ES2283531T3 - Anticuerpos para la prevencion y el tratamiento de enfermedades asociadas a la virulencia de escherichia coli de adhesion y borrado (aeec). - Google Patents
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Abstract
Anticuerpo de clase IgY inmunológicamente específico para una proteína asociada a la virulencia de Escherichia coli de adhesión y borrado (AEEC) seleccionada de entre el grupo que consiste de Eae, Tir, EspA y Paa, previniendo dicho anticuerpo una infección intestinal AEEC in vivo cuando es administrado a un mamífero.
Description
Anticuerpos para la prevención y el tratamiento
de enfermedades asociadas a la virulencia de Escherichia coli
de adhesión y borrado (AEEC).
La presente invención se refiere a unos
anticuerpos inmunológicamente específicos para una proteína asociada
a la virulencia de Escherichia coli de adhesión y borrado
(AEEC) y a la utilización de los mismos en la prevención de una
infección por AEEC en un mamífero.
La Escherichia coli se encuentra asociada
a una amplia variedad de enfermedades intestinales en seres humanos
y en animales. Algunas E. coli patógenas producen lesiones de
adhesión y borrado (A/E), caracterizadas por una adhesión
bacteriana íntima a los entericitos y por la alteración del
citoesqueleto subyacente. Dichos aislados se denominan E.
Coli de A/E (AEEC).
Algunos informes han mostrado que las lesiones
A/E son características de los patógenos entéricos de los seres
humanos, tales como la E. coli enteropatógena (EPEC),
responsable de la diarrea aguda infantil en los países en vías de
desarrollo, y la E. coli enterohemorrágica (EHEC), que
produce la colitis hemorrágica y el síndrome urémico hemolítico
(HUS). Las lesiones A/E también han sido asociadas a la diarrea en
diferentes especies animales, tales como conejos, terneros, perros,
gatos, corderos y cerdos.
Las lesiones A/E surgen de la adhesión
bacteriana íntima a la superficie apical de los enterocitos, y de la
activación de diversos productos de genes cromosómicos que
interaccionan con componentes de la célula huésped. Dichos
productos de genes habitualmente se denominan proteínas asociadas a
la virulencia AEEC. Algunos ejemplos de estas proteínas asociadas a
la virulencia son la intimina (Eae) y las proteínas secretadas Tir
(receptor translocado de la intimina), EspA, EspD, y EspB.
En la actualidad, el único procedimiento para el
control y el tratamiento de las enfermedades asociadas a la AEEC es
la utilización de antibióticos, procedimiento que resulta cada vez
menos deseable debido a problemas de resistencia bacteriana y a los
residuos de antibióticos. Por lo tanto, deben buscarse
procedimientos alternativos para controlar la diarrea
postdestete.
De manera alternativa, otro procedimiento
conocido en la técnica sugiere la utilización de proteínas asociadas
a la virulencia AEEC como antígenos para inmunizar un animal con el
fin de estimular la producción de anticuerpos contra el patógeno
asociado. Sin embargo, no se ha mostrado indicación alguna de la
eficacia de este procedimiento para prevenir la infección por AEEC
en un mamífero. Algunos ejemplos de dicho procedimiento alternativo
son mostrados en la patente US 6.204.004 y en las solicitudes de
patente internacional WO 99/41614; WO 97/40063 y WO 99/24576.
También es conocida en la técnica la utilización
de los anticuerpos aviares (IgY) en la inmunización pasiva. Por
ejemplo, el documento WO 00/52055 da a conocer la utilización de
anticuerpos específicos de yema de huevo de clase IgY para la
inmunoterapia en la cría y producción de animales. Dicho documento
también da a conocer la utilización de anticuerpos de clase IgY en
kits de diagnóstico.
La patente US 5.932.250 se refiere al
tratamiento de trastornos vasculares, particularmente la
arteriosclerosis y la aterosclerosis en animales de sangre
caliente. Más concretamente, esta patente estadounidense da a
conocer procedimientos para el control de los niveles de
colesterol, los depósitos lipídicos, y el desarrollo de lesiones
ateromatosas en animales de sangre caliente mediante la ingestión de
productos derivados del huevo que contienen anticuerpos de clase
IgY erigidos contra las proteínas asociadas a la Escherichia
coli.
La patente US 6.162.441 da a conocer un
procedimiento para la producción de anticuerpos de clase IgY
anti-E. coli O157 en gallinas ponedoras.
El problema con los documentos WO 00/52055, US
5.932.250 y US 6.162.441 es que la eficacia in vivo del IgY
producido no ha sido demostrada. De hecho, ninguno de estos
documentos contiene evidencia alguna con relación a la fiabilidad
de un procedimiento consistente en la administración a un mamífero,
de un anticuerpo inmunológicamente específico para una proteína
asociada a la virulencia AEEC para la prevención de una infección
intestinal por AEEC in vivo. Por lo tanto, todavía hay una
necesidad de anticuerpos, productos derivados del huevo y
procedimientos para la prevención o el tratamiento de enfermedades
producidas por AEEC.
La presente invención se refiere a anticuerpos
de clase IgY inmunológicamente específicos para una proteína
asociada a la virulencia de Escherichia coli de adhesión y
borrado (AEEC), tal como se define en la reivindicación 1, y a la
utilización de los mismos en la prevención de una infección por AEEC
en un mamífero.
Dicho anticuerpo de clase IgY es capaz de
prevenir una infección intestinal por AEEC in vivo cuando es
administrado a un mamífero.
El anticuerpo de la invención es resistente a la
digestión intraintestinal.
El anticuerpo de la invención es preferentemente
capaz de prevenir la adhesión de la AEEC al intestino de un
mamífero. Incluso más preferentemente, el anticuerpo de la invención
es capaz de prevenir el desarrollo de lesiones intestinales de
adhesión y borrado (A/E) asociadas a la AEEC. Este aspecto de la
invención se consigue particularmente utilizando anticuerpos
inmunológicamente específicos para una o más proteínas asociadas a
la virulencia AEEC, tales como Eae, Tir, EspA y Paa.
Según otro aspecto, la invención se refiere a un
huevo de corral y a una yema de huevo aislada de dicho huevo que
contiene un anticuerpo, tal como se ha definido anteriormente en la
presente memoria.
Según un aspecto adicional, la invención se
refiere a una composición que comprende un vehículo o portador
biológicamente aceptable y a un anticuerpo, tal como se ha definido
anteriormente, a un huevo de corral, tal como se ha definido
anteriormente; y/o a una yema de huevo aislada, tal como se ha
definido anteriormente.
Según otro aspecto, la invención se refiera a un
aditivo alimentario que comprende un anticuerpo, tal como se ha
definido anteriormente, a un huevo de corral, tal como se ha
definido anteriormente, a una fracción de yema de huevo, tal como
se ha definido anteriormente, y/o a una composición, tal como se ha
definido anteriormente.
Según un aspecto adicional, la invención se
refiere a un procedimiento para la obtención de un anticuerpo, tal
como se ha definido anteriormente en la presente memoria,
comprendiendo el procedimiento las siguientes etapas:
a) La inmunización activa de una gallina de
corral para provocar la producción de anticuerpos en un huevo de la
gallina; y
b) La recuperación o extracción de los
anticuerpos del huevo.
Según un aspecto adicional, se da a conocer un
procedimiento para la prevención de una infección por la virulencia
Escherichia coli de adhesión y borrado (AEEC) en un mamífero.
El procedimiento comprende la etapa de administración oral al
mamífero de un anticuerpo, tal como se ha definido anteriormente, un
huevo de corral, tal como se ha definido anteriormente y/o una yema
de huevo aislada, tal como se ha definido anteriormente.
Una ventaja importante de la invención es que
proporciona anticuerpos, productos, composiciones útiles y
eficientes para la prevención de una infección por AEEC en un
mamífero.
Además, resulta particularmente ventajoso que
los anticuerpos, productos, composiciones de la invención, prevengan
específicamente el desarrollo de las lesiones intestinales A/E
asociadas a la AEEC.
Otros objetivos y ventajas de la presente
invención resultarán evidentes tras la lectura de la descripción no
restrictiva de diversas formas de realización que sigue a
continuación, realizada con relación las figuras adjuntas.
La Figura 1 es un gráfico de barras que muestra
que las cepas de AEEC que provienen del ratón, el cerdo, el bovino,
y el ser humano (incluyendo la EHEC no O157 y la EPEC), y que
producen la proteína Eae de subtipos \alpha, \beta, \gamma, o
\varepsilon, inducían lesiones A/E igualmente en los explantes
ileales de cerdos recién nacidos.
