KR20180067700A - 사료 첨가제 조성물 - Google Patents

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KR20180067700A
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엘리야 지 키어리
루이스 페르난도 로메로 밀란
로라 페일링
마리아 월쉬
수산 아렌트 룬
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듀폰 뉴트리션 바이오사이언시즈 에이피에스
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Abstract

적어도 하나의 프로테아제와의 조합으로 하나 이상의 박테리아 균주를 포함하는 직접 섭취 미생물로 본질적으로 구성되는 사료 첨가제 조성물 및 대상체의 퍼포먼스 개선 방법 또는 사료에서 원료의 소화력 개선 방법으로서, 프로테아제와의 조합으로 직접 섭취 미생물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 개시된다.

Description

사료 첨가제 조성물
본 출원은 2015년 11월 9일에 출원된 U.S. 가출원 번호 62/253089의 이익을 청구하며, 본원에 그 전문이 참조로 포함된다.
기술분야
본 분야는 하나 이상의 프로테아제와의 조합으로 하나 이상의 박테리아 균주를 포함하는 직접 섭취 미생물을 포함하는 사료 첨가제 조성물뿐만 아니라 이의 방법, 키트 및 용도에 관한 것이다.
직접 섭취 미생물(DFM) 또는 프로바이오틱스는 위장관 감염을 억제하고 소화관에서 최적으로 조절된 미생물 환경을 제공하는 식이 보충물질이다. 동물 사료 산업에서 항생제 사용에 대한 우려는 질환을 예방하기 위한 대안의 탐색으로 이어졌다. DFM은 항균 대체제로 사용될 수 있으며, 이에 따라 동물 사료에서 항생제에 대한 필요성을 감소시킬 수 있다. DFM은 또한 병원체와 경쟁하여 이의 성장을 억제하고, 면역 기능을 촉진하고, 위장관에서 미생물 균형을 조정할 수 있다. DFM은 직접 섭취 박테리아 및 효모-기반 제품을 포함한다. DFM과 하나 이상의 효소의 조합은 동물에서 영양소 이용 생산 퍼포먼스 특징을 개선할 수 있는 것으로 확인되었다.
2013년 12월 12일에 공개된 U.S. 특허 공개 2013/0330307은 프로테아제 및 피타제(phytase)와의 조합으로 직접 섭취 미생물을 포함하는 사료 첨가제 조성물뿐만 아니라 동물에서 생산 퍼포먼스 특징의 개선 방법을 개시한다.
2014년 8월 21일에 공개된 U.S. 특허 공개 2014/0234279는 프로테아제, 자일라나제, 아밀라제 및 피타제와의 조합으로 직접 섭취 미생물을 포함하는 사료 첨가제 조성물뿐만 아니라 동물에서 생산 퍼포먼스 특징의 개선 방법을 개시한다.
2014년 5월 13일에 Rehberger 등에 허여된 U.S. 특허 번호 8,722,058은 3A-P4 ATCC PTA-6506, 15A-P4 ATTC PTA-6507 및 22C-P1 ATCC PTA-6508로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바실러스 균주를 동물에게 공급하는 방법을 기재한다.
하나의 양태에서, 적어도 하나의 프로테아제와의 조합으로 하나 이상의 박테리아 균주를 포함하는 직접 섭취 미생물로 본질적으로 구성되는 사료 첨가제 조성물이 개시된다.
제2 양태에서, 직접 섭취 미생물은 항병원체 직접 섭취 미생물이다.
제3 양태에서, 직접 섭취 미생물은 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코커스(Lactococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 바실러스(Bacillus), 페디오코커스(Pediococcus), 엔테로코커스(Enterococcus), 류코노스톡(Leuconostoc), 카르노박테리움(Carnobacterium), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 클로스트리듐(Clostridium) 및 메가스패라(Megasphaera) 그리고 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 3개의 박테리아 균주를 포함한다.
제4 양태에서, 직접 섭취 미생물은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus), 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 엔테로코커스(Enterococcus), 엔테로코커스 종, 및 페디오코커스(Pediococcus) 종, 락토바실러스(Lactobacillus) 종, 비피도박테리움(Bifidobacterium) 종, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 페디오코커스 애시디락티시(Pediococcus acidilactici), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 프로피오니박테리움 토에니이(Propionibacterium thoenii), 락토바실러스 파르시미너스(Lactobacillus farciminus), 락토바실러스 람노서스(lactobacillus rhamnosus), 클로스트리듐 부티리컴(Clostridium butyricum), 비피도박테리움 애니말리스(Bifidobacterium animalis) 종 애니말리스(animalis), 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius) 종 살리바리우스(salivarius), 메가스패라 엘스데니이(Megasphaera elsdenii), 프로피오니박테리아(Propionibacteria) 종 및 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 3개의 박테리아 균주를 포함한다.
제5 양태에서, 직접 섭취 미생물은 바실러스 서브틸리스 균주 3BP5(NRRL B-50510); 918(NRRL B-50508), 및 1013(NRRL B-50509)을 포함한다.
제6 양태에서, 직접 섭취 미생물은 내생포자의 형태일 수 있다.
제7 양태에서, 사료 첨가제 조성물은 또한 서브틸리신, 바실로라이신, 알칼리성 세린 프로테아제, 케라티나제 또는 노카르디옵시스(Nocardiopsis) 프로테아제인 적어도 하나의 프로테아제를 포함한다.
제8 양태에서, 적어도 하나의 프로테아제는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 유래 서브틸리신이다.
제9 양태에서, 사료 첨가제 조성물에서 적어도 하나의 프로테아제는 1000 PU/사료 첨가제 조성물g 내지 200,000 PU/사료 첨가제 조성물g의 투여량으로 존재한다.
제10 양태에서, 사료 첨가제 조성물에서 DFM은 1×103 CFU/사료 첨가제 조성물g 내지 1×1013 CFU/사료 첨가제 조성물g의 투여량으로 존재한다.
제11 양태에서, 대상체의 퍼포먼스 개선 방법 또는 사료에서 원료의 소화력(예컨대 영양소 소화력, 예컨대 아미노산 소화력) 개선 방법, 또는 질소 보유 개선 방법, 또는 괴사성 장염에 대한 대상체의 저항성 개선 방법 또는 사료 전환 비율(FCR) 개선 방법 또는 날고기 또는 살코기 수율 증가 방법 또는 대상체에서 체중 증가 개선 방법 또는 대상체에서 사료 효율 개선 방법 또는 대상체의 면역 반응 조정(예컨대 개선) 방법, 또는 대상체의 위장관에서 유익한 박테리아의 성장 촉진 방법 또는 대상체의 위장관에서 병원성 박테리아 모집단 감소 방법, 또는 동물거름에서 영양소 배출 감소 방법, 또는 동물거름에서 암모니아 생산 감소 방법, 또는 식이 헤미셀룰로스 또는 섬유의 소화력 또는 이용 개선 방법으로서, 적어도 하나의 프로테아제와의 조합으로 하나 이상의 박테리아 균주를 포함하는 직접 섭취 미생물을 투여하는 단계를 포함하는 방법이 개시된다.
제12 양태에서, 본원에 기재되는 임의의 사료 첨가제 조성물 및 투여 지침을 포함하는 키트가 개시된다.
제13 양태에서, 적어도 하나의 프로테아제와의 조합으로 하나 이상의 박테리아 균주를 포함하는 직접 섭취 미생물을 혼합하는 단계 및 패키지화하는 단계를 포함하는, 사료 첨가제 조성물의 제조 방법이 개시된다.
제14 양태에서, 본원에 기재되는 임의의 사료 첨가제 조성물을 포함하는 사료가 개시된다.
제15 양태에서, 본원에 기재되는 임의의 사료 첨가제 조성물 및 적어도 하나의 미네랄 및/또는 적어도 하나의 비타민을 포함하는 프리믹스가 개시된다.
도 1은 단독 또는 조합으로 섭취되는 경우, 3-균주 바실러스 기반 직접 섭취 미생물(바실러스 균주 3BP5, 918, 1013) 및 프로테아제(P3000)의 돼지 성장 퍼포먼스에 대한 효과를 나타낸다.
도 2는 단독 또는 조합으로 섭취되는 경우, 3-균주 바실러스 기반 직접 섭취 미생물(바실러스 균주 3BP5, 918, 1013) 및 프로테아제의 돼지 성장 퍼포먼스에 대한 효과를 나타낸다.
도 3은 단독 또는 조합으로 섭취되는 경우, 3-균주 바실러스 기반 직접 섭취 미생물(바실러스 균주 3BP5, 918, 1013) 및 프로테아제의 대변 암모니아 배출에 대한 효과를 나타낸다.
도 4는 단독 또는 조합으로 섭취되는 경우, 3-균주 바실러스 기반 직접 섭취 미생물(바실러스 균주 3BP5, 918, 1013) 및 프로테아제의 돼지 성장 퍼포먼스에 대한 효과를 나타낸다.
도 5는 단독 또는 조합으로 섭취되는 경우, 3-균주 바실러스 기반 직접 섭취 미생물(바실러스 균주 3BP5, 918, 1013) 및 프로테아제의 대변 암모니아 농도에 대한 효과를 나타낸다.
도 6은 조합으로 또는 DFM이 단독 섭취되는 경우, 3-균주 바실러스 기반 직접 섭취 미생물(바실러스 균주 3BP5, 918, 1013) 및 프로테아제의 돼지 성장 퍼포먼스에 대한 효과를 나타낸다.
도 7는 단독 또는 조합으로 섭취되는 경우, 3-균주 바실러스 기반 직접 섭취 미생물(바실러스 균주 3BP5, 918, 1013) 및 프로테아제의 돼지 성장 퍼포먼스에 대한 효과를 나타낸다.
도 8a는 프로테아제와의 조합으로 3-균주 바실러스 DFM의 대두 음식 기반 식이를 섭취시킨 돼지의 회장 소화액으로부터의 시험관내 단백질 가용화에 대한 효과를 나타낸다.
도 8b는 프로테아제와의 조합으로 단일 균주 바실러스 리케니포르미스 DFM의 대두 음식 기반 식이를 섭취시킨 돼지의 회장 소화액으로부터의 시험관내 단백질 가용화에 대한 효과를 나타낸다.
도 8c는 프로테아제와의 조합으로 단일 균주 바실러스 푸밀리스(Bacillus pumilis) DFM의 대두 음식 기반 식이를 섭취시킨 돼지의 회장 소화액으로부터의 시험관내 단백질 가용화에 대한 효과를 나타낸다.
도 8d는 프로테아제와의 조합으로 단일 균주 바실러스 푸밀리스 DFM의 밀 기반 식이를 섭취시킨 돼지의 회장 소화액으로부터의 시험관내 단백질 가용화에 대한 효과를 나타낸다.
도 8e는 프로테아제와의 조합으로 단일 균주 바실러스 리케니포르미스 DFM의 밀 기반 식이를 섭취시킨 돼지의 회장 소화액으로부터의 시험관내 단백질 가용화에 대한 효과를 나타낸다.
도 8f는 프로테아제와의 조합으로 단일 균주 락토바실러스 류테리 DFM의 밀 기반 식이를 섭취시킨 돼지의 회장 소화액으로부터의 시험관내 단백질 가용화에 대한 효과를 나타낸다.
인용된 모든 특허, 특허 출원, 및 공보는 이의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 개시에서, 여러 용어 및 약어가 사용된다. 구체적으로 달리 언급되지 않는 한, 다음 정의가 적용된다.
요소 또는 성분 앞의 관사는 요소 또는 성분의 경우(즉, 발생)의 수에 관해 비제한적인 것이다. 따라서, 단수형("a", "an" 및 "the")은 하나 또는 적어도 하나를 포함하는 것으로 파악되어야 하며, 요소 또는 성분의 단수형은 그 수가 명백히 단수임을 의미하지 않는 한 복수형도 포함하는 것이다.
용어 "포함하는"은 구현예에서 나타내는 언급된 특징, 정수, 단계, 또는 성분의 존재를 의미하지만, 하나 이상의 다른 특징, 정수, 단계, 성분 또는 이의 그룹의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다. 용어 "포함하는"은 용어 "본질적으로 구성되는" 및 "구성되는"에 의해 포괄되는 구현예를 포함하려는 것이다. 유사하게, 용어 "본질적으로 구성되는"은 용어 "구성되는"에 의해 포괄되는 구현예를 포함하려는 것이다.
존재하는 경우, 모든 범위는 포괄적이며 조합 가능하다. 예를 들어, "1 내지 5"의 범위가 언급된 경우, 언급된 범위는 "1 내지 4", "1 내지 3", "1~2", "1~2 및 4~5", "1~3 및 5" 등의 범위를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
수치 값과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "약"은 이 용어가 달리 구체적으로 문맥에서 정의되어 있지 않는 한, 그 수치 값의 +/- 0.5의 범위를 나타낸다. 예를 들어, 어구 "약 6의 pH 값"은 그 pH 값이 구체적으로 달리 정의되지 않는 한, 5.5 내지 6.5의 pH 값을 나타낸다.
본 명세서 전체에 걸쳐 주어진 모든 최대 수치 제한은, 마치 모든 하한 수치 제한이 본원에 명백하게 적힌 것처럼, 이러한 모든 하한 수치 제한을 포함하려는 것이다. 본 명세서 전체에 걸쳐 주어진 모든 최소 수치 제한은, 마치 더 큰 모든 수치 제한이 본원에 명백하게 적힌 것처럼, 이러한 더 큰 모든 수치 제한을 포함할 것이다. 본 명세서 전체에 걸쳐 주어진 모든 수치 범위는 마치 더 좁은 모든 수치 범위 전부가 본원에 명백하게 적힌 것처럼, 이러한 더 넓은 수치 범위 내에 있는 더 좁은 모든 수치 범위를 포함할 것이다.
용어 "동물" 및 "대상체"는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 동물은 모든 비-반추(인간 포함) 및 반추 동물을 포함한다. 특정한 구현예에서, 동물은 비-반추 동물, 예컨대 말 및 단일-위 동물이다. 단일-위 동물의 예는 비제한적으로 돼지(pigs 및 swine), 예컨대 새끼돼지, 성장기 돼지, 암퇘지; 가금, 예컨대 칠면조, 오리, 닭, 구이용 닭, 산란계; 어류, 예컨대 연어, 송어, 틸라피아, 메기 및 잉어; 및 갑각류, 예컨대 새우 및 대하를 포함한다. 추가 구현예에서, 동물은 비제한적으로 소, 어린 송아지, 염소, 양, 기린, 유럽들소, 무스, 엘크, 야크, 물소, 사슴, 낙타, 알파카, 라마, 영양, 가지뿔영양 및 닐가이를 포함하는 반추 동물이다.
본원에서 사용되는 용어 "병원체"는 질환의 임의의 원인 제제를 의미한다. 이러한 원인 제제는 비제한적으로 박테리아, 바이러스, 진균 원인 제제 등을 포함할 수 있다.
"사료" 및 "식품"은 각각 비-인간 동물 및 인간이 각각 먹고, 섭취하고, 소화시키기 위한 또는 이에 적합한 임의의 적합한 천연 또는 인공 식이, 음식 등이나 이러한 음식의 성분을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "식품"은 광의의 개념으로 사용되며 인간을 위한 식품 및 식제품뿐만 아니라 비-인간 동물을 위한 식품(즉, 사료)을 포괄한다.
용어 "사료"는 가축의 사육에서 동물에게 섭취시키는 제품에 대해 사용된다. 용어 "사료" 및 "동물 사료"는 상호 교환적으로 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "직접 섭취 미생물"("DFM")은 살아있는(생활성) 자연 발생 미생물의 원천이다. DFM은 하나 이상의 이러한 자연 발생 미생물, 예컨대 박테리아 균주를 포함할 수 있다. DFM의 범주는 바실러스, 락트산 박테리아 및 효모를 포함한다. 바실러스는 포자를 형성하는 독특한, 그람-양성 막대균이다. 이들 포자는 매우 안정하며, 열, 수분 및 다양한 pH와 같은 환경 조건을 견딜 수 있다. 이들 포자는 동물에 의해 소화되면 활성 영양 세포로 발아하며, 음식 및 펠렛화된 식이에서 사용될 수 있다. 락트산 박테리아는 병원체에 길항성인 락트산을 생산하는 그람-양성 구균이다. 락트산 박테리아는 다소 열-민감성으로 나타나므로, 펠렛화된 식이에서 사용되지 않는다. 락트산 박테리아의 유형은 비피도박테리움, 락토바실러스 및 스트렙토코커스를 포함한다. 효모는 박테리아가 아니다. 이들 미생물은 식물 그룹 진균에 속한다. 따라서, 용어 DFM은 직접 섭취 박테리아, 직접 섭취 효모, 직접 섭취 효모 및 이의 조합 중 하나 이상을 포괄한다.
용어 "프리바이오틱"은 1가지의 또는 제한된 수의 유익한 박테리아의 성장 및/또는 활성을 선택적으로 촉진함으로써 숙주에 유익하게 영향을 주는 비-소화성 식품 구성성분을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "프로바이오틱 배양물"은, 예를 들어, 충분한 수로 섭취되거나 국소 적용될 때, 숙주 유기체에 유익하게 영향을 주는, 즉, 하나 이상의 입증 가능한 건강상의 이익을 숙주 유기체에 부여함으로써 그렇게 하는 살아있는 미생물(예를 들어 박테리아 또는 효모를 포함함)로 정의된다. 프로바이오틱스는 하나 이상의 점막 표면에서 미생물 균형을 개선시킬 수 있다. 예를 들어, 점막 표면은 장, 요로, 호흡기관 또는 피부일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "프로바이오틱"은 면역계의 유익한 분지(branch)를 촉진할 수 있고 이와 동시에 점막 표면, 예를 들어 내장에서의 염증 반응을 감소시킬 수 있는 살아있는 미생물을 또한 포괄한다. 프로바이오틱 섭취의 하한치 또는 상한치는 없지만, 1일 용량으로서 적어도 106 내지 1012, 바람직하게는 적어도 106 내지 1010, 바람직하게는 108 내지 109 cfu가 대상체에서 유익한 건강상의 효과를 달성하기에 유효할 것으로 제안되었다.
본원에서 사용되는 용어 "CFU"는 "콜로니 형성 단위"를 의미하며 생활성 세포의 척도이고, 여기서 콜로니는 단일 선조 세포로부터 유래되는 세포의 응집물을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "프로테아제"는 펩타이드 결합을 절단할 수 있는 효소를 나타낸다. 용어 "프로테아제", "펩티다제" 및 "프로테이나제"는 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 프로테아제는 동물, 식물, 박테리아, 원시세균 및 바이러스에서 확인될 수 있다. 단백분해는 현재 6개의 넓은 그룹: 아스파르트산 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 세린 프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 글루탐산 프로테아제, 및 메탈로프로테아제로 분류된 효소에 의해 달성될 수 있다.
용어 "단리된"은 자연에서 발생하지 않는 형태 또는 환경 중의 물질을 의미한다. 단리된 물질의 비제한적 예는 (1) 임의의 비-자연 발생 물질, (2) 자연에서 연관되는 하나 이상의 또는 전체의 자연 발생 구성분으로부터 적어도 부분적으로 제거되는, 비제한적으로 임의의 숙주 세포, 효소, 변이체, 핵산, 단백질, 펩타이드 또는 보조인자를 포함하는 임의의 물질; (3) 자연에서 확인되는 물질에 비해 인간의 힘으로 변형된 임의의 물질; 또는 (4) 자연적으로 연관되는 다른 성분에 비해 물질의 양을 증가시킴으로써 변형된 임의의 물질을 포함한다. 용어 "단리된 핵산 분자", "단리된 폴리뉴클레오타이드", 및 "단리된 핵산 단편"은 상호 교환적으로 사용될 것이며, 선택적으로 합성, 비-천연 또는 변경된 뉴클레오타이드 염기를 함유하는, 단일쇄 또는 이중쇄인 RNA 또는 DNA의 중합체를 나타낸다. DNA의 중합체 형태인 단리된 핵산 분자는 cDNA, 게놈 DNA 또는 합성 DNA의 하나 이상의 절편으로 이루어질 수 있다.
