KR20010023179A - 알에서의 단백질 생산방법 - Google Patents
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Abstract
알에서 항체와 가은 재조합 단백질을 생산하는 방법이 개시된다. 이 방ㅂ버은 높은 수율, 염가 및 동물 보호 규제에 순응적이라는 측면에서 기존의 시스템에 비해 많은 장점을 갖는다. 뿐만 아니라, 알은 먹을 수 있는 식품원이므로, 재조합 단백질을 알로부터 반드시 분리할 필요가 없다.
Description
바이오테크놀로지는 질병을 진단 및 치료해는 것 같은 많은 중요한 의학적 용도를 갖는 단백질의 생산방법을 개선시켜왔다. 불행히도, 재조합 단백질을 생산하는 기존의 많은 방법들은 단백질의 대규모 생산과 정제에 막대한 비용을 요하기 때문에 실제의 이용에 제약이 따랐다.
항체 분자는 바이오테크놀로지를 이용하여 제조된 단백질의 한가지 유형이다. 항체 (또는 임뮤노글로불린)는 여러 가지 질병과 병원체를 진단하고 치료하는데 있어서 매우 유용한 수단이다. 간단히 말해서, 온전한 항체 또는 임뮤노글로불린 분자들은 2개의 헤비(H) 체인과 2개의 라이트 (L) 체인으로 이루어지며, 이들 각각은 카르복시 말단에 항상부를, 아미노 말단에 가변부를 갖는다. 인간의 임뮤노글로불린에 있어서는 몇몇 항상부 이소타잎이 동정되었는데, 이들 중 2개는 라이트 체인 (카파와 람다), 5개는 헤비 체인 (알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤)에 관련되어 있다. 그 이름이 나타내듯, 가변부의 서열은 각각의 임뮤노글로불린 분자에서 저마다 다르다. 가변부는 항원 결합부위를 함유하기 때문에 임뮤노글로불린 분자의 항원 특이성을 결정해준다.
인간을 면역화시키는 경우, 면역화 항체에 대한 면역 반응을 피하기 위해서 인간의 항체를 이용하는 것이 바람직하다. 그러나, 실무성, 그리고 윤리적인 관점에서, 인간 소스로부터 인간의 항체를 대량으로 만들어내기란 불가능하였다. 비록 혈청이나 모유로부터 유래된 인간의 Ig는 효과적인 것으로 입증되었지만, 인간 산물의 높은 비용과 제한된 공급은 이들의 광범한 응용에 제한이 되어왔다. 비인간 항체 제제에 대한 면역 응답을 감소시키기 위해, 키메릭 항체 또는 인간화 항체가 제조되어 왔다. 키메릭 항체는 항체의 항상부는 인간 항체로부터, 가변부는 대체로 비인간의 면역화된 숙주로부터 유래되도록 유전공학적으로 만들어낸다. 가변부는 대개 소망되는 항원으로 면역화시킨 설치류로부터 분리된 항체로부터 유래된다.
항체로 치료하는데 유용한 한 분야는 장 감염 (enteric infections) 치료 분야이다. 설사, 이질 또는 장티푸스를 일으키는 장 감염은 개발도상국가에서 연간 수십억건의 발병률과 수백만건의 사망률을 일으켜, 중대한 공중위생상의 문제점이 되고 있다. 로타바이러스 (rotaviruses)는 선진국과 개발도상국 모두에 있어서 유아 및 아동의 위장염 감염의 주요한 원인이 되고 있다. 장 독소발생성 대장균 (ETEC: enterotoxigenic Escherichia coli)은 또 다른 주요한 원인균으로서 전세계적으로 연간 6억건의 설사를 일으킨다. ETEC 질환은 오염된 음식이나 물을 섭취함으로써 개시된다. 세균은 상부 소장에 전이되어 집락화된 다음 열에 안정하거나/또는 불안정한 엔테로톡신을 생산한다. 두가지 병원체 모두 점막 표면에 효적화된 항체로 처리하는데 민감성을 가질 것이다.
발명의 요약
본 발명은 알에서 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다. 넓은 의미로, 본 발명은 단백질 발현 및 알에 단백질을 전달하는데 적당한 조건 하에, 알을 낳는 (egg-laying) 포유동물에서 단백질을 발현하는 단계를 포함함을 특징으로 하는, 난에서 재조합 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.
재조합 단백질은 그 동물에서 발현될 수 있고 그 재조합 단백질을 코딩하고 재조합 단백질의 발현에 필요한 조절 대역을 코딩하는 DNA 서열을 함유하는 발현 시스템을 이용하여 알로 전달될 수 있다. 재조합 단백질이 정상적으로 알에 축적되지 않는 경우, 발현 시스템은 알을 낳는 동물의 알에 단백질을 표적화 또는 전달할 수 있는 제 2의 DNA 서열을 함유할 수도 있다.
제 2 DNA는 재조합 단백질의 발현을 알에 표적화시킬 수 있는 알-특이적인 유전자로부터 유래한 조절 대역을 코딩할 수 있다. 다른 한편, 제 2 DNA 서열은 난의 수용체에 결합하여 재조합 단백질을 알에 업테이크(uptake) 시킬 수 있는 단백질 또는 펩티드를 코딩할 수 있다.
본 발명자들은 임뮤노글로불린 단백질들이 알을 낳는 포유동물에서 발현되어 알에 전달될 수 있음을 입증하였다. 특히, 본 발명자들은 인간의 임뮤노글로불린 단백질로부터의 항상부가 조류의 난모세포에 결합하여 난황내로 인터널라이제이션될 수 있음을 밝혀내었다.
한가지 구체예에서, 본 발명은 조류의 알에서 재조합 항체 분자를 제조하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 계란에서 인간화 (humanized) 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본문에서 "인간화 항체"란 인간의 항상부를 함유하는 임뮤노글로불린 또는 항체 분자를 의미한다. 인간화 항체는 키메릭일수도 있고 닭, 마우스 등과 같은 비인간의 가변부를 함유할 수도 있다. 항체는 키메릭이 아닐수도 있고 인간의 가변부를 함유할 수도 있다. "항체" 및 "임뮤노글로불린"이라 함은 본문에서 상호동의어로 사용된다.
따라서, 본 발명은 (i) 임뮤노글로불린 항상부를 코딩하는 제 1 DNA 서열 (ii) 임뮤노글로불린 가변부를 코딩하는 제 2 DNA 서열 및 (iii) 항체를 발현시키는데 충분한 조절 대역을 포함함을 특징으로 하는, 재조합 항체를 알에 전달하기 위한 발현 시스템을 제공한다. 바람직하게는, 항상부는 인간의 임뮤노글로불린으로부터 유래된 것이 좋다.
임뮤노글로불린 단백질이 알에 결합되어 테이크업될 수 있다는 본 발명자들의 발견으로 인해, (a) 알에 결합 및 업테이크되는데 충분한 임뮤노글로불린 단백질 부분과 그에 커플링된 (b) 목적하는 재조합 단백질을 함유하는 융합 단백질을 제조함으로써, 재조합 단백질을 알에 전달하는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명은 (i) 재조합 단백질을 코딩하는 제 1 DNA 서열과 (ii) 상기 제 1 DNA 서열에 작동적으로 링크되고 알에 결합하는데 충분하며 그 결과 재조합 단백질을 업테이크시키는 임뮤노글로불린 분자의 일부를 코딩하는 제 2 DNA 서열로 이루어진, 알에 재조합 단백질을 전달하기 위한 발현 시스템을 제공한다. 한가지 특정한 구체예에서, 제 2 DNA 서열은 임뮤노글로불린 항상부를 코딩하는 유전자로부터 유래한다.
상술한 발현 시스템은 여러 가지 기술을 이용하여 알을 낳는 동물내로 도입될 수 있다. 한가지 구체예에서는, 재조합 단백질이 발현되어 알에 전달될 알을 낳는 동물내로 발현 시스템을 직접 도입할 수 있다.
또 다른 구체예에서는, 발현 시스템을 숙주세포내로 배양 형질도입시킬 수 있다. 숙주 세포는 재조합 단백질이 재조합 단백질이 분비될, 알을 낳는 동물내로 주입될 수 있다. 숙주 세포는 알을 낳는 동물과 동일한 종인 것이 바람직하다. 특정 구체예에서, 숙주 세포는 조류의 세포주이다. 재조합 단백질이 항체이면, 조류의 세포주는 임파양 세포주인 것이 바람직하고, DT40 또는 v rel 형질전환 B 세포주와 같은 불멸화 B 세포주이면 더욱 바람직하다.