La Figura 2 es un gráfico de barras que muestra
que una sustitución de la proteína Eae de subtipo \gamma por la
proteína Eae de subtipo \alpha en una cepa de serotipo O157:H7
resultó en la inducción de lesiones A/E en una medida similar a la
observada para la cepa porcina homóloga de AEEC.
La Figura 3 es un gráfico de barras que muestra
que los anticuerpos según la invención son capaces de bloquear de
manera considerable el desarrollo de lesiones A/E en explantes
ileales producidas por la cepa homóloga 1390.
La Figura 4 es un gráfico de barras que muestra
que los anticuerpos según la invención son capaces de bloquear de
manera considerable el desarrollo de lesiones A/E en explantes
ileales producidas por diversas cepas bovinas de AEEC.
Las Figuras 5 y 6 son gráficos de barras que
muestran que los anticuerpos según la invención son capaces de
bloquear de manera considerable el desarrollo de lesiones A/E en
explantes ileales producidas por diversas cepas humanas de AEEC.
La Figura 7 es un gráfico de barras que muestra
que los anticuerpos según la invención son capaces de bloquear de
manera considerable el desarrollo de lesiones A/E en explantes
ileales producidas por diversas cepas de EPEC.
Las Figuras 8A y 8B son gráficos de barras que
muestran que la administración oral de los anticuerpos de yema de
huevo según la invención inhibe de manera considerable el desarrollo
de lesiones A/E en el intestino ciego y en el colon de crías de
cerdo desafiadas por una cepa porcina homóloga de AEEC.
Las Figuras 9A y 9B son gráficos de barras que
muestran que la administración oral de los anticuerpos de yema de
huevo según la invención inhibe el desarrollo de lesiones A/E en el
intestino ciego y en el colon de crías de cerdo desafiadas por una
cepa de AEEC de serotipo O157:H7.
Tal como se ha indicado anteriormente, la
presente exposición se refiere a un nuevo procedimiento alternativo,
distinto a los antibióticos, para la prevención de una infección
por AEEC en un mamífero.
En concreto, la presente exposición se refiere a
anticuerpos inmunológicamente específicos para una proteína
asociada a la virulencia AEEC, siendo estos anticuerpos capaces de
prevenir una infección por AEEC in vivo cuando son
administrados en un mamífero. Concretamente, los anticuerpos de la
exposición son capaces de prevenir la adhesión de la AEEC al
intestino de un mamífero, e incluso más preferentemente, previenen
el desarrollo de lesiones intestinales A/E asociadas a la AEEC. Tal
como se utiliza en la presente memoria, el término
"prevenir" se refiere a un procedimiento por el que se
obstruye o se retrasa la infección por AEEC.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "mamífero" se refiere a cualquier mamífero que
presente la posibilidad de resultar infectado por una virulencia
AEEC. Entre los mamíferos que son conocidos por presentar un
potencial de infección por una virulencia AEEC, se encuentran los
seres humanos, los cerdos, los bovinos, los ovinos, los caprinos,
los conejos, los perros y los gatos. Para un experto en la materia
resultará evidente que los anticuerpos de la invención están
destinados a ser inmunológicamente específicos para proteínas de
virulencia aisladas de una diversidad de cepas de AEEC que puedan
producir lesiones intestinales, tales como la E. coli
enteropatógena (EPEC) y la E. coli enterohemorrágica (EHEC).
En la Tabla 1 se muestran algunos ejemplos de cepas de EPEC y
de
EHEC.
EHEC.
Con relación a los anticuerpos de la invención,
la expresión "inmunológicamente específico" se refiere a
anticuerpos que se unen con una afinidad relativamente elevada a
uno o más epítopos de una proteína de interés, pero que no
reconocen ni unen de manera considerable moléculas que no sean la
molécula o las moléculas de interés. Tal como se utiliza en la
presente memoria, los términos "anticuerpo" y
"anticuerpos" incluyen todas las posibilidades
indicadas en lo sucesivo: anticuerpos o fragmentos de los mismos
obtenidos mediante purificación, tratamientos proteolíticos o por
ingeniería genética, construcciones artificiales que comprenden
anticuerpos o fragmentos de los mismos y construcciones
artificiales diseñadas para simular la unión de anticuerpos o de
fragmentos de los mismos. Dichos anticuerpos son descritos en
Colcher et al. (Q J Nucl Med 1998; 42:
225-241). Incluyen anticuerpos completos,
fragmentos F(ab')_{2}, fragmentos Fab, fragmentos Fv,
fragmentos scFV, otros fragmentos, miméticos y péptidos de la CDR.
Estos pueden ser fácilmente obtenidos y preparados por los expertos
de la materia. Por ejemplo, puede utilizarse la digestión con
enzimas para obtener los fragmentos F(ab')_{2} y Fab
sometiendo una molécula de IgG al clivaje producido por la pepsina o
la papaína respectivamente. La presente invención también cubre los
anticuerpos
recombinantes.
recombinantes.
De manera alternativa, el anticuerpo de la
invención puede ser un derivado de un anticuerpo. Dicho anticuerpo
puede comprender una región de unión al antígeno ligada o no una
región no inmunoglobulina. La región de unión al antígeno es un
dominio variable de la cadena ligera o un dominio variable de la
cadena pesada del anticuerpo. Típicamente, el anticuerpo comprende
tanto el dominio variable de la cadena ligera como el dominio
variable de la cadena pesada, de manera que puede insertarse en
construcciones tales como los fragmentos Fv de una sola cadena
(scFv), fragmentos Fv estabilizados por puentes disulfuro (dsFv),
fragmentos scFv multiméricos, diacuerpos, minicuerpos u otras
formas similares (Colcher et al. Q J Nucl Med 1998;
42: 225-241). A veces puede resultar preferente
dicho derivado de anticuerpo ya que está desprovisto del fragmento
Fc del anticuerpo natural que puede unirse a diversos efectores del
sistema inmune y provocar una respuesta inmune cuando es
administrado a un ser humano o a un animal. De hecho, los derivados
de anticuerpo habitualmente no conducen ni a una enfermedad
producida por complejos inmunes ni a una activación del complemento
(reacción de hipersensibilidad tipo III).
De manera alternativa, se fusiona una región no
inmunoglobulina a la región de unión al antígeno del anticuerpo de
la invención. La región no inmunoglobulina típicamente es una
fracción no inmunoglobulina y puede ser un enzima, una región
derivada de una proteína con una especificidad de unión conocida,
una región derivada de una toxina proteína o de hecho de cualquier
proteína expresada mediante un gen, o una entidad química que
muestre una actividad o actividades inhibitorias o de bloqueo contra
las proteínas asociadas a la virulencia AEEC. Las dos regiones de
ese anticuerpo modificado pueden conectarse por medio de una
secuencia de unión permanente o de un
clivaje.
clivaje.
Ya que la infección por AEEC generalmente se
encuentra en el tracto intestinal, resulta altamente preferente que
el anticuerpo de la exposición resulte resistente a la digestión
gastrointestinal. Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "resistente" se refiere a un anticuerpo que
retendrá de manera considerable su función inmunológica incluso
tras haber estado en contacto con los ácidos gástricos durante un
periodo de tiempo necesario para prevenir una infección por AEEC
in vivo. El anticuerpo de la invención es una
inmunoglobulina aviar, tal como el anticuerpo de clase IgY. De
hecho, es bien conocido que los anticuerpos de clase IgY presentan
una gran resistencia a los ácidos y al calor. El anticuerpo de la
exposición puede ser también una inmunoglobulina humana o una
inmunoglobulina animal, tal como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA,
IgE o IgD portadora de las regiones variables de anticuerpo de rata
o ratón (quiméricas) o de las CDR (humanizadas o
"animalizadas"). Sin embargo, la exposición no está limitada a
anticuerpos de clase IgY ya que es concebible considerar que la
capacidad de resistencia del anticuerpo, si fuera escasa, podría ser
proporcionada o podría ser incrementada mediante ingeniería
genética o mediante cualquier otro medio conocido por un experto en
la materia. Además, el anticuerpo de la invención puede también
estar conjugado a cualquier portador conocido por un experto en la
materia con el fin de incrementar su resistencia a los ácidos
gástricos o con el fin de proporcionar, por ejemplo, un suministro
específico y una retención prolongada del anticuerpo, en un área
local determinada, tal como el intestino, o para una aplicación
sistémica.
