DE60218636T2

DE60218636T2 - Antikörper zur Vorbeugung und Behandlung von AEEC-Infektionen

Info

Publication number: DE60218636T2
Application number: DE60218636T
Authority: DE
Inventors: John M. Saint-Hyacinthe FAIRBROTHER; Josee Saint-Bruno HAREL; Isabelle Batisson; Francis Saint-Hyacinthe GIRARD; Marie-Pierre Montreal GUIMOND
Original assignee: Valorisation-Recherche Montreal SC; Valorisation-Recherche LP
Current assignee: Valorisation-Recherche Montreal SC; Valorisation-Recherche LP
Priority date: 2001-03-15
Filing date: 2002-03-14
Publication date: 2007-11-15
Anticipated expiration: 2022-03-15
Also published as: WO2002074812A2; CA2339436A1; US20040086513A1; EP1368379B1; BRPI0208124B8; US7727531B2; ATE356147T1; AU2002242531B8; BRPI0208124B1; AU2002242531B2; ES2283531T3; US8623372B2; US20100183627A1; US7445782B2; WO2002074812A3; DE60218636D1; EP1368379A2; BR0208124A; US20090092621A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Antikörper, die für ein Attaching-and-Effacing-Escherichia coli (AEEC)-Virulenz-assoziiertes Protein immunologisch spezifisch sind, und deren Verwendung bei der Verhinderung bzw. Vorbeugung einer AEEC-Infektion bei einem Säuger.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Escherichia coli hängt mit einer großen Vielfalt von Darmerkrankungen bei Menschen und bei Tieren zusammen. Manche pathogenen E. coli produzieren Attaching-and-Effacing (A/E)-Läsionen, die durch eine enge bakterielle Adhärenz an Enterocyten und Zerstörung bzw. Aufbrechen des zugrunde liegenden Cytoskeletts gekennzeichnet sind. Derartige Isolate sind als A/E-E. coli (AEEC) bezeichnet worden.
Berichte haben gezeigt, dass A/E-Läsionen charakteristisch sind für enterische Pathogene von Menschen, wie z.B. enteropathogene E. coli (EPEC), die für schwere Diarrhoe im Kindesalter in den Entwicklungsländern verantwortlich sind, und enterohämorrhagische E. coli (EHEC), die hämorrhagische Colitis und hämolytisch-urämisches Syndrom (HUS) verursachen.
A/E-Läsionen werden auch mit Diarrhoe bei verschiedenen Tierarten, wie z.B. Kaninchen, Kälbern, Hunden, Katzen, Lämmern und Schweinen, assoziiert.
A/E-Läsionen resultieren aus der engen bakteriellen Adhärenz an die apikale Oberfläche der Enterocyten und der Aktivierung mehrerer chromosomaler Genprodukte, die mit Komponenten der Wirtszelle Wechsel wirken. Derartige Genprodukte werden im Allgemeinen AEEC-Virulenz-assoziierte Proteine ("AEEC virulence-associated proteins") genannt. Beispiele für diese Virulenz-assoziierten Proteine sind das Intimin (Eae) und die sekretierten Proteine Tir (translozierter Intimin-Rezeptor), EspA, EspD und EspB.
Gegenwärtig ist die einzige Herangehensweise zur Kontrolle und Behandlung AEEC-assoziierter Erkrankungen die Verwendung von Antibiotika, eine Herangehensweise, die aufgrund von Problemen mit bakterieller Resistenz und Antibiotikarückständen immer weniger wünschenswert wird. Deshalb muss nach alternativen Ansätzen zum Kontrollieren von Diarrhoe nach dem Abstillen gesucht werden.
Alternativ schlägt eine andere im Fachgebiet bekannte Herangehensweise die Verwendung von AEEC-Virulenz-assoziierten Proteinen als Antigene beim Immunisieren eines Tieres vor, um eine Antikörperproduktion gegen das zugehörige Pathogen bzw. den zugehörigen Krankheitserreger zu stimulieren. Jedoch ist kein Anhaltspunkt für die Wirksamkeit dieses Ansatzes zum Verhindern einer AEEC-Infektion bei einem Säuger gezeigt worden. Beispiele einer solchen alternativen Herangehensweise sind im US-Patent 6,204,004 und in den Internationalen Patentanmeldungen WO 99/41614; WO 97/40063 und WO 99/24576 gezeigt.
Im Fachgebiet ist auch die Verwendung von avianen Antikörpern (IgY) in der passiven Immunisierung bekannt. Zum Beispiel offenbart die WO 00/52055 die Verwendung spezifischer Eidotter-IgY-Antikörper für die Immuntherapie bei der Tierzüchtung und Tierproduktion. Sie offenbart auch die Verwendung von IgY-Antikörpern in Kits für Diagnostika.
Das US-Patent 5,932,250 betrifft die Behandlung von Gefäßerkrankungen, insbesondere Arteriosklerose und Atherosklerose bei warmblütigen Tieren. Spezifischer offenbart dieses US-Patent Verfahren zum Kontrollieren von Cholesterinspiegeln, Lipidablagerungen und der Entwicklung von atheromatösen Läsionen in warmblütigen Tieren durch die Ingestion bzw. Aufnahme von Eiprodukten, die IgY-Antikörper, erzeugt gegen Escherichia coli-Proteine, enthalten.
Das US-Patent 6,162,441 offenbart ein Verfahren zum Produzieren von Anti-E. coli-0157-IgY-Antikörpern in Eier-legenden Hennen.
Das Problem bei WO 00/52055, US 5,932,250 und US 6,162,441 ist, dass die in vivo-Wirksamkeit des produzierten IgY nicht gezeigt worden ist. Tatsächlich enthält keine von diesen einen Beweis hinsichtlich der Durchführbarkeit einer Herangehensweise, die in der Verabreichung eines Antikörpers, der für ein AEEC-Virulenz-assoziiertes Protein immunologisch spezifisch ist, an einen Säuger, um eine(r) intestinale(n) AEEC-Infektion in vivo zu verhindern bzw. vorzubeugen, besteht. Deshalb gibt es weiterhin einen Bedarf an Antikörpern, Eiprodukten und Verfahren zur Verhinderung bzw. Vorbeugung oder Behandlung von AEEC-vermittelten Erkrankungen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf IgY-Antikörper, immunologisch spezifisch für ein Attaching-and-Effacing-Escherichia coli (AEEC)-Virulenz-assoziiertes Protein, wie in Anspruch 1 definiert, und deren Verwendung bei der Verhinderung bzw. Vorbeugung einer AEEC-Infektion bei einem Säuger.
Der genannte IgY-Antikörper ist dazu fähig, eine intestinale AEEC-Infektion in vivo zu verhindern, wenn er einem Säuger verabreicht wird.
Der Antikörper der Erfindung ist gegenüber gastro-intestinaler Verdauung beständig.
Der Antikörper der Erfindung ist vorzugsweise dazu fähig, die Adhäsion der AEEC an das Intestinum des Säugers zu verhindern. Noch bevorzugter ist der Antikörper der Erfindung dazu fähig, die Entwicklung von intestinalen Attaching-and-Effacing-(A/E)-Läsionen, die mit den AEEC zusammenhängen, zu verhindern. Dieser Gesichtspunkt der Erfindung wird insbesondere durch Verwendung von Antikörpern erreicht, die immunologisch für ein oder mehrere AEEC-Virulenz-assoziierte Proteine, wie z.B. Eae, Tir, EspA und Paa, spezifisch sind.
Gemäß einem anderen Gesichtspunkt betrifft die Erfindung ein Geflügelei und einen isolierten Dotter eines derartigen Eis, enthalten einen Antikörper, wie er hierin zuvor definiert wurde.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt betrifft die Erfindung eine Zusammensetzung, die ein(en) biologisch verträglichen/verträgliches Träger oder Vehikel und einen Antikörper, wie er oben stehend definiert wurde, ein Geflügelei, wie es oben stehend definiert wurde, und/oder dessen isolierten Dotter, wie er oben stehend definiert wurde, umfasst.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt betrifft die Erfindung einen Lebensmittelzusatz, der einen Antikörper, wie er oben stehend definiert wurde, ein Geflügelei, wie es oben stehend definiert wurde, eine Dotterfraktion, wie sie oben stehend definiert wurde, und/oder eine Zusammensetzung, wie sie oben stehend definiert wurde, umfasst.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Erhalten eines Antikörpers, wie er hierin oben stehend definiert wurde, wobei das Verfahren die Stufen:

a) aktives Immunisieren einer Geflügelhenne, um die Produktion von Antikörpern in einem Ei der Henne auszulösen; und
b) Gewinnen der Antikörper aus dem Ei

Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt wird ein Verfahren zur Verhinderung bzw. Vorbeugung einer Attaching-and-Effacing-Escherichia coli (AEEC)-Infektion bei einem Säuger offenbart. Das Verfahren umfasst die Stufe des oralen Verabreichens eines Antikörpers, wie er oben stehend definiert wurde, eines Geflügeleis, wie es oben stehend definiert wurde, und/oder eines isolierten Dotters, wie er oben stehend definiert wurde, an den Säuger.
Ein Hauptvorteil der Erfindung ist, dass sie Antikörper, Produkte und Zusammensetzungen bereitstellt, die zur Verhinderung bzw. Vorbeugung einer AEEC-Infektion bei einem Säuger verwendbar und wirksam sind.
