KR100471117B1

KR100471117B1 - 로타바이러스 감염의 예방 및 치료에 유용한 수용성단백질 및 이를 포함한 알 및 이들의 제조방법

Info

Publication number: KR100471117B1
Application number: KR10-2001-0078697A
Authority: KR
Inventors: 윤보경; 김도균; 김정우
Original assignee: 주식회사 단바이오텍; 김정우
Priority date: 2001-12-12
Filing date: 2001-12-12
Publication date: 2005-03-08
Also published as: KR20030048714A

Abstract

본 발명은 로타바이러스의 흡착 단백질을 항원으로 사용하여 면역화된 산란계로부터 산란되고 영아 및 유아의 설사증을 예방 및 치료하는데 유용한 수용성 단백질을 포함하는 알에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 알의 난황으로부터 분리되고 영아 및 유아의 설사증을 예방 및 치료하는데 유용한 수용성 단백질에 관한 것이다.

Description

로타바이러스 감염의 예방 및 치료에 유용한 수용성 단백질 및 이를 포함한 알 및 이들의 제조방법{Soluble Protein For Prevention and Treatment Of Rotavirus Infection, Eggs Containing The Same And Method For Producing Thereof}

본 발명은 로타바이러스 감염의 예방 및 치료를 위한 수용성 단백질을 포함하는 알 및 이러한 알의 난황으로부터 분리된 수용성 단백질에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 항원으로서 로타바이러스의 흡착(adsorption) 단백질로 면역화된 산란계로부터 배출되고 영아 및 유아의 설사증을 예방 및 치료하는데 유용한 수용성 단백질을 포함한 알 및 이러한 알의 난황으로부터 분리되고 영아 및 유아의 설사증을 예방 및 치료하는데 유용한 수용성 단백질에 관한 것이다.

로타바이러스(Rotavirus)는 사람, 원숭이, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 양, 토끼, 쥐, 닭, 칠면조 등에 설사를 일으키는 병원체로 전세계에 널리 분포되어 있다. 특히, 영아 및 유아의 설사증을 일으키는 주 원인체로 알려져 있다.

로타바이러스(Rotavirus)는 분류상 레오바이러스(Reoviridae)과에 속하며 피막(envelop)이 없는 내외 2층의 캡시드(capsid) 구조로 되어 있다. 직경 약 70nm의 정 20면체로 되어 있으며, 내부 캡시드 중심부에 직경 약 50nm의 코어(core)를 갖고 있다. 이 코어의 내부에는 11분절의 2중 나선 RNA(linear double-stranded RNA)로 구성된 게놈이 존재한다. 로타바이러스의 게놈은 6개의 구조단백(VP1, VP2, VP3, VP4, VP6, VP7)과 5개의 비구조단백(NSP1, NSP2, NSP3, NSP4, NSP5)을 암호화한다(Bernstein D. I. and R. L. Ward, Rotavirus: textbook of pediatric infectious diseases, 4th ed. Philadelphia, WB Saunders. 1901-1902 (1998)).

상기의 11게놈 분절 중에서 특히 제 4게놈 분절과 제 9게놈 분절(어떤 균주에서는 제 7 또는 제 8게놈 분절에 상응)이 백신 및 진단제의 개발에 있어서 중요시되고 있다(Fields Virology, 3rd ed., vol12, pp. 1625-1629, B. N. Fields et al., Lippincott-Raven Publishers, (1996)).

한편, 원숭이와 가축으로부터 분리된 로타바이러스는 통상 배양세포에서 비교적 잘 증식하기 때문에 그 배양 또는 계대배양이 용이하다. 그러나, 사람 로타바이러스의 세포배양에 의한 배양은 바이러스항원이 생산되어도 감염성 바이러스입자는 연속으로 계대하여 얻을 수 없는 불발감염(abortive infection)이 일어나고 따라서 계대배양이 극히 곤란하다. 따라서, 사람 로타바이러스와 원숭이나 소 등의 로타바이러스와의 사이에서 리어솔턴트(reassortant)를 작성하고, 사람 로타바이러스의 증식능의 향상을 도모하거나 또는 트립신(trypsin)으로 전처리한 사람 로타바이러스를 원숭이 유래의 세포 균주 MA104(ECACC No. 85102918)과 AGMK(African Green Monkey Kidney) 세포에서 배양한 후 트립신을 첨가하여 혼합한 유지 배지를 사용하여 회전배양에 의해 로타바이러스를 접종하는 연구가 시도되었다. 그러나, 상기 이러한 회전배양에 있어서도 백신 및 진단제의 제조에 필요한 양의 바이러스항원을 회수할 수 없는 단점이 있다.

