CN107418908B - 产酶芽孢杆菌菌株 - Google Patents

Abstract

本公开涉及为动物提供益处的产酶芽孢杆菌菌株以及使用这些菌株的方法。在一种实施方式中，本公开涉及包括所述产酶芽孢杆菌菌株的组合物。在另一种实施方式中，本公开涉及包括所述产酶芽孢杆菌菌株的动物饲料。

Description

产酶芽孢杆菌菌株

本申请是国际申请日为2012年08月24日，国际申请号为PCT/US2012/052360，并于2014年04月24日进入中国国家阶段的题为“产酶芽孢杆菌菌株”的第201280052430.7号发明专利申请的分案申请。

交叉引用的相关申请

本申请根据35号美国法典第§119(e)要求于2011年8月24日提交的美国临时专利申请第61/526881号和2011年8月25日提交的美国临时专利申请第61/527371号的优先权；上述申请的全部内容通过引用并入到本发明中。

参考文献

在本公开中由括号中的第一作者的姓氏所提到的参考文献的完整文献标引可以在权利要求书之前的参考文献部分中找到。

技术领域

本公开涉及一种产生对动物有益的酶的芽孢杆菌菌株，以及使用这些菌株的方法。在一种实施方式中，本公开涉及改进动物生长性能的方法。在另一种实施方式中，本公开涉及一种直接饲喂微生物，和补充有直接饲喂微生物的动物饲料。在另一种实施方式中，本公开涉及一种改进肥料存储单元的方法。在另一种实施方式中，本公开涉及一种用于减轻炎症应答的方法。

背景技术

全球养猪业已经出现了增加饲喂副产品(含有可溶物的干酒糟(DDGS)、粗麦粉等)从最初的0-10％到当前的极限30-60％。这些饮食成本节约对于工业上节省饲料投入成本是一个很好的机会，但也带来了一系列挑战。从玉米中提取乙醇的发酵过程除去了几乎所有的淀粉，使所得到的DDGS饲料副产品含有大约40％的纤维。这种相对于玉米的高纤维含量导致干物质的消化率降低，且与玉米相比，DDGS中大多数氨基酸的消化率降低大约10个百分数单位(Stein和Shurson，2009)。

因此，在牲畜饲料中包含DDGS可能对动物的生长性能和胴体品质具有负面影响。除了对动物生长及胴体品质的负面影响，作为添加具有高纤维含量的DDGS的结果，营养物消化率的变化对猪粪的处理、储存和分解都有影响。商业养猪业已经表明，在厌氧深基坑猪粪存储单元中持肥能力更小，并且来自饲喂高水平DDGS的猪的粪肥具有更多的固体堆积以及氨、甲烷和硫化氢气体的排放。

鉴于上述情况，人们希望提供产生对动物有益处的酶的芽孢杆菌菌株，以及使用这些菌株的方法。

发明内容

本公开涉及产酶芽孢杆菌菌株。在一种实施方式中，所述菌株为枯草芽孢杆菌。在另一种实施方式中，所述菌株为短小芽孢杆菌。

至少在一些实施方式中，枯草芽孢杆菌菌株是枯草芽孢杆菌AGTP BS3BP5、枯草芽孢杆菌AGTP BS442、枯草芽孢杆菌AGTP BS521、枯草芽孢杆菌AGTP BS918、枯草芽孢杆菌AGTP BS1013、枯草芽孢杆菌AGTP BS1069和枯草芽孢杆菌AGTP 944，以及具有它们的所有特征的菌株、它们的任意的衍生物或变体以及它们的混合物。在一些实施方式中，短小芽孢杆菌菌株是短小芽孢杆菌AGTP BS 1068和短小芽孢杆菌KX11-1，以及具有它们的所有特征的菌株、它们的任意的衍生物或变体以及它们的混合物。

在一种实施方式中，本公开涉及包括给动物施用有效量的产酶菌株、所述菌株的一种或多种组合或者所述菌株的培养物的一种或多种上清液、包含一种或多种菌株或者它们的混合物的饲料的方法，其中，所述施用改进了以下各项中的至少一项：体重、平均日增重、平均日采食量、饲料效率、胴体品质、养分的消化率和粪肥废物问题。

在另一种实施方式中，当饲喂高水平的DDGS时，可以给动物施用所述产酶菌株以提高复合膳食成分的分解、粪肥废物问题、生产效率、胴体品质和性能中的至少一个。

在一种实施方式中，将一种或多种产酶菌株作为直接饲喂微生物(DFM)施用。直接饲喂微生物包括一种或多种芽孢杆菌菌株。产酶菌株在降解难以消化的饲料(例如DDGS)的方面是有效的。这允许增加养分的有效性，从而改进动物的生长反应。此外，产酶菌株减弱粪肥气味，从而改进作业环境空气质量。至少在某些实施方式中，气味的减弱是通过减少挥发性脂肪酸、氨和/或甲烷和硫化氢气体的产生实现的。

在其它的实施方式中，本公开涉及一种方法，包括给猪施用有效量的产酶菌株、所述菌株的一种或多种组合或者所述菌株的培养物的一种或多种上清液、包含一种或多种菌株或者它们的混合物的饲料以改进粪肥存储单元。在某些实施方式中，猪粪肥存储单元是一个粪肥坑。至少在一些实施方式中，相对于对照粪肥坑，所述施用改进了以下各项中的至少一项：更低的起泡发生率、更少的固体积累、以及更少的氮、硫、磷、纤维结合氮、总蛋白、脂肪和纤维含量。

在某些实施方式中，所述产酶菌株直接施加到粪肥的存储单元，例如粪肥坑。由于将产酶菌株与粪肥存储单元直接接触而得到的改进包括以下各项中的至少一种：比对照粪肥坑更低的起泡发生率、更少的固体积累、以及更少的氮、硫、磷、纤维结合氮、总蛋白、脂肪和纤维含量。

在另一种实施方式中，本公开涉及一种改变粪肥坑中挥发性脂肪酸组成的方法，包括给动物(该动物的粪肥存储在粪肥坑中)施用有效量的产酶菌株、所述菌株的一种或多种组合或者所述菌株的培养物的一种或多种上清液、包含一种或多种菌株或者它们的混合物的饲料。在另一种实施方式中，所述产酶菌株可以直接与粪肥坑接触。

在另一种实施方式中，本公开涉及改变积聚在容纳动物的房间内的气体排放的方法，包括给动物施用有效量的产酶菌株、所述菌株的一种或多种组合或者所述菌株的培养物的一种或多种上清液、包含一种或多种菌株或者它们的混合物的饲料以减少气体排放。

在另一种实施方式中，本公开涉及一种用于减轻炎症应答的方法，包括给动物施用有效量的产酶菌株、所述菌株的一种或多种组合或者所述菌株的培养物的一种或多种上清液、包含一种或多种菌株或者它们的混合物的饲料以减轻炎症应答。

附图说明

本发明的示例性的实施方式在附图中举例说明。

图1是显示枯草芽孢杆菌AGTP BS3BP5的RAPD PCR图谱的凝胶照片。

图2是枯草芽孢杆菌AGTP BS3BP5的部分16S rDNA序列。

图3是显示枯草芽孢杆菌AGTP BS442的RAPD PCR图谱的凝胶照片。

图4是枯草芽孢杆菌AGTP BS442的部分16S rDNA序列。

图5是显示枯草芽孢杆菌AGTP BS521的RAPD PCR图谱的凝胶照片。

图6是枯草芽孢杆菌AGTP BS521的部分16S rDNA序列。

图7是显示枯草芽孢杆菌AGTP BS918的RAPD PCR图谱的凝胶照片。

图8是枯草芽孢杆菌AGTP BS918的部分16S rDNA序列。

图9是显示枯草芽孢杆菌AGTP BS1013的RAPD PCR图谱的凝胶照片。

图10是枯草芽孢杆菌AGTP BS1013的部分16S rDNA序列。

图11是显示短小芽孢杆菌AGTP BS 1068的RAPD PCR图谱的凝胶照片。

图12为短小芽孢杆菌AGTP BS 1068的部分16S rDNA序列。

图13是显示枯草芽孢杆菌AGTP BS1069的RAPD PCR图谱的凝胶照片。

图14是枯草芽孢杆菌AGTP BS1069的部分16S rDNA序列。

图15是显示枯草芽孢杆菌AGTP 944的RAPD PCR图谱的凝胶照片。

图16是枯草芽孢杆菌AGTP 944的RAPD PCR图谱的凝胶照片。

图17是显示枯草芽孢杆菌AGTP 944的RAPD PCR图谱的凝胶照片。

图18是枯草芽孢杆菌AGTP 944的部分16S rDNA序列。

图19是显示短小芽孢杆菌KX11-1的RAPD PCR图谱的凝胶照片。

图20是显示短小芽孢杆菌KX11-1的RAPD PCR图谱的凝胶照片。

图21为短小芽孢杆菌KX11-1的部分16S rDNA序列。

图22是设计用于筛选芽孢杆菌菌株抗炎作用的细胞培养板的代表性示意图。LPS是用来诱发的炎症应答，但也可以使用能诱发炎症应答的任何试剂。

图23是描绘在典型巨噬细胞系(鸡HD11)所显示的芽孢杆菌菌株的抗炎作用的柱状图。用于诱发炎症应答的是LPS。对IL-1β基因表达的作用用白色条显示(P<0.01)。对IL-8基因表达的作用用黑色条显示(P<0.01)。不同字母(a、b、c)显示统计学意义上均值不同(P<0.01)。

图24是设计用于细胞培养物筛选候选直接饲喂微生物的板的代表性示意图。LPS用作诱发炎症应答的试剂。

图25是描绘在哺乳动物细胞系(大鼠肠上皮细胞系(IEC-6))中芽孢杆菌菌株的抗炎作用的柱状图。LPS用于诱发炎症应答。测定肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的基因表达。不同的字母(a或b)显示均值统计学差异(P<0.10)。

图26是显示在170天测试期内经过3次采样坑内泡沫特征的折线图。

图27是在用“x”标示的区域中在每个栏中的生物发光测量的代表性示意图。

在详细说明本发明的实施方式之前，应当理解的是，本发明在其应用方面并不限于在以下的描述中或在附图中示出的构造的细节和部件的设置。本发明能够以其它实施方式或者以各种方式实施或实现。此外，应当理解的是，本发明使用的措辞和术语是为了说明的目的，而不应被视为限制。

本公开中的组织框架不应限于本公开的任何实施方式或元件。其意图是在一种实施方式中列举的元素和应用可以应用于本公开范围内的其他实施方式。

具体实施方式

本公开中的数值范围是近似值，因此可以包括该范围之外的值，除非另有说明。数值范围包括来自并包括下限值和上限值的以一个单位递增的所有值，只要在任意下限值和任意上限值之间存在至少2个单位的间隔。作为一个实例，如果组成的、物理的或其它性质，诸如，例如分子量、粘度等，是从100到1,000时，它意在将所有单独的值(例如100、101、102等)和子范围(例如100至144、155至170、197至200等等)都明确地列举出来。对于包含小于1的值或包含大于1的分数(例如1.1、1.5等)的范围，一个单位被认为是0.0001、0.001、0.01或0.1是适当的。对于含有小于10(例如1至5)的单数位数字的范围，一个单位通常被认为是0.1。这些仅是具体意图的实例，列举的最低值和最高值之间数值的所有可能的组合都被认为在本公开中明确述及。本公开中提供的数值范围用于在混合物中的组分的相对量，以及方法中列举的各种温度和其他参数的范围。

通过“施用”，是指将至少一种菌株和/或来自本发明中所述的至少一种菌株的培养物的上清液引入到动物的胃肠道中的操作。更具体地说，该施用是一种通过口服途径的施用。特别地，该施用可以通过用至少一种所述菌株添加到动物饲料中来进行，然后由动物摄入这样添加的饲料。也可以使用胃管或任何其他方法进行该施用以使其可以将至少一种所述菌株直接引入到动物的胃肠道内。

通过“至少一种菌株”是指一种单一菌株，但也指包含至少两种细菌菌株的混合物。通过“至少两种菌株的混合物”，是指两种、三种、四种、五种、六种或者甚至更多种菌株的混合物。在菌株混合物的一些实施方式中，比例可以从1％至99％变化。在某些实施方式中，在混合物中使用的菌株的比例为至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。菌株混合物的其他实施方式是从25％到75％变化。菌株混合物的另外的实施方式是每种菌株约50％。当混合物包含两种以上菌株时，菌株可以以基本相等的比例或以不同的比例存在于混合物中。

通过“接触”，是指将至少一种菌株和/或来自本发明所述的至少一种菌株的培养物的上清液与包括但不限于粪肥存储单元的基板、容器或物体紧密接近的操作。在一些实施方式中，粪肥存储单元是粪肥坑。可以通过直接或间接的方式来接触。如在本发明中所用，接触包括施加、喷洒、接种、分散、分配、倾倒以及其他类似的术语。

通过“有效量”，是指足以允许在以下各项中的至少一项中改进的菌株和/或上清液的量：动物生产的效率、胴体品质、动物生长性能、当给动物喂食高含量DDGS时的生长性能、养分的消化率、复合饲料成分的分解、家禽生长性能、猪生长性能、饲料利用率、平均日增重、平均日采食量、体重增加:饲料或饲料:采食量、以及死亡率。

在其它实施方式中，“有效量”是指足以允许在以下各项中的至少一项中改进的菌株和/或上清液的量：粪肥废物问题、粪肥储存单元中的发泡量、粪肥存储单元中的微生物生态、粪肥存储单元中的挥发性脂肪酸的量、在圈养动物的房间中或粪肥储存单元中产生气体的量，包括但不限于甲烷和硫化氢。

在另一实施方式中，“有效量”是指足以允许在以下各项中的至少一项中改进的菌株和/或上清液的量：涉及炎症应答的基因的表达、涉及炎症应答的蛋白的表达以及涉及炎症应答的蛋白质的活性。

如在本发明中所用，“性能”是指通过下面的一个或多个参数测量的动物(例如猪或家禽)的生长：平均日增重(ADG)、重量、腹泻、死亡率、饲料转化率(其包括饲料:增重和增重:饲料)、以及采食量。此处所使用的“性能的改进”或“改进的性能”是指在性能定义中列出的至少一个参数的改进。

如在本发明中所用，使用随机扩增多态性DNA聚合酶链式反应(RAPD-PCR)分析，“变体”与所公开的菌株的基因序列具有至少80％的同一性。基因序列的同一性程度可以变化。在一些实施方式中，使用RAPD-PCR分析，所述变体与所公开的菌株具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的基因序列的同一性。可以用于RAPD-PCR分析的六种引物包括如下引物：引物1(5'-GGTGCGGGAA-3')(SEQ ID NO.1)；引物2(5'-GTTTCGCTCC-3')(SEQID NO.2)；引物3(5'-GTAGACCCGT-3')(SEQ ID NO.3)；引物4(5'-AAGAGCCCGT-3')(SEQ IDNO.4)；引物5(5'-AACGCGCAAC-3')(SEQ ID NO.5)；以及引物6(5'-CCCGTCAGCA-3')(SEQ IDNO.6)。RAPD分析可以使用Ready-to-Go^TM RAPD分析珠(安玛西亚生物科技公司(AmershamBiosciences)，瑞典)来进行，其设计为预混合、预分配反应以进行RAPD分析。

本发明人发现某些芽孢杆菌菌株具有分解纤维、脂质、碳水化合物和蛋白质的酶活性。这些菌株在本发明中称作“产酶菌株”，“芽孢杆菌菌株”，或“菌株”。在一些实施方式中，所述酶活性是纤维素酶、α-淀粉酶、木聚糖酶、酯酶、酪蛋白酶、玉米淀粉酶、β-甘露聚糖酶、脂肪酶和/或蛋白酶，例如玉米蛋白酶和大豆蛋白酶。

本发明人发现某些微生物可以用来分解含有可溶物的干酒糟(DDGS)中的挑战性成分。

本发明人还发现，产酶菌株可以提高以下各项中的至少一项：(1)复合膳食成分的分解；(2)粪肥废物问题；(3)动物生产的效率；(4)动物胴体品质；(5)动物生长性能；和(6)炎症应答的效果。

产酶菌株

产酶菌株包括芽孢杆菌菌株，包括但不限于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和迟缓芽孢杆菌菌株，以及具有它们的所有特征的菌株、它们的任何衍生物或变体，和它们的混合物。

至少在一些实施方式中，所述枯草芽孢杆菌菌株是枯草芽孢杆菌AGTP BS3BP5、枯草芽孢杆菌AGTP BS442、枯草芽孢杆菌AGTP BS521、枯草芽孢杆菌AGTP BS918、枯草芽孢杆菌AGTP BS1013、枯草芽孢杆菌AGTP BS1069和枯草芽孢杆菌AGTP 944，以及具有它们的所有特征的菌株、它们的任何衍生物或变体和它们的混合物。在一些实施方式中，所述短小芽孢杆菌菌株是短小芽孢杆菌AGTP BS 1068和短小芽孢杆菌KX11-1，以及具有它们的所有特征的菌株、它们的任何衍生物或变体和它们的混合物。