Insbesondere ist es ferner ein Vorteil, dass die Antikörper, Produkte, Zusammensetzungen der Erfindung, die Entwicklung von intestinalen A/E-Läsionen, die mit den AEEC zusammenhängen, spezifisch verhindern.
Andere Gegenstände und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden beim Lesen der folgenden nicht-beschränkenden Beschreibung mehrerer bevorzugter Ausführungsformen, die unter Bezug auf die begleitenden Figuren erstellt wurde, offensichtlich sein.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 ist ein Balkendiagramm, das zeigt, dass AEEC-Stämme, die von Kaninchen, Schwein, Hund, Rind und Mensch stammen (einschließlich Non-0157-EHEC und EPEC) und die Eae der α-, β-, δ- oder ε-Subtypen produzieren, A/E-Läsionen gleichermaßen gut an Ileumexplantaten aus neugeborenen Schweinen induzierten.
2 ist ein Balkendiagramm, das zeigt, dass ein Ersatz des Eae des γ-Subtyps durch das Eae des α-Subtyps in einem 0157:H7-Stamm in der Induktion von A/E-Läsionen in einem ähnlichen Ausmaß resultierte, wie es für den homologen porcinen AEEC-Stamm beobachtet wurde.
3 ist ein Balkendiagramm, das zeigt, dass erfindungsgemäße Antikörper dazu fähig sind, die Entwicklung von durch den homologen Stamm 1390 verursachten A/E-Läsionen in Ileumexplantaten signifikant zu blockieren.
4 ist ein Balkendiagramm, das zeigt, dass erfindungsgemäße Antikörper dazu fähig sind, die Entwicklung von durch verschiedene Kalb-AEEC-Stämme verursachte Entwicklung von A/E-Läsionen in Ileumexplantaten signifikant zu blockieren.
5 und 6 sind Balkendiagramme, die zeigen, dass erfindungsgemäße Antikörper dazu fähig sind, die Entwicklung von durch verschiedene humane AEEC-Stämme verursachten A/E-Läsionen in Ileumexplantaten signifikant zu blockieren.
7 ist ein Balkendiagramm, das zeigt, dass erfindungsgemäße Antikörper dazu fähig sind, die Entwicklung von durch verschiedene EPEC-Stämme verursachten A/E-Läsion in Ileumexplantaten signifikant zu blockieren.
8A und 8B sind Balkendiagramme, die zeigen, dass eine orale Verabreichung von Eidotter-Antikörpern gemäß der Erfindung die Entwicklung von A/E-Läsionen im Caecum und Colon von Ferkeln, die mit einem homologen porcinen AEEC-Stamm produziert wurden, signifikant inhibiert.
9A und 9B sind Balkendiagramme, die zeigen, dass eine orale Verabreichung von Eidotter-Antikörpern gemäß der Erfindung die Entwicklung von A/E-Läsionen im Caecum und Colon von Ferkeln, die mit einem 0157:H7-AEEC-Stamm produziert wurden, inhibiert.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wie zuvor erwähnt, betrifft die vorliegende Offenbarung einen im Gegensatz zu Antibiotika neuen alternativen Ansatz zur Verhinderung bzw. Vorbeugung einer AEEC-Infektion bei einem Säuger.
Genauer betrifft die vorliegende Offenbarung Antikörper, die immunologisch für ein AEEC-Virulenz-assoziiertes Protein spezifisch sind, wobei diese Antikörper dazu fähig sind, eine(r) intestinale(n) AEEC-Infektion in vivo zu verhindern bzw. vorzubeugen, wenn sie in einem Säuger verabreicht werden. Spezieller sind die Antikörper der Offenbarung dazu fähig, die Adhäsion der AEEC an das Intestinum des Säugers zu verhindern und, noch bevorzugter, verhindern sie die Entwicklung von intestinalen A/E-Läsionen, die mit den AEEC zusammenhängen.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "verhindern" (bzw. "vorbeugen") auf einen Vorgang, durch den die AEEC-Infektion aufgehalten oder verzögert wird.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Säuger" auf einen beliebigen Säuger, bei dem die Möglichkeit besteht, von AEEC infiziert zu sein. Zu den Säugern, die dafür bekannt sind, dass sie potentiell durch AEEC infiziert sind, zählen Menschen, Schweine, Rinder, Schafe, Ziegen, Kaninchen, Hunde und Katzen. Es wird für einen Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich sein, dass die Antikörper der Erfindung immunologisch spezifisch sein sollen gegenüber Virulenzproteinen, die aus einer Vielzahl an AEEC-Stämmen, die intestinale Läsionen verursachen, isoliert werden, wie z.B. jene der enteropathogenen E. coli (EPEC) und enterohämorrhagischen E. coli (E-HEC). Einige Beispiele für EPEC- und EHEC-Stämme sind in Tabelle I gezeigt.
Hinsichtlich der Antikörper der Erfindung bezieht sich der Begriff "immunologisch spezifisch" auf Antikörper, die mit einer relativen hohen Affinität an ein oder mehrere Epitope eines Proteins von Interesse binden, aber die andere Moleküle außer dem/denen von Interesse nicht in wesentlicher Weise erkennen und daran binden. Wie hierin verwendet, umfasst/umfassen "Antikörper" alle der nachstehend genannten Möglichkeiten: Antikörper oder Fragmente davon, erhalten durch Reinigung, proteolytische Behandlung oder durch Gentechnologie, künstliche Konstrukte, die Antikörper oder Fragmente davon umfassen, und künstliche Konstrukte, die dafür gedacht sind, die Bindung von Antikörpern oder Fragmenten davon nachzuahmen. Derartige Antikörper werden in Colcher et al. (Q. J. Nucl. Med. 1998; 42:225–241) diskutiert. Sie umfassen vollständige Antikörper, F(ab')₂-Fragmente, Fab-Fragmente, Fv-Fragmente, scFv-Fragmente, oder andere Fragmente, CDR-Peptide und -Mimetika. Diese können von Fachleuten leicht erhalten und hergestellt werden. Zum Beispiel kann ein Enzymverdau verwendet werden, um F(ab')₂- und Fab-Fragmente zu erhalten, und zwar indem ein IgG-Molekül einer Pepsin- bzw. Papain- Spaltung unterworfen wird. Von der vorliegenden Erfindung sind auch rekombinante Antikörper abgedeckt.
Alternativ kann der Antikörper der Erfindung ein Antikörperderivat sein. Ein derartiger Antikörper kann eine Antigenbindende Region umfassen, die mit einer Nicht-Immunglobulinregion verknüpft ist oder nicht. Die Antigen-bindende Region ist eine variable Domäne einer leichten Kette eines Antikörpers oder eine variable Domäne einer schweren Kette. Typischerweise umfasst der Antikörper variable Domänen sowohl der leichten als auch der schweren Kette, die in Konstrukte insertiert werden können, z.B. Einzelketten-Fv (scFv)-Fragmente, Disulfid-stabilisierte Fv (dsFv)-Fragmente, multimere scFv-Fragmente, Diabodies, Minibodies oder andere damit verwandte Formen (Colcher et al., Q. J. Nucl. Med. 1998; 42:225–241). Ein derartiger derivatisierter Antikörper kann manchmal bevorzugt sein, da ihm der Fc-Teil des natürlichen Antikörpers fehlt, der an etliche Effektoren des Immunsystems binden und eine Immunreaktion hervorrufen kann, wenn er einem Menschen oder Tier verabreicht wird. Tatsächlich führen derivatisierte Antikörper normalerweise nicht zu Immunkomplex-Erkrankung und Komplementaktivierung (Typ III-Überempfindlichkeitsreaktion).
Alternativ wird eine Nicht-Immunglobulinregion mit der Antigen-bindenden Region des Antikörpers der Erfindung fusioniert. Die Nicht-Immunglobulinregion ist typischerweise eine Nicht-Immunglobulingruppierung und kann ein Enzym, eine Region, die von einem Protein, das eine bekannte Bindungsspezifität hat, abgeleitet ist, eine Region, die von einem Proteintoxin oder tatsächlich von einem beliebigen Protein, das von einem Gen exprimiert wird, abgeleitet ist, oder eine chemische Gruppierung sein, die (eine) inhibitorische oder blockierende Aktivität(en) gegen die AEEC-Virulenz-assoziierten Proteine zeigt, sein. Die zwei Regionen dieses modifizierten Antikörpers können über eine spaltbare oder permanente Linkersequenz verbunden sein.
