JP3946143B2 - 抗−混合菌免疫蛋白質を保有した卵の生産方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は，腸炎を誘発させる大腸菌(E.coli)，胃炎菌のヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)及び食中毒を誘発させるサルモネラ菌(Salmonella enteritidis and Salmonella typmurium)を抗原化させて幼いひよこに同時に接種することで，胃炎，腸炎及び食中毒を予防することができる抗−病原性バクテリア抗体(IgY)を卵一つに共有させる生産技術，独立的に4種類の抗原をひよこにそれぞれ接種した後，生産された各特殊抗体を適正割合に混合した抗−病原性バクテリア抗体の粉末組成物及び，該抗−病原性バクテリア抗体を有効性分とするヨーグルト，アイスクリーム等の乳加工食品に関するものである。
【０００２】
また，本発明は，前記抗−病原性バクテリア抗体を抽出するための方法であって，特殊抗体(抗−病原性バクテリア抗体)を含有する卵黄を蒸留水により1：1に希釈した後，該希釈溶液に水溶性蛋白質及び燐脂質を十分に分離し得る所定量の硫酸アンモニウムを添加することを特徴とする，IgY含有水溶性蛋白質及び燐脂質の分離方法及び，その分離方法により分離された溶液を蒸留水だけにより所定倍率に再び希釈した後，所定温度で静置させ沈澱させて精製することを特徴とする，卵黄の色素及び水溶性蛋白質の分離方法に関するものである。
【０００３】
【従来の技術】
本発明と関連して，現在まで報告された大腸菌(Enterotoxigenic E.coli：腸管毒素原性大腸菌)関連資料を調べて見ると，人体及び家畜の腸内に常駐する正常常駐菌種の一つの大腸菌は，小児だけでなく健康な成人にも胃腸炎と関連される原因菌として知られている。
【０００４】
現在まで人の下痢原因大腸菌としては，次の5種類が報告されている。腸管病原性大腸菌(以下，EPECと略称す：Enteropathogenic E.coli)，腸管侵入性大腸菌(以下，EIECと略称す：Enteroinvasive E.coli)，腸管毒素原性大腸菌(以下，ETECとする：Enterotoxigenic E.coli)，腸管出血性大腸菌(以下，EHECと略称す：Enterohemorrhageic E.coli)，腸管付着性大腸菌(以下，EAECと略称す：Enteroadhesive E.coli)である。
【０００５】
1923年，アダム(Adam)は，乳児の下痢患者から大腸菌を分離し，その菌が胃腸炎と関連すると報告し，1940年代の半ばには主に英国で大腸菌による集団下痢が乳児院から発生され，それら一群の大腸菌を腸管出血性大腸菌(Enteropathogenic E.coli)と呼んだのはニター(Neter)等が最初であって，病原性大腸菌と呼ぶようになった。
【０００６】
従来の大腸菌特許に関する技術を要約すると次の通りである。
【０００７】
キムジョンウ(1999)等は，豚からのETEC K88菌株の抗原及び卵の卵黄中の免疫グロブリン(IgY)を利用して卵黄抗体を製造し，それを効果的に分離する技術を提供することを目的とする特許を出願した。また，キムジョンウ(1999)等は，豚からのETEC K99菌株，K88菌株の抗原及び卵の卵黄中の免疫グロブリン(IgY)を利用して卵黄抗体を製造し，それを効果的に分離する技術を提供することを目的とする特許を出願した。また，キムジョンウ(1999)等は，豚からのETEC 987p菌株，K88菌株の抗原及び卵の卵黄中の免疫グロブリン(IgY)を利用して卵黄抗体を製造し，それを効果的に分離する技術を提供することを目的とする特許を出願した。その他に，コダマヨシカズ(1998)は，腸管出血性大腸菌(ETHC)による感染症の予防及び治療に利用するために，腸管出血性大腸菌細胞全体及び抗原としてベロ毒素に対して免疫された鶏が産んだ卵から得た抗体IgYを利用する特許を出願した。
【０００８】
一方，十二指腸炎を誘発させる腸炎菌のヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)の予防治療剤として開発された世界各国の特許から一部を要約すると次の通りである。
【０００９】
胃炎及び十二指腸炎の治療を抗原抗体反応により解決しようという努力が継続されており，コラー等は，ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)に起因する胃炎や消化器官潰瘍治療用の免疫グロブリンを哺乳動物の乳房分泌物から分離した(1992)。タイヨーカガクシャは，産卵鶏にヘリコバクター・ピロリ(H.pylori)を抗原化した後，免疫させることで特殊抗体を得(1992)，この時に使用された抗原はヘリコバクター・ピロリバクテリア(H.pylori bacteria)ATCC菌株43504，43506，43579及び43629であった。
【００１０】
最近では，サルモネラ腸炎菌(S.enteritidis)，ネズミチフス菌(S.typmurium)及び大腸菌などのような人獣共通伝染病中，腸管内病原性微生物による人の被害が日増しに深刻化しているのが実情である。
【００１１】
食中毒の原因中，最も発生頻度の高いものは細菌性食中毒である。食中毒の主要原因菌としては，サルモネラ，腸炎ビブリオ及びブドウ状球菌が挙げられ，腸管内病原微生物中，人の食中毒発生原因となる細菌としては，サルモネラが最も高い頻度を示す。サルモネラによる食中毒は，全体患者数の37.7％に達する。主な食中毒の原因菌中，腸炎ビブリオによるものは夏に集中的に現れるのに対し，サルモネラによる食中毒は年中発生報告があるので，その重要性が認められる。北米を始めとして南米やヨーロッパでもサルモネラによる食中毒被害は継続的に発生しており，過去の保菌率に比べ，肉類の大量流通網形成，環境汚染の増加及び給食などの大単位食習慣形態が増えることで発生及び保菌率が増大している状況である。
【００１２】
サルモネラ中，制限された宿主領域を有している血清型の錘白狸菌及び家禽チフス菌を除いた残り2，400余種の血清型は特別な宿主領域を持たず，如何なる環境下でも最小一種類以上の動物に感染または汚染されているため，それらの根本的な除去は不可能である。サルモネラ菌種中，サルモネラ腸炎菌(Salmonella enteritidis)及びネズミチフス菌(Salmonella typumrium)が食中毒の主原因として報告されている(国立保健院感染病発生情報誌，キムホフン(1997))。一般に，卵の外部からの(on egg infection)感染経路が大部分を占めるが，卵内伝染(in egg infection)もサルモネラ感染症では発生する。特に，サルモネラ腸炎菌及びネズミチフス菌の場合は，卵巣に感染されていたものが卵の卵黄に移行して現れた例があるものであって，その重要性がより強調される。従って，それを除去することは，直ちに疾病発生の連結輪を遮断し得ることになるので，サルモネラ由来食中毒に対する予防の基本となる。
【００１３】
サルモネラと関連する従来技術としては，ソンキョンビン (2000)が，サルモネラ腸炎菌のATFAサブユニットのマルトース結合蛋白質と融合された蛋白質の大腸菌での発現により特許を出願した。これは鶏で最も問題とされる疾病のサルモネラ感染に対する診断用キット及びワクチンの開発に利用するためのものである。(出願番号：10-2000-024818)。
【００１４】
上述したように，ヘリコバクター及びサルモネラ菌の成長抑制を図るために抗生剤及び天然物質を利用するなどの多様な方法が研究されているが，その効能評価では一定な結論が得られていないのが実情である。併し，毎年食中毒問題は発生しており，根本的に，卵にサルモネラ抗体及び他の抗体を同時に含有させることで，より効果的な予防策を提示することができる。
【００１５】
また，一般には，或る一定した菌に対する抗体を生成し，その生成された抗体を利用して治療を行うことが最も理想的な方法として知られているが，それぞれの抗体を生産することが難しく，また，抗体分離などの問題を産業的に解決することができないという問題点があった。
【００１６】
もう一つの発明の関連する従来の技術を説明すると，抗−病原性バクテリア抗体の一種のIgYを含有した卵黄から蛋白質及び燐脂質を分離する方法であって，卵黄の蛋白質は15〜17％を占め，α，β，γ-リベチン (livetin)の三種類の蛋白質が主成分である。この中でγ-リベチン (livetin)は，IgG系列の抗−病原性バクテリア抗体であって卵黄に存在すると知られ(Poson等，1980)，一般にIgYとして知られている。また，IgYは，選択的に口腔摂取が可能な抗−病原性バクテリア抗体である(McBee等，1979)。IgYを分離するための第一段階は，卵黄の脂質(lipid)及びリポ蛋白質(lipoprotein)の除去である。それらを除去するための方法としては，ウルトラ遠心分離によるリポ蛋白質(lipoprotein)の分離(Bade，1984)，有機溶媒による脂肪除去(Polson等，1980)，PEG(ポリエチレングリコール;polyethyleneglycol)やナトリウムデキストラン硫酸 (sodium dextran sulfate)またはキサンタン・ガム (xanthan gum)によりリポ蛋白質(lipoprotein)を沈澱させる方法(ハチダ等，1993)が挙げられ，特に，増粘安定剤として食品に広用されている天然多糖類のカラゲナン(carrageenan；強力な卵黄のリポ蛋白質凝集活性力を有する)を利用した方法など(Hansen等，1998)が挙げられる。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
上述したような従来の方法は，卵黄から水溶性蛋白質及び脂質を分離するために広用されている技術であるが，分離・精製の大量生産のための産業的規模では前記各方法では効率が少なく非経済的(生産コストが高い)であるという問題点があった。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
本発明は，このような従来の技術的課題を解決するためになされたもので，１個の卵に4種類または3種類の抗−病原性バクテリア抗体(抗−大腸菌IgY，抗−ヘリコバクター・ピロリIgY，抗−サルモネラ腸炎菌IgY及び抗−ネズミチフス菌IgY，または，抗−大腸菌IgY，抗−サルモネラ腸炎菌IgY及び抗−ネズミチフス菌IgY)を同時に含有する共有方法及びそれら4種類または3種類の抗−病原性バクテリア抗体を含有した卵の生産方法並びに，前記抗−病原性バクテリア抗体を含むヨーグルト及びアイスクリーム等の乳加工食品を提供しようとする。
【００１９】
また，本発明は，卵黄から水溶性蛋白質を分離する方法において，従来技術とは異なって遠心分離機及び沈殿剤を使用しないだけでなく，無毒性の硫酸アンモニウム及び蒸留水を利用して大量に抗−病原性バクテリア抗体(IgY)の分離及び精製を容易に行うことが出来る。
【００２０】
上述した技術的課題を達成するための本発明の構成は，
(1) 大腸菌抗原，サルモネラ腸炎菌抗原，ネズミチフス菌抗原及びヘリコバクター・ピロリ抗原を水酸化アルミニウムにより所定割合に乳化させた混合菌乳化液1mlをひよこの片方側脚に1回接種し，2回目からは乳化アジュバント(ISA25)を使用した混合菌乳化液を1週間隔に1mlずつ2回接種した後，成長した産卵鶏に3カ月間隔に前記乳化アジュバント(ISA25)を使用した混合菌乳化液を前記混合菌乳化液と同一割合に0.5mlずつ2回接種することを包含して合計5回接種する方法であって，生産された1個の卵に，抗−大腸菌，抗−サルモネラ腸炎菌，抗−ネズミチフス菌及び抗−ヘリコバクター・ピロリの抗−病原性バクテリア抗体を同時に共有させることを特徴とする，抗−病原性バクテリア抗体を含有した卵の生産方法に関するもので，より詳しくは，前記ひよこに接種された菌体数は，大腸菌抗原：サルモネラ腸炎菌抗原：ネズミチフス菌抗原：ヘリコバクターピロリ抗原：乳化アジュバントの比率を1.5：1：1：3.5：3とし，4.0×108／mlの大腸菌の死菌液抗原0.15ml，4。0×108／mlのサルモネラ腸炎菌の死菌液抗原0.10ml，4.0×108／mlのネズミチフス菌の死菌液抗原0.10ml及び4.0×108／mlのヘリコバクター・ピロリの死菌液抗原0.35mlを水酸化アルミニウム0.3mlに乳化させた混合菌乳化液1mlを1回接種し，2回目からは1週間隔に乳化アジュバント(ISA25)を使用した前記混合菌乳化液と同一割合に混合した混合菌乳化液1mlずつ2回接種した後，成長した産卵鶏の脚に，前記と同一割合に，2.0×108／mlの大腸菌の死菌液抗原0.15ml，2.0×108／mlのサルモネラ腸炎菌の死菌液抗原0.10ml，2.0×108／mlのネズミチフス菌の死菌液抗原0.10ml，2.0×108／mlのヘリコバクター・ピロリの死菌液抗原0.35ml及び乳化補助液(ISA25)0.3mlにより製造した混合菌乳化液を3カ月間隔に0.5mlずつ2回接種することを包含して合計5回を接種して，抗−病原性バクテリア抗体を含有した卵を生産する方法に関するものである。
【００２１】
（2）もう一つの発明は，大腸菌抗原，サルモネラ腸炎菌抗原，ネズミチフス菌抗原及びヘリコバクター・ピロリ抗原の4種類の抗原を完全フロインドアジュバント (Freund's complete adjuvant)により乳化させた所定比率の混合菌乳化液1mlをひよこの片方側脚に1回接種し，2回目からは不完全フロインドアジュバント(Freund's incomplete adjuvant)を使用した混合菌乳化液を前記混合菌乳化液と同一割合にして1mlずつ2週間隔に2回接種した後，成長した産卵鶏に3カ月間隔に前記混合菌乳化液と同一割合に0.5mlずつ2回接種することを包含して合計5回接種する方法により，抗−病原性バクテリア抗体を含有した卵を生産する方法に関するものである。
【００２２】
（３）もう一つの発明は，前記(1)，(2)の卵生産方法と同様の方法により抗原を接種して特殊抗体を生産するが，前記4種類の抗原の代りに大腸菌抗原，サルモネラ腸炎菌抗原及びネズミチフス菌抗原の，すなわち，3種類の抗原を接種する点に特徴がある。
【００２３】
（4）もう一つの発明は，抗−病原性バクテリア抗体を同時に共有した卵の卵黄35gを250mlの瓶に入れた後，アルカリイオン水(pH9)35mlを添加して攪拌し，24時間低温(5-10℃)で放置した後，卵黄及びアルカリイオン水(1：1)の混合溶液の上澄液に18倍(1260ml)以上のアルカリイオン水(pH10)を更に混合し，48時間放置して水溶性抗−病原性バクテリア抗体を抽出した後，上澄液をウルトラフィルタレーション(Ultra filteration)システムでホロー・ファイバー(Hollow fiber)膜分離方法により濃縮して凍結乾燥することを特徴とする。
【００２４】
その他の抗−病原性バクテリア抗体の分離方法は，抗−病原性バクテリア抗体(IgY)を含有した卵から分離させた卵黄を蒸留水により所定比率に１次希釈した後，前記卵黄及び蒸留水の希釈溶液に，水溶性免疫蛋白質及び燐脂質が充分に分離されるように硫酸アンモニウムを添加して，所定期間，所定温度下で静置させて分離した上層部(脂質)を除去した分離液を再び蒸留水により所定割合に２次希釈した後，所定温度下で静置させ沈澱させて分離／精製する方法に関するもので，より好ましくは，前記蒸留水と卵黄の希釈倍率は1：1であるか，または，前記硫酸アンモニウムの添加量は3〜10％であることを特徴とする。特に，最適の硫酸アンモニウム添加量は5％〜6％である。
【００２５】
