろう。非天然アミノ酸の例は、天然に存在するＬ−アミノ酸の光学異性体である。全てのペプチドはＬアミノ酸を用いて合成されたが、全てのＤ型ペプチドも合成によって製造することができる。さらに、本発明のペプチドの抗微生物活性を高めるために、Ｃ−末端誘導体（例えばＣ−末端メチルエステル）を製造できる。本発明にしたがって多くの改変が考えられる。天然の配列中の特定残基の置換という明白なアプローチの他に、別の実施態様では、Ｄ−アミノ酸からのペプチドの合成が含まれる（したがってプロテアーゼによる不活化の可能性が減少する）。そのような手段は当技術分野では同様に周知である（Wadeら、ＰＮＡＳ,ＵＳＡ87:4761-4765(1990) ）。化学的改変または置換の例には、天然のアミノ酸内のＣ−Ｈ結合のヒドロキシル化または弗素化が含まれる。そのような技術は生物学的化合物の薬剤類似体の製造で用いられ、当業者には知られている。好ましい実施態様では、本発明のペプチドの改変は、カルボキシ末端アミドを用いた改変を含む。当業者は、より強い抗微生物活性およびより広いホスト域を有するペプチドを完成させるために同様な置換を実施することができる。例えば本発明は、配列番号：１、３、５、６および７で説明するようなペプチドとともに、ペプチドが抗微生物活性を保持するかぎりそのアナログ、誘導体または機能的フラグメントを含む。本発明のペプチドの一次アミノ酸配列の僅かの改変によって、本明細書の配列番号：１、３、５、６および７に記載する固有のペプチドと比較したとき実質的に同等な抗微生物活性を含むペプチドが得られうる。そのような改変は（位置特異的突然変異のように）意図的でもよいし、また偶発的でもよい。これらの改変によって生成されるペプチドの全ては、本来のペプチドの抗微生物的、生物学的活性がなお存在するかぎり本明細書に含まれる。本発明のＢＧＰ−ＡまたはＭＧＰ−Ａペプチドはまた、ＢＧＰ−ＡまたはＭＧＰ−Ａの活性が保持されるかぎり、当該ペプチドの機能的フラグメント、当該ペプチドをコードする核酸配列の機能的フラグメントを含む。ＢＧＰ−ＡまたはＭＧＰ−Ａの生物学的活性を含むより小さなペプチドもまた、当該ペプチドの全体または機能的フラグメントをコードするより小さな核酸配列が本発明に含まれるのと同様に本発明に含まれる。本発明のペプチドの機能的フラグメントまたは該ペプチドの機能的フラグメントをコードする核酸配列の相対的な有効性は、該ペプチドフラグメントに対する微生物の感受性を決定することによって当業者は容易に決定できる。ペプチドの機能的フラグメントの有効性は、該フラグメントまたはそのようなフラグメントをコードする核酸配列の潜在的な殺微生物的または静微生物的活性を、配列番号：６または７のＢＧＰ− ＡまたはＭＧＰ−Ａペプチドの殺微生物的活性と比較して測定することによって評価される。試験は、本明細書の材料と方法の”抗微生物アッセイ”の項および実施例５で述べるように、または当業者に周知の他の標準的抗微生物試験（例えばＭＩＣ）によって実施される。さらに、１つまたは２つ以上のアミノ酸の欠失によって、その生物学的活性を顕著に変えることなく生じたペプチドの構造の改変がもたらされる。これによって、また有用性を有する、より小さな活性ペプチドの開発がもたらされる。例えば、個々のペプチドの生物学的活性には必要ではないアミノまたはカルボキシ末端のアミノ酸を除去できる。本発明のペプチドは、本明細書に記載したその活性が保持されるかぎり、本発明で開示したペプチドの一切のアナログ、ホモログ、変異体、異性体または誘導体を含む。本発明の方法および組成物はまた、ＢＧＰ −Ａ、ＭＧＰ−Ａ、ＢＧＰ−Ａ−アミドまたはＭＧＰ−Ａ−アミドの生物学的活性と機能的に匹敵する生物学的活性を有する合成非ペプチド組成物を利用することができる。”機能的に匹敵する”ということは、非ペプチド分子の形状、大きさ、可撓性および電子的立体配置が、当該分子の生物学的活性の観点に鑑みてＢＧＰ−Ａ、ＭＧＰ−Ａ、ＢＧＰ−Ａ−アミドまたはＭＧＰ−Ａ−アミドペプチドと同様であるようなものであるということを意味する。特に、この非ペプチド分子は匹敵する抗微生物活性を示すべきである。そのような非ペプチドは、約１００から１０００ダルトンの範囲の分子量をもつ小さな分子であろう。そのような小分子の使用は薬理学的組成物の調製に有利である。そのような非ペプチド類似体分子の特定は、薬剤デザインの技術分野で既知の技術を用いて実施できる。そのような技術には、自己無撞着場（ＳＣＦ）分析、配置間相互作用（ＣＦ）分析、および通常モード力学コンピューター分析（これらは全て学術文献に詳しく記載されている；Reinら、「レセプターリガンド相互作用のコンピューター支援モデリング（Computer-Assisted Modeling of Recept or-Ligand Interactions）」、Alan Liss,NY,(1989)を例えば参照のこと）が含まれるが、これらに限定されない。同定化合物の調製は当該化合物の所望される性状に左右されるが、標準的な化学的合成技術を伴う（Caryら、「高等有機化学(Ad vanced Organic Chemistry)」、パートＢ、Plenum Press刊、ＮＹ,(1983)を参照のこと）。本明細書で用いられる”保存的変型”という用語は、別の生物学的に同様な残基によるアミノ酸残基の置換を指す。保存的変型の例には１つの疎水性残基（例えばイソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニン）を別のものと置換すること、または１つの極性残基を別のものに置換すること、例えばリジンの代わリにアルギニンを、アスパラギン酸の代わりにグルタミン酸を、またはアスパラギンの代わりにグルタミンを置換することなどが含まれる。”保存的変型”はまた、置換ペプチドに対して作製した抗体がまた非置換ペプチドとも免疫反応するということを条件に未置換親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸を使用することを含む。本発明のＢＧＰ−ＡまたはＭＧＰ−Ａペプチドは当技術分野で周知の方法、例えば自動ペプチド合成装置によって、組換え体の方法によって、または周知の手動ペプチド合成法によって合成できる。さらにそれらは、天然の供給源（例えば白血球細胞）から、および脊椎動物（好ましくは哺乳類起源）の骨髄から精製できる。そのような細胞または組織は当業者に周知の手段によって得ることができる。本明細書で用いる”実質的に純粋”という用語は、実質的に他のタンパク脂質、炭水化物または当然付随する他の物質を含まないＢＧＰ−ＡもしくはＭＧＰ− Ａ核酸またはタンパクを指すか、または実質的に純粋と称されるペプチドまたはタンパクがそのインビボの細胞環境から単離されていることを意味する。当該実質的に純粋なペプチドおよびタンパクは、分離と精製がなされているため、未分離の不純なペプチドまたはタンパクが不適な用途において有用である。当業者は、タンパク精製について標準的な技術を用いてＢＧＰ−ＡまたはＭＧＰ−Ａを精製することができる。実質的に純粋なペプチドは、酸−尿素ゲルで単一の主要バンドを生じる。ＢＧＰ−ＡまたはＭＧＰ−Ａの純度はまた、アミノ末端アミノ酸配列分析および分析用ＲＰ−ＨＰＬＣによって決定できる。本発明はまた、ＢＧＰ−ＡまたはＭＧＰ−Ａタンパクをコードするポリヌクレオチドを提供する。これらのポリヌクレオチドには、ＢＧＰ−ＡまたはＭＧＰ− ＡをコードするＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＲＮＡ配列が含まれる。ＢＧＰ−ＡまたはＭＧＰ−Ａの全体または部分をコードする全てのヌクレオチドはまた、それらがＢＧＰ−ＡまたはＭＧＰ−Ａ活性をもつペプチドをコードする限り本発明に含まれる。そのようなポリヌクレオチドには、天然に存在するポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチドおよび意図的に操作して作製したポリヌクレオチドが含まれる。例えばＢＧＰ−ＡまたはＭＧＰ−Ａポリヌクレオチドを位置特異的突然変異に付すことができる。本発明のポリヌクレオチドには遺伝暗号の結果として縮退配列が含まれる。２０の天然アミノ酸が存在するが、そのほとんどは１つ以上のコドンによって指定される。したがって、すべての縮退ヌクレオチド配列は、当該ヌクレオチド配列によってコードされるＢＧＰ−ＡまたはＭＧＰ−Ａペプチドのアミノ酸配列が機能的に変化しない限り本発明に含まれる。ＢＧＰ−ＡまたはＭＧＰ−Ａをコードするポリヌクレオチドには、図４および５（配列番号：２および４）のヌクレオチド配列とともに相補的核酸配列が含まれる。相補的配列はアンチセンスヌクレオチドを含むことができる。当該配列がＲＮＡの場合は、配列番号：２および４のデオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、ＣおよびＴはリボヌクレオシドＡ、Ｇ、ＣおよびＵにそれぞれ置き換えられる。本発明にまた含まれるものは、長さが少なくとも１５塩基である上記の核酸配列のフラグメントで、この長さは、フラグメントが、生理学的条件下で図４および５（配列番号：３および５）のタンパクをコードするＤＮＡ（配列番号：２および４）と選択的にハイブリダイズすることを可能にするために十分である。本発明によってまた提供されるものは、ＢＧＰ-ＡまたはＭＧＰ−Ａペプチドをコードする核酸配列、ベクターおよびそれらを含むホスト細胞並びに組換えによって製造されるペプチドを提供するための発現方法である。この方法は、当該核酸が伝達されおよび／または翻訳される適切な条件下でペプチドをコードする核酸を含むホスト細胞を増殖させ、さらにそのようにして産生されたペプチドを分離する工程を含む。本発明のペプチドが分離された後、このペプチドをコードする核酸は、以下のように周知の方法によって分離される。これら分離された核酸はベクターに連結され、適切なホスト細胞に発現のために導入される。核酸の連結および細胞内での核酸の発現の方法は当技術分野で周知である（「分子クローニング：実験室マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual）」(1989)Cold Spring Harb or Laboratory刊、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、最新版；この文献は参照により本明細書に含まれる）。本明細書で特に開示されるものは、ＢＧＰ−ＡまたはＭＧＰ−Ａのコード配列の活性部分を含むｃＤＮＡである。当業者はこの配列を用いて、他の完全な長さのクローンを分離することができるであろう。