Da die AEEC-Infektion im Allgemeinen im Intestinaltrakt lokalisiert ist, ist es in hohem Maße bevorzugt, dass die Antikörper der Offenbarung gegenüber gastro-intestinaler Verdauung beständig sind. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "beständig" auf einen Antikörper, der seine immunologische Funktion selbst nachdem er mit Magensäuren in Kontakt war, für eine Zeitdauer im Wesentlichen beibehält, die nötig ist, um eine AEEC-Infektion in vivo zu verhindern. Der Antikörper der Erfindung ist ein avianes Immunglobulin, wie z.B. IgY. Es ist in der Tat gut bekannt, dass IgY-Antikörper eine große Säure- und Hitzebeständigkeit zeigen. Der Antikörper der Offenbarung kann auch ein humanes oder tierisches Immunglobulin, wie z.B. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, IgE oder IgD, sein, das variable Ratten- oder Mausregionen (chimär) oder CDRs (humanisiert oder "animalisiert") trägt. Jedoch ist die Offenbarung nicht auf IgY-Antikörper beschränkt, da es denkbar ist, dass die Beständigkeitskapazität des Antikörpers, wenn sie fehlt, durch Gentechnologie oder auf eine andere Weise, die einem Fachmann bekannt ist, bereitgestellt oder erhöht werden kann. Ferner kann der Antikörper der Erfindung auch mit einem beliebigen geeigneten Träger, der einem Fachmann auf dem Gebiet bekannt ist, konjugiert werden, um seine Beständigkeit gegenüber Magensäuren zu erhöhen oder um, beispielsweise, eine spezifische Abgabe und verlängerte Retention des Antikörpers, entweder in einem targetierten begrenzten Gebiet, wie z.B. dem Intestinum, oder für eine systemische Anwendung bereitzustellen.
Wie oben erwähnt, ist der Antikörper der Offenbarung gegenüber einem oder mehreren AEEC-Virulenz-assoziierten Proteinen immunologisch spezifisch. Die bevorzugten AEEC-Virulenz-assoziierten Proteine, die für die Erfindung in Betracht ge zogen werden, sind Eae, Tir, EspA, Paa und immunologische Derivate davon. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "immunologisches Derivat" auf ein Protein/Peptid, das eine immunologische Aktivität besitzt, die im Wesentlichen zu der immunologischen Aktivität des gesamten Proteins/Peptids ähnlich ist, und eine derartige immunologische Aktivität bezieht sich auf die Fähigkeit bzw. Kapazität des Stimulierens der Produktion von Antikörpern, die gegenüber einem AEEC-Virulenz-assoziierten Protein oder Derivat davon immunologisch spezifisch sind. Der Begriff "immunologisches Derivat" umfasst deshalb "Fragmente", "Abschnitte", "Varianten" oder "Analoga" eines Proteins/Peptids.
Die vorliegende Erfindung verwendet IgY-Antikörper, da, wie oben stehend erwähnt, sie vorteilhafterweise Magensäurebeständigkeit zeigen. Ferner haben IgY-Antikörper den Vorteil, dass sie mit Säuger-Komplement, -Fc-Rezeptor, -Protein A oder -Protein G nicht reagieren. Außerdem können IgY-Antikörper in Eiern produziert werden und ihre Extraktion aus Eidottern kann in einem großen Maßstab ohne teure Investitionen durchgeführt werden.
In diesem Zusammenhang und gemäß einem weiteren Gesichtspunkt ist die vorliegende Erfindung auch auf ein Verfahren zum Erhalten des oben erwähnten Antikörpers, der für ein AEEC-Virulenz-assoziiertes Protein immunologisch spezifisch ist, gerichtet. Obgleich viele auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren zum Erhalten der von den Erfindern betrachteten Antikörpern geeignet sein können, ist es bevorzugt, dass das Verfahren der vorliegenden Erfindung die Stufen a) aktives Immunisieren einer Geflügelhenne, um die Produktion von Antikörpern in einem Ei der Henne auszulösen; und b) Gewinnen der Antikörper aus dem Ei umfasst. Ein Fachmann auf dem Gebiet wird verstehen, dass die Immunisierungsstufe durch gut bekannte Verfahren erreicht wird. Zum Beispiel kann das AEEC- Virulenzprotein parenteral, z.B. intravenös, intramuskulär, subkutan, gegeben werden. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Geflügel" auf beliebige Vögel, die dazu fähig sind, immunisiert zu werden. Unter diesem ist das gewöhnliche domestisierte Huhn bevorzugt. Das Verfahren der Erfindung kann auch eine Stufe des Verabreichens wenigstens eines Boosters der Proteine zum Aufrechterhalten eines hyperimmunen Zustandes in der Henne umfassen. Ferner umfasst das Verfahren der Erfindung bevorzugt eine Stufe der Reinigung der Antikörper aus einer Dotterfraktion des Eis. Wiederum wird die Reinigungsstufe mit Verfahren erzielt, die einem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt sind. Eine derartige Person wird auch verstehen, dass die Boosting-Stufe nicht darauf beschränkt ist, vor der Stufe des Legens des Eis durchgeführt zu werden. Ein Booster kann der gleichen Henne sogar während oder nach der Stufe des Legens des Eis gegeben werden.
Folglich bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf ein Geflügelei, das einen Antikörper der Erfindung enthält. Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf einen isolierten Dotter des Eis.
Die vorliegende Offenbarung beschreibt auch ein Verfahren und Zusammensetzungen zur Verhinderung bzw. Vorbeugung von AEEC-assoziierten Erkrankungen. Viele Verfahren könnten verwendet werden, um die vorliegende Erfindung praktisch zu verwirklichen. Es wird jedoch besonders angenommen, dass ein Verfahren, das die Stufe des oralen Verabreichens eines Antikörpers der Erfindung, eines Geflügeleis und/oder eines isolierten Dotters, wie zuvor definiert, an einen Säuger aus kommerzieller Sicht besonders vorteilhaft ist. Nichtsdestoweniger können Verfahren, die eine parenterale Verabreichung des Antikörpers der Erfindung umfassen, von Fachleuten auf dem Gebiet in Betracht gezogen werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung der Erfindung wenigstens ein Element bzw. einen Bestandteil, der gegen AEEC immunologisch aktiv ist, und ein(en) biologisch verträgliches/verträglichen Träger oder Vehikel, wobei ein derartiges Element entweder ein Antikörper, ein Geflügelei oder ein isolierter Dotter, wie oben stehend definiert, ist. Zum Herstellen der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können Verfahren, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, eingesetzt werden. Wie hierin verwendet, beziehen sich der Begriff "immunologisch aktiv" oder ein Verweis auf die immunologische Aktivität eines Elements, wie z.B. eines Antikörpers der Erfindung, in dieser Hinsicht auf die Fähigkeit eines solchen Antikörpers, eine AEEC-Infektion bei einem Säuger durch Binden an ein AEEC-Virulenz-assoziiertes Protein zu verhindern. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "biologisch verträglich" auf ein Vehikel oder einen Träger, das/der einem Säuger, insbesondere Menschen und Tieren, in sicherer Weise ohne übermäßige negative oder toxische Nebenwirkungen verabreicht werden kann. Ein derartiges Vehikel oder ein derartiger Träger kann für zahlreiche Zwecke verwendet werden, z.B. Konservierungsmittel, Solubilisierungsmittel, Stabilisierungsmittel, Benetzungsmittel, Emulgatoren, Süßungsmittel, Färbemittel, Duftstoffe, Salze, Puffer, Beschichtungs- bzw. Überzugsmittel oder Antioxidanzien und dergleichen. Sie können von Fachleuten auf diesem Gebiet unter Verwendung gut bekannter Verfahren leicht hergestellt werden.
Gemäß einer anderen Ausführungsform wird die Zusammensetzung der Erfindung in Form einer pharmazeutischen oder nutrazeutischen Zusammensetzung formuliert. Die vorliegende Erfindung stellt auch einen Lebensmittelzusatz, umfassend wenigstens eines der oben genannten Elemente, bereit und umfasst ferner eine Zusammensetzung, wie oben definiert. Es wird einem Fachmann auf dem Gebiet klar sein, dass, obwohl die Zusammenset zungen der Erfindung bevorzugt oral verabreicht werden, sie auf jedem anderen geeigneten Weg verabreicht werden können. Es ist in der Tat denkbar, dass sie mittels anderer Mittel gegeben werden könnten. Falls die Zusammensetzungen oral gegeben werden, können sie in der Form von Tabletten, Kapseln, Pulver, Sirupen usw. sein.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können in Verbindung mit pharmazeutischen Zusammensetzungen, die im Fachgebiet bekannt sind, verwendet werden. Beispielsweise könnte man es vorteilhaft finden, eines der Elemente der Zusammensetzung der Erfindung mit anderen Wirkstoffen zu kombinieren, die verwendet werden können, um andere(n) Erkrankungen als jene, die durch AEEC induziert werden, zu behandeln oder vorzubeugen.
Die Menge an spezifischen Antikörpern, die einem Menschen oder einem Tier verabreicht wird oder die in der Zusammensetzung der Erfindung vorliegt, ist eine therapeutisch wirksame Menge. Eine therapeutisch wirksame Menge eines Antikörpers ist die Menge, die notwendig ist, um günstige Ergebnisse zu erhalten ohne übermäßig negative Nebenwirkungen in dem Wirt, dem der Antikörper oder die Zusammensetzung verabreicht wird, zu verursachen. Darüber hinaus ist eine wirksame Menge eines Antikörpers zum Behandeln einer speziellen Erkrankung eine Menge, die hinreichend ist, die Symptome, die mit der Erkrankung zusammenhängen, zu bessern oder auf irgendeine Weise zu verringern. Eine derartige Menge kann als Einzeldosierung verabreicht werden oder sie kann gemäß eines Regimes bzw. Plans verabreicht werden, wodurch sie wirksam ist. Die Menge kann die Erkrankung heilen, wird aber typischerweise verabreicht, um die Symptome der Erkrankung zu bessern.