또 다른 구체예에서, 임의로, 단백질을 알에 전달하는 단백질 또는 펩티드와의 융합 단백질로서 재조합 단백질을 발현시키는 트랜스제닉 알 낳는 동물을 제조함으로써 알에 발현 벡터를 전달할 수 있다. 바람직하게는, 동물이 가금류인 것이 좋고, 재조합 단백질은 인간화 항체와 같은 항체인 것이 좋다.
본 발명은 재조합 단백질을 함유하는 알 제제 뿐만 아니라, 예컨대 여러 가지 질병을 진단, 예방 및 치료하는데 있어서의 상기 알 제제의 용도를 포함한다. 알 제제는 직접 사용할 수 있고 또는 알로부터 재조합 단백질을 추가로 분리 및 정제할 수도 있다.
한가지 구체예에서, 본 발명의 항체들은 장 감염을 예방 및 치료하는데 유용하다.
본 발명은 또한 동물의 알에서 병원균에 특이적인 재조합 항체를 제조함으로써 무병원균란을 제조하는데 이용될 수도 있다. 따라서, 본 발명은
(a) 알 낳는 동물내로 병원균에 특이적인 항체를 도입하고;
(b) 상기 동물로 하여금 실제로 병원균이 없는 알을 낳게 하는 것을 특징으로 하는, 특정 병원균이 없는 알을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면과 장점은 다음의 상세한 설명으로부터 분명히 드러날 것이다. 그러나, 본 발명의 상세한 설명과 특정 실시예는 어디까지나 설명목적을 위해 바람직한 구체예를 제공하는데 지나지 않으며 많은 변형과 변화가 본 발명의 범위와 정신 내에서 가능함을 당업자는 본 발명의 상세한 설명으로부터 파악할 수 있을 것이다.
본 발명은 알(卵)에서 재조합 단백질을 생산하는 방법; 재조합 단백질을 난에 전달하기 위한 발현 시스템; 재조합 단백질을 함유하는 알 및 재조합 단백질을 생산하는 비인간 트랜스제닉 알 낳는 동물에 관한 것이다.
도 1은 난황 1 ml 당 hIgG의 농도 대 시간을 나타낸 그래프이다.
도 2A는 난황 1 ml 당 hIgA의 농도 대 시간을 나타낸 그래프이다.
도 2B는 알부민 1 ml 당 hIgA의 농도 대 시간을 나타낸 그래프이다.
도 3A는 난황 1 ml 당 rhIgG의 평균 디포지션 (deposition) 대 시간을 나타낸 그래프이다.
도 3B는 난황 1 ml 당 rhIgG의 최고 디포지션 대 시간을 나타낸 그래프이다.
도 4A는 암탉으로부터의 혈액 샘플 중의 hIgG 세포의 광현미경 사진이다.
도 4B는 암탉으로부터 채혈된 혈액 샘플 중 hIgG에 대한 면역조직학적 염색을 나타낸 도면이다.
도 5는 난황 1 ml 당 rhIgA의 농도 대 시간을 나타낸 그래프이다.
넓게 말해서, 본 발명은 단백질 발현과 다백질을 알에 전달하는데 적합한 조건하에, 알 낳는 포유동물 중에서 단백질을 발현시키는 것으로 되는, 알에서의 재조합 단백질의 제조방법을 제공한다.
단백질은 어떠한 단백질이어도 무방하고 항체, 시토카인, 호르몬, 효소, 백신 및 진단 용도의 항원이거나, 치료용 펩티드가 이에 포함된다.
알은 새, 양서류, 파충류 및 어류를 비롯한 여하한 알 낳는 동물로부터 유래한 것일 수 있다. 바람직하게는, 알이 닭, 칠면조 또는 오리와 같은 가금류로부터 유래된 것이 좋다. 재조합 단백질원으로서의 알을 이용함으로써 현대적인 동물 보호 규제, 염가, 편리성 살균성 및 난황의 분획화를 위한 기술의 이용가능성, 및 항체와 같은 단백질의 분리 등 커다란 장점을 누릴 수 있다. 하나의 알은 대략 항체 100mg을 생산할 수 있고, 년간 250개의 계란을 낳는 닭 한 마리는 25g의 Ig를 생산할 수 있고 10,000마리 정도의 소규모의 닭은 1년에 25kg의 임뮤노글로불린을 생산할 수 있게 된다. 알은 실온에서 수주일간 보관할 수 있다.
1. 발현 시스템
(a) 임뮤노글로불린
상기한 바와 같이, 본 발명자들은 임뮤노글로불린이 알 낳는 동물에서 발현되어 알에 전달될 수 있음을 밝혀내었다.
특히 본 발명자들은 인간의 임뮤노글로불린 (Ig)G와 IgA를 닭에 직접 주입하거나 (실시예 1) 재조합 IgG 또는 IgA를 발현하는 세포주를 닭에 주입함으로써 (실시예 2 및 실시예 3) 인간의 임뮤노글로불린 (Ig)G와 IgA를 계란에 전달할 수 있음을 밝혀냈다. 이에 더해, 본 발명자들은 조류의 알에 Ig를 결합 및 업테이크시키는 역할을 하는 임뮤노글로불린의 일부가 임뮤노글로불린 단백질의 Fc 대역 중 CH2-CH3 부분에 존재함을 밝혀냈다. 본 발명자들은 조류의 알 상의 Fc 수용체가, 마우스에 있어서 혈청 Ig 농도의 조절, 모계 IgG의 트랜스시토시스, 모계배아 (maternofetal) 장벽을 가로질러 IgG를 전달하는 역할을 하는 포유동물의 Fc 수용체 신생아 (FcRn: Fc Receptor neonate)의 동족체일 수 있음을 추가로 밝혀냈다(실시예 4).
따라서, 본 발명은 (i) 임뮤노글로불린 가변부를 코딩하는 제 1 DNA 서열 (ii) 임뮤노글로불린 항상부를 코딩하는 제 2 DNA 서열 및 (iii) 항체를 발현시키는데 충분한 조절 대역을 포함하는, 알에 재조합 항체를 전달하기 위한 발현 시스템을 제공한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 계란에서 인간화 항체를 제조하는 것에 관한다. 상기 정의한 바와 같이, 인간화 항체는 인간의 항상부를 함유한다. 이 항상부는 카파 및 람다 라이트 체인과 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 헤비 체인을 비롯한 공지의 항상부에서 선택될 수 있다. 가변부는 인간 또는 조류, 양, 쥐 또는 소와 같은 비인간 유래의 것일 수 있다. 가변부와 항상부가 상이한 종으로부터 유래된 것인 경우에는 그 항체를 "키메릭 항체"라 부른다. 키메릭 항체는 본 발명에 참조된 Morrison 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6859, 1984에 설명된 바와 같은 공지기술을 이용함으로써 제조할 수 있다.
가변부는 소망되는 항원에 대한 특이성을 가질 수 있다. 소망된 항원은 세균, 바이러스, 독소, 앨러젠 뿐만 아니라 종양관련 항원을 비롯한 질병 특이 항원 중에서 선택될 수 있다. 소망되는 항원 특이성을 갖는 가변부를 코딩하는 가변부 유전자는 소망되는 항원 특이성을 갖는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 얻을 수 있다. 소망되는 특이성을 갖는 항체를 생산하는 하이브리도마는 공지기술을 이용하여 제조할 수 있다. 간략히 설명하면, 어떤 동물 (닭, 쥐 또는 토끼 등과 같은 동물)을 소망되는 항원으로 면역화시켜 항체를 생산하는 임파구를 얻을 수 있다. 이 임파구를 골수세포와 같은 불멸화 세포와 융합시킴으로써 불멸화시켜 하이브리도마를 제조한다. 소망되는 항체를 생산하는 하이브리도마는 공지기술에 따라 선별할 수 있다 (예컨대 Kohler 및 Milstein, Nature 265:495-497. 1975). 이어서 폴리머라제 연쇄반응 (PCR)과 같은 공지기술을 이용함으로써 하이브리도마로부터 소망되는 가변부 유전자를 분리할 수 dT다.
서로 다른 2가지 항원 특이성을 갖는 2가지 상이한 가변부를 함유하는 이기능 (bifunctional) 항체 역시 제조가능하다.
인간의 항상부를 코딩하는 DNA 서열은 입수가능한 소스로부터 얻거나 또는 상술한 기술에 EK라 인간 항상부를 갖는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주로부터 분리해낼 수 있다.
인간의 항상부를 코딩하는 DNA 서열과 소망되는 가변부를 코딩하는 DNA 서열을 함유하는 재조합 발현 벡터를 제조할 수 있다. 이러한 벡터에는 발현 조절 EH는 프로모터, 인핸서 및 종결 서열과 같은 조절 서열이 부가적으로 포함될 수 있다. 바람직한 조절 서열은 임뮤노글로불린 유전자로부터 유래되지만 바이러스로부터 유래된 것들 과 같은 부가적인 조절 대역도 유용할 수 있다. 벡터는 플라스미드, 바이러스, 레트로바이러스 및 아데노바이러스를 비롯한 다양한 벡터로부터 선택가능하다.