完全な長さのＢＧＰ−ＡｃＤＮＡは長さが６８８ヌクレオチド（配列番号：２）で、それから１９０残基から成る２１ｋＤの前駆体（図４、配列番号：３）が予想される。ＢＧＰ−Ａ前駆体の中で、最初の２１残基の１１が疎水性で、シグナルペプチドと推定される（G.Von Heijne,Eur.J.Biochem.,133:17-21(1983)）。シグナルペプチドドメインの後には１５６残基を含む介在ペプチド領域が続く。当該前駆体の最後の１３残基が成熟ＢＧＰ−Ａペプチド配列（配列番号：６）と対応する。完全な長さのＭＧＰ− ＡｃＤＮＡは長さが６７９ヌクレオチド（配列番号：４）で、ＢＧＰ−Ａについて述べたものと同様なシグナルプロペプチドドメインを含む前駆体が予想される（図５、配列番号：５）。この類似性を基にしてネズミ骨髄ｃＤＮＡから分離された配列をネズミ好中球ペプチドＡ（ＭＧＰ−Ａ、図５、配列番号：５および７）と呼ぶ。ネズミｃＤＮＡによって推定される成熟ペプチド配列は、１３残基のうち７残基がＢＧＰ−Ａと同一である（図６、配列番号：７）。図６の斜線領域は、ＢＧＰ−ＡとＭＧＰ−Ａとの間の保存された同一のアミノ酸を示す。当該コンセンサスペプチドアミノ酸配列はＹＸＸＩＱＸＷＸＨＹＲ（配列番号：１）で、ここでＸはいずれのアミノ酸でもよい。本発明のＤＮＡ配列はいくつかの方法によって得ることができる。例えば、ＤＮＡは、当技術分野で既知のハイブリダイゼーション技術を用いて分離できる。これらの方法には以下が含まれるが、ただしこれらに限られるものではない：１）相同なヌクレオチド配列を検出するためのゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーとプローブのハイブリダイゼーション、２）目的のＤＮＡとアニーリングすることができるプライマーを用いたゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応、３）共通の構造的特性をもつクローン化ＤＮＡフラグメントを検出するための発現ライブラリーの抗体スクリーニング。核酸分子対の配列（または単一核酸分子内の２つの領域）は、対の一方の各々のヌクレオチドと当該対の他方の各々のヌクレオチドとの間で塩基の対合反応が生じるならば、互いに” 相補的”であると言う。核酸分子対（または単一核酸分子内の２つの領域）は、それらの間で塩基の対合反応によって二重体（duplex）を形成するならば、互いに”ハイブリダイズ”すると言う。当技術分野で知られているように、核酸対間のハイブリダイゼーションは、ハイブリダイズする領域間で完全な相補性を必要としないが、当該ハイブリダイゼーション条件下で二重体を維持するために十分なレベルの塩基対合が存在することが必要である。ハイブリダイゼーション反応は、典型的には低度から中等度のストリンジェンシー条件下で実施されるが、このような条件では幾つかの非特異的相互反応が生じる。ハイブリダイゼーションの後で、中等度または高度なストリンジェンシー条件下で洗浄を実施して非特異的結合を排除する。当技術分野で知られているように、最適洗浄条件は経験的に、例えば徐々にストリンジェンシーを高めることによって決定できる。ストリンジェンシーに影響を与えるために変化させることができる条件パラメーターには例えば温度、塩濃度が含まれる。一般に、塩濃度が低いほどおよび温度が高いほど、ストリンジェンシーは高くなる。例えば、ハイブリダイゼーション溶液と同等または低い塩濃度を含む溶液を用いて、洗浄を低温(例えば室温)で開始することができる。同じ塩濃度を含む溶液の温度を徐々に高めながらその後の洗浄を実施することができる。また別には、洗浄工程で塩濃度を下げて温度は維持することができ、また塩濃度を下げて温度を高くすることができる。また別のパラメーター（例えば脱安定化剤（例えばホルムアミド）の使用）を変化させストリンジェンシーに影響を与えることができる。核酸のハイブリダイゼーション反応では、個々のレベルのストリンジェンシーを達成するために使用される条件は、ハイブリダイズされる核酸の性状によって変動するであろう。例えば、核酸のハイブリダイゼーション領域の長さ、相補性の度合い、ヌクレオチド配列の組成（例えばＧＣ対ＡＴ含有量）および核酸の種類（例えばＲＮＡ対ＤＮＡ）を、ハイブリダイゼーション条件を選択する際に考慮することができる。さらにまた考慮しなければならないことは、核酸の一方を例えばフィルターに固定するか否かである。ストリンジェンシー条件を徐々に高める場合の例は以下の通りである：ほぼ室温で２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（ハイブリダイゼーション条件）；ほぼ室温で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（低いストリンジェンシー条件）：約４２℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（中等度のストリンジェンシー条件）；および約６８℃で０．１×ＳＳＣ（高いストリンジェンシー条件）。洗浄はこれら条件のうち１つのみ（例えば高いストリンジェンシー条件）を用いるか、または上記の順に上記の工程のいずれかまたは全てを繰り返しながら条件の各々を例えばそれぞれ１０〜１５分用いて実施できる。しかしながら、上記で述べたように、最適条件は、含まれる個々のハイブリダイゼーション反応にしたがって変動し、経験的に決定できる。好ましくは本発明のＢＧＰ−ＡまたはＭＧＰ−Ａは哺乳類生物、最も好ましくはネズミ、ウシまたはヒトに由来する。核酸ハイブリダイゼーションによるスクリーニング方法は、適切なプローブが利用可能であるということを条件に一切の遺伝子配列の分離を可能にする。オリゴヌクレオチドプローブ（これは目的のタンパクをコードする配列の部分に相当する）は、化学的に合成できる。そのためには、アミノ酸配列の短い一続きのオリゴヌクレオチドが既知であることが必要である。このタンパクをコードするＤＮＡ配列は遺伝暗号から推定できるが、コードの縮退が考慮されなければならない。配列が縮退している場合は混合添加反応を実施することが可能である。これは、変性二本鎖ＤＮＡの異種混合物を含む。そのようなスクリーニングのために、ハイブリダイゼーションは好ましくは一本鎖ＤＮＡまたは変性二本鎖ＤＮＡの何れかで実施される。目的のペプチドに関連するｍＲＮＡ配列が極めて僅かしか存在しない供給源に由来するｃＤＮＡクローンの検出の場合にハイブリダイゼーションは特に有用である。言い換えれば、非特異的結合を避けるためにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を用いることによって、例えば、混合物中の、ただ１つのプローブに対する完全な相補物である標的ＤＮＡのハイブリダイゼーションによって、特異的なｃＤＮＡクローンのオートラジオグラフィーによる視覚化が可能である(Wallaceら、Nucl .Acid Res.,9:879(1981))。したがって、目的のＢＧＰ−ＡまたはＭＧＰ−Ａ遺伝子の部分的なＤＮＡ配列が与えられるならば、当業者は、過度の実験を行うことなく完全な長さのｃＤＮＡクローンの分離のためのプローブを調製することができるであろう(Ausubelら、「分子生物学の最新プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)」ユニット6.3-6.4、Greene Publ.刊(1994)：Maniatisら、「分子クローニング(Mole cular Cloning)」、Cold Spring Harbar Laboratories刊、最新版)。ＢＧＰ−ＡまたはＭＧＰ−Ａをコードする特異的なＤＮＡ配列の相補物はまた以下によって得ることができる：１）ゲノムＤＮＡから二本鎖ＤＮＡ配列の分離；２）目的のペプチドのために必要なコドンを提供するＤＮＡ配列の化学的な製造；および３）真核ドナー細胞から分離されたｍＲＮＡの逆転写による二本鎖ＤＮＡ配列のインビトロ合成。後者の場合、一般にｃＤＮＡと呼ばれるｍＲＮＡの二本鎖ＤＮＡ相補物が最終的に形成される。組換え方法で使用する特異的ＤＮＡ配列を作製するための上記の３つの方法のうち、ゲノムＤＮＡ単離体の分離は最も一般的ではない。これは、哺乳類のペプチドを微生物で発現させたい場合にイントロンの存在のために特に言えることである。所望のペプチド精製物のアミノ酸残基の完全な配列が分かっている場合は、ＤＮＡ配列の合成はしばしば選択される方法である。所望のペプチド精製物のアミノ酸残基の完全な配列が分かっていない場合は、ＤＮＡ配列の直接合成は不可能で、選択される方法はｃＤＮＡ配列の合成である。目的のｃＤＮＡ配列を分離するための標準的な方法の中ではとりわけ、プラスミドまたはファージによって運ばれるｃＤＮＡライブラリーの形成がある。このライブラリーは、高レベルで遺伝子が発現されているドナー細胞に豊富なｍＲＮＡの逆転写に由来する。ポリメラーゼ連鎖反応技術と合わせて用いれば、稀な発現生成物でもクローン化できる。ペプチドのアミノ酸配列の大部分が分かっているような場合には、標的ｃＤＮＡでの存在が推定される配列の複製である標識一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡプローブの製造を、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション工程で用いることができる。この工程は、一本鎖型に変性させたｃＤＮＡのクローン化コピーＤＮＡで実施される(Jayら、Nucl.Acid,11:2325(1983))。いくつかの種類のベクターが利用可能で、本発明を実施するために用いることができる。それらは、例えばプラスミド、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスベクター、バキュロウイルスベクターおよび酵母で使用するベクターである。ベクターがプラスミドであるときは、当業者に知られている通り、当該ベクターは一般に、プロモータ、シグナル配列、表現型選択遺伝子、複製開始部位および他の必要な成分を含む種々の成分を含む。原核細胞ベクターで最も一般的に用いられるプロモータにはｌａｃＺプロモータ系、アルカリホスファターゼｐｈｏＡプロモータ、バクテリオファージλＰＬプロモータ（温度感受性プロモータ）、ｔａｃプロモータ（ｌａｇリプレッサによって調節されるハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモータ）、トリプトファンプロモータ、およびバクテリオファージＴ７プロモータが含まれる。本発明の実施に有用な他のベクター成分はシグナル配列である。