Tal como se ha indicado anteriormente, el
anticuerpo de la exposición es inmunológicamente específico para
una o más proteínas asociadas a la virulencia AEEC. Las proteínas
asociadas a la virulencia AEEC preferentes contempladas por la
invención son la Eae, Tir, EspA, Paa y derivados inmunológicos de
las mismas. Tal como se utiliza en la presente invención, la
expresión "derivado inmunológico" se refiere a una
proteína o un péptido que posee una actividad inmunológica que es
considerablemente similar a la actividad inmunológica de la proteína
completa o del péptido completo, y dicha actividad inmunológica se
refiere a la capacidad de estimular la producción de anticuerpos
inmunológicamente específicos para una proteína asociada a la
virulencia AEEC o derivada de la misma. Por lo tanto, la expresión
"derivado inmunológico" abarca "fragmentos",
"segmentos", "variantes" o "análogos" de una
proteína o de un péptido.
La presente invención utiliza anticuerpos de
clase IgY, ya que tal como se ha indicado anteriormente, estos
presentan, de manera ventajosa, una resistencia a los ácidos
gástricos. Además, los anticuerpos de clase IgY presentan la
ventaja de no reaccionar con el complemento mamífero, el receptor
Fc, la proteína A o la proteína G. También, los anticuerpos de
clase IgY producidos en huevos, y su extracción de las yemas de los
huevos, pueden llevarse a cabo a gran escala sin que ello suponga
una inversión costosa.
A este respecto y según otro aspecto, la
presente invención también se refiere a un procedimiento para la
obtención del anticuerpo inmunológicamente específico indicado
anteriormente para una proteína asociada a la virulencia AEEC. A
pesar de que muchos procedimientos conocidos en la técnica pueden
resultar adecuados para la obtención de los anticuerpos
contemplados por los presentes inventores, resulta preferente que el
procedimiento de la presente invención comprenda las siguientes
etapas: a) la inmunización activa de una gallina de corral para
provocar la producción de anticuerpos en un huevo de la gallina; y
b) la recuperación o extracción de los anticuerpos del huevo. Un
experto en la materia podrá entender que la etapa de inmunización se
lleva a cabo mediante procedimientos bien conocidos. Por ejemplo,
la proteína asociada a la virulencia AEEC puede darse por vía
parenteral, por ejemplo intravenosa, intramuscular, subcutánea. Tal
como se utiliza en la presente memoria, la expresión "ave de
corral" se refiere a cualquier ave que pueda ser inmunizada.
Entre ellas, resulta preferente la gallina doméstica común. El
procedimiento de la invención puede también comprender una etapa de
administración de por lo menos una dosis de refuerzo de las
proteínas para mantener un estado hiperinmune en la gallina.
Además, el procedimiento de la invención preferentemente comprende
una etapa de purificación de los anticuerpos de una fracción de la
yema del huevo. Una vez más, la etapa de purificación es llevada a
cabo mediante procedimientos bien conocidos por un experto en la
materia. Dicha persona podrá entender que la etapa de refuerzo no
se limita que sea llevada a cabo con anterioridad a la etapa en la
que se pone el huevo. De hecho, También puede administrarse una
dosis de refuerzo a la misma gallina incluso durante la etapa en la
que pone el huevo o después de dicha etapa.
Por consiguiente, la presente invención también
se refiere a un huevo de corral que contiene un anticuerpo de la
invención. La presente invención se refiere adicionalmente a una
yema de huevo aislada del huevo.
La presente exposición también describe un
procedimiento y unas composiciones para la prevención de
enfermedades asociadas la virulencia AEEC. Podrían utilizarse
muchos procedimientos para llevar a la práctica la presente
invención. Sin embargo, se cree particularmente que un procedimiento
que comprende una etapa de administración oral a un mamífero de un
anticuerpo de la invención, un huevo de corral y/o una yema de huevo
aislada, tal como se ha definido anteriormente, resulta
particularmente ventajoso desde un punto de vista comercial. No
obstante, un experto en la materia puede considerar los
procedimientos que implican una administración parenteral del
anticuerpo de la invención.
Según una forma de realización preferente, la
composición de la invención comprende por lo menos un elemento
inmunológicamente activo contra la virulencia AEEC y un vehículo o
portador biológicamente aceptable, tal como un elemento que sea un
anticuerpo, un huevo de corral o una yema de huevo aislada, tal como
se ha definido anteriormente. Para preparar las composiciones de la
presente invención, pueden utilizarse procedimientos bien conocidos
en la técnica. Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "inmunológicamente activo", o la referencia a
la actividad inmunológica de un elemento, tal como un anticuerpo de
la invención, se refiere en dicha instancia, a la capacidad de
dicho anticuerpo para prevenir una infección por AEEC en un
mamífero uniéndose a una proteína asociada a la virulencia AEEC. Tal
como se utiliza en la presente memoria, la expresión
"biológicamente aceptable" se refiere a un vehículo o un
portador que pueda administrarse de manera segura a un mamífero,
particularmente a seres humanos o animales, sin efectos secundarios
tóxicos o demasiado negativos. Dicho vehículo o portador puede se
utilizado para diversos fines, tales como agentes conservantes,
agentes solubilizantes, agentes estabilizantes, agentes humectantes,
emulsionantes, edulcorantes, colorantes, odorantes, sales,
tampones, agentes de recubrimiento o antioxidantes y similares.
Estos pueden se fácilmente preparados por los expertos en la
materia utilizando procedimientos bien conocidos.
Según otra forma de realización, la composición
de la invención se formula bajo la forma de una composición
farmacéutica o una composición nutracéutica. La presente invención
también proporciona un aditivo alimentario que comprende por lo
menos uno de los elementos indicados anteriormente y comprende
adicionalmente una composición, tal como se ha definido
anteriormente. Para un experto en la materia resultará evidente que
a pesar de que las composiciones de la invención se administran
preferentemente por vía oral, pueden ser administradas por
cualquier otra vía adecuada. De hecho, es concebible considerar que
podrían ser administradas por otros medios. En el caso de que las
composiciones sean administradas por vía oral, pueden encontrarse en
forma de tabletas, cápsulas, polvo, jarabes, etc.
Las composiciones de la invención pueden ser
utilizadas conjuntamente con composiciones farmacéuticas conocidas
en la técnica. Por ejemplo, puede resultar ventajoso combinar uno de
los elementos de la composición de la invención con otros agentes
activos que puedan ser utilizados para tratar o prevenir otras
enfermedades aparte de las inducidas por la virulencia AEEC.
La cantidad de anticuerpos específicos que se
administra a un ser humano o a un animal o que se encuentra
presente en la composición de la invención es una cantidad
terapéuticamente efectiva. Una cantidad terapéuticamente efectiva
de anticuerpos es aquella cantidad necesaria para obtener resultados
beneficiosos sin provocar efectos secundarios demasiado negativos
en el huésped en el que se administra el anticuerpo o la
composición. Además, una cantidad efectiva de un anticuerpo para
tratar una enfermedad particular es una cantidad que resulta
suficiente para mejorar, o de alguna manera reducir, los síntomas
asociados a la enfermedad. Dicha cantidad puede ser administrada
como una única dosis o puede ser administrada según un régimen, de
manera que resulte efectiva. La cantidad puede curar la enfermedad,
pero, típicamente, se administra con el fin de mejorar los síntomas
de la enfermedad.
La cantidad exacta de anticuerpos o de cada uno
de los componentes en la composición y la cantidad de la composición
a ser administrada variará según determinados factores, tales como
el tipo de condición a tratar, los otros ingredientes en la
composición, el modo de administración, la edad y el peso del
mamífero, etc. Sin que resulte limitado por alguna dosis
particular, se cree que por ejemplo para la administración oral, una
dosis diaria de entre aproximadamente 100 mg/kg y
aproximadamente 600 mg/kg de yema de huevo liofilizada que
contenga anticuerpos inmunológicamente específicos para una
proteína asociada a la virulencia AEEC (habitualmente presente como
parte de una composición, tal como se ha indicado anteriormente)
puede resultar adecuada para la prevención de una infección
mamífera por AEEC en un adulto típico. Esta dosis puede repetirse
tantas veces como resulte apropiado. Típicamente, la administración
puede ser de entre 1 vez por semana y 21 veces por semana. Si se
desarrollaran efectos secundarios, podría reducirse la cantidad y/o
la frecuencia de dosificación.
Ejemplo
El siguiente ejemplo es un ejemplo ilustrativo
del amplio abanico de aplicabilidad de la presente invención y no
pretende en modo alguno ser limitativo del alcance de la misma.
Sobre el mismo pueden llevarse a cabo modificaciones y variaciones
sin alejarse del alcance de la invención. A pesar de que en la
práctica, para los ensayos de la presente invención puede
utilizarse cualquier procedimiento y cualquier material similar o
equivalente a aquellos descritos en la presente memoria, a
continuación se describen los procedimientos y materiales
preferentes.