핵산 또는 폴리펩타이드에 적용되는 용어 "정제된"은 일반적으로 당분야에 널리 공지된 분석 기법에 의해 결정된 바와 같은 다른 성분이 본질적으로 없는 핵산 또는 폴리펩타이드를 나타낸다(예컨대, 정제된 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드가 전기영동 겔, 크로마토그래픽 용출액, 및/또는 밀도 구배 원심분리를 거친 매질 중에 별도 밴드를 형성함). 예를 들어, 전기영동 겔에서 본질적으로 하나의 밴드를 생성하는 핵산 또는 폴리펩타이드는 "정제된" 것이다. 정제된 핵산 또는 폴리펩타이드는 적어도 약 50% 순수하고, 보통 적어도 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 99.5%, 약 99.6%, 약 99.7%, 약 99.8% 이상 순수하다(예컨대, 몰 농도 기준 중량%). 관련된 개념에서, 조성물은 정제 또는 농축 기법의 적용 후 분자 농도의 실질적 증가가 존재하는 경우, 분자에 대해 농축된 것이다. 용어 "농축된"은 시작 조성물보다 높은 상대 또는 절대 농도로 조성물에 존재하는 화합물, 폴리펩타이드, 세포, 핵산, 아미노산, 또는 다른 명시된 물질 또는 성분을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "형질전환"은 숙주 유기체 내로의 핵산 분자의 전달 또는 도입을 나타낸다. 핵산 분자는 선형 또는 원형 형태의 DNA로 도입될 수 있다. 핵산 분자는 자율적으로 복제하는 플라스미드일 수도 있고, 또는 생산 숙주의 게놈 내로 통합될 수도 있다. 형질전환된 핵산을 함유하는 생산 숙주는 "형질전환된" 또는 "재조합" 또는 "트랜스제닉" 유기체 또는 "형질전환체"로 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "재조합"은, 예컨대 화학적 합성에 의한 또는 유전 조작 기법에 의한 핵산의 단리된 절편의 조작에 의한, 다른 경우 2개로 분리된 핵산 서열 절편의 인공 조합을 나타낸다. 예를 들어, 자연적으로 또는 실험적 조작에 의해, 상이한 분자로부터, 동일한 분자의 또 다른 부분, 또는 인공 서열로부터, 하나 이상의 절편 또는 유전자가 삽입된 DNA는 유전자에서 그리고 후속적으로 유기체에서 새로운 서열의 도입을 일으킨다. 용어 "재조합", "트랜스제닉", "형질전환된", "조작된" 또는 "외인성 유전자 발현을 위해 변형된"은 본원에서 상호 교환적으로 사용된다.
본원에서 용어 "미생물(microbial)"은 "미생물(microorganism)"과 상호 교환적으로 사용된다. 생활성 미생물은 대사 활성이거나 분화할 수 있는 것이다.
본원에 기재되는 DFM은 적어도 하나의 생활성 미생물, 예컨대 생활성 박테리아 균주 또는 생활성 효모 또는 생활성 진균을 포함한다. 바람직하게는, DFM은 적어도 하나의 생활성 박테리아를 포함한다.
하나의 구현예에서, DFM은 포자 형성 박테리아 균주일 수 있고 이에 따라 용어 DFM은 포자, 예컨대 박테리아 포자로 이루어지거나 이를 함유할 수 있다. 따라서, 본원에서 사용되는 용어 "생활성 미생물"은 미생물 포자, 예컨대 내생포자 또는 분생포자를 포함할 수 있다. 대안적으로, 본원에 기재되는 사료 첨가제 조성물에서의 DFM은 미생물 포자, 예컨대 내생포자 또는 분생포자로 이루어지지 않을 수 있거나 이를 함유하지 않을 수 있다.
미생물은 자연 발생 미생물일 수도 있고 또는 형질전환된 미생물일 수도 있다. 바람직하게는, 미생물은 단리될 수 있는 적어도 3개의 적합한 미생물, 예컨대 박테리아의 조합이다.
본원에 기재되는 DFM은 다음 속: 락토바실러스, 락토코커스, 스트렙토코커스, 바실러스, 페디오코커스, 엔테로코커스, 류코노스톡, 카르노박테리움, 프로피오니박테리움, 비피도박테리움, 클로스트리듐 및 메가스패라 그리고 이의 조합 중 하나 이상으로부터의 미생물을 포함할 수 있다.
바람직하게는, DFM은 다음 바실러스 종: 바실러스 서브틸리스, 바실러스 세레우스, 바실러스 리케니포르미스, 바실러스 푸밀리스 및 바실러스 아밀로리퀘파시엔스로부터 선택되는 하나 이상의 박테리아 균주를 포함한다.
본원에서 사용되는 "바실러스" 속은 비제한적으로 B. 서브틸리스, B. 리케니포르미스, B. 렌투스(lentus), B. 브레비스(brevis), B. 스테아로써모필러스(stearothermophilus), B. 알칼로필러스(alkalophilus), B. 아밀로리퀘파시엔스, B. 클라우시이(clausii), B. 할로두란스(halodurans), B. 메가테리움(megaterium), B. 코아굴란스(coagulans), B. 써쿨란스(circulans), B. 깁소니이(gibsonii), B. 푸밀리스 및 B. 투링기엔시스(thuringiensis)를 포함하는 당업자에게 공지된 바와 같은 "바실러스" 속 내의 모든 종을 포함한다. 바실러스 속은 계속 분류학적 재구성을 거치고 있음이 인식된다. 따라서, 이 속은 비제한적으로 현재 "지오바실러스 스테아로써모필러스(Geobacillus stearothermophilus)"로 명명된 바실러스 스테아로써모필러스, 또는 현재 "패니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa)"인 바실러스 폴리믹사(Bacillus polymyxa)와 같은 유기체를 포함하는, 재분류된 종을 포함하는 것이다. 스트레스를 주는 환경 조건 하에 저항성 내생포자의 생산은 바실러스 속을 정의하는 특징으로 간주되지만, 이 특징은 최근에 명명된 알리사이클로바실러스(Alicyclobacillus), 암피바실러스(Amphibacillus), 아뉴리니바실러스(Aneurinibacillus), 아녹시바실러스(Anoxybacillus), 브레비바실러스(Brevibacillus), 필로바실러스(Filobacillus), 그라실리바실러스(Gracilibacillus), 할로바실러스(Halobacillus), 패니바실러스(Paenibacillus), 살리바실러스(Salibacillus), 써모바실러스(Thermobacillus), 우레이바실러스(Ureibacillus), 및 비르기바실러스(Virgibacillus)에도 적용된다.
바람직하게는, DFM은 3개 이상의 바실러스 서브틸리스 균주 3BP5(NRRL B-50510); 918(NRRL B-50508), 및 1013(NRRL B-50509)의 조합일 수 있다.
균주 3BP5(NRRL B-50510); 918(NRRL B-50508), 및 1013(NRRL B-50509)은 농업 연구 서비스 배양 컬렉션(Agricultural Research Service Culture Collection(NRRL))에서 공개적으로 이용 가능하다. 이들 균주는 WO2013029013에 교시되어 있다.
다른 양태에서, DFM은 다음 락토코커스 종: 락토코커스 크레모리스(Lactococcus cremoris) 및 락토코커스 락티스 그리고 이의 조합과 추가 조합될 수 있다.
DFM은 다음 락토바실러스 종: 락토바실러스 부크네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 케피리(Lactobacillus kefiri), 락토바실러스 비피더스(Lactobacillus bifidus), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 헬베티커스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실러스 컬바투스(Lactobacillus curvatus), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 류테리, 락토바실러스 페르멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 파르시미니스(Lactobacillus farciminis), 락토바실러스 락티스, 락토바실러스 델브류키이(Lactobacillus delbreuckii), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 파라플란타럼(Lactobacillus paraplantarum), 락토바실러스 파르시미니스(Lactobacillus farciminis), 락토바실러스 람노서스, 락토바실러스 크리스파터스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 존소니이(Lactobacillus johnsonii) 및 락토바실러스 젠세니이(Lactobacillus jensenii), 및 임의의 이의 조합과 추가 조합될 수 있다.
다른 양태에서, DFM은 다음 비피도박테리아 종: 비피도박테리움 락티스, 비피도박테리움 비피덤, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 애니말리스(Bifidobacterium animalis), 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 카테눌라텀(Bifidobacterium catenulatum), 비피도박테리움 슈도카테눌라텀(Bifidobacterium pseudocatenulatum), 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis), 및 비피도박테리움 앵굴라텀(Bifidobacterium angulatum), 및 임의의 이의 조합과 추가 조합될 수 있다.
다음 종의 박테리아: 바실러스 서브틸리스, 바실러스 리케니포르미스, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스, 바실러스 푸밀리스, 엔테로코커스, 엔테로코커스 종, 및 페디오코커스 종, 락토바실러스 종, 비피도박테리움 종, 락토바실러스 애시도필러스, 페디오코커스 애시디락티시, 락토코커스 락티스, 비피도박테리움 비피덤, 바실러스 서브틸리스, 프로피오니박테리움 토에니이, 락토바실러스 파르시미니스, 락토바실러스 람노서스, 메가스패라 엘스데니이, 클로스트리듐 부티리컴, 비피도박테리움 애니말리스 종 애니말리스, 락토바실러스 류테리, 바실러스 세레우스, 락토바실러스 살리바리우스 종 살리바리우스, 프로피오니박테리아 종 및 이의 조합이 언급될 수 있다.
하나 이상의 박테리아 균주를 포함하는 본원에 기재되는 직접 섭취 미생물은 동일한 유형(속, 종 및 균주)일 수 있거나 속, 종 및/또는 균주의 혼합물을 포함할 수 있다.
적합하게는 본 개시에 따른 조성물은 WO2012110778에 개시되고, 아래와 같이 요약되는 하나 이상의 제품 또는 이들 제품에 함유되는 미생물과 조합될 수 있다:
바실러스 서브틸리스 균주 2084 Accession No. NRRl B-50013, 바실러스 서브틸리스 균주 LSSAO1 Accession No. NRRL B-50104, 및 바실러스 서브틸리스 균주 15A-P4 ATCC Accession No. PTA-6507(예전에 Avicorr®로 공지된 Enviva Pro®); 바실러스 서브틸리스 균주 C3102(Calsporin®); 바실러스 서브틸리스 균주 PB6(Clostat®); 바실러스 푸밀리스(8G-134); 엔테로코커스 NCIMB 10415(SF68)(Cylactin®); 바실러스 서브틸리스 균주 C3102(Gallipro® & GalliproMax®); 바실러스 리케니포르미스(Gallipro®Tect®); 엔테로코커스 및 페디오코커스(Poultry star®); 락토바실러스, 비피도박테리움 및/또는 엔테로코커스(Protexin®); 바실러스 서브틸리스 균주 QST 713(Proflora®); 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 CECT-5940(Ecobiol® & Ecobiol® Plus); 엔테로코커스 패시움 SF68(Fortiflora®); 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 리케니포르미스(BioPlus2B®); 락트산 박테리아 7 엔테로코커스 패시움(Lactiferm®); 바실러스 균주(CSI®); 사카로마이세스 세레비시애(Yea-Sacc®); 엔테로코커스(Biomin IMB52®); 페디오코커스 애시디락티시, 엔테로코커스, 비피도박테리움 애니말리스 종 애니말리스, 락토바실러스 류테리, 락토바실러스 살리바리우스 종 살리바리우스(Biomin C5®); 락토바실러스 파르시미니스(Biacton®); 엔테로코커스(Oralin E1707®); 엔테로코커스(2개 균주), 락토코커스 락티스 DSM 1103(Probios-pioneer PDFM®); 락토바실러스 람노서스 및 락토바실러스 파르시미니스(Sorbiflore®); 바실러스 서브틸리스(Animavit®); 엔테로코커스(Bonvital®); 사카로마이세스 세레비시애(Levucell SB 20®); 사카로마이세스 세레비시애(Levucell SC 0 & SC10® ME); 페디오코커스 애시디락티(Bactocell); 사카로마이세스 세레비시애(ActiSaf®(예전 BioSaf®)); 사카로마이세스 세레비시애 NCYC Sc47(Actisaf® SC47); 클로스트리듐 부티리컴(Miya-Gold®); 엔테로코커스(Fecinor 및 Fecinor Plus®); 사카로마이세스 세레비시애 NCYC R-625(InteSwine®); 사카로마이세스 세레비시애(BioSprint®); 엔테로코커스 및 락토바실러스 람노서스(Provita®); 바실러스 서브틸리스 및 아스퍼길러스 오리재(Aspergillus oryzae)(PepSoyGen-C®); 바실러스 세레우스(Toyocerin®); 바실러스 세레우스 변종 토요이(toyoi) NCIMB 40112/CNCM I-1012(TOYOCERIN®), 또는 다른 DFM, 예컨대 바실러스 리케니포르미스 및 바실러스 서브틸리스(BioPlus® YC) 및 바실러스 서브틸리스(GalliPro®).
DFM은 Danisco A/S에서 상업적으로 이용 가능한 Enviva Pro®와 조합될 수 있다. Enviva Pro®는 바실러스 균주 2084 Accession No. NRRl B-50013, 바실러스 균주 LSSAO1 Accession No. NRRL B-50104 및 바실러스 균주 15A-P4 ATCC Accession No. PTA-6507의 조합이다(US 7,754,469 B에 교시됨 - 본원에 참조로 포함됨).
또한 본원에 기재되는 DFM은 속: 사카로마이세스 종으로부터의 효모와 조합할 수 있다.
바람직하게는, 본원에 기재되는 DFM은 일반적으로 안전한 것으로 인식되고(GRAS) 바람직하게는 GRAS-승인된 미생물을 포함한다.
당업자라면 식품 및/또는 농업 산업에서 사용되고 일반적으로 동물 소비에 적합한 것으로 간주되는, 본원에 기재된 속으로부터의 미생물의 특정 종 및/또는 균주를 쉽게 인식할 것이다.
유리하게는, 제품이 사료 또는 사료 첨가제 조성물인 경우, DFM은 사료 또는 사료 첨가제 조성물이 소매자에 의한 판매를 위해 제공되는 기간인 제품의 정상적인 "판매 기한" 또는 "유효 기한" 날짜까지 유효하게 유지되어야 한다. 요망되는 시간의 길이 및 정상 저장 기간은 사료물질마다 다를 것이며, 당업자라면 저장 시간이 사료물질의 유형, 사료물질의 크기, 저장 온도, 가공 조건, 패키지화 물질 및 패키지화 장비에 따라 변할 것임을 인식할 것이다.
일부 구현예에서, DFM은 내열성인 것이, 즉 열안정한 것이 중요하다. 이는 특히 사료가 펠렛화되는 경우 해당된다. 따라서, 다른 구현예에서, DFM은 열안정성 미생물, 예컨대 바실러스 종을 예로 포함하는 열안정성 박테리아일 수 있다.
다른 양태에서, DFM이 포자 생산 박테리아, 예컨대 바실러스, 예컨대 바실러스 종을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 바실러스는 성장을 위한 조건이 바람직하지 못한 경우 그리고 열, pH, 수분 및 소독제에 매우 저항성인 경우, 안정한 내생포자를 형성할 수 있다.
본원에 기재되는 DFM은 병원성 미생물(예컨대 클로스트리듐 퍼프링겐스(Clostridium perfringens) 및/또는 대장균(E. coli) 및/또는 살모넬라(Salmonella) 종 및/또는 캄필로박터(Campylobacter) 종)의 장내 확립을 감소시키거나 예방할 수 있다. 다시 말하면, DFM은 항병원성일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "항병원성"은 DFM이 병원체의 효과(부정적 효과)에 대항함을 의미한다.
상술된 바와 같이, DFM은 임의의 적합한 DFM일 수 있다. 예를 들어, 다음 검정 "DFM 검정"은 DFM이 될 미생물의 적합성을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 DFM 검정은 US2009/0280090에서 보다 상세히 설명된다. 의혹을 배제하기 위해, 본원에서 교시되는 "DFM 검정"에 따른 억제 균주로 선택되는 DFM(또는 항병원성 DFM)은 본 개시에 따라, 즉 본 개시에 따른 사료 첨가제 조성물에서 사용하기 적합한 DFM이다.
튜브는 각각 대표적 클러스터로부터의 대표적 병원체(예컨대, 박테리아)와 함께 씨드접종되었다.
호기적으로 또는 혐기적으로 성장시킨 잠재적 DFM으로부터의 상청액이 씨드접종된 튜브에 첨가되고(상청액이 첨가되지 않는 대조군은 예외로 함) 인큐베이션된다. 인큐베이션 후, 대조군 및 상청액 처리 튜브의 광학 밀도(OD)가 각각의 병원체에 대해 측정되었다.
이어서 대조군(임의의 상청액을 함유하지 않음) 대비 더 낮은 OD를 생성한 (잠재적인 DFM) 균주의 콜로니는 억제 균주(또는 항병원성 DFM)로 분류될 수 있다. 따라서, 본원에서 사용되는 DFM 검정은 US2009/0280090에서 보다 상세히 설명된다.
바람직하게는, 이 DFM 검정에서 사용되는 대표적 병원체는 클로스트리듐, 예컨대 클로스트리듐 퍼프링겐스 및/또는 클로스트리듐 디피실레(Clostridium difficile), 및/또는 대장균 및/또는 살모넬라 종 및/또는 캄필로박터 종 중 하나(또는 그 초과)일 수 있다. 하나의 바람직한 구현예에서, 검정은 하나 이상의 클로스트리듐 퍼프링겐스 및/또는 클로스트리듐 디피실레 및/또는 대장균, 바람직하게는 클로스트리듐 퍼프링겐스 및/또는 클로스트리듐 디피실레, 보다 바람직하게는 클로스트리듐 퍼프링겐스로 수행된다.
항병원성 DFM은 하나 이상의 다음 박테리아를 포함하며, WO2013029013에 기재되어 있다:
바실러스 서브틸리스 균주 3BP5 Accession No. NRRL B-50510,
바실러스 서브틸리스 균주 918 ATCC Accession No. NRRL B-50508, 및
바실러스 서브틸리스 균주 1013 ATCC Accession No. NRRL B-50509.
DFM은 배양물(들) 및 (사용되는 경우) 담체(들)로 제조될 수 있고, 리본 또는 패들 혼합장치에 첨가되어 약 15분 동안 혼합될 수 있지만, 시간은 증가되거나 감소될 수 있다. 성분은 배양물 및 담체의 균일한 혼합물이 생성되도록 배합된다. 최종 제품은 바람직하게는 건조한, 유동성 분말이다. 이어서 하나 이상의 박테리아 균주를 포함하는 DFM(들)은 동물 사료 또는 사료 프리믹스에 첨가되거나, 동물의 물에 첨가되거나, 또는 당분야에 공지된 다른 방식으로 투여될 수 있다(바람직하게는 본원에 기재되는 효소와 동시에.
DFM 혼합물에서 개별 균주의 혼입 비는 1% 내지 99%, 바람직하게는, 25% 내지 75%로 변할 수 있다.
동물 사료에서 DFM의 적합한 투여량은 약 1×103 CFU/사료g 내지 약 1×1010 CFU/사료g, 적합하게는 약 1×104 CFU/사료g 내지 약 1×108 CFU/사료g, 적합하게는 약 7.5×104 CFU/사료g 내지 약 1×107 CFU/사료g의 범위일 수 있다.
다른 양태에서, DFM은 약 1×103 CFU/사료g 초과, 적합하게는 약 1×104 CFU/사료g 초과, 적합하게는 약 5×104 CFU/사료g 초과, 또는 적합하게는 약 1×105 CFU/사료g 초과로 사료물질에 투여될 수 있다.
DFM은 약 1×103 CFU/조성물g 내지 약 1×1013 CFU/조성물g, 바람직하게는 1×105 CFU/조성물g 내지 약 1×1013 CFU/조성물g, 보다 바람직하게는 약 1×106 CFU/조성물g 내지 약 1×1012 CFU/조성물g, 가장 바람직하게는 약 3.75×107 CFU/조성물g 내지 약 1×1011 CFU/조성물g로 사료 첨가제 조성물에 투여될 수 있다. 다른 양태에서, DFM은 약 1×105 CFU/조성물g 초과, 바람직하게는 약 1×106 CFU/조성물g 초과, 가장 바람직하게는 약 3.75×107 CFU/조성물g 초과로 사료 첨가제 조성물에 투여될 수 있다. 하나의 구현예에서, DFM은 약 2×105 CFU/조성물g 초과, 적합하게는 약 2×106 CFU/조성물g 초과, 적합하게는 약 3.75×107 CFU/조성물g 초과로 사료 첨가제 조성물에 투여된다.
