CA2339436A1 - Production d'anticorps contre les facteurs de virulence associes aux souches d'escherichia coli aeec, et leur utilisation - Google Patents
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Description
PRODUCTION D'ANTICORPS CONTRE LES FACTEURS DE VIRULENCE
ASSOCIÉS AUX SOUCHES D'ESCHERICHIA COLI AEEC, ET LEUR
UTILISATION
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se rapporte en général aux facteurs de virulence de microorganismes, et plus spécifiquement aux facteurs de virulence associés aux E.
1 o coli associés aux maladies entériques et plus particulièrement aux souches d'Escherichia coli attachantes-effaçantes AEEC incluant les E. coli entérohémorragiques EHEC (VTEC, STEC...) et les E. coli entéropathogènes EPEC
(REPEC, DEPEC, PEPEC,....) et aux souches d'E. coli entérotoxinogènes ETEC.
INTRODUCTION
La présente invention propose le développement de stratégies thérapeutiques et diagnostiques contre les souches E. coli associés aux maladies entériques et plus particulièrement les souches de Escherichia coli attachant-effaçant (AEEC) incluant les EHEC 0157:H7 et autres E. coli entérohémorragiques (non-0157), les E. coli entéropathogènes (EPEC) et les souches d'E. coli entérotoxinogènes ETEC.
La présente invention consiste aussi en l'étude des aspects cellulaires et moléculaires de la pathogenèse et de la réponse de l'hôte durant les infections dues aux souches AEEC
ASSOCIÉS AUX SOUCHES D'ESCHERICHIA COLI AEEC, ET LEUR
UTILISATION
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se rapporte en général aux facteurs de virulence de microorganismes, et plus spécifiquement aux facteurs de virulence associés aux E.
1 o coli associés aux maladies entériques et plus particulièrement aux souches d'Escherichia coli attachantes-effaçantes AEEC incluant les E. coli entérohémorragiques EHEC (VTEC, STEC...) et les E. coli entéropathogènes EPEC
(REPEC, DEPEC, PEPEC,....) et aux souches d'E. coli entérotoxinogènes ETEC.
INTRODUCTION
La présente invention propose le développement de stratégies thérapeutiques et diagnostiques contre les souches E. coli associés aux maladies entériques et plus particulièrement les souches de Escherichia coli attachant-effaçant (AEEC) incluant les EHEC 0157:H7 et autres E. coli entérohémorragiques (non-0157), les E. coli entéropathogènes (EPEC) et les souches d'E. coli entérotoxinogènes ETEC.
La présente invention consiste aussi en l'étude des aspects cellulaires et moléculaires de la pathogenèse et de la réponse de l'hôte durant les infections dues aux souches AEEC
2 5 avec des applications potentielles comme l'immunothérapie, différentes stratégies vaccinales (tel que l'élaboration de vaccins ADN capables d'induire une réponse immunitaire cellulaire et humorale spécifiquement dirigées contre les souches AEEC) et de développement de tests diagnostiques sensibles et spécifiques.
3 0 La présente invention a également pour but d'évaluer le rôle des animaux comme réservoirs de souches E. coli pathogènes pour l'homme incluant les E. coli 0157:H7 de plus en plus fréquents au Canada et dans le monde entier.
Problématigue.
Les AEEC incluent les EHEC (sérogroupes 0157:H7 et non-0157) et d'autres E.
coli entéropathogènes (EPEC) de nombreuses espèces animales comme le lapin (REDEC), le chien (DEPEC), le porc (PEPEC),.... qui sont hétérogènes dans leur structure antigénique (antigène O- et H-). Bien qu'il n'existe pas de marqueur phénotypique commun à
tous les AEEC, les déterminants de virulence codés par le locus d'effacement des entérocytes LEE
(intimine Eae, protéines sécrétées EspA, EspB, EspD, récepteur de l'intimine Tir...) sont 1 o cependant des marqueurs communs aux différentes souches. Ces marqueurs peuvent donc être utilisés pour le développement de tests diagnostiques, d'immunothérapie et de stratégies vaccinales contre les différentes souches AEEC.
Les bovins sont un important réservoir d'infection pour les EHEC 0157:H7 et d'autres souches AEEC responsables de dysenteries et de syndromes urémiques hémolytiques (NUS) chez l'homme. De nombreux cas de maladies ont été attribuées aux EHEC de sérogroupe 0157 mais d'autres sérogroupes sont responsables de cas sporadiques de maladies humaines. Les infections humaines aux EHEC 0157 sont sous surveillance nationale dans beaucoup de pays mais la détection des infections EHEC non-0157 est 2 o souvent limitée à un petit groupe de laboratoires spécialisés. Cependant, les humains sont beaucoup plus souvent exposés aux EHEC non 0157 car ces souches sont prévalentes chez les animaux et comme contaminants de nourriture.
