KR100423983B1 - 대장균, 살모넬라 엔테라이티디스, 살모넬라 티피뮤리움, 전염성 위장염 바이러스에 대한 특수면역단백질을 공유하는 계란생산방법과 그 생산방법으로 제조된 특수면역단백질을 함유한 계란, 난황, 사료 - Google Patents
대장균, 살모넬라 엔테라이티디스, 살모넬라 티피뮤리움, 전염성 위장염 바이러스에 대한 특수면역단백질을 공유하는 계란생산방법과 그 생산방법으로 제조된 특수면역단백질을 함유한 계란, 난황, 사료 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 자돈의 설사증을 일으키는 대장균(E. coli), 살모넬라 엔테라이티디스(Salmonella enteritidis),살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 전염성 위장염 바이러스(TGEV: Transmissible gastroenteritis virus)를 항원화시켜, 어린 병아리에 동시에 접종하여 자돈의 설사증을 예방할 수 있는 복합특수면역단백질을 계란 하나에 공유하게 하는 생산방법과, 독립적으로 네 가지 항원을 병아리에 접종하여 각 항원에 대한 특수면역단백질을 보유한 별개의 계란생산방법 및, 상기 두 가지 방법에 의하여 생산된 복합특수면역단백질을 함유한 계란과 그 난황, 네 가지 항원에 대한 특수면역단백질을 일정비율로 혼합한 혼합조성물에 관한 것이다.
또 다른 발명은 상기 방법으로 생산된 복합특수면역단백질을 함유한 사료와 각각 생산된 특수면역단백질을 일정비율로 혼합한 혼합조성물을 함유한 사료에 관한 것이다.
상기 두 가지 방법으로 생산된 복합특수면역단백질을 함유한 계란과 난황, 각 항원에 대한 특수면역단백질을 일정비율로 혼합한 혼합조성물을 함유한 사료를 자돈에 급여시킴으로써 자돈, 특히 이유자돈의 설사증 예방에 효과가 있다.
Description
본 발명은 자돈의 설사증을 일으키는 대장균(E. coli), 살모넬라 엔테라이티디스(Salmonella enteritidis),살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 전염성 위장염 바이러스(TGEV: Transmissible gastroenteritis virus)를 항원화시켜, 어린 병아리에 동시에 접종하여 자돈의 설사증을 예방할 수 있는 복합특수면역단백질을 계란 하나에 공유하게 하는 생산방법과, 독립적으로 네 가지 항원을 병아리에 접종하여 각 항원에 대한 특수면역단백질을 보유한 별개의 계란생산방법 및, 상기 두 가지 방법에 의하여 생산된 복합특수면역단백질을 함유한 계란과 그 난황, 네 가지 항원에 대한 특수면역단백질을 일정비율로 혼합한 혼합조성물에 관한 것이다.
또 다른 발명은 상기 방법으로 생산된 복합특수면역단백질을 함유한 사료와 각각 생산된 특수면역단백질을 일정비율로 혼합한 혼합조성물을 함유한 사료에 관한 것이다.
본 발명과 관련한 대장균(Enterotoxigenic E.coli: 장관독소원성 대장균)은 인체 및 가축의 장내에 상주하는 정상상주균총 중의 하나로 돼지의 모든 연령에서 발생하며, 특히 자돈에서 주로 발생한다. 대장균에 의한 자돈의 설사증의 발생양상은 연중 지속적으로 발생하며 포유초기와 이유초기에 강한 감수성을 나타낸다. 국립수의과학검역원의 자료에 의하면 1994년부터 1995년 사이의 가검의뢰시료 중34.5%가 대장균에 의한 자돈의 설사증 유발이 있었다고 한다. 이러한 대장균은 이열성(LT)과 내열성(ST)의 장독소를 갖는 장독소 분비형 대장균으로 이는 소장을 침범하여 장벽에 부착함으로써 병을 유발하며, 대장균의 부착인자(pili)에는 K88, K99, 987p, F41등의 4가지가 주요 인자가 있다. 대장균이 장상피에 부착되면 대장균은 증식하여 장독소를 생산하고 장상피세포에 손상을 주어 체액의 손실을 가져오며, 영양분의 흡수가 저해되어 설사를 일으키게 된다. 역학적으로 패혈증은 2∼3일 이내의 신생자돈에서 주로 발생하고, 설사는 1∼2주령의 포유기 및 이유직 후에 다발하고 부종형은 이유 후 자돈에서 발생이 많다. 초유를 먹지 않은 자돈이나 초유에 대장균에 대한 항체를 공급받지 못하는 모돈에서 태어난 자돈은 대장균에 감염되기 쉽다. 따라서 자돈의 설사증에는 항체의 작용이 중요함을 알 수 있다.
대장균에 의한 자돈의 설사증에 대한 문헌을 보면 다음과 같다.
문(Moon HW) 등은 임신중인 소, 돼지, 양에 부착인자 백신(fimbrial vaccine)의 접종은 장독소원성 대장균에 의한 자축의 설사증 예방에 효과가 있다고 보고하였다.
김정우(1999)는 돼지에서 ETEC K99균주의 K88균주의 항원과 계란의 난황 중의 면역글로블린(IgY)를 이용하여 난황항체를 제조하고 이를 효과적으로 분리하는 방법을 특허출원하였다.
본 발명과 관련한 돼지에서의 살모넬라증은 그 증상과 원인에 따라 패혈증형을 일으키는 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella cholerasuis), 살모넬라 티피수이스(S.typhisuis) 등과 위장염(설사증)을 유발하는 살모넬라티피뮤리움(S.typhimurium), 살모넬라 엔테라이티디스(S.enteritidis) 등이 있다. 자돈시기에는 지속적인 발생이 있으나 이유중기 이후에 강한 감수성을 나타낸다. 사료는 살모넬라 콜레라수이스(S.choleraesuis)의 일반적인 오염원은 아니나 살모넬라 티피뮤리움과 다른 혈청형의 주요한 오염원으로 작용한다고 보고되어 있으며, 살모넬라에 의한 질병의 발증 및 병세의 증악은 환경불량, 영양장애, 혼합감염, 기타 여러 가지 스트레스가 중요한 인자로 작용한다.
설사증을 유발하는 것은 주로 살모넬라 티피뮤리움이고 황백색-녹황색의 악취가 나는 설사변을 배설하는 특징이 있다. 발열, 원기상실, 식욕부진, 피모의 광택소실, 탈수증상을 보이며, 위축돈이 되는 경우가 많다. 또한 장관내의 회색 수양물의 저류와 점막의 괴사는 이차감염에 의해 병발하는 경우가 있다.
상기 살모넬라에 의한 자돈의 설사증과 관련한 문헌 및 자료는 다음과 같다.
리드(Reed WM. 1986) 등은 살모넬라 티피뮤리움과 살모넬라 콜레라수이스의 이유자돈에서의 병원성에 대하여 연구하였다. 접종 후 2, 4, 6, 8, 12, 24시간 경과 후 양상을 본 결과 살모넬라 콜레라수이스는 패혈증과 대장의 괴사와 염증을 동반하여 살모넬라 티피뮤리움 급성장염을 일으킨다고 보고하였다.
김정우 등은 양계연구에서 살모넬라 5종을 항원화하여 난황 내에 항체를 갖는 계란을 생산하였고, 이들 난황항체는 균이 장점막에 부착하지 못하고 배출되게 하여 질병을 예방 또는 치료하는 작용을 한다고 보고하였다.
송경빈(2000)은 살모넬라 엔테라이티디스의 에이티에프에이 서브유니트의 말토오스 결합단백질과 융합된 단백질로의 대장균에서의 발현으로 특허출원하였다.이는 닭에서 가장 문제되는 질병인 살모넬라 감염에 대한 진단용 키트와 백신개발에 이용하기 위한 것이다(출원번호: 10-2000-024818). 주식회사 미원(1993)은 살모넬라와 웰시균의 생육을 억제하는 방법을 특허출원하였다. 이는 가축의 장에 살모넬라와 웰시균의 성장을 저해하는 기능이 있는 효과적인 화합물을 투여하여 살모넬라균과 웰시균의 생육을 억제하는 방법에 관한 것이다(출원번호: 10-1993-004430).