사람 로타바이러스 감염증에 대한 각종 백신은 1985년경부터 개발이 시도되어 왔다. 그 주류는 항원성이 유사한 비인간 유래의 희석된 바이러스를 백신으로 대용하는 소위 제너방식(Jenerian Approach)에 의한 생백신(live vaccine)의 개발이다(WO92/01784; EPO 130906; 일본특개평 06-328107 ; 'Modern Vaccinology', pp. 213-229, E.Kurstak편, Plenum Medical BookCompany (1994), USA; 'Vaccines', 2nd ed., pp. 809-822, S. A. Plotolokin and E. A. Mortimer편, W. B. Saundorscompany 1994, USA; 'The Jordan Report-Accelerated Development of Vaccines 1996', p. 46과 p. 68, National Institute of Health 발행, USA). 그러나, 이들 생백신에 관한 임상 시험 테이터가 축적됨에 따라 예방효과가 충분하지 않으며 또한 위장염과 같은 부작용으로 인하여 판매가 금지된 상태이다.

이외에도 로타바이러스 감염을 예방 및 치료하기 위해 항혈청이나 초유, 단일클론항체를 이용한 항체가 개발되었으나 다량의 혈청항체를 얻기 위해서는 비용이 많이 소요되며 분리 및 보관에 따른 기술적 문제점이 있다. 혈청항체의 경우, 혈액으로부터 혈청과 면역글로불린의 분리 및 보관에 따른 제반 기술 및 소요경비가 고가인 점이 있어 실용적이지 못하다. 초유의 경우, 제한된 기간에만 분비되기 때문에 충분한 양의 초유항체 생산은 불가능한 실정이다.

최근에 몇몇 연구자들에 의해 산란계의 알을 이용한 항체단백질에 대한 연구가 시작되었다. 산란계의 알, 특히 난황(yolk of the egg)은 특이항체의 풍부한 자원으로서 알려져 있다 (Gassmann, et al., FASEB J, 4, 2528-2538 (1990)). 대한민국특허공보 제2001-16599호에는 유아의 분변에서 분리 수득한 로타바이러스를 회전배양한 다음 이를 불활성화시켜 항원으로 사용하여 산란계에 면역반응을 유도함으로써 생성된 로타바이러스에 대한 난황항체가 개시된 바 있다. 또한, 유럽특허공보 제955061호에는 돼지 로타바이러스를 항원으로 사용하여 산란계에 면역반응을 유도함으로써 생성된 난황항체를 포함하는 돼지 장관감염의 예방 및 치료를 위한 경구투여용 조성물이 개시된 바 있다.

상기 발명은 산란계에 로타바이러스 항체를 유도하기 위한 항원으로생균을 사용하거나 또는 약독화 및 불활성화된 바이러스를 사용한 것이다. 그러나, 로타바이러스의 바이러스자체를 항원으로 사용하는 경우, 바이러스 내에 여러 이종 단백질을 많이 함유하고 있기 때문에 단일항원을 사용하는 경우에 비해 항체 역가가 높게 나타나지 않는 단점이 있다.

본 발명자들은 영아 및 유아의 설사증을 유발하는 로타바이러스의 흡착 단백질을 유전자 재조합에 의해 제조하고, 이를 항원으로 이용하여 산란계를 면역시킨 다음 면역화된 산란계로부터 산란된 알의 난황에서 수용성 단백질을 분리하고, 이에 따라 수득된 수용성 단백질이 영아 및 유아의 설사증을 유발하는 로타바이러스에 고도의 결합력을 나타냄으로써 영아 및 유아의 설사증을 예방 및 치료하는데 유용할 수 있음을 확인하였다.

따라서, 한 가지 관점으로서, 본 발명은 유전자 재조합에 의해 제조된 영아 및 유아의 설사증을 유발하는 로타바이러스의 흡착 단백질을 항원으로서 사용하여 면역화된 산란계로부터 산란되고 영아 및 유아 설사증의 예방 및 치료에 유용한 수용성 단백질을 포함한 알을 제공한다.

