KR100403281B1 - 대장균, 로타바이러스에 대한 특수면역단백질을 공유하는 계란생산방법과 상기 생산방법으로 제조된 특수면역단백질을 함유한 계란, 난황분말, 조제분유 - Google Patents
대장균, 로타바이러스에 대한 특수면역단백질을 공유하는 계란생산방법과 상기 생산방법으로 제조된 특수면역단백질을 함유한 계란, 난황분말, 조제분유 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 설사를 일으키는 대장균(Enterotoxigenic Escherichia coli: ETEC), 로타바이러스(Rotavirus Rotaviruses)를 항원화시켜 중추병아리에 동시에 접종하여 설사를 예방할 수 있는 항 대장균 특수면역단백질과 항 로타바이러스 특수면역단백질을 혼합한 복합 특수면역단백질을 계란 하나에 공유하게 하는 생산 방법과 상기 2가지 특수면역단백질을 단독으로 생산 후 적정비율로 혼합하여 식품첨가제로 사용하는 것에 관한 것이다.
또 다른 발명은 상기 복합특수면역단백질과 단독으로 생산된 두 가지 특수면역단백질을 각각 함유한 계란 및 조제분유에 관한 것이다.
본 발명에 의해서 생산된 항 혼합균 특수면역단백질과 상기 두 가지 특수면역단백질을 식품첨가제로 사용한 조제분유는 장질환 특히, 설사증후군을 예방하는 효과가 있다.
Description
본 발명은 설사를 일으키는 대장균(Enterotoxigenic Escherichia coli: ETEC), 로타바이러스(Rotavirus Rotaviruses)를 항원화시켜 중추병아리에 동시에 접종하여 설사를 예방할 수 있는 항 대장균 특수면역단백질과 항 로타바이러스 특수면역단백질을 혼합한 복합 특수면역단백질을 계란 하나에 공유하게 하는 생산방법과 상기 2가지 특수면역단백질을 단독으로 생산하여 적정비율로 혼합하여 식품첨가제로 이용하는 것에 관한 것이다.
또 다른 발명은 상기 복합특수면역단백질과 단독으로 생산된 특수면역단백질을 각각 함유한 계란, 난황분말 및 조제분유에 관한 것이다.
본 발명과 관련하여, 현재까지 보고된 대장균과 로타바이러스의 자료를 살펴보면 다음과 같다.
대장균(Enterotoxigenic Escherichia coli: ETEC, 장관 독소원성 대장균) 관련 자료를 보면 인체 및 가축의 장내에 상주하는 정상상주균총의 하나인 대장균은 소아뿐만 아니라 건강한 성인에게도 위장염과 관련있는 원인균으로 알려져 있다.
현재까지 사람의 설사원인 대장균으로서 밝혀진 것은 장관병원성 대장균(이하 EPEC라 함 :Enteropathogenic E. coli), 장관침습성 대장균(이하 EIEC라 함 :Enteroinvasive E. coli), 장관독소원성 대장균(이하 ETEC라 함 :Enterotoxigenic E. coli), 장관출현성 대장균(이하 EHEC라 함 :Enterohemorrhageic E. coli), 장관부착성 대장균(이하 EAEC라 함 :Enteroadhesive E. coli) 5가지이다.
1923년 아담(Adam)은 유아 설사환자에서 대장균을 분리하여 이 균이 위장염과 관련된다고 보고하였으며, 1940년대 중반에는 영국에서 대장균에 의한 집단설사가 유아원에서 발생하였는데 이들 일군의 대장균을 최초로 엔테로페소젠닉 이콜리(Enteropathogenic E.coli)라고 호칭한 것은 니터(Neter) 등으로서 병원성 대장균이라고 부르게 되었다.
장관독소원성 대장균(이하 ETEC라 함 :Enterotoxigenic E. coli)의 존재를 최초로 보고한 것은 1956년 데(De) 등이다. 그는 인도 칼카타의 전염병원에서 콜레라 양 증상의 환자 중 콜레라균이 분리되지 않는 환자에서 분리한 대장균을 장관결착시험(De test)으로 콜레라균과 유사한 장관 내 액체저류가 생김을 확인하였다. 싹(Sack) 등은 이 사실을 확인함과 동시에 기존의 혈청형과 다른 장관독소원성 대장균으로 호칭하게 되었다. 이후로 크게 주목받기 시작하였으며, 세계 각국에서 많이 보고되고 있다. 특히 개발도상국에서는 어린이 설사의 원인균은 물론 성인의 설사 및 위장염관련 원인균으로 중요함이 알려져 있다. 우리 나라에서도 외래장관감염증 중 가장 많은 것이 ETEC에 의한 설사이다.
ETEC 감염증의 임상 증상은 설사를 주증으로 하는 급성위장염이며, 복통과 혼합감염에 의한 혈변 및 점액변이 나타난다.
대장균에 의한 설사는 대장균이 대사물질로 분비하는 장내독소(enterotoxin)에 의한다.
대장균의 장내 독소는 그 화학적 성분이 단백질로 대장균의 장내 독소는 열에 대한 감수성 정도에 따라 내열성인 독소(heat-stable toxin : ST)와 이열성 독소(labile toxin : LT)로 구분되며, 소아설사를 일으키는 균은 주로 내열성 독소(ST)를 분비하는 대장균군이고, 성인의 설사는 이열성 독소(LT)를 분비하는 대장균에 의한 것으로 보고되어 있다(워쉬스무스 : Washsmuth, et al. 1976).
ETEC에 의해 생성되는 소장의 군집화는 소장의 점막상피세포에 세균의 직접적인 접착(adhesion)에 의해 조절된다. ETEC가 생산하는 장독소가 장점막 세포의 수용체와 결합하여 아세틸레이트 씨클레이즈(acetylate cyclase)나 구안닐레이트 씨클레이즈(guanylate cyclase)를 활성화시켜서 세포 내 씨클릭 아데노신 일인산(cyclic AMP)과 씨클릭 구아닌 일인산(cyclic GMP)을 증가시켜 염류 및 수분의 과다배출을 야기시키는 분비성 설사를 유발한다고 알려져 있다(이제철 등, 1995). 상기와 같은 과정을 통해 ETEC는 숙주의 연동운동, 점액분비와 융모운동을 방해함으로써 설사를 유발시키는 것으로 알려져 있다(이노위 : Inoue 등, 1993).
이러한 질병에 초유나 혈청면역글로블린을 급여한 결과 매우 효과적이라는 연구가 보고되었으나(파콘 : Facon 등, 1993) 다량의 항체를 얻기 위해서는 매우 많은 비용과 문제점이 발생된다. 그러나 난황에서 생산되는 항체의 생산량은 초유나 혈청의 경우보다 상대적으로 기술적 및 양적 측면에서 많은 이점을 갖고 있다.
상기의 ETEC의 특성과 발생적 특성에 따라 김정우(1998)는 장독성 대장균의 진단방법 및 그 진단용 키트에 대해 특허(대한민국 공개특허공보 1999-0066438)를 출원하였다. 이는 효소면역분석법을 이용하여 가축의 분변으로부터 원인균을 질적 및 양적으로 측정할 수 있는 측정방법 및 그 진단용 키트에 관한 것이다.
