DE69837337T2

DE69837337T2 - Herstellung von proteinen in eiern

Info

Publication number: DE69837337T2
Application number: DE69837337T
Authority: DE
Inventors: Robert J. University o Guelph ETCHES; Mansoor Ajax Ontario MOHAMMED; Sherie Los Angeles MORRISON; Letitia Alice Culver City WIMS; Kham M. Monterey Park TRINH; Alan G. Guelph WILDEMAN
Original assignee: University of Guelph
Current assignee: University of Guelph
Priority date: 1997-08-22
Filing date: 1998-08-21
Publication date: 2008-02-21
Anticipated expiration: 2018-08-22
Also published as: ATE356878T1; IL134618A0; HK1028623A1; KR20010023179A; JP2011050393A; BR9811981A; DE69837337D1; IL134618A; JP4731683B2; WO1999010505A2; EP1007697B1; WO1999010505A3; EP1007697A2; JP2001514005A; AU8848598A; AU750028B2; NZ503098A; CA2311116A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Produktion rekombinanter Proteine in Eiern, ein Expressionssystem für die Zufuhr der rekombinanten Proteine zu Eiern, Eier, die das rekombinante Protein enthalten, und transgene, nicht-menschliche eierlegende Tiere, die die rekombinanten Proteine produzieren.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Biotechnologie ermöglicht eine bessere Produktion von Proteinen mit vielen wichtigen medizinischen Anwendungen, wie Diagnose und Therapie von Erkrankungen. Unglücklicherweise verbieten sich viele bestehende Verfahren zur Erzeugung rekombinanter Proteine aufgrund der hohen Kosten für eine Produktion im industriellen Maßstab und die Reinigung der Proteine.
Antikörpermoleküle sind ein Proteintyp, den man unter Verwendung von Biotechnologie herstellt. Antikörper (oder Immunglobuline) sind sehr spezifische Werkzeuge, die zur Therapie und Diagnose verschiedener Krankheiten und Pathogene geeignet sind. Kurz gesagt, besteht ein intakter Antikörper oder ein Immunglobulinmolekül aus 2 schweren (H) und 2 leichten (L) Ketten, die jeweils eine konstante Region am Carboxylterminus und eine variable Region am Aminoterminus aufweisen. Man hat mehrere Isotypen für die konstante Region bei menschlichen Immunglobulinen identifiziert: zwei für die leichte Kette (kappa und lambda) und fünf für die schwere Kette (alpha, gamma, delta, epsilon und my). Wie der Name sagt, variiert die Sequenz der variablen Regionen in jedem Immunglobulinmolekül. Die variable Region enthält die Antigenbindungsstelle und bestimmt somit die Antigenspezifität des Immunglobulinmoleküls.
Zur Immunisierung von Menschen möchte man menschlichen Antikörper verwenden, damit eine Immunreaktion gegen die immunisierenden Antikörper verhindert wird. Aufgrund praktischer und ethischer Überlegungen ist es jedoch nicht möglich, große Mengen an menschlichen Antikörpern aus einer menschlichen Quelle herzustellen. Aus Serum oder Brustmilch stammende menschliche Antikörper haben zwar Wirksamkeit gezeigt, aber die hohen Kosten und der beschränkte Vorrat an menschlichen Produkten schließen ihre breit gestreute Anwendung aus. Damit die Immunantwort gegen nicht-menschliche Antikörperpräparationen gesenkt wird, hat man chimäre oder humanisierte Antikörper hergestellt. Chimäre Antikörper sind gentechnologisch derart verändert, dass die konstante Region des Antikörpers von einem menschlichen Antikörper und die variable Region von dem immunisierten, in der Regel nicht menschlichen Wirt stammt. Die vari able Region stammt gewöhnlich von einem Antikörper, der aus einem Nager isoliert wurde, der mit dem gewünschten Antigen immunisiert wurde.
Ein Gebiet, auf dem Antikörper nützlich sind, ist zur Behandlung enterischer Erkrankungen. Enterische Infektionen, die zu Diarrhö, Dysenterie oder Typhus führen, stellen ein riesiges öffentliches Gesundheitsproblem mit mehr als einer Milliarde Erkrankungsepisoden und mehreren Millionen Toden pro Jahr in den Entwicklungsländern dar. Rotaviren sind eine Hauptursache für infektiöse Gastroenteritis bei Kleinkindern und jungen Kindern in industrialisierten und in Entwicklungsländern. Enterotoxigene Escherichia coli (ETEC) sind ein weitere hauptsächlicher Erreger und führen weltweit zu mehr als 600 Millionen Fällen von Diarrhö pro Jahr. Eine ETEC-Erkrankung beginnt mit der Aufnahme von verunreinigter Nahrung oder verunreinigtem Wasser. Die Bakterien gelangen in den oberen Dünndarm, den sie besiedeln und in dem sie hitzebeständige und/oder hitzeunbeständige Enterotoxine produzieren. Beide Pathogentypen sollten für eine Behandlung mit Antikörpern empfänglich sein, die gegen die Schleimhautoberfläche gerichtet sind.