（5）もう一つの発明は，大腸菌抗原：乳化アジュバントの比率を1：1とし，サルモネラ腸炎菌抗原：乳化アジュバントの比率を1：1とし，ネズミチフス菌抗原：乳化アジュバントの比率を1：1とし，ヘリコバクター・ピロリ抗原：乳化アジュバントの比率を1：1として，2.0×108／mlの大腸菌の死菌液抗原0.5ml及び完全フロインドアジュバント (Freund’s complete adjuvant)0.5mlを，2.0×108／mlのサルモネラ腸炎菌抗原0.5ml及び完全フロインドアジュバント (Freund’s complete adjuvant)0.5mlを，2.0×108／mlのネズミチフス菌抗原0.5ml及び完全フロインドアジュバント (Freund’s complete adjuvant) 0.5mlを，2.0×108／mlのヘリコバクター・ピロリ抗原0.5ml及び完全フロインドアジュバント (Freund’s complete adjuvant)0.5mlを，それぞれ個別的に乳化させた後，個別的に菌体数108／mlが含まれた前記個別菌乳化液1mlを各ひよこの片方側脚に1回接種し，2週目からは不完全フロインドアジュバント (Freund’s incomplete adjuvant)を前記と同一割合に個別的に乳化させた前記個別菌乳化液を1mlずつ2週間隔に2回接種した後，成長した産卵鶏の片方側脚に，3カ月間隔に2.0×108／mlの大腸菌の死菌液抗原0.5ml及び不完全フロインドアジュバント (Freund’s incomplete adjuvant)0.5mlを，2.0×108／mlのサルモネラ腸炎菌抗原0.5ml及び不完全フロインドアジュバント (Freund’s incomplete adjuvant)0.5mlを，2.0×108／mlのネズミチフス菌抗原0.5ml及び不完全フロインドアジュバント (Freund’s incomplete adjuvant)0.5mlを，2.0×108／mlのヘリコバクター・ピロリ抗原0.5ml及び不完全フロインドアジュバント (Freund’s incomplete adjuvant)0.5mlを，それぞれ個別的に乳化させて製造した個別菌乳化液を0.5mlずつ2回接種することを包含して合計5回接種する方法であって，生産された抗−病原性バクテリア抗体を含有した各卵の卵黄から抽出したそれぞれの水溶性抗−病原性バクテリア抗体(crude IgY)粉末(ヘリコバクタSー・ピロリ：大腸菌：サルモネラ腸炎菌：ネズミチフス菌)を配合したことを特徴とする，抗−病原性バクテリア抗体粉末の混合組成物に関するものである。
【００２６】
また，大腸菌抗原：乳化アジュバントの比率を1：1とし，サルモネラ腸炎菌抗原：乳化アジュバントの比率を1：1とし，ネズミチフス菌抗原：乳化アジュバントの比率を1：1とし，ヘリコバクター・ピロリ抗原：乳化アジュバントの比率を1：1として，2.0×108／mlの大腸菌の死菌液抗原0.5ml及び水酸化アルミニウム0.5mlを，2.0×108／mlのサルモネラ腸炎菌抗原0.5ml及び水酸化アルミニウム0.5mlを，2.0×108／mlのネズミチフス菌抗原0.5ml及び水酸化アルミニウム0.5mlを，2.0×108／mlのヘリコバクター・ピロリ抗原0.5ml及び水酸化アルミニウム0.5mlを，それぞれ個別的に乳化させた後，個別的に菌体数108／mlが含まれた前記乳化液1mlを各ひよこの片方側脚に1回接種し，2週目からは乳化アジュバント(ISA25)を前記と同一割合にそれぞれ個別的に乳化させた前記個別菌乳化液を1mlずつ2週間隔に2回接種した後，成長した産卵鶏の片方側脚に，3カ月間隔に2.0×108／mlの大腸菌の死菌液抗原0.5ml及び乳化アジュバント(ISA25)0.5mlを，2.0×108／mlのサルモネラ腸炎菌抗原0.5ml及び乳化アジュバント(ISA25)0.5mlを，2.0×108／mlのネズミチフス菌抗原0.5ml及び乳化アジュバント(ISA25)0.5mlを，2.0×108／mlのヘリコバクター・ピロリ抗原0.5ml及び乳化アジュバント(ISA25)0.5mlを，それぞれ個別的に乳化させて製造した個別菌乳化液を0.5mlずつ2回接種することを包含して合計5回接種する方法であって，生産された抗−病原性バクテリア抗体を含有した各卵の卵黄から抽出したそれぞれの水溶性抗−病原性バクテリア抗体(crude IgY)粉末(ヘリコバクター・ピロリ：大腸菌：サルモネラ腸炎菌：ネズミチフス菌)を配合したことを特徴とする，抗−病原性バクテリア抗体粉末の混合組成物に関するものである。
【００２７】
（6）もう一つの発明は，前記 (1)，(2)，(3)及び(4)の卵生産方法により生産された抗−病原性バクテリア抗体を同時に共有した卵，卵黄，卵黄から抽出した抗−病原性バクテリア抗体及び前記(5)の免疫蛋白質の混合物並びに前記抗−病原性バクテリア抗体(IgY)を有効性分とするヨーグルト，アイスクリームなどの乳加工食品及び食品添加剤を製造することをその特徴とする。
【００２８】
以下，実施例，図面及び表に基づいて本発明の構成をより具体的に説明するが，それら実施例や図面により本発明の請求範囲が限定されるものではない。
【００２９】
【発明の実施の形態】
実施例１
1。大腸菌(Enteropathogenic E.coli)の分離同定及び抗原製造
（イ）人からの大腸菌(Enterotoxigenic Escherica coli；ETEC)分離及び同定本試験に用いられた大腸菌は人から分離した。即ち，抗原として用いられた大腸菌(Enterotoxigenic E.coli)は，下痢症状を表した小児の糞便から分離した。菌の分離は次のような方法により行った。小児の下痢糞便を血液寒天培地に塗抹した後，37℃の恒温器で18時間培養してα-溶血性を表す一つの大腸菌集落を選択した。選択された集落はマッコンキー培地(MacConkey agar)でピンク色の集落に成長され，EMB培地(EMB agar)に塗抹して鉄緑色(metallic green)に成長する大腸菌の特異的な集落性状を確認した。
【００３０】
（ロ）毒素(Toxin)生産能の確認
大腸菌(E.coli)の腸管毒素原性(Enterotoxigenicity)の主要原因である腸管性毒素(Enterotoxin)の生産能を重合酵素反応(Polymerase chain reaction；以下，PCRと略称す)技法を利用して確認した。熱安全性毒素(heat stable toxin；以下，STと略称す)のSTa1遺伝子及び熱不安定性毒素(heat lable toxin；以下，LTと略称す)のLTh遺伝子に対する特異原形体(Primer)を用いた多複合(multiplex)PCR技法を利用して増幅した。
【００３１】
ここで，ST毒素確認用原形体は，
sense primer；CCCCTCTTTTAGTCAGTC
anti-sense primer；CCAGCACAGGCAGGATTACA
165bpsの最終産物を増幅するように作製されたものを使用した。
【００３２】
また，LT毒素確認用原形体は，
sense primer；CAGACTATCAGTCAGAGGTTG
anti-sense primer；TTCATACTGATTGCCGCA
417bpsの最終産物を増幅するように作製されたものを使用した。
【００３３】
PCR条件は，前−変性温度(Pre-denaturation temperature)は95℃の温度下で5分間，変性温度(Denaturation temperature)は94℃の温度下で1分間，併合温度(Annealing temperature)は56℃の温度下で1分間，延長温度(Elongation temperature)は72℃の温度下で1分間，後−延長温度(Post-elongation temperature)は72℃の温度下で10分間，行った。増幅された産物は，2％の寒天ゲル(agarose gel)を利用した電気泳動により確認した。本発明に用いられた分離菌株はST毒素を生産することが確認された。この大腸菌をEB-E01と命名した。
【００３４】
（ハ）大腸菌ETEC(Enterotoxigenic E.coli)の抗原製造
大腸菌ETEC菌株をトリプティケースソイ培地(Trypticase soy agr)に接種し，37℃の恒温器で18時間培養した後，一つの集落(colony)を5mlのトリプティケースソイ培養液(Trypticase soy broth)に接種した。2時間後，大量のトリプティケースソイ培養液に接種して，37℃で48時間静置培養した。培養された菌液はホルムアルデヒド(formaldehyde)を総量の5％となるように混ぜ，室温で24時間不活化させた。不活化された菌液は4，000rpmで20分間遠心分離して菌を収穫した後，滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (phosphate buffered saline；以下，PBSと略称す)(pH7.2)により3回洗浄した。収穫された菌体は410nmでO.D.(Oculus Dexter)が1.2〜1.3となるようにPBSに浮遊させた後用した。
【００３５】
2。ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)の抗原製造
（イ）ヘリコバクター・ピロリ
ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)は，アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection；ATCC 43504)から分譲を受けて使用した。実験菌株は，トリプティケースソイ培地(Trypticase soy agar；BBL)に羊の血清(sheep serum)を10％添加した平板培地で3〜5日の間隔に継代しながら，37℃，CO2濃度10％環境のCO2細菌培養器(incubator)で培養した。実験菌株の検定は，顕微鏡的観察，尿素分解酵素の活性テスト(urease activity test)により実施した。
【００３６】
（ロ）尿素分解酵素の活性(Urease activity)測定
尿素分解酵素の活性(Urease activity)測定は，尿素(urea)及びフェノールレッド(phenol red)を含む尿素分解酵素テスト培養液(urease test broth)を利用して実施した。尿素培養液(Urea broth)及び培養液または試料を4：1の割合に混ぜて30分間反応させた後，540nmでの吸光度を測定して尿素分解酵素の活性(urease activity)を決定した。
【００３７】
（ハ）細菌の形態調査
3日及び5日間培養された菌の形態変化を肉眼的に観察し，菌集落をスライドガラス(slide glass)に塗抹してグラム染色した後，光学顕微鏡(×1，000)により細菌の形態がグラム陰性螺旋形(curved form)であるかまたは球形(coccoid form)に変形されたかを観察した。
【００３８】
（ニ）ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)抗原の製造
培養されたヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)菌株は，細胞収集器(cell collector)により回収して生理食塩水に浮遊させ，60℃の抗原水槽で30分間熱処理して抗原を不活化させた後，10，000×gで15分間遠心分離して菌体を回収し，回収された菌体に生理食塩水を入れて遠心分離する過程を3回反復して菌体内の培地性分を除去した。不活性化された菌体原液の菌数は，ヘマトサイトメートル(hematocytometer)により測定した。
【００３９】
3。サルモネラ腸炎菌及びネズミチフス菌の抗原製造
サルモネラ腸炎菌(Salmonella enteritidis)及びネズミチフス菌(Salmonella typmurium)をそれぞれトリプティケースソイ培地(Trypticase soy agr)に接種した後，37℃の恒温器で18時間培養した。一つの集落(colony)を大量のトリプティケースソイ培養液(Trypticase soy broth)に接種した後，37℃の温度で48時間静置培養した。培養された菌液はホルムアルデヒド (formaldehyde)を総量の0.2％となるように混ぜ，室温で24時間不活化させた。不活化された菌液を4，000rpmで20分間遠心分離して菌を回収し，滅菌生理食塩水(pH7.2)により3回洗浄した。回収された菌体は−70℃で保管して使用した。
【００４０】
4。複合された4種類の抗原をひよこに接種及び産卵鶏にブースティング(boosting)
（イ）12週齢のひよこに接種された菌体数は108／mlで，大腸菌抗原：サルモネラ腸炎菌抗原：ネズミチフス菌抗原：ヘリコバクター・ピロリ抗原：乳化アジュバントの比率は1.5：1：1：3.5：3とした。詳しくは，4.0×108／mlの大腸菌の死菌液抗原0.15ml，4.0×108／mlのサルモネラ腸炎菌の死菌液抗原0.10ml，4.0×108／mlのネズミチフス菌の死菌液抗原0.10ml及び4.0×108／mlのヘリコバクター・ピロリの抗原0.35mlを水酸化アルミニウム0.3mlにより乳化させた後1回接種を行った。2回目からブースティングに用いられたアジュバントは公知のISA25を使用して接種したが，一次的に混合菌乳化液を1回接種したことを包含して，ひよこの片方側脚に1mlずつ2週間隔に3回接種した後，同一割合に製造した乳化液を28週齢の産卵鶏の脚に3カ月間隔に0.5mlずつ2回接種した。前記4種類の抗原を一緒に合計5回接種した。
【００４１】
（ロ）ISA25乳化剤を使用した場合，抗−サルモネラ腸炎菌IgYの平均力価及び抗−ヘリコバクター・ピロリIgYの平均力価は，対照区の単独投与区よりも２種類以上の混合抗原処理区で有意的に抗−ヘリコバクター・ピロリIgYの平均力価及び抗−サルモネラ腸炎菌IgYの力価が高く現れたことが分かる。(図1a〜1d)
【００４２】
（ハ）中枢12週齢のひよこに接種された菌体数は108／mlで，大腸菌抗原：サルモネラ腸炎菌抗原：ネズミチフス菌抗原：ヘリコバクター・ピロリ抗原：乳化アジュバントの比率は1.5：1：1：3.5：3とした。詳しくは，4.0×108／mlの大腸菌の死菌液抗原0.15ml，4.0×108／mlのサルモネラ腸炎菌の死菌液抗原0.10ml，4.0×108／mlのネズミチフス菌の死菌液抗原0.10ml，4.0×108／mlのヘリコバクター・ピロリ抗原0.35ml及び完全フロインドアジュバント (Freund’s complete adjuvant) 0.3mlを乳化させた後1回接種した。2回目からブースティングに用いられたアジュバントは公知の不完全フロインドアジュバント (Freund’s incomplete adjuvant)を使用して接種したが，前記混合菌乳化液を1回接種したことを包含して，ひよこの片方側足に1mlずつ2週間隔に3回接種した後，同一割合に製造した乳化液を28週齢の産卵鶏の脚に3カ月間隔に0.5mlずつ2回接種した。前記4種類の抗原を一緒に合計5回接種した。その結果，前記混合菌乳化液を接種した産卵鶏により生産された1個の卵は，抗−大腸菌抗−病原性バクテリア抗体(IgY)，抗−サルモネラ腸炎菌抗−病原性バクテリア抗体(IgY)，抗−ネズミチフス菌抗−病原性バクテリア抗体(IgY)及び抗−ヘリコバクター・ピロリ抗−病原性バクテリア抗体(IgY)を同時に共有している。
【００４３】
5。混合された3種類の抗原をひよこに接種及び産卵鶏にブースティング(boosting)