Die genaue Menge an Antikörper oder an jeder der Komponenten in der Zusammensetzung und die Menge der Zusammensetzung, die zu verabreichen ist, werden gemäß Faktoren, wie z.B. dem Typ des zu behandelnden Zustandes, den anderen Inhaltsstoffen in der Zusammensetzung, der Verabreichungsweise, dem Alter und Gewicht des Säugers usw. variieren. Ohne durch eine beliebige bestimmte Dosierung gebunden zu sein, wird angenommen, dass z.B. für orale Verabreichung eine tägliche Dosierung von etwa 100 bis etwa 600 mg/kg lyophilisierten Eidotters, enthaltend Antikörper, die für ein AEEC-Virulenz-assoziiertes Protein immunologisch spezifisch sind, (üblicherweise als Teil einer Zusammensetzung, wie oben angegeben, vorliegend) zum Verhindern bzw. Vorbeugen einer Säuger-AEEC-Infektion bei einem typischen Erwachsenen geeignet sein kann. Diese Dosierung kann so oft wie erforderlich wiederholt werden. Typischerweise kann die Verabreichung 1- bis 21-mal in einer Woche erfolgen. Wenn sich Nebenwirkungen entwickeln, kann die Menge und/oder Häufigkeit der Dosierung verringert werden.
BEISPIEL
Das folgende Beispiel ist für den breiten Bereich der Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung erläuternd und soll ihren Umfang nicht beschränken. Es können darin Modifikationen und Variationen gemacht werden, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen. Obwohl jedes beliebige Verfahren oder Material, das zu jenen, die hierin beschrieben sind, ähnlich oder äquivalent ist, in der Praxis zum Testen bzw. Untersuchen der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, werden die bevorzugten Verfahren und Materialien beschrieben.
Zusammenfassung
Die Erfinder haben erfolgreich Eidotter-Antikörper gegen gereinigte Fusionsproteine der bekannten Attaching-and-Effacing-Virulenzfaktoren Eae, EspA, EspB, EspD und Tir und eines neuen mutmaßlichen Attaching-and-Effacing-Virulenzfaktors Paa produziert. Sie haben gezeigt, dass nur die Anti-Eae-, Anti-Tir- und Anti-Paa-Antikörper dazu in der Lage waren, die Entwicklung von Attaching-and-Effacing-(A/E)-Läsionen infolge des homologen porcinen E. coli-Stammes ex vivo im Schweine-Ileum-Organkulturmodell signifikant zu blockieren. Diese Antikörper waren auch dazu fähig, die Entwicklung von A/E-Läsionen infolge von Attaching-and-Effacing-E. coli, die aus zahlreichen anderen Tierarten, wie z.B. dem Rind und Hund, und aus Menschen stammten, einschließlich sowohl 0157:H7- als auch Non-0157:H7-E. coli, zu blockieren. Schließlich haben die Erfinder gezeigt, dass die Anti-Eae-Antikörper dazu fähig waren, die Entwicklung von A/E-Läsionen infolge der homologen Schweine- und 0157:H7-Human-Attaching-and-Effacing-E. coli in vivo in einem Infektionsmodell an neugeborenen Schweinen signifikant zu verringern. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass Hühnereidotter-Antikörper, die für bestimmte der Virulenzfaktoren, die an der Anheftung bzw. "Attachment"-und-"Effacement" beteiligt sind, spezifisch sind, dazu fähig sind, die bakterielle Infektion und die Entwicklung von intestinalen Läsionen im Schwein zu blockieren und sind deshalb ein potentieller Kandidat für die Verwendung in der Behandlung von Infektionen, die durch Attaching-and-Effacing-E. coli verursacht werden. Sie sind auch ein potentieller Kandidat als Futterzusatz für eine orale Verabreichung an Rinder, um 0157:H7- und andere Attaching-and-Effacing-E. coli aus dem Intestinum zu eliminieren und die Kontamination von Fleisch und nachfolgende Infektion von Menschen zu verhindern.
Materialien und Methoden.
Bakterienstämme, Plasmide und Medien.
E. coli M155(pREP4^rM) (Qiagen) wurde als der Wirtsstamm für rekombinante Proteine verwendet. Die porcine Attaching-and-Effacing-E. coli (AEEC) P86-1390 (Serogruppe 045, Streptomycin-resistent, Sm^R) wurde an der Faculte de Medecine Veterinaire, Saint-Hyacinthe, Que bec, Kanada aus einem 4-Wochen alten Schwein mit Diarrhoe nach dem Absetzen ("postweaning diarrhea") isoliert. Der 045-Stamm P86-1390 induziert typische Attaching-and-Effacing(A/E)-Läsionen (Zhu et al., 1994, Infect Immun. 62: 4153–4159; Zhu et al., 1995, Can. J. Vet. Res. 59: 118–123) und seine genomische DNA wurde als Matrize zum Amplifizieren der Virulenzfaktorgene verwendet, wobei diese am "locus of enterocyte effacement" (LEE) getragen werden.
Für die Explantatmodellprovokation (siehe Tabelle 2 für die Merkmale der Stämme) wurden Bakterien über Nacht in Trypticase-Soja-Boillon (TSB, Difco) unter Rühren bzw. Bewegung (150 U/min) bei 37°C gezüchtet, dann in Dubelcco's modifiziertes Eagle-Medium (DMEM, GibcoBRL) transferiert und vor der Verwendung bis zur frühen exponentiellen Phase gezüchtet (OD₆₀₀ 0,7, entsprechend näherungsweise 2,0 × 10⁸ KbE, bestimmt mittels Verwendung spezifischer Wachstumskurven). D-Mannose wurde in einer Endkonzentration von 1 % zu jeder Kulturbrühe zugesetzt, um Typ-1-Fimbrien-vermittelte Adhärenz vor der Infektion zu minimieren.
Konstruktion von Fusionsgenen.
Das 3'-Ende (Carboxy) des oder das gesamte (reife) eae-Gen, die espA-, espB- und espD-Gene, das tir-Gen und das 3'-Ende (Carboxy) oder das gesamte (reife) paa-Gen wurden mittels PCR unter Verwendung der in Tabelle 3 aufgelisteten Primerpaare amplifiziert. Die Amplikons wurden in den pGEM-T^TM-Vektor (Promega) inseriert und dann in den pQE-30^TM-Expressionsvektor (Qiagen) eingeführt, wobei die geeignete Klonierungsstelle verwendet wurde (zwischen BamHI- und SalI-Stellen für die eae-Carboxy-, espA-, espB-, espD-, paa-Carboxygene, zwischen BamHI und SphI für das reife eae-Gen und zwischen HindIII und SacI für das tir-Gen). Die Genfusionen wurden mittels Sequenzierung überprüft.
Produktion und Reinigung von Fusionsproteinen.
Eine Übernacht-LB-Boillon-Vorkultur wurde verwendet, um eine 1 Liter LB-Bouillon-Kultur zu inokulieren. Die Zellen wurden bei 37°C unter Schütteln gezüchtet, bis die OD_600nm 0,7–0,8 betrug. Isopropylthiogalactosid (IPTG) wurde dann zu einer Endkonzentration von 1 mM zugesetzt. Nach Inkubation für etwa 4 Stunden wurden die Zellen mittels Zentrifugation bei 4000 × g für 10 Minuten geerntet und in zwei Volumen Puffer A (Qiagen) resuspendiert. Die Proben können zentrifugiert und das Pellet gefroren bei –70°C bis zur Verwendung gelagert werden. Die Proben wurden bei Raumtemperatur aufgetaut und in Puffer A resuspendiert. Ein mg/ml Lysozym und eine Endkonzentration von 100 μM PMSF wurden zugesetzt. Die gesamte Suspension wurde 30 Minuten auf Eis inkubiert und ultraschallbehandelt. Je ml Probe wurden 10 μg Rnase A und 5 μg Dnase 1 zugesetzt, und die Probe wurde nach Inkubation für 15 Minuten auf Eis durch Zentrifugation bei 15.000 × g für 20 min geklärt. Der Überstand wurde mit einer 50%igen Aufschlämmung von Ni-NTA-Harz (Qiagen) in Puffer A (8 ml Aufschlämmung pro Liter Zellen) gemischt. Nach sanftem Mischen in einem rotierenden Röhrchen für eine Nacht wurde das Harz in eine Qiagen-Säule gegeben, mit Puffer A gewaschen, bis die OD_280nm kleiner als 0,01 war, mit Puffer B (Qiagen) gewaschen, bis die OD_280nm kleiner als 0,02 war, mit 0,1 M Imidazol in Puffer B (20 ml pro Liter Zellen) gewaschen und mit 0,25 M Imidazol in Puffer B (10 ml pro Liter Zellen) eluiert. Die Fraktionen (1–1,5 ml), gesammelt nach dem Überschichten mit der 0,25 M Imidazol-Elution, wurden mittels SDS-PAGE durch 15 % Acrylamid analysiert. Jene, die Proteine von Interesse enthielten, wurden vereinigt, mittels der Lowry-Methode quantifiziert und bei –70°C gelagert.
Western-Immunblotting.