WO-A-94 20608 offenbart Vektoren für die Gentherapie, die gewebespezifische Expression von Genen, und WO-A-97 47739 Vektoren und Verfahren zur Synthese von Proteinen in Eiern transgener Hennen. Parren PW beschreibt in Hum. Antibodies Hybridomas, 1992, Bd. 3(3), 137-145, Expressionsvektoren, die Sequenzen umfassen, die humanisierte Antikörper kodieren. Die Vektoren umfassen variable Nager-Ig- und menschliche konstante Sequenzen sowie regulatorische Sequenzen für die Expression des Antikörpers und eignen sich für die Zufuhr eines rekombinanten Antikörpers an ein Ei. EP-A-0 394 827 , das nur Stand der Technik gemäß Artikel 54(3) EPÜ ist, betrifft chimäre CD4-Immunoglobulinpolypeptid und Expressionssysteme. Hassan JO und Curtis R lehren in Infection and Immunity, 1996, Bd. 64(3) 938-944, ein Impfverfahren zur Herstellung eines Eis, das pathogenfrei ist. US-A-5 080 895 lehrt ein Immunisierungsverfahren und die Präparation einer antikörperhaltigen Substanz aus Eiern.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Immunglobulinproteins in einem Ei eines eierlegenden Tiers nach Anspruch 1. Grob gesagt, stellt die Erfindung ein Verfahren bereit zur Herstellung eines rekombinanten Immunglobulinproteins in einem Ei, umfassend das Exprimieren des Proteins in einem eierlegenden Säuger unter Bedingungen, die sich zur Expression des Proteins und zur Zufuhr des Proteins in das Ei eignen.
Das rekombinante Protein kann in dem Tier exprimiert und dem Ei zugeführt werden unter Verwendung eines Expressionssystems, das eine DNA-Sequenz enthält, die das rekombinante Immunglobulinprotein und benötigte regulatorische Regionen kodiert, so dass eine Expression des rekombinanten Proteins bereitgestellt wird. Wenn sich das rekombinante Immunglobulinprotein normalerweise nicht in dem Ei anhäuft, enthält das Expressionssystem zudem eine zweite DNA-Sequenz, die das Protein zu dem Ei eines eierlegenden Tiers steuern oder diesem zuführen kann.
Die zweite DNA kann eine regulatorische Region kodieren, die von einem eispezifischen Gen stammt und die Expression des rekombinanten Proteins zu dem Ei steuern kann. Ersatzweise kann die zweite DNA-Sequenz ein Protein oder Peptid kodieren, das an einen Rezeptor auf dem Ei binden kann, wodurch das rekombinante Protein in das Ei aufgenommen wird.
Die Erfinder haben gezeigt, dass Immunglobulinproteine in einem eierlegenden Säuger exprimiert und in das Ei transportiert werden können. Die Erfinder haben insbesondere gefunden, dass die konstante Region eines menschlichen Immunglobulinproteins an eine Vogeloozyte binden und in den Dotter aufgenommen werden kann.
Bei einer Ausführungsform betrifft die Erfindung die Herstellung eines rekombinanten Antikörpermoleküls in einem Geflügelei. Bei einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung die Herstellung humanisierter Antikörper in Hühnereiern.
Der Begriff "humanisierter Antikörper", wie hier verwendet, bedeutet ein Immunglobulin oder ein Antikörpermolekül, das eine menschliche konstante Region enthält. Der humanisierte Antikörper kann chimär sein und die variable Region eines Nicht-Menschen enthalten, wie eines Huhns, einer Maus usw. Der Antikörper kann auch nichtchimär sein und menschliche variable Regionen enthalten. Die Begriffe "Antikörper" und "Immunglobulin" können in der gesamten Anmeldung austauschbar verwendet werden.