본 발명과 관련하여 전염성 위장염 바이러스(TGEV)는 돼지의 설사병원인중 그 문제가 가장 큰 것으로 전염성 위장염 바이러스(TGEV)에 의한 질병은 년중 발생되지만 주로 기온이 낮은 겨울철에 많이 발생하며, 급성설사병으로 모든 일령의 돼지에 발생한다. 특히, 1주 미만의 포유자돈에 발생하며 대부분이 폐사하는 무서운 질병이다. TGEV는 다양한 형태의 바이러스로서 외피막 주위에 돌기를 가진 코로나 바이러스가 원인체이다. TGEV는 저온에 상당히 안정하여 -20℃에서 6개월까지 안정하지만, 37℃에서는 4일, 실온에서 45일간 노출시에 사멸한다. 따라서 여름철에는 발병이 드물고 겨울철에 발병이 많다.
TGEV에 의한 질병의 발생은 전세계적으로 일어나며, 우리나라에서도 1950년대 발생 이후 상재화되어 매년 발생하여 많은 경제적 피해를 주고 있다.
전염성 위장염 바이러스에 의한 질병의 임상증상으로 포유자돈은 12시간에서 1일 잠복기를 거친 뒤 심한 수양성 설사를 일으킨다. 또한 구토는 설사 직전부터 보이기 시작하며, 심한 설사와 동시에 급속히 탈수상태가 되어 체중이 심하게 감소하게 된다. 생후 7일 이내의 자돈은 발병 후 2∼7일 이내에 대부분 폐사한다. 폐사율은 일령이 어릴수록 높게 나타나고 회복 후에 발육은 아주 나빠서 위축돈이 되는경우가 많다. 포유자돈과는 달리 육성돈은 설사가 5∼7일 지속되며, 발병율은 100%에 가깝지만 폐사율은 5%이고, 성돈은 잠복기간이 3∼4일이나 발병하지 않는 돼지가 많다. 따라서 포유자돈에 가장 영향을 많이 미치는 심각한 설사증 유발 원인체이다. 상기 전염성 위장염 바이러스와 관련한 자료와 문헌은 다음과 같다.
윤인중은 돼지의 전염성 위장염 바이러스와 돼지 유행성 설사병바이러스의 혼합 사독 유성백신의 제조방법을 특허출원하였다. 이는 종자독을 이용하여 각각 바이러스를 베로(vero)세포에 접종하여 바이러스를 확보하고, 불활화하여 유성백신을 제조하는 방법에 관한 것이다(출원번호: 10-1994-010071).
미국의 아이오와 대학에서는 전염성 위장염 예방 백신의 제조 방법에 대해 특허출원하였다. 이는 돼지의 전염성 위장염 바이러스를 취득하여, 적당한 담체 또는 보조제와 혼합시켜 제조하는 방법에 관한 것이다(출원번호: 10-1980-004310).
상기와 같이 현재까지 출원된 특허 중 자돈의 설사증을 일으키는 대장균, 살모넬라 엔테라이티디스, 살모넬라 티피뮤리움, 전염성 위장염 바이러스에 대한 복합특수면역단백질을 함유한 계란과 그 난황, 각 항원에 대한 특수면역단백질을 일정비율로 혼합한 혼합조성물을 함유한 자돈의 설사증을 예방할 수 있는 자돈사료는 아직까지 보고된 바가 없다.
본 발명은 전술한 문제점을 해결하기 위해서, 자돈의 설사증을 일으키는 대장균(E. coli), 살모넬라 엔테라이티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 전염성 위장염 바이러스(TGEV: Transmissiblegastroenteritis virus)를 항원화시켜서, 어린 병아리에 동시에 접종하여 자돈의 설사증을 예방할 수 있는 복합특수면역단백질을 계란 하나에 공유하게 하는 생산방법과, 독립적으로 네 가지 항원을 병아리에 접종한 후 각각의 특수면역단백질을 생산하는 방법 및, 상기 방법에 의한 복합특수면역단백질을 함유한 계란과 그 난황, 각 항원에 대한 특수면역단백질을 일정비율로 혼합한 혼합조성물을 제공하고자 한다.
또한 상기 복합특수면역단백질을 함유한 계란과 그 난황, 각 항원에 대한 특수면역단백질의 혼합조성물을 함유한 자돈사료를 제공하고자 한다.
도 1은 대장균, 살모넬라 엔테라이티디스, 살모넬라 티피뮤리움, 전염성 위장염 바이러스 복합 접종시 항-전염성 위장염 바이러스 특수면역단백질 역가 변화이다.
도 2는 대장균, 살모넬라 엔테라이티디스, 살모넬라 티피뮤리움, 전염성 위장염 바이러스 복합 접종시 항-대장균 특수면역단백질 역가 변화이다.
도 3은 대장균, 살모넬라 엔테라이티디스, 살모넬라 티피뮤리움, 전염성 위장염 바이러스 복합 접종시 항-대장균 특수면역단백질 평균 역가이다.
도 4는 대장균, 살모넬라 엔테라이티디스, 살모넬라 티피뮤리움, 전염성 위장염 바이러스 복합 접종시 항-전염성 위장염 바이러스 특수면역단백질 평균 역가이다.도 5는 대장균, 살모넬라 엔테라이티디스, 살모넬라 티피뮤리움, 전염성 위장염 바이러스 복합 접종시 항-살모넬라 특수면역단백질 역가 변화이다. 도 6은 대장균, 살모넬라 엔테라이티디스, 살모넬라 티피뮤리움, 전염성 위장염 바이러스 복합 접종시 항-살모넬라 특수면역단백질 평균 역가이다.
본 발명은 자돈의 설사증을 일으키는 대장균(E. coli), 살모넬라 엔테라이티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움( Salmonella typhimurium), 전염성 위장염 바이러스(TGEV : Transmissible gastroenteritis virus)를 항원화시켜, 어린 병아리에 동시에 접종하여 자돈의 설사증을 예방할 수 있는 복합특수면역단백질을 계란 하나에 공유하게 하는 생산방법과, 독립적으로 네 가지 항원을 병아리에 접종하여 각 항원에 대한 특수면역단백질을 보유한 별개의 계란생산방법 및 상기 두 가지 방법에 의하여 생산된 복합특수면역단백질을 함유한 계란과 그 난황, 네 가지 항원에 대한 특수면역단백질을 일정비율로 혼합한 혼합조성물에 관한 것이다.
또 다른 발명은 상기 방법으로 생산된 복합특수면역단백질을 함유한 사료와 각각 생산된 특수면역단백질을 일정비율로 혼합한 혼합조성물을 함유한 사료에 관한 것이다.
본 발명은 병아리에 대장균항원과 살모넬라 엔터라이티디스(Salmonella enteritidis)항원과 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium)항원과 전염성 위장염 바이러스항원을 수산화 알루미늄으로 일정 비율 유화시킨 혼합균 유화액 1㎖를 병아리 한쪽 다리에 1회 접종하고, 2회 째부터 유화보조제(ISA25)를 사용한 혼합균 유화액을 상기 혼합균 유화액과 동일한 비율로 1㎖씩 1주 간격으로 2회 접종한 후, 상기 성장한 산란계의 한쪽 다리에 한 달 간격으로 상기 혼합균 유화액과 동일한 비율로 4달마다 0.5㎖씩 2회 접종을 포함하여 총 5회를 접종하는 방법에 의해 생산된 한 개의 계란에 상기 혼합균 항원들에 대한 복합특수면역단백질을 보유한 계란생산방법에 관한 것이다.