II est donc important d'éliminer les souches EHEC pathogènes de la microflore intestinale des veaux pour éviter une propagation chez l'homme. Une thérapie curative n'est pas encore disponible. Des techniques rapides de détection existent pour certaines souches AEEC comme celles appartenant à 0157 mais ne sont pas efficaces pour détecter un grand nombre d'autres souches EHEC et AEEC. De nouvelles techniques de détection, basées sur les marqueurs de virulence communs à toutes les souches AEEC, doivent donc étre 3 o mises en place.
Les diarrhées dues aux AEEC sont aussi observées de plus en plus fréquemment dans de nombreuses espèces animales comme les lapins, les chiens, les chevaux, les moutons, les chats et les porcs. Ces diarrhées restent une importante cause de pertes économiques dans l'industrie animale. Les AEEC dont les E. coli entérohémorragiques (EHEC) exercent leurs effets pathogènes par l'intermédiaire de nombreux facteurs de virulence codés par le LEE dont certaines ont été caractérisées par la Demanderesse. Cette dernière a également démontré qu'une autre protéine appelée Paa est aussi impliquée dans l'adhésion des AEEC
aux cellules hôtes et qu'elle se retrouve dans toutes les souches EHEC 0157:H7 et est aussi fortement associée aux ETEC ( au moins dans les souches d'origine porcine). Ces résultats ont fait l'objet d'une publication dans Mechanisms in the pathogenesis of enteric 1o diseases 2 Vol. 473, An H. et al., p179-184, ed. Paul P.S. et Francis D.H., Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, 1999.
La vaccination maternelle est couramment pratiquée chez le porc et contrôle les diarrhées chez les animaux nouveau-nés mais pas chez les porcelets en période de post-sevrage.
Une approche pour contrôler et traiter les diarrhées dues aux AEEC est l'utilisation d'antibiotiques qui devient de moins en moins recommandée à cause des problèmes de résistance bactérienne et de sa non efficacité. Une vaccination préventive et/ou une thérapie efficaces doivent donc être développées, à partir des facteurs de virulence communs aux différentes souches AEEC.
SOMMAIRE DE L'INVENTION
La présente invention a donc pour objet de proposer des outils de diagnostic pour détecter les AEEC chez les animaux (préférablement chez les veaux et les porcs) et l'homme.
La présente invention a également pour objet de développer des méthodes de prévention et de thérapie efficaces contre les AEEC.
Plus particulièrement, la présente invention propose la production d'anticorps contre les protéines Eae, EspA, EspB, EspD, Paa, et Tir, et préférentiellement contre la Paa.
Problématigue.
Les AEEC incluent les EHEC (sérogroupes 0157:H7 et non-0157) et d'autres E.
coli entéropathogènes (EPEC) de nombreuses espèces animales comme le lapin (REDEC), le chien (DEPEC), le porc (PEPEC),.... qui sont hétérogènes dans leur structure antigénique (antigène O- et H-). Bien qu'il n'existe pas de marqueur phénotypique commun à
tous les AEEC, les déterminants de virulence codés par le locus d'effacement des entérocytes LEE
(intimine Eae, protéines sécrétées EspA, EspB, EspD, récepteur de l'intimine Tir...) sont 1 o cependant des marqueurs communs aux différentes souches. Ces marqueurs peuvent donc être utilisés pour le développement de tests diagnostiques, d'immunothérapie et de stratégies vaccinales contre les différentes souches AEEC.
Les bovins sont un important réservoir d'infection pour les EHEC 0157:H7 et d'autres souches AEEC responsables de dysenteries et de syndromes urémiques hémolytiques (NUS) chez l'homme. De nombreux cas de maladies ont été attribuées aux EHEC de sérogroupe 0157 mais d'autres sérogroupes sont responsables de cas sporadiques de maladies humaines. Les infections humaines aux EHEC 0157 sont sous surveillance nationale dans beaucoup de pays mais la détection des infections EHEC non-0157 est 2 o souvent limitée à un petit groupe de laboratoires spécialisés. Cependant, les humains sont beaucoup plus souvent exposés aux EHEC non 0157 car ces souches sont prévalentes chez les animaux et comme contaminants de nourriture.
II est donc important d'éliminer les souches EHEC pathogènes de la microflore intestinale des veaux pour éviter une propagation chez l'homme. Une thérapie curative n'est pas encore disponible. Des techniques rapides de détection existent pour certaines souches AEEC comme celles appartenant à 0157 mais ne sont pas efficaces pour détecter un grand nombre d'autres souches EHEC et AEEC. De nouvelles techniques de détection, basées sur les marqueurs de virulence communs à toutes les souches AEEC, doivent donc étre 3 o mises en place.