所述菌株由威斯康星州(Wisconsin)沃基沙(Waukesha)的丹尼斯克美国(DaniscoUSA)有限公司保藏在美国农业研究菌种保藏中心(NRRL)，伊里诺斯州皮奥里亚市北大学街1815号(1815North University Street，Peoria，Ill.)，61604。原始保藏日期和保藏登记号如下：枯草芽孢杆菌AGTP BS3BP5，2011年5月13日(NRRL B-50510)；枯草芽孢杆菌AGTPBS442，2011年8月4日(NRRL B-50542)；枯草芽孢杆菌AGTP BS521，2011年8月4日(NRRL B-50545)；枯草芽孢杆菌AGTP BS918，2011年5月13日(NRRL B-50508)；枯草芽孢杆菌AGTPBS1013，2011年5月13日(NRRL B-50509)；枯草芽孢杆菌AGTP BS1069，2011年8月4日(NRRLB-50544)；枯草芽孢杆菌AGTP 944，2011年8月11日(NRRL B-50548)；短小芽孢杆菌AGTP BS1068，2011年8月4日(NRRL B-50543)以及短小芽孢杆菌KX11-1，2011年8月5日(NRRL B-50546)。所有这些保藏都是根据国际承认用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约的规定进行。

在一些实施方式中，所述产酶菌株具有酶活性，包括但不限于纤维素酶、α-淀粉酶、木聚糖酶、酯酶、酪蛋白酶、玉米淀粉酶、β-甘露聚糖酶、脂肪酶和/或蛋白酶，例如玉米蛋白酶和大豆蛋白酶。

至少在一些实施方式中，将多于一种的本发明所述菌株相结合。

任何芽孢杆菌的衍生物或变体也包括在本发明中，并且在本发明所描述和所要求保护的方法中是有用的。在一些实施方式中，具有枯草芽孢杆菌AGTP BS3BP5、枯草芽孢杆菌AGTP BS442、枯草芽孢杆菌AGTP BS521、枯草芽孢杆菌AGTP BS918、枯草芽孢杆菌AGTPBS1013、枯草芽孢杆菌AGTP BS1069、枯草芽孢杆菌AGTP 944、短小芽孢杆菌AGTP BS 1068和短小芽孢杆菌KX11-1的所有特征的菌株也包括在本发明中，并且在本发明所描述和所要求保护的方法中是有用的。

在某些实施方式中，枯草芽孢杆菌AGTP BS3BP5、枯草芽孢杆菌AGTP BS442、枯草芽孢杆菌AGTP BS521、枯草芽孢杆菌AGTP BS918、枯草芽孢杆菌AGTP BS1013、枯草芽孢杆菌AGTP BS1069、枯草芽孢杆菌AGTP 944、短小芽孢杆菌AGTP BS 1068和短小芽孢杆菌KX11-1的任何衍生物或变体也包括在本发明中，并且在本发明所述和所要求保护的方法中是有用的。

至少在一些实施方式中，所述产酶菌株是组合使用的。在一种实施方式中，所述产酶菌株可以与来自芽孢杆菌属的细菌菌株和来自不同种属的其它细菌菌株组合使用。

至少在一些实施方式中，当饲喂高水平的DDGS时，与对照相比，本发明所述产酶菌株和提供的方法改进了以下各项中的一项或多项：复合饲料成分的分解、粪肥废物问题、动物生产的效率、动物胴体品质、和性能。

粪肥废物问题包括，但不限于，不希望的粪肥养分和微生物的组分，以及来自粪肥储存单元(例如粪肥坑)的不希望的气体排放。粪肥废物问题的改进包括，但不限于，以下各项中的至少一项：(1)粪肥中积累更少营养物，(2)将粪肥的微生物群落改变至对固体分解有利的种群，以及(3)氨、甲烷和硫化氢气体排放的减少。

胴体品质的改进可以通过增加的瘦肉率和屠宰率以及减少的油脂碘值中的至少一个来测量。性能可以通过平均日增重、平均日饲料摄取量、每单位增重所需饲料，以及本领域中已知的其他测量方法来测定。

当摄入时，产酶菌株产生酶。在一些实施方式中，产酶菌株在体内产生酶。在其它实施方式中，所述产酶菌株在施用了该菌株的动物的粪肥中生存，并在排出的粪肥中产生酶。

培养菌株的方法

芽孢杆菌菌株由细菌菌株发酵产生。发酵可以通过按比例放大种子培养物开始。这涉及重复地且无菌地将培养物转移到越来越大的体积，作为用于发酵的接种体，所述发酵在含有蛋白质、碳水化合物和最佳生长必要的矿物质的培养基的大型不锈钢发酵罐中进行。一种非限制性的示例性培养基是TSB。接种体加入到发酵容器中后，控制温度和搅拌以允许最大生长。一旦培养物达到最大群落密度，通过从发酵培养基中分离出细胞以收集培养物。这通常是通过离心进行的。

其后可以确定培养物的总数。CFU或菌落形成单位是从标准微生物平板法得到的样品的活菌计数。该术语是由当单个细胞在合适的培养基中培养时会生长并成为一个在琼脂培养基中有活力的菌落而得出。由于多个细胞可以产生一个可见的菌落，术语菌落形成单位是一个比细胞数目更加有用的度量单位。

在一种实施方式中，每种芽孢杆菌菌株以5×10⁸CFU/ml的水平到约4×10⁹CFU/ml的水平发酵。在至少一种实施方式中，使用2×10⁹CFU/ml的水平。细菌通过离心收集，并除去上清液。上清液可以在本发明中描述的方法中使用。至少在一些实施方式中，细菌被造粒。至少在一些实施方式中，细菌被冷冻干燥。至少在一些实施方式中，将细菌与载体混合。然而，在使用它们之前没有必要冷冻干燥芽孢杆菌。菌株也可以添加或不加防腐剂，以浓缩、非浓缩或稀释的形式来使用。

DFM和制备DFM的方法

提供一种包括本发明所述的一种或多种菌株的组合物。该组合物可以作为直接饲喂微生物(DFM)饲喂动物。一种或多种载体或其它成分可以添加到DFM中。DFM可以以各种物理形式存在，例如作为追肥，作为用于液体灌服药或添加到代乳料的水溶性浓缩物、明胶胶囊或凝胶。在追肥形式的一种实施方式中，将冻干的细菌发酵产物加入到载体上，例如乳清、麦芽糊精、蔗糖、右旋糖、石灰石(碳酸钙)、稻壳、酵母培养物、干淀粉和/或硅铝酸钠。在用于液体灌服药或代乳料补充物的水溶性浓缩物的一种实施方式中，将冻干的细菌发酵产物加入到水溶性载体上，例如乳清、麦芽糊精、蔗糖、右旋糖、干淀粉、硅铝酸钠，并添加一种液体以形成所述灌服药或将所述补充物加入乳料或代乳料中。在明胶胶囊形式的一种实施方式中，将冻干的细菌发酵产物加入到载体上，例如乳清、麦芽糊精、糖、石灰石(碳酸钙)、稻壳、干燥淀粉酵母培养物和/或硅铝酸钠。在一种实施方式中，细菌和载体被封装在可降解的胶囊中。在凝胶形式的一种实施方式中，将冻干的细菌发酵产物加入到载体中，例如植物油、蔗糖、二氧化硅、聚山梨醇酯80、丙二醇、丁羟茴醚、柠檬酸、乙氧喹和/或人造色素，以形成凝胶。

菌株可以任选地与添加剂的干制剂混合，所述添加剂包括，但不限于，生长基质、酶、糖、碳水化合物、提取物、和生长促进微量成分。所述糖可以包括：乳糖；麦芽糖；右旋糖；麦芽糖糊精；葡萄糖；果糖；甘露糖；塔格糖；山梨糖；棉子糖；以及半乳糖。所述糖的范围从50至95％，单独或组合使用。所述提取物可以包括酵母或干酵母发酵可溶物，其范围从5至50％。所述生长基质可以包括：胰蛋白胨，其范围从5至25％；乳酸钠，其范围从5至30％；以及吐温80，其范围从1至5％。所述碳水化合物可以包括甘露糖醇、山梨糖醇、阿东糖醇以及阿糖醇。所述碳水化合物的范围从5至50％，单独或组合使用。所述微量成分可以包括：碳酸钙，其范围从0.5至5.0％；氯化钙，其范围从0.5至5.0％，磷酸氢二钾，其范围从0.5-5.0％；磷酸钙，其范围从0.5至5.0％；蛋白锰，其范围从0.25至1.00％，以及锰，其范围从0.25至1.0％。

为了制备本发明所述的DFM，可以将培养物和载体(如果使用)添加到螺带式混合机或桨式混合机中，混合约15分钟，尽管时间可以增加或减少。将上述成分混合，以产生培养物和载体的均匀混合物。最终产物优选是干燥的、可流动的粉末。然后可以将菌株添加到动物饲料或饲料预混合物中，添加到动物的饮水中，或者以本领域中已知的其他方式施用。动物饲料可以补充本发明所述的一种或多种菌株或本发明所述的组合物。

例如，本发明提供的DFM可以作为含有菌株的培养溶液、产生菌株的上清液、或培养溶液的细菌产物来施用。

给动物施用本发明提供的DFM可以提高动物性能。在一种实施方式中，给动物施用本发明提供的DFM可以增加平均日饲料摄入量(ADFI)、平均日增重(ADG)或饲料效率(增重:饲料；G:F或者饲料:增重；F:G)(统称为“性能指标”)。一种或多种上述性能指标可以得到改进。

所述DFM可以以多种方式中的一种施用于动物。例如，所述菌株可以以固体形式作为兽医药剂施用，可以分配在赋形剂，优选为水中并直接给动物饲喂，可以与干燥形式的饲料材料物理混合，或所述菌株可以形成溶液然后喷洒到饲料材料上。给动物施用所述菌株的方法被认为是在本领域技术人员的技能范围内。

给动物施用的方法

在一种实施方式中，可以向动物施用有效量的所述菌株。至少在一些实施方式中，本公开涉及一种方法，其包括给动物施用有效量的所述产酶菌株、所述菌株的一种或多种组合、所述菌株的培养物的一种或多种上清液、包含一种或多种菌株或者它们的混合物的饲料。在一种实施方式中，所述动物是猪。在另一种实施方式中，所述动物是家禽。在另一种实施方式中，所述动物是反刍动物。

给动物施用一种或多种产酶菌株通过任何方便的方法来实现，包括将所述菌株添加到动物的饮用水中，添加到饲料中，或添加到垫草中，或者通过直接口腔插入，例如通过气雾剂或通过注射剂。

在另一种实施方式中，一种或多种产酶菌株的施用是通过用产酶菌株喷洒动物。动物可以清理或用嘴整理并摄取产酶菌株。

在一种实施方式中，芽孢杆菌菌株作为芽孢施用。

如在本发明中所用，术语“动物”包括但不限于人、哺乳动物、两栖动物、鸟类动物、爬行动物、猪属动物(swine)、家猪(pigs)、奶牛(cows)、牛(cattle)、山羊、马、绵羊、家禽和其它在农场或牧场饲养或生长的动物、绵羊、大角羊、野牛(buffalo)、羚羊、公牛(oxen)、驴、骡、鹿(deer)、麋鹿(elk)、驯鹿(caribou)、水牛(water buffalo)、骆驼、美洲驼(llama)、羊驼(alpaca)、兔、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、雪貂、狗、猫和其他宠物、灵长类动物、猴子、猿和大猩猩。

在一些实施方式中，所述动物是不同龄的鸟类，如起始期鸟(starters)、成长期鸟(growers)和育成期鸟(finishers)。在一些实施方式中，所述动物是家禽和野鸟(exoticfowl)，其包括，但不限于，雏鸡(chicks)、雏火鸡(turkey poults)、雏鹅(goslings)、雏鸭(ducklings)、几内亚珍珠鸡(guinea keets)、小母鸡(pullets)、母鸡(hens)、雄鸡(roosters)(也称为公鸡(cocks))、小公鸡(cockereks)和阉鸡(capons)。

在一些实施方式中，动物是猪，其中包括但不限于保育猪(nursery pigs)、种猪(breeding stock)、大母猪(sows)、小母猪(gilts)、公猪(boars)、哺乳期仔猪(lactation-phase piglets)、和育肥猪(finishing pigs)。可以在哺乳期间将菌株饲喂给母猪，虽然可以在不同的时间持续不同的时间来饲喂菌株。在某些实施方式中，菌株是通过给小母猪或大母猪饲喂菌株来施用给仔猪的。人们认为，从母猪转移到仔猪是通过粪-口途径和/或通过其它途径来实现的。

产酶菌株可以施用于动物以改进以下各项中的至少一项：养分的消化率、猪生长性能、家禽生长性能反应、饲料效率(增重:饲料或饲料:增重)、体重、采食量、平均日增重、平均日饲料摄取量、复合饲料成分分解、家禽生产效率、猪生产效率和死亡率。当饲喂含有高水平DDGS的饲料时，这些优点可以是特别有用的。最初，DDGS为动物饮食的0％至10％。目前，DGGS为30％至60％。

改进的量可以如本发明所述或通过本领域中已知的其它方法进行测量。所述有效量可以通过提供随意饲料含有DFM的饲料来施用给动物。所述DFM也可以以一剂或多剂施用。

在某些实施方式中，与未经处理的对照相比，所述改进为至少1-5％、5-10％、10-15％、15-20％、20-25％、25-30％、30-35％、35-40％、40-45％、45-50％、50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％、75-80％、80-85％、85-90％、90-95％、96％、97％、98％、99％或大于99％。

至少在一些实施例中，与对照动物相比，在对施用所述菌株的动物的所述测量中的改进为至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和大于99％。

在其它实施方式中，相对于对照动物，在对施用所述菌株的动物的所述测量中的改进为2-8％。在某些其它实施方式中，相比于对照动物，在对施用所述菌株的动物的所述测量中的改进至少为8％。

在一些实施方式中，对照动物是没有施用所述产酶菌株的动物。

这种有效量可以以一剂或多剂施用于动物。在一些实施方式中，所述一种或多种芽孢杆菌菌株以至少1×10⁴CFU/动物/天的比例加入到动物的饲料中。

在一种实施方式中，所述施用改进了以下各项中的至少一项：养分的消化率、生长性能反应，例如，饲料效率、复合饲料成分的分解、生产效率、体重增加、饲料摄取量和死亡率。

在所述方法的某些实施方式中，所述菌株是以约1×10⁵CFU/动物/天至约1×10¹¹CFU/动物/天施用。在一些实施方式中，所述动物是猪。在另一种实施方式中，所述动物是家禽。

至少在某些实施方式中，当给动物饲喂高水平的含有可溶物的干酒糟(DDGS)时使用所述方法。高水平的DDGS可以是大于动物饲料的10％以上的比例。高水平的DDGS也可以是大于动物的饲料的30％以上的比例。

至少在某些实施方式中，至少一种有效量的细菌菌株是通过给预期用于动物的饲料补充至少一种有效量的细菌菌株而施用给动物的。如在本发明中所用，“补充”是指将本发明所提供的有效量的细菌直接混合到预期用于动物的饲料中的操作。因此，当饲养时，动物摄取本发明提供的细菌。

所述产酶菌株可以以单菌株或多菌株施用。可以给动物施用产酶菌株的一种或多种上清液。当摄入时，产酶菌株产生酶。

在某些实施方式中，给猪饲喂一种或多种产酶菌株。所述一种或多种产酶菌株分解含有可溶物的干酒糟(DDGS)中的挑战性成分。

在一种实施方式中，所述产酶菌株是以每克动物饲料1×10³、1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹、1×10¹⁰、1×10¹¹、1×10¹²、1×10¹³和大于1×10¹³CFU的比例加入到动物饲料中的。

在另一种实施方式中，所述产酶菌株是以每只动物每天1×10³、1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹、1×10¹⁰、1×10¹¹、1×10¹²、1×10¹³和大于1×10¹³CFU的比例加入到动物饲料中的。

在一种实施方式中，所述一种或多种芽孢杆菌菌株是以每克饲料约3.75×10⁵CFU的比例加入到猪饲料中的。它(们)也可以以约1×10⁴至约1×10¹¹CFU/动物/天来饲喂。在一些实施方式中，所述一种或多种芽孢杆菌菌株是以约1×10⁸CFU/动物/天来饲喂的。

对于反刍动物，所述一种或多种芽孢杆菌菌株是以约5×10⁹CFU/头/天来饲喂的。

对于家禽，所述一种或多种芽孢杆菌菌株是以约1×10⁴CFU/g饲料至约1×10¹⁰CFU/g饲料加入饲料的。至少在某些实施例中，所述一种或多种芽孢杆菌菌株以约1×10⁵CFU/只/天至约1×10⁸CFU/只/天来饲喂的。

饲料原料

在另一种实施方式中，动物饲料包括本发明所述的至少一种细菌菌株。至少在一些实施方式中，用有效量的至少一种细菌菌株补充饲料。如在本发明中所用，“补充”是指将本发明所提供的有效量的细菌直接混合进预期用于动物的饲料中的操作。因此，当饲喂时，动物摄取本发明提供的细菌。

当与饲料原料组合使用时，对于单胃进食，饲料原料可以包括玉米、豆粕、如含有可溶物的干酒糟(DDGS)的副产物，以及维生素/矿物质补充剂。用于反刍动物的饲料原料可以是谷物或干草或青贮饲料或牧草，或它们的组合。包括在这样的饲料原料中的是玉米、晒谷(dried grain)、紫花苜蓿、任何饲料成分和食品或饲料工业副产品以及生物燃料工业的副产品和玉米粕以及它们的混合物。也可以使用其它饲料原料。

施用时间可以有所不同，只要显示出以下各项中的一项或多项改进即可：(1)复合饲料成分的分解，(2)养分的消化率，(3)粪肥废物的问题，(4)生产效率，(5)胴体品质，(6)生长性能，(7)当饲喂高水平DDGS时的生长性能，(8)家禽生长性能反应，(9)猪生长性能反应，(10)家禽生产效率，(11)猪生产效率，(12)体重增加，(13)采食量，(14)饲料效率，以及(15)死亡率。可以在任何时候以喂或不喂饲料来施用。然而，优选在饲喂饲料时或紧接饲喂饲料之前施用所述细菌。