12週齢のひよこに接種された抗原と乳化アジュバントの比率は，大腸菌抗原：サルモネラ腸炎菌抗原：ネズミチフス菌抗原：乳化アジュバントの比率を3.5：1.8：1.7：3とし，4.0×108／mlの大腸菌の死菌液抗原0.35ml，4.0×108／mlのサルモネラ腸炎菌の死菌液抗原0.18ml及び4.0×108／mlのネズミチフス菌の死菌液抗原0.17mlを水酸化アルミニウム0.3mlにより乳化させた混合菌乳化液1mlを1回接種した。2回目からは乳化アジュバント(ISA25)を使用した前記混合菌乳化液を同一割合に混合した混合菌乳化液を1mlずつ2週間隔に2回接種した後，成長した産卵鶏の脚に，同一割合に2.0×108／mlの大腸菌の死菌液抗原0.35ml，2.0×108／mlのサルモネラ腸炎菌の死菌液抗原0.18ml，2.0×108／mlのネズミチフス菌の死菌液抗原0.17ml及び乳化アジュバント(ISA25)0.3mlにより製造した混合菌乳化液を3カ月間隔に0.5mlずつ2回接種することを含めて合計5回接種した。生産された1個の卵は，抗−大腸菌抗−病原性バクテリア抗体(IgY)，抗−サルモネラ腸炎菌抗−病原性バクテリア抗体(IgY)及び抗−ネズミチフス菌抗−病原性バクテリア抗体(IgY)を同時に共有している。
【００４４】
もう１つの発明の構成は，大腸菌抗原，サルモネラ腸炎菌及びネズミチフス菌抗原を完全フロインドアジュバント (Freund’s complete adjuvant)により乳化させた所定比率の混合菌乳化液1mlをひよこの片方側足に1回接種した。2回目からは不完全フロインドアジュバント (Freund’s incomplete adjuvant)を使用した混合菌乳化液を前記混合菌乳化液と同一割合に1mlずつ2週間隔に2回接種した後，成長した産卵鶏に前記混合菌乳化液を同一割合に3カ月間隔に0.5mlずつ2回接種して，合計5回接種した。生産した1個の卵は，抗−大腸菌抗−病原性バクテリア抗体(IgY)，抗−サルモネラ腸炎菌抗−病原性バクテリア抗体(IgY)及び抗−ネズミチフス菌抗−病原性バクテリア抗体(IgY)を同時に共有する抗−病原性バクテリア抗体(IgY)を含有している。前記発明を具体的に説明すると，ひよこに接種された菌体数は，大腸菌抗原：サルモネラ腸炎菌抗原：ネズミチフス菌抗原：完全フロインドアジュバント (Freund’s complete adjuvant)の比率を3.5：1.8：1.7：3とし，4.0×108／mlの大腸菌の死菌液抗原0.35ml，4.0×108／mlのサルモネラ腸炎菌の死菌液抗原0.18ml及び4.0×108／mlのネズミチフス菌の死菌液抗原0.17mlを完全フロインドアジュバント (Freund’s complete adjuvant)0.3mlにより乳化させた混合菌乳化液1mlを1回接種した。2回目からは不完全フロインドアジュバント (Freund’s incomplete adjuvant)を乳化剤として使用した混合菌乳化液を前記混合菌乳化液と同一割合に1mlずつ2回接種した後，成長した産卵鶏の脚に，同一割合に2.0×108／mlの大腸菌の死菌液抗原0.35ml，2.0×108／mlのサルモネラ菌の死菌液抗原0.18ml，2.0×108／mlのサルモネラ菌の死菌液抗原0.17ml及び不完全フロインドアジュバント (Freund’s incomplete adjuvant)0.3mlにより製造した混合菌乳化液を3カ月間隔に0.5mlずつ2回接種することを包含して合計5回接種した。生産された1個の卵は，抗−大腸菌抗−病原性バクテリア抗体(IgY)，抗−サルモネラ腸炎菌抗−病原性バクテリア抗体(IgY)及び抗−ネズミチフス菌抗−病原性バクテリア抗体(IgY)を同時に共有する抗−病原性バクテリア抗体(IgY)を含有している。
【００４５】
また他の発明の構成は，上述した方法により生産された抗−大腸菌抗−病原性バクテリア抗体(IgY)，抗−サルモネラ腸炎菌抗−病原性バクテリア抗体(IgY)及び抗−ネズミチフス菌抗−病原性バクテリア抗体(IgY)を同時に共有する卵及び，上述した方法により生産された卵を所定容器に入れて卵黄膜を除去した卵黄20gを入れ，同量のアルカリイオン水 (pH9)20mlを添加して攪拌して，24時間低温(5〜10℃)に放置した後，卵黄：アルカリイオン水(1：1)の上澄液の18倍分量(720ml)のアルカリイオン水(pH10)を混ぜ，48時間放置して水溶性蛋白質を抽出した後，上澄液をウルトラフィルタレーション(Ultra filteration)システムでホロー・ファイバー(Hollow fiber)膜分離方法により濃縮して凍結乾燥することを特徴とする，抗−混合菌水溶性抗−病原性バクテリア抗体の生産方法並びに抗−混合菌IgYを含有した抗−病原性バクテリア抗体に関するものである。
【００４６】
6。卵黄分離，卵黄粉末の抽出，免疫蛋白質の分離及び力価測定
（イ）卵黄分離
前記方法により生産された卵を割って卵黄を除いた残り部分を分離することで新鮮な卵黄を分離して，フラスコや瓶に入れる。
【００４７】
（ロ）卵黄粉末
前記分離された新鮮卵黄を遠心分離した後，凍結乾燥して卵黄粉末を抽出する。
【００４８】
（ハ）免疫蛋白質の分離及び力価測定
試験分析に用いられた免疫蛋白質の分離方法は次の通りで，免疫蛋白質の力価測定は公知の方法により実施した。
【００４９】
膜を除去した卵黄35gを250mlの瓶に入れた後，アルカリイオン水(pH9)35mlを添加して攪拌した。24時間低温(5〜10℃)に放置した後，卵黄：アルカリイオン水(1：1)液の上澄液の18倍分量(1260ml)のアルカリイオン水(pH10)を混合し，48時間放置して抽出した後，上澄液をウルトラフィルタレーション(Ultra filteration)システムでホロー・ファイバー(Hollow fiber)膜分離方法により濃縮して，凍結乾燥した。
【００５０】
前記濾過により得られた水溶性蛋白質中，特殊IgYの含量を次のように測定した。
【００５１】
また，特殊IgYの含量もサンドウィッチイライザ(ELISA)方法により測定した。ヘリコバクター・ピロリを660nmでのO.D.値が0.05となるよう緩衝液により希釈した。前記希釈された菌体をマイクロプレートにコーティングして一晩中放置した。前記マイクロプレートを洗浄し，前記濾過された水溶性蛋白質を入れて反応させた後，洗浄して，1／10，000に希釈されたラビット抗−チックIgG Ab-HRPを添加する。HRPの基質としてはTMBを使用し，反応停止液としては2N-H2SO4を利用して450nmでの吸光度を測定した。(図2a〜2d)
【００５２】
7。4種類の抗体を含有したヨーグルトの製造
（イ）水溶性抗−病原性バクテリア抗体の抽出
水溶性抗−病原性バクテリア抗体の抽出は次のような方法で行った。
膜を除去した卵黄35gを250mlの瓶に入れた後，アルカリイオン水(pH9)35mlを添加して攪拌した。24時間低温(5〜10℃)で放置した後，卵黄：アルカリイオン水(1：1)液の上澄液の18倍分量(1260ml)のアルカリイオン水(pH10)と混合し，48時間放置して抽出した後，上澄液をウルトラフィルタレーション(Ultra filteration)システムでホロー・ファイバー(Hollow fiber)膜分離方法により濃縮して，凍結乾燥した。
【００５３】
（ロ）新鮮卵黄を含有したヨーグルトの製造
上述したようにヘリコバクター・ピロリ抗原，大腸菌抗原，サルモネラ腸炎菌抗原及びネズミチフス菌抗原を混合させた複合抗原を接種した後，生産された卵から卵黄を分離してヨーグルトの材料として使用した(表3，4)。ヨーグルトの製造工程では殺菌問題が非常に深刻であるにも拘らず，65℃で1分間処理するだけであるので病原菌を殺菌する条件としては適合せず，そのため，製品の流通期間が短縮される問題点が登場した。本発明ではこのような問題点を解決するために，サルモネラ菌IgYを卵黄自体に含ませることで，殺菌しなくてもヨーグルトの製造に使用し得る技術を開発した。
【００５４】
（ハ）抽出した水溶性抗−病原性バクテリア抗体を含有したヨーグルト及びアイスクリームの製造
上述したように大腸菌抗原，サルモネラ腸炎菌抗原，ネズミチフス菌抗原及びヘリコバクター・ピロリ抗原を混合させた複合抗原を接種した後，生産された卵から卵黄を分離して，抽出した水溶性蛋白質(crude IgY)粉末を添加した。アイスクリーム及びヨーグルトの製造配合比は次の表１，2，3，4で提示したものと同様である。
【００５５】
【表１】
【００５６】
【表２】
【００５７】
【表３】
【００５８】
【表４】
【００５９】
8。３種類(大腸菌，サルモネラ腸炎菌及びネズミチフス菌)抗体を含有したヨーグルトの製造
（イ）水溶性抗−病原性バクテリア抗体の抽出
水溶性蛋白質の抽出は次のような方法で行った。
膜を除去した卵黄35gを250mlの瓶に入れた後，アルカリイオン水(pH9)35mlを添加して攪拌した。24時間低温(5〜10℃)で放置した後，卵黄：アルカリイオン水(1：1)液の上澄液の18倍分量(1260ml)のアルカリイオン水(pH10)と混合し，48時間放置して抽出した後，上澄液をウルトラフィルタレーション(Ultra filteration)システムでホロー・ファイバー(Hollow fiber)膜分離方法により濃縮して，凍結乾燥した。
【００６０】
（ロ）新鮮卵黄を含有したヨーグルトの製造
上述したように大腸菌抗原，サルモネラ腸炎菌抗原及びネズミチフス菌抗原を混合させた複合抗原を接種した後生産された卵から新鮮卵黄を分離してヨーグルトの材料として使用した(表7，8)。ヨーグルトの製造工程では殺菌問題が非常に深刻であるにも拘らず，65℃で1分間処理するだけであるので病原菌を殺菌する条件としては適合せず，そのため，製品の流通期間が短縮される問題点が登場した。本発明ではこのような問題点を解決するために，サルモネラ菌IgYを卵黄自体に含ませることで，殺菌しなくてもヨーグルトの製造に使用し得る技術を開発した。
【００６１】
（ハ）抽出した水溶性抗−病原性バクテリア抗体を含有したヨーグルト及びアイスクリームの製造
上述したように大腸菌抗原，サルモネラ腸炎菌抗原及びネズミチフス菌抗原を混合させた複合抗原を接種した後生産された卵から卵黄を分離した後，新鮮卵黄または卵黄粉末または抽出した水溶性蛋白質(crude IgY)粉末を添加した。アイスクリーム及びヨーグルトの製造配合比は次の表5，6，7，8で提示したものと同様である。
【００６２】
【表５】
【００６３】
【表６】
【００６４】
【表７】
【００６５】
【表８】
【００６６】
実施例２
実施例2は，4種類の抗体を独立的に生産した後，抗体混合及びその生産方法により生産された卵から抽出した抗−病原性バクテリア抗体を用いたヨーグルト及びアイスクリームに関するものである。
【００６７】
1。大腸菌(Enteropathogenic E.coli)の分離同定及び抗原製造
本発明に用いられた大腸菌は人から分離した。
大腸菌の分離，同定及び抗原製造は，前記実施例1と同様に行った。
【００６８】
2。ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)の抗原製造
ヘリコバクター・ピロリの抗原製造も前記実施例1と同様に行った。
【００６９】
3。サルモネラ腸炎菌及びネズミチフス菌の抗原製造
サルモネラ腸炎菌及びネズミチフス菌の抗原製造も前記実施例1と同様に行った。
【００７０】
4。4種類の抗原を独立的にひよこに接種及び産卵鶏にブースティング(boosting)（イ）12週齢のひよこに接種された菌体数は108／mlで，大腸菌抗原：乳化アジュバントの比率を1：1，サルモネラ腸炎菌抗原：乳化アジュバントの比率を1：1，ネズミチフス菌抗原：乳化アジュバントの比率を1：1，ヘリコバクター・ピロリ抗原：乳化アジュバントの比率を1：1とし，2.0×108／mlの大腸菌の死菌液抗原0.5ml及び水酸化アルミニウム0.5mlを乳化させ，また，サルモネラ腸炎菌の死菌液抗原0.5ml及び水酸化アルミニウム0.5mlを乳化させ，また，ネズミチフス菌の死菌液抗原0.5ml及び水酸化アルミニウム0.5mlを乳化させ，また，ヘリコバクター・ピロリ抗原0.5ml及び水酸化アルミニウム0.5mlを乳化させた後，それぞれ個別的に菌体数108／mlが含まれた前記乳化液1mlを各ひよこの片方側脚に1回接種し，2週目からは乳化アジュバント(ISA25)を使用した個別菌乳化剤を前記個別菌乳化剤と同一割合に1mlずつ2週間隔に2回接種した後，成長した産卵鶏に，1カ月間隔に，2.0×108／mlの大腸菌の死菌液抗原0.5ml及び乳化アジュバント(ISA25)0.5mlを乳化させ，また，2.0×108／mlのサルモネラ腸炎菌の死菌液抗原0.5ml及び乳化アジュバント(ISA25)0.5mlを乳化させ，また，2.0×108／mlのネズミチフス菌抗原0.5ml及び乳化アジュバント(ISA25)0.5mlを乳化させ，また，2.0×108／mlのヘリコバクター・ピロリ抗原0.5ml及び乳化アジュバント(ISA25)0.5mlを個別的に乳化させて製造した乳化液を，各ひよこの片方側脚に1mlずつ1回接種した。2回目からは乳化アジュバント(ISA25)を使用して2週間隔に1回目の接種を包含して1mlずつ3回接種した。成長後28週齢の産卵鶏の脚に3カ月間隔に，2.0×108／mlの大腸菌の死菌液抗原0.5ml及び乳化アジュバント(ISA25)0.5mlを乳化させ，また，2.0×108／mlのサルモネラ腸炎菌抗原0.5ml及び乳化アジュバント(ISA25)0.5mlを乳化させ，また，2.0×108／mlのネズミチフス菌抗原0.5ml及び乳化アジュバント(ISA25)0.5mlを乳化させ，また，2.0×108／mlのヘリコバクター・ピロリ抗原0.5ml及び乳化アジュバント(ISA25)0.5mlを乳化させたそれぞれの乳化液を0.5mlずつ2回接種した。前記4種類(大腸菌，サルモネラ腸炎菌，ネズミチフス菌及びヘリコバクター・ピロリ)抗原を混合せずに個別的に合計5回接種した。
【００７１】
（ロ）12週齢のひよこに接種された菌体数は108／mlで，大腸菌抗原：乳化アジュバントの比率を1：1，サルモネラ腸炎菌抗原：乳化アジュバントの比率を1：1，ネズミチフス菌抗原：乳化アジュバントの比率を1：1，ヘリコバクター・ピロリ抗原：乳化アジュバントの比率を1：1とし，2.0×108／mlの大腸菌の死菌液抗原0.5ml及び完全フロインドアジュバント (Freund’s complete adjuvant)0.5mlを乳化させ，また，2.0×108／mlのサルモネラ腸炎菌の死菌液抗原0.5ml及び完全フロインドアジュバント (Freund’s complete adjuvant)0.5mlを乳化させ，また，2.0×108／mlのネズミチフス菌の菌抗原0.5ml及び完全フロインドアジュバント (Freund’s complete adjuvant)0.5mlを乳化させ，また，2.0×108／mlのヘリコバクター・ピロリ抗原0.5ml及び完全フロインドアジュバント (Freund’s complete adjuvant)0.5mlを個別的に乳化させた後，個別的に菌体数108／mlが含まれた前記個別菌乳化液1mlを各ひよこの片方側脚に1回接種し，2週目からは不完全フロインドアジュバント (Freund’s incomplete adjuvant)を使用した個別菌乳化剤を前記個別菌乳化液と同一割合に1mlずつ2週間隔に2回接種した後，成長した産卵鶏の片方側脚に3カ月間隔に，2.0×108／mlの大腸菌の死菌液抗原0.5ml及び不完全フロインドアジュバント (Freund’s incomplete adjuvant)0.5mlを乳化させ，また，2.0×108／mlのサルモネラ腸炎菌の死菌液抗原0.5ml及び不完全フロインドアジュバント (Freund’s incomplete adjuvant)0.5mlを乳化させ，また，2.0×108／mlのネズミチフス菌抗原0.5ml及び不完全フロインドアジュバント (Freund’s incomplete adjuvant)0.5mlを乳化させ，また，2.0×108／mlのヘリコバクター・ピロリ抗原0.5ml及び不完全フロインドアジュバント (Freund’s incomplete adjuvant)0.5mlを乳化させて製造した乳化液を0.5mlずつ2回接種することを含んで合計5回接種した。その結果，前記個別菌乳化液を接種した産卵鶏により生産された卵は，抗−大腸菌抗−病原性バクテリア抗体(IgY)，抗−ヘリコバクター・ピロリ抗−病原性バクテリア抗体(IgY)，抗−サルモネラ腸炎菌抗−病原性バクテリア抗体(IgY)，または，ネズミチフス菌抗−病原性バクテリア抗体(IgY)を独立的に含有している。