본원에 기재되는 사료 첨가제 조성물은 하나 이상의 박테리아 균주를 포함하는 DFM 및 적어도 하나의 프로테아제로 본질적으로 구성된다. 프로테아제는 서브틸리신(E.C. 3.4.21.62) 또는 바실로라이신(E.C. 3.4.24.28) 또는 알칼리성 세린 프로테아제(E.C. 3.4.21.x) 또는 케라티나제(E.C. 3.4.x.x)일 수 있다. 바람직한 프로테아제는 서브틸리신이다. 프로테아제는 B. 서브틸리스에서 유래될 수 있거나 프로테아제는 Novozymes A/S에서 이용 가능한 노카르디옵시스 프로테아제일 수 있다.
다른 적합한 프로테아제는 동물, 식물 또는 미생물 유래의 것들을 포함한다. 화학적으로 변형되거나 단백질 조작된 돌연변이체 프로테아제가 또한 사용될 수 있다. 프로테아제는 세린 프로테아제 또는 메탈로프로테아제, 예컨대, 알칼리성 미생물 프로테아제 또는 트립신-유사 프로테아제일 수 있다. 알칼리성 프로테아제의 예는 서브틸리신, 특히 바실러스 종에서 유래되는 것들, 예컨대, 서브틸리신 노보(Novo), 서브틸리신 칼스버그(Carlsberg), 서브틸리신 309(예컨대, U.S. 특허 번호 6,287,841 참조), 서브틸리신 147, 및 서브틸리신 168(예컨대, WO 89/06279 참조)이다. 트립신-유사 프로테아제의 예는 트립신(예컨대, 돼지 또는 소 기원), 및 푸사리움 프로테아제(예컨대, WO 89/06270 및 WO 94/25583 참조)이다. 유용한 프로테아제의 예는 또한 비제한적으로 WO 92/19729 및 WO 98/20115에 기재된 변이체를 포함한다.
아래의 하나 이상의 상업적 제품에서의 하나 이상의 프로테아제가 본원에 기재되는 3-균주 직접 섭취 미생물과의 조합으로 사용될 수 있다:
Figure pct00001
바람직하게는, 프로테아제는 약 1000 PU/사료㎏ 내지 약 200,000 PU/사료㎏, 보다 바람직하게는 약 1500 PU/사료㎏ 내지 약 100000 PU/사료㎏, 보다 바람직하게는 약 2000 PU/사료㎏ 내지 약 60000 PU/사료㎏의 범위로 사료물질에 존재한다. 보다 구체적으로, 프로테아제는 약 1000 PU/사료㎏ 초과 또는 약 1500 PU/사료㎏ 초과, 또는 약 2000 PU/사료㎏ 초과로 사료물질에 존재한다. 다른 양태에서, 프로테아제는 약 200,000 PU/사료㎏ 미만 또는 약 100000 PU/사료㎏ 미만 또는 약 70000 PU/사료㎏ 미만 또는 약 60000 PU/사료㎏ 미만으로 사료물질에 존재한다.
프로테아제는 약 200 PU/g 내지 약 400,000 PU/조성물g, 보다 바람직하게는 약 300 PU/조성물g 내지 약 200,000 PU/조성물g, 더욱 바람직하게는 약 5000 PU/조성물g 내지 약 100,000 PU/조성물g, 더욱 더 바람직하게는 약 700 PU/조성물g 내지 약 70,000 PU/조성물g, 보다 더 바람직하게는 약 1000 PU/조성물g 내지 약 60,000 PU/조성물g 범위로 사료 첨가제 조성물에 존재할 수 있다.
다른 양태에서, 프로테아제는 약 200 PU/조성물g 초과 또는 약 300 PU/조성물g 초과 또는 약 400 PU/조성물g 초과 또는 약 500 PU/조성물g 초과 또는 약 750 PU/조성물g 초과 또는 약 1000 PU/조성물g 초과로 사료 첨가제 조성물에 존재한다.
다른 양태에서, 프로테아제는 약 400,000 PU/조성물g 미만 또는 약 200,000 PU/조성물g 미만 또는 약 100,000 PU/조성물g 미만 또는 약 80,000 PU/조성물g 미만 또는 약 70000 PU/조성물g 미만 또는 약 60000 PU/조성물g 미만으로 사료 첨가제 조성물에 존재한다.
1 프로테아제 단위(PU)는 50℃에서 pH 10.0에서 1분 당 카제인 기질로부터 2.3 마이크로그램의 페놀계 화합물(티로신 당량으로 표현됨)을 방출하는 효소의 양인 것이 이해될 것이다. 이는 1 PU의 결정을 위한 검정으로 나타낼 수 있다.
이론에 구애받고자 하지 않고, 프로테아제는 식이 단백질의 비-특이적 가수분해를 유도하여 장 관강에서 다양한 폴리펩타이드를 산출한다. 동물은 단백질 가수분해를 끝내고 이러한 아미노산을 흡수한다. 그러나, 장 병원성 유발접종의 경우, 병원성 박테리아는 공장 및 회장의 관강에서의 더 높은 펩타이드 이용 가능성을 이용할 수 있다. DFM(들)은 예를 들어 N 원천에 대해 경쟁함으로써 뿐만 아니라 직접적 억제에 의해 장-병원체의 성장을 억제한다.
본원에서 교시되는 하나 이상의 박테리아를 포함하는 DFM 및 적어도 하나의 프로테아제의 특정 조합은 유리하게는 감소된 뮤신 분비로 이어질 수 있다. 이러한 감소된 뮤신 분비는 내인성 아미노산 손실의 감소를 일으킬 수 있고/있거나 개선된 퍼포먼스에 관여될 수 있는 것으로 여겨진다.
본원에서 교시되는 하나 이상의 박테리아를 포함하는 DFM 및 적어도 하나의 프로테아제의 특정 조합은 유리하게는 회장에서의 염증을 감소시킬 수 있다. 이는 회장에서 인터페론 감마(IFN 감마) 발현의 하향조절에 의해 나타날 수 있다.
본원에 기재되는 사료 첨가제 조성물은 직접 섭취 미생물(DFM)로 동물에게 섭취될 수 있다. 하나 이상의 담체(들) 또는 다른 구성성분이 DFM에 첨가될 수 있다. DFM은 다양한 물리적 형태로, 예를 들어, 상부 드레싱으로서, 액체 드렌치로 사용하기 위한 또는 우유 대체제, 젤라틴 캡슐, 또는 겔에 첨가될 수용성 농축물로 제공될 수 있다. 상부 드레싱 형태의 하나의 구현예에서, 냉동-건조된 발효 산물은 담체, 예컨대 유장, 말토덱스트린, 수크로스, 덱스트로스, 석회암(탄산칼슘), 쌀 겨, 효모 배양물, 건조된 전분, 및/또는 나트륨 실리코 알루미네이트에 첨가된다. 액체 드렌치 또는 우유 대체제 보충물질을 위한 수용성 농축물의 하나의 구현예에서, 냉동-건조된 발효 산물은 수용성 담체, 예컨대 유장, 말토덱스트린, 수크로스, 덱스트로스, 건조된 전분, 나트륨 실리코 알루미네이트에 첨가되며, 액체가 첨가되어 드렌치를 형성하거나 보충물질이 우유 또는 우유 대체제에 첨가된다. 젤라틴 캡슐 형태의 하나의 구현예에서, 냉동-건조된 발효 산물은 담체, 예컨대 유장, 말토덱스트린, 당, 석회암(탄산칼슘), 쌀 겨, 효모 배양물, 건조된 전분, 및/또는 나트륨 실리코 알루미네이트에 첨가된다. 하나의 구현예에서, 박테리아 및 담체는 분해성 젤라틴 캡슐에 봉입된다. 겔 형태의 하나의 구현예에서, 냉동-건조된 발효 산물은 담체, 예컨대 식물 오일, 수크로스, 이산화규소, 폴리소르베이트 80, 프로필렌 글리콜, 부틸화 하이드록시아니솔, 시트르산, 에톡시퀸, 및/또는 인공 착색제에 첨가되어 겔을 형성한다.
DFM(들)은 비제한적으로 성장 기질, 효소, 당류, 탄수화물, 추출물 및 성장 촉진 미량-구성성분을 포함하는 첨가제의 건조 제형물과 선택적으로 혼합될 수 있다. 당류는 락토스; 말토스; 덱스트로스; 말토-덱스트린; 글루코스; 프룩토스; 만노스; 타가토스; 소르보스; 라피노스; 및 갈락토스를 포함할 수 있다. 당류는 개별적으로 또는 조합되어 50~95% 범위이다. 추출물은 5~50% 범위의 효모 또는 건조된 효모 발효 가용분을 포함할 수 있다. 성장 기질은 5~25% 범위의 트립티카제; 5~30% 범위의 락트산나트륨; 및 1~5% 범위의 Tween 80을 포함할 수 있다. 탄수화물은 만니톨, 소르비톨, 아도니톨 및 아라비톨을 포함할 수 있다. 탄수화물은 개별적으로 또는 조합되어 5~50% 범위이다. 미량-구성성분은 0.5~5.0% 범위의 탄산칼슘; 0.5~5.0% 범위의 염화칼슘; 0.5~5.0% 범위의 인산이칼륨; 0.5~5.0% 범위의 인산칼슘; 0.25~1.00% 범위의 프로틴산망간; 및 0.25~1.0% 범위의 망간을 포함할 수 있다.
하나 이상의 박테리아 균주를 포함하는 DFM 및 적어도 하나의 프로테아제는 제형물이 생활성 DFM 및 적어도 하나의 활성 프로테아제를 포함하도록 보장하는 임의의 적합한 방식으로 제형화될 수 있다. 하나의 구현예에서 하나 이상의 박테리아 균주를 포함하는 DFM 및 적어도 하나의 프로테아제는 액체, 건조 분말 또는 과립으로 제형화될 수 있다.
건조 분말 또는 과립은 당업자에게 공지된 수단에 의해, 예컨대 상부-분무 유동층 코팅장치에서, 하부 분무 부르스터(Wurster)에서 또는 드럼 제립(예컨대 고전단 제립), 압출, 팬 코팅에 의해 또는 미량구성성분 혼합장치에서 제조될 수 있다.
일부 구현예에 있어서, DFM 및/또는 적어도 하나의 프로테아제는 코팅, 예를 들어 캡슐화될 수 있다. 적합하게는 DFM 및 적어도 하나의 프로테아제는 동일한 코팅 내에 제형화되거나 동일한 캡슐 내에 캡슐화될 수 있다. 대안적으로, 1개 또는 2개 또는 3개 또는 4개의 효소는 동일한 코팅 내에 제형화되거나 동일한 캡슐 내에 캡슐화될 수 있고 DFM은 하나 이상의 또는 모든 효소와 별도의 코팅에 제형화될 수 있다.
일부 구현예에서, 예컨대 DFM이 내생포자를 생산할 수 있는 경우, DFM은 임의의 코팅 없이 제공될 수 있다. 이러한 경우, DFM 내생포자는 적어도 하나의 프로테아제와 단순 혼합될 수 있다. 후자의 경우, 적어도 하나의 프로테아제는 코팅, 예컨대 캡슐화될 수 있다.
하나의 구현예에서, 코팅은 효소, 예컨대 적어도 하나의 프로테아제를 열로부터 보호하며 열보호제로 간주될 수 있다.
다른 양태에서, 사료 첨가제 조성물은 WO2007/044968(TPT 과립으로 나타냄) 또는 WO1997/016076 또는 WO1992/012645(그 각각이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같은 건조 분말 또는 과립으로 제형화된다.
사료 첨가제 조성물은 이후 사료에 첨가되는 과립으로 제형화될 수 있고, 과립은 코어; 활성 제제; 및 적어도 하나의 코팅을 포함하며, 과립의 활성 제제는 a) 사료 펠렛화 공정, b) 증기-가열 사료 전처리 공정, c) 저장, d) 펠렛화되지 않은 혼합물에서 구성성분으로 저장, 및 e) 미량 미네랄, 유기산, 환원당, 비타민, 염화콜린, 및 산성 또는 염기성 사료 기재 혼합물 또는 사료 프리믹스를 생성하는 화합물로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 사료 기재 혼합물 또는 사료 프리믹스에서 구성성분으로 저장 중 하나 이상으로부터 선택되는 조건 후 적어도 50% 활성, 적어도 60% 활성, 적어도 70% 활성, 적어도 80% 활성을 보전한다.
과립에 대해 적어도 하나의 코팅은 과립의 적어도 55% w/w를 이루는 수분 수화 물질을 포함할 수 있고/있거나; 적어도 하나의 코팅은 2개의 코팅을 포함할 수 있다. 2개의 코팅은 수분 수화 코팅 및 수분 배리어 코팅일 수 있다. 일부 구현예에서, 수분 수화 코팅은 과립의 25% 내지 60% w/w일 수 있고 수분 배리어 코팅은 과립의 2% 내지 15% w/w일 수 있다. 수분 수화 코팅은 무기 염, 수크로스, 전분, 및 말토덱스트린으로부터 선택될 수 있고, 수분 배리어 코팅은 중합체, 고무, 유장 및 전분으로부터 선택될 수 있다. 사료 첨가제 조성물을 함유하는 사료는 사료 펠렛화 공정을 사용해서 생산될 수 있고 사료 전처리 공정은 적어도 30초 동안 70℃ 내지 95℃에서 최대 수 분 동안 85℃ 내지 95℃의 온도에서 수행될 수 있다.
사료 첨가제 조성물을 함유하는 사료는 약 30초 내지 최대 수 분 사이의 임의 기간 동안 85℃ 내지 95℃에서 수행될 수 있는 증기-가열 펠렛화 공정을 사용해서 생산될 수 있다.
일부 구현예에서, DFM(예컨대 DFM 내생포자)은 희석제, 예컨대 전분 분말, 석회암 등을 사용해서 희석될 수 있다.
하나의 구현예에서, 조성물은 소비에 적합한 액체 제형물이며, 바람직하게는 이러한 액체 소비물은 완충액, 염, 소르비톨 및/또는 글리세롤 중 하나 이상을 함유한다.
다른 구현예에서, 사료 첨가제 조성물은 담체 기재, 예컨대 분쇄 밀 상으로 효소(들)을 적용하여, 예컨대 분무하여 제형화될 수 있다.
하나의 구현예에서, 사료 첨가제 조성물은 프리믹스로 제형화될 수 있다. 단지 예로서, 프리믹스는 하나 이상의 사료 성분, 예컨대 하나 이상의 미네랄 및/또는 하나 이상의 비타민을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 하나 이상의 박테리아 균주를 포함하는 DFM 및/또는 적어도 하나의 프로테아제는 적어도 하나의 말토덱스트린, 석회암(탄산칼슘), 사이클로덱스트린, 밀 또는 밀 성분, 수크로스, 전분, Na2SO4, 활석, PVA, 소르비톨, 벤조에이트, 소르비에이트, 글리세롤, 수크로스, 프로필렌 글리콜, 1,3-프로판 디올, 글루코스, 파라벤, 염화나트륨, 시트레이트, 아세테이트, 포스페이트, 칼슘, 메타바이설파이트, 포르메이트 및 이의 혼합물로부터 선택되는 적어도 하나의 생리적으로 허용 가능한 담체와 제형화될 수 있다.
하나의 구현예에서 사료 첨가제 조성물 및/또는 프리믹스 및/또는 사료 또는 사료물질은 패키지화된다.
하나의 바람직한 구현예에서 사료 첨가제 조성물 및/또는 프리믹스 및/또는 사료 또는 사료물질은 백, 예컨대 종이 백에 패키지화된다.
대안적인 구현예에서 사료 첨가제 조성물 및/또는 프리믹스 및/또는 사료 또는 사료물질은 용기에 밀봉될 수 있다. 임의의 적합한 용기가 사용될 수 있다.
본원에 기재되는 사료 첨가제 조성물은 사료로서 사용되거나 또는 사료의 제조에 사용될 수 있다.
용어 "사료"는 용어 "사료물질"과 상호 교환적으로 사용된다. 본원에서 사용되는 용어 "사료물질(feedstuff)"은 하나 이상의 사료 첨가제 조성물이 첨가된 사료 물질(feed material)을 나타낸다.
사료는 용도 및/또는 적용 방식 및/또는 투여 방식에 따라 용액 형태로 또는 고체로 존재할 수 있다.
사료로서, 또는 사료, 예컨대 기능성 사료의 제조에 사용되는 경우, 본원에 기재되는 사료 첨가제 조성물은 영양적으로 허용 가능한 담체, 영양적으로 허용 가능한 희석제, 영양적으로 허용 가능한 부형제, 영양적으로 허용 가능한 아쥬반트, 영양적 활성 구성성분 중 하나 이상과 함께 사용될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 사료 첨가제 조성물은 사료 성분과 혼합되어 사료물질을 형성할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "사료 성분"은 사료물질의 전부 또는 일부를 의미한다. 사료물질의 일부는 사료물질의 하나의 구성분 또는 사료물질의 하나를 초과하는, 예컨대 2개 또는 3개 또는 4개 구성분을 의미할 수 있다. 하나의 구현예에서, 용어 "사료 성분"은 프리믹스 또는 프리믹스 구성분을 포괄한다.
바람직하게는, 사료는 마초, 또는 이의 프리믹스, 화합물 사료, 또는 이의 프리믹스일 수 있다. 하나의 구현예에서 사료 첨가제 조성물은 화합물 사료, 화합물 사료 성분 또는 화합물 사료의 프리믹스 또는 마초, 마초 성분, 또는 마초의 프리믹스와 혼합될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "마초"는 동물(스스로를 위해 이를 채집해야 하는 동물이 아님)에 제공되는 임의의 식품을 의미한다. 마초는 절단된 식물을 포괄한다.
용어 마초는 건초, 짚, 저장 목초, 압축 및 펠렛화 사료, 오일 및 혼합 배급사료, 및 또한 발아 곡물 및 콩류를 포함한다.
마초는 알팔파(lucerne), 보리, 버어즈푸트 트레포일(birdsfoot trefoil), 십자화과 채소(brassicas), 차우 모엘리어(Chau moellier), 케일, 평지씨(카놀라), 순무종 덩이줄기(rutabaga(swede)), 순무, 토끼풀, 유럽산 클로버종(alsike clover), 붉은 토끼풀, 지하 토끼풀, 흰 토끼풀, 풀(grass), 가짜 귀리 잡초, 김의털, 버뮤다 풀(Bermuda grass), 참새귀리(brome), 히스 풀(heath grass), 온습지 풀(자연 혼합된 온실 풀밭, 과수원 풀, 호밀 풀, 티모시-풀(Timothy-grass), 옥수수(maize), 기장, 귀리, 수수, 대두, 나무(나무-건초를 위한 전지 나무(pollard tree)의 어린 가지), 밀, 및 콩류로부터 선택되는 하나 이상의 식물로부터 수득될 수 있다.
용어 "화합물 사료"는 음식, 펠렛, 너트, 케이크 또는 크럼블 형태의 상업적 사료를 의미한다. 화합물 사료는 다양한 원료 및 첨가제로부터 배합될 수 있다. 이들 배합물은 대상이 되는 동물의 구체적 요건에 따라 제형화된다.
화합물 사료는 모든 1일 요구 영양소를 제공하는 완전 사료, 배급사료(단백질, 에너지)의 일부를 제공하는 농축물 또는 추가 미량영양소, 예컨대 미네랄 및 비타민만을 제공하는 보충물질일 수 있다.
화합물 사료에서 사용되는 주요 구성성분은 사료 곡물이며, 이는 옥수수, 대두, 수수, 귀리, 및 보리를 포함한다.
적합하게는 본원에서 나타내는 프리믹스는 미량구성성분, 예컨대 비타민, 미네랄, 화학 보존제, 항생제, 발효 산물, 및 다른 필수 구성성분으로 이루어진 조성물일 수 있다. 프리믹스는 보통 상업적 배급사료로 배합하기 적합한 조성물이다.
본원에 기재되는 임의의 사료물질은 a) 곡류, 예컨대 소형 곡물(예컨대, 밀, 보리, 호밀, 귀리 및 이의 조합) 및/또는 대형 곡물, 예컨대 옥수수 또는 수수; b) 곡류로부터의 부산물, 예컨대 옥수수 글루텐 음식, 증류 건조 곡물 가용분(DDGS), 밀 왕겨, 거친 밀가루, 밀 쇼트(shorts), 쌀 왕겨, 쌀 겨, 귀리 겨, 야자핵, 및 시트러스 펄프; c) 대두, 해바라기, 땅콩, 루핀, 완두, 누에콩, 목화, 카놀라, 어류 음식, 건조 혈장 단백질, 고기 및 뼈 음식, 감자 단백질, 유장, 코프라, 참깨와 같은 원천에서 수득된 단백질; d) 식물 및 동물 원천에서 수득된 오일 및 지방; e) 미네랄 및 비타민을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 사료 물질을 포함할 수 있다.