この配列は典型的には当該ペプチドをコードする核酸の５’に近接して見出され、したがって融合タンパクのアミノ末端に転写される。しかしながら、ある種の事例では、シグナル配列は分泌タンパクをコードする遺伝子の５’以外の場所に存在することが示された。この配列は、それが細菌細胞の内膜を貫通して付着しているタンパクを標的とする。シグナル配列をコードするＤＮＡは、シグナル配列を有するペプチドをコードするいずれの核酸からも制限エンドヌクレアーゼフラグメントとして得ることができる。適切な原核細胞シグナル配列は、例えばＬａｍｂまたはＯｍｐＦ(Wongら、Gene 68:193(1983))、ＭａｌＥ、ＰｈｏＡ、ＯｍｐＡおよび他の遺伝子をコードする遺伝子から得ることができる。本発明を実施するために好ましい原核細胞シグナル配列は、チャンら(Changら、Gene,55:189(1987))が記載した大腸菌熱耐性腸毒素ＩＩ（ＳＴＩＩ）のシグナル配列である。本発明を実施するために用いられるベクターの別の有用な成分は表現型選択遺伝子である。典型的な表現型選択遺伝子は、ホスト細胞に抗生物質耐性を付与するタンパクをコードするものである。説明すれば、アンピシリン耐性遺伝子（ａｍｐ）およびテトラサイクリン耐性遺伝子（ｔｅｔ）がこの目的のために容易に利用できる。前述の成分とともに所望のペプチドをコードする遺伝子を含む適切なベクターの構築は、標準的な組換えＤＮＡ法を用いて調製できる。ベクターを形成するために結合させる分離ＤＮＡフラグメントを切断し、整え、特定の順序と方向性で一緒に連結して所望のベクターを作製する。ＤＮＡは標準的な工程にしたがって調製する（Maniatisら、分子クローニング：実験室ニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)」cold Spring Har bor Laboratory刊、cold Spring Harbor,NY.最新版、この文献は参照により本明細書に含まれる）。ＤＮＡフラグメントをベクターに連結しようとする場合には、ベクターを先ず適切な制限エンドヌクレアーゼで切断することによって直線化する。この直線化ベクターを続いてアルカリホスファターゼまたはウシ腸管ホスファターゼで処理することができる。ホスファターゼ処理は連結工程時におけるベクターの自己連結を防止する。連結後、異種遺伝子を挿入したベクターで適切な宿主細胞を形質転換させる。適切な原核ホスト細胞には、大腸菌ＪＭ１０１株、大腸菌Ｋ１２の２９４株（AT CC No.31446）、大腸菌Ｗ３１１０株(ATCC No.27325)、大腸菌Ｘ１７７６（ATCC No.31537）、大腸菌ＸＬ−1Ｂｌｕｅ（Strategene）、および大腸菌Ｂが含まれるが、多くの他の大腸菌株（例えばＨＢ１０１、ＮＭ５２２、ＮＭ５３８、ＭＮ５３９）並びに多くの他の原核細胞種および属も同様に用いることができる。上記に挙げた大腸菌の他に、杆菌（例えば枯草菌）、他の腸内細菌科（例えばネズミチフス菌または霊菌）および種々のシュードモナスの種も全てホストとして用いることができる。原核細胞の形質転換は塩化カルシウムまたは当業者に周知の他の方法によって容易に達成できる。電気穿孔(Neumannら、EMBO J.,1:841(1982))もまたこれらの細胞の形質転換に用いることができる。形質転換細胞は抗生物質中で増殖させることによって選択される。この抗生物質は、通常はテトラサイクリン（ｔｅｔ）たはアンピシリン（ａｍｐ）で、形質転換細胞はベクター上のｔｅｔおよび／またはａｍｐ耐性遺伝子のために耐性となっている。形質転換細胞の選別後、これらの細胞を培養で増殖させ、続いてプラスミドＤＮＡ（または挿入された外来遺伝子を含む他のベクター）を分離する。プラスミドＤＮＡは当技術分野で既知の方法を用いて分離できる。この精製プラスミドＤＮＡを続いて制限地図作成および／またはＤＮＡの配列決定によって分析する。上記に概略した工程に続いて、哺乳類細胞株、例えばミエローマ（Ｐ３−６５３）、ハイブリドーマ（ＳＰ２／０）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、およびミドリザル腎（ＣＯＳＩ）およびネズミ線維芽細胞（Ｌ４９２）がペプチド発現に適したホスト細胞である。これらの”哺乳類”ベクターはプロモータ、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、シグナル配列および選択可能マーカー、例えばジェネティシン（ネオマイシン耐性）、ミコフェノール酸（キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）またはヒスチジノール（ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ）を含むことができる。哺乳類ホスト細胞で使用する適切なプロモーターには、Ｉｇカッパ、Ｉｇガンマ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）極初期、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期、マウス乳癌（ＭＭＴＶ）ウイルスおよびメタロチオネインが含まれるが、これらに限定されるものではない。適切なエンハンサーには、Ｉｇカッパ、Ｉｇ重鎖、ＣＭＶ初期およびＳＶ４０が含まれるが、これらに限定されるものではない。適切なポリアデニル化配列にはＩｇカッパ、Ｉｇ重鎖およびヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）が含まれる。ベクターがバキュロウイルスの場合、適切なプロモータおよびエンハンサー配列にはＡｃＭＧＰＶポリヘドリン、ＡｃＭＧＰＶＥＴＬおよびＡｃＭＧＰＶｐ１０配列が含まれるが、これらに限定されない。特に適切なポリアデニル化シグナルはポリヘドリンＡｃＭＧＰＶである。Ｉｇカッパ、Ｉｇ重鎖およびＡｃＭＧＰＶは適切なシグナル配列の例である。これらのベクターは、とりわけ以下の昆虫細胞株（ＳＦ９、ＳＦ２１およびＨｉｇｈ５）で有用である。また別には、ペプチドを酵母株、例えばＰＳ２３−６Ａ、Ｗ３０１−１８Ａ、ＬＬ２０、Ｄ２３４−３、ＩＮＶＳＣ１、ＩＮＶＳＣ２、ＹＪＪ３３７で発現させることができる。プロモータおよびエンハンサー配列、例えばｇａｌｌおよびｐＥＦＴ−１が有用である。Ｖｒａ−４はまた適切なエンハンサー配列を提供する。機能的な”複製開始点”として有用な配列にはａｒｓ１および２μ環状プラスミドが含まれる。本発明は、ＢＧＰ−ＡもしくはＭＧＰ−Ａペプチドまたはそのフラグメントと免疫反応する抗体を含む。個々の単クローン性抗体調製物のみならず、本質的に異なるエピトープ特異性を有する混合単クローン性抗体から成る抗体群もともに提供される。単クローン性抗体は当該タンパクのフラグメントを含む抗原から当業者に周知の方法によって作製される(Kohlerら、Nature,256:495(1975))。抗ＢＧＰ−Ａまたは抗ＭＧＰ−Ａ抗体は当技術分野で慣用的な方法によって作製できる。例えば、多クローン性抗血清は適切な動物、例えばウサギ、ネズミまたはラットで作製できる。ＢＧＰ−ＡまたはＭＧＰ−Ａペプチドは合成によって得られたものでも天然に得られたものでも、動物を免疫するために用いることができる。免疫原は当業者に周知の手段で動物を免疫するために用いることができる。血清サンプルは抗ＢＧＰ−Ａまたは抗ＭＧＰ−Ａ力価が適切になるまで採取する。抗血清の種々の分画、例えばＩｇＧを当技術分野で周知の手段によって分離することができる。また別には、ＢＧＰ-ＡまたはＭＧＰ−Ａ免疫原はまた当技術分野で周知の手段によって単クローン性抗体を得るために用いることができる（Ha rlowら、「抗体:実験室マニュアル(Antibodies:A Laboratory Manual)」、Cold Springs Harbor Laboratory刊(1988)を例えば参照のこと）。抗ＢＧＰ−Ａまたは抗ＭＧＰ−Ａ抗体は、生物学的サンプル（例えば組織サンプル）中のＢＧＰ−ＡまたはＭＧＰ−Ａの存在を検出するために用いることができる。適切な検出可能二次抗体を用いて視覚化して、ＢＧＰ−ＡまたはＭＧＰ− Ａに結合した一次抗体を特定することができる。検出手段には、放射性ヌクレオチド、酵素基質（例えばペルオキシダーゼ）の使用が含まれる。例えば、抗ＢＧＰ−Ａが標準的方法で作製され、ウシの骨髄調製物（細胞学的サンプル）を染色することが示された。特に顆粒球（例えば好酸球）がＢＮＰ−Ａについて強く染色された。本発明で用いられる”抗体”という用語は、完全な分子とともにエピトープ決定基に結合できるそのフラグメント（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ')2、およびＦｖ）を含む。これらの抗体フラグメントはその抗原またはレセプターと選択的に結合する能力を保持し、以下のように定義される：（１）Ｆａｂ：抗体分子の１価の抗原結合フラグメントを含むフラグメント、Ｆａｂフラグメントは完全な抗体を酵素パパインで消化して、完全な１つの軽鎖および１つの重鎖の部分を生じ作製される；（２）Ｆａｂ’：抗体分子のフラグメント、Ｆａｂ’は完全な抗体をペプシンで処理し、続いて還元し、完全な軽鎖と重鎖の部分を生じることによって得られる。抗体分子１つにつき２つのＦａｂ’フラグメントが得られる；（３）(Ｆａｂ')2：完全な抗体を酵素ペプシンで処理し、その後還元を行わないで得られる抗体フラグメントである。Ｆ(ａｂ')2は、２つのジスルフィド結合によって結合された２つのＦａｂ’フラグメントの二量体である；（４）Ｆｖ：軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含み、２つの鎖として発現される遺伝子工学的に作製されたフラグメントと定義される；および（５）一本鎖抗体（”ＳＣＡ”）：軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域を含み、これらが遺伝子的に単一鎖分子として適切なペプチドリンカーによって連結されている遺伝子工学的に作製された分子と定義される。これらのフラグメントを作製する方法は当技術分野で知られている(Harlow & Lane，「抗体：実験室マニュアル(Antibodies:A Laboratory Manual)」、Cold S pring Harbor Laboratory刊、ニューヨーク、最新版：この文献は参照により本明細書に含まれる）。本発明で用いられるように、”エピトープ”という用語は、抗体のパラトープが結合する抗原上の一切の抗原決定基を意味する。