用于改进动物生长性能的方法

在一种实施方式中，本公开涉及一种用于改进动物生长性能的方法，其包括使用一种或多种产酶菌株或其上清液，以相对于没有施用产酶菌株的动物提高动物生长性能。在一种实施方式中，所述动物是猪。在另一种实施方式中，所述动物是禽类。在另一种实施方式中，所述动物是反刍动物。

在一种实施方式中，生长性能包括但不限于养分的消化率、家禽生长性能反应、猪的生长性能反应、饲料效率、复合饲料成分的分解、平均日增重、平均日采食量、体重增量、采食量、胴体品质和死亡率。在另一种实施方式中，本发明所公开的方法可用来改进饲喂了含有DDGS的动物饲料的动物的生长性能。

在某些实施方式中，相对于未经处理的对照，生长性能的改进至少是1-5％、5-10％、10-15％、15-20％、20-25％、25-30％、30-35％、35-40％、40-45％、45-50％、50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％、75-80％、80-85％、85-90％、90％-95％、96％、97％、98％、99％或大于99％。

至少在一些实施方式中，与对照动物相比，施用菌株的动物的生长性能的改进至少是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和大于99％。

在一种实施方式中，用于改进动物的生长性能的所述产酶菌株包括芽孢杆菌菌株。在一种实施方式中，所述芽孢杆菌菌株是枯草芽孢杆菌。在另一种实施方式中，芽孢杆菌菌株是短小芽孢杆菌。

在另一种实施方式中，所述用于改进生长性能的产酶菌株包括，但不限于，枯草芽孢杆菌AGTP BS3BP5、枯草芽孢杆菌AGTP BS442、枯草芽孢杆菌AGTP BS521、枯草芽孢杆菌AGTP BS918、枯草芽孢杆菌AGTP BS 1013，以及枯草芽孢杆菌BS AGTP 1069、枯草芽孢杆菌AGTP 944、短小芽孢杆菌AGTP BS 1068和短小芽孢杆菌KX11-1，以及具有它们所有特征的菌株、它们的任意衍生物或变体以及它们的混合物。

所述用于改进动物生长性能的产酶菌株可以以单一菌株、所述菌株的一种或多种组合或者所述菌株的培养物的一种或多种上清液、包含一种或多种菌株或者它们的混合物的饲料的形式施用。

A.养分消化率

在另一种实施方式中，本公开涉及一种提高动物饲料的消化率的方法，包括给动物施用有效量的产酶菌株，以相对于未施用所述产酶菌株的动物提高动物饲料的消化率。在另一种实施方式中，所述方法进一步包括测量在来自施用了所述产酶菌株的动物的粪肥坑中累积的养分的量，并将该养分的量与在来自未施用所述产酶菌株的动物的粪肥坑中的养分的量相比较。在另一种实施方式中，所述动物饲料含有DDGS。

在另一种实施方式中，本公开涉及一种提高动物饲料的消化率的方法，包括给动物施用补充了有效量的产酶菌株的饲料，以相对于未施用所述产酶菌株的动物提高动物饲料的消化率。

在一种实施方式中，用于改进动物生长性能的方法包括给动物施用产酶菌株，并且相对于未施用所述产酶菌株的动物，减少动物未消化的养分的量。

在另一种实施方式中，用于改进动物生长性能的方法，包括通过给动物施用产酶菌株，相对于未施用所述产酶菌株的动物，减少动物未消化的养分的量。

在另一种实施方式中，用于改进动物生长性能的方法包括给动物施用产酶菌株，测量在来自施用了所述产酶菌株的动物的粪肥坑中累积的养分的量，并将在来自施用所述产酶菌株的动物的粪肥坑中的养分的量与在来自未施用所述产酶菌株的动物的第二粪肥坑中的养分的量相比较。

在一种实施方式中，动物饲料的消化率可以通过粪肥坑中的养分的量来测量。可以从粪肥坑测量出任何养分，包括但不限于干物质、灰分、总氮、铵态氮、磷和钙。

所述用于改进养分消化率的产酶菌株可以以单一菌株所述菌株的、一种或多种组合或者所述菌株的培养物的一种或多种上清液、包含一种或多种菌株或者它们的混合物的饲料的形式施用。

B.家禽生长性能

在一种实施方式中，本公开涉及一种提高家禽生长性能的方法，包括对家禽施用有效量的产酶菌株，以相对于没有施用产酶菌株的家禽提高家禽生长性能。本发明公开的方法可以用于改进生长性能，无论家禽的饲料或饮食。

在一种实施方式中，本公开涉及一种提高喂食了高纤维副产品饲料的家禽的生长性能的方法，包括对喂食了高纤维副产品饲料的家禽施用有效量的产酶菌株，以相对于没有施用产酶菌株的家禽提高家禽生长性能。

在另一种实施方式中，本公开涉及一种提高家禽平均日增重的方法，包括对家禽施用有效量的产酶菌株，以相对于没有施用产酶菌株的家禽提高家禽平均日增重。

在另一种实施方式中，本公开涉及一种提高家禽平均日饲料摄入量的方法，包括对家禽施用有效量的产酶菌株，以相对于没有施用产酶菌株的家禽提高家禽平均日饲料摄入量。

在另一种实施方式中，本发明涉及一种提高家禽的动物饲料的饲料效率的方法，包括给家禽施用补充了有效量产酶菌株的动物饲料，以相对于没有施用产酶菌株的家禽提高家禽的饲料效率。

在又一种实施方式中，本公开涉及一种改进家禽胴体品质的方法，包括对家禽施用有效量的产酶菌株，以相对于没有施用产酶菌株的家禽改进家禽的胴体品质。可以改进的胴体品质包括，但不限于，脂肪厚度、器官重量、胸部特征、胴体重、胴体等级和胴体价值。

在一种实施方式中，所述胴体品质的测量值可以增加或减少。

在另一种实施方式中，以下各项中的一种或多种胴体品质的测量值增加：脂肪厚度、器官重量、胸部特征、胴体重、胴体等级和胴体价值。

在又一种实施方式中，以下各项中的一种或多种胴体品质的测量值减少：脂肪厚度、器官重量、胸部特征、胴体重、胴体等级和胴体价值。

在又一实施方式中，本公开涉及一种降低家禽死亡率的方法，包括对家禽施用有效量的产酶菌株，以相对于没有施用产酶菌株的家禽降低所述家禽的死亡率。

在另一种实施方式中，本公开涉及一种提高木质素消化率的方法，包括对家禽施用有效量的产酶菌株，以相对于没有施用产酶菌株的家禽提高木质素的消化率。

在另一种实施方式中，本公开涉及提高高纤维饲料中的木质素的消化率的方法，包括对家禽施用有效量的产酶菌株，以相对于没有施用产酶菌株的家禽提高高纤维饲料中木质素的消化率。在另一种实施方式中，所述高纤维饲料包括基于副产品的饲料。在另一种实施方式中，所述饲料含有DDGS。

在另一种实施方式中，本公开涉及提高表观回肠消化率的方法，包括对家禽施用有效量的产酶菌株，以相对于没有施用产酶菌株的家禽提高表观回肠消化率。

在又一种实施方式中，本公开涉及提高表观总肠道消化率的方法，包括对家禽施用有效量的产酶菌株，以相对于没有施用产酶菌株的家禽提高表观总消化道消化率。

在另一种实施方式中，本公开涉及降低回肠食糜的pH值的方法，包括对家禽施用有效量的产酶菌株，以相对于没有施用产酶菌株的家禽降低回肠食糜的pH值。

在又一实施方式中，以上所述的方法进一步包括施用补充了产酶菌株的饲料。

所述用于提高家禽生长性能的产酶菌株可以以单一菌株、所述菌株的一种或多种组合或者所述菌株的培养物的一种或多种上清液、包含一种或多种菌株或者它们的混合物的饲料的方式施用。

C.猪生长性能

在一种实施方式中，本公开涉及一种提高猪生长性能的方法，包括对猪施用有效量的产酶菌株，以相对于没有施用产酶菌株的猪提高猪生长性能。本发明公开的方法可以用于改进生长性能，无论猪的饲料或饮食。

在一种实施方式中，本公开涉及一种提高喂食了高纤维副产品饲料的猪的生长性能的方法，包括对喂食了高纤维副产品饲料的猪施用有效量的产酶菌株，以相对于没有施用产酶菌株的猪提高猪生长性能。

在另一种实施方式中，本公开涉及一种提高猪平均日增重的方法，包括对猪施用有效量的产酶菌株，以相对于没有施用产酶菌株的猪提高猪平均日增重。

在另一种实施方式中，本公开涉及一种提高猪平均日饲料摄入量的方法，包括对猪施用有效量的产酶菌株，以相对于没有施用产酶菌株的猪提高猪平均日饲料摄入量。

在另一种实施方式中，本公开涉及一种提高猪的动物饲料的饲料效率的方法，包括给猪施用补充了有效量产酶菌株的动物饲料，以相对于没有施用产酶菌株的猪提高猪的饲料效率。

在又一种实施方式中，本公开涉及一种改进猪胴体品质的方法，包括对猪施用有效量的产酶菌株，以相对于没有施用产酶菌株的猪改进猪的胴体品质。可以改进的胴体品质包括，但不限于，脂肪厚度、腰部厚度、瘦肉率、热胴体重、器官重量、胴体等级和胴体价值。

在一种实施方式中，所述胴体品质的测量值可以增加或减少。

在另一种实施方式中，以下各项中的一种或多种胴体品质的测量值增加：脂肪厚度、腰部厚度、瘦肉率、热胴体重、器官重量、胴体等级和胴体价值。

在又一种实施方式中，以下各项中的一种或多种胴体品质的测量值减少：脂肪厚度、腰部厚度、瘦肉率、热胴体重、器官重量、胴体等级和胴体价值。

在又一实施方式中，本公开涉及一种降低猪死亡率的方法，包括对猪施用有效量的产酶菌株，以相对于没有施用产酶菌株的猪降低所述猪的死亡率。

在另一种实施方式中，本公开涉及一种提高木质素消化率的方法，包括对猪施用有效量的产酶菌株，以相对于没有施用产酶菌株的猪提高木质素的消化率。

在另一种实施方式中，本公开涉及提高高纤维饲料中的木质素的消化率的方法，包括对猪施用有效量的产酶菌株，以相对于没有施用产酶菌株的猪提高高纤维饲料中木质素的消化率。在另一种实施方式中，所述高纤维饲料包括基于副产品的饲料。在另一种实施方式中，所述饲料含有DDGS。

在另一种实施方式中，本公开涉及提高表观回肠消化率的方法，包括对猪施用有效量的产酶菌株，以相对于没有施用产酶菌株的猪提高表观回肠消化率。

在又一种实施方式中，本公开涉及提高表观总肠道消化率的方法，包括对猪施用有效量的产酶菌株，以相对于没有施用产酶菌株的猪提高表观总消化道消化率。

在另一种实施方式中，本公开涉及降低回肠食糜的pH值的方法，包括对猪施用有效量的产酶菌株，以相对于没有施用产酶菌株的猪降低回肠食糜的pH值。

在又一实施方式中，以上所述的方法进一步包括施用补充了产酶菌株的饲料。

在另一种实施方式中，在上述有关猪的生长性能的方法中的产酶菌株是包括枯草芽孢杆菌菌株AGTP BS918(NRRL B-50508)、AGTP BS1013(NRRL B-50509)和AGTP BS3BP5(NRRL B-50510)的组合。

所述用于提高猪生长性能的产酶菌株可以以单一菌株、所述菌株的一种或多种组合或者所述菌株的培养物的一种或多种上清液、包含一种或多种菌株或者它们的混合物的饲料的形式施用。

用于改进粪肥存储单元的方法

在一种实施方式中，本公开涉及一种用于改进粪肥存储单元的方法，其包括给动物施用有效量的产酶菌株、所述菌株的一种或多种组合、所述菌株的培养物的一种或多种上清液、包含一种或多种菌株或者它们的混合物的饲料以改进粪肥存储单元。在一种实施方式中，所述动物是猪。在某些实施方式中，所述粪肥存储单元是粪肥坑。

在另一种实施方式中，本公开涉及一种用于改善圈养动物的房间的空气质量的方法，其包括给动物施用有效量的产酶菌株、所述菌株的一种或多种组合、所述菌株的培养物的一种或多种上清液、包含一种或多种菌株或者它们的混合物的饲料以改善该房间的空气质量。在一种实施方式中，改善空气质量包括减弱房间内气味。在另一种实施方式中，改善空气质量包括降低下列中的一种或多种的产生：挥发性脂肪酸、氨、甲烷或硫化氢。

至少在一些实施方式中，相对于对照粪肥坑，该施用在以下各项中的至少一项上得到了改进：更低的起泡发生率、更少的固体积累、以及更少的氮、硫、磷、纤维结合氮、总蛋白、脂肪和纤维含量。

在一种实施方式中，所述用于改进粪肥储存单元的产酶菌株包括芽孢杆菌菌株。在一种实施方式中，所述芽孢杆菌菌株是枯草芽孢杆菌。在另一种实施方式中，所述芽孢杆菌菌株是短小芽孢杆菌。

在另一种实施方式中，所述用于改进粪肥储存单元的产酶菌株包括但不限于枯草芽孢杆菌AGTP BS3BP5、枯草芽孢杆菌AGTP BS442、枯草芽孢杆菌AGTP BS521、枯草芽孢杆菌AGTP BS918、枯草芽孢杆菌AGTP BS1013、枯草芽孢杆菌AGTP BS1069、枯草芽孢杆菌AGTP944、短小芽孢杆菌AGTP BS 1068、短小芽孢杆菌KX11-1以及具有它们所有特征的菌株、它们的任何衍生物或变体和它们的混合物。

在另一种实施方式中，本公开涉及一种用于改进粪肥储存单元的方法，其包括将产酶菌株、所述菌株的一种或多种组合、所述菌株的培养物的一种或多种上清液、包含一种或多种菌株或者它们的混合物的组合物与粪肥存储单元(例如粪肥坑)直接接触。将产酶菌株与粪肥存储单元直接接触所产生的改进包括以下各项中的至少一种：比对照粪肥坑更低的起泡发生率、更少的固体积累以及更少的氮、硫、磷、纤维结合氮、总蛋白、脂肪和纤维含量。

在另一种实施方式中，上述方法可用于改进粪肥废物问题，其包括，但不限于：粪肥坑中的发泡，固体积累，(a)氮、(b)硫、(c)磷、(d)纤维结合氮、(e)总蛋白、(f)脂肪和(g)纤维含量的增加。

A.用于控制或减少粪肥存储单元中的泡沫的方法

在另一种实施方式中，本公开涉及一种用于控制或减少粪肥存储单元中的泡沫的方法，其包括给动物施用有效量的产酶菌株、所述菌株的一种或多种组合、所述菌株的培养物的一种或多种上清液、包含一种或多种菌株或者它们的混合物的饲料，以相对于未施用产酶菌株的动物的粪肥存储单元控制或减少粪肥存储单元中的泡沫。在另一种实施方式中，所述粪肥存储单元中的泡沫:液体的比例降低。

在另一种实施方式中，本公开涉及一种用于控制或减少存储坑中的泡沫的方法，其包括将有效量的产酶菌株、所述菌株的一种或多种组合、所述菌株的培养物的一种或多种上清液、包含一种或多种菌株或者它们的混合物的组合物与粪肥存储坑直接接触，以相对于没有产酶菌株的粪肥存储坑控制或减少粪肥存储坑中的泡沫。在另一种实施方式中，所述粪肥存储单元中的泡沫:液体的比例降低。

粪肥存储单元中泡沫的量与粪肥存储单元中的固体的量相关联。具有更高的固体百分比的粪肥存储单元通常具有更大的泡沫:液体比例，因此，有更多泡沫。

在另一种实施方式中，本公开涉及一种用于控制或减少粪肥存储单元中的泡沫的方法，其包括给动物施用有效量的产酶菌株、所述菌株的一种或多种组合、所述菌株的培养物的一种或多种上清液、包含一种或多种菌株或者它们的混合物的饲料，以相对于未施用产酶菌株的动物的粪肥存储单元减少固体的量，从而减少粪肥存储单元中的泡沫量。在另一种实施方式中，所述粪肥存储单元的中泡沫:液体的比例降低。

在另一种实施方式中，本公开涉及一种用于控制或减少粪肥存储单元中的泡沫的方法，其包括将有效量的产酶菌株、所述菌株的一种或多种组合、所述菌株的培养物的一种或多种上清液、包含一种或多种菌株或者它们的混合物的组合物与粪肥存储单元直接接触，以相对于没有产酶菌株的粪肥存储单元减少粪肥存储单元中的固体的量。在另一种实施方式中，所述粪肥存储单元的中泡沫:液体的比例降低。

B.用于改变粪肥存储单元微生物生态的方法

在一种实施方式中，本公开涉及一种用于改变粪肥存储单元中的微生物生态的方法，其包括给动物施用有效量的产酶菌株、所述菌株的一种或多种组合、所述菌株的培养物的一种或多种上清液、包含一种或多种菌株或者它们的混合物的饲料，以相对于未施用产酶菌株的动物的粪肥存储单元改变粪肥存储单元的微生物生态。

在另一种实施方式中，本公开涉及一种用于改变粪肥存储单元中的微生物生态的方法，其包括将有效量的产酶菌株、所述菌株的一种或多种组合、所述菌株的培养物的一种或多种上清液、包含一种或多种菌株或者它们的混合物的组合物与粪肥存储单元直接接触，以相对于没有产酶菌株的粪肥存储单元改变粪肥存储单元的微生物生态。