또한, 이러한 사료물질은 적어도 30중량%, 적어도 40중량%, 적어도 50중량% 또는 적어도 60중량%의 옥수수 및 대두 음식 또는 옥수수 및 전지 콩, 또는 밀 음식 또는 해바라기 음식을 함유할 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 사료물질은 고섬유질 사료물질을 제공하기 위해 적어도 하나의 고섬유질 사료 물질 및/또는 적어도 하나의 고섬유질 사료 물질의 적어도 하나의 부산물을 포함할 수 있다. 고섬유질 사료 물질의 예는 밀, 보리, 호밀, 귀리, 곡류로부터의 부산물, 예컨대 옥수수 글루텐 음식, 증류 건조 곡물 가용분(DDGS), 밀 왕겨, 거친 밀가루, 밀 쇼트, 쌀 왕겨, 쌀 겨, 귀리 겨, 야자핵, 및 시트러스 펄프를 포함한다. 일부 단백질원: 해바라기, 루핀, 누에콩 및 목화와 같은 원천에서 수득된 단백질도 고섬유질로 간주될 수 있다.
본원에 기재되는 사료는 펠렛, 너트 또는 (소) 케이크를 포함하는 화합물 사료 및 프리믹스; 농작물 또는 농작물 잔여물: 옥수수, 대두, 수수, 귀리, 보리, 옥수수 여물, 코프라(copra), 짚, 왕겨, 사탕무 폐기물; 어류 음식; 신선 절단 풀 및 다른 채집 식물; 살코기 및 뼈 음식; 당밀; 오일 케이크 및 프레스 케이크; 올리고당류; 보존 채집 식물: 건초 및 저장 목초; 해초; 전체 또는 분쇄, 제분 등에 의해 제조되는, 종자 및 곡물; 발아 곡물 및 콩류; 효모 추출물 중 하나 이상일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 사료는 또한 일부 구현예에서 애완동물 식품을 포괄한다. 애완동물 식품은 애완동물에 의한 소비를 위한 식물 또는 동물 물질, 예컨대 개 식품 또는 고양이 식품이다. 애완동물 식품, 예컨대 개 및 고양이 식품은 건조 형태, 예컨대 개를 위한 건조 식품, 또는 캔으로 만들어진 습식 형태일 수 있다. 고양이 식품은 아미노산 타우린을 함유할 수 있다.
용어 사료는 또한 일부 구현예에서 어류 식품을 포괄할 수 있다. 어류 식품은 보통 포획 어류의 우수한 건강을 유지하기 위해 필요한 다량 영양소, 미량 요소 및 비타민을 함유한다. 어류 식품은 플레이크, 펠렛 또는 정제 형태일 수 있다. 그 일부가 빠르게 가라앉는, 펠렛화된 형태가 종종 대형 어류 또는 하부 섭취 종을 위해 사용된다. 일부 어류 식품은 또한 관상용 어류의 색상을 인공적으로 증강시키기 위해 첨가제, 예컨대 베타 카로틴 또는 성 호르몬을 함유한다.
조류 사육처에서 그리고 애완 조류를 사육하기 위해 모두 사용되는 식품을 포함하는 조류 식품도 용어 "사료" 내에 포괄된다. 전형적으로 조류 식품은 다양한 종자를 포함하지만, 또한 지방(소 또는 양고기 지방)을 포괄할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "접촉되는"은 제품(예컨대 사료)에 대한 사료 첨가제 조성물의 간접적 또는 직접적 적용을 나타낸다. 사용될 수 있는 적용 방법의 예는, 비제한적으로 사료 첨가제 조성물을 포함하는 물질 중 제품의 처리, 사료 첨가제 조성물과 제품의 혼합에 의한 직접 적용, 제품 표면 상으로의 사료 첨가제 조성물의 분무 또는 사료 첨가제 조성물의 제조물 내로의 제품 침지를 포함한다.
이 사료 첨가제 조성물은 바람직하게는 제품(예컨대 사료물질)과 혼합된다. 대안적으로, 사료 첨가제 조성물은 사료물질의 에멀젼 또는 원료 구성성분에 포함될 수 있다.
일부 적용에 있어서, 영향을 받는/처리되는 제품의 표면 상에서 또는 이에 대하여 조성물을 이용 가능하게 만드는 것이 중요하다. 이것은 조성물이 다음의 유리한 특성: 퍼포먼스 이익 중 하나 이상을 부여할 수 있게 한다.
사료 첨가제 조성물은 제어되는 양의 DFM 및 효소로 제품(예컨대 사료물질 또는 사료물질의 원료 구성성분)을 점재시키고/시키거나, 코팅하고/하거나 함침시켜서 적용될 수 있다.
적어도 하나의 박테리아 균주를 포함하는 DFM 및 적어도 하나의 프로테아제는 동시에(예컨대 이들이 함께 혼합물에 있는 경우 또는 심지어 이들이 상이한 경로에 의해 전달되는 경우) 또는 순차적으로(예컨대 이들이 상이한 경로에 의해 전달될 수 있음) 사용될 수 있다. 하나의 구현예에서 바람직하게는 DFM 및 효소는 동시에 적용된다. 바람직하게는 적어도 하나의 박테리아 균주를 포함하는 DFM 및 적어도 하나의 프로테아제는 사료물질 또는 사료물질의 원료 구성성분에 전달되기 전에 혼합된다.
적어도 하나의 박테리아 균주를 포함하는 DFM 및 적어도 하나의 프로테아제는 적합한 농도로, 예를 들어 최종 사료 제품에서 약 2×103 CFU/사료g 내지 약 2×1011 CFU/사료g, 적합하게는 약 2×106 내지 약 1×1010, 적합하게는 약 3.75×107 CFU/사료g 내지 약 1×1010 CFU/사료g의 1일 용량을 제공하는 농도로 첨가될 수 있다.
바람직하게는, 사료 첨가제 조성물은 최대 약 70℃; 최대 약 85℃; 또는 최대 약 95℃의 열 처리에 열적으로 안정할 것이다. 열 처리는 약 30초 내지 수 분까지 수행될 수 있다. 용어 열적으로 안정한은 명시된 온도까지의 가열 전에 첨가제에 존재했던/활성이었던 효소 성분 및/또는 DFM의 적어도 약 50%가 이것이 실온으로 냉각된 후 여전히 존재함/활성임을 의미한다. 특히 바람직한 구현예에서, 사료 첨가제 조성물은 균질화되어 분말을 생산한다.
대안적으로, 사료 첨가제 조성물은 본원에 참조로 포함되는 WO2007/044968에 기재된 바와 같은 과립(TPT 과립으로 나타냄)으로 제형화된다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 사료 첨가제 조성물이 과립으로 제형화되는 경우, 과립은 단백질 코어 상에 코팅된 수화된 배리어 염을 포함한다. 이러한 염 코팅의 장점은 개선된 열-내성, 개선된 저장 안정성 및 다른 경우 적어도 하나의 프로테아제 및/또는 하나 이상의 박테리아 균주를 포함하는 DFM에 대한 유해한 효과를 갖는 다른 사료 첨가제에 대한 보호이다. 바람직하게는, 염 코팅을 위해 사용되는 염은 20℃에서 0.25 초과의 수 활성 또는 60% 초과의 일정한 습도를 갖는다. 바람직하게는, 염 코팅은 Na2SO4를 포함한다.
사료 첨가제 조성물을 함유하는 사료는 사료 펠렛화 공정을 사용하여 생산될 수 있다. 선택적으로, 펠렛화 단계는 펠렛의 형성 전에, 증기 처리, 또는 컨디셔닝 단계를 포함할 수 있다. 분말을 포함하는 혼합물은 컨디셔너, 예컨대 증기 주입을 포함하는 혼합장치에 배치될 수 있다. 혼합물은 컨디셔너에서 명시된 온도까지, 예컨대 60~100℃로 가열되며, 전형적인 온도는 70℃, 80℃, 85℃, 90℃ 또는 95℃일 것이다. 체류 시간은 수 초 내지 수 분 및 심지어 수 시간으로 변할 수 있다. 예컨대 5초, 10초, 15초, 30초, 1분, 2분, 5분, 10분, 15분, 30분 및 1시간.
본원에 개시되는 사료 첨가제 조성물은 임의의 적절한 사료 물질에 첨가하기에 적합한 것으로 이해될 것이다.
본원에서 사용되는 용어 사료 물질은 동물에 의해 소비될 기본 사료 물질을 나타낸다. 이는, 예를 들어, 적어도 하나 이상의 미가공 곡물, 및/또는 가공된 식물 및/또는 동물 물질, 예컨대 대두 음식 또는 뼈 음식을 포함할 수 있음이 추가로 이해될 것이다.
당업자에게는, 상이한 동물이 상이한 사료물질을 필요로 하며, 동물의 사육 목적에 따라, 심지어 동일한 동물이 상이한 사료물질을 필요로 할 수 있음이 이해될 것이다.
바람직하게는, 사료물질은 옥수수(maize 또는 corn), 밀, 보리, 라이밀, 호밀, 쌀, 타피오카, 수수, 및/또는 임의의 부산물뿐만 아니라 단백질 풍부 성분, 예컨대 대두 음식, 평지씨 음식, 카놀라 음식, 목화씨 음식, 해바라기씨 음식, 동물 부산물 음식 및 이의 혼합물을 포함하는 사료 물질을 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는, 사료물질은 동물 지방 및/또는 식물 오일을 포함할 수 있다.
선택적으로, 사료물질은 또한 추가 미네랄, 예컨대 칼슘 및/또는 추가 비타민을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 사료물질은 옥수수 대두 음식 믹스이다.
다른 양태에서 사료물질의 생산 방법이 제공된다. 사료물질은 전형적으로 원료 물질이 먼저 적합한 입자 크기로 분쇄된 후 적절한 첨가제와 혼합되는 사료 밀에서 생산된다. 이어서 사료물질은 곤죽사료(mash) 또는 펠렛으로 생산될 수 있다; 후자에는 전형적으로 온도가 목표 수준까지 상승된 후 사료가 다이를 통해 통과되어 특정한 크기의 펠렛을 생산하는 방법이 관여된다. 펠렛은 냉각되도록 방치된다. 이후 액체 첨가제, 예컨대 지방 및 효소가 첨가될 수 있다. 사료물질의 생산에는 또한 펠렛화 전에, 특히 적어도 증기의 사용을 포함할 수 있는 적합한 기법에 의한, 압출 또는 팽창을 포함하는 추가 단계가 관여될 수 있다.
사료물질은 단일 위 동물, 예컨대 가금(예를 들어, 구이용, 산란용, 구이용 종축, 칠면조, 오리, 거위, 물새), 돼지(모든 연령 범주), 애완동물(예를 들어 개, 고양이) 또는 어류를 위한 사료물질일 수 있으며, 바람직하게는 사료물질은 가금을 위한 것이다. 하나의 구현예에 사료물질은 산란용을 위한 것이 아니다.
단지 예로서, 닭, 예컨대 구이용 닭을 위한 사료물질은 아래의 표에 기재된 하나 이상의 구성성분을, 예를 들어 아래의 표에 주어진 백분율로 포함할 수 있다:
Figure pct00002
단지 예로서, 닭, 예컨대 구이용 닭을 위한 식이 사양은 아래의 표에 나타낸 바와 같을 수 있다:
Figure pct00003
단지 예로서, 산란용 암탉을 위한 사료물질은 아래의 표에 기재된 하나 이상의 구성성분을, 예를 들어 아래의 표에 주어진 백분율로 포함할 수 있다:
Figure pct00004
단지 예로서, 산란용 암탉을 위한 식이 사양은 아래의 표에 나타낸 바와 같을 수 있다:
Figure pct00005
단지 예로서, 칠면조를 위한 사료물질은 아래의 표에 기재된 하나 이상의 구성성분을, 예를 들어 아래의 표에 주어진 백분율로 포함할 수 있다:
Figure pct00006
단지 예로서, 칠면조를 위한 식이 사양은 아래의 표에 나타낸 바와 같을 수 있다:
Figure pct00007
단지 예로서, 새끼돼지를 위한 사료물질은 아래의 표에 기재된 하나 이상의 구성성분을, 예를 들어 아래의 표에 주어진 백분율로 포함할 수 있다:
Figure pct00008
단지 예로서, 새끼돼지를 위한 식이 사양은 아래의 표에 나타낸 바와 같을 수 있다:
Figure pct00009
단지 예로서, 사육용/도축용 돼지를 위한 사료물질은 아래의 표에 기재된 하나 이상의 구성성분을, 예를 들어 아래의 표에 주어진 백분율로 포함할 수 있다:
Figure pct00010
단지 예로서, 사육용/도축용 돼지를 위한 식이 사양은 아래의 표에 나타낸 바와 같을 수 있다:
Figure pct00011
본원에 기재되는 사료 첨가제 조성물 및 다른 성분 및/또는 이를 포함하는 사료물질은 임의의 적합한 형태, 예컨대, 고체 또는 액체 제조물 또는 이의 대안에서 사용될 수 있다. 고체 제조물의 예는 수화 가능하거나, 분무-건조되거나, 동결-건조될 수 있는 분말, 페이스트, 볼루스, 캡슐, 펠렛, 정제, 분진, 및 과립을 포함한다. 액체 제조물의 예는 비제한적으로 수성, 유기 또는 수성-유기 용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함한다.
일부 적용에서, 사료 첨가제 조성물은 사료와 혼합되거나 음용수에 투여될 수 있다. 하나의 구현예에서 물 내로의 혼입을 위한 투여량 범위는 약 1×103 CFU/동물/일 내지 약 1×1010 CFU/동물/일, 보다 바람직하게는 약 1×107 CFU/동물/일이다.
형태의 적합한 예는 즉시 방출 적용, 지연 방출 적용, 변형 방출 적용, 지속 방출 적용, 펄스형 방출 적용 또는 제어 방출 적용을 위한, 풍미제 또는 착색제를 함유할 수 있는, 분말, 페이스트, 볼루스, 펠렛, 정제, 알약, 캡슐, 포낭(ovule), 용액 또는 현탁액 중 하나 이상을 포함한다.
예로서, 본원에 기재되는 사료 첨가제 조성물이 고체 형태로 사용되는 경우, 이는 다음 중 하나 이상을 또한 함유할 수 있다: 부형제, 예컨대 미정질 셀룰로스, 락토스, 시트르산나트륨, 탄산칼슘, 제2인산칼슘 및 글리신; 붕해제, 예컨대 전분 (바람직하게는 옥수수, 감자 또는 타피오카 전분), 나트륨 전분 글리콜레이트, 크로스카르멜로스 나트륨 및 소정 복합 실리케이트; 과립화 결합제, 예컨대 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시프로필메틸셀룰로스(HPMC), 하이드록시프로필셀룰로스(HPC), 수크로스, 젤라틴 및 아카시아; 활택제, 예컨대 스테아르산마그네슘, 스테아르산, 글리세릴 베헤네이트 및 활석이 포함될 수 있다.
형태의 제조에 사용하기 위한 영양적으로 허용 가능한 담체의 예는, 예를 들어 물, 염 용액, 알코올, 실리콘, 왁스, 바셀린, 식물 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 리포좀, 당류, 젤라틴, 락토스, 아밀로스, 스테아르산마그네슘, 활석, 계면활성제, 규산, 점성 파라핀, 향유, 지방산 모노글리세라이드 및 디글리세라이드, 페트로에트랄(petroethral) 지방산 에스테르, 하이드록시메틸-셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈 등을 포함한다.
형태에 바람직한 부형제는 락토스, 전분, 셀룰로스, 유당 또는 고분자량 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.
수성 현탁액 및/또는 엘릭시르에 있어서, 사료 첨가제 조성물은 다양한 감미제 또는 풍미제, 착색 물질 또는 염료, 유화제 및/또는 현탁제, 및 희석제, 예컨대 물, 프로필렌 글리콜 및 글리세린, 및 이의 조합과 조합될 수 있다.
비흡습성 유장은 종종 DFM(특히 박테리아 DFM)을 위한 담체로서 사용되며 성장을 개시하기 위한 우수한 배지이다.
박테리아 DFM 함유 페이스트는 식물 오일 및 불활성 겔화 구성성분과 제형화될 수 있다.
진균 제품은 담체로서 곡물 부산물과 제형화될 수 있다.
하나의 구현예에서 바람직하게는 사료 첨가제 조성물은 마이크로입자 시스템, 예컨대 WO2005/123034에서 교시된 마이크로입자 시스템의 형태가 아니다.
DFM 및/또는 사료 첨가제 조성물은 1회 투여를 위해 설계될 수 있거나 1일 기준 사육을 위해 설계될 수 있다.
조합으로 사용되기 위한 사료 첨가제 조성물(및 내부의 각각의 성분)의 최적량은 처리될 제품 및/또는 제품과 조성물의 접촉 방법 및/또는 이에 대해 의도되는 용도에 의존할 것이다.
조성물에서 사용되는 DFM 및 효소의 양은 상기 조성물을 함유하는 동물 섭취 사료 제품의 퍼포먼스 개선에서 유효하고 충분히 유효하게 유지되는 충분량이어야 한다. 이러한 유효성에 대한 시간 길이는 적어도 제품(예컨대 사료 첨가제 조성물 또는 이를 함유하는 사료)의 이용 시간까지 연장되어야 한다.
본원에 기재되는 사료 첨가제 조성물은 동물 소비에 적합하며 소비자에 대해 의학적 또는 생리적 이익을 제공할 수 있는 (또는 이의 하나 이상의 구성분) 및 다른 성분과 조합될 수 있다.
하나의 구현예에서 바람직하게는 "다른 성분"은 추가 효소 또는 추가 DFM이 아니다.
성분은 프리바이오틱스일 수 있다. 프리바이오틱스는 전형적으로 상부 소화관에서 분해되지 않거나 흡수되지 않는 소화-불가능한 탄수화물(올리고당류 또는 다당류) 또는 당 알코올이다. 상업적 제품에서 사용되고 유용한 공지된 프리바이오틱스는 이눌린(프룩토-올리고당, 또는 FOS) 및 트랜스갈락토-올리고당류(GOS 또는 TOS)를 포함한다. 적합한 프리바이오틱스는 팔라티노스올리고당, 대두 올리고당, 알기네이트, 잔탄, 펙틴, 로커스트 빈 고무(LBG), 이눌린, 구아 검, 갈락토-올리고당(GOS), 프룩토-올리고당(FOS), 비분해성 전분, 락토사카로스, 락툴로스, 락티톨, 말티톨, 말토덱스트린, 폴리덱스트로스(즉 Litesse®), 락티톨, 락토수크로스, 대두 올리고당류, 팔라티노스, 이소말토-올리고당류, 글루코-올리고당류 및 자일로-올리고당류, 펙틴 단편, 식이 섬유, 만난-올리고당류를 포함한다.
식이 섬유는 비-전분 다당류, 예컨대 아라비노자일란, 셀룰로스 및 여러 다른 식물 성분, 예컨대 저항성 덱스트린, 이눌린, 리그닌, 왁스, 키틴, 펙틴, 베타-글루칸 및 올리고당류를 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 프리바이오틱과 사료 첨가제 조성물(또는 이의 하나 이상의 구성분)의 조합이 본원에 개시된다. 프리바이오틱은 사료 첨가제 조성물(또는 이의 구성분)과 동시에(예컨대 함께 혼합물로 또는 동일하거나 상이한 경로에 의해 동시 전달되어) 또는 순차적으로(예컨대 동일하거나 상이한 경로에 의해) 투여될 수 있다.
조합의 다른 성분은 폴리덱스트로스, 예컨대 Litesse®, 및/또는 말토덱스트린 및/또는 락티톨을 포함한다. 이러한 다른 성분은 사료 첨가제 조성물에 선택적으로 첨가되어 건조 공정을 보조하고 DFM의 생존을 도울 수 있다.
다른 적합한 성분의 추가의 예는 증점제, 겔화제, 유화제, 결합제, 결정 변형제, 감미제(인공 감미제를 포함함), 레올로지(rheology) 변형제, 안정제, 산화방지제, 염료, 효소, 담체, 비히클, 부형제, 희석제, 활택제, 풍미제, 착색 물질, 현탁제, 붕해제, 제립 결합제 등 중 하나 이상을 포함한다. 이러한 다른 성분은 천연일 수 있다. 이러한 다른 성분은 화학적 및/또는 효소적 기법의 사용에 의해 제조될 수 있다.