【００７２】
5。卵黄分離，卵黄粉末の抽出，免疫蛋白質の分離及び力価測定
卵黄分離，卵黄粉末の抽出，試験分析に用いた免疫蛋白質の分離及び測定法は前記実施例1と同様に行った。
【００７３】
6。混合免疫蛋白質を含有したヨーグルト及びアイスクリームの製造
上述したように，ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)抗原，大腸菌抗原，サルモネラ腸炎菌抗原及びネズミチフス菌抗原を個別的に接種した後生産された卵から抽出した水溶性抗−病原性バクテリア抗体(crude IgY)粉末や新鮮な卵黄または乾燥卵黄をそれぞれ1：1：1：1，2：1：1：1，3：1：1：1，4：1：1：1，5：1：1：1(ヘリコバクター・ピロリ：大腸菌：サルモネラ腸炎菌：ネズミチフス菌)に混合して食品添加剤として使用した。アイスクリーム及びヨーグルトの製造配合比は次の表9，10，11，12に提示したものと同様である。
【００７４】
【表９】
【００７５】
【表１０】
【００７６】
【表１１】
【００７７】
【表１２】
【００７８】
実施例３
本発明の実験方法は図2aに提示した。
より具体的に説明すると，先ず，IgYが含まれた卵黄から脂肪及びリポ蛋白質(lipoprotein)を分離するために，卵黄：蒸留水を1：1に混合する。即ち，2倍に希釈された卵黄試料10ケを準備し，それら準備された各試料をゆっくり回転させながら硫酸アンモニウムを1％から10％まで添加して完全に溶かす。完全に溶かした10個の試料を5℃の室内に一日間静置させておくと，24時間後，それぞれの濃度によって上層と下層とに分離される。この時，上層部には脂質及び一部の蛋白質が集まり，下層部にはやや無視できる程の沈澱が発生する(図2b)。
【００７９】
図2cに示したように，1％の硫酸アンモニウムを添加した処理区では殆んど分離が発生せず，下層部に若干の沈澱が発生しており，2％の処理区でも前記1％の処理区と似たような傾向が現れた。3％の処理区では，上層部に脂質層が若干発生され，下層部は前記1％の処理区と似たような沈澱様相を見せた。4％の処理区は，前記3％の処理区に比べて若干上−下層部に脂質層及び沈澱がやや多めに発生され，5％及び6％の処理区は，上層部に脂質層が厚く形成されて，下層部には若干の沈澱が発生した。そして，7％から9％までの処理区は良好な条件であったし，10％の処理区は前記7〜9％の処理区よりもやや低下した。言い換えると，脂質の除去は5％及び6％の処理区が最も良かった。また，IgYの力価を計算してみると，図2cに示したように，4％の処理区が力価としては最も優秀であったが，脂質層の厚い5％の処理区が脂質除去には最も良かった。この時，上層に浮いている脂質層だけを残して下方側から分離液を抜取ると，脂質層の除去された液だけが残るようになる。
【００８０】
実験結果
従来の硫酸アンモニウムを用いた蛋白質の分離方法(Mathews，1990)は，蛋白質沈澱法として広用されている方法であって，硫酸アンモニウムを多量添加して試料の硫酸アンモニウム濃度が高くなるほど蛋白質沈澱量も多くなり，それを遠心分離して集めて精製に使用する。通常，10％から20％までは精製度を高めるために，不必要な助蛋白質を切取る意味で遠心分離を行って沈澱物を捨て，再び20％以上の硫酸アンモニウムを添加して，その時に沈澱される蛋白質を使用することもあった。
【００８１】
しかし，本発明では，卵黄中に含まれている脂質を分離するために，各種溶媒や溶剤(沈殿剤)を使用しなくては分離し難い卵黄内のリポ蛋白質や抗−病原性バクテリア抗体を，脂質の浮遊性及び硫酸アンモニウムによる凝集性を見出して難題を解決した。
【００８２】
実施例４
脂質が分離された液に一部残留している脂質，水溶性蛋白質及び色素(卵黄)を除去するために次のような実験を行った。
【００８３】
7個の試料を準備し，それぞれの試料に蒸留水を6倍，12倍，18倍，30倍，42倍，48倍及び60倍に混ぜて希釈した後，5℃の室内に一日間静置させた。この時，分離された上澄液を沈澱物が混合されないように注意深く分離させた。6倍に希釈した試料の場合は，沈澱は発生したが，上澄液には卵黄特有の黄色が残っており，沈澱物がたちまち上澄液と混合されてしまった。また，12倍，18倍及び30倍に希釈した試料の場合は，沈澱の発生が良く，沈澱物も混合されなかった。しかし，42倍，48倍及び60倍に希釈した試料の場合は，沈澱は発生したが，沈澱物が混合された。最も適当な沈澱希釈率は12倍及び18倍に希釈した場合であって，流れる水道水で洗っても取れないほど，あたかもペイントの屑が付いているように粘度が高く，熱い水で洗い落とすべき程度であった。また，沈澱物を除去した上澄液のIgY力価を測定した結果，図2d及び表１3に示したように，力価だけでは希釈率60倍及び6倍の試料の生産量(yield)が109％及び110％と標準よりも高かった。
【００８４】
それは，原液の力価よりも希釈した時の力価が水溶性蛋白質などの影響により高く現れた結果である。残りの各試料も，12倍及び18倍の試料を除いては100％を越えた。しかし，沈澱物がくっ付かず，色素も完ぺきに除去される希釈率18倍を選択した。
【００８５】
一方，マシュース等(Mathews，1990)やストライヤー等(Stryer，1998)は，細胞や組織をミキサーやホモジナイザー(homogenizer)に入れて破砕する方法が，細胞分解のための均質化作業として時間面で速く，蛋白質分解酵素による方法よりも蛋白質の損傷が少ない長所があると主張しており，本発明でもホモジナイザーにより細胞及び組織を破砕させた後，希釈率を6倍，12倍，18倍，24倍，36倍，48倍及び60倍にして静置させた後，同一実験を反復して行ったが，沈澱された沈澱物を分離する時，全てが混合されて，表１4及び図2eに示したような結果が出た。即ち，破砕しない方法がむしろ力価が高くなるので，工程的面や経済的な面を鑑みてミキサーやホモジナイザーを使用しないことにした。
【００８６】
【表１３】
【００８７】
【表１４】
【００８８】
実験結果，従来のアキタ等(Akita，1993)も蒸留水を用いた希釈法を使用したが，希釈させた後は沈澱剤としてデキストラン(dextran)， キサンタン・ガム(xanthangum)，ポリエチレングリコール(PEG)，エタノール(ethanol)，硫酸ナトリウム(sodium sulfate)などを使用して沈澱させ，遠心分離機を利用して分離したが，本発明は，卵黄から脂質を除去する時，硫酸アンモニウムを少量使用して脂質及び蛋白質の一部を上層部に凝集させるので，他の発明者らが広用する硫酸アンモニウム沈澱法による蛋白質分離を逆に利用した。即ち，従来は硫酸アンモニウムを利用して沈澱法により分離したが，本発明では反対に浮遊凝集させて分離する点で差がある。
【００８９】
即ち，本発明では5％の硫酸アンモニウム，卵黄及び蒸留水(1：1)だけで脂質及び一部蛋白質を重力差により凝集させて除去し，また，蒸留水だけを用いた希釈法により卵黄の色素及び水溶性蛋白質を凝集沈降させる方法により解決した。
【００９０】
本発明を利用して生産された製品の実験
卵黄からIgY含量の高い製品を生産するために，分離された上澄液を18倍に希釈した後，事前濾過を経由せずに直ちにアミコン(amicon)-2000ホローフィルター (hollow filter：M.W 100K，P100-43)濃縮機により濃縮した上澄液を，今回は事前濾過装置(TOYO fiter paper No.2.2-3重)によりろ過し，濃縮した後，濃縮液に10倍の蒸留水を入れて，再び濃縮・透析を行った。このようにして2種類に製作した試料を凍結乾燥した結果，IgYの力価は図2eに示したようであって，18倍(濃縮だけを行う)に希釈した濃縮したもの(収率53.8％)よりも，18倍に希釈した試料を濃縮して再び10倍の蒸留水を加えて濃縮すると同時に透析したもの（収率70.8％）が優れ，濃縮・透析を併行したものが図2fに示したように精製もよくできて純度も高かった。
【００９１】
マヨネーズの生産実験によるIgYの力価
本発明により生産された卵黄を利用してマヨネーズの生産実験をpH3，pH5及びpH7に分けて行った結果，図2gに示したように，pH7のIgYの力価収率が92.3％と一番優れ，残りのpH3は85.8％，pH5は85.3％の順に力価を表した。即ち，本発明の卵黄を利用してマヨネーズを生産した時，IgYの力価損失が殆んどないことが分かった。
【００９２】
本発明の方法により生産された製品の精製度実験
本発明の方法により生産された分離液を凍結乾燥した結果，製品の色は白色を表し，SDS-ページ(PAGE)により凍結乾燥した製品を原液と分離・精製された液との精製度を比較した結果は，図2hに示したようであった。図2hに示したように，本発明により生産された製品が本来の卵黄であった時よりも著しく精製されたことが確認され，遠心分離機を使用しないと収率が低下され，沈殿剤などの添加物を使用しないと不純物の除去が困難であるため，分離された上澄液のIgY力価が低下するが，本発明を利用して生産された製品は，力価や製品の精製度・品質面で優れて，時間と経済上の利益及び原価節減は勿論で，大量生産も可能である。
【００９３】
本発明は，上述した特定実施例や図面に記載された内容に技術的思想が限定されず，特許請求の範囲により請求される本発明の要旨を外れない限り，当該発明が属する技術分野で通常の知識を有する者であれば誰でも多様な変形の実施が可能であることは勿論で，そのような変更は請求範囲の記載の範囲内にある。
【００９４】
【発明の効果】
本発明の構成によると，本発明により生産された4種類の抗−混合菌または3種類の抗−病原性バクテリア抗体を含む卵や食品添加剤，またはヨーグルト，アイスクリーム等の機能性乳加工食品の摂取は，胃腸炎及び十二指腸炎を予防する効果がある。
【００９５】
また，本発明により生産されたサルモネラ菌IgY含有卵を使用するときは殺菌を最小化することが可能で，サルモネラによる２次汚染を防止することができる。若し，一部が汚染されたとしても本発明による抗−サルモネラIgYが含まれているので，摂取後の食中毒問題を緩和させることができる。
【００９６】
もう一つの発明の，抗−病原性バクテリア抗体の分離方法によると，多様な有機溶媒や沈殿剤を使用して脂質及び水溶性蛋白質などを分離する方法よりもIgYの力価の損失が小さく，少量の硫酸アンモニウムだけあれば良いので，遠心分離を行うときよりも時間及び各種経費を節減することが可能で，大量に処理することができるという効果がある。
【００９７】
また，蒸留水だけを利用した方法により希釈した後，4℃で一日ほど静置させると，97％以上の生産量(yield)を得ることが可能で，卵黄の色素を除去することも可能で，遠心分離機を使用しなくても完全に分離し得るため原価低減を図り得るという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】 大腸菌，サルモネラ腸炎菌，ネズミチフス菌及びヘリコバクター・ピロリの複合接種時，抗−ヘリコバクター・ピロリ特殊IgYの力価変化を示したグラフである。
【図１ｂ】 大腸菌，サルモネラ腸炎菌，ネズミチフス菌及びヘリコバクター・ピロリの複合接種時，抗−サルモネラ菌特殊IgYの力価変化を示したグラフである。
【図１ｃ】 大腸菌，サルモネラ腸炎菌，ネズミチフス菌及びヘリコバクター・ピロリの複合接種時，抗−ヘリコバクター・ピロリ特殊IgYの平均力価を示した棒グラフである。
【図１ｄ】 大腸菌，サルモネラ腸炎菌，ネズミチフス菌及びヘリコバクター・ピロリの複合接種時，抗−サルモネラ菌特殊IgYの平均力価を示したグラフである。
【図１ｅ】 大腸菌，サルモネラ腸炎菌及びネズミチフス菌の複合接種時，抗−サルモネラ菌特殊IgYの力価変化を示したグラフである。
【図１ｆ】 大腸菌，サルモネラ腸炎菌及びネズミチフス菌の複合接種時，抗−大腸菌特殊IgYの力価変化を示したグラフである。
【図１ｇ】 大腸菌，サルモネラ腸炎菌及びネズミチフス菌の複合接種時，抗−サルモネラ菌特殊IgYの平均力価を示したグラフである。
【図１ｈ】 大腸菌，サルモネラ腸炎菌及びネズミチフス菌の複合接種時，抗−大腸菌特殊IgYの平均力価を示したグラフである。
【図２ａ】 卵黄中の水溶性抗−病原性バクテリア抗体(IgY)を分離／精製する方法を示した図である。
【図２ｂ】 硫酸アンモニウム処理を利用した卵黄内の水溶性抗−病原性バクテリア抗体及び燐脂質の分離状態を示した状態図である。
【図２ｃ】 硫酸アンモニウム処理による抗−病原性バクテリア抗体(IgY)の力価変化を示したグラフである。
【図２ｄ】 希釈倍率による抗−病原性バクテリア抗体(IgY)の力価変化を示したグラフである。
【図２ｅ】 均質化作業を行った後，希釈倍率による抗−病原性バクテリア抗体(IgY)の力価変化を示したグラフである。
【図２ｆ】 濃縮及び透析による抗−病原性バクテリア抗体(IgY)の力価変化を示したグラフである。
【図２ｇ】 マヨネーズ生産による抗−病原性バクテリア抗体(IgY)の力価変化を示したグラフである。
【図２ｈ】 精製後SDS−ページ(PAGE)を利用した抗−病原性バクテリア抗体(IgY)の純度確認に関するものである。
【発明の属する技術分野】
本発明は，腸炎を誘発させる大腸菌(E.coli)，胃炎菌のヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)及び食中毒を誘発させるサルモネラ菌(Salmonella enteritidis and Salmonella typmurium)を抗原化させて幼いひよこに同時に接種することで，胃炎，腸炎及び食中毒を予防することができる抗−病原性バクテリア抗体(IgY)を卵一つに共有させる生産技術，独立的に4種類の抗原をひよこにそれぞれ接種した後，生産された各特殊抗体を適正割合に混合した抗−病原性バクテリア抗体の粉末組成物及び，該抗−病原性バクテリア抗体を有効性分とするヨーグルト，アイスクリーム等の乳加工食品に関するものである。
【０００２】
また，本発明は，前記抗−病原性バクテリア抗体を抽出するための方法であって，特殊抗体(抗−病原性バクテリア抗体)を含有する卵黄を蒸留水により1：1に希釈した後，該希釈溶液に水溶性蛋白質及び燐脂質を十分に分離し得る所定量の硫酸アンモニウムを添加することを特徴とする，IgY含有水溶性蛋白質及び燐脂質の分離方法及び，その分離方法により分離された溶液を蒸留水だけにより所定倍率に再び希釈した後，所定温度で静置させ沈澱させて精製することを特徴とする，卵黄の色素及び水溶性蛋白質の分離方法に関するものである。
【０００３】
【従来の技術】
本発明と関連して，現在まで報告された大腸菌(Enterotoxigenic E.coli：腸管毒素原性大腸菌)関連資料を調べて見ると，人体及び家畜の腸内に常駐する正常常駐菌種の一つの大腸菌は，小児だけでなく健康な成人にも胃腸炎と関連される原因菌として知られている。
【０００４】
現在まで人の下痢原因大腸菌としては，次の5種類が報告されている。腸管病原性大腸菌(以下，EPECと略称す：Enteropathogenic E.coli)，腸管侵入性大腸菌(以下，EIECと略称す：Enteroinvasive E.coli)，腸管毒素原性大腸菌(以下，ETECとする：Enterotoxigenic E.coli)，腸管出血性大腸菌(以下，EHECと略称す：Enterohemorrhageic E.coli)，腸管付着性大腸菌(以下，EAECと略称す：Enteroadhesive E.coli)である。
【０００５】
1923年，アダム(Adam)は，乳児の下痢患者から大腸菌を分離し，その菌が胃腸炎と関連すると報告し，1940年代の半ばには主に英国で大腸菌による集団下痢が乳児院から発生され，それら一群の大腸菌を腸管出血性大腸菌(Enteropathogenic E.coli)と呼んだのはニター(Neter)等が最初であって，病原性大腸菌と呼ぶようになった。