エピトープ決定基は通常は分子の化学的に活性な表面基（例えばアミノ酸または糖の側鎖）から成り、通常特異的な三次元構造特性とともに特異的な荷電特性を有する。必要な場合には、多クローン性または単クローン性抗体は、例えばそれに対して抗体を作製したペプチドを結合させたマトリックスに結合させ、それを溶出させることによってさらに精製することができる。当業者は多クローン性抗体と同様単クローン性抗体の精製および／または濃縮のために免疫学分野において一般的な種々の技術(Coliganら、ユニット９、「免疫学の最新プロトコル(Current P rotocols in Immunology)」、Wiley Interscience刊、最新版：この文献は参照により本明細書に含まれる)について習熟しているであろう。エピトープを模倣する単クローン性抗体を作製するために抗イディオタイプ技術を用いることもまた可能である。例えば、第一の単クローン性抗体に対して作製した抗イディオタイプ単クローン性抗体は、第一の単クローン性抗体が結合するエピトープに非常に相似度の高い高可変領域の結合ドメインを有する。 ”精製抗体”という語句は、当該抗体に自然の状態で付随しているタンパクおよび天然に存在する有機分子を含まない、少なくとも６０重量％の抗体を意味する。好ましくは当該調製物は少なくとも７５重量％、より好ましくは９０重量％、さらに最も好ましくは少なくとも９９重量％抗体（例えば抗ＢＧＰ−Ａ特異的抗体）である。精製抗体は、例えば組換えによって作製したタンパクまたは保存モチーフペプチドおよび標準的技術を用いてアフィニティークロマトグラフィーによって得ることができる。本発明は、完全な単クローン性または多クローン性抗体だけでなく、免疫学的に活性な抗体フラグメント（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’ または(Ｆａｂ')2フラグメント）または遺伝子工学によって作製したＦｖフラグメント（Landerら、米国特許第4946788号）も利用することができる。 ”特異的に結合する”とは、特定のタンパクを認識し結合する抗体（例えば抗ＢＧＰ−Ａ特異的抗体または抗ＭＧＰ−Ａ特異的抗体）を指し、これは、当然タンパクが含まれるサンプル中の他の分子を実質的に認識せず、さらにそれらと結合しない。本発明の組成物は多くの微生物（例えばカビ、細菌（グラム陽性および陰性の両方）、原虫およびウイルス）に対して活性を有することは理解されるべきである。種々の組成物は種々の生物に対して様々な程度の活性を有するであろう。本発明のペプチドはまた、細菌による分解からタンパクを保護する保存料として作用させるために該タンパクと混合することができる。また別には、本ペプチドまたは組成物は、多くの製剤形で（例えばコンタクトレンズ溶液、軟膏、シャンプー、医薬、食品など）保存料および消毒薬として用いることができる。組成物中に用いられるペプチドの量は、他の成分の性状、どの程度の保護が必要とされるか、さらに組成物の使用目的にしたがって変動するであろう。好ましい実施態様では、治療量の本発明の抗微生物ペプチドの投与が提供される。本明細書に開示した１つまたは２つ以上のペプチドは、単独または脂質ファシクル調製物として抗真菌剤としての有用性を有するであろう。後者のアプローチは、非ペプチド抗真菌剤アンホテリシンとともに用いられて成功した。個々の応用は標的とされる病原体に左右される。例えば、エイズ患者の粘膜皮膚の真菌疾患の一般的原因である鵞口瘡カンジダ（C.albicans、これはいくつかのβ−ディフェンシンに極めて高い感受性を有する）は、ＢＧＰ−ＡまたはＭＧＰ−Ａを基にした治療薬によって、または現在用いられている第一線の薬剤と併用してこのような患者でより効果的に制御することができるであろう。同様にＢＧＰ−ＡまたはＭＧＰ−Ａは獣医用医薬として用いることができる。本発明の治療薬としての利点の１つは、当該ペプチドの免疫原性が低いということである。天然の供給源から精製されようと合成であろう、ＢＧＰ−ＡまたはＭＧＰ−Ａは、治療の必要のある対象者に経口投与を含む種々の手段によって投与することができる。経口投与では、好ましくは胃の中での遊離を避けるために遅放性型製剤である。また別には、これらは鼻胃保温また腹腔カテーテルによって投与することができる。ＢＧＰ−ＡまたはＭＧＰ−Ａの個々のペプチドは単独で投与するか、または組み合わせたものを同時にもしくは連続して投与するか、さらには他の抗微生物組成物と併用して投与することもできる。さらに、本発明はヒトの細菌または真菌の感染を治療する医薬組成物を提供する。この医薬組成物は、ヒトの細菌および真菌の感染を治療するために有効な量の本発明の精製ペプチドおよび医薬的に許容できる担体を含む。細菌の増殖を抑制する本発明の方法には、併用治療または相助治療のためのさらなる抗生物質の添加が含まれる。投与される適切な抗生物質は、典型的には細菌の感受性（例えばグラム陰性であるかまたはグラム陽性であるか）に左右され、当業者は容易に識別することができるであろう。本発明のペプチドとの相助治療に有用な抗生物質の具体的な種類の例には、アミノグリコシド系（例えばトブラマイシン）、ペニシリン系（例えばピペラリシン）、セファロスポリン系（例えばセフタジジム）、フルオロキノロン系（例えばシプロフロキサシン）、カルベペネム系（例えばイミペネム）、テトラサイクリン系およびマクロライド系（例えばエリスロマイシンおよびクラリスロマイシン）が含まれる。細菌の増殖を抑制する本発明の方法には、併用治療または相助治療のためのさらなる抗生物質の添加が含まれる。投与される適切な抗生物質は、典型的には細菌の感受性（例えばグラム陰性であるかまたはグラム陽性であるか）に左右され、当業者は容易に識別することができるであろう。上記の抗生物質の他に、典型的な抗生物質には、アミノグリコシド系（アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネチルミシン、トブラマイシン、ストレプトマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、エリスロマイシンエストレート／エチルスクシネート／グルセプテート／ラクトビオネート／ステアレート）、ペニシリンのようなβ−ラクタム系（例えばペニシリンＧ、ペニシリンＶ、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、アンピシリン、アモキシシリン、チカルシリン、カルベニシリン、メズロシリン、アズロシリンおよびピペラシリン）、またはセファロスポリン系（例えばセファロシン、セファゾリン、セファクロル、セファマンドール、セフォキシチン、セフロキシム、セフォニシド、セフメタゾール、セフォテタン、セフプロジル、ロラカルベフ、セフェタメト、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフタジジム、セフェピム、セフィキシム、セフポドキシムおよびセフスロジン）が含まれる。他の種類の抗生物質には、例えばカルバペネム系（例えばイミペネム）、モノバクタム系（例えばアズトレオナム）、キノロン系（例えばフレロキサシン、ナリジキシン酸、ノルフロキサシン、シプロフロキサシン、オフロキサシン、エノキサシン、ロメフロキサシンおよびシノキサシン）、テトラサイクリン系（例えばドキシサイクリン、ミノサイクリン、テトラサイクリン）およびグリコペプチド系（例えばバンコマイシン、テイコプラニン）が含まれる。他の抗生物質には、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、トリメトプリム、スルファメトキサゾール、ニトロフラントイン、リファンピンおよびムピロシンが含まれる。本発明のある種の実施態様では、可溶性タンパクの処理はサイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーまたは逆相、高速、液体クロマトグラフィーを含む。しかしながら、ペプチド精製のための可溶性タンパクの処理は、当業者に既知の多くの方法によって達成できることは当業者には理解されよう（それらは全て本発明の意図するところである）。さらに、本発明の実施態様の１つでは、顆粒回収のための顆粒球の処理は密度勾配遠心沈殿を含む。本発明はまた、細菌または真菌を殺すために有効量の精製ペプチドおよび適切な担体を含む組成物を提供する。そのような組成物は、細菌または真菌と戦うために多くの態様で、例えば、当技術分野で周知の担体を用いて家事用または実験室用抗微生物製剤として使用することができる。本発明の組成物は、局所適用に適した生理学的に許容できる担体中に取り込まれたＢＧＰ−Ａ、ＢＧＰ−Ａ−アミド、ＭＧＰ−ＡまたはＭＧＰ−Ａ−アミドを単独または併用した状態で含む。当該組成物は、約１０ｕｇ／ｍｌから２０００ｕｇ／ｍｌ、好ましくは５０ｕｇ／ｍｌから５００ｕｇ／ｍｌを含む。担体の特質は適用しようとする領域にしたがって変わる。皮膚に適用する場合は、以下を含む適切な基剤を含むクリームまたは軟膏基剤が好ましい：ラノリン、シルバデン（商標）（Sivadene（商標）,Marion；特に火傷の治療用）、アクアフォア（商標）（Duke Laboratories，サウスノーウォーク、コネチカット）など。天然または合成包帯および他の創傷用包帯にＢＧＰ−Ａ、ＢＧＰ−Ａ−アミド、ＭＧＰ−ＡまたはＭＧＰ−Ａ−アミドペプチドを取り込ませて創傷を当該ペプチドに持続的に曝露させることもまた可能であろう。エアロゾル用アプリケーターでもまた本発明を使用することができる。本ペプチドが抗微生物剤として用いられる場合、それらは、種々の塩および緩衝液を含む緩衝水性媒体中で製剤化できる。塩はほとんどの場合についてアルカリおよびアルカリ土類のハロゲン化物、燐酸化物および硫酸塩、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウムまたは硫酸ナトリウムであろう。種々の緩衝液、例えばクエン酸、燐酸、ＨＥＰＥＳ、トリスなどが、治療を受けるホストにとってそのような緩衝液が生理学的に許容できる程度で用いられる。当該化合物がその後溶液としての使用のために凍結乾燥粉末として製剤化される場合は、種々の賦形剤または他の添加物を用いることができる。賦形剤には種々のポリオール、不活性粉末または他の膨張剤が含まれるであろう。製剤およびホストの特質にしたがって、本化合物は種々の態様で投与することができる。製剤は局所的に注射によって（例えば静脈内、腹腔内、鼻咽頭内など）適用できる。本発明の別の特徴では、殺微生物的に有効な量の本発明の精製ペプチドおよび適切な担体を含む組成物もしくは医薬組成物または医薬的に許容できる担体として、さらに洗剤を含むことができる。