보다 상세하게는, 상기 병아리에 접종되는 세균의 균체수가 108/㎖, 바이러스의 수가 105TCID50/㎖이 포함되도록 대장균항원 : 살모넬라 엔터라이티디스항원 : 살모넬라 티피뮤리움항원 : 전염성 위장염 바이러스항원 : 유화보조제의 비율이 2.0 : 1.5 : 1.5 : 2.0 : 3.0이 되게, 5.0×108/㎖ 대장균사균액항원 0.2㎖와 7.0×108/㎖ 살모넬라 엔터라이티디스 사균액항원 0.15㎖와 7.0×108/㎖ 살모넬라 티피뮤리움사균액 항원 0.15㎖와 5×105TCID50/㎖전염성 위장염 바이러스항원 0.2㎖와 수산화 알루미늄 0.3㎖로 유화시킨 혼합균 유화액 1㎖를 1회 접종하고, 2회 때부터 1주 간격으로 유화보조제(ISA25)를 사용한 상기 혼합균 유화액을 동일 비율로 혼합한 혼합균 유화액 1㎖씩 3회 접종한 후, 상기 성장한 산란계의 한쪽 다리에 동일한 비율로, 5.0×108/㎖ 대장균 사균액항원 0.2㎖와 7.0×108/㎖ 살모넬라 엔터라이티디스 사균액항원 0.15㎖와 7.0×108/㎖ 살모넬라 티피뮤리움균 사균액항원 0.15㎖와 5×105TCID50/㎖전염성 위장염 바이러스항원 0.2㎖와 유화보조제(ISA25)0.3㎖로 유화시킨 혼합균 유화액을 4달마다 0.5㎖씩 2회 접종을 포함하여 총5회를 접종하는 방법에 의해 생산된 한 개의 계란에 상기 혼합균 항원들에 대한 복합특수면역단백질을 보유한 계란생산방법에 관한 것이다.
또 다른 발명의 구성은 병아리에 대장균항원과 살모넬라 엔터라이티디스(Salmonella enteritidis)항원과 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium)항원과 전염성 위장염 바이러스항원과 프로인트 완전보조제(Adjuvant complete Freund's)로 일정비율 유화시킨 혼합균 유화액 1㎖를 병아리 한쪽 다리에 1회 접종하고, 2회 째부터 프로인트 불완전보조제(adjuvant incomplete Freund's)를 사용한 혼합균 유화액을 상기 혼합균 유화액과 동일한 비율로 1㎖씩 1주 간격으로 2회 접종한 후, 상기 성장한 산란계의 한쪽 다리에 한 달 간격으로 상기 혼합균 유화액과 동일한 비율로 4달마다 0.5㎖씩 2회 접종을 포함하여 총5회를 접종하는 방법에 의해 생산된 한 개의 계란에 상기 혼합균 항원들에 대한 복합특수면역단백질을 보유한 계란생산방법에 관한 것이다.
보다 상세하게는 병아리에 접종되는 세균의 균체수가 108/㎖, 바이러스의 수가 105TCID50/㎖이 포함되도록 대장균항원 : 살모넬라 엔터라이티디스항원 : 살모넬라 티피뮤리움항원 : 전염성 위장염 바이러스항원 : 유화보조제의 비율이 2.0 : 1.5 : 1.5 :2.0 : 3.0이 되게, 5.0×108/㎖ 대장균 사균액항원 0.2㎖와 7.0×108/㎖ 살모넬라 엔터라이티디스 사균액항원 0.15㎖와 7.0×108/㎖ 살모넬라 티피뮤리움균 사균액항원 0.15㎖와 5×105TCID50/㎖ 전염성 위장염 바이러스항원 0.2㎖와 프로인트 완전보조제(adjuvant complete Freund's) 0.3㎖로 유화시킨 혼합균 유화액 1㎖를 1회 접종하고, 2회 때부터 1주 간격으로 프로인트 불완전보조제를 사용한 상기 혼합균 유화액을 동일 비율로 혼합한 혼합균 유화액 1㎖씩 3회 접종한 후, 상기 성장한 산란계의 한쪽 다리에 동일한 비율로, 5.0×108/㎖ 대장균 사균액항원 0.2㎖와 7.0×108/㎖ 살모넬라 엔터라이티디스 사균액항원 0.15㎖와 7.0×108/㎖ 살모넬라 티피뮤리움 사균액항원 0.15㎖와 5×105TCID50/㎖전염성 위장염 바이러스항원 0.2㎖와 프로인트 불완전보조제 0.3㎖로 유화시킨 혼합균 유화액을 4달마다 0.5㎖씩 2회 접종을 포함하여 총5회를 접종하는 방법에 의해 생산된 한 개의 계란에 상기 혼합균 항원들에 대한 복합특수면역단백질을 보유한 계란생산방법에 관한 것이다.
또 다른 발명의 구성은 상기의 방법들로 생산된 상기 혼합균 항원들에 대한복합특수면역단백질을 보유한 계란과 상기 복합특수면역단백질을 보유한 계란을 함유한 자돈사료에 관한 것이다.
또 다른 발명은 상기의 방법으로 생산된 계란을 소정의 용기에서 난황막이 제거된 복합특수면역단백질을 보유한 난황과 상기 복합특수면역단백질을 보유한 난황을 함유한 자돈사료에 관한 것이다.
또 다른 발명은 상기 난황막이 제거된 난황 2㎏을 넣고 동량의 알카리이온수(pH 9) 2ℓ를 첨가하여 교반하고, 24시간 저온(2∼10℃)에 방치 후 난황:알카리이온수(1:1)의 18배 분량(7ℓ)의 알카리이온수(pH 10)를 섞은 후 48시간 방치하여 수용성 단백질을 추출한 다음, 상등액을 울트라 필터레이션(Ultra filteration)시스템에서 홀로우 화이버(Hollow fiber)막분리방법으로 농축하여 동결건조하는 것을 특징으로 하는 복합특수면역단백질의 생산방법에 관한 것이다.
또 다른 발명은 상기 생산방법으로 생산된 복합특수면역단백질과 상기 복합특수면역단백질을 함유한 자돈사료에 관한 것이다.
또 다른 발명은 대장균항원, 살모넬라 엔테라이티디스항원, 살모넬라 티피뮤리움항원, 전염성 위장염 바이러스항원 각각의 항원에 수산화 알루미늄으로 유화시킨 유화액 1㎖를 각각의 병아리 한쪽 다리에 1회 접종하고 상기 각각의 항원을 유화보조제(ISA25)로 유화시킨 유화액을 1㎖씩 1주 간격으로 2회 접종한 후, 다시 4달 간격으로 상기 각각의 항원을 유화보조제(ISA25)로 유화시킨 유화액을 상기 각각의 성장한 산란계의 한쪽 다리에 0.5㎖씩 2회 접종을 포함하여 총 5회 접종하는 방법에 의해 생산된 한 개의 계란에 항 대장균 특수면역단백질, 항 살모넬라 엔테라이티디스 특수면역단백질, 항 살모넬라 티피뮤리움 특수면역단백질, 항 전염성 위장염 바이러스 특수면역단백질 각각을 보유한 계란으로부터 분리된 각각의 특수면역단백질을 보유한 난황의 배합비가 1:1:1:1, 2:1:1:1, 3:1:1:1, 4:1:1:1, 5:1:1:1중 어느 하나의 배합비율로 선택된 것을 특징으로 하는 특수면역단백질을 보유한 난황의 혼합조성물에 관한 것이다.
보다 상세하게는 상기 병아리에 개별적으로 세균의 균체수 108/㎖, 바이러스의 수 105TCID50/㎖이 포함되도록 상기 대장균항원: 유화보조제의 비율이 1:1, 살모넬라 엔테라이티디스항원:유화보조제의 비율이 1:1, 살모넬라 티피뮤리움항원:유화보조제의 비율이 1:1, 전염성 위장염 바이러스항원: 유화보조제의 비율이 1:1로, 2.0×108/㎖ 대장균 사균액항원 0.5㎖와 수산화 알루미늄 0.5㎖를 유화시키고, 살모넬라 엔테라이티디스 사균액항원 0.5㎖와 수산화 알루미늄 0.5㎖를 유화시키고, 살모넬라 티피뮤리움 사균액항원 0.5㎖와 수산화 알루미늄 0.5㎖를 유화시키고, 2×105TCID50/㎖ 전염성 위장염 바이러스항원 0.5㎖와 수산화 알루미늄 0.5㎖를 유화시킨 후 상기 각각의 유화액을 서로 다른 병아리 한쪽 다리에 1㎖를 1회 접종하고, 2주 째부터는 유화보조제(ISA25)를 사용한 유화액를 상기 유화액과 동일한 비율로 1㎖씩 1주 간격으로 2회 접종한 후, 다시 4달 간격으로 2.0×108/㎖ 대장균 사균액항원 0.5㎖와 유화보조제(ISA25) 0.5㎖를 유화시키고, 2.0×108/㎖ 살모넬라 엔테라이티디스 사균액항원 0.5㎖와 유화보조제(ISA25) 0.5㎖를 유화시키고, 2.0×108/㎖ 살모넬라 티피뮤리움 사균액항원 0.5㎖와 유화보조제(ISA25) 0.5㎖를 유화시키고, 2×105TCID50/㎖ 전염성 위장염 바이러스항원 0.5㎖와 유화보조제(ISA25) 0.5㎖를 유화시킨 유화액을 상기 서로 다른 성장한 산란계 한쪽다리에 0.5㎖씩 2회 접종을 포함하여 총 5회 접종하는 방법에 의해 생산된 한 개의 계란에 항 대장균 특수면역단백질, 항 살모넬라 엔테라이티디스 특수면역단백질, 항 살모넬라 티피뮤리움 특수면역단백질, 항 전염성 위장염 바이러스 특수면역단백질 각각을 보유한 계란으로부터 분리된 각각의 특수면역단백질을 보유한 난황의 배합비가 1:1:1:1, 2:1:1:1, 3:1:1:1, 4:1:1:1, 5:1:1:1중 어느 하나의 배합비율로 선택된 것을 특징으로 하는 특수면역단백질을 보유한 난황의 혼합조성물에 관한 것이다.