【０００６】
従来の大腸菌特許に関する技術を要約すると次の通りである。
【０００７】
キムジョンウ(1999)等は，豚からのETEC K88菌株の抗原及び卵の卵黄中の免疫グロブリン(IgY)を利用して卵黄抗体を製造し，それを効果的に分離する技術を提供することを目的とする特許を出願した。また，キムジョンウ(1999)等は，豚からのETEC K99菌株，K88菌株の抗原及び卵の卵黄中の免疫グロブリン(IgY)を利用して卵黄抗体を製造し，それを効果的に分離する技術を提供することを目的とする特許を出願した。また，キムジョンウ(1999)等は，豚からのETEC 987p菌株，K88菌株の抗原及び卵の卵黄中の免疫グロブリン(IgY)を利用して卵黄抗体を製造し，それを効果的に分離する技術を提供することを目的とする特許を出願した。その他に，コダマヨシカズ(1998)は，腸管出血性大腸菌(ETHC)による感染症の予防及び治療に利用するために，腸管出血性大腸菌細胞全体及び抗原としてベロ毒素に対して免疫された鶏が産んだ卵から得た抗体IgYを利用する特許を出願した。
【０００８】
一方，十二指腸炎を誘発させる腸炎菌のヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)の予防治療剤として開発された世界各国の特許から一部を要約すると次の通りである。
【０００９】
胃炎及び十二指腸炎の治療を抗原抗体反応により解決しようという努力が継続されており，コラー等は，ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)に起因する胃炎や消化器官潰瘍治療用の免疫グロブリンを哺乳動物の乳房分泌物から分離した(1992)。タイヨーカガクシャは，産卵鶏にヘリコバクター・ピロリ(H.pylori)を抗原化した後，免疫させることで特殊抗体を得(1992)，この時に使用された抗原はヘリコバクター・ピロリバクテリア(H.pylori bacteria)ATCC菌株43504，43506，43579及び43629であった。
【００１０】
最近では，サルモネラ腸炎菌(S.enteritidis)，ネズミチフス菌(S.typmurium)及び大腸菌などのような人獣共通伝染病中，腸管内病原性微生物による人の被害が日増しに深刻化しているのが実情である。
【００１１】
食中毒の原因中，最も発生頻度の高いものは細菌性食中毒である。食中毒の主要原因菌としては，サルモネラ，腸炎ビブリオ及びブドウ状球菌が挙げられ，腸管内病原微生物中，人の食中毒発生原因となる細菌としては，サルモネラが最も高い頻度を示す。サルモネラによる食中毒は，全体患者数の37.7％に達する。主な食中毒の原因菌中，腸炎ビブリオによるものは夏に集中的に現れるのに対し，サルモネラによる食中毒は年中発生報告があるので，その重要性が認められる。北米を始めとして南米やヨーロッパでもサルモネラによる食中毒被害は継続的に発生しており，過去の保菌率に比べ，肉類の大量流通網形成，環境汚染の増加及び給食などの大単位食習慣形態が増えることで発生及び保菌率が増大している状況である。
【００１２】
サルモネラ中，制限された宿主領域を有している血清型の錘白狸菌及び家禽チフス菌を除いた残り2，400余種の血清型は特別な宿主領域を持たず，如何なる環境下でも最小一種類以上の動物に感染または汚染されているため，それらの根本的な除去は不可能である。サルモネラ菌種中，サルモネラ腸炎菌(Salmonella enteritidis)及びネズミチフス菌(Salmonella typumrium)が食中毒の主原因として報告されている(国立保健院感染病発生情報誌，キムホフン(1997))。一般に，卵の外部からの(on egg infection)感染経路が大部分を占めるが，卵内伝染(in egg infection)もサルモネラ感染症では発生する。特に，サルモネラ腸炎菌及びネズミチフス菌の場合は，卵巣に感染されていたものが卵の卵黄に移行して現れた例があるものであって，その重要性がより強調される。従って，それを除去することは，直ちに疾病発生の連結輪を遮断し得ることになるので，サルモネラ由来食中毒に対する予防の基本となる。
【００１３】
サルモネラと関連する従来技術としては，ソンキョンビン (2000)が，サルモネラ腸炎菌のATFAサブユニットのマルトース結合蛋白質と融合された蛋白質の大腸菌での発現により特許を出願した。これは鶏で最も問題とされる疾病のサルモネラ感染に対する診断用キット及びワクチンの開発に利用するためのものである。(出願番号：10-2000-024818)。
【００１４】
上述したように，ヘリコバクター及びサルモネラ菌の成長抑制を図るために抗生剤及び天然物質を利用するなどの多様な方法が研究されているが，その効能評価では一定な結論が得られていないのが実情である。併し，毎年食中毒問題は発生しており，根本的に，卵にサルモネラ抗体及び他の抗体を同時に含有させることで，より効果的な予防策を提示することができる。
【００１５】
また，一般には，或る一定した菌に対する抗体を生成し，その生成された抗体を利用して治療を行うことが最も理想的な方法として知られているが，それぞれの抗体を生産することが難しく，また，抗体分離などの問題を産業的に解決することができないという問題点があった。
【００１６】
もう一つの発明の関連する従来の技術を説明すると，抗−病原性バクテリア抗体の一種のIgYを含有した卵黄から蛋白質及び燐脂質を分離する方法であって，卵黄の蛋白質は15〜17％を占め，α，β，γ-リベチン (livetin)の三種類の蛋白質が主成分である。この中でγ-リベチン (livetin)は，IgG系列の抗−病原性バクテリア抗体であって卵黄に存在すると知られ(Poson等，1980)，一般にIgYとして知られている。また，IgYは，選択的に口腔摂取が可能な抗−病原性バクテリア抗体である(McBee等，1979)。IgYを分離するための第一段階は，卵黄の脂質(lipid)及びリポ蛋白質(lipoprotein)の除去である。それらを除去するための方法としては，ウルトラ遠心分離によるリポ蛋白質(lipoprotein)の分離(Bade，1984)，有機溶媒による脂肪除去(Polson等，1980)，PEG(ポリエチレングリコール;polyethyleneglycol)やナトリウムデキストラン硫酸 (sodium dextran sulfate)またはキサンタン・ガム (xanthan gum)によりリポ蛋白質(lipoprotein)を沈澱させる方法(ハチダ等，1993)が挙げられ，特に，増粘安定剤として食品に広用されている天然多糖類のカラゲナン(carrageenan；強力な卵黄のリポ蛋白質凝集活性力を有する)を利用した方法など(Hansen等，1998)が挙げられる。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
上述したような従来の方法は，卵黄から水溶性蛋白質及び脂質を分離するために広用されている技術であるが，分離・精製の大量生産のための産業的規模では前記各方法では効率が少なく非経済的(生産コストが高い)であるという問題点があった。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
本発明は，このような従来の技術的課題を解決するためになされたもので，１個の卵に4種類または3種類の抗−病原性バクテリア抗体(抗−大腸菌IgY，抗−ヘリコバクター・ピロリIgY，抗−サルモネラ腸炎菌IgY及び抗−ネズミチフス菌IgY，または，抗−大腸菌IgY，抗−サルモネラ腸炎菌IgY及び抗−ネズミチフス菌IgY)を同時に含有する共有方法及びそれら4種類または3種類の抗−病原性バクテリア抗体を含有した卵の生産方法並びに，前記抗−病原性バクテリア抗体を含むヨーグルト及びアイスクリーム等の乳加工食品を提供しようとする。
【００１９】
また，本発明は，卵黄から水溶性蛋白質を分離する方法において，従来技術とは異なって遠心分離機及び沈殿剤を使用しないだけでなく，無毒性の硫酸アンモニウム及び蒸留水を利用して大量に抗−病原性バクテリア抗体(IgY)の分離及び精製を容易に行うことが出来る。
【００２０】
上述した技術的課題を達成するための本発明の構成は，
(1) 大腸菌抗原，サルモネラ腸炎菌抗原，ネズミチフス菌抗原及びヘリコバクター・ピロリ抗原を水酸化アルミニウムにより所定割合に乳化させた混合菌乳化液1mlをひよこの片方側脚に1回接種し，2回目からは乳化アジュバント(ISA25)を使用した混合菌乳化液を1週間隔に1mlずつ2回接種した後，成長した産卵鶏に3カ月間隔に前記乳化アジュバント(ISA25)を使用した混合菌乳化液を前記混合菌乳化液と同一割合に0.5mlずつ2回接種することを包含して合計5回接種する方法であって，生産された1個の卵に，抗−大腸菌，抗−サルモネラ腸炎菌，抗−ネズミチフス菌及び抗−ヘリコバクター・ピロリの抗−病原性バクテリア抗体を同時に共有させることを特徴とする，抗−病原性バクテリア抗体を含有した卵の生産方法に関するもので，より詳しくは，前記ひよこに接種された菌体数は，大腸菌抗原：サルモネラ腸炎菌抗原：ネズミチフス菌抗原：ヘリコバクターピロリ抗原：乳化アジュバントの比率を1.5：1：1：3.5：3とし，4.0×108／mlの大腸菌の死菌液抗原0.15ml，4。0×108／mlのサルモネラ腸炎菌の死菌液抗原0.10ml，4.0×108／mlのネズミチフス菌の死菌液抗原0.10ml及び4.0×108／mlのヘリコバクター・ピロリの死菌液抗原0.35mlを水酸化アルミニウム0.3mlに乳化させた混合菌乳化液1mlを1回接種し，2回目からは1週間隔に乳化アジュバント(ISA25)を使用した前記混合菌乳化液と同一割合に混合した混合菌乳化液1mlずつ2回接種した後，成長した産卵鶏の脚に，前記と同一割合に，2.0×108／mlの大腸菌の死菌液抗原0.15ml，2.0×108／mlのサルモネラ腸炎菌の死菌液抗原0.10ml，2.0×108／mlのネズミチフス菌の死菌液抗原0.10ml，2.0×108／mlのヘリコバクター・ピロリの死菌液抗原0.35ml及び乳化補助液(ISA25)0.3mlにより製造した混合菌乳化液を3カ月間隔に0.5mlずつ2回接種することを包含して合計5回を接種して，抗−病原性バクテリア抗体を含有した卵を生産する方法に関するものである。
【００２１】
（2）もう一つの発明は，大腸菌抗原，サルモネラ腸炎菌抗原，ネズミチフス菌抗原及びヘリコバクター・ピロリ抗原の4種類の抗原を完全フロインドアジュバント (Freund's complete adjuvant)により乳化させた所定比率の混合菌乳化液1mlをひよこの片方側脚に1回接種し，2回目からは不完全フロインドアジュバント(Freund's incomplete adjuvant)を使用した混合菌乳化液を前記混合菌乳化液と同一割合にして1mlずつ2週間隔に2回接種した後，成長した産卵鶏に3カ月間隔に前記混合菌乳化液と同一割合に0.5mlずつ2回接種することを包含して合計5回接種する方法により，抗−病原性バクテリア抗体を含有した卵を生産する方法に関するものである。
【００２２】
（３）もう一つの発明は，前記(1)，(2)の卵生産方法と同様の方法により抗原を接種して特殊抗体を生産するが，前記4種類の抗原の代りに大腸菌抗原，サルモネラ腸炎菌抗原及びネズミチフス菌抗原の，すなわち，3種類の抗原を接種する点に特徴がある。
【００２３】
（4）もう一つの発明は，抗−病原性バクテリア抗体を同時に共有した卵の卵黄35gを250mlの瓶に入れた後，アルカリイオン水(pH9)35mlを添加して攪拌し，24時間低温(5-10℃)で放置した後，卵黄及びアルカリイオン水(1：1)の混合溶液の上澄液に18倍(1260ml)以上のアルカリイオン水(pH10)を更に混合し，48時間放置して水溶性抗−病原性バクテリア抗体を抽出した後，上澄液をウルトラフィルタレーション(Ultra filteration)システムでホロー・ファイバー(Hollow fiber)膜分離方法により濃縮して凍結乾燥することを特徴とする。
【００２４】
その他の抗−病原性バクテリア抗体の分離方法は，抗−病原性バクテリア抗体(IgY)を含有した卵から分離させた卵黄を蒸留水により所定比率に１次希釈した後，前記卵黄及び蒸留水の希釈溶液に，水溶性免疫蛋白質及び燐脂質が充分に分離されるように硫酸アンモニウムを添加して，所定期間，所定温度下で静置させて分離した上層部(脂質)を除去した分離液を再び蒸留水により所定割合に２次希釈した後，所定温度下で静置させ沈澱させて分離／精製する方法に関するもので，より好ましくは，前記蒸留水と卵黄の希釈倍率は1：1であるか，または，前記硫酸アンモニウムの添加量は3〜10％であることを特徴とする。特に，最適の硫酸アンモニウム添加量は5％〜6％である。
【００２５】
（5）もう一つの発明は，大腸菌抗原：乳化アジュバントの比率を1：1とし，サルモネラ腸炎菌抗原：乳化アジュバントの比率を1：1とし，ネズミチフス菌抗原：乳化アジュバントの比率を1：1とし，ヘリコバクター・ピロリ抗原：乳化アジュバントの比率を1：1として，2.0×108／mlの大腸菌の死菌液抗原0.5ml及び完全フロインドアジュバント (Freund’s complete adjuvant)0.5mlを，2.0×108／mlのサルモネラ腸炎菌抗原0.5ml及び完全フロインドアジュバント (Freund’s complete adjuvant)0.5mlを，2.0×108／mlのネズミチフス菌抗原0.5ml及び完全フロインドアジュバント (Freund’s complete adjuvant) 0.5mlを，2.0×108／mlのヘリコバクター・ピロリ抗原0.5ml及び完全フロインドアジュバント (Freund’s complete adjuvant)0.5mlを，それぞれ個別的に乳化させた後，個別的に菌体数108／mlが含まれた前記個別菌乳化液1mlを各ひよこの片方側脚に1回接種し，2週目からは不完全フロインドアジュバント (Freund’s incomplete adjuvant)を前記と同一割合に個別的に乳化させた前記個別菌乳化液を1mlずつ2週間隔に2回接種した後，成長した産卵鶏の片方側脚に，3カ月間隔に2.0×108／mlの大腸菌の死菌液抗原0.5ml及び不完全フロインドアジュバント (Freund’s incomplete adjuvant)0.5mlを，2.0×108／mlのサルモネラ腸炎菌抗原0.5ml及び不完全フロインドアジュバント (Freund’s incomplete adjuvant)0.5mlを，2.0×108／mlのネズミチフス菌抗原0.5ml及び不完全フロインドアジュバント (Freund’s incomplete adjuvant)0.5mlを，2.0×108／mlのヘリコバクター・ピロリ抗原0.5ml及び不完全フロインドアジュバント (Freund’s incomplete adjuvant)0.5mlを，それぞれ個別的に乳化させて製造した個別菌乳化液を0.5mlずつ2回接種することを包含して合計5回接種する方法であって，生産された抗−病原性バクテリア抗体を含有した各卵の卵黄から抽出したそれぞれの水溶性抗−病原性バクテリア抗体(crude IgY)粉末(ヘリコバクタSー・ピロリ：大腸菌：サルモネラ腸炎菌：ネズミチフス菌)を配合したことを特徴とする，抗−病原性バクテリア抗体粉末の混合組成物に関するものである。
【００２６】