Die Anmeldung liefert somit ein Expressionssystem zum Zuführen eines rekombinanten Antikörpers an ein Ei, umfassend (i) eine erste DNA-Sequenz, die eine konstante Immunglobulinregion kodiert, (ii) eine zweite DNA-Sequenz, die eine variable Immunglobulinregion kodiert, und (iii) eine regulatorische Region, die für die Expression des Antikörpers ausreicht. Vorzugsweise stammt die konstante Region von einem menschlichen Immunglobulin.
Weil die Erfinder gefunden haben, dass ein Immunglobulinprotein an ein Ei binden und von diesem aufgenommen werden kann, kann jedes beliebige rekombinante Protein einem Ei zugeführt werden, indem man ein Fusionsprotein herstellt, das (a) einen ausreichenden Teil von einem Immunglobulinprotein enthält, dass es an ein Ei binden und von diesem aufgenommen werden kann, gekoppelt an (b) das rekombinante Protein von Interesse. Die Erfindung stellt also ein Expressionssystem bereit zum Zuführen eines rekombinanten Proteins an ein Ei, umfassend (a) eine erste DNA-Sequenz, die das rekombinante Protein kodiert, die operativ an (b) eine zweite DNA-Sequenz gebunden ist, die einen Teil von einem Immunglobulinmolekül kodiert, der genügt, dass das rekombinante Protein an das Ei gebunden und davon aufgenommen wird. Bei einer spezifischen Ausführungsform stammt die zweite DNA-Sequenz von einem Gen, das eine konstante Immunglobulinregion kodiert.
Die oben beschriebenen Expressionssysteme können in ein eierlegendes Tier mithilfe einer Reihe an Techniken eingebracht werden. Bei einer Ausführungsform kann das Expressionssystem direkt in das eierlegende Tier eingebracht werden, in dem das rekombinante Protein exprimiert und dem Ei zugeführt wird.
Bei einer anderen Ausführungsform kann das Expressionssystem in Kultur in eine Wirtszelle transfiziert werden. Die Wirtszelle kann in das eierlegende Tier injiziert werden, in dem das rekombinante Protein sezerniert wird. Die Wirtszelle ist bevorzugt von der gleichen Spezies wie das eierlegende Tier. Bei einer spezifischen Ausführungsform ist die Wirtszelle eine Vogelzelllinie. Ist das rekombinante Protein ein Antikörper, ist die Vogelzelllinie vorzugsweise eine Lymphzelllinie, stärker bevorzugt eine immortalisierte B-Zelllinie, wie DT40 oder eine mit v-rel transformierte B-Zelllinie.
Bei einer anderen Ausführungsform kann der Expressionsvektor dem ei zugeführt werden, indem man ein transgenes eierlegendes Tier herstellt, welches das rekombinante Protein, wenn nötig, als Fusionsprotein mit einem Protein oder Peptid exprimiert, welches das Protein dem Ei zuführt. Vorzugsweise ist das Tier ein Geflügel, das rekombinante Protein ist ein Antikörper, wie ein humanisierter Antikörper.
Die Anmeldung lehrt eine Eipräparation, die ein rekombinante Protein enthält, sowie Verwendungen der Eipräparation, beispielsweise zur Diagnose, Prävention und zur Behandlung verschiedener Krankheiten. Die Eipräparation kann direkt verwendet werden, oder das rekombinante Protein kann weiter aus dem Ei isoliert und gereinigt werden.
Bei einer Ausführungsform eignen sich die Antikörper zur Prävention und Behandlung enterischer Infektionen.
Die Erfindung kann auch zur Herstellung pathogenfreier Eier verwendet werden, indem man einen für das Pathogen in den Eiern des Tiers spezifischen rekombinanten Antikörper herstellt. Die Anmeldung (ehrt deshalb ein Verfahren zur Herstellung eines Eis, das frei von einem bestimmten Pathogen ist, wobei man:

(a) einen für das Pathogen spezifischen Antikörper in ein eierlegendes Tier einbringt und
(b) das Tier ein Ei legen lässt, wobei das Ei im Wesentlichen frei von Pathogen ist.

