MXPA06013253A

MXPA06013253A - Metodo y composicion para reducir la enfermedad de e. coli disease y mejorar el rendimiento utilizando bacilos.

Info

Publication number: MXPA06013253A
Application number: MXPA06013253A
Authority: MX
Inventors: Thomas G Rehberger; Dorrie Sue Jordan-Parrott
Original assignee: Agtech Products Inc
Priority date: 2004-05-14
Filing date: 2005-05-13
Publication date: 2007-02-28
Also published as: WO2005112658A1; US8722058B2; CA2566617A1; US20100209406A1; US20120315258A1; US7618640B2; US20050255092A1; CA2566617C

Abstract

Se proporcionan cepas de Bacillus que inhiben el E. coli de cerdo patogenico y/o mejoran el rendimiento. La inhibicion de E. coli de cerdo patogenico disminuye la enfermedad de E. coli. Al menos una cepa mejoro el rendimiento de cerdo al mejorar la ganancia diaria promedio, la eficiencia de alimentacion, y la ingesta de alimentacion. Las cepas Bacillus preferidas son de la especie incluida en la lista GRAS. Las especies de Bacillus son formadores de esporas y por lo tanto son altamente estables y pueden darsele como alimento al cerdo.

Description

"MÉTODO Y COMPOSICIÓN PARA REDUCIR LA EN FERMEDAD D E E. COLI Y MEJORAR EL RENDIMIENTO UTILIZANDO BACILOS" Referencia cruzada a la solicitud relacionada Esta solicitud reivindica prioridad bajo 35 U.S.C. § 1 19(e) para la Solicitud de Patente Provisional de E. U. No. 60/571 , 193, presentada el 14 de Mayo de 2004, cuya totalidad se incorpora en la presente para referencia.

Bibliografía Las citas bibliográficas completas de las referencias hechas en la presente por un número de referencia en paréntesis pueden encontrarse en la sección de bibliografía, inmediatamente a continuación de los Ejemplos.

Campo de la invención La invención se refiere a cepas bacteriales y al uso de las mismas para controlar enfermedades en animales y mejorar el rendimiento del animal. Más particularmente, la invención se refiere a cepas de Bacillus y a su uso para controlar enfermedades ocasionadas por Escherichia coli y para mejorar el rendimiento del animal.

Discusión de antecedentes La enfermedad de E. coli es una importante y devastadora enfermedad para los productores de cerdos. Conocida por ocasionar la enfermedad del edema (ED - edema disease) y diarrea post-destete (PWD - post weaning disease), el impacto económico puede ser considerable con pérdidas mortales tan altas como un 50% (1 ) . Múltiples factores administrativos y ambientales han sido asociados con las infecciones de E. coli, incluyendo la edad de destete, dieta, hacinamiento, y transporte. Algunos factores genéticos del huésped, tales como el tener receptores para que las franjas de E. coli se adhieran a la superficie intestinal, también contribuyen a la susceptibilidad de cerdo a la infección de E. coli. Tanto la ED como la WPD son ocasionadas básicamente por la E. coli hemolítica que prolifera en el intestino delgado. La infección de E. coli también puede diagnosticarse en cerdos poco después del nacimiento hasta las dos semanas de edad (3). La ED puede ocurrir en cerdos entre tres y ocho semanas de edad y se caracteriza por un edema subcutáneo y subserosal, una ataxia progresiva, parálisis y una mortalidad elevada (2) . La PWD es observada comúnmente a los 7-10 días después del destete pero puede ocurrir hasta las ocho semanas de edad y se caracteriza por una tasa de desarrollo reducida, diarrea severa, deshidratación, toxemia, o muerte (2, 3). Tanto la PWD como la ED pueden ocurrir en el mismo grupo de cerdos y las cepas de E. coli causativas frecuentemente comparten algunos factores de virulencia. Normalmente, la primera manifestación observada con la PWD es la muerte súbita, tan precozmente como a los dos días, después del destete. Los cerdos que no mueren súbitamente, presentan una disminución en el consumo de alimento y una diarrea muy aguada que llevan a la depresión y a la deshidratación poniendo en riesgo la vida. Muchos cerdos presentan una descoloración cianótica de la punta de la nariz, las orejas, y el abdomen. Puede observarse también movimientos tambaleantes y no coordinados en los cerdos severamente afectados. La mortalidad pico ocurre generalmente 6-10 días después del destete. En un rebaño con PWD, la morbilidad puede variar. En una cría, la morbilidad puede ser alta y alcanzar hasta 80% con un promedio de 30-40%. La mortalidad en piaras no tratadas pueden alcanzar 26% (4). La anorexia frecuentemente es el primer signo observado con la enfermedad del edema. Si va a ocurrir la diarrea, normalmente llega después de la anorexia. La diarrea normalmente desaparece al momento en que se vuelven aparentes del edema y complicaciones nerviosas. El edema puede observarse en los párpados, frente, orejas, y labios. Después de la necropsia puede observarse el edema en la submucosa del estómago, el mesocolon , la vesícula biliar, y pulmones. La ataxia progresiva y la confusión mental que llevan a un vuelco completo y a una disnea se observan en las etapas finales. La tasa de mortalidad en la enfermedad del edema puede alcanzar 50% hasta más de 90% (4). La fuente de E. coli en un cerdo destetado normalmente se deriva del medio ambiente sea en el criadero, o el cerdo puede adquirir el E. coli en la unidad de alumbramiento y llevarla al criadero. El E. coli patogénico puede dispersarse por medio de aerosol, alimentos, vehículos de granja, cerdos, y otros animales (4).

Los E. coli son parte de la flora intestinal normal en los cerdos. La mayoría de los E. coli intestinales no poseen la capacidad de ocasionar la enfermedad. Estos E. coli pasan por los intestinos y no son capaces de adherirse a la pared intestinal y no producen toxinas. Aquellos E. coli que son patogénicos y que ocasionan la enfermedad tienen la capacidad de hacerlo debido a que han obtenido genes que codifican para factores de virulencia específica (5). Estos factores de virulencia le permiten al E. coli adherirse a la pared intestinal, colonizar el intestino, y producir enterotoxinas, lo cual puede ocasionar diarrea y verotoxinas que pueden ocasionar la enfermedad del edema. El E. coli enterotoxigénico (ETEC - enterotoxigenic E. coli) es el principal tipo de E. coli implicado en la enfermedad diarréica de cerdos (Figura 1 ) (5). Estas cepas se caracterizan por su capacidad de adherirse al intestino del cerdo y de producir enterotoxinas. La adherencia al tracto intestinal se realiza por franjas (pili) en la bacteria que se adhieren a los receptores ubicados en la superficie intestinal. Estos piii son estructuras proteínicas filamentosas altamente antigénicas que se extienden desde la superficie de la bacteria (5). Los pili más grandes encontrados en ETEC son F4 (K88), F5 (K99), F6 (987p), F41 , y F1 8. El E. coli enterohemorrágico (EHEC - enterohemorrhagic E. coli) es el principal tipo de E. coli implicado en la enfermedad del edema en cerdos. La base de la colonización y la producción de la toxina es la misma que con el ETEC. El único pilus que se ha asociado con la enfermedad del edema en cerdos es F1 8, asociándose la variante F18ab más comúnmente con la enfermedad del edema. La toxina producida por el EHEC es conocida como Stx2e. Esta toxina pertenece a una familia de toxinas llamadas shiga o verotoxinas. Es una proteína de alto peso molecular que se une a receptores específicos en células endoteliales vasculares en algunos tejidos objetivo (5). Por lo tanto, la enfermedad observada con el EH EC es un resultado de toxemia. El receptor para la toxina se encuentra en vasos sanguíneos en el cerebro, párpado, pared estomacal, mesenterio del colon, y la médula espinal (5). La toxina ocasiona daños y muerte a las células endoteliales en estos órganos objetivo. Las cepas de E. coli enteropatogénico (EPEC -Enteropathogenic E. coli), también conocidas por adherirse al y desvanecer el E. coli (AEEC - attaching and effacing E. coli) puede desempeñar un papel en la enfermedad diarréica de los cerdos. Estas cepas solamente se han investigado como causa de diarrea en cerdos destetados y se asociaron primeramente con diarrea en los seres humanos (5). El EPEC ocasiona la enfermedad al formar una adherencia a las células epiteliales intestinales del cerdo, posiblemente mediante el uso de pili, y ocasiona la destrucción de los microvellos (5). Las lesiones son llamadas lesiones de adherencia y desvanecimiento. No se encuentra disponible ninguna profilaxis universalmente efectiva para la enfermedad del post-destete de E. coli (4). Es fundamental para la prevención de la enfermedad evitar la atrofia y colonización vellosas (7). La atrofia y colonización vellosas se encuentran relacionadas con muchos factores tales como una infección del rotavirus, dieta, STb, y estrés (7). Los factores administrativos que contribuyen al estrés son cambios en la temperatura, sobrepoblación, cambios en la alimentación, humedad, y mezcla de cerdos. Actualmente no se encuentra comercialmente disponible ninguna vacuna comercial para la enfermedad de post-destete de E. coli. Sin embargo, existen compañías que prepararán para cada granja una vacuna muerta o viva modificada utilizando una cepa atenuada de E. coli patogénico encontrado en la granja. Esta vacuna generalmente contiene pili F1 8 o K18 pero carece de los genes de toxina. La cepa atenuada frecuentemente se desarrolla en la granja y se alimenta o se administra intranasalmente a los cerdos. También se utilizan toxoides elaborados a partir de Stx2, pero tampoco se encuentran comercialmente disponibles. Estas vacunas frecuentemente no son muy puras e incluso pueden impactar la mortalidad debido a la enfermedad de E. coli, generalmente no disminuyen la mortalidad a niveles aceptables. La inmunoglobulina de huevo producida por gallinas que fueron vacunadas contra los antígenos de E. coli de franjas también se han desarrollado como un polvo de huevo con contenido de anticuerpos en alimento para cerdos (4) . La inmunoglobulina de huevo se produce al vacunar la gallina con una cepa atenuada de ETEC o con franjas derivadas de las cepas de E. coli patogénico. Después se recogen las yemas de huevo, y el polvo de anticuerpo de yema de huevo se obtiene después al liofilizar la fracción de proteína soluble en agua de yemas de huevo (9). La teoría fue que proporcionaría protección inmunológica contra la colonización de E. coli positiva para K88 y F 8 (4). Marquardt et al. demostraron que los anticuerpos de yema de huevo fueron capaces de evitar experimentalmente la diarrea inducida por ETEC en cerdos destetados a los 3 días y a los 21 días, y también disminuyó la ocurrencia de diarrea en cerdos destetados precozmente durante un estudio de prueba de campo (9). Sin embargo, no siempre se observa esto en el campo, y los productores parecen obtener resultados mixtos utilizando anticuerpos de yema de huevo. Lo que se ha demostrado es que la protección se proporciona solamente contra las cepas estimuladas que solamente tienen las franjas de F18 en común con las cepas (4) de vacuna. La protección también puede ocurrir solamente para la cepa de E. coli para la que fue vacunada la gallina. Otra desventaja es que la inm unoglobulina de huevo puede ser cara de incluir en las dietas de cerdos. Algunos cerdos son resistentes genéticamente a las cepas de ETEC y EHEC debido a que carecen genéticamente del receptor de pili K88 y/o F1 8. La reproducción para resistencia genética puede ayudar a controlar la enfermedad de E. coli. La parte difícil acerca de este proceso es el costo de las experimentaciones y la falta de pruebas disponibles. Se ha desarrollado una prueba de propiedad para la presencia de receptores de F18, pero no existen pruebas para el receptor de K88 (6). Frecuentemente se añaden antibióticos para alimentación como preventivo. Existen muchas desventajas tales como la aceptación del consumidor y la selección de bacterias resistentes (4). Para este propósito se utilizan numerosas sustancias antim icrobianas, algunas incluyen: sulfonamida, trimetoprima, gentamicina, y otros aminoglicósidos. Los aislados del ETEC y del EHEC muestran la tasa más alta de resistencia en E. coli de cerdos, y la resistencia se induce frecuentemente en cuestión de días o en unas cuantas" semanas (4). El óxido de cinc y el plasma porcino deshidratado por aspersión incluidos en dietas de cerdos destetados también se han utilizado con éxito variado. Una vez que ocurre el desencadenamiento de E. coli, debe administrarse el tratamiento a fin de disminuir la mortalidad y la morbilidad. La terapia antimicrobiana ha sido el tratamiento de elección. Los antibióticos pueden administrarse parenteralmente o en agua una vez que se detecta el agua. La resistencia antibiótica con los aislados de E. coli es ampliamente conocida. La resistencia de E. coli patogénico se ha detectado contra cada antibiótico aprobado para su uso (4). Los electrolitos también pueden ser ofrecidos como una elección de tratamiento pero puede variar costosamente para el productor. Un factor importante que podría dar como resultado una falla del tratamiento actual y de las técnicas de prevención es la alta diversidad genética de las cepas de ETEC y EHEC. Se ha mostrado un alto grado de heterogeneidad entre los aislados derivados del m ismo estado y granja (8). Wilson, et al. demostraron que los serotipos asociados con la diarrea de post-destete parecen estar limitados pero tienen antecedentes genéticos muy diversos (1 0). Esto le lleva a uno a considerar que múltiples cepas de los mismos factores de virulencia o serotipo son la causa de un solo desencadenamiento de enfermedad de E. coli en una granja. La causa de la heterogeneidad es incierta, pero puede deberse al hecho de que la transferencia genética puede ocurrir fácilmente en E. coli de cerdo. El hecho de que siempre se utilizan antibióticos, vacunas, y otros tratamientos estimula la necesidad de la transferencia genética para la sobrevivencia del E. coli de cerdo patogénico. Además, la gran cantidad de transmisión oral fecal en sistemas porcinos proporciona un ambiente necesario para que ocurra la transferencia genética. Esta heterogeneidad es evidencia de explicar porqué fallan muchos métodos tradicionales de tratamiento y prevención. Por lo tanto, lo que se necesita es uno o más microorganismos Bacillus aislado que sea(n) capaz de al menos uno de entre (A) inhibir la enfermedad de E. coli y (B) mejorar el rendimiento de un animal. También se requiere un método para alimentar cerdos o uno o más de los microorganismos Bacillus anteriormente mencionados para inhibir la enfermedad de E. coli y/o mejorar el rendimiento del cerdo. También se requiere un método para formar un agente microbiano de alimentación derivado de los microorganismos Bacillus anteriormente mencionados.

Breve descripción de la invención La invención, que es definida por las reivindicaciones expuestas al final de esta descripción, pretende solucionar al menos algunos de los problemas expuestos con anterioridad. Se proporciona un microorganismo aislado del género Bacillus que sea capaz al menos de uno de los siguientes: (A) inhibir la enfermedad de E. coli, y (B) mejorar el rendimiento de un animal. En una modalidad, el microorganismo se selecciona a partir del grupo que consiste en las cepas 3A-P4, 1 5A-P4, y 22C-P1 . En otra modalidad, el microorganismo es la cepa 1 5A-P4. Se proporciona también una combinación de microorganismos que comprende al menos dos de los microorganismos anteriormente listados. También se proporciona un método para alimentar cerdos. En el método, al menos una de las cepas anteriormente listadas se le proporciona como alimento al cerdo. También se proporciona un método para formar un agente microbiano de alimentación directa que incluye al menos una de las cepas anteriormente listadas. En el método se desarrolla al menos una de las cepas anteriormente listadas en un caldo de nutriente l íquido. El microorganismo se separa del líquido para formar el agente microbiano de alimentación directa.