다른 관점으로서, 본 발명은 유전자 재조합에 의해 제조된 영아 및 유아의 설사증을 유발하는 로타바이러스의 흡착 단백질을 항원으로서 사용하여 면역화된 산란계로부터 산란된 알의 난황으로부터 분리되고 영아 및 유아 설사증의 예방 및 치료에 유용한 수용성 단백질을 제공한다.

또 다른 관점으로서, 본 발명은 (a) 로타바이러스의 흡착 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, (b) 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주를 형질전환시키며, (c) 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건하에서 배양하고, (d) 배양된 형질전환체를 파쇄시키고 파쇄물로부터 실질적으로 순수한 부착 단백질을 회수하며, (e) 회수된 부착 단백질로 산란계를 면역화시키고, (f) 면역화된 산란계로부터 알을 산란시키는 단계를 포함함을 특징으로 하여, 영아 및 유아의 설사증을 예방 및 치료하는데 유용한 수용성 단백질을 포함한 알을 제조하는 방법을 제공한다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 (a) 로타바이러스의 흡착 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, (b) 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주를 형질전환시키며, (c) 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건하에서 배양하고, (d) 배양된 형질전환체를 파쇄시키고 파쇄물로부터 실질적으로 순수한 부착 단백질을 회수하며, (e) 회수된 부착 단백질로 산란계를 면역화시키고, (f) 면역화된 산란계로부터 알을 산란시키고, (g) 산란된 알의 난황으로부터 수용성 단백질을 분리하는 단계를 포함함을 특징으로 하여, 영아 및 유아의 설사증을 예방 및 치료하는데 유용한 수용성 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서 영아 및 유아의 설사증을 유발하는 로타바이러스의 병원성인자로서 흡착단백질이 사용되며 대표적으로 Vp8이 예시된다. 여기서, 용어 "영아"는 생후 2주부터 만 2세까지의 시기에 있는 아이를 가리키며 용어 "유아"는 만 2세부터 만 6세까지의 시기에 있는 아이를 가리킨다.

로타바이러스의 11 게놈 분절 중 제 4게놈 분절은 바이러스입자의 표면에 스파이크(spike) 상으로 노출된 구조단백질 Vp4를 암호화한다. Vp4는 혈구응집소, 중화항원, 프로테아제(protease)에 의해 촉진된 감염성, 병원성, 막융합, 세포로의 부착 등의 기능을 하며 프로테아제에 의해 Vp5와 Vp8로 잘린다. 이 중에서, 특히 Vp8은 8개의 Vp4 중화항체 결정기 중 5개를 가지고 있는 것으로 알려져 있다.

본 발명에 따른 영아 및 유아의 설사증을 유발하는 로타바이러스의 병원성인자는 유전자 재조합으로 제조한다. 유전자 재조합에 의한 병원성 인자의 제조는 공지 기술을 사용할 수 있다. 일반적인, 유전자 재조합에 의한 병원성인자의 제조는 병원체로부터 게놈 RNA 또는 DNA를 분리하고, 이로부터 중합효소 연쇄반응을 실시하여 cDNA를 제조하며, 생성된 cDNA를 주형으로 하여 표적유전자를 증폭하고, 상기 표적유전자의 DNA 서열을 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)을 포함하는 벡터에, 그 DNA 서열과 작동가능하게 연결되어 (operatively linked) 그 DNA 서열의 발현을 조절할 수 있도록 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주를 형질감염 또는 형질전환시키며, 생성된 형질감염 또는 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건하에서 배양하고, 배양된 형질전환체로부터 생성된 재조합 단백질을 분리 및 정제하는 단계로 구성된다.