Les diarrhées dues aux AEEC sont aussi observées de plus en plus fréquemment dans de nombreuses espèces animales comme les lapins, les chiens, les chevaux, les moutons, les chats et les porcs. Ces diarrhées restent une importante cause de pertes économiques dans l'industrie animale. Les AEEC dont les E. coli entérohémorragiques (EHEC) exercent leurs effets pathogènes par l'intermédiaire de nombreux facteurs de virulence codés par le LEE dont certaines ont été caractérisées par la Demanderesse. Cette dernière a également démontré qu'une autre protéine appelée Paa est aussi impliquée dans l'adhésion des AEEC
aux cellules hôtes et qu'elle se retrouve dans toutes les souches EHEC 0157:H7 et est aussi fortement associée aux ETEC ( au moins dans les souches d'origine porcine). Ces résultats ont fait l'objet d'une publication dans Mechanisms in the pathogenesis of enteric 1o diseases 2 Vol. 473, An H. et al., p179-184, ed. Paul P.S. et Francis D.H., Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, 1999.
La vaccination maternelle est couramment pratiquée chez le porc et contrôle les diarrhées chez les animaux nouveau-nés mais pas chez les porcelets en période de post-sevrage.
Une approche pour contrôler et traiter les diarrhées dues aux AEEC est l'utilisation d'antibiotiques qui devient de moins en moins recommandée à cause des problèmes de résistance bactérienne et de sa non efficacité. Une vaccination préventive et/ou une thérapie efficaces doivent donc être développées, à partir des facteurs de virulence communs aux différentes souches AEEC.
SOMMAIRE DE L'INVENTION
La présente invention a donc pour objet de proposer des outils de diagnostic pour détecter les AEEC chez les animaux (préférablement chez les veaux et les porcs) et l'homme.
La présente invention a également pour objet de développer des méthodes de prévention et de thérapie efficaces contre les AEEC.
Plus particulièrement, la présente invention propose la production d'anticorps contre les protéines Eae, EspA, EspB, EspD, Paa, et Tir, et préférentiellement contre la Paa.
4 La présente invention propose aussi l'utilisation de ces anticorps, de préférence ceux contre la Paa, pour le développement de kits de diagnostics pour la détection des AEEC.
La présente invention propose également l'utilisation de ces anticorps, de préférence ceux contre la Paa, pour le développement de méthodes de prévention et d'immunothérapie, par exemple, contre les maladies telles que la diarrhée, les colites hémorragiques et le syndrome urémique hémolytique (SUH) causés par les AEEC.
Préférentiellement, les anticorps produits contre les protéines Eae, EspA, EspB, EspD, Paa, et Tir sont des anticorps de poulet (de type IgY).
La présente invention a également pour objet l'usage les protéines Eae, EspA, EspB, EspD, Paa, et Tir, et tout fragment dérivant de ces protéines et ayant les caractéristiques immunologiques pour le développement de vaccin.
La présente invention a donc comme avantage l'utilisation d'anticorps de poulet pour le développement de kits de diagnostics pour la détection des AEEC et pour le développement de méthodes de prévention et d'immunothérapie contre les AEEC. Plus particulièrement, la production d'anticorps chez le poulet offre l'avantage d'être facilement réalisable et 2 0 d'obtenir de meilleur rendement en terme de quantité par rapport aux méthodes traditionnelles. De plus, cette technique est non invasive.
Une immunothérapie à base d'anticorps de poulet présente aussi les avantages suivants - elle offre une alternative très intéressante à l'usage d'antibiotiques contre les AEEC ;
- elle offre la possibilité d'être administrés par voie orale lors de l'immunothérapie en administrant les jaunes d'oeufs dans la nourriture, par exemple.
L'usage de la protéine Paa comme substrat pour la production d'IgY de poulet offre plusieurs avantages. En effet, paa est un nouveau gène impliqué dans l'adhérence des bactéries AEEC qui a été découvert dans notre laboratoire. La protéine Paa (28 kDa) n'est pas encore exploitée entièrement, ni très bien caractérisée et toutes les utilisations possibles de Paa ne sont donc pas encore connues. Paa est par conséquent une protéine prometteuse pour lutter contre les souches d'AEEC. Paa est retrouvée dans 70%
des souches AEEC et existe chez toutes les souches EHEC 0157 :H7.Paa est également retrouvée dans les souches ETEC (voir Tableau N 2 publication An et al.) mais est rarement associé aux souches d' E. coli de la flore normale.