そのようなペプチド組成物への洗剤の添加は、本発明の新規ペプチドの抗菌、抗ウイルス、抗真菌特性を強化するために有用である。適切な何れの洗剤も用いることができるが、現時点で好ましい洗剤は非イオン性洗剤、例えばトゥイーン２０または１％ＮＰ４０である。本発明はまた、ヒトの微生物、細菌、ウイルスまたは真菌の感染を治療する医薬製剤または組成物を提供する。当該製剤または組成物は、本発明の精製ペプチドまたは、ヒトの微生物、細菌、ウイルスもしくは真菌感染の治療に有効な量のペプチドを、医薬的に許容できるリポソームまたは他の配送用輸送体に取り込み配送することができる遺伝子伝達および遺伝子発現ベクターを含む。 ”製剤”とは、遺伝子伝達および遺伝子発現の能力を有する組成物を指し、これはヌクレオチド配列を標的細胞に（または直接標的細胞内に）配送することができ、その結果、ヌクレオチド配列を含む製剤が標的細胞の最外側膜の細胞質側に取り込まれ、遺伝子発現を達成して検出可能レベルの配送ヌクレオチド配列の遺伝子発現が標的細胞で生じる。より好ましくは、細胞膜の細胞質側に配送された後、エンドソーム内分解または溶解性分解を受けることなく、検出可能レベルの配送ヌクレオチド配列の遺伝子発現が標的細胞で生じるように遺伝子発現を達成することができる機能的状態で、標的細胞の核内に続いて輸送される。標的細胞内部の発現レベルの遺伝子またはヌクレオチド配列は、一定期間の間、細胞内のヌクレオチド生成物が生物学的に有益な有効量の遺伝子生成物を提供できるような量で、または機能的に有益な生物学的効果を提供できるような量で遺伝子発現を提供することができる。本明細書で用いられるように、製剤という用語は以下の例を指すが、しかしながら(絶対的にも暗示的にも)それらに限定されない：（１）正味の特性または正味の荷電が陽イオン、陰イオンまたは中性であるリポソームまたはリポソーム試薬またはリポソーム組成物。；（２）多価陽イオンとリガンドとともにイオン的に複合体を形成するＤＮＡ、核酸または核酸発現ベクター。複合体形成の結果、〔ＤＮＡ＋多価陽イオン＋リガンド〕組成物として標的細胞の細胞表面レセプターにリガンドを介して結合した後、標的細胞内にエンドサイトーシスによって取り込まれ、続いてＤＮＡがリガンドと多価陽イオンとの結合から解離し、その後の発現のために機能的な状態で細胞の核に配送されるようなもの。当業者は、例えば以下のような作用をもつペプチド配列を含む、組成物における種々の改変を考案することができよう：（ａ）標的細胞に取り込まれた後、組成物がリソソーム小胞から離れさせておくことにより、エンドソームによる溶解から組成物を保護する作用か、または（ｂ）核酸に付きそって核エンベロープの穴を通り細胞の核内に入り、核に標的を集中させる薬剤の作用。以前に報告された同様な試薬はアシアロ糖タンパクーポリリジン共役物である(Wuら、J．Biol．Chem.，262:14621(1988);Wuら、J．Biol．Chem.，264:16985(1989)) 。；（３）裸の核酸；（４）圧縮核酸または圧縮試薬；または（５）微量注入できるプラスミドまたは裸の核酸(Wolffら、Science，247:1465(1990));(６)ウイルスまたはレトロウイルスベクター組成物中の核酸；および（７）コロイド分散液(Felgnerら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，84:7413(1987);Onoら、Neuroscie nce Lett.,117:259(1990);Brighamら、Am.J．Med.，Sci.，298:278(1989);Staub inger & Papahadjopoulos，Meth．Enz.，101:512(1983))。ヌクレオチド配列を標的細胞に配送する他の組成物が可能なことは、当業者には理解されよう。医薬的に許容できる何れのリポソームも本発明のペプチドの輸送体として用いることができることは当業者には容易に理解されよう。そのようなリポソーム組成物は、上記でより詳細に考察した本発明の他の組成物の活性と同様に多くの微生物に対抗する活性を有する。さらに、これらの組成物は、上記でまたより詳しく考察したような慣用的で周知の種々の方法で投与することができる。本明細書で用いられる“治療的に有効”とは、医薬的に許容できる担体中の製剤、組成物または試薬の量を指し、それはそのような治療を受けた患者または動物の状態を改善するために十分な量である。“改善する”とは、治療を受ける対象者の病的状態または疾患の有害な作用を減少させることを意味する。本発明の主体は好ましくはヒトであるが、何れの動物も本発明の方法で治療することができることは想像に難くない。”調節する”という用語は、医薬的に許容できる担体と組み合わせて抗微生物活性を発現、または機能を、強化し、抑制し、変化または改変させることを意味する。医薬的に許容できる投与用担体調製物は、滅菌されたまたは水性もしくは非水性溶液、懸濁液および乳濁液が含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えばオリーブ油）および注射可能有機エステル（例えばオレイン酸エチル）である。水性担体は水、アルコール／水溶液、乳濁液または懸濁液（食塩水および緩衝媒体を含む）を含む。非経口用輸送体としては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液または固定油を含む。活性な治療成分はしばしば、医薬的に許容でき、活性成分と適合する賦形剤と混合される。適切な賦形剤は、水、食塩水、デキストロース、グリセロールおよびエタノールまたはそれらの組合せを含む。静脈内用輸送体には、液体および栄養補充液、電解質補充液（例えばリンゲルデキストロースを基にしたもの）などが含まれる。保存料および他の添加剤（例えば抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガスなど）もまた含むことができる。本発明に含まれる治療のための別のアプローチは、通常の投与技術（例えば局所注射、吸入または全身投与があるが、これらに限らない）のいずれかによって試薬または組成物を微生物、細菌、ウイルスまたは真菌感染者に直接投与することを含む。試薬、製剤または組成物はまた、本明細書に記載するいずれかの方法によって特定の細胞またはレセプターに集中させることができる。微生物、細菌、ウイルスまたは真菌疾患を調節する試薬、製剤または組成物の実際の投与量は、生物体の大きさおよび健康状態を含む多くの因子に左右されるが、当業者は、使用する適切な投与量を決定するために、臨床投与量を決定するための方法および技術を述べた下記の教示を利用することができる(B.Spilker，「臨床研究およびプロトコル作成の手引（Guide to Clinical Studies and Developing Protocols ）」、Raven Press Books,Ltd.,刊、ニューヨーク(1984)、pp.7-13,54-60;B.Spil ker，「臨床試験の手引（Guide to Clinical Trials）」、Raven Press Ltd.,刊、ニューヨーク(1991)、pp.93-101;C.Craig ＆ R.Stitzel編、「最新薬理学(Moder n Pharmacology)」、第２版、Little Brown & Co.,ボストン(1986)、pp.127-33; T.Speight編、「アベリーの薬剤治療:臨床薬理学と治療の原理と実際(Avery's Dr ug Treatment:Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics)」、第３版、Williams & Wilkins刊、バルチモア(1987)、pp.50 -56;R.Tallarida,R.Raffa ＆ P.McGonigle，「総合薬理学の原理(Principles in General Pharmacology)」、Springer-Verlag刊、ニューヨーク(1988)、pp.18-20) )。然し、一般には約０．１ｍｇ／ｋｇから１０００ｍｇ／ｋｇ、より具体的には約１．０ｍｇ／ｋｇから５００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１０ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇの範囲の包括的最終濃度が、医薬的に許容できるいずれかの担体とともに成人に一日につき投与される。本発明のペプチドはまたＬＰＳ結合疾患の治療に用いることができる。ＬＰＳ関連疾患について、ＬＰＳ関連疾患（例えば内毒素血症、敗血症）治療の場合に本明細書で用いられる“治療的に有効な量”という用語は、対象者のＬＰＳに対する反応を減少させ、さらにＬＰＳ関連疾患（例えば敗血症）の症状を減少させるために十分なＢＧＰ−ＡまたはＭＧＰ−Ａペプチドの量を指す。“治療的に有効”という用語はしたがって、臨床的に顕著なＬＰＳの血漿レベルの増加を防止するために十分なＢＧＰ−ＡまたはＭＧＰ−Ａペプチド量、好ましくは少なくとも５０％減少、より好ましくは９０％減少させるために十分なＢＧＰ−ＡまたはＭＧＰ−Ａペプチド量を含む。ＢＧＰ−ＡまたはＭＧＰ−Ａ投与の服用量範囲は所望の効果を生じるために十分に大きいものである。一般に服用量は、年令、健康状態、性別、および細菌または本明細書で述べたような他の生物体による患者の感染の程度によって変動し、当業者はこれを決定することができる。服用量はいずれかの禁忌に際して個々の医師によって調節される。いずれの場合にも治療の有効性は、患者のＬＰＳまたはＬＰＳ関連分子(例えば腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)) のレベルをモニターすることによって決定できる。血清ＬＰＳおよびＴＮＦレベルの減少は、ＬＰＳ関連疾患の軽減と正の相関性を示す。また別の実施態様では、本発明は、食物の保存料としてまたは潜在的病原体を排除する目的で食品を処理するために用いることができる。後者の用途は、重篤なヒトの疾患を引き起こす腸の病原体に関する重要な問題を抱える魚および家禽産業を標的とするであろう。別の実施態様では、ＢＧＰ−ＡまたはＭＧＰ−Ａは、微生物の夾雑を排除しなければならない一切の製品で使用する消毒剤として用いることができる。また別の実施態様では、ＢＧＰ−ＡまたはＭＧＰ−Ａは、食用収穫物のための抗微生物剤として（収穫後腐敗を減少させる製剤として、またはホストの抵抗性を強化するために遺伝子伝達により発現させる製剤として）用いることができる。当該ペプチドの抗生物質特性、抗微生物、抗ウイルス特性のゆえに、それらは、微生物またはウイルス汚染を受けやすい物質の保存料または消毒剤としてもまた用いることができる。