하나의 구현예에서, 적어도 하나의 박테리아 균주를 포함하는 DFM 및/또는 적어도 하나의 프로테아제는 캡슐화될 수 있다. 하나의 구현예에서, 사료 첨가제 조성물 및/또는 DFM 및/또는 효소는, 본원에 참조로 포함되는 참고문헌인 WO2007/044968에 기재되는 건조 분말 또는 과립(TPT 과립으로 나타냄)으로 제형화된다.
하나의 바람직한 구현예에서, 적어도 하나의 박테리아 균주를 포함하는 DFM 및/또는 적어도 하나의 프로테아제는 하나 이상의 지질과의 조합으로 사용될 수 있다.
예를 들어, 적어도 하나의 박테리아 균주를 포함하는 DFM 및/또는 적어도 하나의 프로테아제는 하나 이상의 지질 마이셀과의 조합으로 사용될 수 있다. 지질 마이셀은 단순 지질 마이셀 또는 복합 지질 마이셀일 수 있다. 지질 마이셀은 양쪽성 성분, 예컨대 지질 및/또는 오일의 배향 분자의 응집물일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "증점제 또는 겔화제"는 불혼화성 액체의 소적, 공기 또는 불용성 고체 중 어느 하나인 입자의 이동을 늦추거나 방지함으로써 분리를 방지하는 제품을 나타낸다. 증점은 개별 수화 분자가 점도의 증가를 야기하여서 분리를 늦출 때 일어난다. 겔화는 수화 분자가 결합되어 입자를 포획하는 3차원 네트워크를 형성함으로써 입자를 고정시킬 때 일어난다.
본원에서 사용되는 용어 "안정제"는 제품(예를 들어, 사료 제품)이 시간이 지나도 변화하지 않게 하는 구성성분 또는 구성성분의 조합으로 정의된다.
본원에서 사용되는 용어 "유화제"는 에멀젼의 분리를 방지하는 구성성분(예를 들어, 사료 구성성분)을 나타낸다. 에멀젼은 2가지 불혼화성 물질이며, 하나가 소적 형태로 존재하고 다른 것 내에 함유된 것이다. 에멀젼은 소적 또는 분산 상이 오일이고 연속 상이 물인 수중유; 또는 물이 분산 상이 되고 연속 상이 오일인 유중수로 구성될 수 있다. 액체중기체인 폼, 및 액체중고체인 현탁물이 또한 유화제의 사용을 통하여 안정화될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "결합제"는 물리적 또는 화학적 반응을 통하여 제품을 함께 결합시키는 구성성분(예를 들어, 사료 구성성분)을 나타낸다. 예를 들어 "겔화" 동안, 물이 흡수되어 결합 효과를 제공한다. 그러나, 결합제는 다른 액체, 예컨대 오일을 흡수하여 이를 제품 내에 유지할 수 있다. 결합제는 전형적으로 고체 또는 저-수분 제품, 예를 들어 제빵 제품: 페스트리, 도넛, 빵 등에서 사용될 것이다.
"담체" 또는 "비히클"은 DFM 및/또는 효소의 투여에 적합한 물질을 의미하며, 당분야에 공지된 임의의 이러한 물질, 예를 들어, 비-독성이며 조성물의 임의의 성분과도 해로운 방식으로 상호작용하지 않는 임의의 액체, 겔, 용매, 액체 희석제, 가용화제 등을 포함한다.
부형제의 예는 미정질 셀룰로스 및 기타 셀룰로스, 락토스, 시트르산나트륨, 탄산칼슘, 제2인산칼슘, 글리신, 전분, 유당 및 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 중 하나 이상을 포함한다.
붕해제의 예는 전분(바람직하게는 옥수수, 감자 또는 타피오카 전분), 나트륨 전분 글리콜레이트, 크로스카르멜로스 나트륨 및 소정 복합 실리케이트 중 하나 이상을 포함한다.
제립 결합제의 예는 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시프로필메틸셀룰로스(HPMC), 하이드록시프로필셀룰로스(HPC), 수크로스, 말토스, 젤라틴 및 아카시아 중 하나 이상을 포함한다.
활택제의 예는 스테아르산마그네슘, 스테아르산, 글리세릴 베헤네이트 및 활석 중 하나 이상을 포함한다.
희석제의 예는 물, 에탄올, 프로필렌 글리콜 및 글리세린, 및 이의 조합 중 하나 이상을 포함한다.
다른 성분들이 동시에(예를 들어, 이들이 함께 혼합물에 존재하거나 심지어 이들이 상이한 경로로 전달될 때에도) 또는 순차적으로(예를 들어, 이들은 상이한 경로에 의해 전달될 수 있음) 사용될 수 있다.
바람직하게는, 사료 첨가제 조성물이 다른 성분(들)과 혼합되는 경우, 적어도 하나의 박테리아 균주를 포함하는 DFM은 생활성으로 유지된다.
하나의 구현예에서 바람직하게는 사료 첨가제 조성물은 크롬 또는 유기 크롬을 포함하지 않는다.
하나의 구현예에서, 바람직하게는 사료 첨가제는 글루카나제를 함유하지 않는다.
다른 구현예에서, 바람직하게는 사료 첨가제는 소르브산을 함유하지 않는다.
적어도 하나의 박테리아 균주를 포함하는 DFM(들)은 농축물의 형태일 수 있다. 전형적으로 이러한 농축물은 실질적으로 고농도의 DFM을 포함한다.
본원에 기재되는 사료 첨가제 조성물은 적어도 103 CFU/g(적합하게는 적어도 105 CFU/g, 예컨대 적어도 106 CFU/g, 예컨대 적어도 107 CFU/g, 적어도 108 CFU/g, 예컨대 적어도 109 CFU/g) 내지 약 1010 CFU/g(또는 심지어 약 1011 CFU/g 또는 약 1012 CFU/g 포함) 범위인 생활성 세포 함량(콜로니 형성 단위, CFU)을 가질 수 있다.
DFM이 농축물의 형태인 경우, 사료 첨가제 조성물은 적어도 109 CFU/g 내지 약 1012 CFU/g, 바람직하게는 적어도 1010 CFU/g 내지 약 1012 CFU/g 범위의 생활성 세포 함량을 가질 수 있다.
농축물 형태의 분말, 과립 및 액체 조성물은 물로 희석되거나 물 또는 다른 적합한 희석제, 예를 들어 적절한 성장 배지, 예컨대 우유 또는 미네랄 또는 식물 오일에 재현탁되어 사용 준비가 된 조성물을 제공할 수 있다.
사료 첨가제 조성물은 당분야에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있는 농축물의 형태일 수 있다. 본원에 기재되는 사료 첨가제 조성물은 당분야에 공지된 방법에 의해 분무-건조되거나 동결-건조될 수 있다.
분무 건조 공정을 사용한 전형적인 입자 제조 공정에는 적절한 용매에 용해되는 고체 물질(예를 들어, 발효 배지 중 DFM의 배양물)이 관여된다. 대안적으로, 이 물질은 비-용매에 현탁되거나 유화되어 현탁물 또는 에멀젼을 형성할 수 있다. 다른 구성성분(상기에 논의된 바와 같음) 또는 성분, 예컨대 항미생물제, 안정제, 염료 및 건조 공정을 보조하는 제제가 이 단계에서 선택적으로 첨가될 수 있다.
그 후, 용액은 미세분무되어 소적의 미세 미스트(mist)를 형성한다. 소적은 즉각적으로 건조 챔버에 유입되며, 여기서 이들은 건조 기체와 접촉한다. 용매를 소적으로부터 건조 기체 내로 증발시켜 소적을 고형화함으로써 입자를 형성한다. 그 후 입자는 건조 기체로부터 분리되고, 수집된다.
본원에서 사용되는 용어 "대상체"는 사료 첨가제 조성물 또는 상기 사료 첨가제 조성물을 포함하는 사료물질이 투여될 또는 투여된 동물을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "대상체"는 동물을 의미한다. 바람직하게는, 대상체는 가축 또는 가축화된 동물(예컨대 애완동물)을 포함하는 포유류, 조류, 어류 또는 갑각류이다.
하나의 구현예에서 대상체는 장 병원체에 의해 유발접종될 수 있다.
예로서, 대상체는 그 내장 또는 소화관에 존재하는 하나 이상의 장 병원체를 가질 수 있다. 예를 들어 대상체는 다음과 같은 수준으로 그 내장 또는 소화관에 존재하는 하나 이상의 장 병원체를 가질 수 있다:
i) 동물의 퍼포먼스 손실을 일으킴; 및/또는
ii) 임상적으로 관련된 수준임; 또는
iii) 임상 수준-미만임.
장 병원체는 예를 들어 클로스트리듐 퍼프링겐스일 수 있다.
본원에서 사용되는 "동물 퍼포먼스"는 사료 효율 및/또는 동물의 체중 증가에 의해 및/또는 사료 전환 비율에 의해 및/또는 사료 중 영양소 소화력(예컨대 아미노산 소화력) 및/또는 사료 중 소화 가능한 에너지 또는 대사 가능한 에너지에 의해 및/또는 질소 보유에 의해 및/또는 동물이 괴사성 장염의 부정적 효과를 회피하는 능력에 의해 및/또는 대상체의 면역 반응에 의해 결정될 수 있다.
바람직하게는 "동물 퍼포먼스"는 사료 효율 및/또는 동물의 체중 증가에 의해 및/또는 사료 전환 비율에 의해 결정된다.
"개선된 동물 퍼포먼스"란 사료 첨가제 조성물을 포함하지 않는 사료에 비해 사료 중 상기 사료 첨가제 조성물의 사용으로 생성되는 증가된 사료 효율 및/또는 증가된 체중 증가 및/또는 감소된 사료 전환 비율 및/또는 개선된 사료 중 영양소 또는 에너지 소화력 및/또는 개선된 질소 보유 및/또는 괴사성 장염의 부정적 효과를 회피하는 개선된 능력 및/또는 대상체의 개선된 면역 반응이 존재함을 의미한다.
바람직하게는 "개선된 동물 퍼포먼스"란 증가된 사료 효율 및/또는 증가된 체중 증가 및/또는 감소된 사료 전환 비율이 존재함을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "사료 효율"은 동물에 일정 시기 동안 식품을 자유롭게 또는 특정된 양으로 섭취시키는 경우 일어나는 동물에서의 체중 증가량을 나타낸다.
"증가된 사료 효율"이란 사료 중 사료 첨가제 조성물의 사용이 상기 사료 첨가제 조성물이 존재하지 않고 섭취시킨 동물에 비해 사료 섭취 단위 당 증가된 체중 증가를 일으킴을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "사료 전환 비율"은 특정된 양만큼 동물의 체중을 증가시키기 위해 동물에게 섭취시킨 사료의 양을 나타낸다.
개선된 사료 전환 비율은 더 낮은 사료 전환 비율을 의미한다.
"더 낮은 사료 전환 비율" 또는 "개선된 사료 전환 비율"이란 사료 중 사료 첨가제 조성물의 사용으로 사료가 상기 사료 첨가제 조성물을 포함하지 않는 경우 특정된 양만큼 동물의 체중을 증가시키기 위해 필요한 사료의 양에 비해 동일한 양만큼 동물의 체중을 증가시키기 위해 동물에게 섭취시켜야 하는 사료의 양이 더 낮아지는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 영양소 소화력은 위장관으로부터 또는 위장관의 특정 절편, 예컨대 소장으로부터 사라지는 영양소의 분율을 의미한다. 영양소 소화력은 대상체에 투여되는 것과 대상체 대변에서 나오는 것 간, 또는 대상체에 투여되는 것과 위장관의 특정 절편, 예컨대 회장 상의 소화액에 남아있는 것 간 차이로 측정될 수 있다.
본원에서 사용되는 영양소 소화력은 영양소의 섭취 및 일정 시기 동안 전체 배설물 수집에 의한 배출 영양소 간 차이에 의해; 또는 동물에 의해 흡수되지 않고 연구자가 전체 위장관 또는 위장관의 절편에서 사라지는 영양소의 양을 계산할 수 있게 해주는 불활성 마커의 사용으로 측정될 수 있다. 이러한 불활성 마커는 이산화티탄, 산화크롬 또는 산 불용성 재(ash)일 수 있다. 소화력은 사료 중 영양소의 백분율로, 또는 사료 중 영양소의 질량 단위 당 소화 가능한 영양소의 질량 단위로 표현될 수 있다.
본원에서 사용되는 영양소 소화력은 전분 소화력, 지방 소화력, 단백질 소화력, 및 아미노산 소화력을 포괄한다.
본원에서 사용되는 에너지 소화력은 소비되는 사료의 총 에너지 - 대변의 전체 에너지 또는 소비되는 사료의 총 에너지 - 동물의 위장관의 특정 절편, 예컨대 회장 상에 남아 있는 소화액의 총 에너지를 의미한다.
본원에서 사용되는 대사 가능한 에너지는 겉보기 대사 가능한 에너지를 나타내며, 소비된 사료의 총 에너지 - 소화의 대변, 소변, 및 기체성 생성물에 함유된 총 에너지를 의미한다. 에너지 소화력 및 대사 가능한 에너지는 사료의 대사 가능한 에너지를 계산하기 위해 질소 배출에 대한 적절한 보정을 포함하여, 영양소의 소화력을 측정하기 위한 것과 동일한 방법을 사용하여 총 에너지 섭취 및 대변 또는 위장관의 특정 절편에 존재하는 소화액에 배출된 총 에너지 간 차이로 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 사료 첨가제 조성물은 대상체에서 식이 헤미셀룰로스 또는 섬유의 소화력 또는 이용을 개선할 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 돼지이다.
본원에서 사용되는 질소 보유는 식이로부터의 질소를 신체 물질로 보유하는 대상체의 능력을 의미한다. 질소 배출이 1일 섭취를 초과하는 경우 음의 질소 균형이 발생하며 근육이 소실되고 있을 때 종종 나타난다. 양의 질소 균형은 특히 성장기 동물에서, 근육 성장과 종종 연관된다. 질소 보유는 질소 섭취 및 일정 시기 동안 배설물 및 소변의 전체 수집에 의해 배출된 질소 간 차이로 측정될 수 있다. 배출된 질소는 사료로부터 소화되지 않은 단백질, 내인성 단백질성 분비, 미생물 단백질, 및 소변 질소를 포함하는 것으로 이해된다.
본원에서 사용되는 용어 "생존"은 생존한 채 유지되는 대상체의 수를 의미한다. 용어 "개선된 생존"은 "감소된 사망률"의 다른 표현 방식일 수 있다.
본원에서 사용되는 "날고기 수율"은 상업적 또는 실험적 도축 공정 후, 날고기의 살아있는 체중의 비로서의 양을 의미한다. 용어 날고기는 두부, 창자, 다리의 일부, 및 깃털 또는 피부가 제거된, 식품을 위해 도축된 동물의 신체를 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "살코기 수율"은 식용 가능한 살코기의 살아있는 체중의 비로서의 양, 또는 절단된 특정 살코기의 살아있는 체중의 비로서의 양을 의미한다.
본 구현예는 추가로 대상체, 예컨대 가금 또는 돼지에서 체중 증가를 증가시키는 방법으로서, 사료 첨가제 조성물을 포함하는 사료물질로 상기 대상체를 사육하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
"증가된 체중 증가"는 사료 첨가제 조성물이 존재하지 않는 사료를 섭취시키고 있는 동물에 비해 상기 사료 첨가제 조성물을 포함하는 사료를 섭취시키고 있는 증가된 체중을 갖는 동물을 나타낸다.
본원에서 사용되는 면역 반응은 DFM이 증가된 항체 생산, 세포 매개 면역성의 상향-조절, 전-염증성 사이토카인의 상향-조절, 및 강화된 toll-유사 수용체 신호전달을 포함하여 동물의 면역계를 조정하는 여러 방식 중 하나를 의미한다. DFM에 의한 위장관의 면역-촉진은 질환에 대해 숙주를 보호하는 데 유리할 수 있고, 위장관의 면역-억제는 더 적은 영양소 및 에너지가 면역 기능을 뒷받침하기 위해 사용되므로 숙주에 대해 유리할 수 있는 것으로 이해된다.
바람직하게는 면역 반응은 면역 마커를 탐색함으로써 측정될 수 있는 세포성 면역 반응이다. 다른 양태에서, 대상체의 위장관에서 병원체의 모집단이 감소될 수 있다.
하나의 구현예에서, 동물거름에서의 영양소 배출 감소, 또는 동물거름에서의 암모니아 생산 감소가 달성될 수 있다. 이는 환경적 유해요소의 감소에 긍정적 효과를 갖는다. 예를 들어, 바람직한 구현예에서, 대상체의 동물거름에서 질소 및/또는 인 함량의 감소 방법이 개시된다. 따라서, 이는 환경에서의 질소 및/또는 인의 양을 감소시키며, 유익할 수 있다. 일부 적용에 있어서, 본원에 기재되는 사료 첨가제 조성물에 적어도 하나의 박테리아 균주를 포함하는 DFM은 프로바이오틱 배양 효과를 일으킬 수 있는 것으로 여겨진다. 또한 이 사료 첨가제 조성물에 추가의 프로바이오틱 및/또는 프리바이오틱스를 첨가할 수 있다.
본원에 개시된 조성물 및 방법의 비제한적 예는 다음을 포함한다:
1. 적어도 하나의 프로테아제와의 조합으로 하나 이상의 박테리아 균주를 포함하는 직접 섭취 미생물로 본질적으로 구성되는 사료 첨가제 조성물.
2. 구현예 1에 있어서, 직접 섭취 미생물이 항병원체 직접 섭취 미생물인 사료 첨가제 조성물.
3. 구현예 1 또는 2에 있어서, 직접 섭취 미생물이 락토바실러스, 락토코커스, 스트렙토코커스, 바실러스, 페디오코커스, 엔테로코커스, 류코노스톡, 카르노박테리움, 프로피오니박테리움, 비피도박테리움, 클로스트리듐 및 메가스패라 그리고 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 3개의 박테리아 균주를 포함하는 사료 첨가제 조성물.
4. 구현예 3에 있어서, 직접 섭취 미생물이 바실러스 서브틸리스, 바실러스 리케니포르미스, 바실러스 푸밀러스, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스, 엔테로코커스, 엔테로코커스 종, 및 페디오코커스 종, 락토바실러스 종, 비피도박테리움 종, 락토바실러스 애시도필러스, 페디오코커스 애시디락티시, 락토코커스 락티스, 비피도박테리움 비피덤, 프로피오니박테리움 토에니이, 락토바실러스 파르시미너스, 락토바실러스 람노서스, 클로스트리듐 부티리컴, 비피도박테리움 애니말리스 종 애니말리스, 락토바실러스 류테리, 바실러스 세레우스, 락토바실러스 살리바리우스 종 살리바리우스, 메가스패라 엘스데니이, 프로피오니박테리아 종 및 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 3개의 박테리아 균주를 포함하는 사료 첨가제 조성물.
5. 구현예 1, 2 또는 4 중 어느 하나에 있어서, 직접 섭취 미생물이 바실러스 서브틸리스 균주 3BP5(NRRL B-50510); 918(NRRL B-50508), 및 1013(NRRL B-50509)을 포함하는 사료 첨가제 조성물.
6. 구현예 1, 2 또는 4 중 어느 하나에 있어서, 직접 섭취 미생물이 내생포자의 형태인 사료 첨가제 조성물.
7. 구현예 5에 있어서, 직접 섭취 미생물이 내생포자의 형태인 사료 첨가제 조성물.
8. 구현예 1, 2, 4 또는 7 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제가 서브틸리신, 바실로라이신, 알칼리성 세린 프로테아제, 케라티나제 또는 노카르디옵시스 프로테아제인 사료 첨가제 조성물.
9. 구현예 6에 있어서, 프로테아제가 서브틸리신, 바실로라이신, 알칼리성 세린 프로테아제, 케라티나제 또는 노카르디옵시스 프로테아제인 사료 첨가제 조성물.
10. 구현예 1, 2, 4 또는 7 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제가 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 유래 서브틸리신인 사료 첨가제 조성물.
11. 구현예 6에 있어서, 프로테아제가 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 유래 서브틸리신인 사료 첨가제 조성물.