Breve descripción de los dibujos Las modalidades preferidas a manera de ejemplo de la invención se ilustran en los dibujos acompañantes en los cuales: La Figura 1 es un diagrama que muestra la colonización y la enfermedad debido a E. coli Enterotoxigénico (ETEC) , E. coli Enteropatogénico (EPEC), y E. coli Enterohemorrágico (EHEC). La Figura 2 es un dendograma de los aislados de E. coli obtenidos a partir del laboratorio de diagnóstico que combina el análisis RAPD (random amplified polymorphic DNA - ADN polimórfico amplificado aleatorio) utilizando el imprimador 1 y el imprimador 2. También se muestran los resultados múltiplex reportados provenientes de un laboratorio de diagnóstico y los resultados múltiplex obtenidos del laboratorio de Agtech Products. La Figura 3 es una imagen de gel de dos conjuntos de impresiones digitales de ADN para las tres cepas preferidas de aislados de Bacillus: 3A-P4 (pistas 1 y 5), 15A-P4 (pistas 2 y 6), y 22C-P1 (pistas 3 y 7). En la pista 4 se encuentra un marcador de peso molecular de 100 bp (Bio-Rad, Hercules, CA). Se utilizaron dos diferentes imprimadores de 1 0 bp para dos conjuntos de análisis de ADN polimórfico amplificado aleatorio en los aislados, con resultados del primer conjunto mostrados en las pistas 1 -3, y los resultados del segundo conjunto mostrados en las pistas 5-7. La Figura 4 es una gráfica que muestra la inhibición porcentual de la cepa de E. coli E.20 por el aislado de Bacillus 3A-P4 con lecturas de diferente densidad óptica (OD - optical density). La Figura 5 es una gráfica que muestra la inhibición porcentual de la cepa de E. coli E.20 por el aislado de Bacillus 1 5A-P4 con lecturas de diferente densidad óptica (OD - optical density). La Figura 6 es una gráfica que muestra la inhibición porcentual de la cepa de E. coli E.20 por el aislado de Bacillus 22C-P 1 con lecturas de diferente densidad óptica (OD - optical density) . La Figura 7 es una gráfica que muestra la inhibición porcentual de las cepas de E. coli E.20 y E.23 por el aislado de Bacillus 3A-P4 en diferentes momentos. La Figura 8 es una gráfica que muestra la inhibición porcentual de las cepas de E. coli E.20 y E.23 por el aislado de Bacillus 1 5A-P4 en diferentes momentos. La Figura 9 es una gráfica que muestra la inhibición porcentual de las cepas de E. coli E.20 y E.23 por el aislado de Bacillus 22C-P1 en diferentes momentos. La Figura 10 es una gráfica que muestra las curvas de desarrollo, en ausencia de cualquier aislado de Bacillus, de cepas de E. coli E.20 y E.23 en diferentes momentos. La Figura 1 1 es un SDS-PAGE en 1 5A-P4 después de la precipitación de sulfato de amonio. P= fracción de comprimido (pellet), S= fracción de sobrenadante. La caja delinea la probable proteína inhibidora ubicada entre el marcador de peso molecular 31 ,000 y 45,000. El (+) denota la inhibición de E. coli utilizando el método de placa indicadora. El (-) no denota ninguna inhibición de E. coli utilizando el método de placa indicadora. Las Figuras 12A y 12B son las gráficas que muestran el modo de acción del metabolito activo producido por 3A-P4 en la cepa de E. coli E20 (Figura 1 2A) y la cepa de E. coli E23 (Figura 1 2B). Las Figuras 1 3A y 13B son las gráficas que muestran el modo de acción del metabolíto activo producido por 1 5A-P4 en la cepa de E. coli E20 (Figura 13A) y la cepa de E. coli E23 (Figura 1 3B) . Las Figuras 14A y 14B son las gráficas que muestran el modo de acción del metabolito activo producido por 22C-P1 en la cepa de E. coli E20 (Figura 14A) y la cepa de E. coli E23 (Figura 14B). Las Figuras 1 5A y 1 5B son las gráficas que muestran el efecto de una modalidad preferida de una combinación de las cepas de Bacillus (Producto 3) en el peso de los cerdos para la Prueba de Campo E en el Día 7 (Figura 1 5A) y en el Día 15 (Figura 1 5B) . La Figura 16 es una gráfica que muestra el efecto del Producto 3 en ADG para la Prueba de Campo E. La Figura 17 es una gráfica que muestra el efecto del Producto 3 en el consumo de alimento para la Prueba de Campo E. Las Figuras 18A y 1 8B son gráficas que muestran el efecto del Producto 3 en la mortalidad para la Prueba de Campo E en los Días 0-7 (Figura 1 8A) y en los Días 0-28 (Figura 18B). La Figura 19 son los resultados múltiplex de la Prueba de Campo E. Antes de explicar detalladamente las modalidades de la invención, debe comprenderse que la invención no se encuentra limitada a su aplicación a los detalles de construcción y la configuración de los componentes expuestos en la siguiente descripción o ilustradazos en los dibujos. La invención es capaz de otras modalidades o de practicarse en diversas maneras. También, debe comprenderse que la fraseolog ía y terminolog ía empleadas en la presente se brindan para propósitos de descripción y no deben considerarse como limitantes. Las referencias citadas a lo largo de la solicitud se incorporan para referencia en la presente.

Descripción detallada de la modalidad preferida Definiciones: Las siguientes definiciones pretenden ayudar a proporcionar una comprensión clara y consistente del alcance y el detalle de los términos: Como se utiliza en la presente, "metabolito activo" se refiere a una sustancia producida por bacterias y que tiene actividad antibacterial hacia otros géneros de bacterias. Como se utiliza en la presente, "animal" se refiere a un organismo multicelular del reino Animalia. Como se utiliza en la presente, "bacteriocina" se refiere a una sustancia producida por bacterias y que tiene actividad antibacterial hacia otros géneros de bacterias. Como se utiliza en la presente, "mezcla base" o "mezcla base concentrada" se refiere a las cepas de Bacillus añadidas a un vehículo a fin de elaborar una forma de mezcla base. La forma concentrada se encuentra compuesta de las cepas de Bacillus añadidas al veh ículo de forma más concentrada. La mezcla base o las formas de mezcla base concentrada se añaden después al alimento a una tasa de inclusión deseada y se le dan como alimento al animal. Como se utiliza en la presente, "rendimiento" se refiere al desarrollo de un animal, tal como un cerdo, medido por los siguientes parámetros: ganancia diaria promedio (ADG - average daily gain), peso, mortalidad, conversión de alimento, que incluye tanto alimento:ganancia como ganancia:alimentación, y consumo de alimento.