미리-형성된 발현 벡터는 항상부를 코딩하는 DNA 서열과 필요한 조절 서열을 함유하도록 제조할 수도 있다. 소망되는 항원 특이성을 갖는 항체 제조를 위해 미리 형성시킨 벡터 내부로 소망되는 가변부 DNA 서열을 삽입할 수 있다. 미리-형성된 벡터는 EK라서 소망되는 인간화 항체를 손쉽게 제조할 수 있게 해준다.
(b) 재조합 융합 단백질
상술한 바와 같이, 본 발명자들은 임뮤노글로불린이 조류의 알에 결합하여 조류의 알 속으로 전달됨을 보여준 바 있다. 이에 더해, 본 발명자들은 계란에서의 Ig 결합과 업테이크에 책임이 있는 임뮤노글로불린의 일부가 Fc 대역의 CH2-CH3 부분에 함유되어 있음을 측정해냈다. 이러한 본 발명자들의 발견으로 인해 알에 결합하는데 충분한 임뮤노글로불린의 서열에, 소망되는 단백질을 커플링시킴으로써 난에서 재조합 단백질을 제조하는 것이 가능하게 되었다.
따라서, 한가지 측면에서, 본 발명은 (i) 재조합 단백질을 코딩하는 제 1 DNA 서열과 (ii) 상기 제 1 DNA 서열에 작동적으로 링크되고 알에 결합하여 재조합 단백질의 업테이크를 일으키기에 충분한 임뮤노글로불린 단백질의 일부를 코딩하는 제 2 DNA 서열을 포함하는, 알에 재조합 단백질을 전달하기 위한 발현 시스템에 관한 것이다.
"알에 결합하는데 충분한 임뮤노글로불린 단백질의 일부" (이하 "일부"라 약칭함)라는 용어에는 알 상의 수용체에 결합하여 알에 실질적으로 전달될 수 있는 임뮤노글로불린으로부터 유래된 아미노산 서열이 모두 포함된다. "일부"는 알 상의 Fc 수용체에 결합하는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 조류의 FcRn에 결합하는 것이 좋다.
특정 구체예에서, 제 2 DNA 서열은 임뮤노글로불린 항상부로부터 유도된다. 바람직하게는 제 2 DNA 서열은 임뮤노글로불린의 항상부 대역의 CH2-CH3 대역의 일부를 코딩하는 것이 좋다.
재조합 단백질은 임뮤노글로불린 단백질과의 융합 단백질로서 제조될 것이다. 재조합 단백질은 공지기술을 이용하여 융합 단백질로부터 방출된 형태일 수 있다.
발현 시스템은 프로모터, 인핸서 및 종결 서열과 같이 재조합 단백질을 발현시키는데 필요한 조절 서열을 부가적으로 포함할 것이다. 발현 시스템은 바이러스 벡터 또는 비바이러스 벡터일 수 있고 공지기술에 따라 구축할 수 있다. 파지미드 (pahagemids)는 플라스미드 또는 박테리오파지 벡터로서 이용될 수 있기 때문에 유용한 벡터의 예가 된다. 기타 벡터의 예로는 박테리오파지, 배큘로바이러스 및 레트로바이러스와 같은 바이러스, DNA 바이러스, 리포좀 및 기타 재조합 벡터를 들 수 있다. 벡터는 또한 진핵세포 숙주계, 바람직하게는 조류 숙주계에서 사용할 수 있는 요소들을 함유할 수 있다.
본 발명이 속한 분야의 당업자라면 본 발명이 비텔로제닌(vitellogenin) 및 아폴리포단백질 B (apolipoprotein B)와 같이 알-특이적인 수용체에 결합할 수 있는 기타의 단백질 또는 펩티드를 이용함으로써 재조합 단백질을 제조하는 방법도 포함함을 이해할 수 있을 것이다.
2. 알에의 전달 및 표적화
상술한 본 발명의 발현 시스템은 공지기술을 이용하여 알을 낳는 동물 내로 도입될 수 있다.
한가지 구체예에서, 발현 벡터는 알을 낳는 동물 내로 직접 도입된다.
따라서, 본 발명은
a) (i) 재조합 단백질을 코딩하는 제 1 DNA 서열과 (ii) 상기 제 1 DNA 서열에 작동적으로 링크되고 동물의 알에 단백질을 전달하기 쉽게 만들어주는 제 2 DNA 서열을 포함하는 발현 시스템을 알 낳는 동물에 도입하고;
b) 상기 동물로 하여금 알을 낳게 하여;
c) 재조합 단백질을 함유하는 알을 얻은 다음; 임의로
d) 알로부터 재조합 단백질을 분리하는 단계를 포함함을 특징으로 하는, 알에서 재조합 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
바람직하게는, 제 2 DNA 서열은 알에 결합하기에 충분한 임뮤노글로불린 단백질의 일부를 코딩하고 재조합 단백질을 알 내부로 업테이크시킬 수 있는 것이 좋다. 더욱 바람직하게는, 제 2 DNA 서열이 임뮤노글로불린의 항상부 대역의 CH2-CH3 영역의 일부를 코딩하는 것이 좋다.
한가지 구체예에서, 본 발명은:
a) (i) 임뮤노글로불린 항상부를 코딩하는 제 1 DNA 서열 (ii) 임뮤노글로불린 가변부를 코딩하는 제 2 DNA 서열 및 (iii) 항체를 충분히 발현시키도록 하는 조절 대역을 포함하는 발현 벡터를 알 낳는 동물에 도입하고;
b) 상기 동물로 하여금 알을 낳게 하여;
c) 재조합 단백질을 함유하는 알을 얻은 다음; 임의로
d) 알로부터 재조합 단백질을 분리하는 단계를 포함함을 특징으로 하는, 알에서 재조합 항체를 생산하는 방법을 제공한다.
발현 시스템은 다양한 공지방법에 의해 알 낳는 동물의 세포나 조직 내로 도입될 수 있다. 이러한 방법은 일반적으로 Sambrook 외, molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989, 1992), Ausubel 외, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989), Chang 외, Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, MI (1995): A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston MA (1988) 및 Gilboa 외 (1986)에 설명되어 있으며, 예컨대, 안정하거나 일시적인 형질도입, 리포펙션, 일렉트로포레이션 및 재조합 바이러스 벡터에 의한 감염이 이에 포함된다.
벡터와 같은 발현 시스템의 감염에 의한 도입은 몇가지 장점을 갖는다. 즉, 감염 특성으로 인해 고효율을 달성할 수 있다. 뿐만 아니라, 바이러스는 특수한 세포 유형에서 매우 특이적이고 일반적으로 감염 및 전파된다. 따라서, 이들의 자연적인 특이성은 생체내에서 벡터를 특정 세포 유형에 표적화시키거나 세포의 조직 또는 혼합 배양체 중에서 표적화시키는데 이용될 수 있다. 바이러스 벡터 역시 수용체 매개 이벤트를 통해 표적 특이성을 변경시키도록 특정 수용체나 리간드에 의해 변형될 수 있다.
벡터는 그의 안전성을 공고히 하고/또는 그의 효능을 증대시키기 위해 몇몇 부가적인 특성이 더해질 수 있다. 이러한 특성에는 예컨대, 재조합 바이러스에 감염된 세포에 대한 네가티브 선별에 이용가능한 마커가 포함된다. 이러한 네그티브 선별 마커는 항-바이러스 간시클로버 (gancyclovir)에 대해 민감성을 부여한다. 네가티브 선별은 따라서 항생제 첨가를 통해 유도가능한 자살을 제공하기 때문에 감염을 통제할 수 있는 수단이 된다. 이러한 보호는 예컨대, 바이러스 벡터 또는 서열의 변형 형태를 생산하는 돌연변이가 일어날 경우, 세포수준의 형질전환이 일어나지 않도록 해준다. 특정 세포 유형에 발현을 한정시키는 특성 역시 포함될 수 있다. 이러한 특성에는 예컨대, 소망되는 세포 유형에 특이적인 포르모터와 조절 요소가 포함된다.