로타바이러스의 게놈 RNA는 로타바이러스를 배양세포에 감염시키고 상기 배양세포의 성장에 필요한 영양물을 함유하는 배양 배지 내에서 배양시킨 다음 회수한 배양액을 용해시킨 후 바이러스 분리용 컬럼을 사용하여 분리할 수 있다. 배양세포로는 아프리카 녹색 원숭이 신장세포인 베로세포(CV-1)를 사용한다. 적합한 배지는 당해 분야에 공지되어 있으며 일반적으로 탄소 공급원, 질소 공급원, 필수 아미노산, 비타민 및 미네랄뿐 만 아니라 이외의 성분, 예를 들어 특정 숙주 세포에 의해 요구될 수 있는 증식 인자 또는 혈청을 포함한다. 바람직하게는 DMEM(Dulbeco's minimum essen tial medium)에 2% 소 태아 혈청(Fetal Bovine Serum)을 첨가한 보존배지에서 1주일간 배양한다. 배양이 완료되면, 배양액을 회수하고 RNA 추출 완충용액을 첨가하여 세포를 용해시킨 후 바이러스 분리용 키트 컬럼을 통과시켜 게노믹 DNA와 단백질을 완전히 제거하여 순수한 로타바이러스 RNA만을 분리한다.

로타바이러스 cDNA는 상기 로타바이러스의 RNA를 역전사-중합효소 연쇄반응으로 제조할 수 있다. 역전사-중합효소 연쇄반응에 사용되는 시발체는 유전자 은행에서 획득한 사람 로타바이러스 Vp8의 염기서열(M96825)를 참고로 하여 합성한다.

로타바이러스의 Vp8 유전자는 상기 로타바이러스 cDNA를 주형으로 하여 중합효소 연쇄반응으로 증폭함으로써 제조할 수 있다. 제조된 Vp8 유전자는 적합한 벡터에 클로닝한다. 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 예를 들어, pUC8, pBR322, pET/Rb, pGEX, pET28a 등을 사용할 수 있으며 바람직하게는 pMAL-c2x(NEB)를 사용한다. 본 발명에서 예시된 발현벡터로는 재조합 플라스미드 pMAL:Vp8이다.

상술한 발현 벡터에 의해 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질감염"은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되든 아니든 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다. "숙주 세포"는 원핵 또는 진핵세포일 수 있다. 또한, DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용된다. 예를 들면 대장균, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 대장균을 사용한다.

본 발명의 재조합 플라스미드 pMAL:Vp8을 상기 숙주세포에 형질전환하는 방법은 통상의 형질전환 방법, 예를 들어 DEAE-덱스트란, 칼슘 포스페이트법, 일렉트로포레이션 방법 등을 사용할 수 있다.

형질전환체 또는 형질감염체 및 이의 배양물로부터 Vp8 단백질을 분리하는 것은 통상적인 공지의 방법에 의해 실시될 수 있다. 불필요한 세포 조각(cell debris) 등을 제거하기 위해 세포 용해물 또는 세포 배양물을 원심분리한 후, 침전, 투석, 각종 컬럼 크로마토그래피 등을 적용한다. 예를 들어, 이온교환 크로마토그래피, 겔-침투 크로마토그래피, HPLC, 역상-HPLC, 프렙용 SDS-PAGE, 친화성 컬럼 등은 컬럼 크로마토그래피를 사용할 수 있다. 바람직하게는 본 발명에 따라 형질전환된 대장균을 초음파 파쇄한 후 4℃에서 5,000 내지 9,000Xg, 10분 내지 40분 원심분리하여 상청액을 회수하고 회수한 상청액을 아밀로즈 컬럼을 이용하여 순수한 Vp8 단백질 분획을 분리한다.

본 발명에 따라 제조된 Vp8 단백질을 항원으로 사용하여 산란계에 면역화시키는 방법은 당 분야의 통상적인 기술에 따라 실시할 수 있다. 본 발명에 이용되는 산란계로는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 산란율이 높은 백색레그혼계, 로드아일랜드계, 하이라인 브라운계 등을 이용하는 것이 바람직하다. 산란계에 항원 단백질을 투여하는 경로로는 복멤브레인내, 근육내, 안내 또는 피하 주사 등이 포함된다. 본 발명의 항원 단백질은 보조제, 예를 들어 프로인트(Freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 사용하여 그 면역성을 증가시킬 수 있다.

추가항원접종(booster)은 충분한 항체가 얻어질 때까지 실시할 수 있다. 바람직하게는 약 2주 간격으로 3회 내지 4회 면역을 실시하고, 다음 접종은 약 8주 간격으로 실시한다. 면역화된 산란계로부터 알을 수집하고 이로부터 목적하는 단백질을 분리한 다음 유도된 단백질의 양을 측정하여 그 증가량이 정체 상태에 도달하면, 최종적으로 알을 회수한다.