"Una mejora en el rendimiento" como se utiliza en la presente, se refiere a una mejora en al menos uno de los parámetros listados anteriormente bajo la definición de rendimiento. De acuerdo con la presente invención, pueden emplearse biolog ía y microbiología moleculares convencionales como es conocido en la materia. Tales técnicas se explican detalladamente en la literatura. Ver, por ejemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Clonación molecular: un manual de laboratorio.) , Tercera Edición (2001 ), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Las formadoras de esporas aeróbicas y facultativas del género Bacillus fueron aisladas. Las especies de Bacillus son las únicas formadoras de esporas que son consideradas GRAS (generally recognized as safe - reconocidos generalmente como seguros), es decir, generalmente se reconocen seguras. En una modalidad preferida, se incluyó una especie de Bacillus solamente si ten ía el estado GRAS. Las especies de Bacillus se aislaron de las muestras ambientales tales como crías de aves de corral y desechos animales y se examinaron. También pueden examinarse otras fuentes de Bacillus. Se examinó la capacidad de las cepas de Bacillus para su capacidad de inhibir el desarrollo del E. coli de cerdo patogénico. Aunque no se pretende como una limitante a la presente descripción, se considera que la inhibición se realiza mediante la secreción de un metabolito activo derivado del Bacillus. Aunque los solicitantes no desean restringirse a alguna teoría particular sobre cómo el metabolito activo inhibe al desarrollo microbial y no pretenden limitar la presente descripción, se considera que el metabolito activo es una sustancia proteinácea y, más específicamente, se considera que es un bactericida. Se probó la capacidad de los aislados de Bacillus para inhibir diversas cepas patogénicas de E. coli de cerdo. Las cepas de E. coli se obtuvieron a partir de laboratorios de diagnóstico de animales, ambientes para cerdos, y materia fecal. Las cepas de E. coli demostraron ser patogénicas al realizar una PCR patogénica para detectar pili y genes de toxinas asociados con la enfermedad de E. coli patogénica en cerdos. A fin de probar la producción del metabolito activo, los aislados de Bacillus se colocaron en placas de réplica sobre placas indicadoras de patógenos, las cuales se formaron a partir de una vacuna patogénica al 1 % de la cepa de E. coli de cerdo patogénico. Además, la actividad del metabolito activo de los aislados de Bacillus se reconfirmó utilizando un método de prueba de manchas. Los aislados de Bacillus se probaron después utilizando pruebas bioquímicas para determinar si los aislados ten ían el estado de GRAS. Después se determinó el espectro de actividad de los diversos aislados de Bacillus. Se probó la actividad de los aislados de Bacillus contra los patógenos conocidos de E. coli de cerdos recogidos de diferentes regiones de los Estados Unidos utilizando el método de prueba de manchas. Esto se realizó para confirmar que la actividad producida por los aislados de Bacillus sería útil a todo lo largo de los Estados Unidos. Los aislados de Bacillus que mostraron la actividad inhibidora más alta contra numerosas cepas de E. coli patogénico se caracterizan además por su nivel de actividad. A partir de estos experimentos, se encontraron tres cepas de Bacillus preferidas: 3A-P4, 1 5A-P4, y 22C-P 1 , aunque también pueden utilizarse otras cepas. Se prefirieron estas cepas debido al número de cepas de E. coli patogénicas que se inhibieron cada una de ellas y debido a su estado de GRAS. El 12 de Enero de 2005, las cepas 3A-P4, 15A-P4, y 22C-P1 se depositaron en el Compendio de Cultivo de Tipo Americano, 10801 University Blvd. , Manassas, VA 201 10-2209 y se les otorgó los números de acceso PTA-6506 (3A-P4), PTA-6507 (15A-P4), y PTA-6508 (22C-P 1 ). Los depósitos se realizaron bajo las condiciones del Tratado de Budapest del Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para Propósitos de Procedimientos de Patentes. Las cepas 3A-P4, 1 5A-P4, y 22C-P 1 , pueden proporcionársele como alimento individualmente o en combinación, a los cerdos, aunque se incluyen otras cepas dentro del alcance de la invención. Para las cepas de Bacillus 3A-P4, 1 5A-P4, y 22C-P 1 , se determinaron los tiempos de desarrollo para la producción de un nivel óptimo del metabolito activo utilizando el método de actividad de caldo. También se determinó el tiempo de incubación de prueba en el cual ocurrió la inhibición óptima de E. coli utilizando el método de actividad de caldo. Para esto, el metabolito activo se añadió a un cultivo de E. coli y se leyeron las ODs en diversos momentos. Se probó la actividad de los aislados de Bacillus 3A-P4, 1 5A-P4, y 22C-P 1 contra 142 patógenos de E. coli de cerdo conocidos recogidos de diferentes regiones de los Estados Unidos utilizando el método de actividad de caldo. Estas cepas inhibieron a grados variables cien por ciento de las cepas de E. coli probadas. Las cepas pueden utilizarse solas o en combinación para inhibir el desarrollo de E. coli de cerdo patogénico. Los tres aislados de Bacillus preferidos de la invención se aislaron a partir de diferentes regiones geográficas de Norte América y a partir de diferentes fuentes ambientales. Específicamente, la cepa 3A-P4 se aisló a partir de crías de ave de corral provenientes de Canadá, la cepa 1 5A-P4 se aisló a partir de las crías de pavo provenientes del Este de Estados Unidos, y la cepa 22C-P1 se aisló a partir de una laguna de cerdos proveniente del Este de Estados Unidos. El metabolito activo se purificó después a partir de cada uno de los aislados de Bacillus en dos niveles: primero, se obtuvo una purificación cruda del metabolito activo al filtrar el sobrenadante de cultivo, y segundo, se obtuvo un metabolito activo purificado parcialmente al salar el metabolito activo y al fraccionarlo después por cromatografía de columnas. La estabilidad y caracterización del metabolito activo se determinó después utilizando la forma cruda del metabolito activo al realizar pruebas de enzimas y degradación térmica, modo de pruebas de acción, y pruebas de sensibilidad antibiótica. También se determinaron las condiciones de medios óptimos y tiempo para el desarrollo celular y la formación de esporas. La caracterización adicional de los aislados de Bacillus 3A-P4, 1 5A-P4, se realizó, incluyendo las impresiones digitales de ADN y determinando la estabilidad de los aislados en una premezcla para cerdos a 60°C durante 8 semanas. Mediante estudios de pruebas de campo, se determinó que las cepas de Bacillus mejoran también el rendimiento del cerdo de criadero. Por lo tanto, es rentable que el productor incluya rutinariamente las cepas de Bacillus, sea individualmente o en combinación, en alimento no solamente para evitar la enfermedad de E. coli sino también para mejorar el rendimiento. Los aislados de Bacillus de la invención, que inhiben el E. coli patogénico, pueden alimentarse directamente al cerdo para inhibir la enfermedad de E. coli del cerdo patogénico y mejorar el rendimiento del cerdo. Proporcionarle como alimento los microorganismos que tienen estado de GRAS al ganado es una práctica aceptable entre los productores, veterinarios, y otros en la industria de la ganadería. Al inhibir este patógeno en el cerdo, los aislados de Bacillus reducen y evitan incluso la enfermedad del E. coli en los cerdos. Los aislados de Bacillus pueden administrarse como un preventivo contra las piaras que actualmente no infectaron el E. coli patogénico. En una modalidad preferida, los cerdos recién destetados son alimentados con los aislados de Bacillus mediante la fase de criadero a fin de inhibir o incluso evitar brotes de la enfermedad de E. coli y mejorar el rendimiento. Sin embargo, uno o más aislados de Bacillus puede(n) alimentarse en otras fases también. La administración de rutina de los microorganismos se reduce dramáticamente e incluso elimina los brotes de la enfermedad de E. coli en las instalaciones de producción animal y mejora el rendimiento de cerdos. Los aislados de Bacillus pueden administrarse como un agente microbial de alimentación directa. La administración de uno o más microorganismos de alimentación directa a animales se lleva a cabo por cualquier método convencional, incluyendo añadir los aislados de Bacillus al agua que beben los animales o a su alimento, o por inserción oral directa. En una modalidad preferida, el microorganismo se le proporciona como alimento a los animales al añadirlo al alimento o agua de los animales. Los aislados de Bacillus se administran preferentemente como esporas. Los aislados de Bacillus pueden presentarse en diversas formas físicas, por ejemplo, como una cubierta, enjuague líquido, cápsula de gelatina, gel, o se añaden al agua. En forma de alimento, los aislados pueden presentarse en forma de mezcla base o una forma concentrada de la mezcla base. En una modalidad preferida de una forma de cubierta, el producto de fermentación de Bacillus liofilizado se añade a un veh ículo, tal como suero, manto maltodextrina, sucrosa, dextrosa, piedra caliza (CaC03), cascaras de arroz, cultivo de levadura, almidón seco, o aluminato de sílice de sodio. En una modalidad preferida de la forma de enjuague líquido, el producto de fermentación de Bacillus liofilizado se añade a un veh ículo, tal como suero, maltodextrína, sucrosa, dextrosa, almidón seco, o aluminato de sílice de sodio, y si añade un l íquido para formar el enjuague. En una modalidad preferida de la forma de cápsula de gelatina, el producto de fermentación de Bacillus liofilizado se añade a un vehículo, tal como suero, maltodextrina, azúcar, piedra caliza (CaCO3), cascaras de arroz, almidón seco de cultivo de levadura, o aluminato de sílice de sodio. Los aislados de Bacillus y el vehículo pueden incluirse en una cápsula de gelatina degradable gastrointestinal. En una modalidad preferida de la forma de gel, el producto de fermentación de Bacillus liofilizado se añade a un vehículo, tal como aceite vegetal, sucrosa, dióxido de silicio, polisorbato 80, propilenglicol, hidroxianisola butilada, y ácido cítrico, o una coloración artificial para formar el gel. En una modalidad preferida de la forma de agua, el producto de fermentación de Bacillus liofilizado se añade a un vehículo, tal como sucrosa, dextrosa, aluminato de sílice de sodio, y coloración artificial. En una modalidad preferida de la mezcla base o de la forma de mezcla base concentrada, el producto de fermentación de Bacillus liofílizado se añade a un vehículo, tal como, pero no se limita a, cascaras de arroz, orujos secos para cerveza, piedra caliza, o baylith para el control de humedad. También puede utilizarse otro veh ículo adecuado y compatible para estas cepas. Los microorganismos pueden administrarse por deshidratación por aspersión, liofilización, deshidratación de lecho fluidizado, se utilizan en forma de fermentación de estado sólido, así como también otras formas. Para la liofilización, la pasta celular húmeda preferentemente se mezcla después con crioprotectores, que mantienen la viabilidad de las células durante el proceso de congelación y deshidratación. Después, la mezcla se coloca en bandejas, se congela y subsecuentemente se seca. Para la deshidratación por aspersi?n, la pasta o pasta aguada se mezcla después con auxiliares de deshidratación por aspersión, si es aplicable, y se deshidrata por aspersión. La masa seca resultante, obtenida a partir de métodos de deshidratación o de un método de fermentación de estado sólido, se muele después hasta lograr un tamaño uniforme y se coloca en placas para determinar la actividad. Después de que se ha determinado una cuenta celular viable, preferentemente la cuenta celular se estandariza hasta un nivel de actividad predeterminado o unidades de formación de colonias (CFU - colony forming units) por gramo al mezclar con vehículos secos. Para producir los aislados de Bacillus se desarrollan uno o más aislados en un caldo de nutriente l íquido, tal como TSB, preferentemente a un nivel en el que se forma el número más alto de esporas. En una modalidad preferida, los aislados crecen con una OD donde el rendimiento de esporas es de al menos 1 *109 unidades de formación de colonias (CFU) por mililitro de cultivo. Las cepas bacteriales de la presente invención se producen por fermentación de las cepas de bacteriales. La fermentación inicia al acelerar cultivo de siembra. Esto involucra repetidamente y asépticamente transferir el cultivo a un mayor volumen a fin de servir como la vacuna para la fermentación, lo cual se lleva a cabo en grandes termentadores de acero inoxidable en un medio con contenido de proteínas, carbohidratos, y minerales necesarios para un desarrollo óptimo. Un medio no limitante a manera de ejemplo es TSB. Después de que la vacuna se añade al recipiente de fermentación, se controlan la temperatura y la fermentación para permitir el máximo desarrollo. Una vez que el cultivo alcanza una densidad poblacional máxima, se cosecha de cultivo al separar las células del medio de fermentación. Esto se realiza comúnmente por centrifugación. Después, puede determinarse la cuenta del cultivo. La cuenta de las bacterias es importante cuando se combina con un vehículo. Al momento de la elaboración de la composición, preferentemente la cuenta de Bacillus es de al menos aproximadamente 1 .0*101 1 CFU/g. Las cuentas pueden incrementarse o disminuir a partir de los números base y tener aún una eficacia total. La CFU o unidad de formación de colonias es la cuenta celular viable de una muestra resultante derivada de métodos microbiológicos convencionales de colocación en placas. El término deriva del hecho de que una sola célula cuando se coloca en placas en el medio apropiado que se desarrollará y volverá una colonia viable en el medio de ágar. Dado que múltiples células que pueden originar una colonia visible, el término unidad de formación de colonias es una medición de unidad más útil que el número de células. Para preparar las composiciones, los cultivos y el veh ículo pueden añadirse a un mezclador de cintas o de paletas y mezclarse preferentemente durante aproximadamente 1 5 minutos. Los componentes se combinan de manera tal que se obtiene una mezcla uniforme del vehículo y los cultivos. El producto final es preferentemente un polvo seco con capacidad de deslizamiento. Los vehículos a manera de ejemplo en esta composición son cascaras de arroz, orujos secos para cerveza, piedra caliza, baylith, hubo otros veh ículos adecuados para microorganismos. El rango de dosificación preferido del enjuague l íquido, cápsula de gelatina, y gel es de aproximadamente 1 *104 CFU/g o ml/día hasta aproximadamente 1 *1010 CFU/g o ml/día, y más preferentemente aproximadamente 1 *1 06 CFU/g o ml/d ía. El rango de dosificación preferido de la cubierta, mezcla base, y pre-mezcla es de aproximadamente 1 *103 CFU/g de alimentación aproximadamente a 1 *108 CFU/g de alimento, y más preferentemente aproximadamente 1 *106 CFU/g de alimento. El rango de dosificación preferido para la inclusión en agua es de aproximadamente 1 *1 03 CFU/cerdo/d ía hasta aproximadamente 1 *1010 CFU/cerdo/d ía, y más preferentemente aproximadamente 1 *1 08 CFU/cerdo/día. Aunque estos ejemplos utilizan Bacillus liofilizados como ingrediente en las cubiertas, enjuague líquido, cápsula de gelatina, geles, agua, y formas de alimento no es necesario liofilizar el Bacillus antes de proporcionárselo a los cerdos como alimento. Por ejemplo, puede utilizarse el Bacillus deshidratado por aspersión, deshidratado por lecho fluidizado, o de fermentación de estado sólido, o el Bacillus en otros estados. Los microorganismos también pueden administrarse en una pasta aguada celular húmeda, con o sin conservadores, en forma concentrada, no concentrada, o diluida. La composición utilizada en los ejemplos mostrados se produjo como se explica continuación: la cepa 3A-P4 con una cuenta de 7* 1 01 1 CFU/g , 1 5A-P4 con una cuenta de 8.4*1 01 1 CFU/g, y 22C-P 1 con una cuenta de 6*101 1 CFU/g se combinaron en diferentes tasas con vehículos a fin de determinar la mejor relación para inhibir el E. coli de cerdo patogénico y mejorar el rendimiento de criadero. Las combinaciones fueron las siguientes: Producto 1 : 30% de la cuenta total de la cepa 3A-P4, 60% de la cuenta total de la cepa 1 5A-P4, 10% de la cuenta total de la cepa 22C-P 1 para una cuenta final de bacterias de 5.1 *1 08 CFU/g; Producto 2: 100% de la cuenta total de la cepa 22C-P 1 con una cuenta final de bacterias de 4.5*108 CFU/g; y Producto 3: 90% de la cuenta total de la cepa 22C-P1 , 10% de la cuenta total de la cepa 15A-P4 con una cuenta final de bacterias de 5.1 *1 08 CFU/g. En los Ejemplos, todas las combinaciones anteriores se añadieron al alimento para una cuenta final de 1 .10*6 CFU/g de alimento y se alimentaron mediante la fase de criadero. Los vehículos utilizados en todas las combinaciones utilizados en los experimentos fueron 40%o de cascaras de raíz, 1 9% de orujos secos de cerveza, 40% de piedra caliza, y 1 % de baylith del control de humedad. Una combinación preferida el 90% de la cuenta total de la cepa 22C-P 1 y 10% de la cuenta total de la cepa 1 5A-P4. Esta combinación se encontró efectiva para disminuir la enfermedad de E. coli de cerdo y mejorar el rendimiento del cerdo. Las combinaciones adicionales y composiciones de cepa individual que son útiles incluyen una combinación de aproximadamente 90%o de la cuenta total de la cepa 1 5A-P4 y aproximadamente 10% de la cuenta total de la cepa 22C-P1 con una cuenta final de bacterias de aproximadamente 1 *1 06 CFU/g de alimento y 100% de 1 5A-P4 con una cuenta final de bacterias de aproximadamente 1 *106 CFU/g de alimento. Las cepas de Bacillus proporcionadas en la presente son capaces de lograr al menos uno de los siguientes objetivos en cerdos: (A) inhibir la enfermedad de E. coli y B) mejorar el rendimiento. Se ha demostrado que una o más cepas de Bacillus son eficaces para estos propósitos cuando se le proporciona como alimento a los cerdos de criadero. Se considera que alimentar una o más cepas de Bacillus proporcionadas en la presente también sería útil cuando se alimenta a cerdos en otras etapas de sus vidas. Por ejemplo, se considera que proporcionarle una o más cepas de Bacillus a ganado en reproducción, incluyendo cerdas adultas, cerdas prim íparas, y verracos y a cerdos en fase lactante, y cerdos en etapa de finalización proporcionaría también beneficios para inhibir la enfermedad de E. coli y/o mejorar el rendimiento. Una o más cepas de Bacillus también han demostrado ser benéficas cuando se le proporcionan como alimento a aves de corral. Por ejemplo, las poblaciones de £. coli patogénico aviar se han reducido cuando la cepa 1 5-A-P4 se le proporcionó como alimento a aves de corral.

Ejemplos Los siguientes Ejemplos se proporcionan solamente para propósitos ilustrativos. Los Ejemplos incluidos en la presente solamente ayudan a una comprensión más completa de la invención descrita actualmente. Los Ejemplos no limitan el alcance de la invención descrita o reivindicada en la presente de manera alguna.

Ejemplo 1 Aislamiento de cepas de Bacillus de producción de metabolitos activos y aislamiento de cepas patogénicas A. Cepas y medios de Bacillus: Se examinaron las cepas microbiales provenientes de crias de pollo, crías de pavo, desechos de cerdo, y desechos de manteca para analizar las cepas de Bacillus. La muestra ambiental se pesó y mezcló con huecos de peptona estériles para realizar una dilución de 10" 1. A fin de pasteurizar, y consecuentemente, seleccionar formadoras de esporas aeróbicas y facultativas, la muestra se colocó en un triturador durante un minuto y después se calentó durante treinta minutos en un baño de agua a 63 °C. Después, la muestra se colocó en placas de manera serial sobre Ágar de Soya Tríptica (TSA - Tryptic Soy Agar) y se incubó a 32° durante 24-48 horas a fin de obtener los aislados. B. Cepas y medios de E. coli patógeno: Se obtuvo una recolección inicial de cepas patógenas derivadas de un laboratorio de diagnóstico de cerdos. Esta incluyó dos cepas de E. coli K88 y F1 8. Los aislados se almacenaron como material congelado a -85 °C en TSB complementado con glicerol al 1 0% . Para el proceso de examinación inicial, se utilizaron las tres cepas de E. coli en las pruebas para examinar la actividad de los aislados de Bacillus contra E. coli. Los patógenos de E. coli de cerdo probados no se desarrollaron durante toda la noche en caldo de Soya tríptico (TSB) a 37 °C. Una vacuna al 1 % se transfirió a su medio correspondiente al d ía siguiente y se incubó a 37 °C hasta que el valor de OD a 600 nm fue de 0.600.

Ejemplo 2 Actividad de aislados de Bacillus contra E. coli: A. Zona de prueba de inhibición: Se determinó la actividad contra E. coli al colocar en placas réplicas de los aislados de Bacillus sobre las placas indicadoras con contenido de patógenos de E. coli de cerdo. Las placas indicadoras de patógenos se formaron al transferir 1 % de una vacuna patógena de E. coli de cerdo, desarrollada como se describe con anterioridad, en TSA templado. Se vertieron siete mililitros de este ágar en una caja de Petri a fin de realizar las placas indicadoras de patógenos. Los aislados de Bacillus se colocaron en placas de réplica sobre placas indicadoras de patógeno y se incubaron durante toda la noche a 32 °C. Las placas se observaron después para zonas de inhibición para cada patógeno. Los aislados de Bacillus que produjeron zonas de inhibición fueron retirados de la placa y se desarrollaron en TSB a fin de aislar la colonia para la reconfirmación de su actividad. Los aislados se almacenaron como material congelado a -85 °C en TSB complementado con glicerol al 1 0%.

Se examinó la actividad de treinta mil aislados de Bacillus contra E. coli.

Cincuenta aislados produjeron actividad contra E. coli. B. Prueba de manchas: La actividad de los 50 aislados de Bacillus se confirmó utilizando el método de prueba de placa indicadora al desarrollar los aislados en TSB durante toda la noche a 32 °C. Después, diez mililitros del aislado de Bacillus se inocularon en placas sobre placas indicadoras de patógenos como se describió con anterioridad. Las placas indicadoras se incubaron 24 horas a 32 °C y se observaron para las zonas. Treinta y seis de los cincuenta aislados presentaron actividad contra E. coli después de la reconfirmación utilizando el método de prueba de manchas. La Tabla 2 muestra las cepas de Bacillus que tuvieron actividad contra una o más cepas de E. coli. Debe observarse que algunas cepas de Bacillus tuvieron actividad contra más de una cepa de E. coli.

Tabla 2. Resumen de los aislados de Bacillus de producción de metabolitos activos contra E. coli.

CEPA INDICADORA CEPAS POSITIVAS DE BACILLUS Cepa BH de Escherichia coli K88 1 5 Cepa S de Escherichia coli K88 9 Cepa 8A1 33 de Escherichia coli 1 6 Ejemplo 3 Pruebas bioquímicas en aislados de Bacillus: Todos los aislados de Bacillus que se confirmaron como productores de metabolitos activos se probaron bioquímicamente para identificar los aislados que generalmente se reconocieron como seguros (GRAS). Las pruebas se realizaron tanto por (1 ) métodos de laboratorio tradicionales, incluyendo la coloración de Gram, morfolog ía de colonia, producción de catalasa, utilización de almidón, utilización de caseína, reducción de nitrato, formación de indola, Voges-Proskauer, hidrólisis de gelatina, y producción de citratos y (2) un kit de prueba bioquímico Bacillus API disponible por bioMérieux de Hazelwood, Missouri. Se analizaron treinta y seis aislados de Bacillus utilizando métodos bioqu ímicos tradicionales, que demostraron que seis de los treinta y seis aislados probados fueron posibles coloraciones de GRAS. Estos aislados se volvieron a probar utilizando el kit de prueba API , y los resultados demostraron que los seis aislados se confirmaron por pertenecer a la especie de GRAS. Los aislados que produjeron el espectro más amplio de actividad contra el E. coli se probaron bioquímicamente utilizando un laboratorio de referencia exterior para su identificación final.