Los inventores han producido exitosamente
anticuerpos de yema de huevo contra proteínas de fusión purificadas
de los factores de virulencia de adhesión y borrado conocidos Eae,
EspA, EspB, EspD, y Tir y de un nuevo factor de virulencia de
adhesión y borrado putativo Paa. Los inventores han demostrado que
solamente los anticuerpos anti-Eae,
anti-Tir, y anti-Paa resultaron
capaces de bloquear de manera considerable el desarrollo de lesiones
de adhesión y borrado (A/E) provocadas por la cepa porcina homóloga
de E. coli ex vivo en el modelo de cultivo de
órganos ileales de cerdo. Estos anticuerpos también resultaron
capaces de bloquear el desarrollo de lesiones A/E provocadas por la
virulencia de E. coli de adhesión y borrado originada a
partir de diversas especies animales, tales como el bovino y el
perro, y a partir de seres humanos, incluyendo tanto la E.
coli O157:H7 y la E. coli no O157:H7. Por último, los
inventores han demostrado que los anticuerpos
anti-Eae resultaron capaces de reducir de manera
considerable el desarrollo de lesiones A/E provocadas por la cepa
porcina homóloga de E. coli y la cepa humana homóloga de
E. coli de adhesión y borrado de serotipo O157:H7 in
vivo en un modelo de infección de cerdos recién nacidos. Estos
resultados demuestran claramente que los anticuerpos de yema de
huevo de gallina específicos para algunos de los factores de
virulencia involucrados en la adhesión y el borrado resultan
capaces de bloquear una infección bacteriana y el desarrollo de
lesiones intestinales en el cerdo, y que de esta manera, son
potenciales candidatos para ser utilizados en el tratamiento de
infecciones provocadas por la E. coli de adhesión y
borrado. También son potenciales candidatos como aditivo alimentario
para la administración oral al ganado con el fin de eliminar la
E. coli de adhesión y borrado de serotipo O157:H7 y otras
E. coli de adhesión y borrado del intestino y prevenir la
contaminación de la carne y la consiguiente infección de seres
humanos.
Cepas bacterianas, plásmidos y medios. Se
utilizó la E. coli M155(pREP4™) (Qiagen) como cepa
huésped para las proteínas recombinantes. Se aisló la E.
coli de adhesión y borrado porcina (AEEC)
P86-1390 (serogrupo O45, resistente a
estreptomicina, Sm^{R}) en la Faculté de Médecine
Vétérinaire, Saint-Hyacinthe, Québec, Canadá, a
partir de un cerdo de 4 semanas de edad con diarrea postdestete. La
cepa P86-1390 de serogrupo O45 induce lesiones de
adhesión y borrado (A/E) típicas (Zhu et al., 1994 Infect
Immun 62: 4153-4159; Zhu et al., 1995
Can J Vet Res 59: 118-123) y se utilizó su
DNA genómico como modelo para amplificar los genes de factor de
virulencia portados en el locus de destrucción de los entericitos
(LEE).
Para el desafío del modelo de explante (véase
Tabla 2 para las características de las cepas), las bacterias
fueron cultivadas durante la noche en caldo de soja Trypticase (TSB,
Difco) con agitación (150 rpm) a 37ºC, a continuación fueron
transferidas a un medio de cultivo modificado "Dubbelcco's
Modified Eagle's Médium" (DMEM, GibcoBRL) y crecidas hasta la
fase exponencial temprana previamente a su utilización (OD_{600}
0,7, correspondiente a aproximadamente 2,0 x 10^{8} CFU,
determinado mediante la utilización de curvas de crecimiento
específicas). Se añadió una concentración final de
D-manosa al 1% a cada cultivo en caldo para
minimizar la adhesión producida por la fimbria de tipo 1
previamente a la infección.
Construcción de los genes de fusión. El
terminal 3' (carboxi) del gen eae o el gen eae completo
(maduro), los genes espA, espB, y espD, el gen
tir, y el terminal 3' (carboxi) del gen paa o el gen
paa completo (maduro) fueron amplificados mediante PCR
utilizando los pares de cebadores mostrados en la Tabla 3. Los
amplicones fueron insertados en el vector pGEM-T™
(Promega) y a continuación fueron introducidos en el vector de
expresión pQE30 (Qiagen) utilizando un sitio de clonación apropiado
(entre los sitios BamHI y SalI para el terminal
carboxi del gen eae, y los terminales carboxi de los genes
espA, espB, espD y paa, entre BamHI y
SphI para el gen maduro eae, y entre HindIII y
SacI para el gen tir). Las fusiones de genes fueron
verificadas mediante secuenciación.
Producción y purificación de las proteínas de
fusión. Se utilizó un precultivo en caldo LB incubado durante
la noche para inocular un cultivo en caldo LB de 1 litro. Las
células fueron cultivadas a 37ºC con agitación hasta OD_{600 \
nm} de entre 0,7 y 0,8. A continuación se añadió
isopropiltiogalactósido (IPT-G) a una concentración
final de 1 mM. Tras una incubación de aproximadamente 4 horas, las
células fueron recogidas o extraídas por centrifugación a 4.000 x g
durante 10 minutos y resuspendidas en dos volúmenes de tampón A
(Qiagen). Las muestras pueden ser centrifugadas y el pellet
almacenado congelado a -70ºC hasta su utilización. Las muestras
fueron descongeladas a temperatura ambiente y resuspendidas en un
tampón A. Se añadieron un mg/ml de lisozima y una concentración
final de 100 \muM de PMSF. La totalidad de la suspensión fue
incubada en hielo durante 30 minutos y sonicada. Por cada ml de
muestra; se añadieron 10 \mug de Rnasa A y 5 \mug de Dnasa 1 y
tras una incubación durante 15 minutos en hielo, las muestras
fueron aclaradas por centrifugación a 15.000 x g durante 20 minutos.
El supernadante fue mezclado con una suspensión de resina
Ni-NTA al 50% (Qiagen) en tampón A (8 ml de
suspensión por litro de células). Tras una mezcla cuidadosa en un
tubo de agitación durante una noche, la resina fue añadida a una
columna Qiagen, lavada con un tampón A hasta OD_{280 \ nm}
inferior a 0,01, lavada con tampón B (Qiagen) hasta OD_{280 \ nm}
inferior a 0,02, lavada con imidazol 0,1 M en tampón B (20 ml por
litro de células), y eluída con imidazol 0,25 M en tampón B (10 ml
por litro de células). Se analizaron fracciones (de entre 1 ml y
1,5 ml), recogidas al comienzo de la elución con imidazol 0,25 M,
mediante SDS-PAGE con acrilamida al 15%. Aquellas
fracciones que contenían proteínas de interés fueron agrupadas,
cuantificadas mediante el procedimiento Lowry, y almacenadas a
-70ºC.
Inmunotransferencia Western. Se mezclaron
proteínas purificadas a través de columnas de afinidad marcadas con
histidina con un volumen igual de tampón Laemmli 2x, se hirvió
durante 5 minutos, fue aplicado a SDS-PAGE al 15%,
y electrotransferido a una membrana de nitrocelulosa de 0,2 \mum
(Bio Rad). Los "blots" fueron bloqueados y lavados con
albúmina de suero bovino (BSA) al 1% - Tween™ 20 al 0,1% en salina
tamponada con Tris (TBS), e incubados durante la noche con
anticuerpos primarios, entre los que se incluían el anticuerpo
RGS-His (Qiagen) y los anticuerpos
anti-Eae, anti-EspA,
anti-EspB, anti-EspD, y
anti-Tir, amablemente proporcionados por el Dr. Gad
Frankel y el Dr. Frank Ebel. Para el análisis de la producción de
anticuerpos de gallina (IgY), como anticuerpos primarios se
utilizaron anticuerpos de clase IgY purificados, específicamente
dirigidos contra cada uno de los factores de virulencia LEE. A
continuación se desarrollaron filtros con anticuerpos secundarios
IgG de cabra anti-conejo (1/1.000), cabra
anti-ratón (1/1.000) o conejo
anti-gallina (1/5.000) conjugados con HRP y con
H_{2}O_{2}-\alpha-cloronaftol
comos sustrato.
Inmunización de animales y purificación de
anticuerpos. Fueron inmunizados entre dos y ocho gallinas
ponedoras en su músculo pectoral en múltiples sitios con 50 \mug
de proteínas purificadas y emulsionadas en el adyuvante incompleto
de Freund en los día 1, 14, 28, 42 y 56. Se utilizaron proteínas
totales M15 (pREP4™) como control negativo para la producción de
anticuerpos de clase IgY anti-factor de virulencia.