국립수의과학검역원(1998)은 돼지 유행성 설사병의 예방 및 치료를 위한 난황항체 이용경구용 면역제제에 대한 특허(대한민국 공개특허공보 1999-0079333)를 출원하였다. 이는 돼지 유행성 설사병 바이러스(PEDV)로 면역시킨 산란계가 낳은 달걀의 난황으로부터 PEDV 항원에 대하여 특이적인 항체(항 PEDV 항체)를 추출하여, 제제화한 면역제제에 관한 것이다.
설사를 일으키는 또 다른 로타바이러스의 특성은 다음과 같다.
로타바이러스는 레오바이레데(Reoviridae)과에 속하는 이중 나선형의 리보핵산(RNA)바이러스이며, 게놈(genome)은 11개의 유전자 분절로 되어 있으며, 핵은 이중 캡시드(capsid)로 둘러싸여 있는 바이러스이다. 로타바이러스 구조상 바깥에 존재하는 바이러스 단백질4(VP4 : viral protein)와 바이러스 단백질7을 기초로 하여 혈청형을 나누며 혈청형 1, 2, 3, 4가 주로 질병을 유발하며, 혈청군 A, B, C군 중에서 A군이 소아의 위장염에 흔한 원인이다.
로타바이러스는 영유아 급성 설사증의 가장 흔한 원인을 차지하고 있으며, 전세계에 분포하여 후진국이나 개발도상국뿐만 아니라 선진국에서도 지속적인 발생보고가 있다. 전세계적으로 광범위하게 발생하여 열대지방에서는 계절적인 차이없이 발생하며 온대지방에서도 연중 발생하나, 춥고 건조한 겨울철에 주로 유행하며 여름철에 발생빈도가 가장 낮다. 우리 나라에서는 10월부터 증가하기 시작하여 10월, 11월, 1월에 가장 많이 발생하며, 이 시기에 발생하는 설사증의 80% 이상의 원인이 된다(문경래, 1993). 급성기 뿐 아니라 회복이 지연되는 경우 어린이의 영양 및 성장 발육에 영향을 가져올 수 있으므로 소아의 보건학적 측면에서 중요한 질병이다.
위와 같은 로타바이러스의 특성과 발생에 따라 로타바이러스에 대한 백신은 약독화 생백신을 개발하려는 시도가 되어 왔고 처음에는 동물의 로타바이러스를 이용하는 백신인 제너리언 접근(Jennerian approach)을 개발하려 하였다. 이후 사람바이러스 유전자를 동물 바이러스에 넣어 개발하는 동물/사람 조합제(animal/human reassortant)백신인 변형된 제너리언 접근(modified jennerian approach) 백신의 개발이 시도되었다. 약 10년 전에 로타바이러스 백신이 처음 시도되었을 때 소나 원숭이에서 나온 로타바이러스를 가지고 백신을 만들어서 이종면역을 유도하기 때문에 사람에서 백신의 효과가 확실하지 않았다. 최근 들어 사람의 로타바이러스 VP7또는 VP4와 VP7이 함유된 백신을 개발하였으나, 영아에서 장중첩의 빈도가 증가된다는 합병증의 보고로 사용이 중지되어 아직 로타바이러스 백신은 실용화되지 않고 있다.
상기와 같은 로타바이러스의 특성과 발생에 따라 자이단호우징한다, 이비세이부쯔뵤우, 겐큐우카이(1998)는 로타바이러스항원, 로타바이러스 감염증에 대한 백신 및 진단제와 항원 제조방법(10-1999-072201)을 출원하였다. 이는 대량 배양이 곤란한 로타바이러스의 증식을 배양세포로부터 클로닝하고, 수득한 세포클론주에 로타바이러스를 계대하여 세포클론 순화 로타바이러스를 작성하고, 이 순화 로타바이러스주 또는 이를 친주로 사용하여 작성한 리어솔턴트를 시드바이러스로 하여 배양하고, 이 배양물로부터 로타바이러스항원을 분리 정제하는 것을 특징으로 하는 로타바이러스항원의 제조방법과 이 방법에 따라 수득된 로타바이러스항원, 이 항원을 사용하여 제조한 로타바이러스 감염증 백신 및 진단제를 제공하는 것에 관한 것이다.
상기한 바와 같이 대장균, 로타바이러스 각각에 대한 항체를 생산하여 균을 예방하는 연구가 진행되었고, 로타바이러스의 백신에 대한 연구가 오랫동안 진행되어 이용되었으나 합병증 발생으로 실용화되지 않고 있으므로 경제적으로 많은 손실이 있었고, 실생활에 이용할 수 있는 특수항체의 생산을 필요로 하였다.
따라서, 본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해서 설사를 유발하는 두 가지 균, 대장균항원과 로타바이러스항원을 제조하여 중추병아리에 동시에 면역시키고, 이 닭이 성장 후 산란된 계란에 이 두 가지 균에 대한 항체를 공유한 계란을 생산하는 방법 및 각각 독립적으로 생산된 두 가지 항체를 혼합한 후 계란을 생산하는 방법에 관한 것이다.
상기 첫 번째 방법에 의해 생산된 항 대장균 특수면역단백질, 항 로타바이러스 특수면역단백질을 동시에 공유하는 계란에서 추출한 난황분말, 수용성 특수면역단백질 그리고 상기 두 번째 방법에 의해 생산된 상기 두가지 특수면역단백질을 각각 함유하는 별개의 계란에서 추출한 난황분말, 수용성 특수면역단백질을 함유한 조제분유를 제공하는 것을 목적으로 한다.
도 1은 단독 접종시 및 복합 접종시 항-로타바이러스 특수IgY 역가변화이다.
도 2는 단독 접종시 및 복합 접종시 항-대장균 특수IgY 역가변화이다.
도 3은 단독 접종시 및 복합 접종시 로타바이러스 총IgY 평균역가이다.
도 4는 단독 접종시 및 복합 접종시 항-로타바이러스 특수IgY 평균역가이다.
도 5는 단독 접종시 및 복합 접종시 대장균 총IgY 평균역가이다.
도 6은 단독 접종시 및 복합 접종시 항-대장균 특수IgY 평균역가이다.
전술한 기술적 과제를 달성하기 위한 본 발명은, 설사를 일으키는 대장균(Enterotoxigenic Escherichia coli: ETEC), 로타바이러스(Rotavirus Rotaviruses)를 항원화시켜 중추병아리에 동시에 접종하여 설사를 예방할 수 있는 항 대장균 특수면역단백질과 항 로타바이러스 특수면역단백질을 혼합한 복합 특수면역단백질을 계란 하나에 공유하게 하는 생산 방법과 상기 2가지 특수면역단백질을 단독으로 생산 후 적정비율로 혼합하여 식품첨가제로 이용하는데 그 특징이 있다.
또 다른 발명은 두 가지 특수면역단백질을 함유한 계란, 난황분말, 특수면역단백질을 제공하는데 그 특징이 있다.
또 다른 발명은 상기 계란에서 추출한 난황분말, 항 대장균 특수면역단백질, 항 로타바이러스 특수면역단백질을 일정비율로 배합한 특수면역단백질을 함유한 조제분유에 그 특징이 있다.