Ejemplo 4 Determinación del espectro de actividad contra E. coli de aislados de Bacillus: A. Procedimiento de placa indicadora para determinar el espectro de actividad contra E. coli: Para confirmar que los seis aislados de Bacillus GRAS también fueron eficaces contra los patógenos de E. coli provenientes de otras regiones de los Estados Unidos, se seleccionó una amplia colección de patógenos de E. coli porcino a partir de diversos laboratorios de diagnóstico de animales de I ndiana, Oklahoma, lowa, y Texas. Otros diecinueve aislados de Bacillus GRAS que se demostraron contra otros patógenos también se examinaron contra patógenos de E. coli de laboratorios de diagnóstico. Algunas de estas cepas adicionales se incluyen en la Tabla 4 mostrada a continuación. Después de su llegada, los patógenos que desarrollaron inmediatamente en TSB durante toda la noche a 37 °C. Las placas de banda de cada cultivo se realizaron para asegurar colonias puras, las cuales se desarrollaron nuevamente en sus respectivos medios durante toda la noche a 37 °C. Se obtuvieron cuarenta aislados de E. coli porcino. Las cepas de E. coli representadas fueron K88, K99, 987p, F18, F41 , y 71 8. Las toxinas producidas por E. coli incluyeron las enterotoxinas LT (enterotoxina lábil térmicamente), Sta (enterotoxina a estable térmicamente) , y STb (enterotoxina b estable térmicamente); y la toxina Stx2e de tipo Shiga (el subgrupo Stx2 con la forma de variante e) .

Treinta y siete de los cuarenta aislados de E. coli confirmaron ser E. coli utilizando un kit de pruebas bioquímicas API . Los veinticinco aislados de Bacillus GRAS, que incluyeron los seis aislados que mostraron actividad contra los tres aislados de E. coli originales y los diecinueve aislados que mostraron actividad contra otros patógenos, probaron su actividad contra los treinta y ocho patógenos porcinos de E. coli, utilizando el método de prueba de mancha descrito anteriormente en el Ejemplo 2B. Para cada aislado de Bacillus, se desarrolló una colonia individual durante toda la noche en TSB a 32 °C y se utilizó como el cultivo productor del agente antimicrobial. Los indicadores patógenos se prepararon como se explica a continuación: se desarrolló E. coli en TSB durante 24 horas a 37°C. Después de 24-48 horas de desarrollo, los indicadores patógenos se transfirieron al 1 % en un medio nuevo y se incubaron a 37°C hasta que se alcanzó una OD de 0.6.-1 .0 a 600 nm . Las placas indicadoras de patógenos se prepararon como se describe con anterioridad. Cinco microlitros del cultivo de Bacillus se inocularon en placas sobre la placa indicadora y se incubaron durante 24 horas a 32°C. Después, se observaron las placas para las zonas de inhibición. Como se observa en la Tabla 3, 1 8 de las 25 cepas de Bacillus mostraron actividad inhibidora contra los treinta y siete aislados de E. coli, indicando que se estaba produciendo un metabolito activo que inhibió el patógeno. La cepa 3A-P4 inhibió once aislados de E. coli, 1 5A-P4 inhibió catorce aislados de E. coli, y 22C-P 1 inhibió dieciocho aislados de E. coli. Las cepas 3A-P4, 1 5A-P4, y 22C-P 1 se seleccionaron para su caracterización adicional debido a su actividad incrementada contra E. coli en comparación con los otros 25 aislados de GRAS. Las tres cepas 3A-P4, 1 5A-P4, y 22C-P 1 se probaron contra >140 aislados de E. coli de cerdo patogénico. Cada una de las cepas de Bacillus inhibió los > 140 aislados de E. coli en porcentajes que difieren.

Tabla 3. Número de cepas de E. coli inhibidas por aislados de Bacillus Aislado de Bacillus E. coli _____ _ 3B-P5 2 3C-P2 5 6A-P1 1 6A-P2 2 6A-P5 0 6A-P6 1 6A-P8 1 6A-P12 1 7E-P1 0 9A-P1 0 10A-P4 4 10A-P5 0 10A-P6 2 10B-P1 2 10D-P1 3 10F-P3 1 10F-P5 2 10I-P1 4 10K-P1 2 14C-P1 0 14D-P1 0 15A-P4 14 15B-P3 0 22C-P1 18 B. Caracterización de los aislados de E. coli: La electroforesis de gel múltiplex, RAPD, en el campo sometido a impulsos se realizó en los aislados de E. coli obtenidos a partir de laboratorios de diagnóstico. Después de la llegada, los aislados se desarrollaron y almacenaron como se describió con anterioridad. Todos los aislados de E. coli se clasificaron por genotipo por Agtech Products utilizando PCR múltiplex. Este procedimiento distinguió la E. coli que contenía factores de virulencia responsables de ocasionar la enfermedad en cerdos. El ADN genómico purificado se aisló utilizando un kit de aislamiento de ADN (Roche, Indianápolis, I N). El procedimiento múltiplex se realizó utilizando los agentes reactivos de polimerasa de ADN de Amplitaq Gold (Roche, Branchburg, Nueva Jersey) (7). Se utilizaron nueve imprimadores oligonucleótidos en el procedimiento múltiplex para detectar las toxinas STX2e, LT, STa, y STb; y los pili K88, K99, F 1 8, 987p, y F41 . Los fragmentos de ADN se separaron utilizando gel de agarosa 3: 1 de Nusieve (Biowhittaker, Rockland, ME). Los aislados de E. coli patogénico se analizaron genéticamente utilizando el método de RAPD. Los aislados de E. coli se desarrollaron en TSB durante toda la noche hasta que se obtuvo una OD de 4.0 a 600 nm. El ADN genómico purificado se aisló utilizando el kit de aislamiento de ADN Roche Molecular Biochemicals (Indianápolis, I N). Una vez que se aisló el ADN, se realizó un análisis de RAPD utilizando el kit Ready-To-Go RAPD Analysis Bead de Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ) . El análisis de RAPD se realizó utilizando dos imprimadores de oligonucleótidos de 1 0 pares base en una reacción de cadena de polimerasa. Los fragmentos de ADN se separaron utilizando un gel de agarosa al 1 .5% en 0.5X de regulador de TBE a cien voltios. Se realizó una electroforesis de gel de campo sometido a impulsos (PFGE - pulsed-field gel electrophoresis) utilizando ADN cromosómico incorporado en cuentas de agarosa y se asimiló con Xba I mediante una modificación del método de Rehberger (12) . Los fragmentos de ADN se separaron en gel de agarosa al 0.8% utilizando un sistema de electroforesis CHEF-DR I I I (Bio-Rad). Se visualizan bandas de ADN después del teñido de bromuro de etidio y se capturaron digitalmente utilizando el software de cuarto oscuro Syngene Genesnap (Frederick, MD). La determinación del tamaño molecular de los fragmentos de ADN y el dendograma se realizaron utilizando el software Bionumerics (Kortrigjk, Bélgica) . La población de E. coli aislado de piaras infectadas fue heterogénea, como se muestra en el Dendograma de la Figura 2. El análisis de RAPD diferenció los 48 aislados en 48 patrones genotípicos. De los 48 genotipos, 12 grupos con contenido de 2 o más aislados se identificaron con un coeficiente de similitud de 65% o superior. El grupo más grande contuvo 7 aislados. Los ocho aislados tuvieron menos de 67% de similitud en cualquier otro aislado. La PFGE del ADN cromosómico intacto asimilada con Xba I diferenció 42 aislados en 42 patrones genotípicos. Seis de los 48 aislados no produjeron fragmentos discernibles utilizando PFGE. De los 42 patrones de RAPD, se identificaron 3 grupos con contenido de 2 o más aislados con un coeficiente de similitud de 67% o más. El grupo más grande contuvo 5 aislados. Treinta y seis aislados tuvieron menos de 67% de similitud en cualquier otro aislado.

Ejemplo 5 Caracterización de cepas de Bacillus 3A-P4, 15A-P4, y 22C-P1 : A. I mpresión digital de ADN: La impresión digital de ADN de las cepas 3A-P4, 1 5A-P4, y 22C-P1 se realizó por análisis de PCR de ADN polimórfico amplificado aleatorio (RAPD) en ADN genómico aislado de las cepas 3A-P4, 15A-P4, y 22C-P1 utilizando el kit de aislamiento de ADN Roche Molecular Biochemicals (Hoffmann-La Roche, Inc. , Nutley, NJ). El análisis de PCR de RAPD se realizó utilizando el kit Ready-to-go RAPD Analysis Bead de Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ) utilizando dos diferentes imprimadores de oligonucleótidos de 10 pares base en dos conjuntos de reacciones de cadena de polimerasa. Los dos conjuntos de patrones de bandas de ADN, generados a partir de dos diferentes imprimadores de 10 bp, a partir de las cepas 3A-P4, 15A-P4, y 22C-P1 mostradas en la Figura 3 con un marcador de peso molecular de 1 00 bp de Bio-Rad, en la pista 4, separando los conjuntos. Aunque algunas bandas se compartieron entre las cepas, no se encontró ninguna impresión digital de ADN entre las tres cepas, lo cual indica que las cepas 3A-P4, 15A-P4, y 22C-P 1 son diferentes. B. Estabilidad en premezcla: Se añadieron las cepas 3A-P4, 15A-P4, y 22C-P1 a 5.0*108 a 500g de premezcla de ración de cerdos. La premezcla se incubó en un horno de secado a 60 °C durante ocho semanas. La enumeración de esporas se realizó semanalmente a 10"6, 10"7 , y 10"8 . No fue evidente ninguna disminución en la cuenta de esporas durante esta prueba. Las cepas 3A-P4, 1 5A-P4, y 22C-P 1 fueron visibles en raciones de premezcla con contenido básicamente de minerales a temperaturas que pueden ubicarse en climas más cálidos cuando el alimento se almacena en almacenes, graneros, o depósitos de alimento. Esta prueba también presentó cepas de Bacillus viables a una concentración mineral alta. C. Sensibilidad de antibiótico: Las cepas 3A-P4, 1 5A-P4, y 22C-P 1 se desarrollaron en 50 ml de TSB durante toda la noche a 32 °C con agitación. Se inoculó 1 .0% de cada cepa individualmente en TSA y se vertió en cajas de Petri. Después de que las placas solidificaron, los discos antibióticos se colocaron sobre la superficie de ágar. Las placas incubaron a 32 °C durante toda la noche. Las zonas inhibidoras se midieron en milímetros. Los anticuerpos ocasionaron zonas de inhibición de tamaño mínimo contra las 3 cepas de Bacillus (Tabla 4). por lo tanto, los antibióticos no debe interferir con el desarrollo de 3A-P4, 1 5A-P4, y 22C-P1 . Se realizaron pruebas adicionales de caldo y ágar con el antibiótico ASP-250 (clortetraciclina, sulfatiazola, y penicilina combinadas) contra 3A-P4, 1 5A-P4, y 22C-P1 . Este antibiótico disminuyó el desarrollo de 3A-P4, 15A-P4, y 22C-P1 en 99. 9%. Este antibiótico es bactericida para las cepas de Bacillus.

Tabla 4. Prueba de sensibilidad de antibiótico de la cepa 3A-P4, 15A-P4, y 22C-P1.

Zonas inhibid oras medidas en milímetros Disco antibiótico 3A-P4 15A-P4 22C-P1 Oxitetraciclina 30 µg 24 14 24 Tetraciclina 5 µg 26 14 21 Gentamicina 10 µg 26 22 22 Neomicina 5 µg 16 12 12 Penicilina de 2 IU 0 11 13 Bacitracina 10 IU 8 8 8 Lincomicina 2 µg 8 9 8 Ejemplo 6 Prueba bioquímica de los tres aislados de Bacillus, 3A-P4, 15A-P4, y 22C-P1: Las cepas 3A-P4, 15A-P4, y 22C-P1 también se probaron bioquímicamente utilizando laboratorio de MIDI. El análisis de ADN ribosómico que utiliza Genbank mostró que éstas cepas fueron cepas de Bacillus subtilis. Bacillus subtilis es una especie de Bacillus que se considera GRAS.

Ejemplo 7 Purificación de metabolito activo derivado de aislados de Bacillus y caracterización de actividad contra de E. coli: A. Purificación cruda de metabolitos activos: A fin de optimizar adicionalmente las cepas de Bacillus para la producción óptima de metabolitos activos y caracterizar adicionalmente el metabolito activo para identificación se introdujo una nueva prueba. Esta prueba, llamada la prueba de actividad de caldo, involucró el uso del metabolitos activos en forma cruda de manera que pudiesen realizarse también pruebas de caracterización y optimización sin interferencia de las células de Bacillus. Esta prueba permite también un resultado más cuantificado que es reportado como inhibición porcentual. Se recogió una colonia individual de cada aislado de Bacillus y se inoculó en 50 mililitros de TSB y se incubó a 32 °C con agitación durante toda la noche. Después de 1 8 horas de incubación, se cosecharon 10 m l de la cepa productora por centrifugación de 5000 rpm durante 10 minutos, y el sobrenadante se filtró mediante un filtro Acrodisc de 0.2 um. El sobrenadante filtrado, la forma cruda purificada del metabolitos activos, se utilizó inmediatamente o se congeló para su almacenamiento durante no más de dos días antes de utilizarse en una prueba. A partir de una colonia aislada, se desarrollaron patógenos de E. coli en TSB a 37 °C, con al menos dos transferencias de 1 % hasta que se alcanzó una OD de 0.6 a 600 nm . Se inoculó un tubo de prueba con TSB con la forma cruda del metabolitos activos y la vacuna de E. coli. Un tubo de prueba separado con TSB se inoculó con solamente la vacuna de E. coli y se incubó a 37 °C. La inhibición porcentual se determinó como se explica a continuación: (OD de 0% - OD demuestra)/OD de 0%*100. Para realizar correctamente esta prueba, se determinaron la cantidad de la forma cruda de metabolitos activos necesarios en la prueba, tiempo de desarrollo óptimo, y OD para que los aislados de Bacillus se produzcan un nivel óptimo de metabolitos activos, y el tiempo de incubación de la prueba. B. Porcentaje de metabolitos activos necesarios para la prueba de actividad de caldo: Se realizaron las pruebas para determinar el porcentaje óptimo de metabolitos activos necesarios para inhibir de E. coli en la prueba de caldo. Los aislados de Bacillus 3A-P4, 1 5A-P4, y 22C-P1 se probaron contra las cepas de E. coii patogénicas de cerdo. Se seleccionaron los aislados de E. coli E.20 y E.23 para utilizarse como patógenos de examinación debido a que los tres aislados de Bacillus preferidos (3A-P4, 1 5A-P4, y 22C-P1 ) presentaron una actividad inhibidora contra estos patógenos. A partir de una colonia aislada, se desarrollaron patógenos en TSB a 37 °C, con al menos dos transferencias de 1 % hasta que se obtuvo una OD de 0.6 en 600nm. Los tubos de TSB se inocularon al número 1 % con el patógeno y 10%, 5%, 1 %, 0.5%), y 0% con la forma purificada cruda del metabolito activo, recogido como se describió con anterioridad, y se incubó a 37 °C . Se leyó una OD 4 y 8 horas para determinar la inhibición porcentual en cada nivel porcentual de metabolitos activos. La inhibición porcentual se determinó como se explica a continuación: (0% de OD - OD demuestra)/0% de OD*1 00. Los resultados se muestran en la Tabla 5. El metabolito activo añadido al 10% presentó la inhibición más grande de E. coli. También se presentó la inhibición en los demás niveles. A partir de estos resultados, se determinó que el metabolito activo añadido al 10% brindaría una inhibición suficiente para detectarse con pruebas adicionales de caracterización y optimización. Por lo tanto, este porcentaje se utilizó en estudios subsecuentes.