본 발명에 따른 수용성 단백질은 상기 회수된 알에서 난황을 분리하고, 이를 증류수로 희석한 다음, 상기 희석액의 pH를 4.0 내지 6.0으로 조절한 후 동결시키고, 동결체를 해동시켜 원심분리하며, 형성된 상청액을 여과하여 분리할 수 있다. 바람직하게는 회수된 알에서 난황을 분리하고 증류수를 가하여 5배 내지 15배로 희석한 다음, 희석액의 pH를 약 5.0으로 조절한 후 -10℃내지 -30℃에서 24시간 이상 동결시키고, 동결체를 실온에서 해동시켜 5,000 내지 15,000 ×g, 10℃ 내지 20℃에서 20 내지 40분간 원심분리하며, 형성된 상청액을 여과지로 여과하여 분리한다.

유도된 단백질 양의 측정은 당 분야의 통상적인 방법에 따라 측정할 수 있으며, 바람직하게는, 효소면역흡착법 또는 마이크로타이터법으로 측정한다. 더욱 바람직하게는, 마이크로플레이트에 부착된 재조합 단백질 Vp8과 본 발명에 따라 면역화된 알의 난황으로부터 분리한 수용성 단백질을 반응시킨 다음 알칼린 포스페이트로 희석한 2차항체를 반응시키고 여기에 기질용액으로 포스페이트 섭스트레이트 타블레트를 가하여 효소의 작용에 의한 발색반응을 약 405nm 파장에서 측정함으로써 유도된 단백질의 양을 정량하는 방법인 효소면역측정법(Enzyme Linked Immunosorbent Assay; ELISA)을 사용한다.

한편, 본 발명에 따라 생성된 알의 난황으로부터 분리된 단백질은 로타바이러스와 강력하게 결합하는 특성이 있다. 이는 현미경 슬라이드의 고정면에 로타바이러스에 감염된 세포를 고정하고, 이를 본 발명에 따른 수용성 단백질과 반응시킨 후, 형광색소가 결합된 2차 항체를 첨가하여 형광현미경하에서 관찰하는 간접형광항체법(Indirect Fluorescent Assay, IFA)으로 분석할 수 있다. 이때, 감염세포 또는 감염되지 않은 대조세포의 세포질에서 전혀 형광이 없는 경우를 음성, 반응의 역가가 감염세포나 비감염세포에 있어서 동일하거나 또는 형광이 세포핵 안에 있으면 그 결과는 미결정 및 대조세포와 비교하여 감염세포의 세포질에 형광이 있는 경우를 양성으로 판정한다. 본 발명에 따른 수용성 단백질은 간접형광항체법으로 분석한 결과, 대조세포와 비교하여 감염세포의 세포질에 형광이 관찰되었다. 따라서, 본 발명에 따른 수용성 단백질은 로타바이러스와 강력하게 결합함을 확인할 수 있었다.

본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시 예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

로타바이러스의 Vp8 유전자 클로닝

(1-1) 로타바이러스로부터 게놈 RNA의 분리

세포단층이 형성된 베로세포(CV-1)에 로타바이러스(rotavirus strain Wa)를 감염시킨 후 DMEM(Dulbecco's minimum essential medium)에 2% 소 태아 혈청(Fetal Bovine Serum)을 첨가한 보존배지(maintenance medium)에서 1주일 동안 바이러스를 배양하였다. 바이러스 배양상층액 150㎕를 구아니디움 티오시아네이트 용액(guanidium thiocyanate sol.)으로 용해시킨 후, 바이러스 분리 키트 컬럼(Quiagen virus isolation kit column)에 RNA를 부착시켰다. 세척 완충용액(wash buffer)으로 컬럼을 두번 세척한 다음 50 ㎕ 의 DEPC를 처리한 뉴클레아제 자유수(DEPC treated nuclease free water)로 RNA를 분리하였다.