12. 구현예 1, 2, 4 또는 7 중 어느 하나에 있어서, 프로테아제가 1000 PU/사료 첨가제 조성물g 내지 200,000 PU/사료 첨가제 조성물g의 투여량으로 존재하는 사료 첨가제 조성물.
13. 구현예 6에 있어서, 프로테아제가 1000 PU/사료 첨가제 조성물g 내지 200,000 PU/사료 첨가제 조성물g의 투여량으로 존재하는 사료 첨가제 조성물.
14. 구현예 1, 2, 4 또는 7 중 어느 하나에 있어서, DFM이 1×103 CFU/사료 첨가제 조성물g 내지 1×1013 CFU/사료 첨가제 조성물g의 투여량으로 존재하는 사료 첨가제 조성물.
15. 구현예 6에 있어서, DFM이 1×103 CFU/사료 첨가제 조성물g 내지 1×1013 CFU/사료 첨가제 조성물g의 투여량으로 존재하는 사료 첨가제 조성물.
16. 대상체의 퍼포먼스 개선 방법 또는 사료에서 원료의 소화력(예컨대 영양소 소화력, 예컨대 아미노산 소화력) 개선 방법, 또는 질소 보유 개선 방법, 또는 괴사성 장염에 대한 대상체의 저항성 개선 방법 또는 사료 전환 비율(FCR) 개선 방법 또는 날고기 또는 살코기 수율 증가 방법 또는 대상체에서 체중 증가 개선 방법 또는 대상체에서 사료 효율 개선 방법 또는 대상체의 면역 반응 조정(예컨대 개선) 방법, 또는 대상체의 위장관에서 유익한 박테리아의 성장 촉진 방법 또는 대상체의 위장관에서 병원성 박테리아 모집단 감소 방법, 또는 동물거름에서 영양소 배출 감소 방법, 또는 동물거름에서 암모니아 생산 감소 방법, 또는 식이 헤미셀룰로스 또는 섬유의 소화력 또는 이용 개선 방법으로서, 적어도 하나의 프로테아제와의 조합으로 하나 이상의 박테리아 균주를 포함하는 직접 섭취 미생물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
17. 구현예 1의 사료 첨가제 조성물 및 투여 지침을 포함하는 키트.
18. 사료 첨가제 조성물의 제조 방법으로서, 적어도 하나의 프로테아제와의 조합으로 하나 이상의 박테리아 균주를 포함하는 직접-섭취 미생물을 혼합하는 단계 및 패키지화하는 단계를 포함하는 방법.
19. 구현예 1, 2, 4 또는 7의 사료 첨가제 조성물을 포함하는 사료.
20. 구현예 6의 사료 첨가제 조성물을 포함하는 사료.
21. 구현예 1의 사료 첨가제 조성물 및 적어도 하나의 미네랄 및/또는 적어도 하나의 비타민을 포함하는 프리믹스.
실시예
본원에서 달리 정의되지 않은 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시가 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 문헌[Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED., John Wiley and Sons, New York (1994), 및 Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, N.Y. (1991)]은 본 개시와 함께 사용되는 여러 용어의 일반 사전을 당업자에게 제공한다.
본 개시는 다음 실시예에서 추가로 정의된다. 실시예는 소정 구현예를 나타내지만, 단지 예로서 주어짐이 이해되어야 한다. 위에서의 논의 및 실시예로부터, 당업자는 본 개시의 본질적 특징을 확인할 수 있고, 이의 정신 및 범위에서 벗어나지 않고, 다양한 용도 및 조건에 맞게 다양한 변화 및 변형을 가할 수 있다.
실시예 1
단독 또는 조합으로 섭취되는 경우 3-균주 바실러스 기반 직접 섭취 미생물(바실러스 균주 3BP5, 918, 1013) 및 프로테아제의 옥수수 기반 식이를 섭취시킨 돼지에서의 성장 퍼포먼스 및 영양소의 전체 관 소화력에 대한 효과
물질 및 방법
수용 및 환경
동물 및 실험 프로토콜의 사용은 동물 실험 위원회의 승인을 받는다. 섭취되는 기본 식이는 에너지 및 단백질에 대해 균형잡히고, NRC(2012)에 의해 권장되는 이 연령의 성장기 돼지에 대한 영양소 요건(표 1)에 부합하거나 이를 초과하도록 제형화한다. 식이 성분의 소화력 결정을 허용하기 위해 일반 소화력 마커(산화크롬)를 0.30%로 포함시킨다.
기본 식이를 일부씩 분할한 후 표 2에서 확인되는 효소 또는 직접 섭취 미생물(DFM) 또는 둘 다의 조합으로 처리한다. 사료 혼합 동안, 혼합장치를 플러싱하여 식이의 교차 오염을 방지한다. 샘플을 각 배치의 초기, 중기, 및 말기에 각각의 처리 식이로부터 수집하고 함께 혼합하여 사료에서 효소 활성 및 DFM 계수를 확인한다. 혼합 동안 각각의 처리 식이로부터의 샘플을 보유하여 필요 시까지 -20℃에 저장한다.
Figure pct00012
1식이㎏ 당 공급: 비타민 A, 10,000 IU; 비타민 D3, 1,300 IU; 비타민 E, 40 IU; 비타민 K(메나디온 바이설페이트 복합체), 3.0 ㎎; 비타민 B2, 5.2 ㎎; 비타민 B6, 2.6 ㎎; 비타민 B12, 26 ㎍; 니아신, 32 ㎎; 및 d-판토텐산(d-칼슘 판토테네이트로서), 20 ㎎.
2식이㎏ 당 공급: Cu(CuSO4·5H2O로서), 19 ㎎; Fe(FeSO4·7H2O로서), 70 ㎎; Zn(ZnSO4로서), 50 ㎎; Mn(MnO2로서), 50 ㎎; I(KI로서), 0.5 ㎎; Co(CoSO4·7H2O로서), 0.3 ㎎; 및 Se(Na2SeO3·5H2O로서), 0.2 ㎎.
3식이의 ME는 NRC(2012)에 따라 계산함.
Figure pct00013
1바실러스 3개 균주: 바실러스 균주 3BP5, 918 및 1013
2프로테아제: 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 프로테아제 P3000
실험을 성장기(≤25 내지 약 60 ㎏ 체중)에 대응하여 계획하고 수행한다.
실험 설계
평균 BW가 22.6 ± 1.9 ㎏인 총 96마리 성장기 돼지[(요크셔(Yorkshire) × 랜드레이스(Landrace)) × 듀록(Duroc)]를 42일 실험에서 사용한다. 돼지를 이의 최초 BW에 따라 4개의 실험 식이로 무작위 할당한다. 무리 당 3마리 돼지를 갖는, 처리 당 8개의 복제 무리가 있다. 거세돼지 및 어린암퇘지를 각 처리에서 거세돼지 4무리 및 어린암퇘지 4무리로 분리한다. 모든 돼지를 환경-제어되는 방에 수용한다. 돼지가 사료 및 물에 자유롭게 접근할 수 있도록 각각의 무리에 1방향, 스테인리스 스틸 자가-사료공급장치 및 젖꼭지모양 급수기를 갖춘다.
성장 퍼포먼스 및 대변 샘플 수집 및 분석
체중 및 사료 소비를 매주 측정하여 평균 1일 증가(ADG), 평균 1일 사료 섭취(ADFI) 및 사료 전환 비율(FCR)을 모니터링한다. 식이에서 불활성 표시자로서 산화크롬(0.3%)을 첨가하여 GE 및 N의 겉보기 전체 관 소화력(ATTD, %)을 결정한다. 돼지에 실험 종료 1주 전(35일)에 산화크롬과 혼합된 식이를 섭취시킨다. 직장 마사지에 의해 무리 당 적어도 2마리 돼지에서 신선 대변 확보 샘플을 수집하고(40, 41 및 42일) 분석할 때까지 -20℃에서 냉동고에 저장한다. 화학 분석 전에, 대변 샘플을 해동하고 72 h 동안 60℃에서 건조한 후, 1-㎜ 스크린을 통과할 수 있는 크기로 미분한다. 이어서 모든 사료 및 대변 샘플을 AOAC(2000)에 개략된 절차에 따라 건조물, 총 에너지, 질소, 산성 세제 섬유(ADF) 및 중성 세제 섬유(NDF)에 대해 분석한다. 크롬을 문헌[Williams 등(1962)]에 기재된 방법에 따라 UV 흡광도 분광측정(Shimadzu, UV-1201, Shimadzu, Kyoto, Japan)을 통해 분석한다. 질소에 6.25의 전환 인자를 곱하여 미정제 단백질 겉보기 전체 관 소화력을 계산한다. 음성 대조군 대비 각각의 사료 첨가제의 첨가로 인한 소화 가능한 에너지(kcal)의 개선을 다음 공식에 의해 계산하였다;
1. 분석된 식이 GE(kcal/㎏)/100 * 에너지의 ATTD = 섭취물의 소화 가능한 에너지(kcal/㎏)
2. 소화 가능한 에너지 개선(kcal/㎏) = NC 군의 섭취물의 평균 소화 가능한 에너지(kcal/㎏) - DFM+프로테아제 복제의 섭취물의 평균 소화 가능한 에너지(kcal/㎏)
모든 데이터는 SAS의 Mixed 절차(SAS Inst. Inc., Cary, NC)를 사용하여 무작위화 완전 블록 디자인으로 통계 분석을 거쳤고, 무리를 실험 단위로 사용하였다. 최초 BW를 ADFI 및 ADG에 대한 공변량으로 사용하였다. 유의성은 P<0.05로 구현된다.
성장 퍼포먼스: DFM(바실러스) 및 프로테아제 조합을 이용한 옥수수-기반 식이의 보충은 임의의 사료 첨가제가 없는 음성 대조군 기본 식이 대비 평균 1일 증가 및 사료 전환 효율 비율을 유의미하게 개선한다(P<0.05)(도 1). 옥수수-기반 식이에 대한 DFM(바실러스) 및 프로테아제의 단독 첨가는 음성 대조군 식이 대비 평균 1일 증가 또는 사료 전환 효율 비율을 유의미하게 개선하지 않았다.
영양소의 겉보기 전체 관 소화력: 건조물, 질소, 소화 가능한 에너지, 산성 세제 섬유 및 중성 세제 섬유의 겉보기 전체 관 소화력은 음성 대조군 식이 대비 프로테아제와 조합된 DFM의 보충으로 모두 유의미하게 개선된다(표 3; P<0.05). DFM + 프로테아제 조합으로의 사육 결과로서 이러한 영양소 소화력의 개선은 음성 대조군 식이 대비 질소에 대해 3%, ADF에 대해 9% 및 NDF에 대해 3.5%였다. 그러나, 단독 보충되는 경우, 음성 대조군 식이 및 DFM 또는 프로테아제 처리 간 건조물, 질소, 소화 가능한 에너지, 산성 세제 섬유 및 중성 세제 섬유의 겉보기 전체 관 소화력에는 차이가 없다. DFM 및 프로테아제의 조합은 음성 대조군 식이 대비 식이의 소화 가능한 에너지를 56.8 kcal/㎏만큼 증가시킨 반면(P<0.05), 첨가제가 단독 첨가된 경우에는 식이의 에너지 소화력을 저하시켰다.
Figure pct00014
a,b,c같은 줄에서의 평균으로, 상이한 위첨자는 다른 값임(P<0.05)
1ADF: 산성 세제 섬유
2NDF: 중성 세제 섬유
3DE(소화 가능한 에너지): 음성 대조군 식이 대비 소화 가능한 에너지(kcal/㎏)에서의 차이.
실시예 2
단독 또는 조합으로 섭취되는 경우 3-균주 바실러스 기반 직접 섭취 미생물(바실러스 균주 3BP5, 918, 1013) 및 프로테아제의 옥수수 기반 식이를 섭취시킨 돼지에서의 성장 퍼포먼스, 영양소의 전체 관 소화력 및 대변 암모니아 배출에 대한 효과
물질 및 방법
수용 및 환경
동물 및 실험 프로토콜의 사용은 동물 실험 위원회의 승인을 받는다. 섭취되는 기본 식이는 에너지 및 단백질에 대해 균형잡히고, NRC(2012)에 의해 권장되는 이 연령의 성장기 돼지에 대한 영양소 요건(표 2.1)에 부합하거나 이를 초과하도록 제형화한다. 식이 성분의 소화력 결정을 허용하기 위해 일반 소화력 마커(산화크롬)를 3 g/kg으로 포함시킨다.
기본 식이를 일부씩 분할한 후 표 2.2에서 확인되는 효소 또는 직접 섭취 미생물(DFM) 또는 둘 다의 조합으로 처리한다. 사료 혼합 동안, 혼합장치를 플러싱하여 식이의 교차 오염을 방지한다. 샘플을 각 배치의 초기, 중기, 및 말기에 각각의 처리 식이로부터 수집하고 함께 혼합하여 사료에서 효소 활성 및 DFM 계수를 확인한다. 혼합 동안 각각의 처리 식이로부터의 샘플을 보유하여 필요 시까지 -20℃에 저장한다.
[표 2.1]
Figure pct00015
1식이㎏ 당 공급: 비타민 A, 10,000 IU; 비타민 D3, 1,300 IU; 비타민 E, 40 IU; 비타민 K(메나디온 바이설페이트 복합체), 3.0 ㎎; 비타민 B2, 5.2 ㎎; 비타민 B6, 2.6 ㎎; 비타민 B12, 26 ㎍; 니아신, 32 ㎎; 및 d-판토텐산(d-칼슘 판토테네이트로서), 20 ㎎.
2식이㎏ 당 공급: Cu(CuSO4·5H2O로서), 19 ㎎; Fe(FeSO4·7H2O로서), 70 ㎎; Zn(ZnSO4로서), 50 ㎎; Mn(MnO2로서), 50 ㎎; I(KI로서), 0.5 ㎎; Co(CoSO4·7H2O로서), 0.3 ㎎; 및 Se(Na2SeO3·5H2O로서), 0.2 ㎎.
3보충 피타제(Danisco UK Ltd)
[표 2.2]
Figure pct00016
1바실러스 3개 균주: 바실러스 균주 3BP5, 918 및 1013
2프로테아제: 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 프로테아제 P3000
실험을 성장기(≤25 내지 약 60 ㎏ 체중)에 대응하여 계획하고 수행한다.
실험 설계
평균 BW가 24.99 ± 1.84 ㎏인 총 128마리 성장기 돼지[(요크셔(Yorkshire) × 랜드레이스(Landrace)) × 듀록(Duroc)]를 42일 실험에서 사용한다. 돼지를 이의 최초 BW에 따라 4개의 실험 식이로 무작위 할당한다. 무리 당 4마리 돼지를 갖는, 처리 당 8개의 복제 무리가 있다. 거세돼지 및 어린암퇘지를 각 처리에서 거세돼지 4무리 및 어린암퇘지 4무리로 분리한다. 모든 돼지를 환경-제어되는 방에 수용한다. 돼지가 사료 및 물에 자유롭게 접근할 수 있도록 각각의 무리에 1방향, 스테인리스 스틸 자가-사료공급장치 및 젖꼭지모양 급수기를 갖춘다.
성장 퍼포먼스 및 대변 샘플 수집 및 분석
체중 및 사료 소비를 매주 측정하여 평균 1일 증가(ADG), 평균 1일 사료 섭취(ADFI) 및 사료 전환 비율(FCR)을 모니터링한다. 식이에서의 불활성 표시자로서 산화크롬(0.3%)을 첨가하여 GE 및 N의 겉보기 전체 관 소화력(ATTD)을 결정한다. 실험에 걸쳐 돼지에 산화크롬과 혼합된 식이를 섭취시킨다. 직장 마사지에 의해 무리 당 적어도 2마리 돼지에서 신선 대변 확보 샘플을 수집하고(21 및 42일) 분석할 때까지 -20℃에서 냉동고에 저장한다. 화학 분석 전에, 대변 샘플을 해동하고 72 h 동안 60℃에서 건조한 후, 1-㎜ 스크린을 통과할 수 있는 크기로 미분한다. 이어서 모든 사료 및 대변 샘플을 AOAC(2000)에 개략된 절차에 따라 건조물, 총 에너지, 질소, 산성 세제 섬유(ADF) 및 중성 세제 섬유(NDF)에 대해 분석한다. 크롬을 문헌[Williams 등(1962)]에 기재된 방법에 따라 UV 흡광도 분광측정(Shimadzu, UV-1201, Shimadzu, Kyoto, Japan)을 통해 분석한다. 질소에 6.25의 전환 인자를 곱하여 미정제 단백질 겉보기 전체 관 소화력을 계산하였다. 음성 대조군 대비 각각의 사료 첨가제의 첨가로 인한 소화 가능한 에너지(kcal)의 개선을 다음 공식에 의해 계산하였다;
1. 분석된 식이 GE(kcal/㎏)/100 * 에너지의 ATTD = 섭취물의 소화 가능한 에너지(kcal/㎏)
2. 소화 가능한 에너지 개선(kcal/㎏) = NC 군의 섭취물의 평균 소화 가능한 에너지(kcal/㎏) - DFM+프로테아제 복제의 섭취물의 평균 소화 가능한 에너지(kcal/㎏)
대변 암모니아 배출
대변 NH3 농도의 분석을 위해, 300 g의 신선 대변 샘플을 무리 당 적어도 2마리의 돼지로부터 수집하고 밀봉된 박스로 옮겨서 인큐베이터(35℃)에서 발효시킨다. 이어서 NH3 농도를 7일에 기체 검색 탐침(Gastec Corp., Kanagawa, Japan)을 사용하여 분석한다.
통계 분석
모든 데이터는 SAS의 Mixed 절차(SAS Inst. Inc., Cary, NC)를 사용하여 무작위화 완전 블록 디자인으로 통계 분석을 거쳤고, 무리를 실험 단위로 사용하였다. 최초 BW를 ADFI 및 ADG에 대한 공변량으로 사용하였다. 유의성은 P<0.05로 구현된다.
결과
성장 퍼포먼스: DFM(바실러스) 및 프로테아제 조합을 이용한 옥수수-기반 식이의 보충은 임의의 사료 첨가제가 없는 음성 대조군 기본 식이 대비 평균 1일 증가 및 사료 전환 효율 비율을 유의미하게 개선한다(P<0.05)(도 2). 그러나 옥수수-기반 식이에 DFM(바실러스) 및 프로테아제의 단독 첨가도 음성 대조군 식이 대비 평균 1일 증가 및 사료 전환 효율 비율을 개선한다(P<0.05); 개선의 크기는 프로테아제 + DFM의 조합에 대해 나타난 것보다 작았다.
영양소의 겉보기 전체 관 소화력: 21 및 42일에 모두, 건조물 및 미정제 단백질의 겉보기 전체 관 소화력이 음성 대조군 식이 대비 프로테아제와 조합된 DFM의 보충으로 개선된다(표 2.3; P<0.05). DFM + 프로테아제 조합으로의 사육 결과로서 영양소 소화력에서의 이러한 개선은 21일에 음성 대조군 식이 대비 건조물에 대해 5%, 질소에 대해 5%, 및 NDF 및 ADF 둘 다에 대해 2%였고, 42일에 음성 대조군 식이 대비 건조물에 대해 5%, 질소에 대해 6%, ADF에 대해 6% 및 NDF에 대해 2%였다. 그러나, 단독 보충되는 경우, 음성 대조군 식이 및 DFM 또는 프로테아제 처리 간 건조물 및 질소의 겉보기 전체 관 소화력에는 차이가 없다(P>0.05). 21일에, 프로테아제 및 DFM 처리는 모든 다른 처리에 비해 소화 가능한 에너지, ADF 및 NDF의 수치적으로 더 높은 겉보기 전체 관 소화력을 유도하였다. 42일에, 프로테아제 및 DFM의 조합은 소화 가능한 에너지, NDF 및 ADF의 겉보기 전체 관 소화력을 수치적으로 증가시켰다. 프로테아제 및 DFM 간 소화 가능한 에너지에서의 상승작용 반응이 관찰되었고, 이에 의해 조합은 음성 대조군 식이 대비 추가 181.3 kcal/㎏을 방출하였고, 이 값은 DFM 또는 프로테아제 단독에 기인할 수 있는 추가적인 소화 가능한 에너지의 합보다 컸다.
[표 2.3]
Figure pct00017
a,b,c같은 줄에서의 평균으로, 상이한 위첨자는 다른 값임(P<0.05)
1ADF: 산성 세제 섬유
2NDF: 중성 세제 섬유
3DE: 음성 대조군 식이 대비 소화 가능한 에너지(kcal/㎏)에서의 차이.