Affinitätssäulen-gereinigte Proteine mit His-Tag wurden mit einem gleichen Volumen an 2× Laemmli- Puffer gemischt, für 5 Minuten gekocht, auf eine 15%ige SDS-PAGE aufgebracht und auf 0,2 μm Nitrocellulosemembran (BioRad) elektrotransferiert. Die Blots wurden blockiert und gewaschen mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA) – 0,1 % Tween^TM 20 in Tris-gepufferter Salzlösung (TBS) und über Nacht mit primären Antikörpern, einschließlich RGS-His-Antikörper (Qiagen) und den Anti-Eae, Anti-EspA, Anti-EspB, Anti-EspD und Anti-Tir, freundlicherweise bereitgestellt von Dr. Gad Frankel und Dr. Frank Ebel, inkubiert. Für die Untersuchung der Antikörper (IgY)-Produktion durch Hühner wurden gereinigte IgY, die spezifisch gegen jeden der LEE-Virulenzfaktoren gerichtet waren, als primäre Antikörper verwendet. Die Filter wurden dann mit sekundärem Ziege-Anti-Kaninchen- (1/1000), Ziege-Rnti-Maus- (1/1000) oder Kaninchen-Anti-Huhn- (1/5000) HRP-konjugiertem IgG und mit H₂O₂-α-Chlornaphthol als dem Substrat entwickelt.
Immunisierung der Tiere und Antikörperreinigung.
Zwei bis acht Legehennen wurden in ihrem Pectoralmuskel an mehreren Stellen mit 50 μg gereinigten Proteinen, die in unvollständigem Freund's Adjuvans emulgiert waren, an den Tagen 1, 14, 28, 42 und 56 immunisiert. M15 (pREP4^TM)-Gesamtproteine wurden als Negativkontrolle für die Antivirulenzfaktor-IgY-Produktion verwendet. Eier wurden ab dem Tag 28 gesammelt und bei 4°C bis zur Reinigung der Antikörper aufbewahrt. Für die Reinigung der Antikörper wurden die Dotter von der Dottermembran und dem Eiweiß getrennt, vereinigt, und es wurde 1 Volumen PBS 1× zugegeben. Das gesamte Gemisch wurde homogenisiert, mit einem Volumen Chloroform gemischt und bei 15000 × g für 10 Minuten zentrifugiert. Eine orange-gefärbte Lösung, enthaltend den Vitellus, eine gelbe halbfeste Emulsion der Lipide in Chloroform und eine wässrige Phase, enthaltend Hühner-IgY, wurden dann von unten nach oben im Röhrchen beobachtet. Gereinigtes IgY wurde mittels SDS-PAGE, gefärbt mit Coomassie-Blau, und mittels Western-Immunblotting untersucht, wie oben erläutert.
ELISA.
Die Titer des Antivirulenzfaktors IgY in Dottereiern ("yolk eggs") wurden unter Verwendung von Mikrotiterplatten (Immulon 2HB, Dynec), die mit 100 ng an gereinigten Proteinen im Carbonatpuffer (pH 9,6) vorbeschichtet waren, bestimmt. Gereinigtes IgY, das seriell in PBS (pH 7,4), enthaltend 1 % BSA und 0,05 % Tween 20, verdünnt war, wurde in die Wells gegeben und für 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS, enthaltend 0,05 % Tween^TM 20, wurden die gebundenen Antikörper durch Zugeben von Kaninchen-Anti-Huhn-IgG (1/25000), konjugiert mit Peroxidase, (Jackson Immuno Research Laboratories, Inc.) detektiert. Nach einer 10-minütigen Enzym-Substrat-Reaktion wurde die Extinktion bei 405 nm ausgelesen, und die Antikörpertiter wurden als der log₁₀ der reziproken Verdünnung ausgedrückt. Zum Überwachen unspezifischer Reaktionen wurden die Extinktionen, die mit IgY aus Hühnern, die mit dem Gesamtproteinextrakt aus dem M14 (pREP4^TM)-Stamm immunisiert worden waren, von den Extinktionen abgezogen, die mit den Untersuchungsproben erhalten wurden.
Antikörperextraktion aus Eidottern.
Virulenzfaktor-spezifisches IgY wurde aus Eidottern mittels eines Verfahrens, das von [Akita und Nakai, (1993) Immunol. Methods 18: 162(e): 155–164; 1993 Immunol. Methods 2: 160(2): 207–214] beschrieben wurde, durchgeführt, wobei einige Modifikationen erfolgten. Kurz gesagt, wurden Eidotter vom Albumin befreit und dann auf ein (Hand)Tuch gegeben. Die Eidotter wurden dann sanft auf dem (Hand)Tuch gerollt, um Albuminreste zu entfernen, dann punktiert, um den Dotter ohne den Vitellus abzusaugen. Ein gleiches Volumen an Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) wurde zu den Dottern gegeben, dann wurde mittels Vor tex-Schütteln homogenisiert. Ein gleiches Volumen an Chloroform wurde zu der Lösung gegeben, dann wurde gemischt bis ein festes Homogenat entstand. Die Präparation wurde für 5 Minuten bei 14000 U/min zentrifugiert und der Überstand, der IgY enthielt, wurde entfernt. Der Überstand wurde vor der Verwendung lyophilisiert.
Sammlung und Kultur von Explantatgeweben.
Die Expantatkulturtechnik stammte von Zhu et al., 1994 (a.a.O.). Kurz gesagt, wurden mukosale Gewebe aus dem Ileum von neu geborenen Ferkeln aus einer konventionellen Herde, denen das Colostrum entzogen bzw. vorenthalten wurde, erhalten. Die Ferkel wurden mit Ketaminhydrochlorid beruhigt, bevor sie mit einer Überdosis Pentobarbital eingeschläfert wurden. Die Zeitspanne zwischen dem Tod und dem Beginn der Explantatkulturen war näherungsweise 1 h, und jeder Stamm wurde in wenigstens 2 Ferkeln getestet. Nach dem Sammeln wurde die Serosa vorsichtig entfernt und der Mucus wurde mit einem sterilen Tupfer sanft abgestrichen. Die Gewebe wurden in steriles RPMI 1640^TM-Vollmedium (GibcoBRL) getaucht, auf Eis in das Labor transportiert und für 30 Minuten auf eine Schüttelplattform gegeben. Vor der Kultur wurden die Gewebe in Stücke von 5 × 5 mm geschnitten und mit der Mucosaseite nach oben auf Biopsie-Schaumpads (Curtin Matheson Scientic, Inc.) in mehrschalige Nunclon Delta^TM-Oberfläche-Gewebekulturplatten mit vier Wells (Nalge Nunc International) gegeben. Ein Gewebe (nun als Explantat bezeichnet) wurde auf jeden Schwamm mit einem Schwamm pro Well gegeben. Zu den Wells wurde RPMI 1640-Vollmedium gegeben, ohne die Explantate zu überschwemmen. Die Platten wurden bei 37°C auf einem Schüttler (Position 2,5) in einer Atmosphäre von 95 % O₂ und 5 % CO₂ inkubiert.
Inokulation und Untersuchung von Explantaten.
Die Explantate wurde dreimal in stündlichen Intervallen mit 50 μl Bouillon kultur (näherungsweise 1 × 10⁷ KbE), aufgebracht auf die Mucosaoberfläche, infiziert und für 8 Stunden inkubiert. Um einem Überwachsen mit Bakterien und saurem pH vorzubeugen, wurden stündliche Austausche mit sterilem frischem RPMI 1640^TM-Vollmedium während der Kultur durchgeführt, womit 2 Stunden nach der ersten Explantatinfektion begonnen wurde.
Behandlung mit Antikörper im Explantatmodell.
Bouillonkulturen wurden bei 37°C mit einem gleichen Volumen einer Zubereitung aus lyophilisiertem Antikörper, der zuvor mit PBS rekonstituiert worden war, für 30 Minuten vor der Explantatinfektion inkubiert.
Lichtmikroskopie.
Nach der Kultur wurden die Explantate zur mikroskopischen Untersuchung in 10%igem gepuffertem Formalin fixiert. Das gleiche Protokoll wurde für Schnitte aus in vivo experimentell infizierten neugeborenen Ferkeln verwendet. Formalin-fixierte Schnitte wurden weiterhin in Nylon^TM-Gewebebiopsiebeuteln (Shandon Inc.) gegeben, bearbeitet, in Paraffin eingebettet, zu 5 μm geschnitten und gemäß Standardtechniken mit Hämatoxylin, Phloxin und Safranin (HPS) gefärbt. Mit HPS gefärbte Schnitte wurden mittels Lichtmikroskopie auf epitheliale eng bzw. fest anhärierende Bakterien ("epithelial intimate-adherent bacteria") untersucht. Jeder intakte Villus wurde auf das Vorhandensein von fest adhärierenden Bakterien untersucht und die Bewertung der mittleren Epitheloberfläche, die mit fest adhärierenden Bakterien bedeckt war, wurde gemäß einer Skala von 0 bis 100 % durchgeführt.
Immunfluoreszenz.
Schnitte auf Glasobjektträgern wurden vor der Rehydrierung in progressiven Ethanollösungen für 5 Minuten in Xylol entparaffiniert. Die Schnitte wurden in PBS gewaschen, dann wurden die Antigenbindungsstellen in PBS-1 % BSA-0,1 % Tween 20-Lösung bei 37°C für 20 Minuten blockiert. Danach wurden die Schnitte in PBS gewaschen und bei 37°C für 20 Minuten mit einer 150-Verdünnung primärer Antikörper (Escherichia coli Serotyping Laboratory, Kanada) entsprechend dem spezifischen Serotyp des Stammes inkubiert. Nach dem Auswaschen in PBS wurden die Schnitte bei 37°C mit einer 1:200-Verdünnung von FITC-konjubiertem Ziege-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., USA) für 20 Minuten inkubiert. Schließlich wurden die Schnitte mit 0,2 % Evan's Blue^TM (Fisher Scientific Company, USA) gegengefärbt. Montierte Schnitte wurden mit einem Leitz Diaplan^TM-Mikroskop, ausgerüstet mit Epifluoreszenz, untersucht.