在一种实施方式中，产酶菌株可以直接地或间接地改变粪肥存储单元的微生物生态，导致某些种类细菌的数量增加而其它种类细菌的数量减少。通过所述产酶菌株可以直接或间接地改变的细菌种类包括，但不限于，产甲烷菌、拟杆菌属、梭状芽孢杆菌群I、梭状芽孢杆菌群IV、梭状芽孢杆菌群XIVa和硫酸盐还原菌。

在一种实施方式中，所述产酶菌株具有通过微生物种群改变养分利用率并随后改变微生物生态的能力，从而通过减少可被截留在泡沫基质中的气体产生，改变构成泡沫基质的分子化合物的可利用率，或直接抑制与发泡事件有关的细菌的生长，而缓解了累积的发泡发生率。

C.改变挥发性脂肪酸组成的方法

在一种实施方式中，本公开涉及一种用于改变粪肥中挥发性脂肪酸组成的方法，其包括给动物施用有效量的产酶菌株，以相对于来自未施用产酶菌株的第二动物的粪肥改变来自所述动物粪肥中的脂肪酸的组成。在一种实施方式中，改变脂肪酸组合物可能会导致某些脂肪酸增加而其它脂肪酸减少。在另一种实施方式中，改变的脂肪酸组成可以以直接或间接的方式进行。

在一种实施方式中，本公开涉及一种用于改变粪肥存储单元中的挥发性脂肪酸组成的方法，其包括给动物施用有效量的产酶菌株，以相对于来自未施用产酶菌株的第二动物的粪肥改变存储在粪肥存储单元中的来自所述动物粪肥中的脂肪酸的组成。在一种实施方式中，所述动物是猪。在另一种实施方式中，所述粪肥储存单元是粪肥坑。

在另一种实施方式中，本公开涉及一种用于改变粪肥存储单元中的挥发性脂肪酸组成的方法，其包括给动物施用有效量的产酶菌株，测量来自饲喂了产酶菌株的动物的粪肥中的挥发性脂肪酸的量；和调节饲喂动物的产酶菌株的浓度以达到存储在粪肥坑中的粪肥的挥发性脂肪酸的所需浓度。

在又一种实施方式中，本公开涉及一种用于改变粪肥存储单元中的挥发性脂肪酸组成的方法，其包括将有效量的产酶菌株直接与粪肥存储单元接触，以相对于没有产酶菌株的粪肥存储单元改变粪肥存储单元中的脂肪酸的组成。

在另一种实施方式中，可以通过本发明公开的方法改变的挥发性脂肪酸包括，但不限于，乙酸、丙酸、丁酸、I-丁酸、4-甲基戊酸。在另一种实施方式中，本发明所公开的方法增加粪肥中的脂肪酸丁酸。在又一实施例中，本发明所公开的方法降低粪肥中的脂肪酸4-甲基戊酸。

在另一种实施方式中，可以改变总挥发性脂肪酸。在另一种实施方式中，本发明所公开的方法降低粪肥中的总挥发性脂肪酸。

改变气体排放的方法

在一种实施方式中，本公开涉及一种用于改变气体排放的方法，包括给动物施用有效量产酶菌株，以相对于来自未施用产酶菌株的动物改变气体的排放。在一种实施方式中，改变气体排放可以导致某些气体排放增加而其他气体排放减少。在另一种实施方式中，改变气体排放可以以直接或间接的方式发生。

在一种实施方式中，所述用于改变气体排放的产酶菌株包括芽孢杆菌菌株。在一种实施方式中，所述芽孢杆菌菌株是枯草芽孢杆菌。在另一种实施方式中，所说芽孢杆菌菌株是短小芽孢杆菌。

在另一种实施方式中，所述用于改变气体排放的产酶菌株包括，但不限于，枯草芽孢杆菌AGTP BS3BP5、枯草芽孢杆菌AGTP BS442、枯草芽孢杆菌AGTP BS521、枯草芽孢杆菌AGTP BS918、枯草芽孢杆菌AGTP BS1013、以及枯草芽孢杆菌AGTP BS1069、枯草芽孢杆菌AGTP 944、短小芽孢杆菌AGTP BS 1068和短小芽孢杆菌KX11-1，以及具有它们所有特性的菌株、它们的任何衍生物或变体以及它们的混合物。

所述改变气体排放的产酶菌株可以以单一菌株、所述菌株的一种或多种组合或者所述菌株的培养物的一种或多种上清液、包含一种或多种菌株或者它们的混合物的饲料的方式施用。

可以通过产酶菌株改变的气体包括，但不限于，氨、二氧化碳、甲烷和硫化氢。

在另一种实施方式中，本公开涉及一种用于改变饲养动物的房间内的气体排放的方法，其包括给动物施用有效量的产酶菌株，以相对于饲养未施用产酶菌株的动物的房间改变气体的排放。在一种实施方式中，所述动物是猪。在另一种实施方式中，该房间位于猪棚内。在一种实施方式中，饲养施用了产酶菌株的动物的房间内甲烷和硫化氢气体的排放减少。

在另一种实施方式中，本公开涉及一种用于改变饲养动物的房间内的气体排放的方法，其包括：给动物施用有效量的产酶菌株以改变饲养动物的房间内的气体排放；并测量该房间内气体的量。

在另一种实施方式中，本公开涉及一种用于改变粪肥储存单元中的气体排放的方法，其包括给动物施用有效量的产酶菌株，以相对于具有来自未施用产酶菌株的动物的粪肥的粪肥储存单元改变粪肥储存单元中的气体排放。在一种实施方式中，所述动物是猪。在另一种实施例中，所述粪肥储存单元是粪肥坑。

在另一种实施方式中，本公开涉及一种用于改变粪肥储存单元中的气体排放的方法，其包括将有效量的产酶菌株与粪肥储存单元直接接触，以相对于没有产酶菌株的粪肥储存单元改变气体排放。在一种实施方式中，所述动物是猪。在另一种实施方式中，所述粪肥储存单元是粪肥坑。

在一种实施方式中，甲烷和硫化氢气体的排放减少。

减轻炎症应答的方法

在另一种实施方式中，本公开涉及一种减轻动物炎症效应的方法，其包括给动物施用有效量的产酶菌株，以减轻或抑制炎症应答。在一种实施方式中，所述动物是哺乳动物。在另一种实施方式中，所述动物是家禽。在另一种实施方式中，所述动物是鸡。在另一种实施方式中，所述动物是猪。

相对于参考对照(例如无抗炎性质的试剂，例如缓冲盐水或无抗炎性质的菌株)，所述的产酶菌株可以减轻或抑制炎症应答2-5％、5-10％、10-15％、15-20％、20-25％、25-30％、30-35％、35-40％、40-45％、45-50％、50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％、75-80％、80-85％、85-90％、90-95％和大于95％。

在一种实施方式中，所述用于减轻动物炎症效应的产酶菌株包括芽孢杆菌菌株。在一种实施方式中，所述芽孢杆菌菌株是枯草芽孢杆菌。在另一种实施方式中，所述芽孢杆菌菌株是短小芽孢杆菌。

在另一种实施方式中，所述用于减轻动物炎症效应的产酶菌株包括枯草芽孢杆菌AGTP BS3BP5、枯草芽孢杆菌AGTP BS442、枯草芽孢杆菌AGTP BS521、枯草芽孢杆菌AGTPBS918、枯草芽孢杆菌AGTP BS1013、以及枯草芽孢杆菌AGTP BS1069、枯草芽孢杆菌AGTP944、短小芽孢杆菌AGTP BS1068和短小芽孢杆菌KX11-1，以及具有它们的所有特性的菌株、它们的任何衍生物或变体以及它们的混合物。

在另一种实施方式中，所述用于减轻动物炎症效应的产酶菌株是包括枯草芽孢杆菌AGTP BS1013、枯草芽孢杆菌AGTP BS3BP5和枯草芽孢杆菌AGTP 944的组合物。

所述产酶菌株可以通过减少涉及炎症应答的基因的表达以减轻或抑制炎症应答。在一种实施方式中，相对于参考对照(例如无抗炎性质的试剂，例如缓冲盐水或无抗炎性质的菌株)，所述产酶菌株可以降低该基因的表达2-5％、5-10％、10-15％、15-20％、20-25％、25-30％、30-35％、35-40％、40-45％、45-50％、50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％、75-80％、80-85％、85-90％、90-95％和大于95％。

在另一种实施方式中，所述产酶菌株可以通过减少涉及炎症应答的蛋白质的表达以减轻或抑制炎症应答。

在另一种实施方式中，所述产酶菌株可以通过降低涉及炎症应答的蛋白的活性以减轻或抑制炎症应答。

在另一种实施方式中，相对于参考对照(例如无抗炎性质的试剂，例如缓冲盐水或无抗炎性质的菌株)，所述产酶菌株可以减少蛋白质的表达或活性2-5％、5-10％、10-15％、15-20％、20-25％、25-30％、30-35％、35-40％、40-45％、45-50％、50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％、75-80％、80-85％、85-90％、90％-95％和大于95％。

在另一种实施方式中，产酶菌株可以减少涉及参与炎症应答的任何通道的基因的表达或降低涉及参与炎症应答的任何通道的蛋白质的活性，所述通道包括，但不限于，黏附渗出迁移(adhesion-extravasation-migration)；凋亡信号转导；钙信号转导；补体级联(complement cascade)；细胞因子和细胞因子信号转导；类花生酸的合成和信号转导；糖皮质激素/PPAR信号转导；G-蛋白偶联受体信号转导；先天性病原体检测；白细胞信号转导；MAPK信号转导；自然杀伤细胞信号转导；NK–κB信号转导；抗原递呈；PI3K/AKT信号转导；ROS/谷胱甘肽/细胞毒素颗粒；以及TNF超家族和信号转导。

在一种实施方式中，所述产酶菌株可以降低细胞因子的活性或表达，所述细胞因子包括，但不限于，白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、促红细胞生成素、促血小板生成素(Tpo)、Fit-3L、SCF、M-CSF和MSP。

在一种实施方式中，白细胞介素包括，但不限于，白细胞介素(IL)-1、IL-1α、IL-1类似物、IL-β、IL-1RA、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-6类似物、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-10类似物、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、GM-CSF和OSM。

在另一种实施方式中，干扰素包括，但不限于，IFN-α、IFN-β和IFN-γ。

在另一种实施方式中，肿瘤坏死因子包括，但不限于，CD154、LT-β、TNF-α、TNF-β、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、4-1BBL、APRIL、CD70、CD153、CD178、GITRL、LIGHT、OX40L、TALL-1、TRAIL、TWEAK和TRANCE。

在另一种实施方式中，所述产酶菌株可以用于降低趋化因子的活性或减少趋化因子的表达，该趋化因子包括，但不限于，C趋化因子、CC趋化因子、CXC趋化因子和CXC3趋化因子。

在一种实施方式中，C趋化因子包括，但不限于，XCL1和XCL2。

在另一种实施方式中，CC趋化因子包括，但不限于，CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27和CCL28。

在另一种实施方式中，CXC趋化因子包括，但不限于，CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13和CXCL14。

所述用于减轻动物炎症应答的产酶菌株可以以单一菌株、所述菌株的一种或多种组合或者所述菌株的培养物的一种或多种上清液、包含一种或多种菌株或者它们的混合物的饲料的方式施用。

本发明所公开的菌株、方法和组合物可以通过编号的段落来进一步描述。

1、一种具有酶活性的分离的芽孢杆菌菌株。

2、第1段所述的菌株，其中，所述酶活性选自纤维素酶活性、α-淀粉酶活性、木聚糖酶活性、酯酶、β-甘露聚糖酶、脂肪酶活性、蛋白酶活性及其组合。

3、前述段落中的任意一段所述的菌株，其中，所述酶活性选自玉米蛋白酶活性和大豆蛋白酶活性以及它们的组合。

4、前述段落中的任意一段所述的菌株，其中，当喂食高水平的DDGS时，相对于对照动物，当给动物施用所述菌株时，所述菌株在复合饲料成分的分解、粪肥废物问题、猪生产效率、胴体品质和猪性能中的至少一个方面提供了改进。

5、前述段落中的任意一段所述的菌株，其中，与对照动物相比，当饲喂高水平DDGS时，当给动物施用所述菌株时，该菌株在复合饲料成分的分解、粪肥废物问题、猪生产效率、胴体品质中至少一个方面的提供了至少2％的改进。

6、前述段落中的任意一段所述的菌株，其中，与对照动物相比，当给动物施用所述菌株时，该菌株在以下各项中的至少一项上提供改进：体重、平均日增重、平均日饲料摄入量、饲料效率、胴体品质、养分消化率和粪肥废物问题。

7、前述段落中的任意一段所述的菌株，其中，与对照动物相比，当给动物施用所述菌株时，该菌株在以下各项中的至少一项上提供至少2％的改进：体重、平均日增重、平均日饲料摄入量、饲料效率、胴体品质、养分消化率和粪肥废物问题。

8、前述段落中的任意一段所述的菌株，其中，所述菌株选自枯草芽孢杆菌种和短小芽孢杆菌种、具有它们所有特征的菌株、它们的任何衍生物或变体以及它们的混合物。

9、前述段落中的任意一段所述的菌株，其中，所述菌株选自枯草芽孢杆菌AGTPBS3BP5(NRRL B-50510)、枯草芽孢杆菌AGTP BS442(NRRL B-50542)、枯草芽孢杆菌AGTPBS521(NRRL B-50545)、枯草芽孢杆菌AGTP BS918(NRRL B-50508)、枯草芽孢杆菌AGTPBS1013(NRRL B-50509)、枯草芽孢杆菌AGTP BS1069(NRRL B-50544)、枯草芽孢杆菌AGTP944(NRRL B-50548)、短小芽孢杆菌AGTP BS1068(NRRL B-50543)、短小芽孢杆菌KX11-1(NRRL B-50546)、具有它们所有特征的菌株、它们的任何衍生物或变体以及它们的混合物。

10、前述段落中的任意一段所述的菌株，其中，所述菌株选自枯草芽孢杆菌AGTPBS3BP5(NRRL B-50510)、枯草芽孢杆菌AGTP BS442(NRRL B-50542)、枯草芽孢杆菌AGTPBS521(NRRL B-50545)、枯草芽孢杆菌AGTP BS918(NRRL B-50508)、枯草芽孢杆菌AGTPBS1013(NRRL B-50509)、枯草芽孢杆菌AGTP BS1069(NRRL B-50544)、枯草芽孢杆菌AGTP944(NRRL B-50548)、短小芽孢杆菌AGTP BS1068(NRRL B-50543)和短小芽孢杆菌KX11-1(NRRL B-50546)、它们的任何衍生物或变体以及它们的混合物。

11、前述段落中的任意一段所述的菌株，其中，所述芽孢杆菌菌株是枯草芽孢杆菌AGTP BS3BP5(NRRL B-50510)。

12、前述段落中的任意一段所述的菌株，其中，所述芽孢杆菌菌株是枯草芽孢杆菌AGTP BS442(NRRL B-50542)。

13、前述段落中的任意一段所述的菌株，其中，所述芽孢杆菌菌株是枯草芽孢杆菌AGTP BS521(NRRL B-50545)。

14、前述段落中的任意一段所述的菌株，其中，所述芽孢杆菌菌株是枯草芽孢杆菌AGTP BS918(NRRL B-50508)。

15、前述段落中的任意一段所述的菌株，其中，所述芽孢杆菌菌株是枯草芽孢杆菌AGTP BS1013(NRRL B-50509)。

16、前述段落中的任意一段所述的菌株，其中，所述芽孢杆菌菌株是短小芽孢杆菌AGTP BS 1068(NRRL B-50543)。

17、前述段落中的任意一段所述的菌株，其中，所述芽孢杆菌菌株是枯草芽孢杆菌AGTP BS1069(NRRL B-50544)。

18、前述段落中的任意一段所述的菌株，其中，所述芽孢杆菌菌株是枯草芽孢杆菌AGTP 944(NRRL B-50548)。

19、前述段落中的任意一段所述的菌株，其中，所述芽孢杆菌菌株是短小芽孢杆菌KX11-1(NRRL B-50546)。

20、一种组合物，其包括来自根据段落1-19中任一段所述的一种或多种菌株的一种或多种培养物的上清液以及它们的混合物。

21、一种组合物，其包括根据段落1-19中任一段所述的一种或多种菌株以及它们的混合物。

22、根据段落20或21所述的组合物，其中，所述菌株是枯草芽孢杆菌AGTP BS3BP5(NRRL B-50510)、枯草芽孢杆菌AGTP BS918(NRRL B-50508)和枯草芽孢杆菌AGTP BS1013(NRRL B-50509)。

23、根据段落20或21所述的组合物，其中，所述菌株是枯草芽孢杆菌AGTP BS3BP5(NRRL B-50510)、枯草芽孢杆菌AGTP 944(NRRL B-50548)、和枯草芽孢杆菌AGTP BS1013(NRRL B-50509)。

24、一种动物饲料，其中，所述饲料补充有根据段落1-19中任一段所述的分离菌株或根据段落20-23中任一段的组合物或它们的混合物。

25、一种方法，其包括给动物施用有效量的根据段落1-19中任一段所述的菌株、根据段落20-23中任一段所述的组合物、根据段落24的饲料或它们的混合物的步骤，其中，当给动物饲喂高含量的DDGS时，所述施用酶分解了饲喂给动物的饲料中的纤维、蛋白质、碳水化合物和脂质的至少一种。

26、一种方法，其包括给动物施用有效量的根据段落1-19中任一段所述的菌株、根据段落20-23中任一段所述的组合物、根据段落24所述的饲料或它们的混合物的步骤，其中，所述施用改进了复合饲料成分的分解、肥料废物问题、猪生产效率、胴体品质和猪性能中的至少一项。