또 다른 발명은 대장균항원, 살모넬라 엔테라이티디스항원, 살모넬라 티피뮤리움항원, 전염성 위장염 바이러스항원 각각의 항원에 프로인트 완전보조제로 유화시킨 유화액 1㎖를 각각의 병아리 한쪽 다리에 1회 접종하고 상기 각각의 항원을 프로인트 불완전보조제로 유화시킨 유화액을 1주 간격으로 1㎖씩 1주 간격으로 2회 접종한 후, 다시 4달 간격으로 상기 각각의 항원을 프로인트 불완전보조제로 유화시킨 유화액을 상기 각각의 성장한 산란계의 한쪽 다리에 0.5㎖씩 2회 접종을 포함하여 총 5회 접종하는 방법에 의해 생산된 한 개의 계란에 항 대장균 특수면역단백질, 항 살모넬라 엔테라이티디스 특수면역단백질, 항 살모넬라 티피뮤리움 특수면역단백질, 항 전염성 위장염 바이러스 특수면역단백질 각각을 보유한 계란으로부터분리된 각각의 특수면역단백질을 보유한 난황의 배합비가 1:1:1:1, 2:1:1:1, 3:1:1:1, 4:1:1:1, 5:1:1:1중 어느 하나의 배합비율로 선택된 것을 특징으로 하는 특수면역단백질을 보유한 난황의 혼합조성물에 관한 것이다.
보다 상세하게는, 상기 병아리에 개별적으로 세균의 균체수가 108/㎖, 바이러스의 수가 105TCID50/㎖이 포함되도록 대장균항원:유화보조제의 비율이 1:1, 살모넬라 엔테라이티디스항원 : 유화보조제의 비율이 1:1, 살모넬라 티피뮤리움항원:유화보조제의 비율이 1:1의 비율로 2.0×108/㎖ 대장균 사균액항원 0.5㎖와 프로인트 완전보조제(adjuvant complete Freund's) 0.5㎖를 유화시키고, 살모넬라 엔테라이티디스 사균액항원 0.5㎖와 프로인트 완전보조제(adjuvant complete Freund's) 0.5㎖를 유화시키고, 살모넬라 티피뮤리움 사균액항원 0.5㎖와 프로인트 완전보조제(adjuvant complete Freund's) 0.5㎖를 유화시키고, 2×105TCID50/㎖ 전염성 위장염 바이러스항원 0.5㎖와 프로인트 완전보조제(adjuvant complete Freund's)0.5㎖를 유화시킨 후 상기 각각의 유화액을 서로 다른 병아리 한쪽 다리에 1㎖를 1회 접종하고, 2주째부터는 프로인트 불완전보조제(adjuvant incomplete Freund's)를 사용한 유화액을 상기 유화액과 동일한 비율로 1㎖씩 1주 간격으로 2회 접종한 후, 다시 4달 간격으로 2.0×108/㎖ 대장균 사균액항원 0.5㎖와 프로인트 불완전보조제(adjuvantincomplete Freund's) 0.5㎖를 유화시키고,2.0×108/㎖ 살모넬라 엔테라이티디스 사균액항원 0.5㎖와 프로인트 불완전보조제(adjuvant incomplete Freund's) 0.5㎖를 유화시키고, 2.0×108/㎖ 살모넬라 티피뮤리움 사균액항원 0.5㎖와 프로인트 불완전보조제(adjuvant incomplete Freund's) 0.5㎖를 유화시키고, 2×105TCID50/㎖ 전염성 위장염 바이러스항원 0.5㎖와 프로인트 불완전보조제(adjuvant incomplete Freund's) 0.5㎖를 유화시킨 유화액을 상기 서로 다른 성장한 산란계의 한쪽 다리에 0.5㎖씩 2회 접종을 포함하여 총 5회 접종하는 방법에 의해 생산된 한 개의 계란에 항 대장균 특수면역단백질, 항 살모넬라 엔테라이티디스 특수면역단백질, 항 살모넬라 티피뮤리움 특수면역단백질, 항 전염성 위장염 바이러스 특수면역단백질 각각을 보유한 계란으로부터 분리된 각각의 특수면역단백질을 보유한 난황의 배합비가 1:1:1:1, 2:1:1:1, 3:1:1:1, 4:1:1:1, 5:1:1:1중 어느 하나의 배합비율로 선택된 것을 특징으로 하는 특수면역단백질을 보유한 난황의 혼합조성물에 관한 것이다.
또 다른 발명은 상기 각 항원에 대한 특수면역단백질을 보유한 난황의 혼합조성물을 함유한 자돈사료에 관한 것이다.
이하에서는 본 발명의 구성을 보다 구체적으로 실시예 및 도면이나 도표에 의거하여 보다 상세히 설명하기로 하겠다. 다만, 본 발명의 권리범위는 실시예나 도면에 의하여 본 발명의 청구범위가 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
1. 대장균(Enteropathogenic E.coli) 분리동정 및 항원제조
가) 자돈에서의 대장균(Enterotoxigenic Escherichia coli; ETEC) 분리 및 동정
본 시험에 사용된 대장균은 자돈에서 분리하였다. 즉, 항원으로 사용된 대장균(Enterotoxigenic E.coli)은 설사증상을 나타낸 자돈의 설사변에서 분리하였다. 균의 분리는 다음과 같은 방법으로 하였다. 자돈의 설사분변을 혈액한천배지에 도말 후, 37℃ 항온기에서 18시간 배양하여 α-용혈성을 나타내는 하나의 대장균 집락을 선택하였다. 선택된 집락은 멕콩키 배지(MacConkey agar)에서 핑크색의 집락으로 자랐으며, EMB 배지(EMB agar)에 도말하여 철녹색(metalic green)으로 자라는 대장균의 특이적인 집락성상을 확인하였다.
나) 독소(Toxin) 생산능 확인
대장균(E.coli)의 장관독소원성(enterotoxigenicity)의 주요원인인 장관성독소(Entrotoxin)의 생산능을 중합효소반응(Polymerase chain reaction; 이하 PCR이라 함)기법을 이용하여 확인하였다. 열안정성 독소(이하 ST:heat stable toxin)의 STa1유전자와 열 불안정성 독소(이하 LT : heat lable toxin)의 LTh 유전자에 대한 특이 원형체(Primer)를 이용한 다복합(multiplex) PCR기법을 이용하여 증폭하였다.
ST 독소 확인용 원형체는
sense primer ; CCCCTCTTTTAGTCAGTC
anti-sense primer ; CCAGCACAGGCAGGATTACA
165bps의 최종산물을 증폭하도록 작제된 것을 사용하였다.