Tabla 5: Inhibición de E. coli en caldo utilizando diferentes porcentajes de metabolitos activos Aislado Porcentaje de Inhibición porcentual Inhibición porcentual de metabolito E. coli E. coli Bacillus inoculado E. 20 E. 23 4 h 8 h 4 h 8 h 3A-P4 10 18.8 26.7 32.6 20.8 5 9.0 13.3 5.3 8.3 1 0 6.7 5.3 0 0.5 0 6.7 0 0 15A-P4 10 13.6 7.1 15 0 5 9.1 0 10 0 1 0 0 5 0 0.5 0 0 5 0 22C-P1 10 13.6 7.4 15.8 4.3 5 9.1 3.7 5.3 4.3 1 0 0 5.3 0 C. Tiempo de producción del metabolito activo: Se realizaron pruebas del tiempo de incubación para determinar el tiempo de desarrollo óptimo y la OD para que los aislados de Bacillus producen un nivel óptimo de metabolitos activos. Se realizó la inhibición porcentual contra la cepa de E. coli E.20 y se utilizó como la cepa indicadora. Las cepas utilizadas fueron 3A-P4, 1 5A-P4, y 22C-P 1 . Se descubrió que los tiempos de desarrollo y las ODs bajo las cuales los aislados de Bacillus producen la mayor parte de los metabolitos activos y por lo tanto presentan la cantidad más grande de inhibición contra E.20 se determinaron al muestrear el cultivo con intervalos de 12 horas. En estos momentos, se obtuvo la forma purificada cruda del metabolito activo como se describió con anterioridad y se inoculó al 10% en 10 ml de TSB. Se utilizó la cepa de E.20 como el organismo indicador y se desarrolló como se describió con anterioridad. Se añadió la cepa E.20 al 1 % a los tubos de TSB con contenido del metabolito activo. La prueba se incubó a 37 °C y la OD se leyó a las 5 horas y a las 10 horas. A fin de determinar la inhibición porcentual también se incluyó en la prueba un tubo de control con el organismo indicador, añadido al 1 % a un tubo de 1 0 ml de TSB. La inhibición porcentual se calculó utilizando la fórmula: (OD de control -OD de muestra)/OD de control * 1 00 para cada período de tiempo de prueba, y se determinó el promedio entre la inhibición porcentual a las 5 horas y 1 0 horas. Los resultados de esto se muestran en la Tabla 6.

Tabla 6. El efecto del tiempo de incubación de los aislados de Bacillus en la inhibición de E. coli tiempo de 3A-P4 i 5A-P4 22C-P1 incubación de % de inhibición % de inhibición % de inhibición productor E.20 E.20' E.20 ___ ____ __ ___ 24h 26.3 16.3 31.3 36h 44.0 37.0 51.0 48h 6.0 9.0 21.0 60h 13.0 58.4 32.0 72h 1.7 41.3 0. 84h 0.0 26.1 4.4 Para desarrollar los aislados de Bacillus, también se determinó la OD que produjo un nivel óptimo de inhibición contra la cepa de E. coli E.20. Se descubrió que las siguientes ODs producen un nivel óptimo de metabolitos activos: 3A-P4 desarrollada a una OD de 2.5 (Figura 4), 15A-P4 desarrollada a una OD de 3.6 a 4.15 (Figura 5), y 22C-P 1 desarrollada a una OD de 2.04 (Figura 6) . En estas ODs, el metabolito activo producido por los aislados de Bacillus produce la mayor parte de la inhibición contra E. coli. Por lo tanto, estos tiempos de desarrollo deben correlacionarse con el nivel más alto del metabolito activo que se está formando. Los resultados obtenidos determinaron el tiempo (Tabla 7) y la OD en la que se formó el porcentaje más alto del metabolito activo para cada una de las cepas productoras. Esta información se utilizó para desarrollar las cepas productoras para el resto de las pruebas de caracterización y optimización.

Tabla 7: Desarrollo de los aislados de Bacillus de producción de metabolitos activos.

Tiempo de 3A-P4 15A-P4 22C-P1 desarrollo de OD(600nm) OD(600nm) OD(600nm) producción en horas _ ___ 1 .56 1 .62 24 2.34 1 .56 1 .92 36 2.50 2.04 2.04 48 2.22 2.28 2.1 60 2.7 3.6 2.88 72 3.06 4.14 4.2 84 4.2 3.96 4.5 D. Tiempo de incubación de prueba de actividad de caldo: Las pruebas de incubación se realizaron para determinar el tiempo de inhibición óptimo de metabolitos activos contra E. coli utilizando el método de prueba de actividad de caldo. Las cepas 3A-P4, 15A-P4, y 22C-P1 se utilizaron como cepas productoras, y E.20 y E.23 se utilizaron como cepas indicadoras patógenas. El metabolito activo se obtuvo el desarrollar las cepas de Bacillus en sus respectivas ODs y obtener la forma purificada cruda del metabolito activo como se describió con anterioridad. La forma purificada cruda del metabolito activo se inoculó al 10% en 10 ml de TSB. Las cepas indicadoras patógenas se desarrollaron como se describió con anterioridad y después de alcanzar una OD de .60 (600 nm), se añadieron al 1 % a los tubos de TSB con contenido del metabolito activo. La prueba se incubó a 37 °C, y se leyó la OD a las 2, 4, 6, 21 , 23, 26, 28, y 30 horas. Un tubo de control con el organismo de indicador, añadido al 1 % a un tubo de 10 ml de TSB, se incluyó también en la prueba para determinar la inhibición porcentual y el patrón de desarrollo. La inhibición porcentual se calculó como se describió con anterioridad. La cepa 3A-P4 obtuvo la inhibición más alta después de cuatro horas (Figura 7) y, las cepas 1 5A-P4 y 22C-P1 , después de seis horas (Figuras 8 y 9). La curva de desarrollo de E. coli confirmó que qué entre las cuatro y seis horas de tiempo de prueba, el E. coli presentó su desarrollo más alto (Figura 1 0). Consecuentemente, la inhibición por los metabolitos activos no se debe a la disminución natural del E. coli. Estos resultados determinaron el tiempo de inhibición más alto del patógeno por los metabolitos activos. Los tiempos de prueba se utilizaron para todas las pruebas posteriores de caracterización y optimizaci?n. E. Purificación adicional de metabolitos activos: Se realizó la precipitación de sulfato de amonio en los metabolitos activos producidos por las cepas 3A-P4, 1 5A-P4, y 22C-P1 . Este es un método común para fraccionar las proteínas por precipitación y entrega una proteína purificada parcialmente. Las proteínas purificadas parcialmente obtenidas se utilizaron en técnicas de purificación adicional de manera que se alcanzó una proteína purificada. El metabolito activo purificado entrega una mejor comprensión de la inhibición microbial producida por estas cepas. Las fracciones de concentración de sulfato de amonio deben determinarse primeramente para que cada cepa determ ine con certeza la cantidad de sulfato de amonio para añadir a fin de precipitar el metabolito activo. Las cepas 3A-P4, 1 5A-P4, y 22C-P1 se desarrollaron separadamente en TSB a su OD respectiva. Los sobrenadantes sin células se obtuvieron por centrifugación a 6000 X g durante 20 minutos a 4 °C. Se añadió sulfato de amonio al sobrenadante en incrementos del 10% hasta que se obtiene una concentración del 70%. Después de la adición de una de las concentraciones de sulfato de amonio, el sobrenadante se mantuvo a 4 °C durante 2-24 horas. El sobrenadante se cosechó por centrifugación a 6000 * g durante 20 minutos. El sobrenadante (10 ml) se colocó en un dispositivo centrífugo Amicon 10,000 MWC y se centrifugó a 2000 * g hasta que quedó 1 ml en el filtro. Esta fracción se filtró después mediante un filtro de 0.2 µm y se probó la actividad contra E. coli utilizando el método de placa indicadora. El comprimido obtenido a partir del proceso de centrifugación anterior se volvió suspender con 1 0 ml de Tris-HCl y se sometió a diálisis durante toda la noche agitando contra 2 litros del mismo regulador utilizando una tubería de diálisis Spectra/Por no. 3. Debe observarse que en lugar de diálisis, la muestra comprimida también puede colocarse en un filtro Amicon y centrifugarse a 2000 * g hasta que no queda líquido en el filtro. Se añade Tris-HCl (0.05M)(10 mi) al aparato de filtro y se centrifuga a 2000 * g hasta que no queda líquido en el filtro. Este paso se repite y el filtro se centrifuga a 2000 * g hasta que queda 1 ml en el filtro. La preparación se filtró después mediante un filtro de 0.2 µm y se probó la actividad contra E. coli utilizando el método de placa indicadora. Se añadió sulfato de amonio al resto del sobrenadante y el procedimiento de precipitación se repitió hasta que la concentración de sulfato de amonio alcanzó 70%. La concentración de sulfato de amonio que precipita el metabolito activo en el comprimido después de la centrifugación es el porcentaje de sulfato de amonio utilizado para purificar parcialmente al metabolito activo derivado de cada cepa. La concentración de sulfato de amonio necesaria para precipitar al metabolito activo de 1 5A-P4 es de 30%. A fin de disminuir la proteína no deseada y obtener una proteína purificada más parcialmente el mejor añadir sulfato de amonio primeramente a la muestra a una concentración menor, tal como 10%. Esto precipita la proteína no deseada, dejando al metabolito activo en solución. El sulfato de amonio al 30% puede añadirse después para precipitar el metabolíto activo. El sobrenadante se recoge después por centrifugación, como se describió con anterioridad, y se añade la concentración de sulfato de amonio necesaria para precipitar el metabolito activo. F. Caracterización del metabolito activo purificado producido por 15A-P4 por electroforesis de gel: La cepa 15A-P4 se desarrolló a su OD opina como se describió con anterioridad. La forma cruda del metabolito activo se obtuvo como se describió con anterioridad. Después, el metabolito activo se purificó parcialmente, después añadieron 0.1 mM de PMSF y 1 .0 de DTT para incrementar la estabilidad de proteína, al realizar una precipitación de sulfato de amonio de 10% y 30% como se describió con anterioridad. Las fracciones de comprimido y sobrenadante derivadas de ambas precipitaciones porcentuales se mantuvieron y se colocaron en placas indicadora sobre una placa indicadora de E. coli como se describió con anterioridad. Las fracciones de sulfato de amonio se examinaron utilizando electroforesis de gel de poliacrilamida (PAGE - electroforesis de gel de poliacrilamida) en presencia de sulfato de dodecilo de sodio al 0.1 % (SDS) en un Mini-Protean 3 Cell (Bio-Rad, Hercules, CA) . Las muestras se prepararon siguiendo el protocolo proporcionado con el kit de normas de peso molecular de SDS-PAGE (Bio-Rad). Se utilizó un gel de Tris HCl Ready (Bio-Rad) de poliacrilamida al 10% prefundida. La corriente se llevó a cabo en una corriente constante de 10 mA hasta que el azul de bromofenol ingresó al gel de separación. Después, la corriente se incrementó a 15 mA. El gel se tiñó utilizando el agente reactivo de teñido Azul GelCode® (Pierce, disponible por Fisher Scientific, Hampton, NH) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizaron normas de rango amplio y de rango bajo (Bio-Rad) que incluyeron las siguientes proteínas y pesos moleculares: miosina (200,000), ß-galactosidasa (1 16,250), Fosforilasa b (97,400) , Albúmina de suero (66,200), Ovalbúmina (45,000), Anhidrasa carbónica (31 ,000), I nhibidor de tripsina (21 ,500), Lisozima (14,400), y Aprotinina (6, 500). La fracción de comprimido al 1 0% y la fracción de sobrenadante al 30% no inhibieron al E. coli durante la prueba de inhibición de manchas. El sobrenadante el 1 0% y el comprimido al 30% no inhibieron al E. coli durante la prueba de inhibición de manchas. Las fracciones de comprimido y sobrenadante entregaron una banda con un rango de peso molecular entre 31 ,000 y 45,000. Por lo tanto, se considera que esta banda es la proteína inhibidora. (Figura 1 1 ). G. Caracterización del metabolito activo producido por 1 5A- P4 utilizando cromatografía de columna de baja presión: Después de la precipitación de sulfato de amonio, el metabolito activo en la fracción de comprimido al 30% se aplicó a diferentes columnas de química para determinar las características proteínicas. Se exploraron el cartucho de 1 mililitro de intercambio aniónico Bio-Rad High Q y el cartucho de 1 ml hidrofóbico/hidrofílico Bio-Rad HIC. Para determinar las características de la proteína, se mezclaron 0.5 ml del metabolito activo, después de que se llevó a cabo la precipitación de sulfato de amonio, con el regulador de elución, y se colocó en la columna. Un regulador alto en sales y el regulador bajo en sales se aplicaron a la columna para determinar bajo qué condiciones se adheriría el metabolito activo a la columna. Se utilizaron 50 mM de Tris HCl con 1 0 mM de NaCI como el regulador alto en sales para la columna Alta Q y se añadieron 50 mM de Tris HCl con 1 .0 m M de NaCI utilizando un regulador bajo en sales para la columna Alta Q. Se utilizaron 1 00 mM de fosfato de sodio sin sal añadida como el regulador bajo en sales para la columna HIC y se utilizaron 1 00 mM de fosfato de sodio con 2.4M de sulfato de amonio añadido como el regulador alto en sales para la columna HIC. Se utilizó una tasa de flujo de 0.7 ml/min durante 25 minutos con cada regulador. Primeramente se recogieron dos fracciones grandes, una fracción fue la que se extrajo de la columna después de poner en operación un regulador alto en sales mediante la columna y la otra fracción se recogió después de que un regulador sin contenido de sales se puso en operación mediante la columna. Estas fracciones se concentraron después utilizando el dispositivo centrífugo Amicon al colocar las fracciones en un dispositivo centrífugo 10,000 MWC Amicon y se hacen girar a 3000 rpm hasta secarse. Se realizaron dos enjuagues de regulador, y la proteína se reconstituyó en 300 µl. Con la columna HIC, la fracción recogida durante la aplicación del regulador alto en sales generó una inhibición positiva con la prueba de placa indicadora. El principio de separación detrás de la columna HIC no se comprende aún totalmente. Todas las teorías soportan que la interacción se encuentra relacionada con el área superficial hidrofóbica encontrada sobre todas las proteínas y que se incrementa por la resistencia iónica alta y la alta temperatura (1 ). Por lo tanto, el hecho de que la proteína eludida con una alta concentración de sales conduce a sospechas sobre la naturaleza hidrofílíca de la proteína. Con la columna de intercambio aniónico Alta Q, tanto la fracción de regulador alta en sales como la fracción de regulador sin sales no produjeron la inhibición en la prueba de placa indicadora. El procedimiento se repitió y las nueve fracciones se recogieron después de que se aplicó un regulador alto en sales y se recogieron nueve fracciones después de que se aplicó un regulador sin sales. Tres de las fracciones recogidas con el regulador de sales mostraron inhibición en la prueba de placa indicadora. Estas tres fracciones también tuvieron 60 -> 1 00 mg/dl de proteína utilizando la prueba de determinación de proteína. Ninguna de las fracciones derivadas del regulador sin sales presentó inhibición, pero dos fracciones tuvieron 20-30 mg/dl de proteína. Por lo tanto, el hecho de que la proteína eludida a partir de una columna aniónica con una alta concentración de sal demuestra que la proteína es un catión. En resumen, se descubrió que el metabolito activo producido por la cepa 1 5A-P4 tiene un peso molecular entre 31 ,000 y 45,000, es un catión, y parece ser hidrofílico.