본 발명은 중추병아리에 대장균항원과 로타바이러스항원을 수산화알미늄 유화보조제로 유화시킨 혼합균 유화액 1㎖를 중추병아리 한쪽 다리에 1회 접종하여 1차 접종하고, 상기 2개의 항원을 유화보조제(ISA25)로 유화시킨 혼합균 유화액을 2주 간격으로 1㎖씩 3회 2차 접종한 후, 성장한 산란계에 다시 한달 간격으로 상기 2개의 항원을 유화보조제(ISA25)로 유화시킨 혼합균 유화액을 0.5㎖씩 4회 접종을 포함하여 총 8회를 접종하는 방법으로, 생산한 한 개의 계란에 항 대장균 특수면역단백질(IgY)과 항 로타바이러스 특수면역단백질(IgY)을 동시에 공유하게 하는 것을 특징으로 하는 특수면역단백질(IgY)을 보유한 계란생산방법에 관한 것이다. 상기 방법을 보다 구체적으로 기술하면, 중추병아리에 접종된 균체수가, 대장균항원 : 로타바이러스항원 : 유화보조제의 비율이 3.5 : 3.5 : 3이 되게, 대장균항원과 로타바이러스항원에 수산화알미늄 유화보조제로 유화시킨 혼합균 유화액인 4.0×108/㎖ 대장균사균액항원 0.35㎖와 4.0×107TCID50로타바이러스 불활화항원 0.35㎖를 수산화알미늄 유화보조제 0.3㎖로 유화시킨 혼합균 유화액 1㎖를 중추병아리 다리에 1회 접종하여 1차 접종하고, 상기 항원에 유화보조제(ISA25)를 상기 혼합균 유화액과 동일 비율로 유화시킨 혼합균 유화액을 2주 간격으로 중추병아리 다리에 1㎖씩 3회 2차 접종한 후, 성장한 산란계에 상기 혼합균 유화액과 동일 비율로 4.0×108/㎖ 대장균사균액항원 0.35㎖와 4.0×107TCID50로타바이러스 불활화항원 0.35㎖를 유화보조제(ISA25) 0.3㎖로 유화시킨 혼합균 유화액을 한 달마다 중추병아리 다리에 0.5㎖씩 4회 접종을 포함하여 총 8회를 접종하는 방법으로, 생산한 한 개의 계란에 항 대장균 특수면역단백질(IgY)과 항 로타바이러스 특수면역단백질(IgY)을 동시에 공유하게 하는 것을 특징으로 하는 특수면역단백질(IgY)을 보유한 계란생산방법에 관한 것이다.
또 다른 발명의 구성은, 대장균항원과 로타바이러스항원을 프로인트 완전보조제(Adjuvant complete Freund's)로 유화시킨 혼합균 유화액 1㎖를 중추병아리 다리에 1회 접종하여 1차 접종하고, 상기 2개의 항원을 프로인트 불완전보조제(Adjuvant incomplete Freund's)로 유화시킨 혼합균 유화액을 1주 간격으로 1㎖씩 3회 접종하여 2차 접종한 후, 성장한 산란계에 다시 한 달 간격으로 상기 2개의 항원을 프로인트 불완전보조제로 유화시킨 혼합균 유화액을 0.5㎖씩 4회 접종을 포함하여 총 8회를 접종하는 방법으로, 생산한 한 개의 계란에 항 대장균 특수면역단백질(IgY)과 항 로타바이러스 특수면역단백질(IgY)을 동시에 공유하게 하는 것을 특징으로 하는 특수면역단백질(IgY)을 보유한 계란생산방법에 관한 것이다. 상기 발명을 보다 구체적으로 기술하면, 중추병아리에 접종된 균체수가 대장균항원 : 로타바이러스항원 : 유화보조제의 비율이 3.5 : 3.5 : 3이 되게, 대장균항원과 로타바이러스항원에 프로인트 완전보조제로 유화시킨 혼합균 유화액인 4.0×108/㎖ 대장균사균액항원 0.35㎖와 4.0×107TCID50로타바이러스 불활화항원 0.35㎖를 프로인트 완전보조제 0.3㎖로 유화시킨 혼합균 유화액 1㎖를 중추병아리 다리에 1회 접종하여 1차 접종하고, 상기 항원에 프로인트 불완전보조제를 상기 혼합균 유화액과 동일비율로 배합한 혼합균 유화액을 1주 간격으로 1㎖씩 3회 2차 접종한 후, 성장한 산란계에 상기 혼합균 유화액과 동일비율로 4.0×108/㎖ 대장균사균액항원 0.35㎖와 4.0×107TCID50로타바이러스 불활화항원 0.35㎖를 프로인트 불완전보조제 0.3㎖로 유화시킨 혼합균 유화액을 1달마다 0.5㎖씩 4회 접종을 포함하여 총 8회를 접종하는 방법으로 생산한 한 개의 계란에 항 대장균 특수면역단백질과 항 로타바이러스 특수면역단백질을 동시에 공유하게 하는 것을 특징으로 하는 특수면역단백질을 보유한 계란생산방법에 관한 것이다.
상기 발명을 보다 구체적으로 기술하면, 상기의 방법으로 생산된 계란을 소정의 용기에서 난황막을 제거한 난황을 동결건조하여 난황분말을 제조하고, 난황에 동량의 증류수를 첨가하고 일정시간 실온에 방치 후 소디움 알지네이트(sodium alginate)용액을 혼합하여 일정시간 방치 후, 원심분리법으로 추출한 것을 동결건조하여 항 혼합균 특수면역단백질 분말을 제조하는 것을 특징으로 한다.
또 다른 발명의 구성은 항 혼합균 특수면역단백질을 보유하는 난황분말과 항혼합균 특수면역단백질 분말을 첨가한 조제분유를 제조시, 항 혼합균 특수면역단백질을 보유하는 난황분말을 5.0% 이상 함유한 조제분유와 항 혼합균 특수면역단백질을 1.0% 이하 함유하는 조제분유에 관한 것이다.
그리고 또 다른 발명의 구성은 대장균항원, 로타바이러스항원 각각의 항원과 수산화알미늄 유화보조제로 유화시킨 유화액 1㎖를 서로 다른 중추병아리 한쪽 다리에 1차 접종하고, 상기 각각의 항원을 유화보조제(ISA25)로 유화시킨 유화액을 1주 간격으로 1㎖씩 3회 2차 접종한 후, 성장한 산란계에 다시 한달 간격으로 상기 각각의 항원을 유화보조제(ISA25)로 유화시킨 유화액을 서로 다른 중추병아리 한쪽 다리에 0.5㎖씩 4회 접종을 포함하여 총 8회 접종하는 방법으로, 생산한 한 개의 계란에 항 대장균 특수면역단백질, 항 로타바이러스 특수면역단백질 각각을 보유하는 것을 특징으로 하는 특수면역단백질을 보유한 별개의 계란생산방법에 관한 것이다. 상기 발명의 구성을 보다 구체적으로 기술하면, 상기 중추병아리에 개별적으로 접종된 균체수가 대장균, 로타바이러스 각각 108/㎖를 포함되게 대장균항원 : 유화보조제, 로타바이러스항원 : 유화보조제의 비율이 1:1로 하여 2.0×108/㎖ 대장균사균액항원 0.5㎖와 2.0×107TCID50로타바이러스항원 각각을 수산화알미늄 유화보조제 0.5㎖로 유화시켜, 상기 유화액 1㎖를 각각의 중추병아리 다리에 1회 접종하여 1차 접종하고, 유화보조제(ISA25)가 상기 항원을 상기 유화액과 동일비율로 유화시킨 유화액을 1주 간격으로 1㎖씩 3회 접종한 후, 성장한 산란계에 다시 한달 간격으로 2.0×108/㎖ 대장균사균액항원 0.5㎖와 2.0×107TCID50로타바이러스항원 0.5㎖ 각각을 유화보조제(ISA25) 0.5㎖로 유화시킨 유화액을 0.5㎖씩 4회 접종을 포함하여 총 8회 접종하는 방법으로 항 대장균 특수면역단백질, 항 로타바이러스 특수면역단백질을 보유한 별개의 계란생산방법에 관한 것이다.