LT 독소 확인용 원형체는
sense primer ; CAGACTATCAGTCAGAGGTTG
anti-sense primer ; TTCATACTGATTGCCGCA
417bps의 최종산물을 증폭하도록 작제된 것을 사용하였다. PCR조건의 전-변성 온도(Pre-denaturation temperature)는 95℃ 온도 하에서 5분간, 변성온도(Denaturation temperature)는 94℃ 온도 하에서 1분간, 병합온도(Annealing temperature)는 56℃ 온도 하에서 1분간, 연장온도(Elongation temperature)는 72℃ 하에서 1분간, 후-연장온도(Post-elongation temperature)는 72℃ 온도 하에서 10분간으로 진행되었다. 증폭된 산물은 2% 한천겔(agarose gel)을 이용한 전기영동으로 확인하였다. 본 발명에 사용된 분리균주가 ST독소를 생산함을 확인하였다.
다) 대장균 부착인자(pili) 확인실험
분리된 대장균 집락하나를 선택하여 완충용액에 부유하였다. 이것을 K88, K99, 987p 각각의 항혈청과 평판응집 반응을 실시하였다.
그 결과 대장균 집락이 K88과 응집되는 것이 확인되었다.
라) 대장균 ETEC (Enterotoxigenic E.coli) 항원제조
대장균 ETEC균주를 트립티케이스 소이 배지(Trypticase soy agr)에 접종 후, 37℃ 항온기에서 18시간 배양 후 하나의 집락(colony)을 5㎖의 트립티케이스 소이 브로쓰(Trypticase soy broth)에 접종하였다. 2시간 후 대량의 트립티케이스 소이 브로쓰에 접종 후 37℃에서 48시간 정치배양하였다. 배양된 균액은포름알데하이드(formaldehyde)를 총량의 5%가 되도록 첨가하여 혼합하고 실온에서 24시간 불활화시켰다. 불활화된 균액은 4,000rpm에서 20분간 원심분리하여 균을 수확하였고 멸균 피비에스(phosphate buffered saline : 이하 PBS라 함)(pH 7.2)로 3회 세척하였다. 수확된 균체는 410㎚에서 O.D.(Oculus Dexter)가 1.2∼1.3이 되도록 PBS에 부유시킨 뒤 사용하였다.
2. 살모넬라 엔테라이티디스와 살모넬라 티피뮤리움 항원제조
살모넬라 엔테라이티디스(Salmonella enteritidis)와 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium)을 각각 트립티케이스 소이 아가(Trypticase soy agr)에 접종 후 37℃ 항온기에서 18시간 배양하였다. 하나의 집락(colony)을 대량의 트립틱 소이 부로스(Tryptic soy broth)에 접종 후 37℃에서 48시간 정치배양하였다. 배양된 균액은 포름알데하이드(formaldehyde)를 총량의 0.2%되도록 첨가하여 혼합하고 실온에서 24시간 불활화시켰다. 불활화된 균액은 4,000rpm에서 20분간 원심분리하여 균을 회수하였고 멸균생리식염수(pH7.2)로 3회 세척하였다. 회수된 균체는 -70℃ 보관하여 사용하였다.
3. 전염성 위장염 바이러스 항원제조
1) 바이러스의 증폭
① 사용배지
바이러스증폭 및 세포유지용 배지로는 α-최소필수배지(α-Minimum essential Medium:MEM)(Gibco BRL)를 사용하였고, 소태아혈청(Fetal bovine serum) 5%를 첨가하고 배지 1ℓ당 락토알부민(Lactoalbumine) 50㎎을 첨가하여 사용하였다.
② 세포주
돼지정소세포(Swine testicle cell line: ST cell line)를 사용하여 바이러스의 증폭에 사용하였다.
③ 전염성 위장염 바이러스의 증폭
돼지정소세포(Swine testicle cell)를 1 × 105cell/㎖로 세포배양 플라스크에 분주하여 70%정도 플라스크가 세포로 찼을 때 비혈청함유 α-최소필수배지(α-Minimum essential Medium: MEM)로 3회 세척 후 바이러스액을 접종하였다. 37℃에서 90분간 감작시키고 비혈청함유 α-최소필수배지(α-Minimum essential Medium: MEM)로 1회 세척하였다. 유지배지로 교환 후, 37℃ 항온기에서 세포변성여부를 관찰하였으며, 2일 후 세포변성이 확인된 것은 냉동과 해동과정을 반복하여 3회 거친 후 -20℃에 보관하였다.
④ 전염성 위장염 바이러스의 불활화
전염성 위장염 바이러스(이하 TGEV이라 함)의 불활화는 2-브로모에틸아미드(2-Bromoethylamide: BEI)를 이용하였다. TGEV에 최종농도 0.004M의 2-브로모에틸아미드(BEI)를 첨가하여 37℃에서 5시간 교반반응시켜 불활화하였다. 반응은 0.004M의 쏘디움 티오설페이트(Sodium thiosulfate solution, 2M)로 정지하였다.
⑤ 엘리사(ELISA)용 전염성 위장염 바이러스항원의 제조
ST세포(ST cell)에서 증폭된 전염성 위장염 바이러스를 25,000rpm에서 90분간 초고속 원심분리하였다. 원심분리한 후 침전된 바이러스를 2㎖의 완충용액으로 부유하여 4℃에서 16시간 정치시킨 뒤 재부유하였다. 부유된 액체는 18kHz에서 1분간 3회 초음파고속분리(sonication)하여 엘리사(ELISA)항원으로 이용하였다.
4. 복합된 네 가지 항원을 병아리에 접종 및 산란계에 부스팅(boosting)
가) 중추12주령의 병아리에 접종된 세균 균체수는 108/㎖ 였으며 바이러스는 105TCID50/㎖, 대장균항원 : 살모넬라 엔터라이티디스항원 : 살모넬라 티피뮤리움항원 : 전염성 위장염 바이러스항원 : 프로인트 완전보조제(adjuvant complete Freund's)의 비율이 2.0 : 1.5 : 1.5 : 2.0 : 3.0으로 하여, 5.0×108/㎖ 대장균 사균액항원 0.2㎖와 7.0×108/㎖ 살모넬라 엔터라이티디스 사균액항원 0.15㎖와 7.0×108/㎖ 살모넬라 티피뮤리움 사균액 항원 0.15㎖와 5×105TCID50/㎖ 전염성 위장염 바이러스항원 0.2㎖와 수산화 알루미늄 0.3㎖로 유화시킨 혼합균 유화액 1㎖를 1회 접종하고, 2회 째부터 부스팅에 사용된 보조제는 공지된 ISA25를 사용하여 접종하였는데, 일차적으로 혼합균 유화액을 1회째 접종을 포함하여 병아리 한쪽 다리에 1㎖씩 1주 간격으로 2회 접종한 후, 28주령의 산란계에 4달 간격으로 동일한 비율로 제조한 유화액을 다리에 0.5㎖씩 2회 접종하였다. 상기 네 가지 항원을 함께 총 5회 접종하였다.
나) 중추12주령의 병아리에 접종된 세균의 균체수는 108/㎖, 바이러스의 수는 105TCID50/㎖였으며, 대장균항원 : 살모넬라 엔터라이티디스항원 : 살모넬라 티피뮤리움항원 : 전염성 위장염 바이러스항원 : 프로인트 완전보조제(adjuvant complete Freund's)의 비율이 2.0 : 1.5 : 1.5 : 2.0 : 3.0으로 하여, 5.0×108/㎖ 대장균 사균액항원 0.2㎖와 7.0×108/㎖ 살모넬라 엔터라이티디스 사균액항원 0.15㎖와 7.0×108/㎖ 살모넬라 티피뮤리움균 사균액항원 0.15㎖와 5×105TCID50/㎖ 전염성 위장염 바이러스항원 0.2㎖와 프로인트 완전보조제(Adjuvant complete Freund's) 0.3㎖를 유화시킨 후 1회 접종하였고, 2회 째부터 부스팅에 사용된 보조제는 공지된 프로인트 불완전보조제(Adjuvant incomplete Freund's)를 사용하여 접종하였는데, 상기 혼합균 유화액을 병아리 한쪽 다리에 1㎖씩 2주 간격으로 1회째 접종을 포함하여 3회 접종한 후, 28주령의 산란계에 4달 간격으로 동일한 비율로 제조한 유화액을 다리에 0.5㎖씩 2회 접종하였다. 상기 네가지 항원을 함께 총 5회 접종하였다. 그 결과 상기 혼합균 유화액을 접종한 산란계로부터 생산한 한 개의 계란에 항-대장균 특수면역단백질과 항-살모넬라 엔테라이티디스 특수면역단백질과 항-살모넬라 티피뮤리움 특수면역단백질과 항-전염성 위장염 바이러스 특수면역단백질을 동시에 공유한 계란을 생산하였다.