재조합 바이러스 벡터는 방계 감염 (lateral infection) 및 표적화 특이성과 같은 장점을 제공하기 때문에 소망되는 핵산의 생체내 도입에 유용하다. 방계 감염은 예컨대 레트로바이러스의 라이프 사이클에 고유한 것으로서 이러한 감염 과정에서는 단일의 감염된 세포가, 많은 자손 비리온을 낳고 이들은 출아되어 이웃하는 세포들을 감염시키게 된다. 그 결과 커다란 면적이 급속히 감염되고 그 대부분은 본래의 바이러스 입자에 의해 감염된 것이 아니다. 이것은 감염원이 딸 자손을 통해서만 확산되는 수직형 감염과 대조되는 것이다. 방게적으로 퍼질 수 없는 바이러스 벡터도 제조될 수 있다. 이러한 특성은 소망되는 목적이 특정 유전자를 오직 국소화된 몇몇 표적화 세포에만 절단하는 것일 경우 유용할 수 있다.
레트로바이러스 벡터는 감염 입자로서 기능하도록 또는 단일의 초기 감염 라운드만을 수행하도록 제조될 수 있다. 전자의 경우, 바이러스의 게놈은 필요한 모든 유전자, 조절 서열 및 패키징 시그날을 유지함으로써 새로운 바이러스 단백질과 RNA를 합성하도록 변형된다. 일단 이러한 분자가 합성되면, 숙주 세포는 추가의 감염 라운드를 수행할 수 있는 새로운 바이러스 입자들로 RNA를 패키지시킨다. 벡터의 게놈 역시 소망되는 재조합 유전자를 코딩 및 발현하도록 조작된다. 비감염성 바이러스 벡터의 경우, 벡터 게놈은 대개 RNA를 바이러스 입자내로 캡슐화시키는데 요구되는 바이러스 패키지 시그날을 파괴하도록 돌연변이된다. 이러한 시그날 없이는, 형성된 어떠한 입자도 게놈을 함유하지 못하게 되고 그로 인해 후속적인 감염 라운드가 진행될 수 없다. 특정 유형의 벡터는 목적하는 응용 분야에 의존할 것이다. 실제 벡터들이 알려져 있고 기술분야에서 쉽게 입수할 수 있거나 또는 공지의 방법을 이용하여 당업자가 구축할 수 있다.
접종된 영역 내에서 수혜자 세포 내로 상술한 비바이러스성 벡터를 도입하기 위해 리포좀과 같은 형질도입 비히클 역시 이용될 수 있다.이러한 형질도입 비히클은 당업자에게 잘 알려져 있다.
두번째 구체예에서, 본 발명의 발현 시스템에 의해 형질전환된 숙주세포를 알을 낳는 동물에 도입함으로써 재조합 단백질을 알에 전달할 수 있다. 형질전환된 세포주는 알에 전달될 재조합 단백질을 분비할 것이다. 바람직하게는 숙주 세포가 조류의 세포주인 것이 좋고, 특히 다능형 (pluripotent) 또는 다분화성 (multipotent) 배 세포주, 생식세포주 또는 기타 체세포 조직과 생식세포주에 기여할 수 있는 여하한 세포주인 것이 좋다.
따라서, 본 발명은
a) (i) 재조합 단백질을 코딩하는 제 1 DNA 서열 및 (ii) 동물의 알에 단백질을 전달하기 쉽게 해주는 제 2 DNA 서열을 포함하는 발현 시스템으로 형질전환되어 재조합 단백질을 분비하는 형질전환된 조류의 세포주를 알을 낳는 동물에 도입하고;
b) 재조합 단백질을 함유하는 알을 얻은 다음; 임의로
c) 재조합 단백질을 알로부터 분리하는 단계를 포함하는, 재조합 단백질을 알에서 생산하는 방법을 제공한다.
특정 구체예에서, 조류의 세포주는 재조합 항체, 바람직하게는 인간화 항체를 분비한다. 조류의 세포주는 알을 낳는 암탉에 주입될 수 있다. 항체는 암탉에서 생체내 생산되어 알의 난황에 전달된 다음 그로부터 얻어질 수 있다.
따라서, 본 발명은
a) (i) 임뮤노글로불린 항상부를 코딩하는 제 1 DNA 서열 및 (ii) 임뮤노글로불린 가변부를 코딩하는 제 2 DNA 서열 및 (iii) 항체를 발현시키는데 충분한 조절 대역을 포함하는 발현 시스템에 의해 형질전환되어 재조합 항체를 분비하는 형질전환된 조류의 세포주를 알을 낳는 동물에 도입하고;
b) 재조합 항체를 함유하는 알을 얻은 다음; 임의로
c) 재조합 항체를 알로부터 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 가금류의 알에서 재조합 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
세번째 및 바람직한 구체예에서, 본 발명의 재조합 단백질은 알에 전달된 재조합 단백질을 분비하는 트랜스제닉 동물을 제조함으로써 알을 낳는 동물에서 제조될 수 있다. 따라서, 본 발명은:
a) 그의 체세포와 생식세포가 (i) 재조합 단백질을 코딩하는 제 1 DNA 서열 및 (ii) 상기 제 1 DNA 서열에 작동적으로 링크되고 동물의 알에 단백질을 전달하기 쉽게 해주는 제 2 DNA 서열을 포함하는 발현 시스템을 함유하는 것인 트랜스제닉 알 낳는 동물을 제조하고;
b) 상기 동물로부터 알을 얻은 다음;
c) 임의로, 재조합 단백질을 알로부터 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 알 낳는 동물의 알에서 재조합 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.
바람직하게는, 제 2 DNA 서열이 재조합 단백질을 알에 표적화시켜 알 내부로 재조합 단백질이 흡수되도록 하는데 충분한 임뮤노글로불린 단백질 부분을 코딩하는 것이 좋다. 더욱 바람직하게는, 제 2 DNA 서열이 임뮤노글로불린의 항상부 대역의 CH2-CH3 대역의 일부를 코딩하는 것이 좋다.
바람직한 구체예에서, 항체, 바람직하게는 인간화 항체를 분비하는 트랜스제닉 가금류를 제조함으로써 재조합 항체를 가금류에서 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명은:
(a) 그의 체세포와 생식세포주가 (i) 임뮤노글로불린 항상부를 코딩하는 제 1 DNA 서열 및 (ii) 임뮤노글로불린 가변부를 코딩하는 제 2 DNA 서열 및 (iii) 항체를 발현시키는데 충분한 조절 대역을 포함하는 발현 시스템을 것인 트랜스제닉 알 낳는 동물을 제조하고;
(b) 상기 동물로부터 알을 얻는 것을 특징으로 하는, 알 낳는 동물의 알에서 재조합 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
트랜스제닉 동물을 제조하기 위해서, 마이크로인젝션, 일렉트로포레이션, 정자 형질도입, 리포좀 융합 및 마이크로탄환 충격 (microprojectile bombardment)를 비롯한 공지기술을 이용하여 본 발명의 발현 시스템을 배(胚) (예컨대, 조류의 배) 내부로 삽입시킬 수 있다. 이어서 발현 시스템을 함유하는 배를 대리 쉘 (surrogate shell)에 전달한다. 트랜스진(transgene)은 성적으로 성숙할 때까지 배양될 수 있으며 재조합 단백질의 존재 여부는 성숙한 동물의 알에서 분석가능하다.
본 발명은 또한 이상 설명된 바와 같은 트랜스제닉 알 낳는 동물도 포함한다.
3. 알 제조
본 발명은 재조합 단밸질을 함유하는 알 뿐만 아니라 알의 여러가지 용도도 포함한다. 알은 먹을 수 있는 식품이므로, 재조합 단백질을 알로부터 분리 또는 정제할 필요는 없다. 재조합 단백질을 함유하는 알은 직접 섭취되어도 좋고 또는 섭취전에 조리하거나 또는 다른 요리 (예컨대 오믈렛, 쉐이크, 구운 식품)의 재료로 사용될 수 있다.
소망되는 경우, 재조합 단백질을 알로부터 분리하여 투여전 약학적 제제에 통합시킬 수 있다. 예컨대, 인간화 항체를 공지 기술 (예컨대 미국특허 5,420,253호)에 따라 계란으로부터 제거할 수 있다. 항체는 일반적으로 알의 난황에 함유되어 있으며, 항체를 얻기 위해 알의 나머지 부분으로부터 난황을 분리한다. 항체 또는 기타의 재조합 단백질을 함유하는 난황 제제는 보관을 위해 동결건조시킬 수 있다. 동결건조된 제제는 사용시 재조성시킬 수 있다.
가변부의 특이성에 따라 여러가지 질병이나 병원체를 치료 또는 검색하는데 항체를 이용할 수 있다. 질병 치료를 위해서, 항체를 단독으로 투여할 수 있고, 또는 다른 화합물과 함께 컨쥬게이션시킬 수도 있다. 일단 항체가 질병 또는 감염 세포에 결합되면 항체는 질병 또는 감염 세포의 파괴를 촉진시키기 위해 독소와 먼쥬게이트될 수 있다. 이러한 컨쥬게이트된 항체들은 면역독소로 알려져 있으며 공지기술을 이용하여 제조될 수 있다 (Thorpe 외, Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine, Academic Press, p. 168-190, 1982).