また，大腸菌抗原：乳化アジュバントの比率を1：1とし，サルモネラ腸炎菌抗原：乳化アジュバントの比率を1：1とし，ネズミチフス菌抗原：乳化アジュバントの比率を1：1とし，ヘリコバクター・ピロリ抗原：乳化アジュバントの比率を1：1として，2.0×108／mlの大腸菌の死菌液抗原0.5ml及び水酸化アルミニウム0.5mlを，2.0×108／mlのサルモネラ腸炎菌抗原0.5ml及び水酸化アルミニウム0.5mlを，2.0×108／mlのネズミチフス菌抗原0.5ml及び水酸化アルミニウム0.5mlを，2.0×108／mlのヘリコバクター・ピロリ抗原0.5ml及び水酸化アルミニウム0.5mlを，それぞれ個別的に乳化させた後，個別的に菌体数108／mlが含まれた前記乳化液1mlを各ひよこの片方側脚に1回接種し，2週目からは乳化アジュバント(ISA25)を前記と同一割合にそれぞれ個別的に乳化させた前記個別菌乳化液を1mlずつ2週間隔に2回接種した後，成長した産卵鶏の片方側脚に，3カ月間隔に2.0×108／mlの大腸菌の死菌液抗原0.5ml及び乳化アジュバント(ISA25)0.5mlを，2.0×108／mlのサルモネラ腸炎菌抗原0.5ml及び乳化アジュバント(ISA25)0.5mlを，2.0×108／mlのネズミチフス菌抗原0.5ml及び乳化アジュバント(ISA25)0.5mlを，2.0×108／mlのヘリコバクター・ピロリ抗原0.5ml及び乳化アジュバント(ISA25)0.5mlを，それぞれ個別的に乳化させて製造した個別菌乳化液を0.5mlずつ2回接種することを包含して合計5回接種する方法であって，生産された抗−病原性バクテリア抗体を含有した各卵の卵黄から抽出したそれぞれの水溶性抗−病原性バクテリア抗体(crude IgY)粉末(ヘリコバクター・ピロリ：大腸菌：サルモネラ腸炎菌：ネズミチフス菌)を配合したことを特徴とする，抗−病原性バクテリア抗体粉末の混合組成物に関するものである。
【００２７】
（6）もう一つの発明は，前記 (1)，(2)，(3)及び(4)の卵生産方法により生産された抗−病原性バクテリア抗体を同時に共有した卵，卵黄，卵黄から抽出した抗−病原性バクテリア抗体及び前記(5)の免疫蛋白質の混合物並びに前記抗−病原性バクテリア抗体(IgY)を有効性分とするヨーグルト，アイスクリームなどの乳加工食品及び食品添加剤を製造することをその特徴とする。
【００２８】
以下，実施例，図面及び表に基づいて本発明の構成をより具体的に説明するが，それら実施例や図面により本発明の請求範囲が限定されるものではない。
【００２９】
【発明の実施の形態】
実施例１
1。大腸菌(Enteropathogenic E.coli)の分離同定及び抗原製造
（イ）人からの大腸菌(Enterotoxigenic Escherica coli；ETEC)分離及び同定本試験に用いられた大腸菌は人から分離した。即ち，抗原として用いられた大腸菌(Enterotoxigenic E.coli)は，下痢症状を表した小児の糞便から分離した。菌の分離は次のような方法により行った。小児の下痢糞便を血液寒天培地に塗抹した後，37℃の恒温器で18時間培養してα-溶血性を表す一つの大腸菌集落を選択した。選択された集落はマッコンキー培地(MacConkey agar)でピンク色の集落に成長され，EMB培地(EMB agar)に塗抹して鉄緑色(metallic green)に成長する大腸菌の特異的な集落性状を確認した。
【００３０】
（ロ）毒素(Toxin)生産能の確認
大腸菌(E.coli)の腸管毒素原性(Enterotoxigenicity)の主要原因である腸管性毒素(Enterotoxin)の生産能を重合酵素反応(Polymerase chain reaction；以下，PCRと略称す)技法を利用して確認した。熱安全性毒素(heat stable toxin；以下，STと略称す)のSTa1遺伝子及び熱不安定性毒素(heat lable toxin；以下，LTと略称す)のLTh遺伝子に対する特異原形体(Primer)を用いた多複合(multiplex)PCR技法を利用して増幅した。
【００３１】
ここで，ST毒素確認用原形体は，
sense primer；CCCCTCTTTTAGTCAGTC
anti-sense primer；CCAGCACAGGCAGGATTACA
165bpsの最終産物を増幅するように作製されたものを使用した。
【００３２】
また，LT毒素確認用原形体は，
sense primer；CAGACTATCAGTCAGAGGTTG
anti-sense primer；TTCATACTGATTGCCGCA
417bpsの最終産物を増幅するように作製されたものを使用した。
【００３３】
PCR条件は，前−変性温度(Pre-denaturation temperature)は95℃の温度下で5分間，変性温度(Denaturation temperature)は94℃の温度下で1分間，併合温度(Annealing temperature)は56℃の温度下で1分間，延長温度(Elongation temperature)は72℃の温度下で1分間，後−延長温度(Post-elongation temperature)は72℃の温度下で10分間，行った。増幅された産物は，2％の寒天ゲル(agarose gel)を利用した電気泳動により確認した。本発明に用いられた分離菌株はST毒素を生産することが確認された。この大腸菌をEB-E01と命名した。
【００３４】
（ハ）大腸菌ETEC(Enterotoxigenic E.coli)の抗原製造
大腸菌ETEC菌株をトリプティケースソイ培地(Trypticase soy agr)に接種し，37℃の恒温器で18時間培養した後，一つの集落(colony)を5mlのトリプティケースソイ培養液(Trypticase soy broth)に接種した。2時間後，大量のトリプティケースソイ培養液に接種して，37℃で48時間静置培養した。培養された菌液はホルムアルデヒド(formaldehyde)を総量の5％となるように混ぜ，室温で24時間不活化させた。不活化された菌液は4，000rpmで20分間遠心分離して菌を収穫した後，滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (phosphate buffered saline；以下，PBSと略称す)(pH7.2)により3回洗浄した。収穫された菌体は410nmでO.D.(Oculus Dexter)が1.2〜1.3となるようにPBSに浮遊させた後用した。
【００３５】
2。ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)の抗原製造
（イ）ヘリコバクター・ピロリ
ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)は，アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection；ATCC 43504)から分譲を受けて使用した。実験菌株は，トリプティケースソイ培地(Trypticase soy agar；BBL)に羊の血清(sheep serum)を10％添加した平板培地で3〜5日の間隔に継代しながら，37℃，CO2濃度10％環境のCO2細菌培養器(incubator)で培養した。実験菌株の検定は，顕微鏡的観察，尿素分解酵素の活性テスト(urease activity test)により実施した。
【００３６】
（ロ）尿素分解酵素の活性(Urease activity)測定
尿素分解酵素の活性(Urease activity)測定は，尿素(urea)及びフェノールレッド(phenol red)を含む尿素分解酵素テスト培養液(urease test broth)を利用して実施した。尿素培養液(Urea broth)及び培養液または試料を4：1の割合に混ぜて30分間反応させた後，540nmでの吸光度を測定して尿素分解酵素の活性(urease activity)を決定した。
【００３７】
（ハ）細菌の形態調査
3日及び5日間培養された菌の形態変化を肉眼的に観察し，菌集落をスライドガラス(slide glass)に塗抹してグラム染色した後，光学顕微鏡(×1，000)により細菌の形態がグラム陰性螺旋形(curved form)であるかまたは球形(coccoid form)に変形されたかを観察した。
【００３８】
（ニ）ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)抗原の製造
培養されたヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)菌株は，細胞収集器(cell collector)により回収して生理食塩水に浮遊させ，60℃の抗原水槽で30分間熱処理して抗原を不活化させた後，10，000×gで15分間遠心分離して菌体を回収し，回収された菌体に生理食塩水を入れて遠心分離する過程を3回反復して菌体内の培地性分を除去した。不活性化された菌体原液の菌数は，ヘマトサイトメートル(hematocytometer)により測定した。
【００３９】
3。サルモネラ腸炎菌及びネズミチフス菌の抗原製造
サルモネラ腸炎菌(Salmonella enteritidis)及びネズミチフス菌(Salmonella typmurium)をそれぞれトリプティケースソイ培地(Trypticase soy agr)に接種した後，37℃の恒温器で18時間培養した。一つの集落(colony)を大量のトリプティケースソイ培養液(Trypticase soy broth)に接種した後，37℃の温度で48時間静置培養した。培養された菌液はホルムアルデヒド (formaldehyde)を総量の0.2％となるように混ぜ，室温で24時間不活化させた。不活化された菌液を4，000rpmで20分間遠心分離して菌を回収し，滅菌生理食塩水(pH7.2)により3回洗浄した。回収された菌体は−70℃で保管して使用した。
【００４０】
4。複合された4種類の抗原をひよこに接種及び産卵鶏にブースティング(boosting)
（イ）12週齢のひよこに接種された菌体数は108／mlで，大腸菌抗原：サルモネラ腸炎菌抗原：ネズミチフス菌抗原：ヘリコバクター・ピロリ抗原：乳化アジュバントの比率は1.5：1：1：3.5：3とした。詳しくは，4.0×108／mlの大腸菌の死菌液抗原0.15ml，4.0×108／mlのサルモネラ腸炎菌の死菌液抗原0.10ml，4.0×108／mlのネズミチフス菌の死菌液抗原0.10ml及び4.0×108／mlのヘリコバクター・ピロリの抗原0.35mlを水酸化アルミニウム0.3mlにより乳化させた後1回接種を行った。2回目からブースティングに用いられたアジュバントは公知のISA25を使用して接種したが，一次的に混合菌乳化液を1回接種したことを包含して，ひよこの片方側脚に1mlずつ2週間隔に3回接種した後，同一割合に製造した乳化液を28週齢の産卵鶏の脚に3カ月間隔に0.5mlずつ2回接種した。前記4種類の抗原を一緒に合計5回接種した。
【００４１】
（ロ）ISA25乳化剤を使用した場合，抗−サルモネラ腸炎菌IgYの平均力価及び抗−ヘリコバクター・ピロリIgYの平均力価は，対照区の単独投与区よりも２種類以上の混合抗原処理区で有意的に抗−ヘリコバクター・ピロリIgYの平均力価及び抗−サルモネラ腸炎菌IgYの力価が高く現れたことが分かる。(図1a〜1d)
【００４２】
（ハ）中枢12週齢のひよこに接種された菌体数は108／mlで，大腸菌抗原：サルモネラ腸炎菌抗原：ネズミチフス菌抗原：ヘリコバクター・ピロリ抗原：乳化アジュバントの比率は1.5：1：1：3.5：3とした。詳しくは，4.0×108／mlの大腸菌の死菌液抗原0.15ml，4.0×108／mlのサルモネラ腸炎菌の死菌液抗原0.10ml，4.0×108／mlのネズミチフス菌の死菌液抗原0.10ml，4.0×108／mlのヘリコバクター・ピロリ抗原0.35ml及び完全フロインドアジュバント (Freund’s complete adjuvant) 0.3mlを乳化させた後1回接種した。2回目からブースティングに用いられたアジュバントは公知の不完全フロインドアジュバント (Freund’s incomplete adjuvant)を使用して接種したが，前記混合菌乳化液を1回接種したことを包含して，ひよこの片方側足に1mlずつ2週間隔に3回接種した後，同一割合に製造した乳化液を28週齢の産卵鶏の脚に3カ月間隔に0.5mlずつ2回接種した。前記4種類の抗原を一緒に合計5回接種した。その結果，前記混合菌乳化液を接種した産卵鶏により生産された1個の卵は，抗−大腸菌抗−病原性バクテリア抗体(IgY)，抗−サルモネラ腸炎菌抗−病原性バクテリア抗体(IgY)，抗−ネズミチフス菌抗−病原性バクテリア抗体(IgY)及び抗−ヘリコバクター・ピロリ抗−病原性バクテリア抗体(IgY)を同時に共有している。
【００４３】
5。混合された3種類の抗原をひよこに接種及び産卵鶏にブースティング(boosting)
12週齢のひよこに接種された抗原と乳化アジュバントの比率は，大腸菌抗原：サルモネラ腸炎菌抗原：ネズミチフス菌抗原：乳化アジュバントの比率を3.5：1.8：1.7：3とし，4.0×108／mlの大腸菌の死菌液抗原0.35ml，4.0×108／mlのサルモネラ腸炎菌の死菌液抗原0.18ml及び4.0×108／mlのネズミチフス菌の死菌液抗原0.17mlを水酸化アルミニウム0.3mlにより乳化させた混合菌乳化液1mlを1回接種した。2回目からは乳化アジュバント(ISA25)を使用した前記混合菌乳化液を同一割合に混合した混合菌乳化液を1mlずつ2週間隔に2回接種した後，成長した産卵鶏の脚に，同一割合に2.0×108／mlの大腸菌の死菌液抗原0.35ml，2.0×108／mlのサルモネラ腸炎菌の死菌液抗原0.18ml，2.0×108／mlのネズミチフス菌の死菌液抗原0.17ml及び乳化アジュバント(ISA25)0.3mlにより製造した混合菌乳化液を3カ月間隔に0.5mlずつ2回接種することを含めて合計5回接種した。生産された1個の卵は，抗−大腸菌抗−病原性バクテリア抗体(IgY)，抗−サルモネラ腸炎菌抗−病原性バクテリア抗体(IgY)及び抗−ネズミチフス菌抗−病原性バクテリア抗体(IgY)を同時に共有している。
【００４４】
もう１つの発明の構成は，大腸菌抗原，サルモネラ腸炎菌及びネズミチフス菌抗原を完全フロインドアジュバント (Freund’s complete adjuvant)により乳化させた所定比率の混合菌乳化液1mlをひよこの片方側足に1回接種した。2回目からは不完全フロインドアジュバント (Freund’s incomplete adjuvant)を使用した混合菌乳化液を前記混合菌乳化液と同一割合に1mlずつ2週間隔に2回接種した後，成長した産卵鶏に前記混合菌乳化液を同一割合に3カ月間隔に0.5mlずつ2回接種して，合計5回接種した。生産した1個の卵は，抗−大腸菌抗−病原性バクテリア抗体(IgY)，抗−サルモネラ腸炎菌抗−病原性バクテリア抗体(IgY)及び抗−ネズミチフス菌抗−病原性バクテリア抗体(IgY)を同時に共有する抗−病原性バクテリア抗体(IgY)を含有している。前記発明を具体的に説明すると，ひよこに接種された菌体数は，大腸菌抗原：サルモネラ腸炎菌抗原：ネズミチフス菌抗原：完全フロインドアジュバント (Freund’s complete adjuvant)の比率を3.5：1.8：1.7：3とし，4.0×108／mlの大腸菌の死菌液抗原0.35ml，4.0×108／mlのサルモネラ腸炎菌の死菌液抗原0.18ml及び4.0×108／mlのネズミチフス菌の死菌液抗原0.17mlを完全フロインドアジュバント (Freund’s complete adjuvant)0.3mlにより乳化させた混合菌乳化液1mlを1回接種した。2回目からは不完全フロインドアジュバント (Freund’s incomplete adjuvant)を乳化剤として使用した混合菌乳化液を前記混合菌乳化液と同一割合に1mlずつ2回接種した後，成長した産卵鶏の脚に，同一割合に2.0×108／mlの大腸菌の死菌液抗原0.35ml，2.0×108／mlのサルモネラ菌の死菌液抗原0.18ml，2.0×108／mlのサルモネラ菌の死菌液抗原0.17ml及び不完全フロインドアジュバント (Freund’s incomplete adjuvant)0.3mlにより製造した混合菌乳化液を3カ月間隔に0.5mlずつ2回接種することを包含して合計5回接種した。生産された1個の卵は，抗−大腸菌抗−病原性バクテリア抗体(IgY)，抗−サルモネラ腸炎菌抗−病原性バクテリア抗体(IgY)及び抗−ネズミチフス菌抗−病原性バクテリア抗体(IgY)を同時に共有する抗−病原性バクテリア抗体(IgY)を含有している。