La présente invention propose également l'utilisation de ces anticorps, de préférence ceux contre la Paa, pour le développement de méthodes de prévention et d'immunothérapie, par exemple, contre les maladies telles que la diarrhée, les colites hémorragiques et le syndrome urémique hémolytique (SUH) causés par les AEEC.
Préférentiellement, les anticorps produits contre les protéines Eae, EspA, EspB, EspD, Paa, et Tir sont des anticorps de poulet (de type IgY).
La présente invention a également pour objet l'usage les protéines Eae, EspA, EspB, EspD, Paa, et Tir, et tout fragment dérivant de ces protéines et ayant les caractéristiques immunologiques pour le développement de vaccin.
La présente invention a donc comme avantage l'utilisation d'anticorps de poulet pour le développement de kits de diagnostics pour la détection des AEEC et pour le développement de méthodes de prévention et d'immunothérapie contre les AEEC. Plus particulièrement, la production d'anticorps chez le poulet offre l'avantage d'être facilement réalisable et 2 0 d'obtenir de meilleur rendement en terme de quantité par rapport aux méthodes traditionnelles. De plus, cette technique est non invasive.
Une immunothérapie à base d'anticorps de poulet présente aussi les avantages suivants - elle offre une alternative très intéressante à l'usage d'antibiotiques contre les AEEC ;
- elle offre la possibilité d'être administrés par voie orale lors de l'immunothérapie en administrant les jaunes d'oeufs dans la nourriture, par exemple.
L'usage de la protéine Paa comme substrat pour la production d'IgY de poulet offre plusieurs avantages. En effet, paa est un nouveau gène impliqué dans l'adhérence des bactéries AEEC qui a été découvert dans notre laboratoire. La protéine Paa (28 kDa) n'est pas encore exploitée entièrement, ni très bien caractérisée et toutes les utilisations possibles de Paa ne sont donc pas encore connues. Paa est par conséquent une protéine prometteuse pour lutter contre les souches d'AEEC. Paa est retrouvée dans 70%
des souches AEEC et existe chez toutes les souches EHEC 0157 :H7.Paa est également retrouvée dans les souches ETEC (voir Tableau N 2 publication An et al.) mais est rarement associé aux souches d' E. coli de la flore normale.
5 De plus, un mutant Paa::TnphoA n'adhère pas aux expiants intestinaux mais cette adhérence est restaurée par complémentation en trans de la souche mutante avec le gène paa sauvage ce qui confirme le rôle de cette protéine dans l'adhérence des souches AEEC
(Figure 1 ).
Des anticorps anti-Paa obtenus chez la poule sont capables de bloquer l'adhésion de la souche 1390 aux expiants intestinaux et inhibent donc le développement des lésions A/E
(Figure 2). Ces anticorps pourraient également bloquer l'adhésion de différentes souches AEEC aux cellules intestinales.
DESCRIPTION DES MODES DE RÉALISATION
PRÉFÉRÉS DE L'INVENTION
a) Production des protéines recombinantes Les gènes correspondant aux protéines Eae, EspA, EspB, EspD, Paa, Tir ont été
amplifiés par PCR à partir de l'ADN génomique de la souche de E. coli entéropathogène porcine 1390 et clonés dans un vecteur d'expression (pQE30; Qiagen) permettant la fusion en phase d'une queue polyhistidine (His6) à l'extrémité N-terminale des protéines.
Une protéine de fusion utilisant seulement l'extrémité C-terminale de l'intimine Eae (Eae carboxy) qui est impliquée dans la reconnaissance au récepteur Tir ainsi qu'une autre fusion impliquant l'extrémité C-terminale stable de la protéine Paa ont été
réalisées.
Les protéines recombinantes produites ont pu être détectées par Western blot à
l'aide d'anticorps anti-His et d'anticorps dirigés spécifiquement contre chacun des facteurs de virulence.
(Figure 1 ).
Des anticorps anti-Paa obtenus chez la poule sont capables de bloquer l'adhésion de la souche 1390 aux expiants intestinaux et inhibent donc le développement des lésions A/E
(Figure 2). Ces anticorps pourraient également bloquer l'adhésion de différentes souches AEEC aux cellules intestinales.
DESCRIPTION DES MODES DE RÉALISATION
PRÉFÉRÉS DE L'INVENTION
a) Production des protéines recombinantes Les gènes correspondant aux protéines Eae, EspA, EspB, EspD, Paa, Tir ont été
amplifiés par PCR à partir de l'ADN génomique de la souche de E. coli entéropathogène porcine 1390 et clonés dans un vecteur d'expression (pQE30; Qiagen) permettant la fusion en phase d'une queue polyhistidine (His6) à l'extrémité N-terminale des protéines.