Transmissionselektronenmikroskopie (TEM).
Kleine Ileum-, Caecum- oder Colonschnitte (3 mm × 3 mm) wurden für 2 Stunden bei Raumtemperatur in 2,5 % (V/V) Glutaraldehyd fixiert, dann in Cacodylat-Puffer (0,1 M Cacodylat, pH 7,3) für 1,5 Stunden unter regelmäßigem Wechseln gewaschen. Danach wurden die Gewebe für 1 Stunde bei Raumtemperatur in 2 % Osminiumtetraoxid (OsO₄) nachfixiert, dann in Wasser für 1,5 Stunden unter regelmäßigem Wechseln gewaschen, in abgestuften Ethanolreihen entwässert und schließlich in Spurr-Harz (Marivac, Nova Scotia, Kanada) eingebettet. Dünne Schnitte wurden auf Kupfernetzen montiert, mit Uranylacetat und Bleicitrat gefärbt und mit einem Philips 420^TM-Transmissionselektronenmikroskop bei 80 kV (Philips Electronics, Niederlande) auf AE-Läsionen untersucht.
Infektion von Ferkeln und Provokation von Antikörpern in vi vo.
22 neugeborene Ferkel aus einer konventionellen Herde wurden verwendet, um die Wirkungen von Anti-eaeM-Antikörpern auf die bakterielle Adhärenz in vivo zu testen. 12 Ferkeln wurde vor der Infektion mit dem porcinen Stamm 1390 das Co lostrum vorenthalten, während die anderen 10 Ferkel vor der Infektion mit dem humanen EHEC-Stamm 85-170 mit Colostrum gefüttert wurden. Alle Ferkel wurden in Käfigen gehalten und während des Versuchs mit Kondensmilch gefüttert. Die Ferkel der Gruppe 1 (1390-Infektion) wurden mit 1 × 10¹⁰ KbE des 1390-EPEC-Stammes in 2 ml TSB-Bouillon für 2 Tage infiziert und erhielten dann zweimal täglich Eidotter von Hennen, die mit einem Sonikat bzw. Ultraschallbehandlungsprodukt aus dem PREp15-Stamm immunisiert worden waren, als eine Adhärenzpositive Kontrolle (n = 6) oder Eidotter aus Hennen, die mit EaeM-Fusionsprotein immunisiert worden waren, (n = 6). Die Ferkel der Gruppe 2 (85-170-Infektion) wurden mit 1 × 10¹⁰ KbE des 85-170-EHEC-Stammes in 2 ml TSB-Bouillon für 2 Tage infiziert und erhielten dreimal täglich in Milch rekonstituierte lyophilisierte Eidotter aus Hennen, die mit einem Sonikat des PREp4-Stammes immunisiert worden waren, als Adhärenz-positive Kontrolle (n = 5), oder in Milch-rekonstituierte lyophilisierte Eidotter aus Hennen, die mit EaeM-Fusionsprotein immunisiert worden waren, (n = 5). Die Ferkel wurden täglich auf jegliche klinischen Anzeigen für Diarrhoe überwacht und wurden 48 Stunden nach der Erstinfektion nekropsiert. Die Ferkel wurden mit Ketaminhydrochlorid beruhigt und dann mit einer Überdosis Pentobaribtal-Lösung eingeschläfert.
Ergebnisse und Diskussion
a) Produktion von Fusionsproteinen
Es ist in der Literatur eindeutig gezeigt worden, dass das Intimin (Eae) und die sekretierten Proteine Tir (Translocated intimin receptor), EspA, EspD und EspB Virulenzfaktoren sind, die eine bedeutende Rolle in der Pathogenese zahlreicher AEEC-Infektionen spielen und eine Antikörperreaktion hervorrufen könnten. Ferner haben die Erfinder ein neues Protein, bezeichnet als Paa (für "Porcine attaching and effacing associated"), entdeckt, das auch an der AEEC-Adhäsion an Wirtszellen beteiligt ist (siehe Abschnitt d). Diese verschiedenen Virulenzfaktoren wurden daher als gute Kandidaten für eine schützende Immunität und/oder als Marker in einem diagnostischen Test angesehen. Es wurde angenommen, dass es wichtig sein würde, ein Fusionsprotein zu produzieren, wobei nur das C-terminale Ende von Intimin (Eae-Carboxy), das an der Rezeptorerkennung beteiligt ist, verwendet wird. Somit wurden sieben (7) Fusionsproteine produziert, entsprechend den aufgelisteten Proteinen, im pQE30-Expressionsvektor, der einen His6-Tag im Leseraster an das N-terminale Ende der Proteine anfügt. Primerpaare, die für jeden der Virulenzfaktoren spezifisch waren, wurden ausgewählt, um die gesamten (Eae, EspA, EspB, EspD, Paa, Tir) oder einen Teil (Eae-Carboxy) der Proteine aus der genomischen DNA des enteropathogenen porcinen E. coli-Stammes 1390 mittels PCR zu amplifizieren. Die Fusionsproteine wurden mittels Western-Blot-Untersuchung detektiert, mit Anti-Histidin-Antikörpern und mit Antikörpern, die spezifisch gegen jeden der Virulenzfaktoren gerichtet waren, sichtbar gemacht. Jedoch wurde das His-Paa-Protein nur in geringer Menge detektiert. Da mittels des EXPASY-Programms vorhergesagt wird, dass Paa instabil ist, wurde eine Fusion mit dem stabilen C-terminalen Ende von Paa (Paa-Carboxy) durchgeführt.
Alle Fusionsproteine wurden dann in großem Maßstab produziert und auf einer Nickel-Affinitätssäule in hinreichenden Mengen für die Immunisierung von Hühnern und zur Verwendung als Antigene im ELISA gereinigt. Die gereinigten His-Eae-Carboxy-, His-Eae-, His-EspA-, His-EspB-, His-EspD-, His-Paa- und His-Tir-Proteine wurden erhalten.
b) Produktion und Reinigung der Eidotter-Antikörper
Die Immunisierung der Hühner und die Antikörperreinigungstechnik wurden ausgehend von modifizierten Techniken, wie sie in den Materialien und Methoden beschrieben sind, durchgeführt. Die SDS-PAGE-Analyse zeigte die Produktion von IgY bereits 28 Tage nach der Erstimmunisierung mit den Proteinen His-Eae-Carboxy, His-Eae, His-EspA, His-EspB, His-EspD, His-Paa und His-Tir.
c) Die Sensitivität und die Spezifität der Eidotter-Antikörper gegen jedes der Proteine
Die Western-Blot-Analyse zeigte, dass gereinigtes IgY homologe Fusionsproteine erkannte. Der Titer des spezifischen IgY für jedes Protein wurde dann mittels ELISA unter Verwendung homologer gereinigter Proteine als Antigen gemessen. Die ELISA-Untersuchungsbedingungen wurden für jedes Antigen bestimmt, und die Ergebnisse zeigten einen hohen Titer (> 1/25000) für jedes spezifische IgY nach 42 Tagen. Die Fähigkeit jedes Antikörpers, das korrespondierende native Antigen im homologen Stamm 1390 und in AEEC-Stämmen aus verschiedenen Tierarten zu detektieren, wurde auch untersucht. Es schien jedoch, dass die untersuchten Bedingungen und/oder die Antigen-Präsentation die Detektion einiger Virulenzfaktoren, wie z.B. Eae oder Paa, in Wildtypbakterien mittels ELISA nicht begünstigten.
d) Fähigkeit spezifischer Antikör er, die Entwicklun von A/E-Läsionen in vitro im Schwein-Ileum-Organkulturmodell zu verhindern
• Erarbeitung des Modells
Die erste Stufe dieser Arbeit war es, die Explantatkulturbedingungen zu bestimmen, die eine AEEC-Adhärenz an ileale und caecale Epithelzellen abgesetzter Ferkel erlauben würden. Es wurden unterschiedliche Bedingungen untersucht und eine schnelle Technik zur mikroskopischen Untersuchung von Gewebeschnitten mittels Lichtmikroskopie und Bestätigung mittels Elektronenmikroskopie wurde aufgebaut (siehe Materialien und Methoden). An Ileumexplantaten aus neugeborenen Ferkeln wurde eine höhere und beständigere Adhärenz des 1390-Stammes als an Explantaten aus abgesetzten Schweinen beobachtet. Folglich wurde das Neugeborenes-Schwein-Explantatmodell in den nachfolgenden Versuchen verwendet.