그리고 다른 발명의 구성은 중추병아리에 개별적으로 접종된 균체수가 대장균 108/㎖, 로타바이러스 107TCID50이 포함되게 대장균항원 : 유화보조제, 로타바이러스항원 : 유화보조제의 비율이 1:1로 하여 2.0×108/㎖ 대장균사균액항원 0.5㎖와 2.0×107TCID50로타바이러스항원 0.5㎖ 각각을 수산화알미늄 유화보조제 0.5㎖로 유화시켜, 상기 유화액 1㎖를 각각의 중추병아리 다리에 1회 접종하여 1차 접종하고, 유화보조제(ISA25)가 상기 항원을 상기 유화액과 동일비율로 유화시킨 유화액을 1㎖씩 1주 간격으로 3회 접종한 후, 성장한 산란계에 다시 한달 간격으로 2.0×108/㎖ 대장균사균액항원 0.5㎖와 2.0×107TCID50로타바이러스항원 0.5㎖ 각각을 유화보조제(ISA25) 0.5㎖로 유화시킨 유화액을 0.5㎖씩 4회 접종을 포함하여 총 8회 접종하는 방법으로 항 대장균 특수면역단백질, 항 로타바이러스 특수면역단백질을 보유한 별개의 계란생산방법에 관한 것이다.
또 다른 발명의 구성은 대장균항원, 로타바이러스항원 각각의 항원과 프로인트 완전보조제로 유화시킨 유화액 1㎖를 서로 다른 중추병아리 한쪽 다리에 1회 접종하여 1차 접종하고, 상기 각각의 항원을 프로인트 불완전보조제로 유화시킨 유화액을 1주 간격으로 1㎖씩 3회 2차 접종한 후, 성장한 산란계에 다시 한달 간격으로 상기 각각의 항원을 프로인트 불완전보조제로 유화시킨 유화액을 서로 다른 중추병아리 한쪽 다리에 0.5㎖씩 4회 접종을 포함하여 총 8회를 접종하는 방법으로 생산한 한 개의 계란에 항 대장균 특수면역단백질, 항 로타바이러스 특수면역단백질 각각을 보유하는 것을 특징으로 하는 특수면역단백질을 보유한 별개의 계란을 생산하는 방법에 관한 것이다. 상기 발명의 구성을 보다 구체적으로 기술하면, 상기 중추병아리에 개별적으로 접종된 균체수가 대장균 108/㎖, 로타바이러스 107TCID50이 포함되게 대장균항원 : 유화보조제, 로타바이러스항원 : 유화보조제의 비율이 1 : 1로 하여 2.0×108/㎖ 대장균사균액항원 0.5㎖와 2.0×107TCID50로타바이러스항원 0.5㎖ 각각을 프로인트 완전보조제 0.5㎖로 유화시켜, 상기 유화액 1㎖를 각각의 중추병아리 다리에 1회 접종하여 1차 접종하고, 프로인트 불완전보조제가 상기 항원을 상기 유화액과 동일비율로 유화시킨 유화액을 1주 간격으로 1㎖씩 3회 2차 접종한 후, 성장한 산란계에 다시 한달 간격으로 2.0×108/㎖ 대장균사균액항원 0.5㎖와 2.0×107TCID50로타바이러스항원 0.5㎖ 각각을 프로인트 불완전보조제 0.5㎖로 유화시킨 유화액을 0.5㎖씩 4회 접종을 포함하여 총 8회 접종하는 방법으로 항 대장균 특수면역단백질, 항 로타바이러스 특수면역단백질을 보유한 별개의 계란생산방법에 관한 것이다.
또 다른 발명의 구성은 중추병아리에 개별적으로 접종된 균체수가 대장균 108/㎖, 로타바이러스 107TCID50이 포함되게 대장균항원 : 유화보조제, 로타바이러스항원 : 유화보조제의 비율이 1:1로 하여 2.0×108/㎖ 대장균사균액항원 0.5㎖와 2.0×107TCID50로타바이러스항원 0.5㎖ 각각을 프로인트 완전보조제 0.5㎖로 유화시켜, 상기 유화액 1㎖를 각각의 중추병아리 다리에 1회 접종하여 1차 접종한 후, 프로인트 불완전보조제가 상기 항원을 상기 유화액과 동일비율로 유화시킨 유화액을 1주 간격으로 1㎖씩 3회 2차 접종한 후, 성장한 산란계에 다시 한달 간격으로 2.0×108/㎖ 대장균사균액항원 0.5㎖와 2.0×107TCID50로타바이러스항원 0.5㎖ 각각을 프로인트 불완전보조제 0.5㎖로 유화시킨 유화액을 0.5㎖씩 4회 접종을 포함하여 총 8회 접종하는 방법으로 항 대장균 특수면역단백질, 항 로타바이러스 특수면역단백질을 보유한 별개의 계란생산방법에 관한 것이다.
또 다른 발명의 구성은 상기 방법으로 생산된 계란에서 분리 후 동결건조한 항 대장균 특수면역단백질과 항 로타바이러스 특수면역단백질의 배합비가 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1 중 어느 하나의 배합비율로 선택된 것을 특징으로 하는 수용성 특수면역단백질을 함유한 난황분말의 혼합조성물을 5.0% 이상 12.0% 이하 함유하는 것을 특징으로 하는 조제분유에 관한 것이다.
또 다른 발명의 구성은 상기 방법으로 생산된 계란에서 분리 후 동결건조한 항 대장균 특수면역단백질과 항 로타바이러스 특수면역단백질의 배합비가 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1중 어느 하나 배합비율로 선택된 것을 특징으로 하는 난황 수 용성 특수면역단백질의 혼합조성물을 0.6% 이상 1.0% 이하 함유하는 것을 특징으로 하는 조제분유에 관한 것이다.