Une protéine de fusion utilisant seulement l'extrémité C-terminale de l'intimine Eae (Eae carboxy) qui est impliquée dans la reconnaissance au récepteur Tir ainsi qu'une autre fusion impliquant l'extrémité C-terminale stable de la protéine Paa ont été
réalisées.
Les protéines recombinantes produites ont pu être détectées par Western blot à
l'aide d'anticorps anti-His et d'anticorps dirigés spécifiquement contre chacun des facteurs de virulence.
6 Toutes ces protéines de fusion ont ensuite été produites en grande quantité et purifiées sur colonne d'affinité en quantité suffisante pour réaliser les immunisations des poules et permettre les dosages ELISA.
b) Production, purification et spécificité des anticorps Cinquante microgrammes de chacune des protéines purifiées sont inoculés en présence d'adjuvant incomplet de Freund dans le muscle pectoral de poules aux jours 1, 14, 28 et 42.
1 o Les neufs sont récoltés à partir du jour 28 et conservés à +4C jusqu'à
purification des anticorps. Le jaune d'oeufs est mélangé avec du PBS (vol/vol), un volume de chloroforme est ajouté et l'ensemble est vortexé. Après centrifugation, la phase aqueuse contenant les IgY est conservée. L'analyse en SDS-PAGE permet de montrer qu'il y a production d'IgY dès le 28ème jour après la première immunisation. Des résultats préliminaires obtenus par analyse en Western blot font apparaître que les IgY purifiés reconnaissent spécifiquement les protéines de fusion homologues (voir, Figure 3).
Le titre de chacun des anticorps est alors mesuré par ELISA en utilisant les protéines purifiées homologues comme antigènes. Les conditions du test ELISA ont été
déterminées 2o pour chaque anticorps et les résultats montrent un titre élevé variant de 1/4000 à 1/32000 suivant la protéine (Titre de 1/12800 pour Eae carboxy ; 1/4800 pour Eae, 1/4000 pour EspA ; 1/5600 pour EspB ; 1/12800 pour EspD ; 1/12800 pour Paa ; 1/25600 pour Paa carboxy ; 1/32000 pour Tir) 42 jours après l'immunisation initiale. Par la suite, leur capacité
à détecter les antigènes correspondants dans la souche homologue 1390 et dans des souches EHEC et EPEC d'origines variées seront analysés.
c) Capacité des anticops spécifigues à prévenir le développement des lésions A/E in vüro dans le modèle des expiants d'iléon de porcelets.
- Mise au point du modèle La première étape de ce travail a nécessité la mise au point des conditions de culture des expiants d'intestin de porcelets nouveau-nés permettant la meilleure adhérence des
b) Production, purification et spécificité des anticorps Cinquante microgrammes de chacune des protéines purifiées sont inoculés en présence d'adjuvant incomplet de Freund dans le muscle pectoral de poules aux jours 1, 14, 28 et 42.
1 o Les neufs sont récoltés à partir du jour 28 et conservés à +4C jusqu'à
purification des anticorps. Le jaune d'oeufs est mélangé avec du PBS (vol/vol), un volume de chloroforme est ajouté et l'ensemble est vortexé. Après centrifugation, la phase aqueuse contenant les IgY est conservée. L'analyse en SDS-PAGE permet de montrer qu'il y a production d'IgY dès le 28ème jour après la première immunisation. Des résultats préliminaires obtenus par analyse en Western blot font apparaître que les IgY purifiés reconnaissent spécifiquement les protéines de fusion homologues (voir, Figure 3).
Le titre de chacun des anticorps est alors mesuré par ELISA en utilisant les protéines purifiées homologues comme antigènes. Les conditions du test ELISA ont été
déterminées 2o pour chaque anticorps et les résultats montrent un titre élevé variant de 1/4000 à 1/32000 suivant la protéine (Titre de 1/12800 pour Eae carboxy ; 1/4800 pour Eae, 1/4000 pour EspA ; 1/5600 pour EspB ; 1/12800 pour EspD ; 1/12800 pour Paa ; 1/25600 pour Paa carboxy ; 1/32000 pour Tir) 42 jours après l'immunisation initiale. Par la suite, leur capacité
à détecter les antigènes correspondants dans la souche homologue 1390 et dans des souches EHEC et EPEC d'origines variées seront analysés.
c) Capacité des anticops spécifigues à prévenir le développement des lésions A/E in vüro dans le modèle des expiants d'iléon de porcelets.