Los huevos fueron recogidos a partir del día 28 y se mantuvieron a
una temperatura de 4ºC hasta la purificación de los anticuerpos.
Para la purificación de los anticuerpos, se separaron las yemas de
huevo de la membrana de la yema de huevo y de la clara del huevo,
se agruparon y se añadió un volumen de PBS 1x. Se homogeneizó toda
la mezcla, se mezcló con un volumen de cloroformo, y se centrifugó
a 15.000 x g durante 15 minutos. A continuación fueron observadas
una solución de color naranja que contenía el vitellus, una
emulsión amarilla semisólida de los lípidos en el cloroformo, y una
fase acuosa que contenía los anticuerpos de clase IgY de gallina
desde el fondo hasta la parte superior del tubo. Los anticuerpos de
clase IgY purificados fueron analizados mediante
SOS-PAGE teñido con azul de Coomassie y mediante
inmunotransferencia Western, tal como se ha explicado
anteriormente.
ELISA. Los títulos de anticuerpos de
clase IgY anti-factor de virulencia en yemas de
huevo fueron determinados utilizando placas de microtitulación
(Immulon 2HB, Dynec) precubiertas con 100 ng de proteínas
purificadas en tampón carbonato (pH 9,6). Se añadió IgY purificado
diluido de forma seriada en PBS (pH 7,4) que contenía BSA al 1% y
Tween 20 al 0,05% a los pocillos y se incubaron durante 2 horas a
37ºC. Tras tres lavados con PBS que contenía Tween™ 20 al 0,05%, se
detectaron anticuerpos unidos añadiendo IgG conejo
anti-gallina (1/25.000) conjugado con peroxidasa
(Jackson Immuno Research Laboratories, Inc). Tras 10 minutos de
reacción enzima-sustrato se leyó la absorbancia a
405 nm y los títulos de anticuerpos fueron expresados como un valor
log_{10} de la dilución recíproca. Para monitorizar las
reacciones no específicas, se restaron las absorbancias medidas con
IgY de gallinas inmunizadas con el extracto de proteína total a
partir de una cepa M14 (pREP4™) de las absorbancias obtenidas con
las muestras de ensayo.
Extracción de los anticuerpos de las yemas de
huevo. El anticuerpo de clase IgY específico de factor de
virulencia fue extraído de las yemas de huevo mediante un
procedimiento descrito por [Akita and Nakai, (1993) Immunol.
Methods 18: 162(e): 155-164; 1993 Immunol.
Methods 2: 160(2): 207-214], con algunas
modificaciones. En resumen, se separaron las yemas de huevo de la
albúmina, a continuación se colocaron en una toalla. Se enrollaron
las yemas de huevo en la toalla cuidadosamente para eliminar los
restos de albúmina, y a continuación se realizaron perforaciones en
la toalla para aspirar la yema de huevo sin el vitellus. Se
añadió un volumen igual de salina tamponada con fosfato (PBS) a las
yemas de huevo, y a continuación fueron homogenizadas mediante una
agitación Vortex. Se añadió un volumen igual de cloroformo a la
solución, y a continuación se mezcló hasta obtener un homogenado
sólido. Se centrifugó la preparación durante 5 minutos a 14.000 rpm,
y se retiró el supernadante que contenía el anticuerpo de clase
IgY. El supernadante fue liofilizado previamente a su
utilización.
Recogida y cultivo de tejidos de
explantes. La técnica de cultivo de explantes fue derivada a
partir de Zhu et al., 1994 (supra). En resumen, se
obtuvieron tejidos de mucosa del íleon de crías de cerdo recién
nacidas privadas de calostro de una manada convencional. A las
crías de cerdo se les aplicó un tranquilizante a base de
hidrocloruro de ketamina antes de que fueran eutanasiadas con una
sobredosis de pentobarbital. El lapso de tiempo entre la muerte y
el comienzo de los cultivos de explantes fue de aproximadamente 1
hora y cada cepa fue sometida a ensayo en por lo menos 2 crías de
cerdo. En la recogida, se retiró la serosa con cuidado y se extrajo
cuidadosamente la mucosa con un bastoncillo de algodón estéril. Los
tejidos fueron sumergidos en un medio RPMI 1640™ completo estéril
(GibcoBRL), transportados al laboratorio en hielo, y colocados en
una plataforma de balanceo durante 30 minutos. Previamente al
cultivo, los tejidos fueron cortados en pedazos de 5 mm x 5 mm y
fueron colocados en unos apósitos de espuma para biopsia (Curtin
Matheson Scientific, Inc.) con la parte mucosa mirando hacia arriba
en placas de cultivo de tejidos "multidish" de cuatro pocillos
Nunclon Delta™ Surface (Nalge Nunc Internacional). Se colocó un
tejido (ahora denominado explante) en cada esponja, con 1 esponja
por pocillo. Se añadió un medio RPMI 1640 completo a los pocillos
sin sumergir los explantes. Las placas fueron incubadas a 37ºC en
una plataforma de balanceo (posición 2,5) en una atmósfera de
O_{2} al 95% y CO_{2} al 5%.
Inoculación y examen de los explantes.
Los explantes fueron infectados tres veces en intervalos de una hora
con 50 \mul de cultivo en caldo (aproximadamente 1 x 10^{7}
CFU) aplicados a la superficie y fueron incubados durante 8 horas.
Para prevenir el sobrecrecimiento bacteriano y un pH acídico, se
realizaron cambios cada hora con un medio RPMI 1640™ completo
fresco y estéril durante el cultivo, dando comienzo 2 horas después
de la infección inicial de los explantes.
Tratamiento con anticuerpos en el modelo de
explante. Los cultivos en caldo fueron incubados a 37ºC con un
volumen igual de una preparación liofilizada de anticuerpos,
previamente reconstituidos con PBS, durante 30 minutos previamente
a la infección de los explantes.
Microscopía de luz. Tras el cultivo, los
explantes fueron fijados en formalina tamponada al 10% para un
examen microscópico. Se utilizó el mismo protocolo para las
secciones de las crías de cerdo recién nacidas infectadas de manera
experimental in vivo. Adicionalmente, las secciones fijadas
en formalina fueron colocadas en bolsas de Nylon™ para biopsia de
tejidos (Shandon Inc.), procesadas, embebidas en parafina,
seccionadas a 5 \mum, y teñidas con hematoxilina, floxina, y
safranina (HPS) según técnicas estándares. Las secciones teñidas con
HPS fueron examinadas mediante microscopía de luz para las
bacterias de adhesión intima epitelial. Cada vellosidad intacta fue
sometida a examen para la presencia de bacterias de adhesión íntima,
y se llevó a cabo una evaluación de la superficie epitelial media
cubierta por bacterias de adhesión íntima, según una escala de entre
el 0% y el 100%.
Inmunofluorescencia. Las secciones de las
placas de cristal fueron desparafinadas en xileno durante 5 minutos
previamente a la rehidratación en soluciones progresivas de etanol.
Las secciones fueron aclaradas en PBS, a continuación fueron
bloqueados los sitios de unión antigénica en una solución de PBS -
BSA al 1% - Tween20 al 0,1% a 37ºC durante 20 minutos.
Seguidamente, las secciones fueron aclaradas en PBS e incubadas a
37ºC durante 20 minutos con una dilución 1:50 de anticuerpos
primarios (Escherichia coli Serotyping Laboratory, Canadá)
según el serotipo de la cepa específica. Después del aclarado en
PBS, las secciones fueron incubadas a 37ºC con una dilución 1:200
de un anticuerpo secundario cabra anti-conejo
conjugado con FITC (Jackson ImmunoResearch Laboratories inc., EEUU)
durante 20 minutos. Finalmente, las secciones fueron contrateñidas
con Azul de Evans™ al 0,2% (Fisher Scientific Company, EEUU). Las
secciones montadas fueron examinadas con un microscopio Leitz
Diaplan™ equipado con epifluorescencia.
\newpage
Microscopía electrónica de transmisión
(TEM). Se fijaron pequeñas secciones de íleon, intestino ciego,
o colon (3 mmm x 3 mmm) durante 2 horas a temperatura ambiente en
glutaraldehído al 2,5% (v/v), a continuación fueron aclaradas en
tampón cacodilato (cacodilato 0,1 M, pH 7,3) durante 1,5 horas con
cambios regulares. Seguidamente, los tejidos fueron postfijados
durante 1 hora a temperatura ambiente en tetróxido de osmio
(OsO_{4}) al 2%, a continuación fueron aclarados en agua durante
1,5 horas con cambios regulares, deshidratados en una serie
creciente de etanol, y finalmente embebidos en una resina Spurr
(Marivac, Nova Scotia, Canadá). Estas secciones fueron montadas
sobre rejillas de cobre, teñidas con acetato de uranilo y citrato de
plomo, y examinadas para lesiones A/E con microscopio electrónico
de transmisión Philips 420™ a 80 kV (Philips Electronics, Países
Bajos).