이하에서는 본 발명의 구성을 보다 구체적으로 실시예 및 도면이나 도표에 의거하여 보다 상세히 설명하기로 하겠다. 다만, 본 발명의 권리범위는 실시예나 도면에 의하여 본 발명의 청구범위가 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
1. 대장균(Enteropathogenic E. coli)분리 동정 및 항원제조
가) 사람에서의 대장균(Enterotoxigenic Escherichia coli: ETEC)분리 및 동정
본 시험에 사용된 대장균은 사람에서 분리하였다. 즉, 항원으로 사용된 대장균(Enterotoxigenic E. coli)은 설사증상을 나타낸 소아의 분변에서 분리하였다. 균의 분리는 다음과 같은 방법으로 하였다. 소아의 설사분변을 혈액한천배지에 도말 후 37℃, 항온기에서 18시간 배양하여 α-용혈성을 나타내는 하나의 대장균 집락을 선택하였다. 선택된 집락은 멕콘키 배지(MacConkey agar)에서 핑크색의 집락으로 자랐으며, EMB 배지(EMB agar)에 도말하여 철녹색(metalic green)으로 자라는 대장균의 특이적인 집락성상을 확인하였다. 이렇게 분리된 대장균을 EB-E01로 명명하였다.
나)독소(Toxin) 생산능 확인
대장균(E. coli)의 장관독소원성(enterotoxigenicity)의 주요원인인 장관성독소(Enterotoxin)의 생산능을 중합효소반응(Polymerase Chain Reaction ; 이하 PCR이라 함)기법을 이용하여 확인하였다. 열안전성 독소(이하 ST ; heat stable toxin)의 STal 유전자와 열 불안정성 독소(이하 LT ; heat lable toxin)의 LTh유전자에 대한 특이 원형체(Primer)를 이용한 다복합(multiplex) PCR기법을 이용하여 증폭하였다.
ST 독소 확인용 원형체는
sense primer : CCCCTCTTTTAGTCAGTC
anti-sense primer : CCAGCACAGGCAGGATTACA
165bps의 최종산물을 증폭하도록 작제된 것을 사용하였다.
LT 독소 확인용 원형체는
sense primer : CAGACTATCAGTCAGAGGTTG
anti-sense primer : TTCATACTGATTGCCGCA
417bps의 최종산물을 증폭하도록 작제된 것을 사용하였다.
PCR조건은 전-변성온도(Pre-denaturation temperature)는 95℃ 온도 하에서 5분간, 변성온도(Denaturation temperature)는 94℃ 온도 하에서 1분간, 병합온도(Annealing temperature)는 56℃ 온도 하에서 1분간, 연장온도(Elongation temperature)는 72℃ 하에서 1분간, 후-연장온도(Post-elongation temperature)는 72℃ 온도 하에서 10분간으로 진행되었다. 증폭된 산물은 2% 한천겔(agarose gel)을 이용한 전기영동으로 확인하였다. 본 발명에 사용된 분리균주는 ST독소를 생산하는 것이 확인되었다.
다) 대장균 ETEC(Enterotoxigenic E. coli)항원제조
대장균 ETEC 균주를 트립티케이스 소이 배지(Trypticase soy agar) 접종 후 37℃ 항온기에서 18시간 배양 후 하나의 집락(colony)을 5㎖의 트립티케이스 소이 브로스(Trypticase soy broth)에 접종하였다. 2시간 후 대량의 트립티케이스 브로스에 접종 후 37℃에서 48시간 정치 배양하였다. 배양된 균액은 포름알데하이드(formaldehyde)를 총량의 0.2% 되도록 섞고 실온에서 24시간 불활화시켰다. 불활화된 균액은 4,000rpm에서 20분간 원심분리하여 균을 수확하였고 멸균 생리식염수(pH 7.2)로 3회 세척하였다. 수확된 균체는 410㎚에서 O.D.(Oculus Dexter)가 1.2∼1.3 되도록 생리식염수에 부유시킨 뒤 사용하였다.
2. 로타바이러스(Rotarvirus)의 분리 동정 및 항원제조
가) 로타바이러스(Rotavirus Rotaviruses) 항원제조
레써스 원숭이(Rhesus monkey) 태아의 신장으로부터 유래된 MA-104 cell을 로타바이러스 분리 및 증폭을 위해 사용하였다. 세포증식용 배지로는 10% fetal bovine serum이 첨가된 듀베쿠스 필수 배지(이하 DMEM이라 함 : Dubeccous essential medium)를 사용하였다. 세포배양조건은 이산화탄소 5%를 함유하는 37℃ 항온기(incubator)에서 배양하였다.
나) 대변검체에서 바이러스 분리 및 바이러스 증폭
Ⅰ) 대변검체
설사증상을 일으킨 유아의 설사변을 실험에 사용하였다.
Ⅱ) 일렉트로페로타이핑(Electropherotyping)
대변검체의 로타바이러스 양성여부를 확인하기 위하여 실시하였다. 대변검체 100㎍을 소디움 아세테이트(sodium acetate 0.1M)용액 1㎖에 희석하여 진탕한 후 동량의 페놀(Phenol) : 클로로포름(Chloroform) : 이소아밀 알콜(Isoamyl alcohol)(25:24:1) 첨가하여 진탕하였다. 원심분리를 12,000rpm에서 10분간 실시한 뒤 상층액을 취하였다.
PAGE는 레밀리(Laemli)방법을 따라 8%의 폴리아크릴아미드 평판 겔(polyacrylamide slab gel)에 상기 방법으로 추출한 RNA를 넣고 10㎃로 16시간 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 뒤, 고정액에서 30분간 고정 후 질산은 용액(silver nitrate 0.01M)으로 2시간 동안 염색을 하였다. 염색한 겔은 소디움 보오로하이드라이드(sodium borohydride 0.0023M)로 10분간 환원과정을 거친 뒤 고정하였다. 로타바이러스 특유의 띠가 확인되는 것을 양성으로 판정하였다. 양성판정된 로타바이러스를 EB-RS02로 명명하였다.
Ⅲ) 로타바이러스의 분리
대변검체 중 전기영동명명법(electrophenotyping)에서 양성이 나온 시료를 이용하여 로타바이러스를 분리하였다. 로타바이러스의 처리배지는 트립신(Trypsin) 10㎍/㎖가 첨가된 비혈청함유 DMEM을 이용하였으며 유지배지는 트립신 0.5㎍/㎖가 첨가된 비혈청함유 DMEM을 사용하였다.
양성인 대변검체 200㎍을 처리배지 2㎖에 진탕하여 4℃에서 16시간 반응 후37℃에서 1시간 반응시켰다. 원심분리를 3000rpm에서 10분간 실시하여 상층액을 얻었으며, 상층액은 0.45㎛ 여과기(filter)를 이용하여 여과(filteration)하였다. MA-104 cell을 1×105cells/㎖로 씨딩(seeding)하여 70% 정도 단층(monolayer)되었을 때 비혈청함유 DMEM으로 3회 세척 후 처리배지(Trypsin 10㎕/㎖)에서 반응된 대변검체시료를 접종하였다. 37℃에서 1시간 30분간 감작시킨 뒤 비혈청함유 DMEM으로 1회 세척 후 유지배지로 교환하였고 세포배양조건과 동일한 환경에서 접종된 세포를 배양하였다. 세포변성효과여부를 관찰하였으며 나타나면 배양상층액을 3회 얼리고 녹이는 과정을 반복하여 -20℃에 보관하여 다음 배양에 사용하였다.