- Mise au point du modèle La première étape de ce travail a nécessité la mise au point des conditions de culture des expiants d'intestin de porcelets nouveau-nés permettant la meilleure adhérence des
7 bactéries EHEC et EPEC aux cellules épithéliales d'iléon de porcelets sevrés.
Ces résultats ont été exposés sous forme de communication affichée au ter Colloque International de Bactériologie Vétérinaire de langue française, 17-19 Mai 2000, Saint-Hyacinthe, Québec.
- Rôle de Paa, nouveau facteur de virulence des EHEC et EPEC.
Un mutant non polaire de la souche porcine 1390 par insertion d'une cassette kanamycine dans le gène paa et par échange allélique a été réalisé et sous forme de communication affichée au 1 er Colloque International de Bactériologie Vétérinaire de langue française, 17-19 Mai 2000, Saint-Hyacinthe, QUEBEC. Ce mutant et son complément 1 o pourront être utilisés respectivement comme témoins négatif et positif d'adhérence et de formation des lésions A/E dans les expériences d'expiants d'intestin de porcelets.
- Blocage des lésions A/E
La capacité des anticorps spécifiques à prévenir le développement des lésions de type A/E in vitro dans le modèle d'expiants d'intestin est actuellement testée dans un premier temps avec la souche homologue 1390 puis ensuite avec différentes souches EHEC
et EPEC hétérologues. Cela permettra d'étudier la cinétique d'apparition des différents facteurs de virulence au cours de l'infection et le développement des lésions A/E.
Jusqu'à présent, la Demanderesse a démontré que l'adhérence des bactéries 1390 est fortement diminuée 2 0 en présence des anticorps anti-Eae, anti-Eae carboxy, anti-Tir, et à un degré moindre avec les anticorps anti-Paa (Figure 2). De plus, des études préliminaires ont montré que les anticorps anti-Eae et anti-Tir étaient aussi capables de diminuer fortement l'adhérence d'une souche hétérologue AEEC d'origine bovine (Figure 4) 2 5 - Capacité des anticorps spécifiques à prévenir le développement des lésions A/E in vwo Grâce aux résultats obtenus dans les expériences in vitro, nous pourrons tester la capacité des anticorps spécifiques à prévenir le développement des lésions A/E
in vivo dans les modèles de porcelets nouveau-nés et sevrés infectés expérimentalement ainsi que la 30 capacité d'un test ELISA à détecter les EHEC et EPEC homologues et hétérologues dans les fèces de ces porcs. Un modèle d'infection des porcelets sevrés est actuellement à l'étude au laboratoire. Les expériences préliminaires ont été présentées au congrès organisé par
Ces résultats ont été exposés sous forme de communication affichée au ter Colloque International de Bactériologie Vétérinaire de langue française, 17-19 Mai 2000, Saint-Hyacinthe, Québec.
- Rôle de Paa, nouveau facteur de virulence des EHEC et EPEC.
Un mutant non polaire de la souche porcine 1390 par insertion d'une cassette kanamycine dans le gène paa et par échange allélique a été réalisé et sous forme de communication affichée au 1 er Colloque International de Bactériologie Vétérinaire de langue française, 17-19 Mai 2000, Saint-Hyacinthe, QUEBEC. Ce mutant et son complément 1 o pourront être utilisés respectivement comme témoins négatif et positif d'adhérence et de formation des lésions A/E dans les expériences d'expiants d'intestin de porcelets.
- Blocage des lésions A/E
La capacité des anticorps spécifiques à prévenir le développement des lésions de type A/E in vitro dans le modèle d'expiants d'intestin est actuellement testée dans un premier temps avec la souche homologue 1390 puis ensuite avec différentes souches EHEC
et EPEC hétérologues. Cela permettra d'étudier la cinétique d'apparition des différents facteurs de virulence au cours de l'infection et le développement des lésions A/E.
Jusqu'à présent, la Demanderesse a démontré que l'adhérence des bactéries 1390 est fortement diminuée 2 0 en présence des anticorps anti-Eae, anti-Eae carboxy, anti-Tir, et à un degré moindre avec les anticorps anti-Paa (Figure 2). De plus, des études préliminaires ont montré que les anticorps anti-Eae et anti-Tir étaient aussi capables de diminuer fortement l'adhérence d'une souche hétérologue AEEC d'origine bovine (Figure 4) 2 5 - Capacité des anticorps spécifiques à prévenir le développement des lésions A/E in vwo Grâce aux résultats obtenus dans les expériences in vitro, nous pourrons tester la capacité des anticorps spécifiques à prévenir le développement des lésions A/E
in vivo dans les modèles de porcelets nouveau-nés et sevrés infectés expérimentalement ainsi que la 30 capacité d'un test ELISA à détecter les EHEC et EPEC homologues et hétérologues dans les fèces de ces porcs. Un modèle d'infection des porcelets sevrés est actuellement à l'étude au laboratoire. Les expériences préliminaires ont été présentées au congrès organisé par
8 l'Association des Microbiologistes du Québec (Novembre 1999, Montréal) sous forme de communication affichée (voir résumé).