Ejemplo 10 Determinación de estabilidad de los metabolitos activos producidos por 3A-P4, 15A-P4, y 22C-P1 : Se evaluó la estabilidad del metabolito activo de los aislados de Bacillus. Esta información también ayuda a caracterizar los metabolitos activos. Las pruebas se realizaron utilizando la forma cruda del metabolito activo para determinar la degradación enzimática, estabilidad térmica, y el modo de acción. La actividad del metabolito activo se determinó después de la exposición a las enzimas y calor.

A. Prueba de degradación enzimática: Las pruebas de degradación enzimática se realizaron en las cepas 3A-P4, 1 5A-P4, y 22C-P1 para determinar si el metabolito activo formado fue una proteína. Los productores se desarrollaron en TSB como se describió con anterioridad, y el metabolito activo se obtuvo en forma purificada cruda. Las enzimas (obtenidas todas por Sigma, St. Louis, MO) utilizadas fueron: a-quuimotripsina, pronasa E, proteínasa K, pepsina, tripsina, y catalasa. Se añadieron doscientos cincuenta mg de cada enzima a 1 00 ml de agua destilada fría estéril y se mantuvo en hielo antes de su uso. Se añadió separadamente 1 ml de cada enzima a 4 ml del metabolito activo purificado crudo para una concentración final de 500 µg/ml. Después de una incubación a 37 °C durante 60 minutos, se probó la actividad de bacteriocina en cada muestra utilizando el método de prueba de actividad de caldo. Las muestras sin enzimas se utilizaron como controles. El metabolito activo tratado con enzimas se añadió al tubo de 10 ml de TSB al 10%. La cepa E.23 se utilizó como el organismo indicador y se desarrolló como se describió con anterioridad. El indicador se añadió después a las tuberías de TSB, los cuales conten ían al metabolito activo, en a una concentración al 1 %. Las muestras sin metabolitos activos tratados con enzimas y muestras sin metabolitos activos se utilizaron como controles. La inhibición porcentual se determinó como se describe con anterioridad. Se descubrió que el metabolito activo producido por la cepa 3A-P4 era sensible a la a-quimotripsina, pepsina, catalasa, y pronasa E pero nos afecto por la tripsina o la proteinasa K. Se descubrió que el metabolito activo producido por la cepa 1 5A-P4 fue sensible a la catalasa y pronasa E pero no fue afectado por la a-quimotripsina, pepsina, tripsina, o proteinasa K. Se descubrió que el metabolito activo producido por la cepa 22C-P1 fue sensible a la tripsina y la pronasa E pero no fue afectado por la a-quimotripsina, pepsina, catalasa, o proteinasa K. B. Prueba de calor: Se examinó la sensibilidad de la temperatura de los metabolitos activos purificados crudos producidos por las cepas 3A-P4, 15A-P4, y 22C-P1 . Los aislados se desarrollaron como se indica con anterioridad y se obtuvo el metabolito activo crudo. Los metabolitos activos se calentaron a 100 °C durante 1 , 5, 10, y 1 5 minutos; se enfriaron a temperatura ambiente; y se inocularon al 1 0% en 10 ml de TSB. Los metabolitos activos también se sometieron al autoclave durante 20 minutos a 121 °C y se probó su actividad inhibidora. Se utilizó la cepa E.23 como el organismo indicador y se desarrolló como se describe con anterioridad y se inoculó al 1 % en los 10 ml de TSB con contenido del metabolito activo. La prueba se incubó a 37°C y la lectura de OD se realizó a las cuatro o seis horas. La inhibición porcentual se calculó como se describe con anterioridad. La actividad de los tres metabolitos activos se redujo después del tratamiento térmico (Tabla 8) . Los tres metabolitos activos tuvieron alguna actividad inhibidora después del tratamiento térmico.

Tabla 8: Inhibición porcentual de 3A-P4, 1 5A-P4, y 22C-P 1 después de los tratamientos térmicos.

C. Modo de acción: Se realizaron pruebas para determinar si los metabolitos activos producidos por las cepas 3A-P4, 1 5A-P4, y 22C-P1 fueron bactericidas o bacterioestáticos para E. coli. Las cepas 3A-P4, 15A-P4, y 22C-P 1 se desarrollaron a su OP óptima como se describió con anterioridad. La forma cruda del metabolito activo se obtuvo como se describió con anterioridad. Las cepas de E. coli E.20 y E.23 se desarrollaron como se describe con anterioridad. El metabolito activo de cada cepa se probó separadamente y se añadió al 10% a un tubo de 10 ml de TSB. Las cepas E.20 y E.23 se añadieron separadamente al 1 % al tubo de TSB con contenido del metabolito activo. Un tubo de TSB inoculado solamente con E.20 o E.23 al 1 % se utilizó como el control. Los tubos se incubaron a 37°C, y se obtuvo una OD (600nm) cada dos horas durante un total de ocho horas. También se obtuvieron los valores de tiempo cero. A fin de obtener las cuentas de E. coli vivo derivado de los tubos de TSB inoculado se realizó la colocación en placas. Se realizaron diluciones seriales cada dos horas durante un total de ocho horas y se colocaron en placas en TSA y se incubaron a 37 °C durante toda la noche. También se obtuvieron los valores de tiempo cero. Las placas se contaron después de 24 horas de incubación. El metabolito activo de la cepa 3A-P4 disminuyó las cuentas de E. coli tanto para la cepa de E. coli E.20 (Figura 12A) como para la cepa E.23 (Figura 12B) por un registro y disminuyó los valores de OD. El metabolito activo de la cepa 15A-P4 disminuyó las cuentas de E. coli tanto para la cepa de E. coli E.20 (Figura 13A) como la cepa E.23 (Figura 13B) por tres a cuatro registros y también disminuyó los valores de OD. El metabolito activo de la cepa 22C-P1 disminuyó las cuentas de E. coli tanto para la cepa de E. coli E.20 (Figura 14A) como para la cepa E.23 (Figura 14B) en medio registro hasta un registro y disminuyó también los valores de OD. Los resultados indican que el metabolito activo 15A-P4 es bactericida, y los metabolitos activos de 3A-P4 y 22C-P1 son al menos bacterioestáticos. Los metabolitos activos de las cepas 3A-P4 y 22C-P1 tablero pueden probar ser bactericidas si se dejase continuar más tiempo la prueba.

Ejemplo 11 A. Optimización de medios: Las cepas 3A-P4, 15A-P4, y 22C-P1 se desarrollaron en diferentes medios para determinar un medio que entregaría el desarrollo celular y de esporas más alto. La proteína encontrada en TSB se sustituyó a diferentes niveles porcentuales con otras proteínas. Los carbohidratos y minerales, comunes en la industria, también se incluyeron en los diferentes medios en diferentes niveles porcentuales. Las cepas 3A-P4, 1 5A-P4, y 22C-P 1 se inocularon en los diferentes medios anteriores y se desarrollaron a 32 °C con agitación. Las muestras para el rendimiento de esporas se extrajeron asépticamente a las 24 y 48 horas. La muestra se colocó en un baño de agua a 63 °C durante 35 minutos para matar todas las células vegetativas. Las esporas se enumeraron al colocar en placas diluciones seriales en TSA, que se incubaron durante 24 horas a 32 °C. Las células se enumeraron al colocar en placas diluciones seriales en TSA el cultivo a las 24 horas y 48 horas, que también se incubaron durante 24 horas a 32 °C. Los medios que entregaron el desarrollo celular y de esporas más alto para cada cepas y lista a continuación. B. Medios que entregan el desarrollo celular y de esporas más alto: Para 3A-P4, el medio de desarrollo fue Primagen al 2% , Sucrosa 5g/L, fosfato de dipotasio 2.5g/L, 0.5 g/L, MgS047H20, 0.1 2 g/L, FeS047H20, 0.05 g/L, MnS04H20, 0.004 g/L, ZnS047H20, y 0.05 g/L de CaCI. Las condiciones de desarrollo fueron: 32 °C con agitación durante 48 horas para obtener una cuenta de esporas de al menos 1 *109.

Para 1 5A-P4, el medio de desarrollo fue proteína de leche de peptonizada al 5%, Dextrosa 2.5 g/L, fosfato de dipotasio 2.5 g/L, 0.5 g/L de MgS04 7H20, 0.12 g/L de FeS04 7H20, 0.05 g/L de MnS04 H20, 0.004 g/L de Zn S04 7H20, y 0.05 g/L de CaCl. Las condiciones de desarrollo fueron de 32 °C con agitación durante 48 horas para obtener una cuenta de esporas de al menos 1 *109. Para 22C-P 1 , el medio de desarrollo fue Primagen al 2%, Dextrosa 2.5 g/L, Fosfato de dipotasio 2.5 g/L, 0.5 g/L de MgS04 7H20, 0.12 g/L de FeS04 7H20, 0.05 g/L de MnS04 H20, 0.004 g/L de Zn S04 7H20, y 0.05 g/L de CaCl. Las condiciones de desarrollo fueron de 32 °C con agitación durante 48 horas para obtener una cuenta de esporas de al menos 1 *1 09. El primagen y la proteína de leche peptonizada se obtuvieron a partir de Quest International, Hoffman Estates, I L.

Ejemplo 12 Prueba de campo A: El objetivo de la Prueba de Campo A fue evaluar la capacidad de las cepas de Bacillus seleccionadas para reducir la incidencia de la enfermedad de E. coli y mejorar el rendimiento en la fase de criadero. El sitio se encuentra ubicado aproximadamente a 7 millas (1 1.265 km) al este de Pipestone, MN. Fue una granja usada para lechigada a terminación con una mortalidad de E. coli de 20% sin vacunas y uso antibiótico. La intervención de las vacunas y antibióticos tuvo una disminución de la mortalidad de E. coli de 5-10%. La granja consistió en un granero de criadero con dos recintos. Cada recinto tuvo dos hileras soportando 25 cerdos cada corral. Cada recinto tuvo una capacidad para sostener 300 cerdos. Los cerdos permanecieron en el criadero un promedio de 28 días antes de moverse a la instalación de terminación. Los cerdos se destetaron a los 26 días de edad y se clasificaron por sexo y se les asignó una de tres clases de peso (ligero, medio y pesado). Los cerdos de control y los tratados se colocaron en hileras separadas a fin de disminuir la posibilidad de contaminación entre los cerdos tratados y los de control de las cepas de Bacillus proporcionadas como alimento a los cerdos tratados. Cada hilera tuvo tres corrales de cerdas primíparas y tres corrales de cerdos castrados con un grupo de peso ligero, medio, y pesado en cada sexo. La vacuna de E. coli se administró a todos los cerdos destetados. Se administraron varios antibióticos inyectables (gentamicina, enrofloxacina) tanto a los cerdos de control como a los tratados cuando se observaron impurezas. Los cerdos tratados recibieron el Producto 1 en forma de mezcla base, con contenido de cepas de Bacillus y los vehículos fueron los siguientes: 30% de 3A-P4, 60% de 1 5A-P4, 1 0% de 22C-P1 en una cuenta de producto final de 3.0*107 cfu/g y 40% de cascara de arroz, 19% de orujos secos para cervezas, 40% de piedra caliza y 1 % de baylith. La mezcla base se añadió después a la dieta de comprimido de granja convencional y se molió y mezcló la dieta a la tasa de 5 Ibs/ton de alimento para obtener una tasa de inclusión final de Bacillus de 7.35*104 cfu/g. La dieta de comprimido inició un día después del destete, y el Producto 1 continuó en todas las fases de dieta hasta el final de la etapa de criadero. Los cerdos de control recibieron las mismas dietas molidas y mezcladas y comprimidas que los cerdos tratados excepto que carecían de las cepas de Bacillus. El antibiótico ASP-250 se incluyó en la dieta de comprimido de criadero para los cerdos de control y los tratados. Todas las raciones molidas y mezcladas tanto para los cerdos de control como para los tratados incluyeron BMD y se utilizó el protocolo 3 Nitro Normal para el manejo de los cerdos. La mortalidad y la incidencia de la enfermedad se registraron semanalmente tanto en los cerdos tratados como en los de control. El peso en corral, el sexo en corral, y el número de cerdos en corral se registraron el día uno y el d ía 28 de la prueba de campo. Antes de que comenzase la prueba de campo ambiental, se obtuvieron torundas rectales y fecales de criadero. Las cepas de E. coli provenientes de las torundas se desarrollaron y se aislaron en Agtech Products y se mantuvieron congeladas para su uso posterior. La PCR múltiplex se utilizó para determinar si una cepa fue patogénica. Todos los aislados de E. coli patogénico se probaron individualmente in vitro contra las tres cepas de Bacillus incluidas en el Producto 1 . Esto se realizó utilizando la prueba de actividad de caldo. Cada metabolito activo producido por el Bacillus en el Producto 1 se probó contra cada cepa de E. coli patogénico encontrada en la granja utilizando la prueba de actividad de caldo para obtener el grado porcentual de inhibición. El grado de inhibición se monitoreó mediante lecturas de densidad óptica utilizando un espectrofotómetro. Los resultados del grado de inhibición se muestran a continuación en la Tabla 12. Proporcionarle el Producto 1 como alimento a los cerdos de criadero durante la Prueba de Campo A disminuyó la mortalidad. La mortalidad en los cerdos de control permaneció alta a 7.0%, sin embargo, la mortalidad en los cerdos alimentados con el Producto 1 disminuyó a 1 .4%. Los cerdos tuvieron síntomas típicos de enfermedad de E. coli, como se observó con anterioridad y como se diagnosticó en esta granja. Por lo tanto, se determinó que la causa de la mortalidad es atribuible a la enfermedad de E. coli. No se observó ninguna mejora en el rendimiento durante esta prueba. Los cerdos tratados obtuvieron un promedio de 17.45 libras (7.92 kg) por cerdo, y los cerdos de control obtuvieron un promedio de 18.98 libras (8.61 kg) por cerdo (Tablas 9 y 10).

Tabla 9: Efecto del Producto 1 durante la Prueba de Campo A Grupo tratado Grupo de control Número de cerdos vivos 1 39 143 Número de cerdos muertos 2 10 Mortalidad porcentual 1 .4 7.0 Tabla 1 0. Resultados de la Prueba de Campo A Se recogieron cien torundas del criadero. De las 100 torundas, se probaron 100 aislados de E. coli para determinar su patogenicidad utilizando el procedimiento de PCR múltiplex. Se descubrió que los cincuenta y tres de los 100 aislados contenían uno o más genes asociados con patogenicidad. Los genotipos y los resultados de la inhibición de los aislados de E. coli por el Bacillus en el Producto 1 se muestran a continuación en la Tabla 1 1 Todos los aislados de E. coli se inhibieron por las tres cepas de Bacillus que oscilan de 18.2 a 96% de inhibición de desarrollo. La cepa 1 5A-P4 demostró la inhibición más eficaz contra el E. coli patogénico aislado de la Prueba de Campo A.

Tabla 11. Caracterización de aislados de E. coli patogénico provenientes de la Prueba de Campo A.