Infección en cerdos y desafíos de anticuerpos
in vivo. Se utilizaron 22 crías de cerdo recién nacidas
de una manada convencional para someter a ensayo los efectos de los
anticuerpos anti-eaeM sobre la adhesión bacteriana
in vivo. Fueron privadas de calostro 12 crías de cerdo
previamente a la infección con la cepa porcina 1390, mientras que
las otras 10 crías de cerdo fueron alimentadas con calostro
previamente a la infección con la cepa humana EHEC
85-170. Todas las crías de cerdo permanecieron en
jaulas, y fueron alimentadas con leche evaporada durante el
experimento. Las crías de cerdo del grupo 1 (infección con cepa
1390) fueron infectadas con 1 x 10^{10} CFU de la cepa EPEC 1390
en 2 ml de caldo TSB durante 2 días, y se les administraron dos
veces al día yemas de huevo de gallinas inmunizadas con un sonicado
de la cepa PREp15 como control positivo de la adhesión (n=6), o
yemas de huevo de gallinas inmunizadas con la proteína de fusión
EaeM (n=6). Las crías de cerdo del grupo 2 (infección con cepa
85-170) fueron infectadas con 1 x 10^{10} CFU de
la cepa EHEC 85-170 en 2 ml de caldo TSB durante 2
días, y se les administraron tres veces al día, yemas de huevo
liofilizadas reconstituidas en leche de gallinas inmunizadas con un
sonicado de la cepa PREp4 como control positivo de la adhesión
(n=5), o yemas de huevo liofilizadas reconstituidas en leche de
gallinas inmunizadas con la proteína de fusión EaeM (n=5). Las
crías de cerdo fueron monitorizadas diariamente por cualquier signo
clínico de diarrea, y fueron necropsiadas a las 48 horas de la
infección inicial. A las crías de cerdo se les aplicó un
tranquilizante a base de hidrocloruro de ketamina, y a continuación
fueron eutanasiadas con una sobredosis de una solución de
pentobarbital.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha demostrado claramente en la técnica que la
intimina (Eae) y las proteína secretadas Tir (receptor translocado
de la intimina), EspA, EspD y EspB son factores de virulencia que
juegan un papel importante en la patogénesis de diversas
infecciones AEEC y que podrían provocar una respuesta de
anticuerpos. Además, los inventores han descubierto una nueva
proteína denominada Paa (que significa "asociado a adhesión y
borrado porcino") que también se encuentra involucrada en la
adhesión de AEEC a las células huésped (véase sección d). De esta
manera, estos factores de virulencia diferentes fueron considerados
como buenos candidatos para la inmunidad protectora y/o como
marcadores en un ensayo de diagnóstico. También, se consideró que
resultaría importante producir una proteína de fusión utilizando
solamente el extremo C-terminal de la intimina
(carboxi de la Eae) que se encuentra implicada en el reconocimiento
de receptores. De esta manera, se produjeron siete (7) proteínas de
fusión correspondientes a las proteínas indicadas en el vector de
expresión pQE30 que une en estructura un marcador His6 en el
extremo N-terminal de las proteínas. Se
seleccionaron pares de cebadores específicos para cada uno de los
factores de virulencia para amplificar mediante PCR la parte
completa (Eae, EspA, EspB, EspD, Paa, Tir) o una parte (carboxi de
la Eae) de las proteínas del DNA genómico de la cepa porcina 1390
de la E. coli enteropatógena. Las proteínas de fusión fueron
detectadas mediante el análisis de transferencia Western puestas de
manifiesto con anticuerpos anti-histidina y con
anticuerpos específicamente dirigidos contra cada uno de los
factores de virulencia. Sin embargo, la proteína
His-Paa fue detectada solamente en pequeñas
cantidades. Ya que se considera que la Paa puede resultar inestable
mediante el programa EXPASY, se llevó a cabo una fusión con el
extremo estable C-terminal de la Paa (carboxi de
la
Paa).
Paa).
Todas las proteínas de fusión fueron producidas
a continuación a gran escala y purificadas en una columna de
afinidad de níquel en cantidades suficientes para la inmunización de
las gallinas y para la utilización como antígenos en el
procedimiento ELISA. Se obtuvieron las proteínas purificadas
His-Eae-carboxi,
His-Eae, His-EspA,
His-EspB, His-EspD,
His-Paa e His-Tir.
La técnica de inmunización de las gallinas y la
técnica de purificación de los anticuerpos fueron llevadas a cabo a
partir de técnicas modificadas, tal como se describe en el apartado
Materiales y Procedimientos. El análisis mediante
SDS-PAGE demostró una producción de IgY a los 28
días de la inmunización inicial con las proteínas
His-Eae-carboxi,
His-Eae, His-EspA,
His-EspB, his-EspD,
His-Paa e His-Tir.
El análisis de transferencia Western mostró que
el IgY purificado reconocía proteínas de fusión homólogas. A
continuación se midió el título del IgY específico para cada
proteína mediante el procedimiento ELISA utilizando proteínas
purificadas homólogas como antígeno. Las condiciones del ensayo
ELISA fueron determinadas para cada antígeno y los resultados
mostraron un título elevado (>1/25.000) para cada IgY específico
tras 42 días. También se examinó la capacidad de cada anticuerpo
para detectar el correspondiente antígeno nativo en la cepa
homóloga 1390 y en las cepas de AEEC de diferentes especies
animales. Sin embargo, se observó que las condiciones de los
ensayos y/o la presentación de los antígenos no favorecían a la
detección, mediante el procedimiento ELISA, de algunos factores de
virulencia, tales como Eae o Paa, en bacterias de tipo
silvestre.
La primera etapa de este trabajo fue determinar
las condiciones de cultivo de los explantes que permitirían la
adhesión de AEEC a células epiteliales cecales e ileales de crías de
cerdo destetadas. Se sometieron a ensayo diferentes condiciones y
se configuró una técnica rápida para el análisis microscópico de
secciones de tejido mediante microscopía de luz y para la
confirmación mediante microscopía electrónica (véase el apartado
Materiales y Procedimientos). Se observó una mayor adhesión y más
consistente de la cepa 1390 en explantes ileales de crías de cerdo
recién nacidas en comparación a explantes de cerdos destetados. Por
lo tanto, se utilizó el modelo de explantes de cerdos recién
nacidos en los experimentos posteriores.
Los inventores han demostrado que las cepas de
AEEC provenientes de conejo, cerdo, perro, bovino, y ser humano
(incluyendo la EHEC no O157 y la EPEC), y que producen la proteína
Eae de subtipos \alpha, \beta, \gamma, o \varepsilon,
inducían lesiones A/E igualmente en los explantes ileales de cerdos
recién nacidos (Figura 1). Más concretamente, la Figura 1 muestra
el porcentaje medio de las vellosidades intactas que muestran
adhesión bacteriana en secciones de explantes ileales. Cepas de
diversas especies animales y de seres humanos muestran un
porcentaje de adhesión similar, en comparación a la cepa porcina
homóloga AEEC 1390, excepto la cepas del serotipo O157:H7 (EC505,
43888, STJ348, 85-170, 43895, STJ854, y STJ919 en el
gráfico). Todas las cepas excepto las del serotipo O157:H7 resultan
considerablemente diferentes a la cepa mutante
ICC-170 de la eae (control negativo). Estos datos
validan el modelo de los presentes inventores para el estudio de la
expresión del fenotipo de adhesión y borrado tanto para cepas
homólogas como para cepas heterólogas, excepto para aquellas que
pertenecen al serotipo O157:H7. Los resultados son presentados como
la media \pm la desviación estándar de la media.