【００４５】
また他の発明の構成は，上述した方法により生産された抗−大腸菌抗−病原性バクテリア抗体(IgY)，抗−サルモネラ腸炎菌抗−病原性バクテリア抗体(IgY)及び抗−ネズミチフス菌抗−病原性バクテリア抗体(IgY)を同時に共有する卵及び，上述した方法により生産された卵を所定容器に入れて卵黄膜を除去した卵黄20gを入れ，同量のアルカリイオン水 (pH9)20mlを添加して攪拌して，24時間低温(5〜10℃)に放置した後，卵黄：アルカリイオン水(1：1)の上澄液の18倍分量(720ml)のアルカリイオン水(pH10)を混ぜ，48時間放置して水溶性蛋白質を抽出した後，上澄液をウルトラフィルタレーション(Ultra filteration)システムでホロー・ファイバー(Hollow fiber)膜分離方法により濃縮して凍結乾燥することを特徴とする，抗−混合菌水溶性抗−病原性バクテリア抗体の生産方法並びに抗−混合菌IgYを含有した抗−病原性バクテリア抗体に関するものである。
【００４６】
6。卵黄分離，卵黄粉末の抽出，免疫蛋白質の分離及び力価測定
（イ）卵黄分離
前記方法により生産された卵を割って卵黄を除いた残り部分を分離することで新鮮な卵黄を分離して，フラスコや瓶に入れる。
【００４７】
（ロ）卵黄粉末
前記分離された新鮮卵黄を遠心分離した後，凍結乾燥して卵黄粉末を抽出する。
【００４８】
（ハ）免疫蛋白質の分離及び力価測定
試験分析に用いられた免疫蛋白質の分離方法は次の通りで，免疫蛋白質の力価測定は公知の方法により実施した。
【００４９】
膜を除去した卵黄35gを250mlの瓶に入れた後，アルカリイオン水(pH9)35mlを添加して攪拌した。24時間低温(5〜10℃)に放置した後，卵黄：アルカリイオン水(1：1)液の上澄液の18倍分量(1260ml)のアルカリイオン水(pH10)を混合し，48時間放置して抽出した後，上澄液をウルトラフィルタレーション(Ultra filteration)システムでホロー・ファイバー(Hollow fiber)膜分離方法により濃縮して，凍結乾燥した。
【００５０】
前記濾過により得られた水溶性蛋白質中，特殊IgYの含量を次のように測定した。
【００５１】
また，特殊IgYの含量もサンドウィッチイライザ(ELISA)方法により測定した。ヘリコバクター・ピロリを660nmでのO.D.値が0.05となるよう緩衝液により希釈した。前記希釈された菌体をマイクロプレートにコーティングして一晩中放置した。前記マイクロプレートを洗浄し，前記濾過された水溶性蛋白質を入れて反応させた後，洗浄して，1／10，000に希釈されたラビット抗−チックIgG Ab-HRPを添加する。HRPの基質としてはTMBを使用し，反応停止液としては2N-H2SO4を利用して450nmでの吸光度を測定した。(図2a〜2d)
【００５２】
7。4種類の抗体を含有したヨーグルトの製造
（イ）水溶性抗−病原性バクテリア抗体の抽出
水溶性抗−病原性バクテリア抗体の抽出は次のような方法で行った。
膜を除去した卵黄35gを250mlの瓶に入れた後，アルカリイオン水(pH9)35mlを添加して攪拌した。24時間低温(5〜10℃)で放置した後，卵黄：アルカリイオン水(1：1)液の上澄液の18倍分量(1260ml)のアルカリイオン水(pH10)と混合し，48時間放置して抽出した後，上澄液をウルトラフィルタレーション(Ultra filteration)システムでホロー・ファイバー(Hollow fiber)膜分離方法により濃縮して，凍結乾燥した。
【００５３】
（ロ）新鮮卵黄を含有したヨーグルトの製造
上述したようにヘリコバクター・ピロリ抗原，大腸菌抗原，サルモネラ腸炎菌抗原及びネズミチフス菌抗原を混合させた複合抗原を接種した後，生産された卵から卵黄を分離してヨーグルトの材料として使用した(表3，4)。ヨーグルトの製造工程では殺菌問題が非常に深刻であるにも拘らず，65℃で1分間処理するだけであるので病原菌を殺菌する条件としては適合せず，そのため，製品の流通期間が短縮される問題点が登場した。本発明ではこのような問題点を解決するために，サルモネラ菌IgYを卵黄自体に含ませることで，殺菌しなくてもヨーグルトの製造に使用し得る技術を開発した。
【００５４】
（ハ）抽出した水溶性抗−病原性バクテリア抗体を含有したヨーグルト及びアイスクリームの製造
上述したように大腸菌抗原，サルモネラ腸炎菌抗原，ネズミチフス菌抗原及びヘリコバクター・ピロリ抗原を混合させた複合抗原を接種した後，生産された卵から卵黄を分離して，抽出した水溶性蛋白質(crude IgY)粉末を添加した。アイスクリーム及びヨーグルトの製造配合比は次の表１，2，3，4で提示したものと同様である。
【００５５】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
8。３種類(大腸菌，サルモネラ腸炎菌及びネズミチフス菌)抗体を含有したヨーグルトの製造
（イ）水溶性抗−病原性バクテリア抗体の抽出
水溶性蛋白質の抽出は次のような方法で行った。
膜を除去した卵黄35gを250mlの瓶に入れた後，アルカリイオン水(pH9)35mlを添加して攪拌した。24時間低温(5〜10℃)で放置した後，卵黄：アルカリイオン水(1：1)液の上澄液の18倍分量(1260ml)のアルカリイオン水(pH10)と混合し，48時間放置して抽出した後，上澄液をウルトラフィルタレーション(Ultra filteration)システムでホロー・ファイバー(Hollow fiber)膜分離方法により濃縮して，凍結乾燥した。
【００６０】
（ロ）新鮮卵黄を含有したヨーグルトの製造
上述したように大腸菌抗原，サルモネラ腸炎菌抗原及びネズミチフス菌抗原を混合させた複合抗原を接種した後生産された卵から新鮮卵黄を分離してヨーグルトの材料として使用した(表7，8)。ヨーグルトの製造工程では殺菌問題が非常に深刻であるにも拘らず，65℃で1分間処理するだけであるので病原菌を殺菌する条件としては適合せず，そのため，製品の流通期間が短縮される問題点が登場した。本発明ではこのような問題点を解決するために，サルモネラ菌IgYを卵黄自体に含ませることで，殺菌しなくてもヨーグルトの製造に使用し得る技術を開発した。
【００６１】
（ハ）抽出した水溶性抗−病原性バクテリア抗体を含有したヨーグルト及びアイスクリームの製造
上述したように大腸菌抗原，サルモネラ腸炎菌抗原及びネズミチフス菌抗原を混合させた複合抗原を接種した後生産された卵から卵黄を分離した後，新鮮卵黄または卵黄粉末または抽出した水溶性蛋白質(crude IgY)粉末を添加した。アイスクリーム及びヨーグルトの製造配合比は次の表5，6，7，8で提示したものと同様である。
【００６２】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
実施例２
実施例2は，4種類の抗体を独立的に生産した後，抗体混合及びその生産方法により生産された卵から抽出した抗−病原性バクテリア抗体を用いたヨーグルト及びアイスクリームに関するものである。
【００６７】
1。大腸菌(Enteropathogenic E.coli)の分離同定及び抗原製造
本発明に用いられた大腸菌は人から分離した。
大腸菌の分離，同定及び抗原製造は，前記実施例1と同様に行った。
【００６８】
2。ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)の抗原製造
ヘリコバクター・ピロリの抗原製造も前記実施例1と同様に行った。
【００６９】
3。サルモネラ腸炎菌及びネズミチフス菌の抗原製造
サルモネラ腸炎菌及びネズミチフス菌の抗原製造も前記実施例1と同様に行った。
【００７０】
4。4種類の抗原を独立的にひよこに接種及び産卵鶏にブースティング(boosting)（イ）12週齢のひよこに接種された菌体数は108／mlで，大腸菌抗原：乳化アジュバントの比率を1：1，サルモネラ腸炎菌抗原：乳化アジュバントの比率を1：1，ネズミチフス菌抗原：乳化アジュバントの比率を1：1，ヘリコバクター・ピロリ抗原：乳化アジュバントの比率を1：1とし，2.0×108／mlの大腸菌の死菌液抗原0.5ml及び水酸化アルミニウム0.5mlを乳化させ，また，サルモネラ腸炎菌の死菌液抗原0.5ml及び水酸化アルミニウム0.5mlを乳化させ，また，ネズミチフス菌の死菌液抗原0.5ml及び水酸化アルミニウム0.5mlを乳化させ，また，ヘリコバクター・ピロリ抗原0.5ml及び水酸化アルミニウム0.5mlを乳化させた後，それぞれ個別的に菌体数108／mlが含まれた前記乳化液1mlを各ひよこの片方側脚に1回接種し，2週目からは乳化アジュバント(ISA25)を使用した個別菌乳化剤を前記個別菌乳化剤と同一割合に1mlずつ2週間隔に2回接種した後，成長した産卵鶏に，1カ月間隔に，2.0×108／mlの大腸菌の死菌液抗原0.5ml及び乳化アジュバント(ISA25)0.5mlを乳化させ，また，2.0×108／mlのサルモネラ腸炎菌の死菌液抗原0.5ml及び乳化アジュバント(ISA25)0.5mlを乳化させ，また，2.0×108／mlのネズミチフス菌抗原0.5ml及び乳化アジュバント(ISA25)0.5mlを乳化させ，また，2.0×108／mlのヘリコバクター・ピロリ抗原0.5ml及び乳化アジュバント(ISA25)0.5mlを個別的に乳化させて製造した乳化液を，各ひよこの片方側脚に1mlずつ1回接種した。2回目からは乳化アジュバント(ISA25)を使用して2週間隔に1回目の接種を包含して1mlずつ3回接種した。成長後28週齢の産卵鶏の脚に3カ月間隔に，2.0×108／mlの大腸菌の死菌液抗原0.5ml及び乳化アジュバント(ISA25)0.5mlを乳化させ，また，2.0×108／mlのサルモネラ腸炎菌抗原0.5ml及び乳化アジュバント(ISA25)0.5mlを乳化させ，また，2.0×108／mlのネズミチフス菌抗原0.5ml及び乳化アジュバント(ISA25)0.5mlを乳化させ，また，2.0×108／mlのヘリコバクター・ピロリ抗原0.5ml及び乳化アジュバント(ISA25)0.5mlを乳化させたそれぞれの乳化液を0.5mlずつ2回接種した。前記4種類(大腸菌，サルモネラ腸炎菌，ネズミチフス菌及びヘリコバクター・ピロリ)抗原を混合せずに個別的に合計5回接種した。
【００７１】
（ロ）12週齢のひよこに接種された菌体数は108／mlで，大腸菌抗原：乳化アジュバントの比率を1：1，サルモネラ腸炎菌抗原：乳化アジュバントの比率を1：1，ネズミチフス菌抗原：乳化アジュバントの比率を1：1，ヘリコバクター・ピロリ抗原：乳化アジュバントの比率を1：1とし，2.0×108／mlの大腸菌の死菌液抗原0.5ml及び完全フロインドアジュバント (Freund’s complete adjuvant)0.5mlを乳化させ，また，2.0×108／mlのサルモネラ腸炎菌の死菌液抗原0.5ml及び完全フロインドアジュバント (Freund’s complete adjuvant)0.5mlを乳化させ，また，2.0×108／mlのネズミチフス菌の菌抗原0.5ml及び完全フロインドアジュバント (Freund’s complete adjuvant)0.5mlを乳化させ，また，2.0×108／mlのヘリコバクター・ピロリ抗原0.5ml及び完全フロインドアジュバント (Freund’s complete adjuvant)0.5mlを個別的に乳化させた後，個別的に菌体数108／mlが含まれた前記個別菌乳化液1mlを各ひよこの片方側脚に1回接種し，2週目からは不完全フロインドアジュバント (Freund’s incomplete adjuvant)を使用した個別菌乳化剤を前記個別菌乳化液と同一割合に1mlずつ2週間隔に2回接種した後，成長した産卵鶏の片方側脚に3カ月間隔に，2.0×108／mlの大腸菌の死菌液抗原0.5ml及び不完全フロインドアジュバント (Freund’s incomplete adjuvant)0.5mlを乳化させ，また，2.0×108／mlのサルモネラ腸炎菌の死菌液抗原0.5ml及び不完全フロインドアジュバント (Freund’s incomplete adjuvant)0.5mlを乳化させ，また，2.0×108／mlのネズミチフス菌抗原0.5ml及び不完全フロインドアジュバント (Freund’s incomplete adjuvant)0.5mlを乳化させ，また，2.0×108／mlのヘリコバクター・ピロリ抗原0.5ml及び不完全フロインドアジュバント (Freund’s incomplete adjuvant)0.5mlを乳化させて製造した乳化液を0.5mlずつ2回接種することを含んで合計5回接種した。その結果，前記個別菌乳化液を接種した産卵鶏により生産された卵は，抗−大腸菌抗−病原性バクテリア抗体(IgY)，抗−ヘリコバクター・ピロリ抗−病原性バクテリア抗体(IgY)，抗−サルモネラ腸炎菌抗−病原性バクテリア抗体(IgY)，または，ネズミチフス菌抗−病原性バクテリア抗体(IgY)を独立的に含有している。
【００７２】
5。卵黄分離，卵黄粉末の抽出，免疫蛋白質の分離及び力価測定
卵黄分離，卵黄粉末の抽出，試験分析に用いた免疫蛋白質の分離及び測定法は前記実施例1と同様に行った。
【００７３】
6。混合免疫蛋白質を含有したヨーグルト及びアイスクリームの製造
上述したように，ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)抗原，大腸菌抗原，サルモネラ腸炎菌抗原及びネズミチフス菌抗原を個別的に接種した後生産された卵から抽出した水溶性抗−病原性バクテリア抗体(crude IgY)粉末や新鮮な卵黄または乾燥卵黄をそれぞれ1：1：1：1，2：1：1：1，3：1：1：1，4：1：1：1，5：1：1：1(ヘリコバクター・ピロリ：大腸菌：サルモネラ腸炎菌：ネズミチフス菌)に混合して食品添加剤として使用した。アイスクリーム及びヨーグルトの製造配合比は次の表9，10，11，12に提示したものと同様である。
【００７４】
【表９】
【表１０】
【表１１】
【表１２】
実施例３
本発明の実験方法は図2aに提示した。
より具体的に説明すると，先ず，IgYが含まれた卵黄から脂肪及びリポ蛋白質(lipoprotein)を分離するために，卵黄：蒸留水を1：1に混合する。即ち，2倍に希釈された卵黄試料10ケを準備し，それら準備された各試料をゆっくり回転させながら硫酸アンモニウムを1％から10％まで添加して完全に溶かす。完全に溶かした10個の試料を5℃の室内に一日間静置させておくと，24時間後，それぞれの濃度によって上層と下層とに分離される。この時，上層部には脂質及び一部の蛋白質が集まり，下層部にはやや無視できる程の沈澱が発生する(図2b)。
【００７９】
図2cに示したように，1％の硫酸アンモニウムを添加した処理区では殆んど分離が発生せず，下層部に若干の沈澱が発生しており，2％の処理区でも前記1％の処理区と似たような傾向が現れた。3％の処理区では，上層部に脂質層が若干発生され，下層部は前記1％の処理区と似たような沈澱様相を見せた。4％の処理区は，前記3％の処理区に比べて若干上−下層部に脂質層及び沈澱がやや多めに発生され，5％及び6％の処理区は，上層部に脂質層が厚く形成されて，下層部には若干の沈澱が発生した。そして，7％から9％までの処理区は良好な条件であったし，10％の処理区は前記7〜9％の処理区よりもやや低下した。言い換えると，脂質の除去は5％及び6％の処理区が最も良かった。また，IgYの力価を計算してみると，図2cに示したように，4％の処理区が力価としては最も優秀であったが，脂質層の厚い5％の処理区が脂質除去には最も良かった。この時，上層に浮いている脂質層だけを残して下方側から分離液を抜取ると，脂質層の除去された液だけが残るようになる。