Muestra Fuente de Resultados múltiplex Cepa Cepa Cepa de E. cotí muestra Bacillus Bacillus Bacillus 3A-P4 15A-P4 22C-P1 E.271 Fecal STb 60.0 91.5 55.0 E.273 Fecal STa 45.2 82.7 64.0 E.274 Fecal STb 44.2 84.2 60.0 E.276 Fecal K88 46.2 95.0 52.0 E.278 Fecal F18. STX2e. STa. STb 41.7 87.1 35.0 E.279 Fecal F18. STX2e. STa. STb 36.8 86.5 37.5 E.284 Fecal STb 44.0 85.8 53.8 E.285 Fecal K88 38.0 86.4 51.9 E.294 Fecal F18. STX2e. STa. STb 42.1 92.8 22.5 E.311 Fecal STb 42.0 86.7 51.9 E.315 Fecal STb 39.6 86.9 47.9 E.317 Fecal STb 48.0 78.8 53.6 E.318 Fecal K88 50.0 88.8 50.0 E.319 Fecal F18. STX2e. STa. STb 36.1 88.8 36.8 E.320 Fecal K88 45.8 88.8 50.0 E.323 Fecal STb 47.9 90.8 57.4 E.324 Rectal K88 58.3 96.8 55.8 E.325 Rectal STb 51.9 88.8 61.4 E.327 Rectal K99. STa 65.0 92.7 31.8 E.328 Rectal K99. STa 55.0 90.4 38.5 E.329 Rectal K99. STa 59.1 90.9 41.7 E.337 Rectal F18. STX2e. STa. STb 41.2 90.0 23.7 E.361 Ambiente F18. STX2e. STa. STb 36.8 92.4 25.0 rectal E.374 Ambiente F18. STX2e. STa. STb 47.4 91.9 25.0 rectal E.378 Ambiente F18. STX2e. STa. STb 37.5 89.5 18.2 rectal E.379 Ambiente F18. STX2e. STa. STb 31.8 87.3 21.7 rectal En la Prueba de Campo A, el proporcionarle el Producto 1 a cerdos de criadero mediante el periodo de criadero disminuyó la mortalidad debida a la enfermedad de E. coli. El Producto 1 no mejoró el rendimiento de cerdos de criadero en la Prueba de Campo A. El hecho de que no se mejoró el rendimiento en esta prueba puede deberse ai hecho de que en nuestra prueba de laboratorio confirmamos que ASP-250, lo cual se incluyó en la dieta de comprimido de criadero para los cerdos de control y los tratados, es bactericida para las cepas de Bacillus incluidas en el Producto 1 . Esto es más probable debido a la porción de sulfametazina de este antibiótico. La penicilina y la aureomicina (clorotetraciclina) han demostrado en pruebas de laboratorio tener poco efecto sobre las cepas de Bacillus en el Producto 1 .

Ejemplo 13 Prueba de Campo B-1 y B-2: El objetivo de la Prueba de Campo B-1 y B-2 fue desarrollar un producto adictivo de alimentación que contiene metabolitos activos biológicamente activos provenientes de Bacillus capaces de mejorar el rendimiento de cerdos al reducir patógenos intestinales tales como E. coli. El sitio para la Prueba de Campo B-1 y B-2 fue una granja usada para lechigada a terminación ubicada aproximadamente a 7 millas (1 1 .265 km) al este de Pipestone, MN (El mismo sitio utilizado en el Ejemplo 12). Se construyó un nuevo criadero para instalación de destete en la primavera del 2003. Las pruebas de Campo B-1 y B-2 se realizaron en esta nueva instalación. Ninguna enfermedad de E. coli fue evidente en la nueva instalación. La nueva instalación consistió en cuatro recintos con dos corrales grandes en cada recinto capaces de alojar cerdos provenientes de la fase de criadero a través de la fase de terminación. Para nuestras pruebas, los corrales en cada recinto se dividieron a la mitad para realizar cuatro corrales más pequeñas. Cada corral podría sostener en promedio 70 cerdos. Los cerdos se destetaron a los 18-21 días de edad y se clasificaron por sexo en uno de los grupos de tratamiento. El grupo de control y el tratado estuvo comprendido de un corral de cerdos castrados y un corral de cerdas primíparas. Los cerdos permanecieron en el estudio durante 28 días. Los cerdos tratados recibieron el Producto 2 en forma de mezcla base con contenido de cepas de Bacillus y los vehículos fueron los siguientes: 100% de 22C-P1 a una cuenta de producto final de 3.0*108 cfu/g y 40% de cascaras de arroz, 19% de orujos destilados de cerveza, 40% de piedra caliza y 1 % de baylith. La mezcla base se añadió después a la dieta de comprimido de granja convencional y se molió y mezcló la dieta a la tasa de 5 Ibs/ton de alimento para obtener una tasa de inclusión final de Bacillus de 7.35*105 cfu/g . La dieta de comprimido inició un día después del destete, y el Producto 2 continuó en todas las fases de dieta hasta el final de la etapa de criadero. Los cerdos de control recibieron las mismas dietas molidas y mezcladas y comprimidas que los cerdos tratados excepto que carecían de la cepa de Bacillus. La dieta de comprimido careció de antibióticos. Y todas las raciones molidas y mezcladas tanto para los cerdos de control como para los tratados incluyeron BMD, 3-Nitro, y CTC. Se utilizó el protocolo normal para el manejo de los cerdos. La mortalidad y la incidencia de la enfermedad se registraron semanalmente tanto en los cerdos tratados como en los de control. El peso en corral, el sexo en corral, y el número de cerdos en corral se registraron el día uno y el día 33 (Prueba de Campo B-1 ) y día 31 (Prueba de Campo B-2) de la prueba de campo. Al proporcionarle el Producto 2 como alimento a los cerdos de criadero durante las Pruebas de Campo B-1 y B-2 se incrementó el rendimiento. En la Prueba del Campo B-1 el peso obtenido por cerdo y la ganancia diaria promedio (ADG) fue un 1 1 .3% superior en los cerdos alimentados con el Producto 2. En la Prueba de Campo B-2 el peso obtenido por cerdo fue un 3.9% superior en los cerdos alimentados en el Producto 2, y la ADG fue 4.0% superior en cerdos alimentados para el Producto 2. El efecto general se resume en la Tabla 12. La enfermedad de E. coli no ocurrió durante estas pruebas; por lo tanto, no se analizó la mortalidad debida al E. coli.

Tabla 1 2. Efecto general del Producto 2 para las Pruebas de Campo B-1 y B-2 Grupo Grupo de % de tratado control diferencia Peso obtenido/ Cerdo 23.48 21 .8 7.71 ADG 0.737 0.683 7.91 En las Pruebas de Campo B-1 y B-2, el proporcionar el Producto 2 como alimento a cerdos de corral durante el periodo de criadero incrementó la ADG en 7.9% y el peso obtenido por cerdo en 7.7%. El Producto 2 fue efectivo por mejorar el rendimiento de cerdos de corral en las Pruebas del Campo B-1 y B-2.

Ejemplo 14 Prueba de Campo C El objetivo de la Prueba de Campo C fue evaluar la capacidad de las cepas de Bacillus seccionadas para reducir la incidencia de la enfermedad de E. coli y mejorar el rendimiento en la fase de criadero. El sitio de prueba de campo se encuentra ubicado aproximadamente a 7 millas (1 1 .265 km) al este de Pipestone, MN. Fue en una granja usada para lechigada a terminación con una mortalidad de E. coli de 1 5% sin vacunas y uso antibiótico. La intervención de vacunas y antibióticos había disminuido la mortalidad de E. coli a 3-5%.

La granja consistió en dos graneros con dos recintos en cada recinto. Cada recinto tuvo cuatro hileras de seis corrales soportando 25 cerdos cada corral. Cada recinto tuvo una capacidad para sostener 600 cerdos. Los cerdos permanecieron en el criadero durante 7-8 semanas antes de ser llevados a la instalación de destete. Los cerdos se colocaron en el criadero a los 16-18 días de edad después de llegar a la granja y se clasificaron por sexo y se les asignó a uno de dos grupos de peso (cerdos ligeros y pesados) . Los cerdos de control se colocaron en un recinto y los cerdos tratados en el otro recinto para minimizar el riesgo de contaminación de Bacillus. La vacuna de E. coli se administró para controlar cerdos solamente. Los cerdos tratados recibieron el Producto 1 descrito en el Ejemplo 12 tanto en la dieta de comprimido de granja convencional como en la dieta molida y mezclada a una tasa de inclusión de 7.35*104 cfu/g . La dieta de comprimido inició después de la colocación, y el Producto 1 continuó en todas las fases de dieta hasta el final de la etapa de criadero. Los cerdos de control recibieron las mismas dietas comprimidas y molidas y mezcladas que los cerdos tratados excepto que carecieron de las cepas de Bacillus. Ninguna de las dietas incluyó antibióticos destinados a tratar la enfermedad de E. coli. El protocolo normal se utilizó para el manejo de los cerdos. La mortalidad y la incidencia de la enfermedad se registraron semanalmente tanto en los cerdos tratados como en los de control. Se registró el peso de recinto después de la colocación de los cerdos y al final de la prueba de campo.

Antes de que comenzase la prueba de campo, se obtuvieron torundas ambientales, rectales y fecales provenientes del criadero. Las cepas provenientes de las torundas se desarrollaron y aislaron en Agtech Products y se mantuvieron congeladas para su uso posterior. La PCR múltiplex se utilizó para determinar si una cepa fue patogénica. Todos los aislados de E. coli patogénico se probaron individualmente in vitro contra las tres cepas de Bacillus incluidas en el Producto 1 . Esto se realizó utilizando la prueba de actividad de caldo. Cada metabolito activo producido por el Bacillus en el Producto 1 se probó contra cada cepa de E. coli patogénico encontrada en la granja utilizando la prueba de actividad de caldo para obtener el grado porcentual de inhibición. El grado de inhibición se monitoreó mediante lecturas de densidad óptica utilizando un espectrofotómetro. Veinte días en las estimulaciones de prueba de campo provenientes de E. coli patogénico dio como resultado una pérdida profunda de 0.50%-0.75% en los cerdos alimentados con el Producto 1 en comparación con una pérdida mortal del 3.0%-5.0% para cerdos alimentados con la dieta de control (sin el Producto 1 ). Brevemente después de este periodo una infección de S. suis se volvió una estimulación principal y esta granja y las muertes subsecuentes se diagnosticaron en la necropsia como S. suis. Se recogieron cien torundas del criadero. De las 1 00 torundas, se probaron 100 aislados de E. coli utilizando el procedimiento de PCR múltiplex para identificar las cepas patogénicas. Se descubrió que treinta y uno de los 100 aislados eran patogénicos. Los genotipos para cada uno de los 31 aislados y los resultados de la inhibición del E. coli por el Bacillus en el Producto 1 se muestran a continuación en la Tabla 1 3. Todos los aislados de E. coli se inhibieron por las tres cepas de Bacillus que oscilan de 6.9 a 96% de inhibición de desarrollo. La cepa 15A-P4 demostró la inhibición más eficaz contra el E. coli patogénico aislado de la Prueba de Campo C.

Tabla 13. Caracterización de aislados de E. coli patogénico provenientes de la Prueba de Campo C.

E. coli M uestra Resultados múltiolex Cepa Cepa Cepa Bacill?s Bacillus Bacillus 3A-P4 15A-P4 22C-P 1 E.54 Fecal F 1 8 83.5 98.5 19.2 E.55 Fecal K88 80.7 95.7 14.3 E.57 Fecal STb 97.7 99.2 52.1 E.66 Fecal K88 69.0 91.0 19.2 E.67 Fecal K88 58.6 96.3 16.7 E.69 Fecal K88 60.0 80.5 ND E.74 Ambiental K88 53.8 95.5 6.9 E.86 Rectal F18 91 ,0 95.8 ND E.87 Fecal Sta, STb, K88, STx2e 66.0 ND ND E.90 Fecal F 18 64.6 97.9 20.7 E.91 Fecal F 18 75.4 97.9 15.5 E.96 Fecal K88 79.2 89.1 N D E.104 Rectal STb 92.2 95.2 37.0 E.106 Rectal F18 89.5 96.4 ND E.110 Fecal Sta 79.1 79.2 ND E.1 1 5 Fecal Sta, STb, F 1 8 , STx2e 58.9 85.3 1 5.0 E.1 16 Fecal Sta , STb , F18 , STx2e 50.0 85.0 22.0 E.1 17 Fecal STb 57.7 93.0 16.7 E.1 18 Fecal K88 65.4 95.8 16.7 E.123 Ambiental STa, STb, F18, STx2e 37.0 63.1 24.0 E.239 Ambiental K88 93.9 95.8 1 5.0 E.240 Fecal Sta 56.5 99.0 33.0 E.241 Rectal F1 8, STx2e, STb 83.3 98.2 N D E.246 Fecal K88 53.8 94.2 35.7 E.247 Fecal Sta 33.3 98.9 28.6 E.251 Fecal K88, STa 39.3 90.7 23.5 E.252 Fecal F 18 97.7 99.2 30.0 E.256 Rectal K88 59.2 92.8 30.0 E.257 Ambiental K88, STx2e, STb 66.3 98.5 28.6 E.265 Fecal K88 81 .4 96.7 12.5 E.268 Fecal F18 96.3 99.2 25.0 En la Prueba de Campo C, proporcionarle el Producto 1 como alimento a los cerdos de criadero en el periodo de criadero disminuyó la mortalidad debida a la enfermedad del E. coli. Durante la Prueba de Campo C, el Producto 1 no mejoró el rendimiento de los cerdos de criadero. La falta de mejora en el rendimiento puede deberse a temas de enfermedad ocasionados por otros microorganismos, tales como S. suis, y temas de administración.