d) Développement de kits de diagnostic pour la détection d'AEEC
ELISA sandwich : les anticorps IgY de poules (ou IgG de lapins) spécifiques d'une protéines donnée seront adhérés (coating) sur une plaque ELISA 96 puits. L'échantillon ou des dilutions de cet échantillon à tester sera alors déposé dans les puits puis un anticorps secondaire IgG de lapins (ou IgY de poules) spécifiques de cette même protéine sera ajouté.
La révélation sera effectuée avec un anticorps anti-IgG de lapin (ou anti-IgY
de poule) couplé
1 o à la péroxydase.
ELISA compétitif : les protéines purifiées correspondant à chacun des facteurs de virulence sont utilisées comme antigènes et sont adhérés (coating) sur la plaque ELISA.
Des anticorps spécifiques marqués de ces différentes protéines sont alors ajoutés en même temps que l'échantillon à tester. Si l'échantillon contient la protéine recherchée, cette dernière va reconnaître l'anticorps qui ne pourra alors plus se fixer sur la plaque. II
n'y aura alors pas d'immunoréponse. Inversement, si l'échantillon ne contient pas la protéine recherchée, l'anticorps pourra alors reconnaître la protéine fixée sur la plaque ELISA et une forte réponse sera observée après révélation.
e) Développement d'immunothérapies contre les AEEC
Exemple de protocole d'immunothérapie au niveau du champs : Des porcelets nouveau-nés ou en période de post-sevrage sont séparés en différents groupes. Un groupe est nourri avec une diète conventionnelle commerciale. Un autre groupe est nourri avec une diète supplémentée avec des neufs (ou de la poudre de jaune d'oeufs lyophylisés) ne contenant pas d'anticorps dirigés contre les facteurs de virulence des AEEC (Eae, EspA, EspB, EspD, Tir, Paa). Un troisième groupe est nourri avec une diète supplémentée avec des neufs (ou de la poudre de jaune d'oeufs lyophylisés) contenant des anticorps dirigés contre les facteurs de virulence des AEEC (Eae, EspA, EspB, EspD, Tir, Paa). L'apparition des signes cliniques et la présence de souches AEEC après écouvillons rectaux permet de montrer l'efficacité des anticorps dirigés contre les souches AEEC.
Après validation de l'efficacité des anticorps dirigés contre les différents facteurs de virulence
d) Développement de kits de diagnostic pour la détection d'AEEC
ELISA sandwich : les anticorps IgY de poules (ou IgG de lapins) spécifiques d'une protéines donnée seront adhérés (coating) sur une plaque ELISA 96 puits. L'échantillon ou des dilutions de cet échantillon à tester sera alors déposé dans les puits puis un anticorps secondaire IgG de lapins (ou IgY de poules) spécifiques de cette même protéine sera ajouté.
La révélation sera effectuée avec un anticorps anti-IgG de lapin (ou anti-IgY
de poule) couplé
1 o à la péroxydase.
ELISA compétitif : les protéines purifiées correspondant à chacun des facteurs de virulence sont utilisées comme antigènes et sont adhérés (coating) sur la plaque ELISA.
Des anticorps spécifiques marqués de ces différentes protéines sont alors ajoutés en même temps que l'échantillon à tester. Si l'échantillon contient la protéine recherchée, cette dernière va reconnaître l'anticorps qui ne pourra alors plus se fixer sur la plaque. II
n'y aura alors pas d'immunoréponse. Inversement, si l'échantillon ne contient pas la protéine recherchée, l'anticorps pourra alors reconnaître la protéine fixée sur la plaque ELISA et une forte réponse sera observée après révélation.
e) Développement d'immunothérapies contre les AEEC
Exemple de protocole d'immunothérapie au niveau du champs : Des porcelets nouveau-nés ou en période de post-sevrage sont séparés en différents groupes. Un groupe est nourri avec une diète conventionnelle commerciale. Un autre groupe est nourri avec une diète supplémentée avec des neufs (ou de la poudre de jaune d'oeufs lyophylisés) ne contenant pas d'anticorps dirigés contre les facteurs de virulence des AEEC (Eae, EspA, EspB, EspD, Tir, Paa). Un troisième groupe est nourri avec une diète supplémentée avec des neufs (ou de la poudre de jaune d'oeufs lyophylisés) contenant des anticorps dirigés contre les facteurs de virulence des AEEC (Eae, EspA, EspB, EspD, Tir, Paa). L'apparition des signes cliniques et la présence de souches AEEC après écouvillons rectaux permet de montrer l'efficacité des anticorps dirigés contre les souches AEEC.