【００８０】
実験結果
従来の硫酸アンモニウムを用いた蛋白質の分離方法(Mathews，1990)は，蛋白質沈澱法として広用されている方法であって，硫酸アンモニウムを多量添加して試料の硫酸アンモニウム濃度が高くなるほど蛋白質沈澱量も多くなり，それを遠心分離して集めて精製に使用する。通常，10％から20％までは精製度を高めるために，不必要な助蛋白質を切取る意味で遠心分離を行って沈澱物を捨て，再び20％以上の硫酸アンモニウムを添加して，その時に沈澱される蛋白質を使用することもあった。
【００８１】
しかし，本発明では，卵黄中に含まれている脂質を分離するために，各種溶媒や溶剤(沈殿剤)を使用しなくては分離し難い卵黄内のリポ蛋白質や抗−病原性バクテリア抗体を，脂質の浮遊性及び硫酸アンモニウムによる凝集性を見出して難題を解決した。
【００８２】
実施例４
脂質が分離された液に一部残留している脂質，水溶性蛋白質及び色素(卵黄)を除去するために次のような実験を行った。
【００８３】
7個の試料を準備し，それぞれの試料に蒸留水を6倍，12倍，18倍，30倍，42倍，48倍及び60倍に混ぜて希釈した後，5℃の室内に一日間静置させた。この時，分離された上澄液を沈澱物が混合されないように注意深く分離させた。6倍に希釈した試料の場合は，沈澱は発生したが，上澄液には卵黄特有の黄色が残っており，沈澱物がたちまち上澄液と混合されてしまった。また，12倍，18倍及び30倍に希釈した試料の場合は，沈澱の発生が良く，沈澱物も混合されなかった。しかし，42倍，48倍及び60倍に希釈した試料の場合は，沈澱は発生したが，沈澱物が混合された。最も適当な沈澱希釈率は12倍及び18倍に希釈した場合であって，流れる水道水で洗っても取れないほど，あたかもペイントの屑が付いているように粘度が高く，熱い水で洗い落とすべき程度であった。また，沈澱物を除去した上澄液のIgY力価を測定した結果，図2d及び表１3に示したように，力価だけでは希釈率60倍及び6倍の試料の生産量(yield)が109％及び110％と標準よりも高かった。
【００８４】
それは，原液の力価よりも希釈した時の力価が水溶性蛋白質などの影響により高く現れた結果である。残りの各試料も，12倍及び18倍の試料を除いては100％を越えた。しかし，沈澱物がくっ付かず，色素も完ぺきに除去される希釈率18倍を選択した。
【００８５】
一方，マシュース等(Mathews，1990)やストライヤー等(Stryer，1998)は，細胞や組織をミキサーやホモジナイザー(homogenizer)に入れて破砕する方法が，細胞分解のための均質化作業として時間面で速く，蛋白質分解酵素による方法よりも蛋白質の損傷が少ない長所があると主張しており，本発明でもホモジナイザーにより細胞及び組織を破砕させた後，希釈率を6倍，12倍，18倍，24倍，36倍，48倍及び60倍にして静置させた後，同一実験を反復して行ったが，沈澱された沈澱物を分離する時，全てが混合されて，表１4及び図2eに示したような結果が出た。即ち，破砕しない方法がむしろ力価が高くなるので，工程的面や経済的な面を鑑みてミキサーやホモジナイザーを使用しないことにした。
【００８６】
【表１３】
【表１４】
実験結果，従来のアキタ等(Akita，1993)も蒸留水を用いた希釈法を使用したが，希釈させた後は沈澱剤としてデキストラン(dextran)， キサンタン・ガム(xanthangum)，ポリエチレングリコール(PEG)，エタノール(ethanol)，硫酸ナトリウム(sodium sulfate)などを使用して沈澱させ，遠心分離機を利用して分離したが，本発明は，卵黄から脂質を除去する時，硫酸アンモニウムを少量使用して脂質及び蛋白質の一部を上層部に凝集させるので，他の発明者らが広用する硫酸アンモニウム沈澱法による蛋白質分離を逆に利用した。即ち，従来は硫酸アンモニウムを利用して沈澱法により分離したが，本発明では反対に浮遊凝集させて分離する点で差がある。
【００８９】
即ち，本発明では5％の硫酸アンモニウム，卵黄及び蒸留水(1：1)だけで脂質及び一部蛋白質を重力差により凝集させて除去し，また，蒸留水だけを用いた希釈法により卵黄の色素及び水溶性蛋白質を凝集沈降させる方法により解決した。
【００９０】
本発明を利用して生産された製品の実験
卵黄からIgY含量の高い製品を生産するために，分離された上澄液を18倍に希釈した後，事前濾過を経由せずに直ちにアミコン(amicon)-2000ホローフィルター (hollow filter：M.W 100K，P100-43)濃縮機により濃縮した上澄液を，今回は事前濾過装置(TOYO fiter paper No.2.2-3重)によりろ過し，濃縮した後，濃縮液に10倍の蒸留水を入れて，再び濃縮・透析を行った。このようにして2種類に製作した試料を凍結乾燥した結果，IgYの力価は図2eに示したようであって，18倍(濃縮だけを行う)に希釈した濃縮したもの(収率53.8％)よりも，18倍に希釈した試料を濃縮して再び10倍の蒸留水を加えて濃縮すると同時に透析したもの（収率70.8％）が優れ，濃縮・透析を併行したものが図2fに示したように精製もよくできて純度も高かった。
【００９１】
マヨネーズの生産実験によるIgYの力価
本発明により生産された卵黄を利用してマヨネーズの生産実験をpH3，pH5及びpH7に分けて行った結果，図2gに示したように，pH7のIgYの力価収率が92.3％と一番優れ，残りのpH3は85.8％，pH5は85.3％の順に力価を表した。即ち，本発明の卵黄を利用してマヨネーズを生産した時，IgYの力価損失が殆んどないことが分かった。
【００９２】
本発明の方法により生産された製品の精製度実験
本発明の方法により生産された分離液を凍結乾燥した結果，製品の色は白色を表し，SDS-ページ(PAGE)により凍結乾燥した製品を原液と分離・精製された液との精製度を比較した結果は，図2hに示したようであった。図2hに示したように，本発明により生産された製品が本来の卵黄であった時よりも著しく精製されたことが確認され，遠心分離機を使用しないと収率が低下され，沈殿剤などの添加物を使用しないと不純物の除去が困難であるため，分離された上澄液のIgY力価が低下するが，本発明を利用して生産された製品は，力価や製品の精製度・品質面で優れて，時間と経済上の利益及び原価節減は勿論で，大量生産も可能である。
【００９３】
本発明は，上述した特定実施例や図面に記載された内容に技術的思想が限定されず，特許請求の範囲により請求される本発明の要旨を外れない限り，当該発明が属する技術分野で通常の知識を有する者であれば誰でも多様な変形の実施が可能であることは勿論で，そのような変更は請求範囲の記載の範囲内にある。
【００９４】
【発明の効果】
本発明の構成によると，本発明により生産された4種類の抗−混合菌または3種類の抗−病原性バクテリア抗体を含む卵や食品添加剤，またはヨーグルト，アイスクリーム等の機能性乳加工食品の摂取は，胃腸炎及び十二指腸炎を予防する効果がある。
【００９５】
また，本発明により生産されたサルモネラ菌IgY含有卵を使用するときは殺菌を最小化することが可能で，サルモネラによる２次汚染を防止することができる。若し，一部が汚染されたとしても本発明による抗−サルモネラIgYが含まれているので，摂取後の食中毒問題を緩和させることができる。
【００９６】
もう一つの発明の，抗−病原性バクテリア抗体の分離方法によると，多様な有機溶媒や沈殿剤を使用して脂質及び水溶性蛋白質などを分離する方法よりもIgYの力価の損失が小さく，少量の硫酸アンモニウムだけあれば良いので，遠心分離を行うときよりも時間及び各種経費を節減することが可能で，大量に処理することができるという効果がある。
【００９７】
また，蒸留水だけを利用した方法により希釈した後，4℃で一日ほど静置させると，97％以上の生産量(yield)を得ることが可能で，卵黄の色素を除去することも可能で，遠心分離機を使用しなくても完全に分離し得るため原価低減を図り得るという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】 大腸菌，サルモネラ腸炎菌，ネズミチフス菌及びヘリコバクター・ピロリの複合接種時，抗−ヘリコバクター・ピロリ特殊IgYの力価変化を示したグラフである。
【図１ｂ】 大腸菌，サルモネラ腸炎菌，ネズミチフス菌及びヘリコバクター・ピロリの複合接種時，抗−サルモネラ菌特殊IgYの力価変化を示したグラフである。
【図１ｃ】 大腸菌，サルモネラ腸炎菌，ネズミチフス菌及びヘリコバクター・ピロリの複合接種時，抗−ヘリコバクター・ピロリ特殊IgYの平均力価を示した棒グラフである。
【図１ｄ】 大腸菌，サルモネラ腸炎菌，ネズミチフス菌及びヘリコバクター・ピロリの複合接種時，抗−サルモネラ菌特殊IgYの平均力価を示したグラフである。
【図１ｅ】 大腸菌，サルモネラ腸炎菌及びネズミチフス菌の複合接種時，抗−サルモネラ菌特殊IgYの力価変化を示したグラフである。
【図１ｆ】 大腸菌，サルモネラ腸炎菌及びネズミチフス菌の複合接種時，抗−大腸菌特殊IgYの力価変化を示したグラフである。
【図１ｇ】 大腸菌，サルモネラ腸炎菌及びネズミチフス菌の複合接種時，抗−サルモネラ菌特殊IgYの平均力価を示したグラフである。
【図１ｈ】 大腸菌，サルモネラ腸炎菌及びネズミチフス菌の複合接種時，抗−大腸菌特殊IgYの平均力価を示したグラフである。
【図２ａ】 卵黄中の水溶性抗−病原性バクテリア抗体(IgY)を分離／精製する方法を示した図である。
【図２ｂ】 硫酸アンモニウム処理を利用した卵黄内の水溶性抗−病原性バクテリア抗体及び燐脂質の分離状態を示した状態図である。
【図２ｃ】 硫酸アンモニウム処理による抗−病原性バクテリア抗体(IgY)の力価変化を示したグラフである。
【図２ｄ】 希釈倍率による抗−病原性バクテリア抗体(IgY)の力価変化を示したグラフである。
【図２ｅ】 均質化作業を行った後，希釈倍率による抗−病原性バクテリア抗体(IgY)の力価変化を示したグラフである。
【図２ｆ】 濃縮及び透析による抗−病原性バクテリア抗体(IgY)の力価変化を示したグラフである。
【図２ｇ】 マヨネーズ生産による抗−病原性バクテリア抗体(IgY)の力価変化を示したグラフである。
【図２ｈ】 精製後SDS−ページ(PAGE)を利用した抗−病原性バクテリア抗体(IgY)の純度確認に関するものである。
Claims (4)
- 大腸菌抗原、サルモネラ腸炎菌抗原、ネズミチフス菌抗原、ヘリコバクター・ピロリ抗原を水酸化アルミニウムにより所定割合に乳化させた混合菌乳化液１ｍｌを１２週齢のひよこの片側の脚に１回接種し、２回目からは乳化アジュバントを使用した混合菌乳化液を１週間隔に１ｍｌずつ２回接種した後、
成長した産卵鶏に対して３カ月間隔で、前記乳化アジュバントを使用した混合菌乳化液を、前記混合菌乳化液と菌体数の割合が同一となるように０．５ｍｌずつ２回接種する、混合菌乳化液を合計５回接種する方法であって、
生産した一つの卵は、抗−大腸菌抗体、抗−サルモネラ腸炎菌抗体、抗−ネズミチフス菌抗体、及び抗−ヘリコバクター・ピロリ抗体の特殊免疫蛋白質を同時に含むことを特徴とする、抗−混合菌免疫蛋白質を含有した卵の生産方法。 - 前記１２週齢のひよこに、４．０×１０８／ｍｌの大腸菌の死菌液抗原０．１５ｍｌ、４．０×１０８／ｍｌのサルモネラ腸炎菌の死菌液抗原０．１０ｍｌ、４．０×１０８／ｍｌのネズミチフス菌の死菌液抗原０．１０ｍｌ及び４．０×１０８／ｍｌのヘリコバクター・ピロリの死菌液抗原０．３５ｍｌを水酸化アルミニウム０．３ｍｌに乳化させた大腸菌抗原：サルモネラ腸炎菌抗原：ネズミチフス菌抗原：ヘリコバクター・ピロリ抗原：乳化アジュバントの菌体数の比率が１．５：１：１：３．５：３である混合菌乳化液１ｍｌを、１回接種し、
２回目からは１週間隔に乳化アジュバントを使用した前記混合菌乳化液と菌体数の割合が同一となるように混合した混合菌乳化液を１ｍｌずつ２回接種した後、
成長した産卵鶏の脚に、２．０×１０８／ｍｌの大腸菌の死菌液抗原０．１５ｍｌ、２．０×１０８／ｍｌのサルモネラ腸炎菌の死菌液抗原０．１０ｍｌ、２．０×１０８／ｍｌのネズミチフス菌の死菌液抗原０．１０ｍｌ、２．０×１０８／ｍｌのヘリコバクター・ピロリの死菌液抗原０．３５ｍｌ及び乳化アジュバント０．３ｍｌにより製造した混合菌乳化液を３カ月間隔に０．５ｍｌずつ２回接種する、混合菌乳化液を合計５回接種する方法であって、
生産した一つの卵に、抗−大腸菌抗体、抗−サルモネラ腸炎菌抗体、抗−ネズミチフス菌抗体、及び抗−ヘリコバクター・ピロリ抗体の特殊免疫蛋白質を同時に共有させることを特徴とする、請求項１に記載の抗−混合菌免疫蛋白質を保有した卵の生産方法。 - 大腸菌抗原、サルモネラ腸炎菌抗原、ネズミチフス菌抗原、及びヘリコバクター・ピロリ抗原を完全フロインドアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ）により乳化させた所定比率の混合菌乳化液１ｍｌを１２週齢のひよこの片側の脚に１回接種し、
２回目からは不完全フロインドアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ）を使用した混合菌乳化液を前記混合菌乳化液と菌体数の割合が同一となるように１ｍｌずつ２週間隔に２回接種した後、
成長した産卵鶏に３カ月間隔に前記混合菌乳化液と菌体数の割合が同一となるように０．５ｍｌずつ２回接種する、混合菌乳化液を合計５回接種する方法であって、
生産した一つの卵に、抗−大腸菌抗体、抗−サルモネラ腸炎菌抗体、抗−ネズミチフス菌抗体、及び抗−ヘリコバクター・ピロリ抗体の特殊免疫蛋白質を同時に共有させることを特徴とする、抗−混合菌免疫蛋白質を保有した卵の生産方法。 - 前記１２週齢のひよこに接種された菌体数は、大腸菌抗原：サルモネラ腸炎菌抗原：ネズミチフス菌抗原：ヘリコバクター・ピロリ抗原：完全フロインドアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ）の比率が１．５：１： １：３．５：３としたものであり、
４．０×１０８／ｍｌの大腸菌の死菌液抗原０．１５ｍｌ、４．０×１０８／ｍｌのサルモネラ腸炎菌の死菌液抗原０．１ｍｌ、４．０×１０８／ｍｌのネズミチフス菌の死菌液抗原０．１ｍｌ、４．０×１０８／ｍｌのヘリコバクター・ピロリの死菌液抗原０．３５ｍｌ及び完全フロインドアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ）０．３ｍｌを乳化させた混合菌乳化液１ｍｌを１回接種し、
２回目からは不完全フロインドアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ）を乳化剤として使用した混合菌乳化液を前記混合菌乳化液と菌体数の割合が同一となるように１ｍｌずつ２回接種した後、
成長した産卵鶏の脚に、菌体数の割合が同一となるように２．０×１０８／ｍｌの大腸菌の死菌液抗原０．１５ｍｌ、２．０×１０８／ｍｌのサルモネラ腸炎菌の死菌液抗原０．１ｍｌ、２．０×１０８／ｍｌのネズミチフス菌の死菌液抗原０．１ｍｌ、２．０×１０８／ｍｌのヘリコバクター・ピロリの死菌液抗原０．３５ｍｌ及び不完全フロインドアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ）０．３ｍｌにより製造した混合菌乳化液を３カ月間隔に０．５ｍｌずつ２回接種する、混合菌乳化液を合計５回接種する方法であって、
生産した一つの卵に、抗−大腸菌抗体、抗−サルモネラ腸炎菌抗体、抗−ネズミチフス菌抗体、及び抗−ヘリコバクター・ピロリ抗体の特殊免疫蛋白質を同時に共有させることを特徴とする、請求項３に記載の抗−混合菌免疫蛋白質を保有した卵の生産方法。
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