27、一种方法，其包括给动物施用有效量的根据段落1-19中任一段所述的菌株、根据段落20-23中任一段所述的组合物、根据段落24所述的饲料或它们的混合物的步骤，其中，相对于对照动物，所述施用改进了以下各项中的至少一项：体重、平均日增重、平均日饲料摄入量、饲料效率、胴体品质、养分消化率和粪肥废物问题。

28、一种方法，其包括给家禽施用有效量的根据段落1-19中任一段所述的菌株、根据段落20-23中任一段所述的组合物、根据段落24所述的饲料或它们的混合物的步骤，其中，相对于对照动物，所述施用改进了以下各项中的至少一项：体重、平均日增重、平均日饲料摄入量、饲料效率、胴体品质、养分消化率和粪肥废物问题。

29、一种方法，其包括给猪施用有效量的根据段落1-19中任一段所述的菌株、根据段落20-23中任一段所述的组合物、根据段落24所述的饲料或它们的混合物的步骤，其中，相对于对照动物，所述施用改进了以下各项中的至少一项：体重、平均日增重、平均日饲料摄入量、饲料效率、胴体品质、养分消化率和粪肥废物问题。

30、段落25-29所述的方法，其中，所述组合物是段落22或23所述的组合物。

31、段落25-30中任一段所述的方法，其中，所述菌株是以约1×10⁵至约1×10¹¹CFU/动物/天施用。

32、段落25-27和29-31中任一段所述的方法，其中，所述动物是猪属动物。

33、段落25-32中任一段所述的方法，其中，所述动物饲喂高水平的含有可溶物的干酒糟(DDGS)。

34、段落25-33中任一段所述的方法，其中，所述动物以动物饮食10％以上的比例施用含有可溶物的干酒糟(DDGS)。

35、段落25-34中任一段所述的方法，其中，所述动物以动物饮食30％以上的比例施用含有可溶物的干酒糟(DDGS)。

36、一种方法，其包括给猪粪肥存储单元施用有效量的根据段落1-19中任一段所述的菌株或根据段落20-23中任一段所述的组合物的步骤。

37、段落36所述的方法，其中，所述猪粪肥存储单元是粪肥坑。

38、段落36或37所述的方法，相比于对照粪肥坑，其进一步包括改进以下各项中的至少一项：更少的起泡发生率、更少的固体积累、更少的氮、硫、磷、纤维结合氮、总蛋白、脂肪和纤维含量。

39、一种形成组合物的方法，所述方法包括：(a)在液体肉汤培养基中培养培养物，所述培养物包括根据段落1-19中任意一段所述的分离菌株中的一种，以及(b)从液体肉汤培养基中分离菌株。

40、段落39所述的方法，进一步包括冷冻干燥所述分离的菌株，并将冻干的菌株加入载体。

41、段落39或40所述的方法，进一步包括在所述菌株分离后保留液体肉汤培养基以生成上清液。

42、一种用于相对于对照动物改进动物生长性能的方法，包括给动物施用有效量的根据段落1-19中任一段所述的菌株、根据段落20-23中任一段所述的组合物、根据段落24所述的饲料或它们的混合物。

43、段落42的方法，其中，所述施用改进了以下各项中的至少一项：体重、平均日增重、平均日采食量、饲料效率、胴体品质、养分消化率和粪肥废物问题。

44、一种用于改进粪肥存储单元的方法，其包括给动物施用有效量的根据段落1-19中任一段所述的菌株、根据段落20-23中任一段所述的组合物、根据段落24所述的饲料或它们的混合物，以相对于储存于第二粪肥存储单元的来自对照动物的粪肥改进粪肥存储单元。

45、一种用于改进粪肥存储单元的方法，其包括将有效量的根据段落1-19中任一段所述的菌株、根据段落20-23中任一段所述的组合物、根据段落24所述的饲料或它们的混合物与粪肥存储单元直接接触。

46、段落44或45所述的方法，其中，相对于对照粪肥坑，改进包括下列各项中的至少一项：更低的起泡的发生率、更少的固体积累、更少的氮、硫、磷、纤维结合的氮、总蛋白、脂肪和纤维含量。

47、一种控制或减少粪肥坑中泡沫的方法，其包括给粪肥存储在粪肥坑中的动物施用有效量的根据段落1-19中任一段所述的菌株、根据段落20-23中任一段所述的组合物、根据段落24所述的饲料或它们的混合物。

48、一种控制或减少粪肥坑中泡沫的方法，其包括将有效量的根据段落1-19中任一段所述的菌株、根据段落20-23中任一段所述的组合物、根据段落24所述的饲料或它们的混合物与粪肥坑直接接触。

49、一种改变粪肥坑中的微生物生态的方法，其包括给粪肥存储在粪肥坑的动物施用有效量的根据段落1-19中任一段所述的菌株、根据段落20-23中任一段所述的组合物、根据段落24所述的饲料或它们的混合物。

50、一种改变粪肥坑中的微生物生态的方法，其包括将有效量的根据段落1-19中任一段所述的菌株、根据段落20-23中任一段所述的组合物、根据段落24所述的饲料或它们的混合物与粪肥坑直接接触。

51、一种改变粪肥坑中的挥发性脂肪酸组成的方法，其包括给粪肥存储在粪肥坑的动物施用有效量的根据段落1-19中任一段所述的菌株、根据段落20-23中任一段所述的组合物、根据段落24所述的饲料或它们的混合物。

52、一种改变粪肥坑中挥发性脂肪酸组成的方法，其包括将有效量的根据段落1-19中任一段所述的菌株、根据段落20-23中任一段所述的组合物、根据段落24所述的饲料或它们的混合物与粪肥坑直接接触。

53、一种改变圈养动物的房间内的气体排放的方法，其包括给动物施用有效量的根据段落1-19中任一段所述的菌株、根据段落20-23中任一段所述的组合物、根据段落24所述的饲料或它们的混合物以减少气体排放。

54、一种改变粪肥存储单元中的气体排放的方法，其包括给动物施用有效量的根据段落1-19中任一段所述的菌株、根据段落20-23中任一段所述的组合物、根据段落24所述的饲料或它们的混合物以减少气体排放。

55、一种改变粪肥存储单元中的气体排放的方法，其包括将有效量的根据段落1-19中任一段所述的菌株、根据段落20-23中任一段所述的组合物、根据段落24所述的饲料或它们的混合物与粪肥存储单元直接接触以减少气体排放。

56、一种减轻炎症应答的方法，其包括给动物施用有效量的根据段落1-19中任一段所述的菌株、根据段落20-23中任一段所述的组合物、根据段落24所述的饲料或它们的混合物以减轻炎症应答。

57、段落1-19所述的分离的菌株、根据段落20-23所述的组合物、根据段落24所述的饲料，当饲喂高含量的DDGS时，其用作药物以改进复合饲料成分的分解、肥料废物问题、猪生产效率、胴体品质和猪性能中的至少一项。

58、段落1-19所述的分离的菌株或根据段落20-23所述的组合物或根据段落24所述的饲料在制备提供一种或多种酶的药物中的应用。

60、段落1-19中所述的芽孢杆菌的分离菌株，当饲喂高含量的DDGS时，其用于改进复合饲料成分的分解、肥料废物问题、猪生产效率、胴体品质和猪性能。

61、段落1-19中所述的芽孢杆菌的分离菌株在制备提供酶活性的药物中的应用。

62、段落1-19中所述的芽孢杆菌的分离菌株，当饲喂高含量的DDGS时，在制备用于改进复合饲料成分的分解、肥料废物问题、猪生产效率、胴体品质和猪性能的药物中的应用。

实施例

提供下面的实施例仅用于说明的目的。在本发明中包括实施例仅用于帮助更完整地理解此处所描述的本发明。实施例不以任何方式限制本发明所描述的或要求的范围。

实施例1

环境细菌的分离和酶活性的鉴定。

在几年的时期内，从不同的来源地点收集农业和环境废物样品。达到目的后，将所有样品在1％蛋白胨溶液中稀释，在65℃下芽孢处理35分钟，并连续稀释到胰蛋白酶大豆琼脂平板(BD Difco,Franklin Lakes,NJ)上。在32℃下温育48小时后，将不同的未知环境菌落生长从所述平板转移到胰蛋白大豆肉汤液体培养基(TSB)中进行培养，类似地进行再培养并于-85℃冷冻保存用于后续分析。

收集环境来源的大约4000个可能的芽孢杆菌分离菌株，并筛选其降解各种目标底物的能力。环境培养物挑选自冷冻库材料，并在32℃下在0.5ml TSB中在轨道摇床培养箱中培养24小时，速度设置为130(Gyromax 737R)。通过将2微升液体培养物平行点滴到100×100×15mm栅格板中的15.0ml各种目标底物培养基类型上进行这些试验菌株的高通量筛选。用各个菌株基于特定底物利用测定纤维素酶、α-淀粉酶、玉米蛋白酶、大豆蛋白酶、酯酶、脂肪酶和木聚糖酶活性。用于分析由环境衍生菌株的酶活性导致的底物利用性能的培养基成分描述于表1中。在施加培养物后，将测定板放置干燥30分钟，然后在32℃下孵育24小时。通过以毫米为单位测量底物降解的区域以测定每种菌株的酶活性，如由菌落生长的透明周围边缘所指示的。记录由平行平板得到的平均值。

作为显示出所有筛选菌株中的代表酶活性最高的10％和最高的2％的底物活性的范围的直接饲喂的候选微生物菌株，从约4000株筛选菌株中挑选出九种菌株(表2)。基于它们利用或降解一系列与在饲料中包含DDGs相联系的相关底物的能力，选出九种分离菌株作为一种或多种直接饲喂微生物(DFM(s))的候选物。测定了RAPD PCR图谱和各菌株的部分16S rDNA序列。通过使用8F和1541R引物组扩增16S rDNA进行每个菌株的属和推定种的测定。从正向和反向端对纯化的PCR产物测序，并用CAP3装配程序生成连续序列。九个所选的菌株有：枯草芽孢杆菌AGTP BS3BP5(图1和2)、枯草芽孢杆菌AGTP BS442(图3和4)、枯草芽孢杆菌AGTP BS521(图5和6)、枯草芽孢杆菌AGTP BS918(图7和8)、枯草芽孢杆菌AGTPBS1013(图9和10)、短小芽孢杆菌AGTP BS 1068(图11和12)、枯草芽孢杆菌AGTP BS1069(图13和14)、枯草芽孢杆菌AGTP 944(图15-18)和短小芽孢杆菌KX11-1(图19-21)。

表1-用于分析通过环境衍生芽孢杆菌的底物利用性能说明的酶活性的培养基成分。

表2-直接饲喂微生物候选菌株的酶活性的总结。^a

^a数值代表以毫米(mm)为单位的底物降解区域，如由每种菌株的菌落生长的透明周围边缘所指示的。

^b对于菌株分离命名，BS＝枯草芽孢杆菌；BP＝短小芽孢杆菌

¹数值表示在特定种类的所有4000株筛选菌株中的酶活性最高的2％。

²数值表示在特定种类的所有4000株筛选菌株中的酶活性最高的10％。

实施例2

新型芽孢杆菌菌株和三株市售芽孢杆菌直接饲喂微生物，

S的酶活性比较。

从各个冷冻库材料中挑选三株

S芽孢杆菌菌株(枯草芽孢杆菌27(BS 27)、地衣芽孢杆菌(以前被认为是解淀粉芽孢杆菌)842和地衣芽孢杆菌21(Bl 21))，并在32℃下在0.5ml TSB中在轨道摇床培养箱中培养24小时，速度设置为130(Gyromax737R)。通过将2微升液体培养物平行点滴到100×100×15mm栅格板中的15.0ml各种目标底物培养基类型上进行这些试验菌株的高通量筛选。用各个菌株基于特定底物利用测定纤维素酶、大豆蛋白酶和酯酶/脂肪酶活性。用于分析由环境衍生菌株的酶活性导致的底物利用性能的培养基成分描述于表3中。在施加培养物后，将测定板放置干燥30分钟，然后在32℃下孵育24小时。通过以毫米为单位测量底物降解的区域以测定每种菌株的酶活性，如由菌落生长的透明周围边缘所指示的。记录由平行平板得到的平均值，并与由实施例1中鉴定的新型芽孢杆菌菌株得到的值进行比较(表4)。当与以底物分解活性选择出的新型芽孢杆菌菌株相比较时，三株

S枯草芽孢杆菌菌株中只有一种菌株显示出一些实质性的酶活性；这通过

S枯草芽孢杆菌菌株BS 27的大豆蛋白酶活性举例说明。

表3-用于分析通过环境衍生芽孢杆菌的底物利用性能说明的酶活性的培养基成分。

表4与增强底物分解的新型芽孢杆菌菌株相比，

S芽孢杆菌产品菌株的酶活性。^a

^a数值代表以毫米(mm)为单位的底物降解区域，如由每种菌株的菌落生长的透明周围边缘所指示的。

¹数值表示在特定种类的所有4000株筛选菌株中的酶活性最高的2％。

²数值表示在特定种类的所有4000株筛选菌株中的酶活性最高的10％。

实施例3

相应于将枯草芽孢杆菌菌株3BP5添加到猪饲料中显示出改进的生长性能的动物饲养试验。

进行猪饲养试验以评价基于芽孢杆菌的直接饲喂微生物(DFM)饲料添加物对于生长育肥猪的体重增加、采食量和饲料效率的影响。将约180头猪(与EB超雄性交配的孟山都选择性遗传GPK 35(Monsanto Choice Genetics GPK 35)雌性)按照初始体重围为三个重量区块并在完成育儿期时以5头猪/栏的分组将其关进围栏。将猪转移到断奶到育成(wean-to-finish)设施，并在装配有单孔进食器和断奶到育成杯式饮水器的全条板围栏(1.52m×3.05m)中饲养5头猪/栏。初始最低环境室温保持在约78℉。在育成阶段，最低温度进一步降低到70℉。在整个研究中，饲料和水是自由可得的。

将二种饮食处理之一分配到每个区块内的各栏(18栏/处理)，并在第1阶段(50～90磅)、第2阶段(90～130磅)、第3阶段(130～180磅)、第4阶段(180～230磅)和第5阶段(230磅至大约270磅的商品猪)施用。这两种饮食处理由在五阶段生长-育成(grower-finisher)猪研究中的无DFM3BP5的基础对照饮食和有DFM 3BP5的基础饮食组成。调配饮食以满足或超出NRC(1988)的要求，并且饮食主要由分别占饮食47％、18.6％和30％的玉米、豆粕和DDGS组成。以7.3×10⁷CFU/kg饲料将枯草芽孢杆菌AGTP BS3BP5加入饮食中，并基于平均日饲料摄入量(ADFI)供给约1×10⁸CFU/头/天。收集的数据是在五个生长-育成阶段中的每个阶段的平均日增重、平均日采食量、每单位增重所要求的饲料。当整个猪棚的平均猪体重达到了大约270磅时，从研究中移去猪。

以栏作为试验单位和基于初始体重的区块，以随机化完全区组设计分析性能数据。采用SAS(SAS Institute公司，Cary,NC)的GLM程序进行方差分析。

与饲喂对照饮食的猪相比，饲喂含枯草芽孢杆菌AGTP BS3BP5的饮食的猪在阶段1的生长期间具有更大的(P<0.01)平均日增重(ADG)和增重:饲料，并在总的阶段1和阶段2期间趋向(P<0.08)于具有更大的平均日增重(ADG)和增重:饲料(表5)。在第一生长时期ADG的增加导致饲喂枯草芽孢杆菌AGTP BS3BP5的猪在第一阶段期间结束时与饲喂对照饮食的猪相比具有更大的(P<0.01)的体重。

表5与饲喂对照饮食的猪相比，饲喂枯草芽孢杆菌AGTP 3BP5的猪的生长性能反应。

¹SE＝标准误差

实施例4

显示枯草芽孢杆菌菌株组合添加到猪饲料中的效果的动物饲养和粪肥坑质量平衡试验。

进行猪饲养试验以评价在生长-育肥猪饮食中施用基于芽孢杆菌的直接饲喂微生物(DFM)对生长性能反应(平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和增重:饲料)、胴体产量和质量测量、粪肥营养组成、粪肥坑的微生物组成以及来自粪肥坑的气体排放(氨、甲烷和硫化氢)的影响。将总共720头猪(约克郡长白×杜洛克猪基因型(Yorkshire-Landrace×Duroc genotype))以12栏/间和5头猪/栏安置在12个房间内。每间房包含具有储存整个断奶到育成时期的粪肥的容量的两个粪肥坑。每个粪肥坑位于6个栏下，同时在每个房间内中央走道下的墙分开这两个粪肥坑。12个房间中的每一间都配备有监测器以监测从个独立通风的房间内的气体排放。在研究开始前将猪断奶并放置在栏内，以及当它们已经达到29.5kg的平均体重时，开始接受实验测试饲料。给猪饲喂五个饲养阶段，每个阶段为期三周，并且当猪达到120kg的平均屠宰体重时结束。

在试验中，给猪施用两种饮食处理，这两种饮食处理由对照饮食和补充有芽孢杆菌菌株组合(菌株BS1013、BS918和BS3BP5)的饮食组成。调配饮食以满足或超出NRC(1988)的要求，并且饮食主要由分别占饲料50％、20％和30％的玉米、豆粕和DDGS组成。在芽孢杆菌组合DFM中的三株菌株在每克材料含有1.47×10⁸CFU的DFM的实验测试材料中相等地存在。将芽孢杆菌组合DFM以7.3×10⁷CFU/kg饲料加入到饮食中，根据平均日采食量以约1×10⁸CFU/头/天供应。