또 다른 발명의 구성은 상기의 방법으로 생산된 항-대장균 특수면역단백질과항-살모넬라 엔테라이티디스 특수면역단백질과 항- 살모넬라 티피뮤리움 특수면역단백질과 항-전염성 위장염 바이러스 특수면역단백질을 동시에 공유한 계란과, 상기의 방법으로 생산된 계란을 소정의 용기에서 난황막을 제거한 난황 2㎏을 넣고, 동량의 알카리이온수(pH 9) 2ℓ를 첨가하여 교반하고, 24시간 저온(2∼10℃)에 방치 후 난황:알카리이온수(1:1)의 18배 분량(72ℓ)의 알카리이온수(pH10)를 섞은 후 48시간 방치하여 수용성 단백질을 추출한 다음, 상등액을 울트라 필터레이션 (Ultra filteration)시스템에서 홀로우 화이버(Hollow fiber) 막분리 방법으로 농축하여 동결건조하는 것을 특징으로 하는 복합특수면역단백질의 생산방법 및 복합특수면역단백질에 관한 것이다.
5. 난황분리, 난황분말추출, 특수면역단백질 분리 및 역가 측정
가) 난황분리
상기 방법에 의하여 생산된 계란을 깨서 난황을 제외한 나머지를 분리하고 신선 난황을 분리하여 플라스크나 병에 넣는다.
나) 난황분말
상기 분리된 신선 난황을 원심분리하고 동결건조한 후 난황분말을 추출한다.
다) 특수면역단백질 분리 및 역가 측정
난황막을 제거한 난황 2㎏을 100ℓ통에 넣은 다음, 알카리이온수(pH 9) 2ℓ를 첨가하여 교반하였다. 24시간 저온(2∼10℃)에서 방치한 후 난황 : 알카리이온수(1:1)액의 18배 분량(72ℓ)의 알카리이온수(pH 10)와 혼합한 후 48시간 방치하여 추출한 다음, 상등액을 울트라 필터레이션(Ultra filteration)시스템에서 홀로우화이버(Hollow fiber) 막분리방법으로 농축하여 동결건조하였다.
상기 여과에 의해 얻어진 수용성 단백질 중 특수면역단백질의 함량을 다음과 같이 측정하였다.
또한, 특수면역단백질의 함량 측정도 샌드위치 엘리사(ELISA)방법에 의해 수행되었다. 대장균과 2종의 살모넬라를 흡광도값이 660㎚에서 0.05가 되도록 완충액으로 희석하였고, 전염성 위장염 바이러스는 엘리사(ELISA)항원으로 제작된 것을 100배 희석하여 사용하였다. 상기 희석된 원인체를 마이크로플레이트에 코팅하고 철야로 방치하였다. 이 마이크로플레이트를 세척한 후 상기 여과된 수용성 단백질을 넣고 반응시킨 다음 세척하여, 1/10,000로 희석된 래빗 항-치크 IgG Ab-HRP를 첨가한다. HRP의 기질로는 TMB를 사용하였고, 반응 정지액으로는 2N-황산(2N-H2SO4)을 이용하여 450㎚에서 흡광도를 측정하였다. 이 결과를 도 1∼4에 도시하였다.
도 1에 나타낸 바와 같이 대장균과 살모넬라 엔테라이티디스, 대장균과 살모넬라 티피뮤리움을 접종한 것보다는, 대장균과 살모넬라 엔테라이티디스와 살모넬라 티피뮤리움과 전염성 위장염 바이러스를 복합접종했을 때 전염성 위장염 바이러스의 특수면역단백질의 역가가 증가하는 것으로 나타났다.
도 2에 나타낸 바와 같이 대장균과 살모넬라 엔테라이티디스, 대장균과 살모넬라 티피뮤리움을 접종한 것보다는, 대장균과 살모넬라 엔테라이티디스와 살모넬라 티피뮤리움과 전염성 위장염 바이러스를 복합접종했을 때 대장균의 특수면역단백질의 역가가 증가하는 것으로 나타났다.
도 3에 나타낸 바와 같이 대장균과 살모넬라 엔테라이티디스, 대장균과 살모넬라 티피뮤리움을 접종한 것보다는, 대장균과 살모넬라 엔테라이티디스와 살모넬라 티피뮤리움과 전염성 위장염 바이러스를 복합접종했을 때 대장균의 특수면역단백질의 평균 역가가 증가하는 것으로 나타났다.
도 4에 나타낸 바와 같이 대장균과 살모넬라 엔테라이티디스, 대장균과 살모넬라 티피뮤리움을 접종한 것보다는, 대장균과 살모넬라 엔테라이티디스와 살모넬라 티피뮤리움과 전염성 위장염 바이러스를 복합접종했을 때 전염성 위장염 바이러스의 특수면역단백질의 평균 역가가 증가하는 것으로 나타났다.
도 3와 도 4의 결과에서 전염성 위장염 바이러스의 특수면역단백질의 평균 역가보다 대장균의 특수면역단백질의 평균 역가가 높은 것으로 나타났다.도 5에 나타낸 바와 같이 살모넬라 엔테라이티디스, 살모넬라 티피뮤리움을 단독접종한 것보다는, 상기 두 개의 각각 항원을 대장균과 복합 접종하거나, 대장균, 전염성 위장염 바이러스와 복합 접종했을 때 살모넬라 엔테라이티디스의 특수면역단백질, 살모넬라 티피뮤리움의 특수면역단백질의 역가가 증가하는 것으로 나타났다.도 6에 나타낸 바와 같이 살모넬라 엔테라이티디스와 대장균을 단독 접종한 경우 평균 역가가 가장 높았고, 대장균과 살모넬라 티피뮤리움을 복합 접종한 경우와 대장균, 살모넬라 엔테라이티디스, 살모낼라 티피뮤리움, 전염성 위장염 바이러스를 복합 접종한 경우 평균 역가가 높게 나타났다.상기 도 1, 도 2, 도 3, 도 4, 도 5, 도 6에 나타낸 바와 같이 상기 4가지 항원을 복합 접종시에 상기 각 항원에 대한 특수면역단백질의 역가와 평균 역가가 증가하는 것으로 나타났다.
6. 네 가지 항체를 함유한 자돈사료 제조
가) 수용성 단백질 추출
수용성 단백질 추출은 다음과 같은 방법으로 하였다. 막을 제거한 난황 2㎏을 100ℓ통에 넣은 다음, 알카리이온수(pH 9) 2ℓ를 첨가하여 교반하였다. 24시간 저온(2∼10℃)에서 방치한 후 난황 : 알카리이온수(1:1)액의 18배 분량(72ℓ)의 알카리이온수(pH 10)와 혼합한 후 48시간 방치하여 추출한 다음, 상등액을 울트라 필터레이션(Ultra filteration)시스템에서 홀로우 화이버(Hollow fiber) 막분리 방법으로 농축하여 동결건조하였다.
나) 난황을 함유한 자돈사료 제조
전술한 바와 같이 대장균항원 및 살모넬라 엔테라이티디스항원과 살모넬라 티피뮤리움항원과 전염성 위장염 바이러스항원으로 혼합시킨 복합항원을 접종 후 생산된 계란에서 난황을 분리하여 자돈사료에 사용하였다(표 1).