Por otro lado, las cepas de AEEC de serotipo
O157:H7 que producen la proteína Eae de subtipo \gamma se adherían
en una medida mucho menor al epitelio ileal. Sin embargo, la
sustitución de la proteína Eae de subtipo \gamma por la proteína
Eae de subtipo \alpha en una cepa de serotipo O157:H7 resultó en
la inducción de lesiones A/E en una medida similar a la observada
para la cepa porcina homóloga de AEEC (Figura 2). Más concretamente,
la Figura 2 muestra los efectos de un cambio en el subtipo de
intimina, de gama a alfa, sobre el porcentaje medio de las
vellosidades intactas que muestran adhesión bacteriana de la cepa
humana 85-170 de serotipo O157:H7, sobre secciones
de explantes ileales. La cepa doble mutante complementada
PCVD-438 (intimina alfa de cepa humana EPEC
E2348/69) muestra una adhesión similar a la cepa porcina homóloga
1390. La PICC-55 es una cepa mutante complementada
con subtipo gama-intimina (similar a la cepa
silvestre 85-170). Estos datos confirman el
problema del subtipo gama-intimina en la adhesión al
modelo de explantes ileales. Los resultados son presentados como la
media \pm la desviación estándar de la media. Estos resultados
también sugieren que la proteína Eae de subtipo \gamma de las
cepas de serotipo O157:H7 reconoce receptores en células epiteliales
ileales porcinas de peor manera que la proteína Eae de otros
subtipos conocidos. No obstante, los resultados confirman que los
explantes ileales de cerdo son un modelo apropiado para examinar el
efecto de anticuerpos específicos sobre la formación de lesiones
A/E por una virulencia AEEC de diversos
orígenes.
orígenes.
La capacidad de los anticuerpos específicos para
prevenir el desarrollo de lesiones A/E ex vivo en el modelo
de cultivo de explantes de cerdo, e in vivo en el modelo de
infección de cerdos recién nacidos, fue sometida a ensayo con la
cepa porcina homóloga 1390 y con diferentes cepas heterólogas de
AEEC. Los resultados mostraron que los anticuerpos específicos para
las proteínas Eae, Tir y Paa maduras y los terminales carboxi de las
mismas, en el caso de la cepa porcina homóloga 1390, resultan
suficientes para bloquear de manera considerable el desarrollo de
lesiones A/E en explantes ileales, para la cepa homóloga 1390
(Figura 3). Más concretamente, la Figura 3 muestra el efecto de los
anticuerpos sobre el porcentaje medio de las vellosidades intactas
que muestran adhesión cuando son infectadas por la cepa porcina
1390. 1390 anti-T(-) es un control positivo para la
adhesión. Los resultados muestran una reducción considerable en la
adhesión bacteriana (^{\text{*}} en la parte superior de la
columna) con los anticuerpos anti-EaeC,
anti-EaeM, anti-Tir, y
anti-PaaM. Los resultados son presentados como la
media \pm la desviación estándar de la media. Se llevó a cabo un
ensayo Kruskal-Wallis con un software
comercialmente disponible, y se realizaron unas comparaciones
"post hoc" 2 por 2 para determinar las diferencia entre los
grupos; un valor P < 0,0001 fue considerado como
importante.
importante.
Los resultados muestran que los anticuerpos
específicos para las proteínas Eae, Tir y Paa maduras y el terminal
carboxi de las mismas, en el caso de la cepa porcina homóloga 1390,
son capaces de bloquear de manera considerable (^{\text{*}} en la
parte superior de la columna) el desarrollo de lesiones A/E en
explantes ileales para todas las cepas de AEEC de ternero (Figura
4) y de ser humano sometidas a ensayo, incluyéndose entre las cepas
de ser humano tanto las cepas de EHEC de serotipo O157:H7 (Figuras
5 y 6) como las cepas de EPEC (Figura 7). Los anticuerpos
anti-EspA, anti-EspB, y
anti-EspD no afectaron al desarrollo de lesiones A/E
provocadas por cualquiera de las cepas de AEEC sometidas a ensayo,
a excepción de una cepa humana de EPEC, para la que los anticuerpos
anti-EspA bloquearon de manera considerable el
desarrollo de lesiones A/E (Figura 7). Los anticuerpos
anti-Paa no bloquearon el desarrollo de lesiones A/E
debido a esta cepa humana de EPEC que produjo Eae pero no Paa. Por
lo tanto, los anticuerpos anti-Eae maduro,
anti-Tir, y anti-Paa, y posiblemente
los anticuerpos anti-EspA, fueron considerados como
potenciales candidatos para el bloqueo del desarrollo de lesiones
A/E in vivo.
Más concretamente, la Figura 4 muestra el efecto
de los anticuerpos sobre el porcentaje medio de las vellosidades
que muestran adhesión cuando son infectadas por la cepa bovina
BOO-H854. BOO-H854 representa la
cepa sola, mientras que BOO-H854
anti-T(-) es un control positivo para la adhesión.
Los resultados muestran un reducción considerable en la adhesión
bacteriana (^{\text{*}} en la parte superior de la columna) con
los anticuerpos anti-EaeC,
anti-EaeM, y anti-Tir, y, en menor
medida, con el anticuerpo anti-PaaM. Los resultados
son presentados como la media \pm
la desviación estándar de la media. Se llevó a cabo un ensayo Kruskal-Wallis con un software comercialmente disponible, y se realizaron unas comparaciones "post hoc" 2 por 2 para determinar las diferencia entre los grupos; un valor P < 0,0001 fue considerado como importante.
la desviación estándar de la media. Se llevó a cabo un ensayo Kruskal-Wallis con un software comercialmente disponible, y se realizaron unas comparaciones "post hoc" 2 por 2 para determinar las diferencia entre los grupos; un valor P < 0,0001 fue considerado como importante.
La Figura 5 muestra el efecto de los anticuerpos
sobre el porcentaje medio de las vellosidades intactas que muestran
adhesión cuando son infectadas por la cepa humana EHEC STJ348 de
serotipo O157:H7. STJ348 representa la cepa sola, mientras que
STJ348 anti-T(-) es un control positivo para la
adhesión, e ICC-170 es una cepa mutante de eae
utilizada como control negativo. Los resultados muestran un
reducción considerable en la adhesión bacteriana
(^{\text{*}} en la parte superior de la columna) con los anticuerpos anti-Tir, anti-EaeM, y, en menor medida, con los anticuerpos anti-PaaC y anti-EaeC. Los resultados son presentados como la media \pm la desviación estándar de la media. Se llevó a cabo un ensayo Kruskal-Wallis con un software comercialmente disponible, y se realizaron unas comparaciones "post hoc" 2 por 2 para determinar las diferencia entre los grupos; un valor P < 0,0001 fue considerado como
importante.
(^{\text{*}} en la parte superior de la columna) con los anticuerpos anti-Tir, anti-EaeM, y, en menor medida, con los anticuerpos anti-PaaC y anti-EaeC. Los resultados son presentados como la media \pm la desviación estándar de la media. Se llevó a cabo un ensayo Kruskal-Wallis con un software comercialmente disponible, y se realizaron unas comparaciones "post hoc" 2 por 2 para determinar las diferencia entre los grupos; un valor P < 0,0001 fue considerado como
importante.
La Figura 6 muestra el efecto de los anticuerpos
sobre el porcentaje medio de las vellosidades intactas que muestran
adhesión cuando son infectadas por la cepa humana EHEC
85-170 de serotipo O157:H7. 85-170
representa la cepa sola, mientras que 85-170
anti-T(-) es un control positivo para la adhesión, e
ICC-170 es una cepa mutante de eae utilizada como
control negativo. Los resultados muestran un reducción considerable
en la adhesión bacteriana (^{\text{*}} en la parte superior de la
columna) con los anticuerpos anti-EaeM,
anti-Tir, y, en menor medida, con los anticuerpos
anti-EaeC y anti-PaaM. Los
resultados son presentados como la media \pm la desviación
estándar de la media. Se llevó a cabo un ensayo
Kruskal-Wallis con un software comercialmente
disponible, y se realizaron unas comparaciones "post hoc" 2
por 2 para determinar las diferencia entre los grupos; un valor P
< 0,0001 fue considerado como
importante.
importante.
Además, la Figura 7 muestra el efecto de los
anticuerpos sobre el porcentaje medio de las vellosidades intactas
que muestran adhesión cuando son infectadas por la cepa humana EPEC
E2348/69. E2348/69 representa la cepa sola, mientras que E2348/69
anti-T(-) es un control positivo para la adhesión.
Los resultados muestran un reducción considerable en la adhesión
bacteriana (^{\text{*}} en la parte superior de la columna) con
los anticuerpos anti-EspA,
anti-EaeC, anti-Tir, y
anti-EaeM. Los resultados son presentados como la
media \pm la desviación estándar de la media. Se llevó a cabo un
ensayo Kruskal-Wallis con un software comercialmente
disponible, y se realizaron unas comparaciones "post hoc" 2
por 2 para determinar las diferencia entre los grupos; un valor P
< 0,0001 fue considerado como
importante.
importante.