Ejemplo 15 Prueba de Campo D: El objetivo de la Prueba de Campo D fue evaluar la capacidad de las cepas de Bacillus seleccionadas para reducir la incidencia de la enfermedad de E. coli en la fase de criadero. El sitio se encuentra ubicado en Indiana. Es una granja de lechigada a terminación de 2000 cerdas adultas. El veterinario había diagnosticado E. coli con anterioridad. La granja tiene múltiples criaderos. El estudio se realizó en el criadero Wendell Cates. Los recintos consistieron en dos hileras de 12 corrales con aproximadamente 20 cerdos por corral. Los cerdos permanecieron en el corral un promedio de 35 d ías antes de ser llevados a la instalación de terminación. Los cerdos llegan al criadero entre 1 1 y 13 libras (5 y 5.9 kg) y se clasificaron en peso en tres grupos - ligero, medio, y pesado. Los cerdos de control (403 cabezas) se colocaron en un recinto y los cerdos tratados (440 cabezas) en otro recinto a fin de minimizar el riesgo de contaminación de Bacillus. Los cerdos tratados y los de control recibieron penicilina en el agua para combatir la tos. Los cerdos de control recibieron gentamicina en el agua para combatir las impurezas. Los cerdos tratados recibieron el Producto 3 en forma de mezcla base con contenido de cepas de Bacillus y veh ículos como se explica a continuación: 10% de la cuenta tota! de la cepa 1 5A-P4, 90% de la cuenta total de la cepa 22C-P 1 en una cuenta de producto final de 3.0*108 cfu/g y 40% de cascaras de arroz, 19% de orujos secos para cerveza, 40%) de piedra caliza, y 1 % de baylith. La mezcla base se añadió después a la dieta de comprimido de granja convencional y la dieta se molió y mezcló a una tasa de 5 Ibs/ton de alimentación para obtener una tasa de inclusión final de Bacillus de 7.35*1 05 cfu/g de alimentación. La dieta de comprimido inició el día uno después del destete, y el Producto 3 continuó en todas las fases de dieta hasta el final de la etapa de criadero. Los cerdos de control recibieron las mismas dietas comprimidas y molidas y mezcladas que los cerdos tratados excepto que carecían de las cepas de Bacillus. Se utilizó el protocolo normal para el manejo de los cerdos. Se registraron la mortalidad y la incidencia de la enfermedad, y el número de cerdos que estuvieron en pruebas y en destete. Las torundas rectales y fecales se obtuvieron a partir del criadero durante el brote de E. coli. Tres torundas provinieron de cerdos tratados y tres torundas provinieron de cerdos de control. Las cepas de E. coli se desarrollaron y aislaron en Agtech Products y se mantuvieron congeladas para su uso posterior. Se utilizó PCR múltiplex para determinar si una cepa era patogénica. Los cerdos tratados tuvieron una pérdida mortal total de 4.1 % . La pérdida mortal debida a la enfermedad de E. co///impurezas fue de 1 .4%. Los cerdos de control tuvieron una pérdida mortal total de 12.2%). La pérdida mortal debida a la enfermedad de E. co///impurezas fue de 9.4%). Los cerdos tratados tuvieron una tasa de colocación de 94.5%o de animales en la fase de terminación en comparación con los cerdos de control que tuvieron una colocación de terminación de 87.9% (Tabla 14) . Se enviaron tres torundas provenientes de cerdos tratados y tres torundas se enviaron provenientes de los cerdos de control. De las seis torundas, se probaron 18 aislados de E. coli para determinar su patogenicidad utilizando el procedimiento de PCR múltiplex. Los nueve aislados que provinieron de las tres torundas obtenidas de los cerdos tratados fueron negativas para el E. coli patogénico. Cuatro de los nueve aislados que provenían de las tres torundas obtenidas a partir de los cerdos tratados fueron positivos para el gen de pili de K88 y el gen de enterotoxina Lt y Stb, como se muestra en la Tabla 1 5. Por lo tanto, los aislados provenientes de los cerdos de control fueron E. coli patogénico y representaron dos de las tres torundas tomadas de los cerdos de control.

Tabla 14. Causas de muerte durante la Prueba de Campo D. Los números que representan el número de cerdos que murieron debido a esa causa Cerdos tratados Cerdos de control (no (recibieron el recibieron el Producto 3) Producto 3) Impurezas 6 38 Pequeña 1 1 Muy pequeña 3 10 Combate 1 0 Gripe/Respiratoria 2 0 Sin comer 1 0 Enjuto 1 0 No hay certeza , 3 0 Pérdida Mortal Total 18 49~ Pérdida por 6 38 E. co//7Lesiones total Tabla 1 5. Caracterización de aislados de E. coli obtenidos a partir de la Prueba de Campo D.

En la Prueba de Campo D, proporcionarle el Producto 3 como alimento a cerdos de criadero en todo el periodo de criadero disminuyó la mortalidad debido a la enfermedad de E. coli y se incrementó el número de cerdos colocados en la etapa de finalización.

Ejemplo 16 Prueba de Campo E: El objetivo de la Prueba de Campo E fue evaluar la capacidad de las cepas de Bacillus seleccionadas de reducir la incidencia de la enfermedad de E. coli y de mejorar el rendimiento en la fase de criadero. El sitio del estudio se encuentra ubicado aproximadamente a 7 millas (1 1 .265 km) al este de Pipestone, MN. La instalación del productor en cooperativa consiste de aproximadamente 400-500 cerdas adultas de Babcock genetics y es una operación de lechigada a finalización. Las cerdas prim íparas ingresan típicamente a la fase de lechigada aproximadamente a los 1 1 meses de edad y se toman a través de 5 lechigadas. Se ha diagnosticado E. coli (F18) en la granja con brotes que ocurrieron recientemente. La instalación del criadero consistió en seis recintos divididos cada uno de ellos en una hilera de seis corrales. Cada corral aloja típicamente 25-35 cerdos y los cerdos que permanecen en el criadero un promedio de 30 días antes de ser llevados a la instalación de finalización. Los cerdos se destetaron a los 15 días y se clasificaron en una de tres clases de peso (ligero, medio, y pesado). Las cerdas prim íparas y los cerdos castrados se mezclaron en el grupo del mismo peso en cada uno de los corrales. Idealmente, el grupo del mismo peso entre los corrales tratados y los de control no difirió en más de 0.5 libras (0.227 kg). Se colocó una barrera entre los dos corrales intermedios para dividir la hilera en tres corrales de control y tres corrales de cerdos tratados. Esta barrera minimizó también la contaminación entre los cerdos tratados y los de control. Los cerdos tratados recibieron el Producto 3 descrito en el Ejemplo 15 tanto en la dieta de comprimido de granja convencional como en la dieta molida y mezclada a una tasa de inclusión de 7.35*105 cfu/g. La dieta de comprimido inició después del destete, y el Producto 3 continuó en todas las fases de dieta hasta el final de la etapa de criadero. Los cerdos de control recibieron las mismas dietas comprimidas y molidas y mezcladas que los cerdos tratados excepto que carecieron de las cepas de Bacillus del Producto 3. La dieta de control no contenía otro producto comercial de Bacillus en las raciones de comprimido y la primera ración molida y mezclada. También se incluyeron inmunoglobulinas de huevo en las raciones de comprimido de control. Se incluyó el antibiótico T1 35C400 (Denagard y clortetraciclina) en la dieta de comprimido de criadero para los cerdos de control y tratados. El protocolo normal se utilizó para el manejo de los cerdos. La mortalidad y otros signos clínicos de la enfermedad se registraron tanto en los cerdos tratados como en los de control. También se registraron comentarios sobre la causa de la muerte. Se pesaron los cerdos por corral utilizando la Tecnología Transcell Tl-500SS B. Los pesos se recolectaron al momento del destete (d ía 0), día 7, y día 28. La cantidad de alimento proporcionado se registró diariamente, y el último día de la prueba se pesó del alimento que sobró. Las torundas rectales y fecales se obtuvieron provenientes del criadero durante un brote de E. coli. Las cepas de E. coli se desarrollaron y se aislaron en Agtech Products y se mantuvieron congelados para su uso posterior. Se utilizó el PCR múltiplex para determinar si una cepa era patogénica. Se analizaron los datos utilizando el procedimiento PROC MIXED del programa para computadora SAS, y se evaluaron los efectos del bloque y del tratamiento, con un día incluido, a fin de tomar en cuenta las mediciones e interacciones repetidas. Los datos se resumen en la Tabla 1 6. Refiriéndonos a las Figuras 1 5A y 1 5B, el peso del cerdo se vio sometido a la influencia por parte del tratamiento (P<0.01 ), bloque (P<0.0001 ) y el tratamiento * bloque (P<0.01 ) y el bloque*día (P<0.01 ). Los cerdos pesados y ligeros alimentaron las cepas de Bacillus que tuvieron mayores pesos corporales que los cerdos alimentados con la dieta de control el día 28 (P < 0.005 y P<0.01 , respectivamente), como se muestra en Figura 15B. La ganancia diaria promedia para los cerdos tratados fue siempre superior que la ADG para cerdos de control. Para el Día 0 a 7 , todos los efectos principios y la interacción de rep * bloque (P=0.0250) fue significativo (Figura 16). La interacción de tratamiento * bloque se aproxima en significatividad (P=0.102). El día 7 a 28, el efecto del tratamiento tuvo una significatividad aproximada (P=0.125). El día 0 al 28 todos los efectos principales fueron significativos y el efecto del tratamiento fue prácticamente significativa (P=0.052) .

Tabla 16. Resumen del efecto del Producto 3 para la Prueba de Campo E. Día 28 Tratado n=1 8 Control % de n = 18 diferencia % de mortalidad 1 .5 3.5 57.1 Peso/cerdo (Ib) 26.98 25.89 4.2 ADG (Ib/d ía) 0-7 0.37 0.33 12.1 7-28 0-70 0-66 6.1 0-28 0.62 0.58 6.9 Alimentación: Ganancia 1 .34 1 .42 5.6 Ganancia: Alimentación 0.748 0.71 1 4.8 Consumo de alimento 1927.17 1826.33 5.6 (Ib) El consumo de alimento (Figura 17) en cerdos en el bloque de peso ligero fue superior (P<0.01 ) mientras que el consumo de cerdos en los demás bloques fue similar (interacción de Tratamiento * bloque, P<.05). El efecto alimentación.ganancia del tratamiento tuvo una significatividad aproximada (P=0.125). Refiriéndose ahora a las Figuras 1 8A y 1 8B, la alimentación con las cepas de Bacillus redujo la mortalidad en los bloques alto (P<0.01 ) y medio (P<0.01 ) en el día 28 (interacción de tratamiento * bloque * día, P<0.05) (Figura 18B). Se enviaron seis torundas provenientes de los cerdos de control que mostraron síntomas de la enfermedad del edema de E. coli. Ninguno de los cerdos tratados exhibió síntomas de la enfermedad de E.coli. Por lo tanto, no se tomó ninguna torunda proveniente de los cerdos tratados. A partir de las seis torundas se probaron 24 aislados de E. coli para determinar su patogenicidad utilizando el procedimiento de PCR múltiplex. Todos los aislados fueron positivos durante el gen de pili F18 y el gen de toxina Stx2, tres aislados fueron positivos para los genes de enterotoxina Sta y Stb (Figura 19) . Por lo tanto, todos los aislados fueron positivos para E. coli patogénico, que representó los signos clínicos manifestados por los cerdos de control. En la Prueba de Campo E, la alimentación con el Producto 3 en todo el periodo de criadero mejoró el rendimiento al incrementar la ADG, peso del cerdo, consumo de alimento, y conversión de alimento. La alimentación con el Producto 3 en todo el periodo de criadero disminuye la mortalidad debido a la enfermedad de E. coli en la Prueba de Campo E. Se comprende que se muestran las diversas modalidades preferidas y se describen con anterioridad para ilustrar diferentes características posibles de la invención y las maneras variables en las que pueden combinarse estas características. Aparte de combinar las diferentes características de las modalidades anteriores de maneras variables, también se consideran otras modificaciones que se encuentren dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, un solo aislado de Bacillus, contrariamente a una combinación de aislados, podría utilizarse para controlar un E. coli de cerdo patogénico La invención no pretende limitarse a las modalidades preferidas descritas con anterioridad, sino más bien limitarse solamente por las reivindicaciones expuestas a continuación. Consecuentemente, la invención abarca todas las modalidades alternativas que se encuentran literalmente o equivalentemente dentro del alcance de la invención.

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Claims

REIV1NDICAC10NES

1 . Un microorganismo aislado del género Bacillus que es capaz de lograr uno de los siguientes objetivos: (A) inhibir la enfermedad de E. coli en animales alimentados con el microorganismo en comparación con los animales no alimentados con el microorganismo, y (B) mejorar el rendimiento en animales alimentados con el microorganismo en comparación con los animales no alimentados con el microorganismo, en los que la mejora en el rendimiento incluye una mejora en al menos uno de entre la ganancia diaria promedio (ADG), peso, mortalidad, conversión de alimento, y consumo de alimento.

2. El microorganismo según la reivindicación 1 , donde el microorganismo se selecciona a partir del grupo que consiste en las cepas 3A-P4, 1 5A-P 1 , y 22C-P 1 .

3. El microorganismo según la reivindicación 2, donde el microorganismo es la cepa 1 5A-P

4. 4. Una combinación de microorganismos que comprende al menos dos microorganismos según la reivindicación 2.

5. La combinación según la reivindicación 3, .donde la combinación comprende las cepas 22C-P 1 y 1 5A-P4.

6. La combinación según la reivindicación 5, donde la combinación comprende 90% de la cuenta total de la cepa 22C-P1 y 10% de la cuenta total de la cepa 1 5A-P4.

7. La combinación según la reivindicación 6, que comprende además una alimentación, donde la combinación tiene una cuenta de 5.1 *108 CFU/g de alimento.

8. La combinación según la reivindicación 5, donde la combinación comprende 10% de la cuenta total de la cepa 22C-P1 y 90% de la cuenta total de la cepa 1 5A-P4.

9. La combinación según la reivindicación 8, que comprende además un alimento, donde recombinación tiene una cuenta de 1 *106 CFU/g de alimento.

10. Un método para alimentar cerdos, donde el método comprende alimentar al cerdo con al menos una cepa de microorganismo del género Bacillus, siendo capaz el microorganismo del menos uno de los siguientes objetivos: (A) inhibir la enfermedad de E. coli en cerdos alimentados con el microorganismo en comparación con los animales no alimentados con el microorganismo, y (B) mejorar el rendimiento en animales alimentados con el organismo en comparación con los animales no alimentados con el microorganismo, en los que la mejora en el rendimiento incluye una mejora en al menos uno de entre la ganancia diaria promedio (ADG), peso, mortalidad, conversión de alimento, y consumo de alimento. 1 1 . El método según la reivindicación 10, donde el microorganismo se selecciona a partir del grupo que consiste en las cepas 3A-P4, 1 5A-P4, y 22C-P1 . 12. El método según la reivindicación 1 1 , donde el microorganismo es la cepa 15A-P4. 1 3. El método según la reivindicación 1 1 , donde el microorganismo comprende al menos dos cepas. 14. El método según la reivindicación 13, donde las cepas comprenden la cepa 22C-P1 y la cepa 15A-P4. 15. El método según la reivindicación 14, donde el microorganismo comprende 90% de la cuenta total de la cepa 22C-P1 y 10% de la cuenta total de la cepa 1 5A-P4. 16. El método según la reivindicación 14 donde el microorganismo comprende 10% de la cuenta total de la cepa 22C-P1 y 90% de la cuenta total de la cepa 1 5A-P4. 17. Un método para formar un agente microbial de alimentación directa, comprendiendo el método: (a) desarrollar, en un caldo nutriente líquido, al menos un microorganismo del género Bacillus que es capaz de al menos uno de los siguientes objetivos (i) inhibir la enfermedad de E. coli en animales alimentados con el microorganismo en comparación con los animales no alimentados con el microorganismo, y (ii) mejorar el rendimiento en animales alimentados con el organismo en comparación con los animales no alimentados con el microorganismo, en los que la mejora en el rendimiento incluye una mejora en al menos uno de entre la ganancia diaria promedio (ADG), peso, mortalidad, conversión de alimento, y consumo de alimento; y (b) separar el microorganismo del líquido para formar el agente microbial de alimentación directa. 18. El método según la reivindicación 17, donde el microorganismo se selecciona a partir del grupo que consiste en las cepas 3A-P4, 15A-P4, y 22C-P1 . 19. El método según la reivindicación 1 8, donde el microorganismo es la cepa 15A-P4, donde el paso de desarrollo comprende además desarrollar un segundo microorganismo aislado que se selecciona a partir del grupo que consiste en las cepas 3A-P4, 15A-P4, y 22C-P1 , y donde el segundo microorganismo es una cepa diferente que el primer microorganismo. 20. El método según la reivindicación 1 8, donde el microorganismo es la cepa 22C-P1 . 21 . El método según la reivindicación 18, que comprende además combinar las cepas 15A-P4 y 22C-P1 .