Die Erfinder haben gezeigt, dass AEEC-Stämme, die aus Kaninchen, Schwein, Hund, Rind und Mensch stammen (einschließlich Non-0157-EHEC und EPEC) und Eae der α-, β-, δ- oder ε-Subtypen produzieren, A/E-Läsionen gleichermaßen gut auf Ileumexplantaten aus einem neugeborenen Schwein induzierten (1). Spezifischer zeigt 1 den mittleren prozentualen Anteil intakter Villi, wobei die bakterielle Adhärenz auf Ileumexplantatschnitten gezeigt wird. Stämme aus verschiedenen Tierarten und aus Menschen zeigen eine ähnliche prozentuale Adhärenz im Vergleich zu dem homologen porcinen AEEC-Stamm 1390, abgesehen von jenen des 0157:H7-Serotyps (EC505, 43888, STJ348, 85-170, 43895, STJ854 und STJ919 im Diagramm). Alle außer den 0157:H7-Stämmen sind signifikant verschieden von dem Stamm ICC-170 mit der Mutation eae- (Negativkontrolle). Diese Daten validieren unser Modell für die Studie der Expression des Attaching-and-Effacing-Phänotyps sowie für homologe als auch für heterologe Stämme, abgesehen von jenen, die zum 0157:H7-Serotyp gehören. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± Standardabweichung des Mittelwerts dargestellt.
Andererseits adhärierten 0157:H7-AEEC-Stämme, die Eae des γ-Subtyps produzieren, in einem viel geringeren Ausmaß am Ileumepithel. Jedoch resultierte die Ersetzung des Eae des γ-Subtyps durch das Eae des α-Subtyps in einem 0157:H7-Stamm in der Induktion von A/E-Läsionen in einem ähnlichen Ausmaß, wie es für den homologen porcinen AEEC-Stamm beobachtet wurde (2). Spezifischer zeigt 2 die Effekte des Intimin-Subtypaustauschs von gamma zu alpha auf den mittleren prozentualen Anteil intakter Villi, die eine bakterielle Adhärenz des humanen 0157:H7-Stammes 85-170 zeigen, und zwar an Ileumexplantatschnitten. Der komplementierte Doppelmutanten-Stamm PCVD-438 (Intimin alpha aus dem humanen EPEC-Stamm E2348/69) zeigt eine ähnliche Adhärenz wie der homologe porcine Stamm 1390. PICC-55 ist ein gamma-Intimin-Subtypkomplementierter mutanter Stamm (ähnlich zu dem Wildstamm 85-170). Diese Daten bestätigen das Problem des gamma-Intimin-Subtyps beim Adhärieren an das Ileumexplantatmodell.
Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± Standardabweichung des Mittelwerts dargestellt. Diese Ergebnisse legen auch nahe, dass das Eae des γ-Subtyps der 0157:H7-Stämme Rezeptoren an porcinen ilealen Epithelzellen weniger gut erkennt als das Eae der anderen bekannten Subtypen. Nichtsdestoweniger bestätigen diese Ergebnisse, dass Schweineileumexplantate ein geeignetes Modell zur Untersuchung des Effekts spezifischer Antikörper auf die Bildung von A/E-Läsionen durch AEEC verschiedenen Ursprungs sind.
• Blockierung von A/E-Läsionen
Die Fähigkeit der spezifischen Antikörper, die Entwicklung von A/E-Läsionen ex vivo im Schweineexplantatkulturmodell und in vivo im Neugeborenes-Schwein-Infektionsmodell zu verhindern, wurde mit dem homologen porcinen Stamm 1390 und verschiedenen heterologen AEEC-Stämmen untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die Antikörper, die für das reife und den Carboxyterminus von Eae, Tir und Paa spezifisch sind, im Falle des homologen porcinen Stammes 1390 dazu fähig sind, die Entwicklung von A/E-Läsionen in Ileumexplantaten für den ho mologen Stamm 1390 zu blockieren (3). Spezifischer zeigt die 3 den Effekt von Antikörpern auf den mittleren prozentualen Anteil intakter Villi, die eine Adhärenz zeigen, wenn sie mit dem porcinen Stamm 1390 infiziert werden. 1390-Anti-T(–) ist eine Positivkontrolle für die Adhärenz. Die Ergebnisse zeigen eine signifikante Abnahme der bakteriellen Adhärenz (* an der Spitze der Säule) bei Anti-EaeC, Anti-EaeM, Anti-Tir und Anti-PaaM. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± Standardabweichung des Mittelwerts dargestellt. Ein Kruskal-Wallis-Test wurde mit einer im Handel verfügbaren Software durchgeführt und 2-mal-2-post hoc-Vergleiche wurden erstellt, um die Unterschiede zwischen den Gruppen zu beurteilen; P < 0,0001 wurde als signifikant angenommen.
Die Ergebnisse zeigen, dass die Antikörper, die für das reife und den Carboxyterminus von Eae, Tir und Paa spezifisch sind, im Falle des homologen porcinen Stammes 1390 dazu fähig sind, die Entwicklung von A/E-Läsionen in Ileumexplantaten bei allen der untersuchten AEEC-Stämme aus dem Kalb (4) und Mensch, wobei der letztere sowohl 0157:H7-EHEC- (5 und 6) und EPEC-Stämme (7) einschließt, in signifikanter Weise zu blockieren. Die Anti-EspA, Anti-EspB und Anti-EspD-Antikörper beeinträchtigten die Entwicklung von A/E-Läsionen durch einen beliebigen der untersuchten AEEC-Stämme nicht, mit Ausnahme eines humanen EPEC-Stammes bei dem die Anti-EspA-Antikörper die Entwicklung von A/E-Läsionen signifikant blockierten (7). Anti-Paa-Antikörper blockierten die Entwicklung von A/E-Läsionen durch diesen humanen EPEC-Stamm nicht, der Eae, aber kein Paa produzierte. Folglich wurden die Anti-reifes-Eae-, Anti-Tir- und Anti-Paa-Antikörper und möglicherweise die Anti-EspA-Antikörper als potentielle Kandidaten zum Blockieren der Entwicklung von A/E-Läsionen in vivo betrachtet.
Spezifischer zeigt 4 den Effekt von Antikörpern auf den mittleren prozentualen Anteil an intakten Villi, die eine Adhärenz zeigen, wenn sie mit dem bovinen Stamm B00-H854 infiziert werden. B00-H854 stellt den Stamm alleine dar, während B00-H854-Anti-T(–) eine Positivkontrolle für die Adhärenz ist. Die Ergebnisse zeigen eine signifikante Abnahme der bakteriellen Adhärenz (* über der Säule) bei Anti-EaeC, Anti-EaeM und Anti-Tir und, in einem geringeren Ausmaß, bei Anti-PaaM. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± Standardabweichung des Mittelwerts angegeben. Ein Kruskal-Wallis-Test wurde mit einer im Handel erhältlichen Software durchgeführt, und es wurden post hoc-2-mal-2-Vergleiche gemacht, um Unterschiede zwischen den Gruppen zu beurteilen; P < 0,0001 wurde als signifikant angenommen.
5 zeigt die Wirkung von Antikörpern auf den mittleren prozentualen Anteil intakter Villi, die Adhärenz zeigen, wenn sie mit dem humanen 0157:H7-EHEC-Stamm STJ348 infiziert werden. STJ348 stellt den Stamm alleine dar, während STJ348-Anti-T(–) eine Positivkontrolle für die Adhärenz ist und ICC-170 ein eae- mutanter Stamm ist, der als eine Negativkontrolle verwendet wurde. Die Ergebnisse zeigen eine signifikante Abnahme der bakteriellen Adhärenz (* über der Säule) bei Anti-Tir, Anti-EaeM und, in einem geringeren Ausmaß, bei Anti-PaaC und Anti-EaeC. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± Standardabweichung des Mittelwerts dargestellt. Ein Kruskal-Wallis-Test wurde mit einer im Handel erhältlichen Software durchgeführt, und es wurden post hoc-2-mal-2-Vergleiche gemacht, um Unterschiede zwischen den Gruppen zu beurteilen; P < 0,0001 wurde als signifikant angenommen.
6 zeigt den Effekt von Antikörpern auf den mittleren prozentualen Anteil intakter Villi, die Adhärenz zeigen, wenn sie mit dem humanen 0157:H7-EHEC-Stamm 85-170 infiziert werden. 85-170 stellt den Stamm alleine dar, während 85-170-Anti-T(–) eine Positivkontrolle für die Adhärenz ist und ICC-170 ein eae- mutanter Stamm ist, der als Negativkontrolle verwendet wurde. Die Ergebnisse zeigen eine signifikante Abnahme der bakteriellen Adhärenz (* über der Säule) bei Anti-EaeM, Anti-Tir und, in einem geringeren Ausmaß, bei Anti-EaeC und Anti-PaaM. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± Standardabweichung des Mittelwerts dargestellt. Ein Kruskal-Wallis-Test wurde mit einer im Handel erhältlichen Software durchgeführt, und es wurden post hoc-2-mal-2-Vergleiche gemacht, um Unterschiede zwischen den Gruppen zu beurteilen; P < 0,0001 wurde als signifikant angenommen.