Ⅳ) 로타바이러스의 증폭
MA-104cell을 1×105cells/㎖로 씨딩(seeding)하여 70%정도 단층(monolayer)되었을 때 비혈청함유 DMEM으로 3회 세척한 후 처리배지(Trypsin 10㎕/㎖)에서 4℃의 조건하에서 16시간 반응된 바이러스를 접종하였다. 37℃에서 1시간 30분간 감작시킨 뒤 비혈청함유 DMEM으로 1회 세척후 유지배지로 교환하였고 세포배양조건과 동일한 환경에서 전종된 세포를 배양하였다. 세포변성효과여부를 관찰하였으며 나타나면 배양 상층액을 3회 얼리고 녹이는 과정을 반복하여 -20℃에 보관하였다.
Ⅴ)로타바이러스의 불활화
로타바이러스의 불활화는 2-브로모에틸아미드(2-Bromoethylamide : BEA)를 이용하였다. 로타바이러스에 최종 농도 0.004M의 BEA를 첨가하여 37℃에서 5시간 불활화하였으며, 반응은 0.004M의 소디움 티오썰페이트(sodium thiosulfate 2M) 용액으로 정지하였다.
Ⅵ)엘라이저(ELISA)용 로타바이러스항원의 제조
MA-104cell에서 증폭된 로타바이러스를 25,000rpm에서 90분간 초고속원심분리하였다. 원심분리 후 침전물에 2㎖의 완충용액을 넣고 4℃에서 16시간 정치시킨 뒤 부유한다. 부유된 액체는 18㎑에서 1분간 3회 고주파 분해(sonication)하여 엘라이저(ELISA)항원으로 이용하였다.
3. 복합된 두가지 항원을 중추병아리에 접종 및 산란계에 부스팅(boosting)
가) 중추 12주령의 병아리에 접종된 항원이 대장균 균체수 108/㎖, 로타바이러스 107TCID50이 되게, 대장균항원 : 로타바이러스항원 : 유화보조제의 비율을 3.5 : 3.5 : 3으로 하였다. 보다 상세하게는 4.0×108/㎖ 대장균사균액항원 0.35㎖와 4.0×107TCID50로타바이러스항원 0.35㎖와 수산화알미늄 0.3㎖를 유화시킨 후 1회 접종을 하였고, 2회째부터 부스팅에 사용된 보조제는 공지된 ISA25를 사용하여 접종하였는데, 일차적으로 혼합균 유화액을 1회째 접종을 포함하여 중추12주령의 병아리 한쪽다리에 1㎖씩 1주 간격으로 4회 접종한 후, 28주령의 산란계에다 한달 간격으로 동일한 비율로 제조한 유화액을 다리에 0.5㎖씩 4회 접종하였다. 상기 두 가지 항원을 함께 총 8회 접종하였다.
나) 중추12주령의 병아리에 접종된 대장균 균체수가 108/㎖, 로타바이러스 107TCID50이 되게, 대장균항원, 로타바이러스항원, 유화보조제의 비율은 3.5 : 3.5 : 3으로 하였다. 보다 상세하게는 4.0×108/㎖ 대장균사균액항원 0.35㎖와 4.0×107TCID50로타바이러스항원 0.35㎖와 프로인트 완전유화제(Adjuvant complete Freund's) 0.3㎖를 유화시킨 후 1회 접종하였고, 2회째부터 부스팅에 사용된 보조제는 공지된 프로인트 불완전유화제(Adjuvant incomplete Freund's)를 사용하여 접종하였는데, 상기 혼합균 유화액을 중추12주령의 병아리 한쪽 다리에 1㎖씩 1주 간격으로 1회째 접종을 포함하여 4회 접종한 후, 28주령의 산란계에 한 달 간격으로 동일한 비율로 제조한 유화액을 다리에 0.5㎖씩 4회 접종하였다. 상기 두가지 항원을 함께 총 8회 접종하였다.
그 결과 상기 혼합균 유화액을 접종한 산란계로부터 생산한 한 개의 계란에 항-대장균 특수면역단백질(IgY)과 항-로타바이러스 특수면역단백질(IgY)을 동시에 공유한 계란을 생산하였다.
4. 난황 분리, 난황분말추출, 면역단백질 분리 및 역가 측정
가) 난황분리
상기 방법에 의하여 생산된 계란을 깨서 난황을 제외한 나머지를 분리하여 신선난황을 분리하여 플라스크나 병에 넣는다.
나) 난황분말
상기 분리된 신선 난황을 원심분리한 후 동결건조한 후 난황분말을 추출한다.
다) 면역단백질 분리 및 역가 측정
시험 분석에 사용된 면역단백질의 분리 및 측정법은 공지된 방법으로 하였다.
막을 제거한 난황 35g을 250㎖ 병에 넣은 다음, 증류수 35㎖를 첨가하여 교반하였다. 수분간 실온에서 방치한 후 난황의 4배 분량(140㎖)의 λ-카라기난(0.1%)과 혼합하여, 다시 30분간 방치해둔 다음 10,000×g에서 15분간 원심분리하였다. 침전물은 주로 인지질이므로 제거하고, 상층액은 수용성 단백질이므로 이 부분을 #2여지로 여과하였다.
상기 여과에 의해 얻어진 수용성 단백질 중 총 IgY의 함량과 특수 IgY함량을 다음과 같이 측정하였다.
총 IgY 함량 측정은 희석된 래빗 항-치크 IgG 항체(rabbit anti-chick IgG antibody)를 마이크로플레이트에 코팅하여 16시간 방치해 둔 다음 세척하였다. 이 마이크로플레이트에 상기 여과에 의해 얻어진 수용성 단백질(조항체)을 넣어 반응시킨 후 세척한 다음, 1/30,000로 희석된 래빗 항-치크 IgG Ab-HRP를 첨가한다. 여기에 HRP의 기질로는 TMB를 사용했고 반응정지액으로는 2노르말 황산(2N-H2SO4)을 이용하여 450㎚에서 흡광도를 측정하였다. 이 결과를 도 3∼도 4에 도시하였다.
또한, 특이 IgY의 함량 측정도는 샌드위치 엘라이저(ELISA)방법에 의해 수행되었다. 로타바이러스의 O.D.값이 660㎚에서 0.05가 되도록 완충액으로 희석하였다.
상기 희석된 균체를 마이크로플레이트에 코팅하고 16시간 방치하였다. 이 마이크로플레이트를 세척한 후 상기 여과된 수용성 단백질을 넣고 반응시킨 다음 세척하여, 1/10,000로 희석된 래빗 항-치크 IgG Ab-HRP를 첨가하였다. HRP의 기질로 TMB를 사용하였고, 반응 정지액으로 2노르말 황산(2N-H2SO4)을 이용하여 450㎚에서 흡광도를 측정하였다. 이 결과를 도 5∼도 6에 도시하였다.
도 4와 도 6에서 보는 바와 같이 프로인트 유화제 사용시 항 로타바이러스 특수IgY 평균역가, 항 대장균 특수IgY 역가가 ISA25 유화제 사용시보다 2배 정도 증가하며, 또한 프로인트 유화제를 사용하여 대장균과 로타바이러스를 복합접종시 항 대장균 특수IgY 평균역가와 항 로타바이러스 특수IgY 평균역가가 ISA25 유화제 사용시보다 2배정도 증가하였다.
5. 두가지 항체를 함유한 조제분유 제조
가) 수용성 단백질 추출
수용성 단백질 추출은 다음과 같은 방법으로 하였다.