재조합 단백질 또는 항체는 생체내 투여에 적합한 약학적 조성물로서 제조될 수 있다. 약학적 조성물은 리포좀과 같은 캐리어 시스템이나 생물학적으로 혼용가능한 캐리어 또는 희석제 중에 단백질이나 항체를 함유할 수 있다. 단백질 또는 항체 조성물은 주사, 경구 투여, 흡입, 경피 적용 또는 직장 투여와 같이 적절한 수단으로 투여될 수 있다. 투여 경로에 따라, 효소, 산의 작용 또는 항체를 불활성화시킬 수 있는 기타의 자연적인 조건으로부터 활성 화합물을 보호하기 위한 물질로 활성 화합물을 코팅시킬 수 있다. 이러한 조성물은 치료적으로 유효한 양의 단백질이나 항체를 함유할 것이며 소망되는 결과를 얻는데 필요한 기간과 투여량으로 제공될 것이다.
항체는 질병의 생체내 또는 생체외 진단 또는 검색에 이용될 수 있다. 생체내 진단의 경우, 항체를 상술한 바와 같이 적절한 약학적 제제 형태로 제조한다. 항체는 또한 일반적으로 그들의 검색을 가능하게 하기 위해 검색가능한 마터로 표지시킨다. 사용될 수 있는 검색가능한 마커에는 여러가지 효소, 형광물질, 발광물질 및 방사선 물질이 포함된다. 적절한 효소의 예로는 호스래디쉬 퍼옥시다제, 바이오틴, 알칼라인 포스파타제, β-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스터라제가 포함되며; 적절한 형광물질의 예로는 움벨리페론, 플루오레신, 플루오레신 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레신, 단실 클로라이드 또는 피코에리드린을 들 수 있고; 적절한 방사성 물질의 예로는 S-35, Cu-64, Ga-67, Zr-89, Ru-97, Tc-99m, Rh-105, Pd-109, In-111, I-123, I-125, I131, Re-186, Au-198, Au-199, Pb-203, At-211, Pb-212 및 Bi-212를 들 수 있다. 항체는 리간드 결합 쌍의 한 파트너에 컨쥬게이트되거나 표지될 수 있다. 대표적인 예로는 아비딘-바이오틴 및 리보플라빈-리보플라빈 결합 단백질이 포함된다. 대표적인 표지로 항체를 컨쥬게이트 또는 표지시키는 상기 방법은 당업자에게 쉽게 이해될 것이다.
항체는 기술분야에 잘 알려진 질환 또는 병원체를 생체외에서 검색하는데도 이용가능하다. 그 방법은 병원체 또는 질병에 특이적인 단백질의 항원 결정인자와 항체 사이의 결합 상호작용에 의존한다. 이러한 방법의 예로는 방사선 면역분석법, 효소 면역분석법 (예컨대, ELISA), 면역형광, 면역침전, 라텍스 응집, 혈구응집, 및 효소-링크된 면역흡수분석 (ELISA)와 같은 조직화학적 테스트와 웨스턴 블로팅을 들 수 있다.
본 발명의 항체는 신생아와 아동의 주요한 사망원인인 레트로바이러스 감염 및 장내독소성 Escherichia coli (ETEC)와 같은 장내 감염을 치료하는데 이용될 수 있다. 이들 병원체나 병원체의 일부에 특이적인 가변부를 함유하는 항체들을 제조할 수 있다.
본 발명은 또한 병원균이 없는 알을 제조하는데 이용될 수도 있다. 예컨대, 특정 병원균에 특이적인 항체를 알 낳는 동물에서 생산하고 특정 병원균을 부력화시키게 될 알에 이를 전달할 수 있다. 한가지 구체예에서, 항체는 항-살모넬라 항체일 수 있고 살모넬라가 없는 알을 제조하는데 이용될 수 있다.
결국, 또 다른 측면에서, 본 발명은:
(a) 병원체에 특이적인 항체를 알 낳는 동물에 도입하고;
(b) 상기 동물로 하여금 병원체가 실제로 없는 알을 낳게 하는 단계로 됨을 특징으로 하는, 특정 병원균이 없는 알을 제조하는 방법에 관한 것이다.
다음에 비제한적인 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명한다:
실시예 1
계란에 인간 항체의 업테이크
인간의 IgG (hIgG)가 닭의 발육 난포내로 전달될 수 있는지를 측정하기 위해, 3마리의 Hylline SCTM암탉 각각에게 정제된 10μg의 hIgG를 주입하고 난황 및 난백에서의 그의 존재 여부를 ELISA에 의해 평가하였다. 인간의 IgG는 제 2일에 난황에서 먼저 검출되었고 제 5일에는 89ng/ml의 피크 레벨로 검출되었다 (도 1). 얇은 알부민 추출물에서는 hIgG가 검색되지 않았는데 이는 그 농도가 3.12ng/ml 미만이었음을 가리킨다 (ELISA 분석의 검색 한계).
인간 IgA (hIgA) 10μg을 3마리의 Hyline SCTM암탉에 정맥주사하고 hIgA 역시 알 내부로 축적(deposit) 될 수 있는지를 검색하였다. 인간의 IgA는 제 2일에 난황에서 최초로 검출되었고 제 5일에 피크 레벨이 33 ng/ml로 검출되었는데 (도 2A) 이는 hIgG의 경우 기록된 피크 축적보다 훨씬 낮은 값이었다 (반복 측정 분석, P〈0.01). hIgG는 난백 추출물에서는 검색되지 않았지만 hIgA는 검색되었다. 인간의 IgA는 제 1일에 난백 추출물로부터 최초로 검출되었고 제 2일~8일동안 약 8ng/rnl 알부민의 농도로 일정하게 유지되었다 (도 2B).
실시예 2
계란에서 재조합 IgG의 업테이크
재료 및 방법
세포주의 배양 및 형질도입
Hyline SCTM(Hyline International, Dallas Center, Iowa)로부터 유도된 DT40, 닭의 B 임파아구양 (lymphoblastoid) 세포주를 Dr. Craig Thompson으로부터 입수하여 인간/마우스 키메릭 항체를 생산하는 형질도입된 세포주를 수립하는데 이용하였다. 8% (v/v) 송아지 혈청 (BCS: bovine calf serum) 및 2% (v/v) 닭 혈청 (CS: chicken serum)을 함유하는 IMDMTM(Gibco BRL)에서 1~10 x 106세포/ml로 유지하면서 세포를 배양하였다. 최적화된 일렉트로포레이션 조건 (200V, 960uF 및 1000msec 펄스) 하에서 Bio-Rad 일렉트로포레이터를 이용하여 일렉트로포레이션에 의해 세포 (1 x 107)를 각각 20μg씩의 선형화 헤비 체인 (키메릭 항-단실 감마 1) 및 라이트 체인 (키메릭 항-단실 라이트 체인과 인간의 카파)으로 형질도입시켰다. 세포를 상기 배양체에서 2일간 96-웰 마이크로-타이터 디쉬 (2.5x104세포/웰) 중에 유지시킨 다음 3μg/ml의 미코페놀산, 7.5μg/ml의 하이포잔틴 및 125μg/ml의 잔틴을 함유하는 선별 배지를 첨가하였다. 검색 시약으로서 알칼라인 포스파타제 링크된 항-인간 카파 및 단실-BSA 코팅된 마이크로타이트 플레이트를 이용하여 효소-링크된 면역흡수분석 (ELISA)에 의해 와 생존 콜로니를 스크리닝하였다. 이어서 강한 양성 콜로니들을 추가의 특징화를 위해 보다 큰 디쉬로 옮겼다. 이들 확장된 콜로니로부터의 세포들을35S-메티오닌 존재하에 밤새 배양시킴으로써 표지시켰다. 하룻밤 생장시킨 후, 배양체 상등액과 세포질 용해물을 준비하고 내용물을 토끼의 항-인간 Ig와 Staph A (IgSorb)를 이용하여 면역침전시켰다. 샘플을 5% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 환원없이 분석하고 이어서 12% 겔 상에서 환원시켰다. 밴드의 위치를 오토라디오그래피에 의해 측정하였다. 소망되는 키메릭 항체를 생산한 콜로니로부터의 세포들을 1~10 x 106세포/ml로 배지 중에서 유지시켰다.