每个饲养阶段结束时确定猪性能测定(平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)、增重:饲料)。这些数据是由72个平行测定/处理构成。在0周(最初和猪接受处理之前)、9周和15周对粪肥坑进行真空采样，对包含在猪的粪肥废物的养分进行组分分析(12次平行测定/处理)。也获得每一天的子样本，以确定挥发性脂肪酸含量及微生物群落分析(12次平行测定/处理)。此外，在试验结束时在第15周取样中，将粪肥池坑腾空到混合容器，以混匀整个粪肥坑内容物，测定粪肥坑容积并取样进行养分分析。测量每个房间的气体排放，以确定氨、甲烷和硫化氢气体产生(6次平行测定/处理)。在研究结束时，将猪发送到商业屠宰设施，并收集胴体数据，例如瘦肉率、屠宰率以及碘值(72次平行测定/处理)。

现在参照表6，来自该研究的初步性能数据表明，饲喂芽孢杆菌组合DFM的猪在试验的最后阶段具有更大的(P≤0.05)平均日增重和增重:饲料。此外，饲喂DFM的猪在试验结束时倾向于(P＝0.15)比饲喂对照饮食的猪重4.4磅以上。对胴体品质、粪肥养分和微生物组成以及来自粪肥存储单元(包括但不限于，粪肥坑)的气体排放的数据分析尚未完成，但预期为，DFM处理会增加瘦肉率和屠宰率，减少脂肪碘值，导致在粪肥中更少的养肥积累，改变粪肥微生物群落至对于固体分解有利的种群，降低氨、甲烷和硫化氢气体的排放。

表6相对于饲喂对照饮食的猪，施用三株芽孢杆菌DFM组合作为饮食补充剂对生长-育成猪的生长性能反应的影响。*

*数据为24栏/处理的平均值

¹MSE＝均方误差

实施例5

显示基于芽孢杆菌的猪粪肥坑添加物处理对于提高猪粪废物存储、管理和处理的效果。

将进行研究以评价基于芽孢杆菌的猪粪肥坑添加物对于固体积累、营养成分和粪肥发泡特性的功效。含有具有独立的粪肥处理和存储单元的至少三个猪棚的多个生产地点将是相同的。在每个地点的粪肥坑都将用两种剂量的芽孢杆菌添加物进行处理，并且剩下一个粪肥坑未进行处理。低剂量的粪肥池处理将以每100,000加仑粪肥500g测试材料添加到每个生产地点上的一个粪肥坑中，所述测试材料被配制成每克试验材料含有4×10¹⁰CFU。高剂量处理以每100,000加仑粪肥500g测试材料添加到不同于低剂量的粪肥坑中，所述测试材料被配制成每克试验材料含有1×10¹¹CFU。在每个地点的第三粪肥坑将不进行处理作为对照。

在开始任何处理前并在3-6个月的时期内定期(大约每个月一次)从每个受试生产地点的每个粪肥坑获得样品。收集来自粪肥坑的数据以评价泡沫发生率，并分析粪肥样品以评价固体积累和养分组成。预期是经过处理的猪粪肥坑比对照粪肥坑具有更低的泡沫发生率、更少的固体积累、更少的氮、硫、磷、纤维结合氮、总蛋白、脂肪和纤维含量。

实施例6

显示生长性能对应于添加到家禽饮食中的芽孢杆菌组合的改进的家禽饲养试验。

将进行家禽饲养试验以评价基于芽孢杆菌的直接饲喂微生物(DFM)的饲料添加剂对于火鸡、肉鸡和蛋鸡的体重增加、采食量、饲料效率以及死亡率的影响。在这些研究中，每平行处理的约22只鸡将被随机分配进行饮食处理。相对于相对对照组的鸡，饮食处理可以由以DFM和结合酶的实验DFM处理施用的芽孢杆菌菌株的几种组合组成。将芽孢杆菌DFM处理以1.5×10⁵CFU/g饲料添加到饮食中，并基于各种生产系统(火鸡、肉鸡、蛋鸡)的平均日饲料摄取量，供给约1×10⁷至5×10⁷CFU/只/天。饮食将由基于玉米-豆粕-DDGS的饮食组成。将调配能量和其他营养水平以满足或超过试验禽类的要求。饮食饲喂约42天的测试时间，并在三个饲养阶段来喂养：起始期(第1-20天)、生长期(第21-38天)和育成期(第38-42天)。将饮食造粒(约75℃)，并将起始期饲料弄碎。

使用适当的统计检验将来自处理组的数据与其相关的对照组数据进行比较。通过方差(ANOVA)分析和最小显著差异测试来分析体重、体增重加、采食量、FCR、FCE和死亡率。

完成后，可以预计该数据将支持DFM处理的效果。具体而言，预计DFM处理会增加瘦肉率和屠宰率，将胃肠道微生物群落转变为对于养分利用有利的群落，以及提高鸡生长的效率并提高鸡蛋重量。

实施例7

芽孢杆菌直接饲喂微生物对于猪生长性能、胴体测量、粪肥坑特征和环境气体排放的影响。

在15周的生长-育成研究中，总共使用444头猪(200头公猪和244头母猪)用来研究使用芽孢杆菌直接饲喂微生物补充物对于生长性能、胴体测量、粪肥坑特征和气体排放的影响。猪圈养在环境控制的猪棚，其包含有12个相同的房间，每间房间12栏。在12间房间的每一个下面包括两个粪肥坑，每个粪肥坑上6栏。在实验开始之前，彻底清洁粪肥坑。然后给粪肥坑装入少量的水(～600加仑)。

将分配给试验的猪断奶，根据体重和性别分区块，并以每栏4-5头猪(每栏2-3公猪和2-3头母猪)随机分配进行饮食处理(对照和枯草芽孢DFM)。在饮食处理开始之前，给猪饲喂调整饮食两周以用粪肥给粪肥坑做种源。然后给猪饲喂对照饮食或带有芽孢杆菌DFM补充物的对照饮食。芽孢杆菌DFM微生物由确保总计达3.0×10⁸cfu/g DFM产品的等比例的枯草芽孢杆菌菌株AGTP BS918(NRRL B-50508)、AGTP BS1013(NRRL B-50509)和AGTP BS3BP5(NRRL B-50510)组成，并以1磅/吨的比例包括在饲料中，导致在饲料中1.5×10⁵cfu/g的浓度。

在整个实验中都维持饮食处理，但每三个星期调整饮食，以更好地满足猪的营养需要，致使5个饮食阶段(3个生长阶段，2个育成阶段)，这五个阶段按配方配制以满足或超过猪在这五个阶段的每一个阶段的每个生产阶段的营养需要(NRC，1998)。在五个阶段，饮食配方是基于玉米和豆粕饲料与不同水平的基于玉米的含有可溶物的干酒糟(DDGS)。具体地讲，分别地，用于生长阶段1、2和3的饮食配制成含有25％的DDGS，育成阶段4的饮食含有20％的DDGS，而第二育成阶段5的饮食含有10％的DDGS。

在每个阶段结束时每三周记录猪体重和栏采食量。在生长和育成阶段的每个阶段的开始和结束时，使用真空芯取样器对粪肥坑进行采样，所述真空芯取样器设计有真空泵，其连接到装配有硬塑料芯取样器端的透明塑料管的两个真空瓶。通过在每个受测试池上每个栏下四个位置采样获得粪肥坑的核心样品。相对于栏的粪肥坑抽样位置包括：(1)栏的中心之下；(2)栏饮水器之下；(3)栏给料器前面的下方；以及(4)与给料器相反的栏远角的下方。进行全氮、铵态氮、干物质(DM)、灰分、钙、磷分析肥料含量(AOAC 2007)。在整个实验过程中，使用连续实时测量设备监测在粪肥坑空气室和墙壁排气风扇前面的气体浓度。将这些数据与通风率结合来确定每个房间每天氨、甲烷和硫化氢气体的排放率。以每磅猪体重增加的气体克数表示这些数据。甲烷和硫化氢的浓度也连续10天测定(第70-80天为甲烷，第80-90天为H₂S)，对于总产气量分析按房间取平均(N＝12)。

对粪肥坑样品分析养分(AOAC 2007)和挥发性脂肪酸(VFA)组成。对于挥发性脂肪酸的高压液相色谱(HPLC)检测，将10mL的每种样品分装到15mL的Falcon管中并在-20℃下储存直至HPLC分析。解冻后，在16.1rad下将样品离心15分钟。将1毫升(1mL)上清液在9mL在水/乙腈(98:2，v/v)中的16.8mM的磷酸中稀释。将稀释的上清液涡旋10秒，然后在16.1rad下离心15分钟。过滤上清液(0.22μm)，然后使用装配了300x 7.8mm Aminex HPX-87H色谱柱(Biorad实验室公司，Hercules，CA)的Waters 2695分离模块(Waters公司，Milford，MA)分析乙酸、丙酸、丁酸、I-丁酸、I-戊酸、戊酸、4-甲基戊酸。在0.85mL/分钟的流速和65℃柱温度下以在水/乙腈(98:2，v/v)中的16.8mM的磷酸组成的移动相溶剂应用等度洗脱法。用2996PDA检测器(Waters)在211nm吸收峰处检测所有分析物。

使用SAS的通用线性模块程序(General Linear Model procedure)分析数据，以测试处理组与平行组的差异。对于生产性能和胴体数据，测试单位是栏，对于排泄和VFA数据，测试单位是粪肥坑，以及对于气体排放数据，测试单位是房间。

结果

在实验开始时猪平均64.5磅和经过15周喂养后称重平均257.1磅。在实验结束时，与对照饲喂的猪相比，饲喂含补充DFM的饮食的猪重4磅(P＝0.10)(表7)。这种反应是由于给猪饲喂DFM的补充剂时比对照猪的生长更快(分别为2.01vs.1.93磅/天，P<.03，表8)。平均日采食量(ADFI)不受饮食处理的影响(表9)。这种处理间的对饲料摄取量的无反应差异，加上以DFM处理的猪的较大的平均日增重，导致与饲喂对照饲料的猪相比在两个育成阶段(第4阶段和第5阶段)以及在当给猪饲喂DFM补充饲料时的整个15周试验中改进的(P<0.08)饲料效率(表10)。

表7饮食芽孢杆菌直接饲喂微生物(DFM)补充对猪的体重的影响。

表8饮食芽孢杆菌直接饲喂微生物(DFM)补充对平均日增重(ADG)的影响。

表9饮食芽孢杆菌直接饲喂微生物(DFM)补充对平均日采食量(ADFI)的影响。

表10饮食芽孢杆菌直接饲喂微生物(DFM)补充对饲料效率(消耗每磅饲料增加的体重磅值)的影响。

饲喂DFM补充饲料的猪比对照饲喂猪的热胴体重4.5磅(P<0.01)(表11)。此外，当猪补充DFM时，胴体等级溢价趋向于较高(P＝0.15)。所观察到的由DFM补充导致的胴体重量的增加导致，与对照胴体相比多0.39美元的胴体价值。

表11饮食芽孢杆菌直接饲喂微生物(DFM)补充对胴体品质的影响。

由在整个试验期间获得的样品测定的粪肥养分值见表12。与对照猪相比，与饲喂芽孢杆菌DFM的猪相关的粪肥坑中的干物质(P＝0.20)、灰分(P＝0.11)和铵氮(P＝0.15)趋向于减小。相对于对照，芽孢杆菌DFM补充减少来自处理猪的粪肥中的干物质7％、灰分8％、铵氮5％。所观察到的干物质和灰分排泄的减少可归因于饲料效率的改进。

表12饮食芽孢杆菌直接饲喂微生物(DFM)补充对整个试验中粪肥坑中养分积累(g/体重增加的磅数)的影响。

在处理之间的粪肥中总氮排泄无差异表明，所观察到的来自DFM处理的铵态氮的减少是与对照相比与DFM处理相关的微生物生态学和粪肥坑活性改变的结果。当给猪饲喂DFM补充饲料时，当表示为每磅猪体重的克数时，甲烷气体排放趋于减小(P＝0.16；减少17％)(表13)。表示为每磅猪体重的克数的硫化氢气体排放，与对照相比并没有显著性差异，但当给猪饲喂DFM补充饮食时下降10％。对于DFM饲喂猪，所有时间点的氨排放都是数值较低。在圈养DFM补充猪的房间内，与对照相比，甲烷和硫化氢气体排放(克/天)分别降低(P＝0.08)14％和19％(表14)。

表13饮食芽孢杆菌直接饲喂微生物(DFM)补充对环境气体排放(g/体重增加的磅数)的影响。

表14饮食芽孢杆菌直接饲喂微生物(DFM)补充对平均甲烷(CH₄)和硫化氢(H₂S)气体排放的影响。¹

¹g/天的数据；SEM＝平均数标准误差

与对照猪的粪肥相比，来自饲喂芽孢杆菌DFM补充饮食的猪的粪肥中总挥发性脂肪酸(VFA)降低(P＝0.01)(表15)。具体地讲，这种降低是粪肥中厌氧微生物发酵期间1-丁酸(P＝0.04)、4-甲基-戊酸(P＝0.05)、和丙酸(p＝0.12)的产生减少的结果。相反，DFM补充导致丁酸产生增加(P＝0.06)。

表15饮食DFM补充对于粪肥挥发性脂肪酸(VFA)组成的影响。¹

¹以ppm干物质由体重增加加权的数据

来自该实验的数据表明，在生长和育成生产期间用该芽孢杆菌DFM补充饲喂猪饮食导致生长速度、饲料效率和最终热胴体重的提高。用DFM补充可以减少粪肥坑中的干物质、灰分和铵态氮。此外，当将芽孢杆菌DFM补充到猪饮食时，从存储的猪粪中排放的甲烷和硫化氢明显减少。

实施例8

芽孢杆菌直接饲喂微生物对存储的猪粪中的微生物生态的影响。

从实施例7中描述的15周的生长-育成研究中获得粪肥坑样品。如前实施例7所述，在试验结束时从每个房间的两个单独粪肥坑的每个中收集粪肥样品用于微生物分析，并分别分析形成共24种观测结果。通过定量聚合酶链反应(qPCR)分析(Metzler-Zebeli等人，2010，Yu等人，2005)列举目标产甲烷古菌(Spence等人，2008)和细菌组。通过SAS的ProcMixed程序(v.9.1.3，SAS Institute公司，Cary，NC)采用单因素方差分析对数据进行分析，显着性水平α＝0.10。趋势表示为0.20≥P>0.10。

猪饮食中添加芽孢杆菌DFM导致储存的猪粪肥中的微生物种群的变化。与来自对照猪的粪肥相比，存储的由饲喂DFM的猪产生的粪肥中蛋白水解梭状芽孢杆菌群I组细菌降低(P<0.01)(表16)。给猪饲喂芽孢杆菌DFM导致与丁酸产生有关的纤溶梭状芽孢杆菌群XIVa增加(P＝0.09)。这种梭状芽孢杆菌群XIVa的增加支持了所观察到的与DFM处理相关联的丁酸产生的增加，如实施例7表15中所列。产生各种各样的VFA的杆菌和普雷沃种，在来自补充了DFM的猪肥料显著降低(P＝0.08)。与来自对照猪的粪肥相比，在来自饲喂芽孢杆菌DFM的猪的存储粪便中产甲烷菌趋于降低(P＝0.13)，并且硫酸盐还原菌数值减少。所观察到的这些古细菌和硫酸盐还原菌的减少支持了实施例7中记载于表13和表14中所观察到的带有DFM补充的甲烷和硫化氢气体生产的降低。

表16。饮食芽孢杆菌直接饲喂微生物(DFM)补充对存储的猪粪肥中微生物种群的影响。¹

¹以相对于总芽孢杆菌的Δct和以粪肥干物质(DM)调整，并以体重增加加权的数据；SEM＝平均数标准误差。

实施例9

给饲养在商业断奶到育成设施并饲喂配制有高水平的副产物和有限的能量水平的饮食的猪补充芽孢杆菌直接饲喂微生物(DFM)的效果。

进行断奶到育成研究以确定饲喂带有增加了副产物量的商业玉米-大豆型饮食的猪的生长性能。将总共1024头猪在约3周龄时断奶，按性别和体重级别分隔开，并分配在32个试验栏中和分阶段饲养105天。在起始的三个保育阶段中每两个星期对猪进行称重。起始阶段的饮食含有高达20％的含可溶物的玉米干酒糟(cDDGS)。猪继续分两个生长阶段和一个育成阶段，每个阶段持续21天。所述两个生长期和育成期饮食在饮食中含有35％cDDGS和15％替代饮食中的玉米的麦麸(表17)。

表17饲喂阶段和饮食组成。¹

¹SBM，豆粕；CP，粗蛋白；cDDGS，～10％含油量的含有可溶物的玉米干酒糟；处理包括玉米的损耗。

配制饮食以模拟含有过量的粗蛋白但有限的能量的标准商业饮食。除试验的前6周外，不喂养抗生素生长促进剂。与不含DFM的对照饮食相比，处理包括直接饲喂微生物(DFM)补充。直接饲喂微生物包括保证总计至3.0×10⁸cfu/g DFM产品的比例相等的枯草芽孢杆菌菌株AGTP BS918(NRRL B-50508)、AGTP BS1013(NRRL B-50509)和AGTP BS3BP5(NRRL B-50510)，以1磅/吨的速率包括在饲料中，导致在饮食中1.5×10⁵cfu/g的浓度。生长性能及损耗均采用SAS的Proc Mixed程序(v.9.1.3，SAS Institute公司，Cary，NC)进行分析，显着性水平α＝0.10。趋势表示为0.15≥P>0.10。以性别和体重类别划分数据并以初始重量平衡。