난황을 막없이 채취하여, 250㎖ 용량의 병에 막을 제거한 난황 20g을 넣었다. 같은 량의 증류수를 20㎖를 첨가하여 교반하였다. 10분간 실온에 방치 후 난황의 6배 분량(120㎖)의 소디움 알지네이트(sodium alginate: 0.16% 용액)를 섞은 후 30분간 방치하여 둔 다음 10,000×g에서 15분간 원심분리하였다. 침전물은 주로 인지질이므로 버리고, 상층액은 수용성 단백질이므로 이 부분을 #2 여지로 여과하였다. 이 수용성 단백질을 냉동 건조시켰는데 총 면역단백질 함량이 15% 이상으로 분석되었다. 소디움 알지네이트에 의한 추출은 카라기난과 유사한 효과가 있었다.
나) 복합 면역단백질을 함유한 조제분유 제조
앞 항에서와 같이 로타바이러스항원과 대장균항원으로 혼합시킨 복합 항원을 접종 후 생산된 계란에서 추출한 수용성 단백질(crude IgY)분말을 첨가하여 조제분유를 제조하였으며, 조제분유의 제조 배합비는 아래 제시된 바와 같다.
| 설사 예방 IgY함유 조제분유 배합비 예 | |||
| 원 료 | 배합비A | 배합비B | 배합비C |
| 탈지분유 | 62.00% | 66.50% | 62.00% |
| 유청분말 | 9.00 | 9.50 | 9.00 |
| 야자유 | 4.00 | 4.00 | 4.00 |
| 올리브기름 | 2.00 | 2.00 | 2.00 |
| 유당분말 | 9.00 | 9.00 | 9.00 |
| 백설탕 | 6.00 | 6.00 | 6.00 |
| 라이소자임 | 0.50 | 0.50 | 0.50 |
| 항-복합균*난황분말 | 5.00 | - | 4.50 |
| 항-복합균*난황 IgY추출분말 | - | 1.00 | 0.50 |
| 비타민무기질첨가제 | 1.50 | 1.50 | 1.50 |
| *복합균은 두 가지 균을 동시에 접종한 후 생산된 난황분말 |
실시예 1에서 개발된 단독 접종시 및 복합 접종시 로타바이러스의 총IgY 평균 역가는 도 3에, 항-로타바이러스 특수IgY 평균역가는 도 4에서와 같다.
실시예 2
실시예 2는 두 가지 항체를 독립적으로 생산 후 항체 혼합 및 그 생산방법에 의하여 생산된 계란에서 추출한 특수면역단백질을 이용한 조제분유에 관한 것이다.
1. 대장균(Enteropathogenic E. coli)분리 동정 및 항원제조
본 발명에 사용된 대장균은 사람에서 분리하였다.
대장균의 분리, 동정, 및 항원제조는 실시예 1에 제시된 바와 동일하다.
2. 로타바이러스(Rotavirus Rotaviruses)항원제조
로타바이러스의 항원제조도 실시예 1에 제시된 바와 동일하다.
3. 두가지 항원을 독립적으로 중추병아리에 접종 및 산란계에 부스팅(boosting)
가) 중추 12주령의 병아리에 접종된 균체수가 대장균 108/㎖, 로타바이러스가 107TCID50이 되게, 대장균항원 : 유화보조제의 비율을 1 : 1, 로타바이러스항원 :유화보조제의 비율을 1 : 1로 하였다. 보다 상세하게는 2.0×108/㎖ 대장균사균액항원 0.5㎖와 수산화알미늄 0.5㎖를 유화시키고, 따로 2.0×107TCID50로타바이러스항원 0.5㎖와 수산화알미늄 0.5㎖를 유화시킨 후, 이 유화액을 서로 다른 한쪽 다리에 1㎖씩을 1회 접종하고, 2회째부터 유화보조제는 ISA25를 사용하여 1주 간격으로 1회 접종을 포함하여 1㎖씩을 4회 접종하였다. 성장 후 28주령의 산란계에 한 달 간격으로 2.0×108/㎖ 대장균사균액항원 0.5㎖와 ISA25보조제 0.5㎖를 유화시키고, 따로 2.0×107TCID50로타바이러스항원 0.5㎖와 ISA25 보조제 0.5㎖를 유화시킨 각각의 유화액을 다리에 0.5㎖씩 4회 접종하였다. 상기 두 가지 항원을 혼합하지 않고 개별적으로 총 8회 접종하였다.
나) 중추 12주령의 병아리에 접종된 균체수가 대장균 108/㎖, 로타바이러스 107TCID50이 되게, 대장균항원 : 유화보조제의 비율을 1 : 1, 로타바이러스항원 : 유화보조제의 비율을 1 : 1로 하였다. 보다 상세하게는 2.0×108/㎖ 대장균사균액항원 0.5㎖와 프로인트 완전유화제 0.5㎖를 유화시키고, 따로 2.0×107TCID50로타바이러스항원 0.5㎖와 프로인트 완전유화제 0.5㎖를 유화시킨 후, 이 유화액을 서로 다른 중추병아리 한쪽 다리에 1㎖씩 1회 접종하고, 2회 째부터 유화보조제는 프로인트 불완전유화제를 사용하여 1주 간격으로 1회 접종을 포함하여 4회 1㎖씩을 접종하였다. 성장 후 28주령의 산란계에 한달 간격으로 2.0×108/㎖ 대장균사균액항원 0.5㎖와 프로인트 불완전유화제(Adjuvant incomplete Freund's)보조액 0.5㎖를 유화시키고, 따로 2.0×107TCID50로타바이러스항원 0.5㎖와 프로인트 불완전유화제(Adjuvant incomplete Freund's)보조액 0.5㎖를 유화시키고 각각의 유화액을 닭의 다리에 0.5㎖씩 4회 접종하였다. 상기 두가지 항원을 혼합하지 않고 개별적으로 총 8회 접종하였다. 그 결과 상기 개별균 유화액을 접종한 산란계로부터 생산한 계란에 항-대장균 특수면역단백질(IgY) 및 항-로타바이러스 특수면역단백질(IgY)을 독립적으로 함유한 계란을 생산하였다.
4. 난황분리, 난황분말추출, 면역단백질 분리 및 역가 측정
난황분리, 난황분말추출, 시험분석에 사용한 면역단백질의 분리 및 측정법은 실시예 1과 같다.