Hyline SC 암탉에서의 종양 생성
형질도입된 DT40 세포주, 키메릭 인간 항-단실 감마3을 생산하는 TAOD 7.4를 10% 소의 태아 혈청 (FBS: fetal bovine serum)을 함유하는 Opti-MEM ITM(Gibco BRL, Burlington) 중에서 1 x 106세포/ml 의 농도로 배양시켰다. 세포들을 300 x g에서 5분간 원심분리시켜 수집하고 배지를 제거하였다. 세포들을 5 x 107세포/ml의 농도로 Dulbecco's 인산염 완충염수 (PBS, Gibco BRL, Burlington, Ontario) 중에 재현탁시켰다. 100μㅣ의 PBS 중 총 5 x 106세포를 Hyline SCTM암탉의 허벅지와 체벽사이의 부위에 피하주사하고 매일매일 기준으로 종양 발달상황을 모니터링하였다. 주사에 앞서 암탉의 체중을 재고 체중에 어떤 변동이 있는지를 1주일에 2회씩 측정하였다.
난황 항체의 정제 및 분석
주사된 암탉으로부터 알을 매일 모았다. 알부민으로부터 난황을 분리하고 항체를 감마 YolkTM제조 키트 (Pharmacia Biotech, Morgan Blvd., Quebec)을 이용하여 난황으로부터 항체를 정제하였다. 정제된 난황 항체를 pH 9.6의 탄산염 완충액에 재현탁시키고 샌드위치 항체 ELISA 수단에 의해 키메릭 인간 항-단실 감마3의 존재여부에 대해 분석하였다. ImmulonTM96-웰 마이크로타이터 플레이트를 4℃에서 pH 9.6의 탄산염 완충액 중에서 염소 항-인간 IgG (H+L)(Jackson Immunoresearch, West Grove, PA, USA)의 5μg/ml 용액 50μl로 밤새 코팅시켰다. 하룻밤 인큐베이션시킨 후 코팅 혼합물을 폐기시키고 플레이트를 PBS로 3회 세척하였다. 이어서 블로킹 완충액 (3% (w/v) 소의 형청 알부민을 함유하는 PBS) 100μl를 첨가함으로써 플레이트를 실온에서 1시간 블로킹시켰다. 이어서 블로킹 완충액을 폐기하고 플레이트를 PBS로 3회 세척하였다. 각각의 난황 단백질 제제 또는 단계적으로 희석된 스탠다드들 9Cromopure Human IgG, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA, USA) (50μㅣ)을 각각의 웰에 분배하고 플레이트를 4℃에서 하룻밤 인큐베이션시켰다. 하룻밤 인큐베이션시킨 다음, 테스트 용액을 폐기하고 플레이트를 PBS로 3회 세척하였다. 블로킹 완충액 중 125ng/ml 농도의 호스래디쉬 퍼옥시다제-컨쥬게이트된 염소의 항-인간 IbG(H+L) (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA, USA) (50UL)를 플레이트의 웰에 첨가하고 실온에서 2시간 인큐베이션시켰다. 이어서 퍼옥시다제-컨쥬게이트를 폐기하고 플레이트를 PBS로 3회 세정하였다. 다음, 호스래디쉬-퍼옥시다제 기질 (0.05% (w/v) o-페닐렌디아민 디히드로클로라이드 및 0.05% (v/v) 30% 과산화수소를 함유하는 암모늄 아세테이트-시트르산 완충액 (pH 5.0))을 각각의 웰에 첨가하고 플레이트를 실온의 암실에서 30분간 인큐베이션시켰다. 황산 (5M 용액 50μl)을 각 웰에 첨가하고 플레이트를 테이블 톱 진탕기상에서 10분간 살짝 진탕시켰다. 발색 상황을 Titertek MultiskanTMPLUS ELISA 플레이트 판독기를 이용하여 492nm 필터를 이용하여 평가하였다.
결과
난황에서의 인간 임뮤노글로불린 분석결과에 대한 전형적인 표준 곡선을 표 1에 나타내었다. 난황 존재하에서의 흡수도는 완충액만을 함유하는 음성 대조군으로부터의 흡수도와 다르지 않았으며 이는, 난황이 분석을 간섭하지 않음을 가리키는 것이다. 492nm에서의 흡수도와 인간의 임뮤노글로불린 (hIg)의 로그10 농도 사이의 퇴행 계수 (regression coefficient)는 0.99였는데, 이는 방정식 y=1.1583x-0.0185가 흡수도와 hIg 농도사이의 관계를 정확히 설명함을 가리키는 것이다.
난황 추출물 존재하에 표준 곡선을 구축함으로써 분석에서의 난황의 효과를 더욱 시험하였다. 후술되는 그래프에 나타난 바와 같이, 분석시 모든 표준물 농도에서 난황의 존재에 의해 흡수도가 변경되지는 않았다. 주사되지 않은 암탉으로부터의 난황 추출물의 흡수도는 1.56ng/ml 미만의 모든 스탠다드에서의 흡수도와 동일하였는데, 이는 인간 Ig의 농도가 1.56ng/ml 미만이면 검출이 불가능함을 가리키는 것이다.
암탉 #9185 (케이지 #2)이 낳은 알 중의 인간 임뮤노글로불린의 농도를 표 2에 나타내었다. 이 암탉은 제 1일에 인간 IgG3 (TAOD7.4)로 형질도입된 5백만개의 세포가 주입된 것이다. 종양은 제 11일까지는 작은 노듈(nodule)로서 잔재하였으며, 제 11일에는 종양 주변의 영역에서 출혈이 발생하였다. 난황에의 축적은 제 13일과 제 15일에 낳은 알에서 명확하였으며 그 후의 알들은 hIg를 검출불가능한 양으로 함유하였다.
토론
난황 중 인간의 임뮤노글로불린의 검출을 위한 ELISA는 1.56 ng/ml까지 민감하였고, 인간의 임뮤노글로불린에 특이적이었으며 재생가능하였다. 난황으로부터 인간 임뮤노글로불린의 회수율은 대략 15% (데이타 제시되지 않음)였다.
암탉 #9185에 종양이 존재한다는 것은 DT40 세포가 숙주 닭을 콜로니화하여 체세포 키메라를 형성함을 가리키는 것이다. 이 암탉으로부터의 난황 중의 hIg의 농도를 시험한 결과 인간 임뮤노글로불린이 유전공학적으로 조작된 DT40 세포에 의해 생체내 생산되어 난황 내부로 모였음이 입증되었다. 난황 당 약 10 ~ 15ml가 있으므로, 이 분석에서 hIg의 회수는 대략 15%였으며, 암탉 #9185가 제 13일에 낳은 알에는 hIg가 약 625ng 축적되어 있을 것으로 예상된다.
이러한 데이타는 계란에서 인간 임뮤노글로불린를 대규모 생산할 수 있는 기술을 개발시키기 위한 이론적 근거를 제시해준다.
8 마리의 Hyline SCTM암탉에게 107개의 DT40-hIgG3 세포를 정맥주사하였다. DT40-IgG3 세포가 정맥 주사된 8마리의 암탉 중 3마리는 주사 부위에 종양이 생겼는데, 이는 세포의 일부 또는 모든 세포가 정맥내로 전달되었다기 보다 피하 주입되었음을 가리키는 것이다. 주사부위에서 종양이 발생된 암탉들의 알은 난황에 rhIgG3를 거의 갖지 않았고 얇은 알부민 중에서는 전혀 갖지 않았다 (데이타 미제시). rhIgG3는 나머지 5마리의 암탉의 난황 중에서 제 7일에 최초로 검출되었다 (도 3A 및 3B). 이들 암탉 4마리의 rhIgG3의 최대 축적은 난황 1 ml 당 33 ng이었으며 제 10일에 낳은 알에서 일어났다. 닭들 중 한마리 (새 6, 도 3B)는 제 10일과 제 11일에 알을 낳지 않았으며 제 12일에 생산된 알은 rhIgG3 0.3μg/1ml 난황을 함유하였다. 이 암탉은 제 13일과 제 14일에 알을 낳지 않았고 제 15일과 제 16일에 생산된 알에서는 rhIgG3이 검출되지 않았다.