Après validation de l'efficacité des anticorps dirigés contre les différents facteurs de virulence
9 des souches AEEC, ces anticorps pourront être incorporés, de routine, à la nourriture à des fins préventives.
L'analyse bio-informatique du gène paa et de la protéine Paa a permis de caractériser Paa du point de vue de son pourcentage en G+C (annexe 1 ), de sa localisation potentielle (annexe 2), de son hydrophobicité (annexe 3), de la présence potentielle d'un peptide signal (annexe 4), de son caractère instable (annexe 5) et de ses homologies avec d'autres protéines (annexe 6).
1 o paa est situé à 35,4 min sur le chromosome de E. coli K12 entre les loci rem et rel.
La mesure de l'activité phosphatase alcaline d'un mutant TnphoA ::Paa montre que Paa serait située au niveau du culot bactérien (annexe 7). L'étude plus précise de la localisation de Paa est en cours de réalisation.
L'analyse par électrophorèse en champs pulsés (PFGE) avec une sonde paa a montré la présence d'une seule copie du gène paa dans le chromosome de la souche porcine (annexe 8).
Des fusions du promoteur de paa avec le gène rapporteur de la GFP (green fluorescent protein) vont permettre d'étudier l'activité du promoteur Paa et d'analyser la cinétique d'expression de Paa au cours de l'infection et du développement des lésions A/E . Ces 2 0 expériences sont actuellement en cours de réalisation.
Le mutant TnphoA ::Paa n'adhère pas aux expiants intestinaux de porcelets (adhésion comparable à celle observée avec une souche témoin négatif) mais la complémentation en trans de Paa restaure l'adhésion qui redevient sensiblement identique à la souche sauvage 1390 (Figure 1 ).
2 5 Les anticorps anti-Paa obtenus chez la poule sont capables de bloquer l'adhésion de la souche 1390 aux expiants intestinaux de porcelets (Figure 2).
Bien que des modes de réalisation préférés de l'invention aient été décrits en détails ci-dessus et illustrés dans les dessins annexés, l'invention n'est pas limitée à ces 30 seuls modes de réalisation et plusieurs changements et modifications peuvent y être effectués par une personne du métier sans sortir du cadre ou de l'esprit de l'invention.
L'analyse bio-informatique du gène paa et de la protéine Paa a permis de caractériser Paa du point de vue de son pourcentage en G+C (annexe 1 ), de sa localisation potentielle (annexe 2), de son hydrophobicité (annexe 3), de la présence potentielle d'un peptide signal (annexe 4), de son caractère instable (annexe 5) et de ses homologies avec d'autres protéines (annexe 6).
1 o paa est situé à 35,4 min sur le chromosome de E. coli K12 entre les loci rem et rel.
La mesure de l'activité phosphatase alcaline d'un mutant TnphoA ::Paa montre que Paa serait située au niveau du culot bactérien (annexe 7). L'étude plus précise de la localisation de Paa est en cours de réalisation.
L'analyse par électrophorèse en champs pulsés (PFGE) avec une sonde paa a montré la présence d'une seule copie du gène paa dans le chromosome de la souche porcine (annexe 8).
Des fusions du promoteur de paa avec le gène rapporteur de la GFP (green fluorescent protein) vont permettre d'étudier l'activité du promoteur Paa et d'analyser la cinétique d'expression de Paa au cours de l'infection et du développement des lésions A/E . Ces 2 0 expériences sont actuellement en cours de réalisation.
Le mutant TnphoA ::Paa n'adhère pas aux expiants intestinaux de porcelets (adhésion comparable à celle observée avec une souche témoin négatif) mais la complémentation en trans de Paa restaure l'adhésion qui redevient sensiblement identique à la souche sauvage 1390 (Figure 1 ).
2 5 Les anticorps anti-Paa obtenus chez la poule sont capables de bloquer l'adhésion de la souche 1390 aux expiants intestinaux de porcelets (Figure 2).
Bien que des modes de réalisation préférés de l'invention aient été décrits en détails ci-dessus et illustrés dans les dessins annexés, l'invention n'est pas limitée à ces 30 seuls modes de réalisation et plusieurs changements et modifications peuvent y être effectués par une personne du métier sans sortir du cadre ou de l'esprit de l'invention.
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