다) 추출한 수용성 단백질을 함유한 자돈사료 제조
전술한 바와 같이 대장균항원과 살모넬라 엔테라이티디스항원과 살모넬라 티피뮤리움항원과 전염성 위장염 바이러스항원으로 혼합시킨 복합항원을 접종 후 생산된 계란에서 난황을 분리한 후, 추출한 수용성단백질(crude IgY) 분말을 첨가하였고, 자돈사료의 제조 배합비는 아래 표2에 제시된 바와 같다.
| 설사예방 자돈사료 배합비 예 | |||
| 원 료 | 배합비 A | 배합비 B | 배합비 C |
| 옥수수대두박어 분석회석인산칼슘가공염당 밀과자분영양제항-복합균*난황분말항-복합균*난황IgY추출분말항-복합균*신선난황ME(㎉/㎏)CaP | 62.523.03.00.91.50.41.02.03.72.0--3,2501.120.68 | 64.022.23.50.91.40.42.02.03.5-0.1-3,2501.10.6 | 64.013.33.50.94.01.40.42.02.03.5-5.03,2701.20.6 |
| *복합균은 네 가지 균을 동시 접종 후 생산된 난황 |
| 설사예방 자돈사료 배합비 예 | |||
| 원 료 | 배합비 A | 배합비 B | 배합비 C |
| 옥수수대두박어 분석회석가공염분말우지포도당대두유MCP영양제항-복합균*난황분말항-복합균*난황IgY추출분말항-복합균*신선난황ME(㎉/㎏)CaP | 36.820.02.00.50.29.611.015.01.51.62.0--3,2901.000.67 | 36.820.02.00.50.29.511.015.01.51.62.00.1-3,2801.000.67 | 36.615.02.00.50.29.611.015.01.51.62.0-5.03,3001.000.67 |
| *복합균은 네 가지 균을 동시 접종 후 생산된 난황 |
실시예 2
실시예 2는 네 가지 항체를 독립적으로 생산 후 항체 혼합 및 그 생산방법에 의하여 생산된 계란에서 추출한 특수면역단백질을 이용한 자돈사료에 관한 것이다.
1. 대장균(Enteropathogenic E.coli) 분리동정 및 항원제조
본 발명에 사용된 대장균은 사람에서 분리하였다. 대장균의 분리, 동정 및 항원제조는 실시예1에 제시된 바와 동일하다.
2. 살모넬라 엔터라이티디스 및 살모넬라 티피뮤리움 항원제조
살모넬라 엔터라이티디스 및 살모넬라 티피뮤리움 항원제조도 실시예1에 제시된바와 같다.
3. 전염성 위장염 바이러스(Transmissible gastroenteritis virus) 항원제조
전염성 위장염 바이러스(Transmissible gastroenteritis virus)항원제조도 실시예1에 제시된바와 같다.
4. 네 가지 항원을 독립적으로 병아리에 접종 및 산란계에 부스팅(boosting)
가) 중추12주령의 병아리에 접종된 세균의 균체수는 108/㎖, 바이러스의 수는 105TCID50/㎖ 였으며, 대장균항원: 유화보조제의 비율은 1:1, 살모넬라 엔테라이티디스항원:유화보조제의 비율은 1:1로 하고, 살모넬라 티피뮤리움 항원:유화보조제의 비율은 1:1로 하고, 전염성 위장염 바이러스항원 : 유화보조제의 비율을 1:1로 하여, 2.0×108/㎖ 대장균 사균액항원 0.5㎖와 수산화 알루미늄 0.5㎖를 유화시키고, 살모넬라 엔테라이티디스 사균액항원0.5㎖와 수산화 알루미늄 0.5㎖를 유화시키고, 살모넬라 티피뮤리움 사균액 항원 0.5㎖와 수산화 알루미늄 0.5㎖를 유화시키고, 2×105TCID50/㎖ 전염성 위장염 바이러스항원 0.5㎖와 수산화 알루미늄 0.5㎖를 유화시킨 후 각각의 유화액을 각각의 병아리 한쪽 다리에 1㎖를 1회 접종하고, 2주 째부터는 유화보조제(ISA25)를 사용한 유화액을 상기 유화액과 동일한 비율로 1㎖씩 1주 간격으로 2회 접종한 후, 4달 간격으로 2.0×108/㎖ 대장균 사균액항원 0.5㎖와 유화보조제(ISA25) 0.5㎖를 유화시키고, 2.0×108/㎖ 살모넬라 엔테라이티디스 사균액항원 0.5㎖와 유화보조제(ISA25) 0.5㎖를 유화시키고, 2.0×108/㎖ 살모넬라 티피뮤리움 사균액항원 0.5㎖와 유화보조제(ISA25) 0.5㎖를 유화시키고, 2×105TCID50/㎖ 전염성 위장염 바이러스항원 0.5㎖와 유화보조제(ISA25) 0.5㎖로 유화시킨 후 제조한 유화액을 상기 각각의 성장한 산란계의 한쪽 다리에 0.5㎖씩 2회 접종을 포함하여 총 5회 접종하였다. 상기 네 가지 대장균, 살모넬라 엔테라이티디스, 살모넬라 티피뮤리움, 전염성 위장염 바이러스항원을 혼합하지 않고 개별적으로 총 5회 접종하였다.
나) 중추 12주령의 병아리에 접종된 세균의 균체수는 108/㎖, 바이러스의 수는 105TCID50/㎖였으며, 각각 네가지 항원과 유화보조제의 비율 1:1로 하여, 2.0×108/㎖ 대장균 사균액항원 0.5㎖와 프로인트 완전보조제(adjuvant complete Freund's) 0.5㎖를 유화시키고, 2.0×108/㎖ 살모넬라 엔테라이티디스 사균액항원 0.5㎖와 프로인트 완전보조제(adjuvant complete Freund's) 0.5㎖를 유화시키고, 2.0×108/㎖ 살모넬라 티피뮤리움 사균액항원 0.5㎖와 프로인트 완전보조제(adjuvant complete Freund's) 0.5㎖를 유화시키고, 2×105TCID50/㎖ 전염성 위장염 바이러스항원 0.5㎖와 프로인트 완전보조제(adjuvant complete Freund's) 0.5㎖를 유화시킨 후, 개별적으로 상기 유화시킨 각각의 유화액 1㎖를 각각의 병아리 한쪽 다리에 1회 접종하고, 2주 째부터는 프로인트 불완전보조제(adjuvant incomplete Freund's)를 사용한 각각의 유화액을 상기 각각의 유화액과 동일 비율로 1㎖씩 1주 간격으로 2회 접종한 후, 다시 4달 간격으로 2.0×108/㎖ 대장균 사균액 항원 0.5㎖와 프로인트 불완전보조제(adjuvantincomplete Freund's) 0.5㎖를 유화시키고, 2.0×108/㎖ 살모넬라 엔테라이티디스 사균액항원 0.5㎖를 프로인트 불완전보조제(adjuvant incomplete Freund's) 0.5㎖를 유화시키고, 2.0×108/㎖ 살모넬라 티피뮤리움균항원 0.5㎖와 프로인트 불완전보조제(adjuvant incomplete Freund's) 0.5㎖를 유화시키고, 2×105TCID50/㎖ 전염성 위장염 바이러스항원과 프로인트 불완전보조제(adjuvant incomplete Freund's) 0.5㎖를 유화시킨 후, 제조한 각각의 유화액을 상기 각각의 성장한 산란계의 한쪽 다리에 0.5㎖씩 2회 접종을 포함하여 총 5회 접종하였다.
그 결과 상기 개별균 유화액을 접종한 각각의 산란계로부터 생산한 계란에 항-대장균 특수면역단백질, 항-살모넬라 엔터라이티디스 특수면역단백질, 살모넬라 티피뮤리움 특수면역단백질, 항-전염성 위장염 바이러스 특수면역단백질을 개별적으로 함유한 계란을 생산하였다.
4. 난황분리, 난황분말추출, 특수면역단백질 분리 및 역가 측정
난황분리, 난황분말추출, 시험분석에 사용한 특수면역단백질의 분리 및 측정법은 실시예1과 같다.
5. 특수면역단백질을 함유한 자돈사료제조
앞 항에서와 같이 개별적으로 대장균항원, 살모넬라 엔테라이티디스항원, 살모넬라 티피뮤리움항원, 전염성 위장염 바이러스항원을 접종 후 생산된 계란에서 추출한 수용성특수면역단백질(crude IgY)분말이나 신선한 난황 또는 난황분말을 각각 1:1;1:1, 2:1:1:1, 3:1:1:1, 4:1:1:1 , 5:1:1:1 중 어느 하나로 혼합한 혼합 사료첨가제로 사용하였으며, 자돈사료의 제조 배합비는 아래 제시된 바와 같다.
| 설사예방 자돈사료 배합비 예 | |||
| 원 료 | 배합비 A | 배합비 B | 배합비 C |
| 옥수수대두박어 분분말우지석회석인산칼슘가공염당 밀과자분영양제항-혼합균*난황분말항-혼합균*난황IgY추출분말항-혼합균*신선난황ME(㎉/㎏)CaP | 60.022.53.03.00.91.50.41.02.03.72.0--3,3001.120.68 | 61.022.23.53.00.91.40.42.02.03.5-0.1-3,3101.10.6 | 61.013.33.53.00.94.01.40.42.02.03.5-5.03,3101.20.6 |
| *혼합균은 네 가지 개별적으로 생산된 난황을 건조 후(또는 신선난황 또는 추출 후) 적정 비율로 혼합한 것. |
본 발명은 상술한 특정의 실시예, 도표나 도면에 기재된 내용에 기술적 사상이 한정되지 아니하며, 청구범위에서 청구하는 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구든지 다양한 변형의 실시가 가능한 것은 물론이고, 그와 같은 변경은 청구범위 기재의 범위 내에 있게 된다.