주사부위에서의 종양의 존재 또는 부재에 관계없이 DT40-IgG3 세포가 주사된 모든 암탉에서 제 6일까지 난황에서 닭의 항-rhIgG3을 검색하고 난황 중의 닭의 항-rhIgG3의 최대 레벨을 제 9일까지 관찰하였다 (데이타 미제시). DT40-IgG3 세포가 정맥주사된 모든 암탉들을 제 17일에 안락사시켰다. 이들을 해부하자, 주사된 새들 중 어느 것에서도 내부 종양이 관찰되지 않았다. DT40-IgG3 세포가 백혈병으로서 유지되었는지를 측정하기 위해, 혈액 샘플을 새들로부터 채혈하고 DT40-IgG3 세포의 지속적인 존재여부에 대해 광현미경과 면역형광 염색의 두가지 모두를 이용하여 평가하였다. 비록 이들 종양으로부터 유도된 세포들이 배지에서 성공적으로 재수립되고 rhIgG3을 지속적으로 생산한 것으로 나타나긴 하였으나 주사 부위에 종양이 발생된 암탉으로부터 채혈된 혈액에서는 DT40-IgG3 세포가 관찰되지 않았다 (데이타 미제시). 주사 부위에서 종양이 발생되지 않은 암탉들에서는, DT40-IgG3 세포와 형태학적으로 유사하게 나타난 세포들의 응집체가 묽은 혈액 샘플에서 관찰되었다 (도 4A). 이들dms 세포내 hIgG에 대한 면역조직화학적 염색에 의한 DT40-IgG3 세포인 것으로 확인되었다.
실시예 3
계란에서 재조합 IgA의 업테이크
DT4-IgG3 세포와 마찬가지로, 마우스/인간 키메릭 항-단실 α 항체 (rhIgA)를 분비하는 형질도입된 DT40 세포주, DT40-hIgA이 생산되었다. rhIgA를 생산하는 형질도입된 B 세포 집단을 갖는 암탉들이 rhIgA를 알에 전달한다는 것을 입증하기 위해, 107DT40-hIgA 세포들을 8마리의 Hyline SCTM암탉들에게 정맥 주사하였다. DT4-hIgA 세포가 주입된 닭들 중 5마리에서 주사 부위에 종양이 발생하였다. 주사된 모든 암탉에서 알부멘 내로rhIgA가 저농도로 축적된 것이 검출되었으나, 종양이 발생된 암탉의 난황 내에서는 rhIgA가 거의 축적되지 않은 것으로 검색되었다 (데이타 미제시). 주사부위에서 종양 형성 징후가 전혀 나타나지 않은 3마리의 암탉은 제 9일까지 1ml의 난황 당 2ng의 rhIgA를 축적하였다 (도 5).
실시예 4
조류의 알상의 Fc 수용체의 특징화
이 연구에서는 발생기 조류의 난모세포 낭포 내로 Ig의 업테이크와 관련된 Fc 서열을 밝히고자 하는 시도의 일환으로 변형된 rhIgGs 패널을 제조하였다. 난황내로 IgG를 전달하는데 책임이 있는 발생기 조류 난모세포 막 상의 Fc 수용체가 포유류의 FcRn의 동족체인 것으로 보인다는 것은 본 발명자들이 최초로 보고한 것이다. FcRn은 마우스에 있어서 혈청 IgG 수준의 조절, 모계 IgG의 트랜스시토시스, 및 모계 장벽을 넘어 IgGs를 전달하는 역할을 하는 주요 조직적합 복합체 (MHC) 클래스 I-관련 수용체이다. 동일한 역할을 수행하는 것으로 보이는 동족체가 인간에서도 발견된 바 있다.
방법 및 재료
rhIgG에 대해 가해진 변형을 알기쉽게 설명하기 위해, 야생형 IgG 헤비체인을 V-CH1-H-CH2-CH3으로 표시할 수 있다. 여기서 V는 가변부, CH-는 각각의 헤비 체인 대역이고, H는 힌지(hinge) 대역이다.
6 rhIgG 패널 (하기한 바와 같음)을 실시예 1에서 전술한 바와 같은 암탉에게 주사하였다.
1. 야생형 IgG를 양성 대조근으로 이용하였다.
2. V-CH3 (즉, CH1부터 CH2까지 소실)
3. V-CH1-H-CH3 (즉, CH2 대역 소실)
4. V-CH1-H-CHJ2-*CH3 (즉, CH2-CH3 경계에서 부위-특이적인 돌연변이. 이로 인해 rhIgG가 FcRn에 결합하지 못하게 됨). NB. 결실 없음.
5.**V-CH1-H-CH2-CH3**(즉, 상보체를 활성화시킬수도 없고 대부분의 공지 Fc 수용체를 결합시킬 수도 없으나, FcRn에 결합할 수 있는 능력만이 유지되어 있는 아글리코실화된 rhIgG).
6. V-αCH1-H-CH2-CH3 (즉, CH2-CH3 경계 외부로부터의 대역들이 수용체에 대한 결합력에 영향을 미침이 없음을 입증하기 위해, CH1 항상부 대역 IgA CH1 대역과 맞바꿔 놓은 것).
결과
결과를 표 3에 나타내었다. V-CH3, V-CH1-H-CH3 및 V-CH1-H-CH2*-CH3은 난황 샘플에서 검출되지 않았다.**V-CH1-H-CH2-CH3**및 V-αCH1-H-CH2-CH3은 대조군 야생형 hIgG로서 효과적으로 축적되었다.
이 실시예는 CH2-CH3 경계가 결실에 의해 파괴되는 경우, rhIgG가 조류의 난모세포막을 통과할수 없음을 입증해준다. 뿐만 아니라, FcRn과 상호작용하는 것으로 알려진 CH2-CH3 경계의 아미노산 잔기에서 부위-특이적인 돌연변이가 발생할 경우, rhIgG 역시 조류 난모세포막을 통과할 수 없다. 그러나, CH2-CH3 사이의 경계는 Fcγ I-III을 비롯한 기타의 Fc 수용체와 결합한 것으로 나타났다. IgG의 아글리코실화는 컴플리먼트 활성화 및 대부분의 Fc 수용체에 대한 결합을 간섭하나 FcRn에 대한 결합은 간섭하지 않기 때문에, 난모세포 수용체의 특성을 확인하기 위해 아글리코실화된 rhIgG,**V-CH1-H-CH2-CH3**을 선택하였다. 아글리코실화된 rhIgG는 야생형 hIgG만큼 효율적으로 난황내부로 축적되기 때문에, 이들 실험결과와 다른 발견들을 종합해볼 때, FcRn의 조류의 동족체가 조류의 난모세포 막을 통과하여 IgG를 전달하는데 책임이 있는 것으로 보인다. 이러한 발견은 트랜스제닉 암탉 모델에서의 생산을 위한 치료 항생제의 엔지니어링을 최적화시켜줄 뿐만 아니라 FcRn에 대한 결합에 필요한 서열을 포함함으로써 난황 내부로 소망되는 모든 단백질을 축적하는 것을 가능케 해주는 것이다.
실시예 5
트랜스제닉 닭의 제조
인간화 항체와 같은 재조합 단백질을 생산하는 트랜스제닉 닭을 제조할 수 있다. 트랜스제닉 닭을 제조하기 위해, Stage X (40b)의 배를 Barred Plymouth Rock종 암탉이 낳은 인큐베이션시키지 않은 알로부터 얻을 수 있다. 세포내 매트릭스를 효소절단시켜 블라스토더말 세포를 수확하고 Brazolot 등과 Fraser 등이 설명한 방법대로 리포펙션 시약을 이용하여 분산된 세포 내로 DNA를 도입시킨다. Carscience 등이 설명한 바와 같이 White Leghorn종 암탉이 낳은 알에서 조사된 스테이지 X 수혜자 배에 분산된 세포들을 주입한다. 주입 후 4일째, 주입된 배들을 대리 쉘 (109, 109b)로 옮기면 주입된 배의 부화율이 약 10%에서 약 40%로 증가한다 (Cochran 및 Etches, 미공개). 부화시, 키메라들은 공여체 (Barred Plymourh Rock종) 기원의 검은색 깃털과 수혜자 기원의 황색 깃털 (White Leghorn종)이 존재하는 것으로 구별할 수 있다. 공여 세포의 인코포레이션이 일어났다는 증거를 보이지 않는 부화물들은 폐기한다. 빗살 조직 (comb tissue)와 혈액을 각각 부화일과 제 4주령에 채취하고, 재조합 단백질 (예컨대 키메릭 항체)를 생산에 대한 유전자를 코딩하는 DNA 서열의 존재 여부를 PCR로 측정한다. 재조합 단백질의 존재 여부를 제 4주령에서 채혈한 혈액 샘플에 대해 ELISA를 수행함으로써 평가한다. 트랜스진을 지니는 병아리들을 성적으로 성숙할 때까지 키운다. 암컷 키메라가 낳은 알의 난황으로부터의 추출물에 대해 행한 ELISA에 의해 발육중의 알 중에 재조합 단백질이 축적되었는지를 평가한다. 수컷과 암컷 키메라를 교배시켜 얻어진 자손을 PCR로 스크리닝함으로써 발현 구조물이 함유되었는지를 동정한다.