本発明のＢＧＰ−ＡまたはＭＧＰ−Ａペプチドは、広い抗菌スペクトルをもつ抗微生物剤として種々の特定の応用に向けて利用できる。そのような応用には、（サルモネラ、エルジニア、赤痢菌を含む生物に対する）加工食品の保存料として単独または抗菌食品添加物（例えばリゾチーム）と組み合わせて使用する当該ペプチドの使用；（シュードモナス、ストレプトコッカスに対する）局所剤として、さらに臭い発生微生物（ミクロコッカス）を殺すための当該ペプチドの使用が含まれる。上記の応用について本発明のペプチドの相対的有効性は、これらペプチドに対するいずれかの生物体の感受性を決定することによって当業者は容易に決定できる。微生物の増殖の維持が可能な環境における微生物の増殖の殺微生物的抑制または静微生物的抑制の方法として、当該装置または無形の対象物に殺微生物的または静微生物的に有効な量のペプチドを与えることによって、微生物の増殖を望まない装置または無形の対象物に当該ペプチドを取り込ませることもまた可能である。そのような装置または対象物には、リネン、布、プラスチック、移植装置、（例えば心臓のペースメーカー、外科用ステント）、表面または貯蔵容器が含まれるが、これらに限定されない。被覆は、非特異的吸収または共有結合による付着によって達成できる。実施例以下の実施例は、本発明を説明するためであり、（明瞭であれ暗示的であれ）いかなる態様においても本発明を制限するものと解してはならない。それらは代表的な使用例であるが、一方、当業者に既知の他の方法または技術も代替として用いることができる。材料および方法ウシ好中球多形核白血球（ＰＭＮ）を１リットルの新鮮なクエン酸加ウシ血液から精製した。３７℃、７００×ｇで４０分沈降させた後、赤血球カラムを７秒間低張溶解に付し、その後３×リン酸緩衝食塩水を用いて等張に戻した。続いて白血球に富む浮遊液を１２０×ｇ（４℃、１５分）で沈降させた。この操作を１回または２回繰り返して残留赤血球を溶解させた。血球計算法および鑑別計測によって定量するために適量を取り出した。この工程で得られた調製物は、全血１リットルにつき平均４×１０⁹個の細胞を含み、そのうちの９７±３％が好中球であった。調製物を２ｍＭのジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ）で処理した。続いて好中球調製物を２０分４℃に冷却し、パー・ボンブ（Parr bomb）(N．Bor rregaardら、J.Cell Biol.,97:52-61(1983))で窒素空洞現象によって破壊した。空洞化物を８００×ｇで１０分４℃で遠心沈殿し、顆粒含有上清を採集した。顆粒は２７０００×ｇで４０分遠心して集め、−８０℃で保存した。ＰＭＮ顆粒抽出物１×１０⁹個の細胞由来分あたり５ｍｌの氷冷１０％酢酸を用い、１〜５×１０¹⁰ＰＭＮから得た凍結顆粒調製物を抽出した。氷上で１８時間攪拌した後、懸濁液を２７０００×ｇで２０分、４℃で遠心して清澄にし、この上清を凍結乾燥し−７０℃で保存した。サイズ排除クロマトグラフィー凍結乾燥顆粒抽出物を１０％酢酸で約１×１０⁹個細胞由来分／ｍｌの濃度で溶解し、遠心によって清澄にして、５％酢酸中で平衡化させたバイオゲルＰ−６０の４．８×１１０ｃｍカラムに載せた。溶出速度２ｃｍ／時間で８℃でカラムに液を流し、２８０ｎｍで連続的にモニターしながら１５ｍｌの分画を採集した。逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）１×２５ｃｍのバイダック(Vydac)Ｃ−１８カラムでウォーター(Waters)５１０二元系を用いてＲＰ−ＨＰＬＣによって、サイズ排除カラムから溶出した低分子量成分をさらに分離した。水および０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）または０．１３％ヘプタフルオロ酪酸（ＨＦＢＡ）を含むアセトニトリルを勾配溶出に用いた。精製ペプチドを凍結乾燥し、０．０１％酢酸に1００〜５００μｇ／ｍｌで溶解して−７０℃で保存した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ；１４）および酸−尿素(M.E.Selstedら、An al.Biochem.,155:270-274(1986))ゲル電気泳動を用いて、前述のように分子の質量および／またはタンパク調製物の純度を概算した(M.E.Selstedら、Infect.Imm un.,45:150-154(1984))。アミノ酸分析天然および過ギ酸酸化、または還元およびアルキル化サンプルの６Ｎ塩酸水解物で各ペプチドのアミノ酸組成を決定した(B.A．Bidlingmeyerら、J．Chromatog r.,336:93-104(1984))。トリプトファン含有量は、配列分析およびエデルホック（Edelhoch）の方法(H.Edelhoch,Biochem.,6:1948-1954))によりベックマン（Be ckmann）ＤＵ６０分光光度計を用いて分光測定によって決定した。配列分析配列分析のために精製ＢＧＰ−Ａを自動エドマン配列分析に付した。自動配列分析は、オンラインでＰＴＨ−アミノ酸分析を行うアプライドバイオシステム４７５Ａ装置で実施した。配列は、一次構造の当該アミノ酸組成との比較およびｃＤＮＡクローニングによって確認した。ペプチド合成ＢＧＰ−Ａ−アミドおよびＭＧＰ−Ａ−アミドは、３０分の結合時間で標準的なＦｍｏｃ／ＢＯＰ／ＨＯＢｔ／ＮＭＭ活性化によってミリポア９０５０自動合成装置で０．４mmolスケールで合成した。遊離酸ペプチドのための出発樹脂はＦｍｏｃ−Ｌ−バリン−ＰＥＧ−ＰＳ(Millipore)で、ペプチドアミドのためには出発樹脂はＦｍｏｃ−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳであった（G.Baranyら、Intercept. ，R.Epton,Andover，イギリス(1992)、pp.29-38:R.J.Van Abelら、Int.J.Peptid e Proteinへの投稿者は掲載拒絶を撤回するように求めている、45:401-409(1995 ))。側鎖保護基は、アルギニンにはＰｍｃ、グルタミンおよびヒスチジンにはトリチル、リジンにはｔＢｏｃ、およびチロシンにはｔＢｕであった。Ｆｍｏｃの脱保護は２％ピペリジンおよび２％のＤＢＵを用い１５分をかけた。トリプトファンおよびイソロイシンには二重共役を施した。チェーンアッセンブリーに続いて、樹脂を切断し試薬Ｋ（８２．５％ＴＦＡ、５％フェノール、５％チオアニソール、５％の水おび２．５％エタンジチオール）で４時間脱保護した。ペプチド溶液を酢酸で３０％にしてジクロロメタンで抽出し、水相を凍結乾燥した。精製は、０．１％ＴＦＡおよび１分につき０．３３％で展開したアセトニトリル直線勾配を用いて２２．５×２５０ｍｍ調製バイダックＣ−１８カラムでＲＰ−ＨＰＬＣによって実施した。精製ペプチドをアミノ酸分析、酸−尿素ゲル電気泳動および分析用ＲＰ−ＨＰＬＣで解析した。ｃＤＮＡ分離と性状決定ＢＧＰ−Ａ：コムチンンスキーとサッキーの酸グアニジニウムチオシアネート −フェノール抽出法(P.Chomczynskiら、Analyt.Biochem.,162:156-159(1987))を用いてウシの骨髄から全ＲＮＡを分離した。続いて骨髄全ＲＮＡ（１ｍｇ）をニワトリ逆転写酵素を用いて、製造元の指示にしたがってｃＤＮＡ第一鎖を合成した(５’−ＲＡＣＥシステム:Life Technologies,Gaithersburg，メリーランド) 。このｃＤＮＡを３’−ＲＡＣＥのための鋳型として用いた。このシステムでは、縮退遺伝子特異的プライマーがオリゴ（ｄＴ）₁₅−アンカープライマーと組み合わせて使用され、ＢＧＰ−ＡｃＤＮＡの３’末端を生じる。ＰＣＲ増幅は以下のサイクルパラメーターを用いて実施した：９５℃、１分；５５℃、１分；７２ ℃、１分で３５サイクル。５’ＲＡＣＥは、第一の鎖のｃＤＮＡのテールをターミナルトランスフェラーゼによって付加したこと、および種々の遺伝子特異的プライマー並びにアンカープライマーを用いたことを除いて同様な態様で実施した。ＰＣＲ増幅ＲＡＣＥ生成物をサブクローニングし、以前に記載されたように配列を決定した(N.Y.Yountら、J.Immunol.,155:4476-4484(1995))。ＢＧＰ−ＡｃＤＮＡの５’および３’末端が判明するや、完全な長さのＢＧＰ−Ａ配列に対応するＰＣＲ生成物を作製して配列分析によって性状を調べることができた。ネズミの骨髄の全ＲＮＡおよびｃＤＮＡ第一鎖をＢＧＰ−Ａの場合のように生成した。続いて２つの遺伝子特異的プライマーを用いて、ＢＧＰ−Ａホモログに対応する配列をＰＣＲで増幅した。この配列をサブクローニングして上記のように配列決定を実施した。抗微生物アッセイ以前に述べたように、殺微生物懸濁液アッセイで標的生物として大腸菌ＭＬ３５、黄色ブドウ球菌５０２Ａ、鵞口瘡カンジダ（C.albicans)およびカンジダ・ネオフォルマンス(C.neoformans)を用いた（M.E.Selstedら、「遺伝子工学：原理と方法(Genetic Engineering：Principles and Methods)」、J.K．Setlow，Pl enum Press刊、ニューヨーク(1993),pp.131-147）。実施例１ＢＧＰ−Ａの精製ウシＰＭＮ顆粒の酸可溶性タンパクの以前の電気泳動分析では、これらの調製物は、１０００から２０００００Ｄのサイズのタンパク質群の複雑な混合物を含むことが示された(M.E.Selstedら、J.Biol.Chem.,267:4292-4295(1992))。上記の"材料と方法"の項で述べたように、１．３×１０¹⁰の好中球に由来する顆粒に富む分画の酢酸抽出物についてバイオゲルＰ６０カラムでクロマトグラフィーを実施した。約２×１０¹⁰個の細胞由来分の酸可溶性顆粒タンパクをバイオゲルＰ６０で分画し、"材料と方法"の項で述べたように、１つに合わせた溶出分画の抗菌活性をアッセイした。ピークＥに対応する分画を凍結乾燥し、ＲＰ−ＨＰＬＣによる更なる精製を実施した。各ピーク（Ａ−Ｆ、図１Ａ）は黄色ブドウ球菌および大腸菌に対して殺菌活性を含んでいた。ピークＦはもっぱら、インドリシジン、新規な１３残基の抗生物質ペプチドアミド(M.E,Selstedら、J.Biol.Chem.,2 67:4292-4295)）を含み、ピークＥは少なくとも１３のβ−ディフェンシンを含んでいた。ピークＥ分画を１つに合わせ、さらにＨＰＬＣで精製した。ピークＥの合体分画の１／１０を、流速３．０ｍｌ／分で０．１％ＴＦＡ／水（溶媒Ａ）で平衡化した１×２５ｃmのバイダックＣ−１８カラムに載せた。