5. 혼합 면역단백질을 함유한 조제분유 제조
앞 항에서와 같이 개별적으로 대장균항원과 로타바이러스항원을 접종 후 생산된 계란에서 추출한 수용성 단백질(crude IgY)분말이나 신선한 난황 또는 건조 난황을 각각 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1로 혼합 식품첨가제로 사용하였으며, 조제분유의 제조 배합비는 아래 제시된 바와 같다.
| 설사예방 IgY함유 조제분유 배합비 예 | |||
| 원 료 | 배합비A | 배합비B | 배합비C |
| 탈지분유 | 62.00% | 66.50% | 62.00% |
| 유청분말 | 9.00 | 9.50 | 9.00 |
| 야자유 | 4.00 | 4.00 | 4.00 |
| 올리브기름 | 2.00 | 2.00 | 2.00 |
| 유당분말 | 9.00 | 9.00 | 9.00 |
| 백설탕 | 6.00 | 6.00 | 6.00 |
| 라이소자임 | 0.50 | 0.50 | 0.50 |
| 항-혼합균*난황분말 | 5.00 | - | 4.50 |
| 항-혼합균*난황IgY추출분말 | - | 1.00 | 0.50 |
| 비타민무기물첨가제 | 1.50 | 1.50 | 1.50 |
| *혼합균은 개별적으로 생산된 난황을 건조후(또는 신선난황)적정비율로 혼합한 것. |
본 발명은 상술한 특정의 실시예, 도표나 도면에 기재된 내용에 기술적 사상이 한정되지 아니하며, 청구범위에서 청구하는 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구든지 다양한 변형의 실시예가 가능한 것은 물론이고, 그와 같은 변경은 청구범위 기재의 범위 내에 있게 된다.
본 발명에 의해 생산된 두 가지 특수면역단백질을 공유 또는 함유한 계란이나 유제품은 설사예방에 효능이 있으며, 백신, 항바이러스성 물질을 사용하여 예방할 수 있는 설사병을 계란에서 생산된 특수면역단백질로 예방하는 효과가 있다.
또한, 본 발명에 의한 생산방법에 의하여 생산된 계란에서 추출된 난황이나 난황분말, 또는 특수면역단백질을 첨가한 조제분유를 제조하여 유아 또는 어린이가용이하게 항-대장균 특수면역단백질(IgY)과 항-로타바이러스 특수면역단백질(IgY)을 동시에 함유한 기능성 식품을 섭취하여 장질환 특히, 설사증후군을 예방할 수 있는 효과가 있다.
Claims (18)
- 대장균항원과 로타바이러스항원을 수산화알미늄 유화보조제로 유화시킨 혼합균 유화액 1㎖를 중추병아리 다리에 1회 접종하여 1차 접종하고,상기 각각의 항원을 유화보조제(ISA25)로 유화시킨 혼합균 유화액을 2주 간격으로 1㎖씩 3회 2차 접종한 후,성장한 산란계에 다시 한달 간격으로 상기 각각의 항원을 유화보조제(ISA25)로 유화시킨 혼합균 유화액을 0.5㎖씩 4회 접종을 포함하여 총 8회 접종하는 방법으로,생산한 한 개의 계란에 항-대장균 특수면역단백질(IgY)과 항-로타바이러스 특수면역단백질(IgY)을 동시에 공유하게 하는 것을 특징으로 하는 특수면역단백질을 보유한 계란생산방법.
- 제 1항에 있어서,상기 중추12주령 병아리에 접종된 균체수가 대장균항원: 로타바이러스항원: 유화보조제의 비율이 3.5: 3.5: 3이 되게 4.0×108/㎖ 대장균사균액항원 0.35㎖와 4.0×107TCID50로타바이러스 불활화항원 0.35㎖를 수산화알미늄 유화보조제 0.3㎖로 유화시킨 혼합균 유화액 1㎖를 중추12주령 병아리 다리에 1회 접종하여 1차 접종하고,상기 항원에 유화보조제(ISA25)를 상기 혼합균 유화액과 동일비율로 유화시킨 혼합균 유화액을 2주 간격으로 중추12주령 병아리 다리에 1㎖씩 3회 2차 접종한 후,성장한 산란계에 상기 혼합균 유화액과 동일비율로 4.0×108/㎖ 대장균사균액항원 0.35㎖와 4.0×107TCID50로타바이러스 불활화항원 0.35㎖를 유화보조제(ISA25) 0.3㎖로 유화시킨 혼합균 유화액을 1달마다 중추12주령 병아리 다리에 0.5㎖씩 4회 접종을 포함하여 총 8회를 접종하는 방법으로,생산한 한 개의 계란에 항-대장균 특수면역단백질(IgY)과 항-로타바이러스 특수면역단백질(IgY)을 동시에 보유하게 하는 것을 특징으로 하는 특수면역단백질을 보유한 계란생산방법.
- 대장균항원과 로타바이러스항원을 프로인트 완전보조제로 유화시킨 혼합균 유화액 1㎖를 중추병아리 다리에 1회 접종하여 1차 접종하고,상기 각각의 항원을 프로인트 불완전보조제로 유화시킨 혼합균 유화액을 1주 간격으로 1㎖씩 3회 2차 접종한 후,성장한 산란계에 다시 한달 간격으로 상기 각각의 항원을 프로인트 불완전 보조제로 유화시킨 혼합균 유화액을 0.5㎖씩 4회 접종을 포함하여 총 8회 접종하는 방법으로,생산한 한 개의 계란에 항-대장균 특수면역단백질(IgY)과 항-로타바이러스 특수면역단백질(IgY)을 동시에 공유하게 하는 것을 특징으로 하는 특수면역단백질을 보유한 계란생산방법.
- 제 3항에 있어서,상기 중추12주령 병아리에 접종된 균체수가 대장균항원: 로타바이러스항원: 유화보조제의 비율이 3.5: 3.5: 3이 되게 4.0×108/㎖ 대장균사균액항원 0.35㎖와 4.0×107TCID50로타바이러스 불활화항원 0.35㎖를 프로인트 완전보조제(adjuvant complete Freund's) 0.3㎖로 유화시킨 혼합균 유화액 1㎖를 중추12주령 병아리 다리에 1회 접종하여 1차 접종하고,상기 항원에 프로인트 불완전보조제(adjuvant incomplete Freund's)를 상기 혼합균 유화액과 동일 비율로 배합한 혼합균 유화액을 1주 간격으로 1㎖씩 3회 2차 접종한 후,성장한 산란계에 상기 혼합균 유화액과 동일 비율로 4.0×108/㎖ 대장균사균액항원 0.35㎖와 4.0×107TCID50로타바이러스 불활화항원 0.35㎖를 프로인트 불완전보조제 0.3㎖로 유화시킨 혼합균 유화액을 1달마다 0.5㎖씩 4회 접종을 포함하여 총 8회를 접종하는 방법으로,생산한 한 개의 계란에 항-대장균 특수면역단백질(IgY)과 항-로타바이러스 특수면역단백질(IgY)을 동시에 공유하게 하는 것을 특징으로 하는 특수면역단백질을 보유한 계란생산방법.
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 생산방법으로 생산된 항 혼합균 수용성 특수면역단백질(IgY)을 동시에 보유한 계란.
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 생산방법으로 생산된 계란을 소정의 용기에서 난황막을 제거한 난황을 동결건조한 난황분말.
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 생산방법으로 생산된 계란을 소정의 용기에서 난황막을 제거한 난황에 동량의 증류수를 첨가하고, 일정시간 실온에 방치 후 소디움 알지네이트(sodium alginate)용액을 혼합하여 일정시간 방치한 후, 원심분리법으로 추출한 것을 동결 건조하여 제조하는 것을 특징으로 하는 항 혼합균 특수면역단백질(IgY) 분말.
- 제 6항의 항 혼합균 수용성 특수면역단백질(IgY)을 보유하는 난황 분말을 5.0% 이상 함유한 조제분유.
- 제 7항의 항 혼합균 특수면역단백질 분말을 1.0% 이하 함유한 조제분유.
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