(1-2) 로타바이러스의 Vp8 유전자 클로닝

로타바이러스 Vp8은 스파이크 단백질(spike protein)의 일부분으로 중화항체 형성에 관여한다. 유전자은행(EMBL, Nucleotide Sequence Database, Cambridge, UK.)에서 얻은 사람 로타바이러스(human rotavirus Wa strain) Vp8의 염기서열(M96825)을 참고로 역전사-중합효소 연쇄반응에 관여하는 시발체를 합성하였고, 각 시발체의 말단에 EcoRI 과 HindⅢ 제한효소 인식부위를 삽입하였다. 바이러스 RNA 15㎕ 에 2pmol 프라이머를 넣고 92℃에서 10분간 변성시킨 후, 5unit RNase 억제제(inhibitor), 역전사 완충액, 200μM dNTP, 10unit MMLV 역전사효소를 넣어 최종 30㎕ 되게 한 다음 40℃에서 1시간 반응시켜 cDNA를 합성하였다. 98℃에서 5분간 역전사효소를 불활화시킨 후 중합효소 연쇄반응을 실시하였다.

상기에서 합성한 로타바이러스 cDNA를 주형으로 하고 반응부피를 30 ㎕로 하여 정방향 시발체(reverse primer) 20pmol, 역방향 시발체(forward primer) 20pmol, 250μM dNTP, 2.5unit Taq DNA 중합효소의 조성으로 PCR을 수행하였다. 표적유전자 증폭시 92℃ 1분, 56℃ 1분, 72℃ 1분을 한 주기로 하여 30회 반응시켰다. 증폭된 DNA는 pMAL-c2x(NEB) 발현벡터의 EcoR I 과 Hind Ⅲ의 제한효소 자리에 T4 라이게이즈를 사용하여 클로닝시켰다(도 1).

정방향 시발체 : 5'-EcoRⅠ-GCTTCGCTCATTTATAGACAG-3'

역방향 시발체 : 5'-HindⅢ-TTATGCTCTCTTATACTGTATCG-3'

실시예 2

재조합 단백질 Vp8의 발현 및 정제

(2-1) 재조합 단백질의 발현

실시예 1에서 획득한 양성클론을 취하여 10㎖의 암피실린을 포함한 LB 배지에 접종 후 하룻밤동안 37℃에서 진탕 배양하였다. 준비된 1000㎖의 LB 배지에 밤새 배양된 대장균을 접종하여 흡광도(A₆₀₀)가 1.0이 되도록 진탕배양하고 발현을 유도하기 위해 0.5mM의 IPTG를 가하여 37, 25 또는 20℃에서 16시간 더 배양하였다. 원심분리(8,000rpm, 20분, 4℃)하여 대장균을 얻은 다음 -70℃에서 저장하면서 다음 실험의 시료로 사용하였다.

(2-2) 재조합 단백질Vp8의 정제

상기 실시예 2-1의 형질전환된 대장균 펠렛을 컬럼 완충액(20mM Tris-HCl pH7.4, 200mM NaCl, 1mM EDTA)으로 재부유시켰다. 현탁액을 초음파 파쇄를 실시한 후 원심분리(9,000×g, 30분, 4℃)하여 상청액을 취하고 컬럼 완충액으로 적당히 희석하여 평형화된 아밀로즈 컬럼에 로딩하였다. 컬럼 완충액(컬럼 부피의 12배)으로 세척하고, 용출 완충액(10mM이 함유된 컬럼 완충액)으로 단백질 분획을 얻어내었으며 BCA 분석 키트(price)로 정량하였다. 또한 단백질을 SDS-PAGE (도 2)와 웨스턴 블럿으로 정성검사를 하여 재조합 단백질 Vp8을 확인하였다.

실시예 3

재조합 단백질 Vp8의 면역원성 검사

세포단층이 형성된 베로세포(CV-1)에 로타바이러스 (rotavirus Wa strain, ATCC VR2018)을 감염시킨 후 DMEM (Dulbecco's minimum essential medium)에 2% 소태아혈청(Fetal Bovine Serum)을 첨가한 보존배지로 1주일 동안 바이러스를 배양시켰다. 감염된 세포를 회수하여 웨스턴 블럿 시료 완충용액에 재부유시킨 다음 95℃에서 5분간 방치시키고 SDS-PAGE를 시행하였다. SDS-PAGE로 분리된 단백질을 니트로셀룰로스막(nitrocellulose membrane)으로 옮기고, 대장균 DH5에서 발현된 Vp8재조합 단백질의 항혈청을 항체(primary antibody)로 웨스턴 블럿을 실시한 결과, 약 30kDa의 단백질임을 확인하였다(도 3).