Ya que los experimentos de desafío in
vivo en cerdos presentan un coste elevado y requieren mucho
tiempo, los inventores han decidido enfocare en la evaluación del
efecto de los anticuerpos anti-Eae sobre el
desarrollo de lesiones A/E in vivo. Utilizando el modelo de
crías de cerdo recién nacidas privadas de calostro, se pudo
demostrar que la administración oral de los anticuerpos de yema de
huevo purificados anti-Eae inhibían de manera
considerable el desarrollo de lesiones A/E en el intestino ciego y
en el colon de las crías de cerdo desafiadas con la cepa porcina
homóloga de AEEC (Figuras 8A y 8B). Más concretamente, la Figura 8A
muestra los efectos del anticuerpo en el intestino ciego, mientras
que la Figura 8B muestra los efectos del anticuerpo en el colon.
Los resultados de anti-T(-) corresponden a crías de
cerdo (n=6) a las que se les administraron yemas de huevo de
gallinas no inmunizadas, y representan un control positivo para la
adhesión, mientras que anti-EaeM representa a crías
de cerdo (n=6) a las que se les administraron yemas de huevo que
contenían anticuerpos anti-EaeM dirigidos contra la
intimina madura. Los resultados muestran una reducción considerable
en la adhesión bacteriana con anti-EaeM, en
comparación a anti-T(-).Los resultados son
presentados como la media \pm la desviación estándar de la media.
El análisis estadístico se encuentra todavía en curso.
Ya que las cepas de AEEC de serotipo O157:H7
representan una causa importante de problemas en los seres humanos,
se decidió enfocare también en la evaluación del efecto de los
anticuerpos anti-Eae sobre el desarrollo de
lesiones A/E in vivo en un modelo de desafío porcino del
serotipo O157:H7. Anteriormente se ha mostrado que las cepas de
serotipo O157:H7 inducen lesiones A/E en mayor medida en crías de
cerdo alimentadas con calostro que en crías de cerdo privadas de
calostro. Utilizando un modelo de cerdo de 3 días de edad alimentado
con calostro, los inventores han demostrado que la administración
oral de los anticuerpos de yema de huevo purificados
anti-eae también inhibían el desarrollo de lesiones
A/E en el intestino ciego y en el colon de las crías de cerdo
desafiadas con la cepa de AEEC de serotipo O157:H7 (Figuras 9A y
9B). Más concretamente, la Figura 9A muestra los efectos del
anticuerpo en el intestino ciego, mientras que la Figura 9B muestra
los efectos del anticuerpo en el colon. Los resultados de
anti-T(-) corresponden a crías de cerdo (n=5) a las
que se les administraron yemas de huevo liofilizadas de gallinas no
inmunizadas, y representan un control positivo para la adhesión,
mientras que anti-EaeM representa a crías de cerdo
(n=5) a las que se les administraron yemas de huevo liofilizadas
que contenían anticuerpos anti-EaeM dirigidos contra
la intimina madura. Los resultados muestran una reducción en la
adhesión bacteriana con anti-EaeM, en comparación a
anti-T(-).Los resultados son presentados como la
media \pm la desviación estándar de la media. El análisis
estadístico se encuentra todavía en curso.
Por lo tanto, los inventores han mostrado, por
primera vez, que los anticuerpos administrados por vía oral
específicos para las proteínas asociadas a la virulencia AEEC, tales
como la Eae adesina, son capaces de inhibir el desarrollo de
lesiones A/E en el animal vivo. Además, los inventores han mostrado
que los anticuerpos específicos para la Eae de subtipo \beta y
producidos por una AEEC de origen porcino son capaces de inhibir el
desarrollo de lesiones A/E provocadas por una cepa de AEEC de
serotipo O157:H7 de origen humano que produce proteínas Eae del
subtipo \gamma. En resumen, estos resultados ex vivo e
in vivo muestran que los anticuerpos específicos para las
proteínas Eae y Tir de la AEEC porcina resultan útiles para la
inhibición del desarrollo de lesiones A/E provocadas por
infecciones AEEC en diversas especies animales y en seres humanos.
Los anticuerpos específicos para la proteína Paa resultan útiles,
por lo menos, para la inhibición del desarrollo de lesiones A/E
provocadas por la AEEC homóloga a la cepa utilizada para la
preparación de los anticuerpos para la proteína Paa.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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A pesar de que las formas de realización
preferentes de la presente invención han sido descritas en detalle
en la presente memoria e ilustradas en las figuras adjuntas, debe
entenderse que la invención no se encuentra limitada a esas formas
de realización concretas y que pueden efectuarse diversos cambios y
modificaciones en las mismas sin alejarse del alcance de la
presente invención, tal como se define en las reivindicaciones.
Claims (21)
1. Anticuerpo de clase IgY inmunológicamente
específico para una proteína asociada a la virulencia de
Escherichia coli de adhesión y borrado (AEEC) seleccionada
de entre el grupo que consiste de Eae, Tir, EspA y Paa, previniendo
dicho anticuerpo una infección intestinal AEEC in vivo
cuando es administrado a un mamífero.
2. Anticuerpo de la reivindicación 1, en el que
dicho anticuerpo previene la adhesión de dicha AEEC al intestino de
dicho mamífero.
3. Anticuerpo de cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, en el que dicho anticuerpo previene el
desarrollo de lesiones intestinales de adhesión y borrado (A/E)
asociadas a dicha AEEC.
4. Anticuerpo de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho anticuerpo es administrado
por vía oral.
5. Anticuerpo de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho anticuerpo es resistente a
la digestión gastrointestinal.
6. Anticuerpo de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que el mamífero es seleccionado de
entre el grupo que consiste de seres humanos, cerdos, bovinos,
ovinos, caprinos, conejos, perros y gatos.
7. Anticuerpo de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que el mamífero es un ser humano.
8. Anticuerpo de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que la AEEC es seleccionada de entre
el grupo que consiste de cepas de E. coli enteropatógena
(EPEC) y cepas de E. coli enterohemorrágica (EHEC).
9. Huevo de corral que contiene un anticuerpo
de clase IgY, tal como se define en cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8.
10. Huevo de corral de la reivindicación 9, en
el que dicho huevo se obtiene a partir de un ave de corral
inmunizada contra por lo menos una proteína asociada a la virulencia
AEEC.
11. Huevo de corral de la reivindicación 10, en
el que dicha ave de corral es una gallina.
12. Yema de huevo aislada de un huevo de corral
según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11.
13. Composición que comprende:
- Por lo menos un elemento seleccionado de entre
el grupo que consiste de:
- -
- Un anticuerpo de clase IgY según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8;
- -
- Un huevo de corral según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11; y
- -
- Una yema de huevo aislada según la reivindicación 12; y
- -
- Un vehículo o portador biológicamente aceptable.
14. Composición de la reivindicación 13, en la
que dicha composición es formulada para ser administrada por vía
oral a un mamífero.
15. Composición de la reivindicación 13 o de la
reivindicación 14, en la que dicha composición es formulada bajo la
forma de una composición farmacéutica.
16. Composición de la reivindicación 13 o de la
reivindicación 14, en la que dicha composición es formulada bajo la
forma de una composición nutracéutica.
17. Aditivo alimentario que comprende por lo
menos un elemento seleccionado de entre el grupo que consiste
de:
- -
- Un anticuerpo de clase IgY según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8;
- -
- Un huevo de corral según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11;
- -
- Una yema de huevo aislada según la reivindicación 12; y
- -
- Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16.
\newpage
18. Procedimiento para la obtención de un
anticuerpo de clase IgY según cualquiera de las reivindicaciones 1
a 8, comprendiendo el procedimiento las siguientes etapas:
- a)
- La inmunización activa de una gallina de corral para provocar la producción de anticuerpos en un huevo de dicha gallina; y
- b)
- La recuperación o extracción de dichos anticuerpos de dicho huevo.
19. Procedimiento según la reivindicación 18,
que adicionalmente comprende la etapa de administración de por lo
menos una dosis de refuerzo de por lo menos una proteína asociada a
la virulencia AEEC para mantener un estado hiperinmune en dicha
gallina.
20. Procedimiento según la reivindicación 18 o
la reivindicación 19, que adicionalmente comprende la etapa de
purificación de dichos anticuerpos a partir de una fracción de yema
de huevo de dicho huevo.
21. Utilización de por lo menos un elemento
seleccionado de entre el grupo que consiste de:
- -
- Un anticuerpo de clase IgY según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8;
- -
- Un huevo de corral según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11; y
- -
- Una Yema de huevo aislada según la reivindicación 12;
en la preparación de una composición para la
prevención de una infección mamífera por AEEC.
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