상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 의해 생산된 계란에서 추출한 자돈의 설사증을 유발하는 대장균, 살모넬라 엔테라이티디스, 살모넬라 티피뮤리움, 전염성 위장염 바이러스에 대한 특수면역단백질을 공유한 복합특수면역단백질과 개별적으로 생산된 특수면역단백질은 생후 또는 이유기의 자돈의 설사를 예방하므로 상기 복합특수면역단백질을 함유한 계란과 난황, 개별적으로 생산된 특수면역단백질을 일정비율로 혼합한 혼합조성물을 함유한 자돈사료는 자돈설사 예방에 효과가 있다.
또한 본 발명에 의해 생산된 상기 복합특수면역단백질을 함유한 계란과 그 난황, 개별적으로 생산된 특수면역단백질을 일정비율로 혼합한 혼합조성물을 첨가하여 제조한 사료를 가축 특히 이유자돈에 섭취시켜 폐사 및 성장지연을 감소시킴으로써 한국농가의 양돈사업을 증진시킬 수 있다.
Claims (15)
- 중추병아리에 대장균항원과 살모넬라 엔테라이티디스항원과 살모넬라 티피뮤리움항원과 전염성 위장염 바이러스항원을 수산화 알루미늄으로 일정 비율로 유화시킨 혼합균 유화액 1㎖를 중추병아리 한쪽 다리에다 1회 접종하고,2회 째부터 유화보조제(ISA25)를 사용한 혼합균 유화액을 각 1㎖씩 2회 접종한 후,성장한 산란계에다 상기 유화보조제(ISA25)를 사용한 혼합균 유화액을 상기 혼합균 유화액과 동일한 비율로 각 0.5㎖씩 2회 접종을 포함하여 총 5회를 접종하는 방법으로,생산한 한개의 계란에 항-대장균, 항-살모넬라 엔테라이티디스, 항-살모넬라 티피뮤리움 및 항-전염성 위장염 바이러스의 특수면역단백질을 동시에 공유하게 하는 것을 특징으로 하는 항-혼합균 특수면역단백질을 보유한 계란생산방법.
- 제 1항에 있어서,상기 12주령 중추병아리에 접종되는 세균의 균체수가 108/㎖, 바이러스의 수가 105TCID50/㎖이 포함되도록 대장균항원: 살모넬라 엔테라이티디스항원: 살모넬라 티피뮤리움항원: 전염성 위장염 바이러스항원: 유화보조제의 비율이 2.0: 1.5: 1.5: 2.0: 3.0이 되도록, 5.0×108/㎖ 대장균 사균액항원 0.2㎖: 7.0×108/㎖ 살모넬라 엔테라이티디스 사균액항원 0.15㎖: 7.0×108/㎖ 살모넬라 티피뮤리움 사균액항원 0.15㎖: 5×105TCID50/㎖ 전염성 위장염 바이러스항원 0.2㎖: 수산화 알루미늄 0.3㎖의 비율로 유화시킨 혼합균 유화액 1㎖를 병아리에 1회 접종하는 단계;상기 항원들을 유화보조제(ISA25)로 상기 혼합균 유화액과 동일 비율로 유화시킨 혼합균 유화액을 1주 간격으로 병아리에 1㎖씩 2회 접종하는 단계; 및성장한 산란계에다 상기와 같은 동일 비율로 제조된 혼합균 유화액을 4달마다 각 0.5㎖씩 2회 접종을 포함하여 총 5회를 접종하는 방법으로,생산한 한개의 계란에 항-대장균, 항-살모넬라 엔테라이티디스, 항-살모넬라 티피뮤리움 및 항-전염성 위장염 바이러스의 특수면역단백질을 동시에 공유하게 하는 것을 특징으로 하는 항-혼합균 특수면역단백질을 보유한 계란생산방법.
- 중추병아리에 대장균항원과 살모넬라 엔테라이티디스항원과 살모넬라 티피뮤리움항원 및 전염성 위장염 바이러스항원을 프로인트 완전보조제(Adjuvant complete Freund's)로 유화시킨 일정 비율의 혼합균 유화액 1㎖를 중추병아리 한쪽 다리에다 1회 접종하고,2회 째부터 프로인트 불완전보조제(adjuvant incomplete Freund's)를 사용한 혼합균 유화액을 상기 혼합균 유화액과 동일한 비율로 각 1㎖씩 2회 접종한 후,성장한 산란계에다 상기 혼합균 유화액을 동일한 비율로 각 0.5㎖씩 2회 접종을 포함하여 총 5회를 접종하는 방법으로,생산한 한개의 계란에 항-대장균, 항-살모넬라 엔테라이티디스, 항-살모넬라 티피뮤리움 및 항-전염성 위장염 바이러스의 특수면역단백질을 동시에 공유하게 하는 것을 특징으로 하는 항-혼합균 특수면역단백질을 보유한 계란생산방법.
- 제 3항에 있어서,상기 12주령 중추병아리에 접종되는 세균의 균체수가 108/㎖, 바이러스의 수가 105TCID50/㎖이 포함되도록 대장균항원: 살모넬라 엔테라이티디스항원: 살모넬라 티피뮤리움항원: 전염성 위장염 바이러스항원: 유화보조제의 비율이 2.0: 1.5: 1.5: 2.0: 3.0이 되도록, 5.0×108/㎖ 대장균 사균액항원 0.2㎖: 7.0×108/㎖ 살모넬라 엔테라이티디스 사균액항원 0.15㎖: 7.0×108/㎖ 살모넬라 티피뮤리움 사균액항원 0.15㎖: 5×105TCID50/㎖ 전염성 위장염 바이러스항원 0.2㎖: 프로인트 완전보조제 0.3㎖의 비율로 유화시킨 혼합균 유화액 1㎖를 병아리에 1회 접종하는 단계;상기 항원들을 프로인트 불완전보조제로 상기 혼합균 유화액과 동일 비율로 유화시킨 혼합균 유화액을 1주 간격으로 병아리에 1㎖씩 2회 접종하는 단계; 및성장한 산란계에다 상기 혼합균 유화액을 동일한 비율로 각 0.5㎖씩 2회 접종을 포함하여 총 5회를 접종하는 방법으로,생산한 한개의 계란에 항-대장균, 항-살모넬라 엔테라이티디스, 항-살모넬라 티피뮤리움 및 항-전염성 위장염 바이러스의 특수면역단백질을 동시에 공유하게 하는 것을 특징으로 하는 항-혼합균 특수면역단백질을 보유한 계란생산방법.
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 방법으로 생산된 상기 4가지 항-혼합균 특수면역단백질을 동시에 공유한 계란.
- 삭제
- 제 5항의 계란으로부터 난백을 제거하여 분리한 상기 4가지 항-혼합균 특수면역단백질을 동시에 함유한 난황을 함유한 자돈사료.
- 삭제
- 삭제
- 제 5항의 계란을 소정의 용기에서 난황막이 제거된 난황을 넣은 후,동량의 1차 알카리이온수를 첨가하여 교반하고 하루 정치시키고,상기 난황 및 알카리이온수 혼합액의 18배 분량이상의 알카리이온수를 섞은 후 방치하여 둔 다음 상층에 부유된 지방층을 제거하고 침전되지 않은 상등액을 농축 여과한 수용성 특수면역단백질을 동결건조하여 생산한 상기 4가지 항-혼합균 특수면역단백질(IgY)을 함유한 자돈사료.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
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