대변 암모니아 배출
옥수수 기반 식이에 대한 프로테아제의 단독 첨가는 음성 대조군 또는 DFM 단독 처리 대비 대변 암모니아 배출을 감소시키 않았다(도 3). 음성 대조군 처리에 비해, DFM 단독으로의 사육은 암모니아 배출을 감소시켰다(P<0.05). 그러나, 프로테아제 및 DFM의 조합을 돼지에게 섭취시킨 경우, 암모니아 배출의 감소 크기가 개별 처리 단독에 기인할 수 있는 감소의 합보다 더 큰(음성 대조군 대비 암모니아 농도 17% 감소) 상승작용 반응이 뚜렷하였다(P<0.05).
실시예 3
단독 또는 조합으로 섭취되는 경우 3-균주 바실러스 기반 직접 섭취 미생물(바실러스 균주 3BP5, 918, 1013) 및 프로테아제의 옥수수 기반 식이를 섭취시킨 돼지에서의 성장 퍼포먼스 및 영양소의 전체 관 소화력에 대한 효과
물질 및 방법
수용 및 환경
동물 및 실험 프로토콜의 사용은 동물 실험 위원회의 승인을 받는다. 섭취되는 기본 식이는 에너지 및 단백질에 대해 균형잡히고, NRC(2012)에 의해 권장되는 이 연령의 성장기 돼지에 대한 영양소 요건(표 3.1)에 부합하거나 이를 초과하도록 제형화한다. 식이 성분의 소화력 결정을 허용하기 위해 일반 소화력 마커(산화크롬)를 3 g/kg으로 포함시킨다.
기본 식이를 일부씩 분할한 후 표 3.2에서 확인되는 효소 또는 직접 섭취 미생물(DFM) 또는 둘 다의 조합으로 처리한다. 사료 혼합 동안, 혼합장치를 플러싱하여 식이의 교차 오염을 방지한다. 샘플을 각 배치의 초기, 중기, 및 말기에 각각의 처리 식이로부터 수집하고 함께 혼합하여 사료에서 효소 활성 및 DFM 계수를 확인한다.
[표 3.1]
Figure pct00018
1식이㎏ 당 공급: 비타민 A, 10,000 IU; 비타민 D3, 1,300 IU; 비타민 E, 40 IU; 비타민 K(메나디온 바이설페이트 복합체), 3.0 ㎎; 비타민 B2, 5.2 ㎎; 비타민 B6, 2.6 ㎎; 비타민 B12, 26 ㎍; 니아신, 32 ㎎; 및 d-판토텐산(d-칼슘 판토테네이트로서), 20 ㎎.
2식이㎏ 당 공급: Cu(CuSO4·5H2O로서), 19 ㎎; Fe(FeSO4·7H2O로서), 70 ㎎; Zn(ZnSO4로서), 50 ㎎; Mn(MnO2로서), 50 ㎎; I(KI로서), 0.5 ㎎; Co(CoSO4·7H2O로서), 0.3 ㎎; 및 Se(Na2SeO3·5H2O로서), 0.2 ㎎.
[표 3.2]
Figure pct00019
1바실러스 3개 균주: 바실러스 균주 3BP5, 918 및 1013
2프로테아제: 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 프로테아제 P3000
실험을 성장기(≤25 내지 약 60 ㎏ 체중)에 대응하여 계획하고 수행한다.
실험 설계
총 128마리 성장기 돼지[(요크셔(Yorkshire) × 랜드레이스(Landrace)) × 듀록(Duroc)]를 42일 실험에서 사용한다. 돼지를 이의 최초 BW에 따라 4개의 실험 식이로 무작위 할당한다. 무리 당 3마리 돼지를 갖는, 처리 당 8개의 복제 무리가 있다. 거세돼지 및 어린암퇘지를 각 처리에서 거세돼지 4무리 및 어린암퇘지 4무리로 분리한다. 모든 돼지를 환경-제어되는 방에 수용한다. 돼지가 사료 및 물에 자유롭게 접근할 수 있도록 각각의 무리에 1방향, 스테인리스 스틸 자가-사료공급장치 및 젖꼭지모양 급수기를 갖춘다.
성장 퍼포먼스 및 대변 샘플 수집 및 분석
체중 및 사료 소비를 매주 측정하여 평균 1일 증가(ADG), 평균 1일 사료 섭취(ADFI) 및 사료 전환 비율(FCR)을 모니터링한다. 식이에서의 불활성 표시자로서 산화크롬(0.3%)을 첨가하여 GE 및 N의 겉보기 전체 관 소화력(ATTD)을 결정한다. 실험 기간 동안 돼지에 산화크롬과 혼합된 식이를 섭취시킨다. 직장 마사지에 의해 무리 당 적어도 2마리 돼지에서 신선 대변 확보 샘플을 수집하고(21 및 42일) 분석할 때까지 -20℃에서 냉동고에 저장한다. 화학 분석 전에, 대변 샘플을 해동하고 72 h 동안 60℃에서 건조한 후, 1-㎜ 스크린을 통과할 수 있는 크기로 미분한다. 이어서 모든 사료 및 대변 샘플을 AOAC(2000)에 개략된 절차에 따라 건조물, 총 에너지, 질소, 산성 세제 섬유(ADF) 및 중성 세제 섬유(NDF)에 대해 분석한다. 크롬을 문헌[Williams 등(1962)]에 기재된 방법에 따라 UV 흡광도 분광측정(Shimadzu, UV-1201, Shimadzu, Kyoto, Japan)을 통해 분석한다. 질소에 6.25의 전환 인자를 곱하여 미정제 단백질 겉보기 전체 관 소화력을 계산하였다. 음성 대조군 대비 각각의 사료 첨가제의 첨가로 인한 소화 가능한 에너지(kcal)의 개선을 다음 공식에 의해 계산하였다;
1. 분석된 식이 GE(kcal/㎏)/100 * 에너지의 ATTD = 섭취물의 소화 가능한 에너지(kcal/㎏)
2. 소화 가능한 에너지 개선(kcal/㎏) = NC 군의 섭취물의 평균 소화 가능한 에너지(kcal/㎏) - DFM+프로테아제 복제의 섭취물의 평균 소화 가능한 에너지(kcal/㎏)
대변 암모니아 농도
대변 NH3 농도의 분석을 위해, 300 g의 신선 대변 샘플을 무리 당 적어도 2마리의 돼지로부터 수집하고 밀봉된 박스로 옮겨서 인큐베이터(35℃)에서 발효시킨다. 이어서 NH3 농도를 7일에 기체 검색 탐침(Gastec Corp., Kanagawa, Japan)을 사용하여 분석한다.
통계 분석
모든 데이터는 SAS의 Mixed 절차(SAS Inst. Inc., Cary, NC)를 사용하여 무작위화 완전 블록 디자인으로 통계 분석을 거쳤고, 무리를 실험 단위로 사용하였다. 최초 BW를 ADFI 및 ADG에 대한 공변량으로 사용하였다. 유의성은 P<0.05로 구현된다.
결과
성장 퍼포먼스: DFM(바실러스) 및 프로테아제 조합을 이용한 옥수수-기반 식이의 보충은 임의의 사료 첨가제가 없는 음성 대조군 기본 식이 대비 평균 1일 증가 및 사료 전환 효율 비율을 유의미하게 개선한다(P<0.05)(도 4). 그러나 옥수수-기반 식이에 DFM(바실러스) 및 프로테아제의 단독 첨가도 음성 대조군 식이 대비 평균 1일 증가 및 사료 전환 효율 비율을 개선한다(P<0.05); 개선의 크기는 프로테아제 + DFM의 조합에 대해 나타난 것보다 유의미하게 작았다(P<0.05).
영양소의 겉보기 전체 관 소화력: 21 및 42일에 모두, 건조물 및 질소의 겉보기 전체 관 소화력이 음성 대조군 식이 및 단독 첨가된 첨가제 대비 프로테아제와 조합된 DFM의 보충으로 개선된다(표 3.3; P<0.05). DFM + 프로테아제 조합으로의 사육 결과로서 영양소 소화력에서의 이러한 개선은 21일에 음성 대조군 식이 대비 건조물에 대해 3%, ADF에 대해 5.5%, 그리고 NDF 및 질소 둘 다에 대해 4.5%였고, 42일에 음성 대조군 식이 대비 건조물에 대해 3%, 질소에 대해 4%, ADF에 대해 6% 및 NDF에 대해 3.5%였다. 21일에, 프로테아제 및 DFM 처리는 모든 다른 처리에 비해 소화 가능한 에너지 및 ADF의 수치적으로 더 높은 겉보기 전체 관 소화력을 유도하였다. 또한, 21일에, DFM + 프로테아제 조합은 음성 대조군 및 프로테아제 단독 처리 대비 NDF의 겉보기 전체 관 소화력을 유의미하게 증가시켰다. 42일에, 프로테아제 및 DFM의 조합은 모든 다른 처리 대비 NDF 및 ADF의 겉보기 전체 관 소화력을 수치적으로 증가시켰다. 또한, DFM + 프로테아제 조합은 음성 대조군 및 프로테아제 단독 처리 대비 에너지의 겉보기 전체 관 소화력을 유의미하게 증가시킨다(P<0.05). DFM + 프로테아제 처리에 의해 방출된 추가적인 소화 가능한 에너지(kcal/㎏)는 DFM 또는 프로테아제 단독 처리로부터 방출된 소화 가능한 에너지보다 컸다.
[표 3.3]
Figure pct00020
a,b,c같은 줄에서의 평균으로, 상이한 위첨자는 다른 값임(P<0.05)
1ADF: 산성 세제 섬유
2NDF: 중성 세제 섬유
3DE: 음성 대조군 식이 대비 소화 가능한 에너지(kcal/㎏)에서의 차이.
대변 암모니아 배출: 옥수수 기반 식이에 대한 프로테아제 + DFM 조합의 첨가는 음성 대조군 대비 대변 암모니아 배출을 유의미하게 감소시켰다(도 5). DFM 및 프로테아제는 단독 섭취되는 경우 대조군 대비 대변 암모니아 배출을 수치적으로 감소시킨 반면, 프로테아제 및 DFM을 함께 조합한 것은 대변 암모니아 농도에서 가장 큰 감소(음성 대조군 대비 11% 감소)를 유도하였다.
PKY1312 - 실시예 4
3-균주 바실러스 기반 직접 섭취 미생물(바실러스 균주 3BP5, 918, 1013) 및 프로테아제 조합의 옥수수 기반 식이를 섭취시킨 돼지에서의 성장 퍼포먼스에 대한 효과
물질 및 방법
실험 설계
동일한 수의 거세돼지 및 어린암퇘지의 총 180마리 돼지(BW = 23.15 ± 2.66 ㎏)를 3개의 식이 처리 중 하나에 할당하였다: 1) 음성 대조군(NC) 2) NC + DFM 및 3) NC + 프로테아제 + DFM(표 4.1). 무리 당 4마리 돼지를 갖는, 처리 당 15개 무리(8개의 어린암퇘지 무리 및 7개의 거세돼지 무리)가 있었다. 돼지는 사료 및 물에 자유롭게 접근할 수 있었다. NRC 2012 영양소 및 에너지 요건에 부합하거나 이를 초과하도록 식이를 제형화하고, 3개의 기를 제형화하였다(표 4.2). 2기 및 3기 식이의 계산된 화학 조성을 표 4.3에 개략한다. 1, 2, 및 3기를 총 109일의 실험 기간 동안 각각 41, 45 및 23일 동안 섭취시켰다. 돼지 및 사료공급장치를 매주 칭량하여 평균 1일 증가(ADG), 평균 1일 사료 섭취(ADFI) 및 사료 전환 비율(FCR)을 계산하였다.
[표 4.1]
Figure pct00021
1바실러스 3개 균주: 바실러스 균주 3BP5, 918 및 1013
2 프로테아제: 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 프로테아제 P3000
[표 4.2]
Figure pct00022
1조성: 식이㎏ 당 공급: 비타민 A, 6,600 IU; 비타민 D3, 880 IU; 비타민 E, 44 IU; 비타민 K(메나디온 나트륨 바이설페이트 복합체), 6.4 ㎎; 티아민, 4.0 ㎎; 리보플라빈, 8.8 ㎎; 피리독신, 4.4 ㎎; 비타민 B12, 33 ㎍; 엽산, 1.3 ㎎; 니아신, 44 ㎎.
2조성: 식이㎏ 당 공급 ZnO로서 Zn, 131 ㎎; FeSO4·H2O로서 Fe, 131 ㎎; MnO로서 Mn 45 ㎎; CuSO4·5H2O로서 Cu, 13 ㎎; CaIO6로서 I, 1.5 ㎎; CoCO3로서 Co, 0.23 ㎎; Na2O3Se로서 Se, 0.28 ㎎.
2식이㎏ 당 공급: ZnO로서 Zn, 131 ㎎; FeSO4·H2O로서 Fe, 131 ㎎; MnO로서 Mn 45 ㎎; CuSO4·5H2O로서 Cu, 13 ㎎; CaIO6로서 I, 1.5 ㎎; CoCO3로서 Co, 0.23 ㎎; Na2O3Se로서 Se, 0.28 ㎎.
39.5% 미만 미세물 함유
4계측 톤 당 100 g으로 보충됨.
5계측 톤 당 250 g으로 보충됨.
6DFM = 직접 섭취 미생물; 계측 톤 당 60 g으로 포함됨.
[표 4.3]
Figure pct00023
1DM = 건조물
2NDF = 중성 세제 섬유
통계 분석
데이터를 SAS의 MIXED 절차(SAS Institute Inc., Cary, NC)를 사용하여 분석하였다. 성장 퍼포먼스에 있어서, 무리를 실험 단위로 사용하였다. 모든 데이터에 있어서, 모델은 고정 효과로서 처리 및 무작위 효과로서 무리를 포함하였다. 특이값은 UNIVARIATE 절차를 사용하여 결정하였다. 유의성은 P<0.05로 결정되었다.
결과
프로테아제 + DFM 처리를 섭취시킨 돼지는 대조군 대비 더 높은 ADG를 갖는 경향을 보였다(P = 0.09). DFM 단독 섭취 대비, 조합으로의 DFM의 섭취는 더 높은 ADG 및 더 낮은 FCR을 유도하였다(도 6).
실시예 5
단독 또는 조합으로 섭취되는 경우 3-균주 바실러스 기반 직접 섭취 미생물(바실러스 균주 3BP5, 918, 1013) 및 프로테아제의 옥수수 기반 식이를 섭취시킨 돼지에서의 성장 퍼포먼스 및 영양소의 전체 관 소화력에 대한 효과
물질 및 방법
25.96 ± 0.57 ㎏의 최초 체중(BW)을 갖는 총 64마리 돼지(Danbred DB90, 댐스(dams) × 아그로세레스(Agroceres) PIC 337, 종웅돈)를 42일 연구에서 이용하였다. 각각 2마리 동물을 갖는 32개 무리로 동물을 할당하였으며, 이는 8개의 대표/처리를 갖는 균등한 성비로 이루어졌다. 무리를 연구의 실험 단위로 간주하였다. 돼지는 사료 및 물에 자유롭게 접근할 수 있었다. NRC 2012 영양소 및 에너지 요건(표 5.1)에 부합하거나 이를 초과하도록 식이를 제형화하고, 무리를 4개 처리 중 하나에 무작위 할당하였다(표 5.2).
[표 5.1]
Figure pct00024
[표 5.2]
Figure pct00025
1바실러스 3개 균주: 바실러스 균주 3BP5, 918 및 1013
2프로테아제: 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 프로테아제 P3000
성장 퍼포먼스:
체중 및 사료 소비를 매주 측정하여 평균 1일 증가(ADG), 평균 1일 사료 섭취(ADFI) 및 사료 전환 비율(FCR)을 모니터링한다.
결과
성장 퍼포먼스: DFM 또는 프로테아제로의 개별 사육 대비 DFM + 프로테아제를 식이에 첨가하는 경우, 옥수수-기반 식이를 섭취시킨 돼지의 ADG에서 개선이 있었다(도 7).
실시예 6
단일 또는 여러 균주의 직접 섭취 미생물(DFM) 및 프로테아제의 돼지에게 섭취시킨 밀 또는 대두 음식 기반 기재로부터 단백질을 가용화하는 이의 능력에 대한 효과의 시험관내 평가
물질 및 방법
8 × 2 라틴 방진(Latin square) 설계에서 총 8마리의 회장에 캐뉼라가 삽관된 거세돼지(최초 BW 30 ㎏)에 2개의 실험 식이 중 하나를 섭취시켰다. 각각 7일로 구성되는 2개의 연속 기간이 존재하였다. 대부분 밀 또는 SBM으로 구성되는 반-정제 식이를 각각의 기간 동안 적응을 위한 5일 및 회장 수집을 위한 2일을 포함하는 7일 동안 섭취시켰다. 돼지를 제1 기간의 시작 시(d 0) 2개의 실험 식이 중 하나에 무작위 할당하고, 제2 기간의 시작 시(d 7) 제2 식이로 교체하였다. 식이는 미정제 단백질의 겉보기 회장 소화력을 계산하기 위해 사용된 산화크롬을 함유하였고, 모집단 평균과 가장 가까운 미정제 단백질의 겉보기 회장 소화력을 갖는 돼지로부터의 샘플을 시험관내 연구를 위해 선택하였다. 돼지를 환경-제어되는 방에 수용하였다. 돼지가 사료 및 물에 자유롭게 접근할 수 있도록 각각의 무리에 1방향, 스테인리스 스틸 자가-사료공급장치 및 젖꼭지모양 급수기를 갖추었다. 기본 식이는 NRC(2012)에 의해 권장되는 이 연령의 성장기 돼지에 대한 영양소 요건(표 6.1)에 부합하거나 이를 초과하도록 제형화하였다.
[표 6.1]
Figure pct00026
돼지로부터의 소화액 수집 시, 이를 -20℃에서 즉시 냉동한 후 냉동 건조하였다. 이어서 냉동 건조된 소화액 샘플을 단독으로 또는 조합으로 DFM 및 프로테아제와 함께 시험관내 인큐베이션에 사용하였다. 본 연구에서 사용된 DFM은 단일 균주의 바실러스 푸밀리스(8G-134), 바실러스 리케니포르미스(AEE3), 락토바실러스 류테리(ANC1) 및 3개 균주의 B. 서브틸리스(918, 1013 및 3BP5)로 구성되는 3-균주 바실러스 조합을 포함하였다.
혐기성 박테리아의 배양
냉동-보존된 박테리아가 표면에 부착된 1개의 비드를 제조업체의 지침에 따라 제조되고 멸균된 3 mL MRS(deMan, Rogosa and Sharpe) 배지(OXOID, CMS359)를 함유하는 13 mL 튜브(Sarstedt 62.515.006) 내로 전달하여 락토바실러스 류테리(ANC1)의 하룻밤 배양물을 접종하였다. 튜브를 2개의 활성화 혐기성 기체 생성 사체트(Oxoid AnaeroGen 2.5L, Thermo Scientific)를 보유하는, 단단히 조인 혐기성 단지(Anaerocult®)에 배치하였다. Anaerotest 스트립(Merck 115112)을 단지에 삽입하여 인큐베이션 동안 분위기가 혐기성임을 표시하였다(흰색 색상). 박테리아를 50 rpm 진탕하며 37℃에서 18시간 동안 인큐베이션하였다.
새로운 13 mL 튜브(Sarstedt 62.515.006) 내 3 mL의 신선 MRS 배지로 30 ㎕의 하룻밤 배양물을 전달하여 2차 배양하였다. 튜브를 신선, 활성화 혐기성 기체 생성 사체트(Oxoid AnaeroGen 2.5L, Thermo Scientific)와 함께 단단히 조인 혐기성 단지(Anaerocult®)에 배치한다. 배양물이 600 nm에서의 광학 밀도(OD600) 0.2~0.4에 도달할 때까지 2차 배양물을 50 rpm 진탕하며 37℃에서 인큐베이션하였다. 배양물을 MRS 배지로 OD600 = 0.1까지 희석한 후 100 mM MES(2-(N-모르폴리노)에탄설폰산) 완충액, pH 6.2로 10배 희석하였다. 그 직후 회장 샘플의 처리를 개시하였다.