与对照猪相比，试验的第0到14天和第14到28天，饲喂DFM的猪的平均日增重更大(P<0.05)(表18)，这导致了在本研究的第14和28天DFM补充的猪的体重更大(P<0.05)(表19)。这种由DFM补充猪显示出的体重增重的增加是在第0到14天和第14到28天期间更大的(P<0.10)平均日饲料摄入量的结果(表20)。在试验的前两个星期期间内，饲料效率也得到了改进(P＝0.03)(表20b)。

表18在研究持续期间的平均日增重(adg)。

¹SEM＝平均数标准误差

表19在研究持续期间猪的体重(磅)和健康损失百分比(死亡和剔除)。

¹SEM＝平均数标准误差

表20在研究持续期间的平均日饲料摄入量(adfi)。

¹SEM＝平均数标准误差

表20b在研究持续期间的饲料转化率(饲料:增重，fg)。

¹SEM＝平均数标准误差

直接饲喂微生物补充导致在早期生长阶段(试验的第42到63天)期间更大的(P<0.10)ADG和ADFI。在试验的育成期期间，当给猪饲喂补充有DFM的饮食时，与对照猪相比，从第84到105天ADG更大(P＝0.02)，从整个第0到105天的期间内趋向更大(P＝0.14)。从第84到105天以DFM处理的ADG反应的提高和ADFI反应的缺乏，导致在此期间的饲料转化率提高(P<0.01)。与对照猪相比，在整个试验中由DFM补充导致的ADG的提高导致在研究结束时(第105天)约3磅更重的猪(表19)。此外，由于因流感，猪链球菌感染等引起的死亡和剔除导致的健康损失降低(P＝0.07，表19)。

实施例10

给饲养在商业断奶到育成设施并饲喂配制有高水平副产物和有限能量水平的饮食的猪补充芽孢杆菌直接饲喂微生物(DFM)对饲料转化效率的效果。

评价芽孢杆菌直接饲喂微生物对饲养在断奶到育成设施中的猪的饲料利用效率的效果。总共2160头猪在约3周龄时断奶，按性别分隔，平衡初始重量，并在试验的同一个地点内的两个房间的68栏中分配。将动物分阶段饲养105天。断奶后，在起始的保育阶段每两个星期对猪进行称重，一直持续到第42天。初始阶段的饮食含有高达20％的含有可溶物的玉米干酒糟(cDDGS)。猪继续进行试验经两个生长阶段和一个育成阶段，每个阶段持续21天。所述生长和育成阶段饮食含有35％cDDGS和15％代替饮食中的玉米的麦麸(表21)。配制饮食以模拟具有有限粗蛋白和能量的标准商业饮食。

表21饲养阶段和饮食组成。¹

¹SBM，豆粕；CP，粗蛋白；cDDGS，带有～10％油的含有可溶物的玉米干酒糟；处理包括玉米的损耗。

除试验前6周外，不饲喂抗生素生长促进剂。与不含DFM的对照饮食相比，处理包括直接饲喂微生物(DFM)补充。直接饲喂微生物包括保证总计至3.0×10⁸cfu/g DFM产品的比例相等的枯草芽孢杆菌菌株AGTP BS918(NRRL B-50508)、AGTP BS1013(NRRL B-50509)和AGTP BS3BP5(NRRL B-50510)，以1磅/吨的比例包括在饲料中，导致在饮食中1.5×10⁵cfu/g的浓度。生长性能及损耗均采用SAS的Proc Mixed程序(v.9.1.3，SAS Institute公司，Cary，NC)进行分析，显着性水平α＝0.10。趋势表示为0.15≥P>0.10。以房间和性别划分数据用于分析。

当给猪饲喂含芽孢杆菌DFM补充的饮食时，从试验的第0到14天每磅体重增加需要的饲料更少(P＝0.02)，并且在从本研究的第0到42天的整个保育阶段中，这一饲料效率反应趋于(P＝0.13)明显(表22)。直接饲喂微生物补充也改进了(P＝0.08)育成阶段(第84到第105天)的饲料效率。

表22在研究持续期间的饲料转化率(饲料:增重，fg)。

¹SEM＝平均数标准误差

实施例11

补充芽孢杆菌直接饲喂微生物(DFM)对饲喂配制有高水平纤维副产物的饮食的保育猪的饲料效率反应的影响。

总共480头猪(初始体重：约6.0kg)在21日龄时断奶并在环境控制保育猪设施中以10头猪/栏关入栏中。从21日龄至63日龄对猪进行测试，并用饮食饲喂两个阶段的饲养程序，所述饮食以基于玉米、豆粕、40％玉米DDGS(表23)配制并满足所述两个生产阶段中的每一个阶段(表24)的猪的营养需求。

表23第1阶段和第2阶段保育猪饮食的基本饮食组成。

表24经计算的基础饮食的组成，％

所有的饮食都含有植酸酶(500FTU/kg饲料)。其中，将三种饮食处理中的一种随机分配到栏，使得每个处理由八个平行栏表示。与没有DFM补充的对照饮食相比，处理由以两个水平的添加(0.5和1.0磅/每吨饲料)的直接饲喂微生物(DFM)补充(表25)组成。

直接饲喂微生物由保证总计至3.0×10⁸cfu/g DFM产品的比例相等的枯草芽孢杆菌菌株AGTP BS918(NRRL B-50508)、AGTP BS1013(NRRL B-50509)和AGTP BS3BP5(NRRL B-50510)组成，分别以0.5或1.0磅/吨饲料包括，导致在饮食中7.5×10⁴cfu/g或1.5×10⁵cfu/g的浓度。分别于试验第21日和第42日测量猪体重增加和栏采食量来以增重:饲料计算饲料效率。饲料效率也可以以饲料:增重来计算。

表25饮食处理和DFM添加比例

¹饮食被加工成糊状未造粒的饲料。

²所有饮食都包含500FTU/kg饲料的植酸酶。

在早期保育阶段期间(第0到21天，断奶后；表26)，与饲喂对照饮食的猪相比，饲喂芽孢杆菌DFM处理饮食的猪每单位饲料摄取量的体重增加更大(P＝0.03)。

表26在饮食中以两个添加水平饲喂高纤维为基础的添加芽孢杆菌DFM的饮食的保育猪的体重和饲料效率。

*每栏的猪数＝10

实施例12

芽孢杆菌直接饲喂微生物对于在饲喂含40％玉米DDGS饮食的生长期猪的能量和养分消化率的影响。

对生长期猪进行消化率研究来测量芽孢杆菌直接饲喂微生物(DFM)对在含40％包含可溶物的玉米干酒糟(DDGS)的饮食中的能量和养分的回肠和总肠道消化率的影响。来源于G-Performer公猪与F-25母猪的配种(Genetiporc，Alexandria，MN)的二十四头猪(初始体重：约25kg)进行外科手术，在回肠末端装配T型套管。手术之后，允许猪休养21天。在此期间无限制地提供标准的玉米-豆粕基础饮食。术后3周，将猪分成由对照基础饮食和芽孢杆菌DFM组成的两种饮食处理。将猪圈养在环境控制的房间中的单独的栏(1.2×1.5m)中。每个栏装配进食器和乳头饮水器，并且已全部装混凝土地板。

试验基础饮食基于玉米、豆粕、40％玉米DDGS而配制(表27)。饮食处理为：(1)没有DFM的基础饮食；或(2)减少玉米淀粉的情况下加入0.05％DFM的基础饮食。直接喂养微生物由保证总计至3.0×10⁸cfu/g DFM产品的比例相等的枯草芽孢杆菌菌株AGTP BS918(NRRLB-50508)、AGTP BS1013(NRRL B-50509)和AGTP BS3BP5(NRRL B-50510)组成，以1磅/吨饲料的比例包括，导致在饮食中1.5×10⁵cfu/g的浓度。所有的饮食都被配制以满足或超过生长猪的营养需求(NRC，1998)。

表27试验基础饮食的组成¹

¹在减少玉米淀粉的情况下以饮食的0.05％添加直接饲喂微生物

³维生素-微量元素预混合物每千克完全饮食提供以下量的维生素和矿物质：维生素A，10,990IU；维生素D3，1,648IU；维生素E，55IU；维生素K，4.4mg；硫胺素，3.3mg；核黄素，9.9mg；吡哆醇，3.3mg；维生素B12，0.044mg；D-泛酸，33mg；烟酸，55mg；叶酸，1.1mg；生物素，0.17mg；Cu，16mg以硫酸铜计；Fe，165mg以硫酸铁计；I，0.36mg以碘酸钾计；Mn，44mg以硫酸锰计；Se，0.3mg以亚硒酸钠计；Zn，165mg以氧化锌计。

二氧化钛在所有饮食中都用作不可消化的标记物。给12头猪饲喂饮食，每份饮食提供6头猪17天。在整个试验中允许猪随意摄取饮食和水。为了最大限度地减少对照栏与DFM的交叉污染，饲喂无DFM的饮食的栏首先被饲喂，接着为DFM处理栏。饲喂每个处理之后，彻底清理饲料输送车。在猪饲喂含DFM的饮食之前，还首先对饲喂无DFM的饮食的猪称重并收集。

在第12天通过抓取采样收集排泄物样品，在第13天和第14天采集回肠样品。每个采集日从0800开始连续9小时采集回肠样品。打开套管，采用扎带将225-mL塑料袋连接到套管桶，这让食糜从套管流向袋中。每当充满食糜或至少每30分钟更换一次袋。测定每个采集日的0900、1100、1300和1500之后收集的的第一包中的食糜的pH值。最后一次回肠采集之后，再给猪饲喂它们各自的试验饮食3天。在最后一次回肠采集之后的那天饲喂的早餐(0700)含有绿色标记。在接下来的36小时期间，对所有猪每30分钟记录回肠食糜和粪肥排泄物，记录所述标记第一次出现在这些地方的任一处的时间并用于测量这种特定饮食的通过速率。

在实验结束时，将样品解冻并混合于动物和饮食中，收集子样品进行化学分析。分析之前将所有样品冷冻干燥并磨碎。也对于干物质(DM)、酸性洗涤纤维(ADF)、中性洗涤纤维(NDF)和木质素分析所有样品。如前所述(Stein等人，2007)计算营养物的表观回肠(AID)和总肠道(ATTD)消化率的值。证实了方差齐性并采用UNIVARIATE程序(SAS Institute公司，Cary,NC)测试异常值。未检测到异常值。使用MIXED程序分析数据。该模型包括作为固定效应的饮食处理，而猪是随机效应。计算每个自变量的最小二乘均值。对所有的计算来说，猪是试验单元，并且用于确定均值之间的显著性和趋势的α水平分别为0.05和≤0.10。

与对照猪的回肠pH值相比，在饲喂含有芽孢杆菌DFM的饮食的猪中，回肠pH值降低(P＝0.03)(表28)。通过速率和排泄物pH值并没有受到饮食处理的影响。尽管ADF和NDF并没有受到影响，在饮食中添加芽孢杆菌DFM导致与对照饮食相比木质素的AID(表29)和ATTD(表30)提高(P<0.03)。

这些数据表明，芽孢杆菌DFM降低了回肠食糜的pH，提高了基于高纤维副产品的饮食中木质素的消化率。

表28芽孢杆菌DFM对饲喂含40％DDGS的玉米-豆粕饮食的生长猪的回肠食糜及排泄物的pH和通过速率的影响¹

表29芽孢杆菌DFM对饲喂含40％DDGS的玉米-豆粕饮食的生长猪的纤维养分的表观回肠消化率(AID，％)的影响¹

¹数据为对于所有处理的6个观测的最小二乘均值。

表30芽孢杆菌DFM对饲喂含40％DDGS的玉米-豆粕饮食的生长猪的纤维养分的表表观总肠道消化率(ATTD，％)的影响¹

¹数据为对于所有处理的6个观测的最小二乘均值。

实施例13

芽孢杆菌菌株在鸡HD11巨噬细胞系中的抗炎作用。

鸡的巨噬细胞系HD11用于确定对LPS的炎症应答，并确定直接饲喂微生物芽孢杆菌菌株减轻与革兰氏阴性细菌感染相关的炎症的潜力。在细胞培养试验中筛选芽孢杆菌菌株以确定在炎性细胞因子基因表达应答中对LPS和芽孢杆菌菌株(枯草芽孢杆菌AGTPBS1013(NRRL B-50509)、枯草芽孢杆菌AGTP BS3BP5(NRRL B-50510)和枯草芽孢杆菌AGTP944(NRRL B-50548)中的每一种芽孢杆菌的变化。

在下列条件之一下孵育HD11细胞：(1)单独(未刺激)，(2)和LPS一起；(3)和每种芽孢杆菌菌株一起，以及(4)和LPS+芽孢杆菌菌株一起。该板的模板设计示于图22。

HD11细胞生长至融合，并置于24孔组织培养板中，所述培养板带有含10％胎牛血清(FBS；Atlanta生物制品有限公司,Lawrenceville,GA)的无抗生素Roswell ParkMemorial Institute 1640(RPMI)培养基。一旦融合，除去培养基，在无抗生素培养基中施加处理，随后在41℃下孵育1小时。孵育后，将细胞用PBS洗涤两次，并在380μL的TRIzol(Invitrogen生命技术公司，Carlsbad,CA)中孵育5分钟。从平板上取下样品，置于2mL微量离心管中快速冷冻，并于-80℃下保存，直到RNA分离。为了从有机相中分离RNA，使用2ml重锁相凝胶管(heavy phase lock gel tubes)(Five Prime公司，Gaithersburg,MD)。使用RNeasy迷你试剂盒(mini kit)(Qiagen公司，Valencia,CA)进行RNA的清理，并使用无RNA酶的DNA酶试剂盒(Qiagen)消化DNA酶。紧随RNA分离之后，使用qScript cDNA SuperMix(VWR，Radnor，PA)合成cDNA。

使用表31中显示的引物组使用实时PCR来测定HD11细胞的基因表达。β-肌动蛋白用作参考基因。使用SAS(v.9.1.3，SAS Institute公司，Cary，NC)的Proc Mixed程序进行单因素方差分析(ANOVA)。均值通过Student-Newman-Keuls检验分离，显着性水平α＝0.10。

表31在筛选实验中使用的鸡特异性引物组

相对于未刺激的HD11细胞，在HD11鸡巨噬细胞系中的脂多糖激发导致炎性细胞因子、白细胞介素(IL)-1β和IL-8的基因表达增加(P<0.01)(图23)。当菌株AGTP BS1013以芽孢形态添加到带有LPS的HD11脂多糖细胞时，该芽孢杆菌菌株降低了(P<0.01)由单独施用LPS导致的炎性细胞因子、IL-1β和IL-8基因的表达，并且更类似于未刺激的HD11细胞的基因表达谱。另外，在营养芽孢杆菌菌株BS1013的存在下，对LPS的鸡细胞应答数值较低，和在芽孢形态下的芽孢杆菌菌株AGTP BS3BP5以及芽孢杆菌菌株AGTP 944的营养细胞和芽孢一样。

这些数据说明了芽孢杆菌DFM菌株用于减轻与细菌感染相关的炎症的功效，以及它们在禽类物种中的有效性。芽孢杆菌DFM菌株可用于减轻巨噬细胞炎症。此外，芽孢杆菌DFM菌株可用于减轻革兰氏阴性细菌感染，以及这些细菌感染的影响。

实施例14

芽孢杆菌菌株在大鼠肠上皮细胞系(IEC-6)中的抗炎作用

使用大鼠肠上皮细胞系IEC-6来测定对LPS的炎症应答，并测定直接饲喂微生物芽孢杆菌菌株减轻与革兰氏阴性细菌感染相关的炎症的潜力。在细胞培养试验中筛选芽孢杆菌菌株以测定在炎性细胞因子基因表达应答中对LPS和每一种芽孢杆菌菌株(枯草芽孢杆菌AGTP BS1013(NRRL B-50509)、枯草芽孢杆菌AGTP BS3BP5(NRRL B-50510)、和枯草芽孢杆菌AGTP 944(NRRL B-50548)、枯草芽孢杆菌AGTP BS1069(NRRL B-50544)、枯草芽孢杆菌AGTP BS 442(NRRL B-50542)、枯草芽孢杆菌AGTP BS521(NRRL B-50545)、和枯草芽孢杆菌AGTP BS918(NRRL B-50508))的变化。可以使用的其他芽孢杆菌菌株，包括但不限于，短小芽孢杆菌AGTP BS 1068(NRRL B-50543)和短小芽孢杆菌KX11-1(NRRL B-50546)。

在下列条件之一下孵育IEC-6细胞：(1)单独(未刺激)，(2)和LPS一起；(3)和每种DFM芽孢杆菌菌株一起，以及(4)和LPS+芽孢杆菌菌株一起。该板的模板设计示于图24。

IEC-6细胞生长至融合，并置于24孔组织培养板中，所述培养板带有含10％FBS(Atlanta生物制品有限公司,Lawrenceville,GA)和1％抗生素-抗真菌剂(AtlantaBiologicals)的Dulbecco的改良Eagle培养基(Dulbecco’sModified Eagle’s Medium)(DMEM)(Invitrogen,Life Technologies公司，Carlsbad，CA)的。一旦板融合，就用磷酸盐缓冲盐水(PBS)将IEC-6细胞洗涤3次。在无抗生素培养基中施用处理，随后在37℃下孵育1小时。孵育后，用PBS将细胞洗涤两次，并在380μL的TRIzol(Invitrogen生命技术公司，Carlsbad,CA)中孵育5分钟。