Darüber hinaus zeigt 7 den Effekt von Antikörpern auf den mittleren prozentualen Anteil intakter Villi, die Adhärenz zeigen, wenn sie mit dem humanen EPEC-Stamm E2348/69 infiziert werden. E2348/69 stellt den Stamm alleine dar, während E2348/69-Anti-T(–) eine Positivkontrolle für die Adhärenz ist. Die Ergebnisse zeigen eine signifikante Abnahme der bakteriellen Adhärenz (* über der Säule) bei Anti-EspA, Anti-EaeC, Anti-Tir und Anti-EaeM. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± Standardabweichung des Mittelwerts dargestellt. Ein Kruskal-Wallis-Test wurde mit einer im Handel erhältlichen Software durchgeführt, und es wurden post hoc-2-mal-2-Vergleiche gemacht, um Unterschiede zwischen den Gruppen zu beurteilen; P < 0,0001 wurde als signifikant angenommen.
e) Fähigkeit geeigneter Eidotter-Antikörper, die Entwicklung von intestinaler Kolonisierung und Diarrhoe in vivo in den experimentellen Infektionsmodellen mit neugeborenen und abgesetzten Schweinen zu verhindern
Da in vivo-Provokationsexperimente an Schweinen teuer und zeitaufwändig sind, haben sich die Erfinder dazu entschieden, sich auf die Bewertung des Effekts der Anti-Eae-Antikörper auf die Entwicklung von A/E-Läsionen in vivo zu konzentrieren. Unter Verwendung des Modells mit neugeborenen Ferkeln, denen das Colostrum vorenthalten wurde ("colostrum-deprived newborn piglet model"), wurde gezeigt, dass eine orale Verabreichung der gereinigten Anti-Eae-Eidotter-Antikörper die Entwicklung von A/E-Läsionen im Caecum und Colon von Ferkeln, die mit dem homologen porcinen AEEC-Stamm provoziert wurden, signifikant inhibierte (8A und 8B). Spezifischer zeigt 8A die Antikörpereffekte im Caecum, während 8B die Antikörpereffekte im Colon zeigt. Anti-T(–)-Ergebnisse sind von Ferkeln (n = 6), die Eidotter aus nicht-immunisierten Hennen erhielten und stellen eine Positivkontrolle für die Adhärenz dar, während Anti-EaeM Ferkel (n = 6) wiedergibt, die Eidotter erhielten, die Anti-EaeM-Antikörper, gerichtet gegen reifes Intimin, enthielten. Die Ergebnisse zeigen eine signifikante Abnahme der bakteriellen Adhärenz bei Anti-EaeM im Vergleich zu Anti-T(–). Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± Standardabweichung des Mittelwerts dargestellt. Die statistische Analyse ist noch im Gange.
Da 0157:H7-AEEC-Stämme eine bedeutende Ursache für Probleme bei Menschen sind, wurde entschieden, sich auch auf die Beurteilung des Effekts der Anti-Eae-Antikörper auf die Entwicklung von A/E-Läsionen in vivo in einem 0157:H7-Schweineprovokationsmodell zu konzentrieren. Es ist zuvor gezeigt worden, dass 0157:H7-Stämme A/E-Läsionen in Colostrum-gefütterten Ferkeln in einem größeren Ausmaß induzieren als in Ferkeln, denen das Colostrum vorenthalten wurde. Unter Verwendung eines Modells mit Colstrum-gefütterten 3-Tage-alten Schweinen haben die Erfinder gezeigt, dass eine orale Verabreichung der gereinigten Anti-Eae-Eidotterantikörper auch die Entwicklung von A/E-Läsionen im Caecum und Colon von Ferkeln, die mit einem 0157:H7-REEC-Stamm provoziert wurden, inhibierte (9A und 9B). Spezifischer zeigt 9A die Antikörpereffekte im Caecum, während 9B die Antikörpereffekte im Colon zeigt. Anti-T(–)-Ergebnisse stammen von Ferkeln (n = 5), die lyophilisierte Eidotter aus nicht-immunisierten Hennen erhielten und stellen eine Positivkontrolle für die Adhärenz dar, während Anti-EaeM Ferkel (n = 5) darstellt, die lyophilisierte Eidotter erhielten, die Anti-EaeM-Antikörper, gerichtet gegen reifes Intimin, enthielten. Die Ergebnisse zeigen eine Abnahme der bakteriellen Adhärenz bei Anti-EaeM im Vergleich zu Anti-T(–). Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± Standardabweichung des Mittelwerts dargestellt. Die statistische Analyse ist noch im Gange.
Schlussfolgerung
Somit haben die Erfinder erstmalig gezeigt, dass oral verabreichte Antikörper, die für AEEC-Virulenz-assoziiertes Protein, wie z.B. das Adhäsin Eae, spezifisch sind, dazu fähig sind, die Entwicklung von A/E-Läsionen im lebenden Tier zu inhibieren. Darüber hinaus haben sie gezeigt, dass Antikörper, die für das Eae des β-Subtyps, produziert durch eine aus einem Schwein stammende AEEC, spezifisch sind, dazu fähig sind, die Entwicklung von A/E-Läsionen durch eine 0157:H7-AEEC humanen Ursprungs, die Eae des γ-Subtyps produziert, zu inhibieren. Insgesamt zeigen diese ex vivo- und in vivo-Ergebnisse, dass Antikörper, die für das Eae und Tir der porcinen AEEC spezifisch sind, für die Inhibierung der Entwicklung von A/E-Läsionen durch AEEC-Infektionen in den verschiedenen Tierarten und in Menschen verwendbar sind. Für Paa spezifische Antikörper sind zumindest für die Inhibierung der Entwicklung von A/E-Läsionen durch die AEEC, die homolog zu dem für die Herstellung der Paa-Antikörper verwendeten Stamm sind, verwendbar. Tabelle 1. Serogruppen und Serotypen von AEEC
Tabelle 2. Bakterienstämme und Merkmale
Tabelle 3. Primer und PCR-Produkte
Obgleich bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung hierin im Detail beschrieben und durch die begleitenden Figuren erläutert wurden, ist festzustellen, dass die Erfindung nicht auf diese genauen Ausführungsformen beschränkt ist und dass zahlreiche Änderungen und Modifikationen darin bewerkstelligt werden können, ohne vom Umfang der vorliegenden Erfindung, wie er in den Ansprüchen definiert ist, abzuweichen.

Claims

IgY-Antikörper, immunologisch spezifisch für ein Attaching-and-Effacing-Escherichia coli (AEEC)-Virulenz-assoziiertes Protein, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Eae, Tir, EspA und Paa, wobei der Antikörper eine(r) intestinale(n) AEEC-Infektion in vivo verhindert bzw. vorbeugt, wenn er einem Säuger verabreicht wird.
Antikörper nach Anspruch 1, wobei der Antikörper die Adhäsion von AEEC an das Intestinum des Säugers verhindert.
Antikörper nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei der Antikörper die Entwicklung von intestinalen Attaching-and-Effacing (A/E)-Läsionen, die mit den AEEC zusammenhängen, verhindert.
Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Antikörper oral verabreicht wird.
Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Antikörper beständig gegenüber gastro-intestinaler Verdauung ist.
Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Säuger ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Menschen, Schweinen, Rindern, Schafen, Ziegen, Kaninchen, Hunden und Katzen.
Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Säuger ein Mensch ist.
Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das AEEC ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus enteropathogenen E. coli (EPEC)-Stämmen und enterohämorrhagischen E. coli (EHEC)-Stämmen.
Geflügelei, enthaltend einen IgY-Antikörper, wie er in einem der Ansprüche 1 bis 8 definiert ist.
Geflügelei, wobei das Ei von einem Geflügel bzw. Vogel, immunisiert gegen wenigstens ein AEEC-Virulenz-assoziiertes Protein, erhalten wird.
Geflügelei, wobei das Geflügel bzw. der Vogel ein Huhn ist.
Isolierter Dotter eines Geflügeleis nach einem der Ansprüche 9 bis 11.
Zusammensetzung, umfassend: – wenigstens ein Element, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: – einem IgY-Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 8; – einem Geflügelei nach einem der Ansprüche 9 bis 11; – einem isolierten Dotter nach Anspruch 12; und – ein(en) biologisch verträglichen/verträgliches Träger oder Vehikel.
Zusammensetzung nach Anspruch 13, wobei die Zusammensetzung formuliert ist, um einem Säuger oral verabreicht zu werden.
Zusammensetzung nach Anspruch 13 oder 14, wobei die Zusammensetzung in der Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 13 oder 14, wobei Zusammensetzung in der Form einer Nutraceutical-Zusammensetzung formuliert ist.
Lebensmittelzusatz, umfassend wenigstens ein Element, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: – einem IgY-Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 8; – einem Geflügelei nach einem der Ansprüche 9 bis 11; – einem isolierten Dotter nach Anspruch 12; und – einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 13 bis 16.
Verfahren zum Erhalten eines IgY-Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Verfahren die Stufen a) aktives Immunisieren einer Geflügelhenne, um die Produktion von Antikörpern in einem Ei der Henne auszulösen; und b) Gewinnen der Antikörper aus dem Ei umfasst.
Verfahren nach Anspruch 18, umfassend weiterhin die Stufe des Verabreichens wenigstens eines Boosters wenigstens eines AEEC-Virulenz-assoziierten Proteins, um einen hyperimmunen Zustand in der Nenne aufrechtzuerhalten.
Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, umfassend weiterhin die Stufe der Reinigung der Antikörper aus einer Dotterfraktion des Eis.
Verwendung wenigstens eines Elements, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: – einem IgY-Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 8; – einem Geflügelei nach einem der Ansprüche 9 bis 11; und – einem isolierten Dotter nach Anspruch 12; bei der Herstellung einer Zusammensetzung zum Verhindern einer Säuger-AEEC-Infektion.