실시예 4

재조합 단백질 Vp8을 이용한 산란계의 면역유도

(4-1) 공시동물

상기 실시예에서 획득한 재조합 단백질 Vp8에 대한 수용성 단백질의 유도에 사용된 동물은 산란을 시작한 36주령의 ISA-브라운계의 산란계 15수를 사용하였다.

(4-2) 산란계의 면역유도

준비된 재조합 단백질 Vp8(1㎎/㎖)과 프로운트의 완전 보조제(Freund's complete adjuvant, Sigma Chemical Co.)를 각각 동량 혼합하여 유화시켰다. 상기 유화액 1㎖를 산란계의 흉근에 각각 0.25㎖씩 4곳에 근육 주사하여 1차 접종하였다. 추가항원주입(Booster injection)은 1차 접종 후 2주 간격으로 총 3회 실시하였으며 다음 접종은 8주 간격으로 실시하였다. 2차 접종부터는 프로운트의 불완전 보조제(Freund's incomplete adjuvant, Gibco)로 유화하여 1차 접종과 동일한 방법으로 실시하였다. 난은 매일 회수하여 8℃에 저장하여 실험에 이용하였다.

(4-3) 수용성 단백질의 분리

채집한 알에서 난황을 분리 후 증류수(pH 5.0)로 10배 희석하였다. 희석용액을 pH 5.0으로 조정 후 -20℃에서 하루 동안 동결하였다. 이를 실온에서 해동시킨 후 30분간 15℃에서 10,000×g로 원심분리하여 상청액만 수거하였다. 상청액을 여과지(Whatman No.1)로 여과하여 수용성 단백질을 분리하였다. 그리고 분리된 단백질은 -20℃에 보관하면서 각종 실험의 시료로 사용하였으며 일부는 냉동건조하여 보관하였다.

(4-4) ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)분석

재조합 단백질 Vp8을 각각 5 내지 10㎍/㎖이 되도록 중탄산염 완충용액(pH 9.6)으로 희석하여 마이크로플레이트(MicrotestⅢ flexible Assay plate, Falcon 3991)에 4℃에서 하루 동안 피복하였다. 피복이 완료된 플레이트를 세척용액(0.02M 인산 완충용액, 0.13M NaCl, pH 7.2, 0.05% 트윈20)으로 3회 세척한 후 5% 탈지유 용액(pH 7.3, Difco)으로 2시간 동안 실온에서 방치하였다. 면역화된 알의 난황으로부터 분리한 수용성 단백질을 5%탈지유 용액과 PBST(PBS containing 0.05% Tween-20)를 동량으로 섞은 희석용액으로 2,000배부터 1,458,000배까지 3배수로 희석한 후 37℃에서 2시간 반응시켰다. 2차 항체는 알칼린 포스페이트가 결합된 어피니퓨어 토끼 항-닭 IgY(IgG)(conjugated AffiniPure rabbit anti-chicken IgY(IgG), Jackson, USA)를 5,000배로 희석하여 37 ℃에서 2시간 반응시켰다. 기질용액으로는 인산 기질 타블렛(Phosphate substrate tablets: ρ-nitrophenyl phosphate, Sigma-104)을 10% 디에탄올아민(0.5 mM MgCl₂ pH 9.8를 포함하는 디에탄올아민)에 녹인 용액을 사용하여 20분간 효소반응시켰다. 각 과정 중 플레이트의 세척은 6회씩 실시하였다. 반응억제제는 5M 수산화나트륨을 사용하였으며 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices ;E Max)를 이용하여 405nm에서 OD(optical density)를 측정한 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이, 알 유래 단백질이 유도됨을 확인하였다.