형질도입된 세포가 임파계를 콜로니화시키면 알에서 키메릭 항체를 생산하기 위한 목적이 달성될 것이다. 발현 구조물이 생식세포내로 인코포게이션되면, 키메릭 항체 생산을 코딩하는 DNA 서열이 멘델유전성 흔적으로서 인코포레이션된 닭들의 계보가 유도될 것이다. 그러나, 생식세포 전달이 부재하는 경우에조차, 본 발명자들은 닭에서의 항체 생산에 관한 중요하고도 새로운 정보를 얻을 수 있을 것이다.
이제까지 특정의 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 설명하였지만, 본 발명이 상기 개시된 실시예들로 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 이와 반대로, 본 발명은 첨부된 청구범위의 정신과 범위내에서 여러가지 가능한 변형과 동등한 재구성까지 포괄하는 것이다.
모든 공개문헌, 특허 및 특허출원은 각각의 공개문헌, 특허 또는 특허출원이 특정적으로, 그리고 개별적으로 그 전체로서 참조된 것과 동일한 정도로 본 발명에 참조되었다.
| 표준 농도ng/ml | 표준 농도의Log 10 | 표준농도의 492nm에서 흡수도 | (-)대조군의 평균 corr. | (-) 대조군의492nm에서의흡수도 | (-) 대조군 평균 |
| 0.098 | -1.00877 | 0.079 | 0.095 -0.008 | 0.1 | 0.08 0.09 |
| 0.195 | -0.70997 | 0.101 | 0.109 0.015 | 0.09 | |
| 0.39 | -0.40894 | 0.137 | 0.167 0.062 | 0.09 | |
| 0.78 | -0.10791 | 0.207 | 0.198 0.1125 | 0.09 | |
| 1.56 | 0.193125 | 0.334 | 0.324 0.239 | 0.09 | |
| 3.12 | 0.494155 | 0.637 | 0.578 0.5175 | 0.09 | |
| 6.25 | 0.79588 | 0.959 | 1.017 0.898 | 0.09 | |
| 12.5 | 1.09691 | 1.329 | 1.422 1.2855 | 0.09 | |
| 25 | 1.39794 | 1.499 | 1.393 1.356 | 0.09 |
| 암탉 #9185 (케이지 #2)로부터 유래된 난황에서의 인간 임뮤노글로불린의 농도 | |
| 일수 | hIg의 농도 (mg/ml 난황) |
| 123456789101112131415161718192021222324252627 | 검출불가검출불가검출불가검출불가검출불가검출불가검출불가검출불가검출불가검출불가검출불가알 없음6.27알 없음3.46알 없음검출불가검출불가검출불가검출불가검출불가검출불가검출불가검출불가검출불가검출불가검출불가 |
Claims (28)
- (i) 재조합 단백질을 코딩하는 제 1 DNA 서열 및 (ii) 동물의 알에 단백질을 용이하게 전달할 수 있게 해주는 제 2 DNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질을 알에 전달하기 위한 발현 시스템
- 제 1항에 있어서, 제 2 DNA 서열이 알에 결합할 수 있는 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 것이 특징인 발현 시스템.
- 제 2항에 있어서, 제 2 DNA 서열이 알에 결합할 수 있는 임뮤노글로불린 단백질의 일부를 코딩하는 것이 특징인 발현 시스템.
- 제 3항에 있어서, 임뮤노글로불린의 단백질이 임뮤노글로불린의 Fc 대역의 CH2-CH3 영역으로부터 유래한 것이 특징인 발현 시스템.
- 제 3항에 있어서, 임뮤노글로불린의 일부가 알 상의 Fc 수용체에 결합하는 것이 특징인 발현 시스템.
- 제 5항에 있어서, Fc 수용체가 조류의 Fc 수용체 신생물인 것이 특징인 발현 시스템.
- (i) 임뮤노글로불린 항상부를 코딩하는 제 1 DNA 서열 (ii) 임뮤노글로불린 가변부를 코딩하는 제 2 DNA 서열 및 (iii) 항체를 발현시키는데 충분한 조절 대역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 항체를 알에 전달하기 위한 발현 시스템.
- 제 7항에 있어서, 항상부가 인간 임뮤노글로불린 유전자로부터 유래된 것이 특징인 발현 시스템.
- a) 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 발현 시스템을 알 낳는 동물에 도입하고;b) 재조합 단백질을 함유하는 알을 얻고; 임의로c) 알로부터 재조합 단백질을 분리하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 알에서 재조합 단백질을 생산하는 방법.
- a) 제 7항 또는 제 8항에 따른 발현 시스템을 알 낳는 동물에 도입하고;b) 재조합 항체를 함유하는 알을 얻고; 임의로c) 알로부터 재조합 항체를 분리하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 알에서 재조합 항체를 생산하는 방법.
- a) 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 발현 시스템으로 형질전환되어 재조합 단백질을 분비하는, 형질전환된 조류 세포주를 알 낳는 동물에 도입하고;b) 재조합 단백질을 함유하는 알을 얻고; 임의로c) 알로부터 재조합 단백질을 분리하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 알에서 재조합 단백질을 생산하는 방법.
- a) 제 7항 또는 제 8항에 따른 발현 시스템으로 형질전환되어 재조합 항체를 분비하는, 형질전환된 조류 세포주를 알 낳는 가금류에 도입하고;b) 재조합 항체를 함유하는 알을 얻고; 임의로c) 알로부터 재조합 항체를 분리하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 가금류의 알에서 재조합 단백질을 생산하는 방법.
- (a) 병원체에 특이적인 항체를 알 낳는 동물에 도입하고;(b) 상기 동물로 하여금 병원체가 실제로 없는 알을 낳게 하는 것을 특징으로 하는 병원체가 없는 알을 생산하는 방법.
- 재조합 단백질을 함유하는 알.
- 제 9항의 방법에 따라 생산된 재조합 단백질을 함유하는 알.
- 재조합 항체를 함유하는 알.
- 제 10항의 방법에 따라 생산된 재조합 항체를 생산하는 알.
- 제 16항 또는 제 17항에 따른 알의 치료적 유효량을 투여함을 특징으로 하는 동물의 면역화 방법.
- 재조합 항체를 분비하는 형질전환된 조류 세포주.
- 그의 생식세포와 체세포가 (i) 재조합 단백질을 코딩하는 제 1 DNA 서열과 (ii) 상기 제 1 DNA 서열에 작동적으로 링크되고 알에 재조합 단백질을 전달하는 것을 용이하게 해 주는 제 2 DNA 서열을 포함하는 발현 시스템을 함유하는 것이 특징인 트랜스제닉 알 낳는 동물.
- 그의 생식세포와 체세포가 (i) 임뮤노글로불린 항상부를 코딩하는 제 1 DNA 서열과 (ii) 임뮤노글로불린 가변부를 코딩하는 제 2 DNA 서열을 포함하는 발현 시스템을 함유하는 것이 특징인 트랜스제닉 알 낳는 동물.
- (a) 그의 생식세포와 체세포가 (i) 재조합 단백질을 코딩하는 제 1 DNA 서열과 (ii) 상기 제 1 DNA 서열에 작동적으로 링크되고 알에 재조합 단백질을 전달하는 것을 용이하게 해 주는 제 2 DNA 서열을 포함하는 발현 시스템을 함유하는 것이 특징인 트랜스제닉 알 낳는 동물을 제조하고;(b) 상기 동물로부터 알을 얻은 다음;(c) 임의로 알로부터 재조합 단백질을 분리하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 알 낳는 동물의 알에서 재조합 단백질을 생산하는 방법.
- 제 22항에 있어서, 제 2 DNA 서열이 알에 결합할 수 있는 임뮤노글로불린의 일부를 코딩하는 것이 특징인 방법.
- 제 23항에 있어서, 임뮤노글로불린의 일부가 임뮤노글로불린의 항상부 대역의 CH2-CH3 영역으로부터 유래된 것이 특징인 방법.
- 제 23항에 있어서, 임뮤노글로불린의 일부가 알 상에서 Fc 수용체와 결합하는 것이 특징인 방법.
- 제 23항에 있어서, Fc 수용체가 조류의 Fc 수용체 신생물인 것이 특징인 방법.
- (a) 그의 생식세포와 체세포가 (i) 임뮤노글로불린 항상부를 코딩하는 제 1 DNA 서열과 (ii) 임뮤노글로불린 가변부를 코딩하는 제 2 DNA 서열을 포함하는 발현 시스템을 함유하는 것인 트랜스제닉 알 낳는 동물을 제조하고;(b) 상기 동물로부터 알을 얻는 것을 특징으로 하는 알 낳는 동물의 알에서 재조합 항체를 생산하는 방법.
- 제 27항에 있어서, 항상부가 인간 유전자로부터 유래된 것이 특징인 방법.
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