０．１％ＴＦＡ（溶媒Ｂ）を含むアセトニトリルの直線勾配（２０％から４５％）を０．３３％／分の速度で用いた。ファルマシア(Pharmacia)Ｆｒａｃ−２００分画採集装置のピークカッティングモードを用いて分画を採集した。ピークＥ分画の最初のＲＰ−ＨＰＬＣ精製によって複雑なクロマトグラムが得られた（図１Ｂ）。ここでは、酸 −尿素ＰＡＧＥで調べたとき殆どのピークが２つまたは３つ以上のペプチドを含んでいた。しかしながら、ＢＧＰ−Ａは、ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラフィーの初期に実質的に純粋な単離ピーク（星印“＊”で図１Ｂに表示）として溶出した。最終的精製は２回目のＲＰ−ＨＰＬＣで得られた。実施例２ＢＧＰ−Ａのアミノ酸および配列分析ＢＧＰ−Ａの組成はアミノ酸分析によって確定された（図２）。約５μｇの精製ＢＧＰ−Ａを、流速１．０ｍｌ／分の０．４×２５ｃｍのバイダックＣ−１８カラムに注入した。溶媒は図１Ｂについて上記で述べたものと同じである。勾配条件：２５分で１０％Ｂから５０％Ｂ。図２Ｂは精製ＢＧＰ−Ａの酸−尿素ゲルである。精製ＢＧＰ−Ａの２μｇサンプルを１２．５％の酸−尿素ポリアクリルアミドゲルに載せ、２５０Ｖで４時間電気泳動した（レーン２）。ウシ好中球顆粒から得た粗酸抽出物の１００μｇサンプル（レーン１）を平行して流した。１５％ホルマリンを含むクーマシーブルーで染色した。ＢＧＰ−Ａの吸収スキャンを３００から２００ｎｍの間で実施し、チロシンとトリプトファン含有量の正確な算定量が得られた(H.Edelhochら、Biochem.,6:1948-1954(1967))。自動配列分析を２nmolのＢＧＰ−Ａで実施した。反復配列分析によって平均≧９０％が得られ、１３残基全ての明瞭な割り当てが可能であった。ＢＧＰ−Ａの完全なアミノ酸配列は以下の通りである： Tyr-Lys-Ile-Ile-Gln-Gln-Trp-Pro-His-Tyr-Arg-Arg-Val(配列番号：５、図６) ＢＬＡＳＴアルゴリスム(S.F.Altschulら、J.Molec.Biol.,215:403-410(1990)) を用いたタンパク配列検索によって、GenBankデータベースには同様なアミノ酸配列は存在しないことが明らかになった。実施例３ＢＧＰ−ＡおよびＢＧＰ−Ａ−アミドの合成２つの合成ＢＧＰ−Ａ型をＮ^α−Ｆｍｏｃ保護アミノ酸として集めた。（精製ペプチドの酸−尿素ゲルパターンは図３に示す。）１２．５％酸−尿素ゲルに２ −４μｇの天然ＢＧＰ−Ａ（図３、レーン１）、合成ＢＧＰ−Ａ（図３、レーン２）または合成ＢＧＰ−Ａ−アミド（図３、レーン３）を載せた。染色は図２で述べた通りである。ＨＰＬＣ精製物質の収量は、遊離酸型について３１．４％でカルボキサミド化型で２２．１％であった。実施例４ＢＧＰ−ＡｃＤＮＡクローンの分離と配列決定完全な長さのＢＧＰ−ＡｃＤＮＡは長さが６８８ヌクレオチド(配列番号：２) で、ペプチドは１９０残基（配列番号：３）から成る２１ｋＤ前駆体である。ＢＧＰ−Ａ前駆体の中で、最初の２１残基のうち１１残基が疎水性でシグナルペプチドと推定される（Von Heijne,G.Eur.J.Biochem.,133:17-21(1983)）。シグナルペプチドドメインの後には１５６残基を含む介在プロペプチドが続く。前駆体の最後の１３残基は成熟ＢＧＰ−Ａペプチド配列に対応する（配列番号：６）。ＢＧＰ−Ａ前駆体が他のヌクレオチドまたはタンパク配列と相同であるか否かを決定するために、GenBankデータベースのブラスト検索を実施した。ＢＧＰ− Ａ配列と未知の組織に由来するネズミの腺癌から分離された部分的ｃＤＮＡ配列との間にある程度の相同性が認められた。ネズミの腺癌とＢＧＰ−Ａ配列に由来するコンセンサスプライマーを用いて、マウス骨髄からＢＧＰ−Ａ様配列をコードするｃＤＮＡ（図５、配列番号：５）が分離された。この完全な長さのｃＤＮＡは長さが６７９ヌクレオチド（配列番号：４）で、ＢＧＰ−Ａについて述べたものと同様なシグナルプロペプチドドメインを含む前駆体を予想した（図５、配列番号：５）。ネズミｃＤＮＡによって予想される成熟ペプチド配列は、ＢＧＰ −Ａと１３残基のうち７残基で同一である（図６、配列番号：７）。この類似性を基に、ネズミ骨髄ｃＤＮＡから分離したこの配列をマウス顆粒球ペプチドＡ（ＭＧＰ−Ａ；図５；配列番号：５および図６；配列番号：７）と称する。実施例５ＢＧＰ−ＡおよびＢＧＰ−Ａ−アミドの抗微生物活性天然および合成ＢＧＰ−Ａ並びに合成ＢＧＰ−Ａ−アミドを黄色ブドウ球菌５０２Ａ、大腸菌ＭＬ３５、鵞口瘡カンジダおよびカンジダ・ネオフォルマンスに対してそれらの殺微生物活性についてテストした。殺微生物懸濁アッセイ（M.E. Selstedら、「遺伝子工学：原理と方法(Genetic Engineering：Principles and Methods)」、J.K.Setlow,Plenum Press刊、ニューヨーク(1993)、pp.131-147）を用いて、各ペプチドを４種のテスト微生物に対して５〜１００μｇ／ｍｌの範囲のペプチド濃度でテストした。３種のペプチド調製物の殺菌および殺真菌活性は標準的な殺微生物アッセイを用いて評価した。微生物は対数増殖中期まで増殖させ、採集して２×１０⁷ＣＦＵ／ｍｌで懸濁させた。保温混合物は１〜２×１０⁶ＣＦＵ／ｍｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）および濃度が１００μｇ／ｍｌでのペプチドを含んでいた。３７℃で１時間保温した後（カンジダ・ネオフォルマンスについては４時間の保温）、１０倍段階希釈をトリプチカーゼ大豆寒天（細菌）またはS.abaroudデキストロース寒天（真菌）に平板培養して２４〜４８時間３７℃で培養した。死滅はコロニー計測で定量し、保温したペプチド濃度の関数としてプロットした。図７に提示したデータは、１または４時間保温した後のコロニー形成単位の減少によって測定したとき各ペプチドの用量依存活性を示した。これらのデータは以下の事柄を明らかにした：１）ＢＧＰ−Ａは各微生物に対して殺微生物的であった；２）合成ＢＧＰ−Ａおよび天然ＢＧＰ−Ａは能力が等しく、このことは、天然のペプチド活性は精製化合物に因るもので、夾雑物質に因るものではないことを示唆する；３）ＢＧＰ−Ａのカルボキサミド型は、遊離カルボキシル型よりも標的の殆どに対してはるかに強力である。成熟ペプチドは、代表的なグラム陽性およびグラム陰性細菌並びに２つの酵母型の真菌に対してインビトロで殺微生物的であった。天然のペプチドの抗微生物活性は、合成ＢＧＰ−Ａが等しい死滅活性を有することを示すことによって立証された。実施例６ＢＧＰ−ＡおよびＢＧＰ−Ａ−アミドのＬＰＳ疾患の治療活性マクロファージのＬＰＳ誘発ＴＮＦに対する本発明のＢＧＰ、ＭＧＰ、ＢＧＰ −ＡおよびＭＧＰ−Ａペプチドの作用を、標準的方法にしたがって当業者は決定できる。例えば、マクロファージ細胞を細胞培養フラスコに播種し３７℃、５％ＣＯ₂で１週間培養することによって増殖させる。続いてマクロファージ細胞培養液〔ＨＥＰＥＳ緩衝液含有ダルベッコウ改変イーグル培養液（Dulbecco'sModi fied Eagle Medium）４５０ｍｌ；２．４ｍＭＬ−グルタミン３ｍｌ（４００ｍＭ）;ペニシリン／ストレプトマイシン３ｍｌ（ペニシリン１０⁴Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１ｍｇ／ｍｌ）；および１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）５Ｏｍｌ〕をフラスコから完全に除去する。細胞解離溶液１０ｍｌ（Sigma）を各フラスコに添加し、３７℃で１０分保温する。細胞をフラスコから取り出し、マクロファージ細胞培養液で希釈し、約６分遠心する。細胞沈殿物を使用した培養液／フラスコに再浮遊させる。１００μｌの細胞懸濁液を取り出し、４００μ ｌのトリパンブルーに加えて血球計算盤を用いて細胞を数える。細胞懸濁液を１ ×１０⁶細胞／ｍｌに希釈し、２４穴（ウェル）培養プレートのウェルにつき１ｍｌの浮遊液を加える。２４穴プレートを３７℃で５％ＣＯ₂下で一晩培養する。一晩培養した後、培養液を全てのウェルから吸引する。１００μｌの脂質多糖類（ＬＰＳ）を１００ｎｇ／１００μｌで加える。ＢＧＰ−ＡおよびＭＧＰ−Ａを個々のウェルに所望濃度／１００μｌで加える。マクロファージ細胞培養液を最終容積１ｍｌ／ウェルで加える。プレートを３７℃で５％ＣＯ₂下で６時間保温する。ウェルから上清を取り出し、４℃で保存する。無傷の細菌をウェルに直接添加したウェルについては、０．２μｍフィルター付きエッペンドルフ試験管で５分遠心する。続いて上清を細胞毒性Ｌ９２９アッセイに用いる。サンプルを９６穴プレートに移す。５０μｌのＴＮＦ培養液を、第一列のウェルを除いて全てのプレートの全ウェルに加える。１０μｌのネズミＴＮＦ標準物（２０ｎｇ／ｍｌ）および９０μｌのＴＮＦ培養液を２ウェルずつプレートに加え、第二の列から最後の列までプレートの下に向かって１：２で希釈する。マクロファージ細胞アッセイ由来の上清を含むテストサンプル（７５μｌ）を２ウェルずつ別の列に加え、第二の列から最後の列まで１：３で希釈する。ＴＮＦ感受性Ｌ９２９マウス線維芽細胞を１６２ｃｍ²の培養フラスコに１０⁶ 個を播種し、１週間放置して増殖させる。Ｌ９２９細胞を１フラスコあたり１０ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡを用いフラスコから除去して３〜５分保温する。細胞懸濁液を希釈し６分間遠心沈殿させる。沈殿物を１フラスコあたり５ｍｌの新鮮Ｌ９２９培養液に再懸濁し、計測する(マクロファージ細胞の場合と同じ)。細胞懸濁液を１０⁶細胞／ｍｌに希釈する。上清を含む９６穴プレートの各ウェルに接種するために１００μｌを用いる（Ｌ９２９増殖培養液は、ＦＢＳの代わりに５０ｍｌの１０％熱不活化ウマ血清を用いる点を除きマクロファージ細胞培養液と同じである。ＴＮＦアッセイ培養液は４μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤを添加することを除きマクロファージ細胞培養液と同じである。）プレートを５％ＣＯ₂下で３７℃で２日間培養する。続いて培養液を吸引し、フェノールレッドを含まない改変イーグル培養液中の染料ＭＴＴ（０．５ｍｇ／ｍｌ）の１００μｌと交換する。その後プレートを５％ＣＯ₂下で３７℃で３時間保温する。その後染料を除去し、１００μｌの純粋エタノールに置換する。プレートを室温に１０〜１５分置き、ホルマザン染料の結晶を溶解させる。このプレートを６９０ｎｍのリファレンスフィルターを用いてＥＬＩＳＡプレート読み取り装置で５７０ｎｍで読み取る。ＴＮＦ活性の１ユニットはＬ９２９細胞の５０％を殺すために必要な量と定義される。したがってユニット／ｍｌでのＴＮＦレベルは、Ｌ９２９細胞の５０％死滅をもたらす希釈の逆数である。本発明を上記の詳細な説明を参考に説明してきたが、一方、前述の記載は説明を目的としており、本発明の範囲を限定しようとするものではないことは理解されよう。本発明の他の特徴、利点および改変は以下の請求の範囲内に含まれる。全ての刊行物、特許出願、特許および本明細書に記載した他の参考文献はそれらの完全な形で参照により本明細書に含まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 7/06 Ｃ０７Ｋ 16/18 16/18 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims

【特許請求の範囲】１．ＹＸＸＩＱＸＷＸＨＹＲ（配列番号：１）のアミノ酸配列（式中Ｘはいずれのアミノ酸でもよい）を含む単離抗微生物ペプチド。２．該アミノ酸配列が配列番号：６で説明される請求項１のペプチド。３．該アミノ酸配列が配列番号：７で説明される請求項１のペプチド。４．該ペプチドが少なくとも１つの改変アミノ酸を含む請求項１〜３のいずれかに記載のペプチド。５．該改変アミノ酸がカルボキシ末端アミドを含む請求項４のペプチド。６．該ペプチドが、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、真菌およびウイルスから成る群から選ばれる微生物に対して抗微生物活性を示す請求項１のペプチド。７．該微生物が、黄色ブドウ球菌(S.aureus)、大腸菌(E.coli)、鵞口瘡カンジダ(C.albicans)、ネズミチフス菌(S.typhimurium)およびカンジダ・ネオフォルマン(C.neoformans)から成る群から選ばれる請求項６のペプチド。８．配列番号：３で説明されるアミノ酸配列またはその機能的フラグメントをもつ単離抗微生物ポリペプチド。９．配列番号：５で説明されるアミノ酸配列またはその機能的フラグメントをもつ単離抗微生物ポリペプチド。１０．配列番号：１のペプチドまたはその機能的フラグメントをコードする単離核酸配列。１１．配列番号：６のペプチドまたはその機能的フラグメントをコードする単離核酸配列。１２．配列番号：７のペプチドまたはその機能的フラグメントをコードする単離核酸配列。１３．配列番号：３のポリペプチドまたはその機能的フラグメントをコードする単離核酸配列。１４．配列番号：５のポリペプチドまたはその機能的フラグメントをコードする単離核酸配列。１５．そのような配列が以下の特徴を有する請求項１３または１４に記載のポリヌクレオチド、ａ）ストリンジェントな条件下で請求項１３または１４のポリヌクレオチドとハイブリダイズするヌクレオチド配列；ｂ）請求項１３または１４のＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列の保存的変型を有するペプチドをコードするヌクレオチド配列：ｃ）ＴがＵである請求項１３または１４のヌクレオチド配列；ｄ）ＢＧＰ−ＡまたはＭＧＰ−Ａの生物学的活性を保持するペプチドをコードするａ）、ｂ）またはｃ）の機能的フラグメント；およびｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）のいずれかによってコードされるアミノ酸配列をコードする縮退ヌクレオチド配列。１６．配列番号：１と結合する抗体。１７．該抗体がモノクローナル抗体である請求項１６の抗体。１８．該抗体がポリモノクローナル抗体である請求項１６の抗体。１９．微生物の増殖を維持することが可能な環境での殺微生物的または静微生物的抑制の方法であって、当該方法が、ＹＸＸＩＱＸＷＸＨＹＲ（配列番号：１）のアミノ酸配列（式中Ｘはいずれのアミノ酸でもよい）を含むペプチドの殺微生物的または静微生物的に有効な量を該環境に与えることを含む前記殺微生物的または静微生物的抑制方法。２０．該ペプチドが配列番号：６で説明されるアミノ酸配列を有する請求項１９の方法。２１．該ペプチドが配列番号：７で説明されるアミノ酸配列を有する請求項１９の方法。２２．該ペプチドが、配列番号：３で説明されるアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する請求項１９の方法。２３．該ペプチドが、配列番号：５で説明されるアミノ酸配列またはその機能的フラグメントを有する請求項１９の方法。２４．さらに少なくとも１つのまた別の抗微生物組成物を含む請求項１９の方法。２５．該抗微生物組成物が、抗生物質、抗真菌剤および抗ウイルス剤から成る群から選ばれる請求項２４の方法。２６．該抗生物質が、アミノグリコシド系、ペニシリン系、セファロスポリン系、カルバペネム系、モノバクタム系、キノロン系、テトラサイクリン系、グリコペプチド系、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、トリメトプリム、スルファメトキサゾール、ニトロフラントイン、リファンピンおよびムピロシンから成る群から選ばれる抗生物質の種類から選ばれる請求項２５の方法。２７．該抗生物質が、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネチルミシン、ｔ−オブラマイシン、ストレプトマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、エリスロマイシンエストレート／エチルスクシネート／グルセプテート／ラクトビオネート／ステアレート、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、アンピシリン、アモキシシリン、チカルシリン、カルベニシリン、メズロシリン、アズロシリン、ピペラシリン、セファロシン、セファゾリン、セファクロル、セファマンドール、セフォキシチン、セフロキシム、セフォニシド、セフメタゾール、セフォテタン、セフプロジル、ロラカルベフ、セフェタメト、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフタジジム、セフェピム、セフィキシム、セフポドキシム、セフスロジン、イミペネム、アズトレオナム、フレロキサシン、ナリジキシン酸、ノルフロキサシン、シプロフロキサシン、オフロキサシン、エノキサシン、ロメフロキサシン、シノキサシン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、テトラサイクリン、バンコマイシンおよびテイコプラニンから成る群から選ばれる請求項２６の方法。２８．該ペプチドが、少なくとも１つの改変アミノ酸を含む請求項１９の方法。２９．該改変アミノ酸がカルボキシ末端アミドを含む請求項２８のペプチド。３０．該ペプチドが、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、真菌およびウイルスから成る群から選ばれる微生物に対して有効な殺微生物剤または静微生物剤である請求項１９の方法。３１．該微生物が、黄色ブドウ球菌(S.aureus)、大腸菌(E.coli)、鵞口瘡カンジダ(C.albicans)、ネズミチフス菌（S.typhimurim）およびカンジダ・ネオフォルマン(C.neoformans)から成る群から選ばれる請求項３０のペプチド。３２．該環境が生物である請求項１９の方法。３３．該環境が動物である請求項３２の方法。３４．該環境がヒトである請求項３２の方法。３５．該環境が食物または食用製品である請求項１９の方法。３６．該環境が給水源である請求項１９の方法。３７．脂質多糖類（ＬＰＳ）関連疾患をもつか、またはその危険性を有する対象者のそのような疾患を抑制する方法であって、当該方法が、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：６および配列番号：７のアミノ酸配列またはそれらの機能的フラグメントから成る群から選ばれるアミノ酸配列をもつペプチドの治療的に有効な量を該対象者に投与することを含む前記脂質多糖類結合疾患の抑制方法。３８．さらに、少なくとも１つのまた別の抗微生物組成物を含む請求項３７の方法。３９．該抗微生物組成物が、抗生物質、抗真菌剤および抗ウイルス剤から成る群から選ばれる請求項３８の方法。４０．該抗生物質が、アミノグリコシド系、ペニシリン系、セファロスポリン系、カルバペネム系、モノバクタム系、キノロン系、テトラサイクリン系、グリコペプチド系、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、トリメトプリム、スルファメトキサゾール、ニトロフラントイン、リファンピンおよびムピロシンから成る群から選ばれる抗生物質の種類から選ばれる請求項３９の方法。４１．該抗生物質が、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネチルミシン、ｔ−オブラマイシン、ストレプトマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、エリスロマイシンエストレート／エチルスクシネート／グルセプテート／ラクトビオネート／ステアレート、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、アンピシリン、アモキシシリン、チカルシリン、カルベニシリン、メズロシリン、アズロシリン、ピペラシリン、セファロシン、セファゾリン、セファクロル、セファマンドール、セフォキシチン、セフロキシム、セフォニシド、セフメタゾール、セフォテタン、セフプロジル、ロラカルベフ、セフェタメト、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフタジジム、セフェピム、セフィキシム、セフポドキシム、セフスロジン、イミペネム、アズトレオナム、フレロキサシン、ナリジキシン酸、ノルフロキサシン、シプロフロキサシン、オフロキサシン、エノキサシン、ロメフロキサシン、シノキサシン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、テトラサイクリン、バンコマイシンおよびテイコプラニンから成る群から選ばれる請求項４０の方法。４２．該ペプチドが、少なくとも１つの改変アミノ酸を含む請求項３７の方法。４３．該改変アミノ酸が、カルボキシ末端アミドを含む請求項４２の方法。４４．配列番号：１，６および７から成る群から選ばれるペプチドの抑制的に有効な量と原虫を接触させることを含む、原虫の増殖を抑制する方法。