재조합 단백질 Vp8에 의해 유도된 수용성 단백질

접종후 평균 O.D (50000배 희석)
0주	2주	4주	12주	20주
< 0.01	0.23	0.71	0.98	1.15

실시예 5

로타바이러스에 대한 수용성 단백질의 결합력 조사

간접형광항체법을 실시하기 위해 로타바이러스 감염된 세포를 회수한 후 0.01M 인산완충용액 (pH 7.2)으로 3회 원심세척 하였다. 세척한 감염세포를 최종 세포수가 1x10⁶cells/ml되게 조정한 후 37℃ , 5% CO₂ 배양기에서 24시간 배양한 다음, 4℃ 무수아세톤으로 10분간 항원 슬라이드에 고정하였다. 0.01M 인산 완충용액으로 16배 희석한 Vp8 재조합 단백질의 항혈청을 20㎕ 가한 다음 37℃에서 30분 반응시킨 다음, 형광성 이소티오시아네이트(flourescent isothiocyanate, FITC)-결합된 2차 항체 IgG 8unit를 20㎕ 가한 후 형광 현미경 하에서 관찰하였다.

실험 결과, 대장균에서 재조합 단백질로 발현된 Vp8에 의해 유도된 수용성 단백질은 로타바이러스에 강력하게 결합함을 확인하였다(도 4, a: 양성대조군, b: 음성대장균, c 수용성 단백질 Vp8).

상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 항원으로서 로타바이러스의 흡착에 관여하는 단백질로 면역화된 산란계로부터 배출된 알 및 상기 알의 난황으로부터 분리된 수용성 단백질은 로타바이러스와 강력한 결합능력이 있다. 따라서 본 발명에 따른 산란계로부터 회수된 알 및 상기 알로부터 분리된 단백질은 영·유아 설사증의 원인이 되는 로타바이러스의 검출, 예방 및 치료제로 사용할 수 있다.

도 1은 영아 및 유아의 설사증을 유발하는 로타바이러스의 흡착 단백질 Vp8을 발현하기 위한 재조합 벡터의 작제도이다.

도 2는 발현된 단백질의 분리, 정제된 SDS-PAGE의 사진이다 (레인 1 : 단백질 마커, 레인 2 : MBP-Vp8).

도 3은 로타바이러스의 재조합 단백질 Vp8과 이의 항혈청을 이용한 웨스턴 블럿 결과이다.

도 4는 본 발명에 따른 면역화된 산란계로부터 배출된 알의 난황으로부터 분리된 수용성 단백질과 로타바이러스와의 결합력을 간접 형광항체법으로 측정한 결과이다(a: 양성대조군, b: 음성대조군, c 수용성 단백질Vp8).

Claims

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(a) 로타바이러스의 흡착 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, (b) 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주를 형질전환시키며, (c) 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건하에서 배양하고, (d) 배양된 형질전환체를 파쇄시키고 파쇄물로부터 실질적으로 순수한 흡착 단백질을 회수하며, (e) 회수된 흡착 단백질로 산란계를 면역화시키고, (f) 면역화된 산란계로부터 알을 산란시키는 단계를 포함함을 특징으로 하여, 영아 및 유아의 설사증을 예방 및 치료하는데 유용한 수용성 단백질을 포함한 알을 제조하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 DNA 서열이 유전자 Vp8인 방법.
제8항에 있어서, 재조합 발현 벡터가 재조합 플라스미드 pMAL:Vp8인 방법.
(a) 로타바이러스의 흡착 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, (b) 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주를 형질전환시키며, (c) 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건하에서 배양하고, (d) 배양된 형질전환체를 파쇄시키고 파쇄물로부터 실질적으로 순수한 흡착 단백질을 회수하며, (e) 회수된 흡착 단백질로 산란계를 면역화시키고, (f) 면역화된 산란계로부터 알을 산란시키고, (g) 산란된 알의 난황으로부터 수용성 단백질을 분리하는 단계를 포함함을 특징으로 하여, 영아 및 유아의 설사증을 예방 및 치료하는데 유용한 수용성 단백질을 제조하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 DNA 서열이 유전자 Vp8인 방법.
제11항에 있어서, 재조합 발현 벡터가 재조합 플라스미드 pMAL:Vp8인 인 방법.
제11항에 있어서, 알의 난황으로부터 수용성 단백질을 분리하는 단계가 알의 난황을 증류수로 희석하고, 희석된 난황 용액의 pH를 4.0 내지 6.0으로 조절한 후 동결시키고, 동결체를 해동시켜 원심분리하며, 형성된 상청액을 여과하여 분리하는 것으로 구성되는 방법.