从平板上取下样品，置于2mL微量离心管中，快速冷冻，并于-80℃下保存，直到RNA分离。为从有机相中分离RNA，使用2ml的重锁相凝胶管(Five Prime公司，Gaithersburg,MD)。使用RNeasy迷你试剂盒(Qiagen公司，Valencia,CA)进行RNA的清理，并用无RNA酶的DNA酶试剂盒(Qiagen)消化DNA酶。紧随RNA分离之后，使用qScript cDNA SuperMix(VWR，Radnor，PA)合成cDNA。

使用表32中显示的引物组采用实时PCR来确定IEC-6细胞的基因表达。β-肌动蛋白用作参考基因。使用SAS(v.9.1.3，SAS Institute公司，Cary，NC)的Proc Mixed程序进行单因素方差分析(ANOVA)。均值通过Student-Newman-Keuls检验分离，显着性水平α＝0.10。

表32在筛选实验中使用的大鼠特异性引物。

相对于未刺激的IEC-6细胞，在IEC-6大鼠肠上皮细胞系中的脂多糖激发导致炎性细胞因子、TNF-α的基因表达的增加(P<0.01)(图25)。当在芽孢或营养体形态时，芽孢杆菌菌株BS1013和BS1069降低了(P<0.10)由单独使用LPS产生的TNF-α基因的表达。芽孢杆菌菌株BS3BP5、BS442、BS521也降低了(P<0.10)由单独施用LPS产生的TNF-α基因的表达，但是仅当处于芽孢形态时。相反，芽孢杆菌菌株BS918降低了(P<0.10)由单独施用LPS产生的TNF-α基因的表达，但是仅当处于营养体形态时。

这些数据说明了芽孢杆菌菌株DFM用于减轻与细菌感染相关的炎症的功效，以及它们在哺乳动物物种中的有效性。芽孢杆菌DFM菌株可用于减轻巨噬细胞炎症。此外，芽孢杆菌DFM菌株可用于减轻革兰氏阴性细菌感染，以及这些细菌感染的影响。

实施例15

芽孢杆菌DFM在商业深坑猪粪肥存储系统中减少泡沫形成的功效。

猪粪肥深坑系统在美国中西部是常见的并具有发泡的高可能性。这被认为是在猪饲料稳定增加纤维副产物的添加以及由此产生的在储存粪肥中的微生物生态和发酵特性的改变的结果。评价三菌株芽孢杆菌菌株DFM的效用以确定其在猪粪肥坑的施用是否在能积极改变粪肥坑微生物发酵图谱，并为坑泡沫控制提供工具。选择五个生产地点用于评价，每个生产地点在单独的深坑系统上有三个相同的生长-育成猪棚(每个1400头)。基于饮食中高添加水平的含可溶物的干酒糟(DDGS)和其他纤维性副产品成分以及过去历史上的起泡发生率，所有地点传统上对于产生泡沫都处于高风险。

对于每个地点的3个坑中的每一个，试验开始前，使用用于捕获样品的装有球阀的1’PVC管建立基线抽样。对于每个采样，测定液体深度和泡沫深度，并且由于21天采样后坑的体积极大地变化，在整个研究期间计算液体:泡沫的比例以调节使其适应变化的坑容积。对于实施例9和10，该测试的产品包括同等比例的菌株AGTP BS918(NRRL B-50508)、AGTPBS1013(NRRL B-50509)和AGTP BS3BP5(NRRL B-50510)。可以使用其它芽孢杆菌菌株，包括，但不限于，枯草芽孢杆菌AGTP BS442、枯草芽孢杆菌AGTP BS521、枯草芽孢杆菌AGTPBS1069、枯草芽孢杆菌AGTP 944、短小芽孢杆菌AGTP BS 1068和短小芽孢杆菌KX11-1。

将两种芽孢杆菌产品添加比例直接施加到粪肥坑，并与未经处理的对照坑相比进行测试。以5.3×10⁴cfu/mL粪肥的比例施加芽孢杆菌坑接种菌，相当于如果以1.5×10⁵cfu/g饲料饲喂动物的接种率，并且以1.3×10⁶cfu/mL粪肥的比例给粪肥坑施加2.5倍增加剂量(2.5X)。在170天的完全试验期间，每60天再施加芽孢杆菌产品。通过SAS(v.9.1.3，SASInstitute公司，Cary，NC)的Proc Mixed程序使用单因素ANOVA对数据进行分析，通式重复测量仪检测随时间的变化。显着性水平α＝0.10，使用最小二乘差异(LSD)检验分离均值。

在确认用于测试的地点处的所述坑之间的泡沫深度、液体深度或泡沫:液体比例没有差异(表33)。然而，处理施加之后三个星期，与未处理的坑相比，以芽孢杆菌坑接种菌以任一施加比例处理的坑内的泡沫深度降低(P＝0.03)。芽孢杆菌坑接种菌施加三周后，在三个处理之间的液体深度没有差异，当芽孢杆菌坑接种菌以任一施加比例施加，与未处理的坑相比，导致泡沫:液体的比例降低(P＝0.01)。当将在170天试验的进程中在所有3个采样点之上的数值平均时，与对照坑相比，芽孢杆菌接种菌以任一施加比例施加时，泡沫:液体的比例也都降低(P<0.10)(表34)。数据表明，整个研究的过程中，芽孢杆菌接种菌的添加比例越高，导致泡沫的减少更一致(图26)。

这些数据表明，直接施加到深坑猪粪肥储存设施的三种芽孢杆菌菌株接种菌的使用控制了泡沫的积累。

表33基线与在5个地点平均的21天采样之间的泡沫特征的比较。

^ab带有不同上标的平均数是有显著性差异的(P≤0.10)，使用分离平均值

平均数标准误差。

表34在170天试验期间3个抽样平均的泡沫特征的比较。

^ab带有不同上标的平均数是有显著性差异的(P≤0.10)，使用分离平均值

平均数标准误差。

WHD/8848877.1

实施例16

在商业生长-育成地点对粪肥坑直接施加芽孢杆菌产品改变粪肥的特征。

为了比较以同等比例的含有菌株AGTP BS918(NRRL B-50508)、AGTP BS1013(NRRLB-50509)和AGTP BS3BP5(NRRL B-50510)的三菌株芽孢杆菌坑产品对于当前商业猪粪肥废物处理产品(

DSM)的功效，将三菌株芽孢杆菌产品直接施加到在美国中西部三个商业生产地点的正在饲喂

的粪肥坑。可以使用其它芽孢杆菌菌株，包括，但不限于，枯草芽孢杆菌AGTP BS442、枯草芽孢杆菌AGTP BS521、枯草芽孢杆菌AGTP BS1069、枯草芽孢杆菌AGTP 944、短小芽孢杆菌AGTP BS1068和短小芽孢杆菌KX11-1。

在三个生产地点测试芽孢杆菌产品进行一个60天的时期，以确定其是否能够在猪饲料中施用

的效果之上改进粪肥管理特征。每个地点由带有单独粪肥坑并具有可容纳2250头上市屠宰猪的容量的两个完全相同的房间组成。每个地点，一个猪棚作为未处理对照，而其他的猪棚接受芽孢杆菌坑处理。对于处理坑，芽孢杆菌产品添加比例基于粪肥体积，施用比例为5.3×10⁴cfu/mL肥料。受测试的猪粪肥坑的初始体积估计为120,000加仑的粪肥，因此将总共2.4×10¹³cfu的芽孢杆菌产品直接施加到该坑中。

在芽孢杆菌产品施加前和施加后60天，对对照和处理坑进行采样。在整个坑深度上的采样是使用用于捕获样品的装有球阀的1’PVC管来完成的。改善粪肥特性的测试指示确定为经过60天处理后减小的％固体。使用SPSS统计软件(v.17.0，IBM公司，Armonk，NY)进行具有精确的统计和显着性水平α＝0.10的单尾Jonckheere-Terpstra非参数检验，以分析在处理施用前后的％固体之间的差异，检验均值差异。

在任一测试地点之间的平均粪肥固体无差异，其中，在所有测试中都包括Microsource

作为标准操作程序(表35)。然而，当将三菌株芽孢杆菌接种菌加入到粪肥坑中时，监测的3个地点中固体减少了24.3％(P＝0.10)。这些数据表明了三菌株芽孢杆菌接种菌的施用在Microsource

市售产品之外改进了粪肥管理特性，如固体百分比的减少所指示的。

表35与在相同生产地点的对照粪肥坑相比，给处理粪肥坑施加芽孢杆菌坑产品60天后的固体减少。

¹SEM，平均数标准误差

实施例17

三菌株芽孢杆菌直接饲喂微生物和Microsource

对生长猪的生长性能的效果的比较。

进行研究以比较新型三菌株芽孢杆菌DFM和Microsource

(DSM)对改进生长猪的生长性能的功效。对总共144头猪(初始体重：约23kg)进行测试，在环境控制的生长猪设施中以四头猪/栏关在36栏中。三个饮食处理中的一个被分配到各栏(12平行/处理)，并喂食6周研究时间。处理包括对照基础饮食、三菌株芽孢杆菌直接饲喂微生物(DFM)和Microsource

(DSM)，Microsource

为基于芽孢杆菌的市售猪废物处理DFM。

配制基础饮食以包括50％副产品(35％DDGS和15％麦麸；表36)。植酸酶(500FTU/kg)加入到所有的饮食中。新型芽孢杆菌DFM由确保总计至3.0×10⁸cfu/gDFM产品的比例相等的枯草芽孢杆菌菌株AGTP BS918(NRRL B-50508)、AGTP BS1013(NRRL B-50509)和AGTPBS3BP5(NRRL B-50510)，以0.25磅/吨饲料的比例包括，导致在饮食中以3.75×10⁴cfu/g的浓度。可以使用其它芽孢杆菌菌株，包括，但不限于，枯草芽孢杆菌AGTP BS442、枯草芽孢杆菌AGTP BS521、枯草芽孢杆菌AGTP BS1069、枯草芽孢杆菌AGTP 944、短小芽孢杆菌AGTP BS1068和短小芽孢杆菌KX11-1。

表36基础饮食组成

Microsource

以1磅/吨饲料包含在饮食中，导致在饮食中为7.5×10⁴cfu/g。在测试的第21天和第42天测定猪的体重增加和栏采食量，计算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和增重:饲料(G:F)。

饲喂添加了新型芽孢杆菌DFM的饮食的猪，比饲喂对照饮食或市售DFMMicrosource

的猪，从试验的0到21天具有更大的平均日增重(表37)。这种日增重的增加趋向于导致饲喂新型芽孢杆菌DFM的猪的体重在研究的21天与其他两种处理相比更大(P<0.10)。这些数据表明，与现有的市售基于芽孢杆菌的DFM(Microsource

)相比，新型芽孢杆菌DFM提高了生长猪的体重增加。

表37与Microsource

相比，饲喂新型芽孢杆菌DFM的猪的生长性能。

^ab没有共同上标的平均值是有差异的，P<0.05。

^cd没有共同上标的平均值是有差异的，P<0.10。

实施例18

新型芽孢杆菌菌株酶活性的鉴定。

进行体外测定以测试新型芽孢杆菌菌株对于饲料原料中常见的用于配制猪和家禽饮食的纤维饲料底物的酶活性。通过将2微升液体培养物的平行点板到100×100×15mm栅格板中的15.0ml的各种目标底物培养基类型上进行这些试验菌株的高通量筛选。用各个菌株基于特定底物利用测定纤维素酶、木聚糖酶、β-甘露聚糖酶活性。

用于分析环境衍生菌株的底物利用的酶活性的培养基成分示于表38。培养物施加后将测定板放置干燥30分钟，然后在32℃下孵育24小时。通过以毫米为单位测量底物降解的区域以测定每种菌株的酶活性，由菌落生长的周围边缘的透明所指示。记录来自平行平板的平均值。

表38用于分析通过环境衍生芽孢杆菌的底物利用性说明的酶活性的培养基成分

几种枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌菌株的纤维分解降解酶活性列于表39中。所有菌株都对所评价的三种纤维底物中的至少两种显示出降解活性。这些数据表明，这些新型芽孢杆菌菌株具有对纤维素、木聚糖和β-甘露聚糖的酶降解能力。

表39芽孢杆菌菌株的纤维素酶、木聚糖酶和β-甘露聚糖酶活性。

分离菌株名称	CMCase(纤维素酶)	木聚糖酶	β-甘露聚糖酶
				BS3BP5	3.3	3.0	N/A
BS442	1.8	2.5	2.0
				BS521	6.0	4.0	2.0
BS918	4.0	5.5	3.3
				BS1013	6.5	4.0	2.5
BP1068	3.0	6.0	4.5
				BS1069	4.0	4.0	2.5
944	6.5	3.5	1.0
				KXII-1	2.5	5.0	N/A

实施例19

在饲料中补充芽孢杆菌直接饲喂微生物(DFM)对于在市售生长-育成设施中洗涤后残留细菌负荷的影响。

进行生长-育成研究以测定饲喂含有增加量的副产物的市售的基于玉米-大豆的饮食的猪的生长性能。将总共1040头猪在约3周龄时断奶，并使用标准的市售育雏饮食断奶。将动物按性别分隔开，在试验的40栏中分布并分阶段饲喂。从第42天起，将保证总计至3.0×10⁸cfu/gDFM产品的由比例相等的枯草芽孢杆菌菌株AGTP BS918(NRRL B-50508)、AGTP BS1013(NRRL B-50509)和AGTP BS3BP5(NRRL B-50510)组成的直接饲喂微生物以1磅/吨饲料的比例包括，导致在饮食中1.5×10⁵cfu/g的浓度(表40)。可以使用其它芽孢杆菌菌株，包括，但不限于，枯草芽孢杆菌AGTP BS442、枯草芽孢杆菌AGTP BS521、枯草芽孢杆菌AGTP BS1069、枯草芽孢杆菌AGTP944、短小芽孢杆菌AGTP BS 1068和短小芽孢杆菌KX11-1。

表40饲喂阶段和饮食组成。¹

¹SBM，豆粕；CP，粗蛋白；cDDGS，～10％含油量的含有可溶物的玉米干酒糟；处理包括玉米的损耗。

在将动物载出、洗涤和24小时空气干燥设施后，测定残留的细菌负荷作为栏清洁的指示。在最接近给料机的角落中在每个栏的后面在躺下区域中收集样品，距离侧面和端板约1英尺(图27)。

使用预先浸湿的无菌拭子(PocketSwab Plus,Charm Sciences Lawrence,MA)擦拭设施地板的16in²的区域。每个拭子通过10次样品区域，一式三份进行分析。在擦拭步骤后的15秒内，将拭子置于LUMT生物发光器(Charm Sciences，Lawrence，MA)中。记录由此产生的相对光单位(RLU)值，在统计分析之前以栏平均。

使用SAS(v.9.1.3，SAS Institute公司，Cary，NC)的NPAR1WAY程序分析数据，显着性水平α＝0.05。数据显示，与对照饮食相比，在栏载出、洗涤和干燥之后，饲喂含DFM饮食的栏中的细菌负荷显著降低(P<0.05)(表41)。

表41清洗和风干猪棚之后，指示在饲喂对照饮食或添加有直接饲喂微生物(DFM)的饮食的商业栏中残留细菌负荷的相对光单位(RLU)的比较。

^a,b具有不同上标的平均数有显著性差异(P≤0.05)，¹SEM平均数标准误差。

尽管此处已经详细地说明和描述了具体的实施方式，本领域的普通技术人员可以理解的是，经计算出的用以实现相同目的的任何配置可以替代所示的具体实施方式。本申请旨在覆盖按照所描述的本发明原理操作的任何改变或变化。因此，本发明仅由权利要求及其等价技术方案限定。在本申请中引用的专利、参考文献和出版物的公开内容通过引用整体并入本发明。

参考书目

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序列表

<110> 杜邦营养生物科学有限公司

<120> 产酶芽孢杆菌菌株

<130> AGP-36010-A

<140> PCT/US2012/052360

<141> 2012-08-24

<150> 61/526881

<151> 2011-08-24

<150> 61/527371

<151> 2011-08-25

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于RAPD PCR分析的引物

<400> 1

ggtgcgggaa 10

<210> 2

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于RAPD PCR分析的引物

<400> 2

gtttcgctcc 10

<210> 3

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于RAPD PCR分析的引物

<400> 3

gtagacccgt 10

<210> 4

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于RAPD PCR分析的引物

<400> 4

aagagcccgt 10

<210> 5

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于RAPD PCR分析的引物

<400> 5

aacgcgcaac 10

<210> 6

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于RAPD PCR分析的引物

<400> 6

cccgtcagca 10

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于筛选分析的引物

<400> 7

aggtcaacat cgccacctac 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于筛选分析的引物

<400> 8

caacgggacg gtaatgaaac 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于筛选分析的引物

<400> 9

gctctgtcgc aaggtaggac 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于筛选分析的引物

<400> 10

ggccataagt gcctttacga 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于筛选分析的引物

<400> 11

atgaagccca gagcaaaaga 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于筛选分析的引物

<400> 12

ggggtgttga aggtctcaaa 20

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于筛选分析的引物

<400> 13

ggcagccttg tcccttgaag ag 22

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于筛选分析的引物

<400> 14

gtagcccacg tcgtagcaaa cc 22

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于筛选分析的引物

<400> 15

tgacgaggcc cagagcaaga 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于筛选分析的引物

<400> 16

atgggcacag tgtgggtgac 20

Claims (2)

1.一种分离的具有酶活性的芽孢杆菌菌株，其为枯草芽孢杆菌AGTP BS918，其保藏编号为NRRL B-50508。

2.一种组合物，其包括来自权利要求1所述的菌株的培养物的上清液。

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