호기성 박테리아의 배양
냉동-보존된 박테리아가 표면에 부착된 1개의 비드를 제조업체의 지침에 따라 제조되고 멸균된 3 mL TSB(Tryptic Soy Broth) 배지(Merck 1.05459)를 함유하는 13 mL 튜브(Sarstedt 62.515.006) 내로 전달하여 B. 서브틸리스(3BP5, 918 및 1013), B. 리케니포르미스(AEE3), 및 B. 푸밀리스(8G-134)의 하룻밤 배양물을 접종하였다. 튜브를 진탕하며(200 rpm) 18시간 동안 인큐베이션하였다. B. 푸밀리스 균주를 32℃에서 인큐베이션하고 나머지 균주를 37℃에서 인큐베이션하였다.
3개의 배플을 갖는 250 mL 유리 플라스크 내 30 mL의 신선 TSB 배지에 300 ㎕의 하룻밤 배양물을 전달하여 2차 배양하였다. 0.3 내지 0.7 범위의 OD600값이 수득될 때까지 논쟁적인 진탕 하에 B. 푸밀리스 균주를 32℃에서 인큐베이션하고 나머지 균주를 37℃에서 인큐베이션하였다. 배양물을 TSB 배지로 OD600 = 0.1까지 희석한 후 100 mM MES 완충액, pH 6.2로 10배 희석하였다. 그 직후 회장 샘플의 처리를 개시하였다.
박테리아 및 프로테아제의 조합을 이용한 회장 샘플의 처리
냉동-건조된 회장 샘플을 단독으로 또는 프로테아제와의 조합으로 개별 박테리아 배양물로 처리하였다. 모든 처리는 2회씩 평가하였다. 0.097~0.103 g의 냉동 건조된 회장 샘플을 2 mL 마이크로원심분리 튜브(Eppendorf)로 옮겼다. 850 ㎕의 100 mM MES 완충액, pH 6.2를 20 ㎕의 50 mM 아세트산나트륨 완충액, pH 5.0 또는 50 mM 아세트산나트륨 완충액, pH 5.0 중 프로테아제(B. 아밀로리퀘파시엔스 프로테아제 P3000, 55 U/mL)와 함께 첨가하였다. 모든 물질이 수화될 때까지 샘플을 철저히 혼합하였다. 30 ㎕ 100 mM MES 완충액, pH 6.2 또는 MES 완충액 중 희석된 박테리아 배양물을 첨가하였다. 3-균주 바실러스 조합(균주 918, 1013 및 3BP5)에 있어서, 각각의 3개 균주에 대해 10 ㎕을 첨가하였다(주어진 전체 부피 30 ㎕). 모든 튜브를 Thermomixer(Eppendorf)에서 진탕하며(1150 rpm) 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 2시간 인큐베이션 후, 샘플을 얼음으로 옮겨 5분 동안 방치하였다. 튜브를 2분 동안 17000 × g에서 원심분리하였다. 상청액을 회수하고 원심분리에 의해 AcroPrep™ Advance 필터 플레이트(3 ㎛ 유리 섬유/0.2 ㎛ Supor® 멤브레인)를 사용하여 여과하였다. 샘플을 추가 분석 전까지 -20℃에 저장하였다.
단백질 정량
10 ㎕의 샘플 부피를 갖는 제조에 의해 제공되는 프로토콜을 사용하여 BSA 표준 곡선(0~300 ㎍/mL)에 대한 Quant-iT 단백질 검정 키트(Molecular probes Q33210)를 사용하여 용액 중 단백질을 정량하였다.
결과
단백질 가용화: 3-균주 조합 바실러스 서브틸리스와 프로테아제의 조합은 개별 DFM 또는 프로테아제 성분 단독 대비 대두 음식 기반 돼지 돼지 회장 소화액으로부터의 단백질 가용화를 증가시켰다(도 8a).
단일 균주 바실러스 리케니포르미스와 프로테아제의 조합도 프로테아제 또는 DFM 단독의 개별 성분 대비 대두 음식 기반 식이를 섭취시킨 돼지의 회장 소화액으로부터 더 큰 단백질 가용화를 유도하였다(도 8b).
단일 균주 바실러스 푸밀리스와 프로테아제의 조합도 프로테아제 또는 DFM 단독의 개별 성분 대비 대두 음식 기반 식이를 섭취시킨 돼지의 회장 소화액으로부터 더 큰 단백질 가용화를 유도하였다(도 8c).
단일 균주 바실러스 푸밀리스와 프로테아제의 조합은 프로테아제 또는 DFM 단독의 개별 성분 대비 밀 기반 식이를 섭취시킨 돼지의 회장 소화액으로부터 더 큰 단백질 가용화를 유도하였다(도 8d).
단일 균주 바실러스 리케니포르미스와 프로테아제의 조합은 프로테아제 또는 DFM 단독의 개별 성분 대비 밀 기반 식이를 섭취시킨 돼지의 회장 소화액으로부터 더 큰 단백질 가용화를 유도하였다(도 8e).
단일 균주 락토바실러스 류테리와 프로테아제의 조합은 프로테아제 또는 DFM 단독의 개별 성분 대비 밀 기반 식이를 섭취시킨 돼지의 회장 소화액으로부터 더 큰 단백질 가용화를 유도하였다(도 8f).
실시예 7
조합으로 섭취되는 경우 3-균주 바실러스 기반 직접 섭취 미생물(바실러스 균주 3BP5, 918, 1013) 및 프로테아제의 옥수수 기반 식이를 섭취시킨 돼지의 날고기 특징에 대한 효과
물질 및 방법
네덜란드 동물 실험 및 윤리 위원회 규제/실험실 실습 방침(Animal Experimental and Ethics Committee Regulations/Laboratory Practise Codes in the Netherlands)에 따라 실험을 수행하였다. 대략 200 kcal/㎏만큼 감소된 순 에너지(NE)를 제외하면, 섭취되는 기본 식이를 NRC(2012)에 의해 권장되는 이 연령의 성장기 돼지에 대한 영양소 요건(표 7.1)에 부합하거나 이를 초과하도록 제형화하였다. 기본 식이를 일부씩 분할한 후 표 7.2에서 확인되는 효소 및 직접 섭취 미생물(DFM) 조합으로 처리하였다. 사료 혼합 동안, 혼합장치를 플러싱하여 식이의 교차 오염을 방지하였다. 샘플을 각 배치의 초기, 중기, 및 말기에 각각의 처리 식이로부터 수집하고 함께 배합하여 사료에서 효소 활성 및 DFM 계수를 확인하였다.
[표 7.1]
Figure pct00027
[표 7.2]
Figure pct00028
1바실러스의 3개 균주: 바실러스 균주 3BP5, 918 및 1013
2프로테아제: 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 프로테아제 P3000
실험을 성장기(≤23 내지 약 116 ㎏ 체중)에 대응하여 계획하고 수행한다.
실험 설계
평균 체중이 23 ㎏인 총 180마리 성장기 돼지[그레이트 요크(Great York) × 랜드레이스(Landrace)]를 96~113일 실험에서 사용하였다. 돼지를 이의 최초 체중에 따라 2개의 실험 식이로 무작위 할당하였다. 무리 당 9마리 돼지를 갖는, 처리 당 10개의 복제 무리가 있었다. 거세돼지 및 어린암퇘지를 각 처리에서 거세돼지 5무리 및 어린암퇘지 5무리로 분리하였다. 모든 돼지를 환경-제어되는 방에 수용한다. 돼지가 사료 및 물에 자유롭게 접근할 수 있도록 각각의 무리에 1방향, 스테인리스 스틸 자가-사료공급장치 및 젖꼭지모양 급수기를 갖춘다.
날고기 특징 측정 및 분석
실험 마지막 날, 돼지가 대략 116 ㎏ 체중으로 칭량되었을 때(96일 또는 116일에), 돼지를 희생시키고 날고기 품질을 도축 데이터로부터 결정하였다. 등지방 깊이(㎜)를 탐침을 이용해서 마지막 갈비뼈 위치에서 등쪽 중앙선으로부터 65 ㎜에 위치하는 P2 부위에서 측정하였다. 날고기의 여윔(leanness)을 산정하기 위해 일상적으로 사용되는 척도인 살코기 백분율을 다음과 같이 계산하였다:
살코기% = {8.588 + (0.465 × 날고기 중량) + (3.005 × 허리 근육 영역) - (21.896 × 지방 깊이)}/날고기 중량
통계 분석
모든 데이터는 SAS의 Mixed 절차(SAS Inst. Inc., Cary, NC)를 사용하여 무작위화 완전 블록 디자인으로 통계 분석을 거쳤고, 무리를 실험 단위로 사용하였다. 데이터는 P<0.05로 유의미하게 간주되었다.
결과
DFM(바실러스) 및 프로테아제 조합을 이용한 옥수수-기반 식이의 보충은 임의의 첨가제가 없는 음성 대조군 기본 식이 대비 살코기 백분율 및 등-지방 깊이를 유의미하게 개선하였다(P<0.05)(표 7.3).
[표 7.3]
Figure pct00029
a,b같은 줄에서의 평균으로, 상이한 위첨자는 다른 값임(P<0.05)
실시예 8
단독 또는 조합되어 적용되는 경우, 3-균주 바실러스 기반 직접 섭취 미생물(바실러스 균주 3BP5, 918, 1013) 및 프로테아제의 성장기 돼지에 섭취시킨 밀 또는 대두 음식-기반 식이로부터의 단백질 가용화에 대한 효과의 시험관내 평가
물질 및 방법
8 × 2 라틴 방진(Latin square) 설계에서 총 8마리의 회장에 캐뉼라가 삽관된 거세돼지(최초 BW 30 ㎏)에 2개의 실험 식이 중 하나를 섭취시켰다. 각각 7일로 구성되는 2개의 연속 기간이 있었다. 대부분 밀 또는 SBM으로 구성되는 반-정제 식이를 각각의 기간 동안 적응을 위한 5일 및 회장 수집을 위한 2일을 포함하는 7일 동안 섭취시켰다. 돼지를 제1 기간의 시작 시(d 0) 2개의 실험 식이 중 하나에 무작위 할당하고, 제2 기간의 시작 시(d 7) 제2 식이로 교체하였다. 식이는 미정제 단백질의 겉보기 회장 소화력을 계산하기 위해 사용된 산화크롬을 함유하였고, 모집단 평균과 가장 가까운 미정제 단백질의 겉보기 회장 소화력을 갖는 돼지로부터의 샘플을 시험관내 연구를 위해 선택하였다. 돼지를 환경-제어되는 방에 수용하였다. 돼지가 사료 및 물에 자유롭게 접근할 수 있도록 각각의 무리에 1방향, 스테인리스 스틸 자가-사료공급장치 및 젖꼭지모양 급수기를 갖추었다. 기본 식이는 NRC(2012)에 의해 권장되는 이 연령의 성장기 돼지에 대한 영양소 요건(표 8.1)에 부합하거나 이를 초과하도록 제형화하였다.
[표 8.1]
Figure pct00030
돼지로부터의 소화액 수집 시, 이를 -20℃에서 즉시 냉동한 후 냉동 건조하였다. 이어서 냉동 건조된 소화액 샘플을 단독으로 또는 조합으로 DFM 및 프로테아제와 함께 시험관내 인큐베이션에 사용하였다. 연구에서 사용된 DFM은 3개 균주의 B. 서브틸리스(3BP5, 918 및 1013)로 구성되는 3-균주 바실러스 조합을 포함하였다().
호기성 박테리아의 배양 냉동-보존된 박테리아가 표면에 부착된 1개의 비드를 제조업체의 지침에 따라 제조되고 멸균된 3 mL TSB(Tryptic Soy Broth) 배지(Merck 1.05459)를 함유하는 13 mL 튜브(Sarstedt 62.515.006) 내로 전달하여 B. 서브틸리스(3BP5, 918 및 1013)의 하룻밤 배양물을 접종하였다. 튜브를 진탕하며(200 rpm) 18시간 동안 인큐베이션하였다. 모든 바실러스 균주를 37℃에서 인큐베이션하였다.
3개의 배플을 갖는 250 mL 유리 플라스크 내 30 mL의 신선 TSB 배지에 300 ㎕의 하룻밤 배양물을 전달하여 2차 배양하였다. 0.3 내지 0.7 범위의 OD600값이 수득될 때까지 논쟁적인 진탕 하에 모든 바실러스 균주를 37℃에서 인큐베이션하였다. 배양물을 TSB 배지로 OD600 = 0.1까지 희석한 후 100 mM MES 완충액, pH 6.2로 10배 희석하였다. 그 직후 회장 샘플의 처리를 개시하였다.
박테리아 및 프로테아제의 조합을 이용한 회장 샘플의 처리
냉동-건조된 회장 샘플을 단독으로 또는 프로테아제와의 조합으로 개별 박테리아 배양물로 처리하였다. 모든 처리는 2회씩 평가하였다. 0.097~0.103 g의 냉동 건조된 회장 샘플을 2 mL 마이크로원심분리 튜브(Eppendorf)로 옮겼다. 850 ㎕의 100 mM MES 완충액, pH 6.2를 20 ㎕의 50 mM 아세트산나트륨 완충액, pH 5.0 또는 50 mM 아세트산나트륨 완충액, pH 5.0 중 프로테아제(B. 아밀로리퀘파시엔스 프로테아제 P3000, 55 U/mL)와 함께 첨가하였다. 모든 물질이 수화될 때까지 샘플을 철저히 혼합하였다. 30 ㎕ 100 mM MES 완충액, pH 6.2 또는 MES 완충액 중 희석된 박테리아 배양물을 첨가하였다. 3-균주 바실러스 조합(균주 918, 1013 및 3BP5)에 있어서, 각각의 3개 균주에 대해 10 ㎕을 첨가하였다(주어진 전체 부피 30 ㎕). 모든 튜브를 Thermomixer(Eppendorf)에서 진탕하며(1150 rpm) 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 2시간 인큐베이션 후, 샘플을 얼음으로 옮겨 5분 동안 방치하였다. 튜브를 2분 동안 17000 × g에서 원심분리하였다. 상청액을 회수하고 원심분리에 의해 AcroPrep™ Advance 필터 플레이트(3 ㎛ 유리 섬유/0.2 ㎛ Supor® 멤브레인)를 사용하여 여과하였다. 샘플을 추가 분석 전까지 -20℃에 저장하였다.
단백질 정량
10 ㎕의 샘플 부피를 갖는 제조에 의해 제공되는 프로토콜을 사용하여 BSA 표준 곡선(0~300 ㎍/mL)에 대한 Quant-iT 단백질 검정 키트(Molecular probes Q33210)를 사용하여 용액 중 단백질을 정량하였다.
결과
프로테아제 또는 DFM의 단독 적용은 첨가제가 없는 음성 대조군 대비 밀 및 대두 음식 샘플로부터 가용화된 단백질의 양을 수치적으로 증가시켰다. 그러나, 프로테아제 및 3개 균주의 바실러스 DFM을 조합한 경우, 대조군 및 프로테아제 또는 DFM 단독 대비 밀 및 대두 음식 샘플로부터 가용화된 단백질의 양이 증가하였다(표 8.3).
[표 8.3]
Figure pct00031

Claims (21)

  1. 적어도 하나의 프로테아제와의 조합으로 하나 이상의 박테리아 균주를 포함하는 직접 섭취 미생물로 본질적으로 구성되는 사료 첨가제 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 직접 섭취 미생물이 항병원체 직접 섭취 미생물인 사료 첨가제 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 직접 섭취 미생물이 락토바실러스, 락토코커스, 스트렙토코커스, 바실러스, 페디오코커스, 엔테로코커스, 류코노스톡, 카르노박테리움, 프로피오니박테리움, 비피도박테리움, 클로스트리듐 및 메가스패라 그리고 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 3개의 박테리아 균주를 포함하는 사료 첨가제 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 직접 섭취 미생물이 바실러스 서브틸리스, 바실러스 리케니포르미스, 바실러스 푸밀러스, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스, 엔테로코커스, 엔테로코커스 종, 및 페디오코커스 종, 락토바실러스 종, 비피도박테리움 종, 락토바실러스 애시도필러스, 페디오코커스 애시디락티시, 락토코커스 락티스, 비피도박테리움 비피덤, 프로피오니박테리움 토에니이, 락토바실러스 파르시미너스, 락토바실러스 람노서스, 클로스트리듐 부티리컴, 비피도박테리움 애니말리스 종 애니말리스, 락토바실러스 류테리, 바실러스 세레우스, 락토바실러스 살리바리우스 종 살리바리우스, 메가스패라 엘스데니이, 프로피오니박테리아 종 및 이의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 3개의 박테리아 균주를 포함하는 사료 첨가제 조성물.
  5. 제1항, 제2항 또는 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 직접 섭취 미생물이 바실러스 서브틸리스 균주 3BP5(NRRL B-50510); 918(NRRL B-50508), 및 1013(NRRL B-50509)을 포함하는 사료 첨가제 조성물.
  6. 제1항, 제2항 또는 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 직접 섭취 미생물이 내생포자의 형태인 사료 첨가제 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 직접 섭취 미생물이 내생포자의 형태인 사료 첨가제 조성물.
  8. 제1항, 제2항, 제4항 또는 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아제가 서브틸리신, 바실로라이신, 알칼리성 세린 프로테아제, 케라티나제 또는 노카르디옵시스 프로테아제인 사료 첨가제 조성물.
  9. 제6항에 있어서, 프로테아제가 서브틸리신, 바실로라이신, 알칼리성 세린 프로테아제, 케라티나제 또는 노카르디옵시스 프로테아제인 사료 첨가제 조성물.
  10. 제1항, 제2항, 제4항 또는 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아제가 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 유래 서브틸리신인 사료 첨가제 조성물.
  11. 제6항에 있어서, 프로테아제가 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 유래 서브틸리신인 사료 첨가제 조성물.
  12. 제1항, 제2항, 제4항 또는 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아제가 1000 PU/사료 첨가제 조성물g 내지 200,000 PU/사료 첨가제 조성물g의 투여량으로 존재하는 사료 첨가제 조성물.
  13. 제6항에 있어서, 프로테아제가 1000 PU/사료 첨가제 조성물g 내지 200,000 PU/사료 첨가제 조성물g의 투여량으로 존재하는 사료 첨가제 조성물.
  14. 제1항, 제2항, 제4항 또는 제7항 중 어느 한 항에 있어서, DFM이 1×103 CFU/사료 첨가제 조성물g 내지 1×1013 CFU/사료 첨가제 조성물g의 투여량으로 존재하는 사료 첨가제 조성물.
  15. 제6항에 있어서, DFM이 1×103 CFU/사료 첨가제 조성물g 내지 1×1013 CFU/사료 첨가제 조성물g의 투여량으로 존재하는 사료 첨가제 조성물.
  16. 대상체의 퍼포먼스 개선 방법 또는 사료에서 원료의 소화력(예컨대 영양소 소화력, 예컨대 아미노산 소화력) 개선 방법, 또는 질소 보유 개선 방법, 또는 괴사성 장염에 대한 대상체의 저항성 개선 방법 또는 사료 전환 비율(FCR) 개선 방법 또는 날고기 또는 살코기 수율 증가 방법 또는 대상체에서 체중 증가 개선 방법 또는 대상체에서 사료 효율 개선 방법 또는 대상체의 면역 반응 조정(예컨대 개선) 방법, 또는 대상체의 위장관에서 유익한 박테리아의 성장 촉진 방법 또는 대상체의 위장관에서 병원성 박테리아 모집단 감소 방법, 또는 동물거름에서 영양소 배출 감소 방법, 또는 동물거름에서 암모니아 생산 감소 방법, 또는 식이 헤미셀룰로스 또는 섬유의 소화력 또는 이용 개선 방법으로서, 적어도 하나의 프로테아제와의 조합으로 하나 이상의 박테리아 균주를 포함하는 직접 섭취 미생물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  17. 제1항의 사료 첨가제 조성물 및 투여 지침을 포함하는 키트.
  18. 사료 첨가제 조성물의 제조 방법으로서, 적어도 하나의 프로테아제와의 조합으로 하나 이상의 박테리아 균주를 포함하는 직접-섭취 미생물을 혼합하는 단계 및 패키지화하는 단계를 포함하는 방법.
  19. 제1항, 제2항, 제4항 또는 제7항 중 어느 한 항의 사료 첨가제 조성물을 포함하는 사료.
  20. 제6항의 사료 첨가제 조성물을 포함하는 사료.
  21. 제1항의 사료 첨가제 조성물 및 적어도 하나의 미네랄 및/또는 적어도 하나의 비타민을 포함하는 프리믹스.
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