Weitere Merkmale und Vorteil der Erfindung sind aus der folgenden eingehenden Beschreibung ersichtlich.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die Erfindung wird im Folgenden anhand der Zeichnungen beschrieben. Es zeigt:
1 ein Diagramm der Konzentration an hIgG pro ml Dotter in Eiern gegen die Zeit;
2A ein Diagramm der Konzentration an hIgA pro ml Dotter gegen die Zeit;
2B ein Diagramm der Konzentration an hIgA pro ml Albumen gegen die Zeit;
3A ein Diagramm der mittleren Ablagerung von rhIgG pro ml Dotter gegen die Zeit;
3B die beste Ablagerung von rhIgG pro ml Dotter gegen die Zeit;
4A eine Lichtmikroskopie von hIgG-Zellen in Blutproben, die Hennen entnommen wurden;
4B die immunhistochemische Färbung von hIgG in Blutproben, die Hennen entnommen wurden;
5 ein Diagramm der Konzentration an rhIgA pro ml Dotter gegen die Zeit.
EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Grob gesagt, stellt die Erfindung ein Verfahren bereit zur Herstellung eines rekombinanten Immunglobulinproteins in einem Ei, umfassend das Exprimieren des Proteins in einem eierlegenden Säuger unter Bedingungen, die sich für die Expression des Proteins und die Zufuhr des Proteins in das Ei eignen.
Die Eier können von jedem eierlegenden Tier sein, einschließlich Vögeln, Amphibien, Reptilien und Fischen. Vorzugsweise stammen die Eier von Geflügel, wie Huhn, Truthahn oder Ente. Die Verwendung von Eiern als Quelle rekombinanter Proteine bietet erhebliche Vorteile, einschließlich Kompatibilität mit moderner Tierschutzgesetzgebung, Kostengünstigkeit, Bequemlichkeit, Sterilität und Verfügbarkeit einer Technologie zur Fraktionierung von Eidotter und Isolation von Proteinen, wie Antikörpern. Weil ein einzelnes Ei etwa 100 mg Antikörper ergeben kann, kann ein einziges Huhn, das 250 Eier pro Jahr legt, 25 g Ig produzieren, und eine kleine Schar von 10000 Hennen kann pro Jahr 25 kg Immunglobulin erzeugen. Eier können mehrere Wochen bei Raumtemperatur gelagert werden.
1. EXPRESSIONSSYSTEME
(a) Immunglobuline
Wie oben erwähnt, haben die Erfinder gezeigt, dass Immunglobuline in eierlegenden Tieren exprimiert und in das Ei transportiert werden können.
Die Erfinder haben insbesondere gezeigt, dass Human-Immunglobulin (Ig) G und IgA in ein Hühnerei transportiert werden kann, wenn es direkt in das Huhn injiziert wird (Beispiel 1) oder wenn in das Huhn eine Zelllinie injiziert wird, die ein rekombinantes IgG oder IgA exprimiert (Beispiele 2 und 3). Zudem haben die Erfinder festgestellt, dass der Anteil an Immunglobulin, der für die Bindung und Aufnahme der Ig in das Vogelei verantwortlich ist, die CH2-CH3-Region in der Fc-Domäne des Immunglobulinproteins ist. Die Erfinder haben zudem festgestellt, dass der Fc-Rezeptor auf dem Hühnerei wahrscheinlich ein Homolog des Säuger-Neugeborenen-Fc-Rezeptors (Fc-Rn) ist, der eine Rolle bei der Überführung von IgG über die Mutter-Kind-Barriere, die Transzytose mütterlicher IgG und die Regulation der Serum-IgG-Spiegel bei Mäusen ist) Beispiel 4).
Somit lehrt die Anmeldung ein Expressionssystem zum Zuführen eines rekombinanten Antikörpers an ein Ei, umfassend (i) eine erste DNA-Sequenz, welche die variable Region eines Immunglobulins kodiert, (ii) eine zweite DNA-Sequenz, welche die konstante Region eines Immunglobulins kodiert, und (iii) eine regulatorische Region, die ausreicht, dass der Antikörper exprimiert wird.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung die Herstellung humanisierter Antikörper in Hühnereiern. Wie hier definiert, enthalten die humanisierten Antikörper mindestens eine menschliche konstante Region. Die konstante Region kann aus einer der bekannten konstanten Regionen ausgewählt werden, einschließlich der leichten kappa- und lambda-Ketten und der Gene für die schwere alpha-, gamma-, delta-, epsilon-und my-Kette. Die variable Region kann menschlich oder nicht-menschlich sein, wie aus Vogel, Schaf, Maus oder Rind. Stammen die variable und die konstante Region aus verschiedenen Spezies, dann wird der Antikörper als "chimärer Antikörper" bezeichnet. Chimäre Antikörper können unter Verwendung von Techniken hergestellt werden, die im Stand der Technik bekannt sind, wie in Morrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6859, 1984, beschrieben, das hier durch Bezugnahme aufgenommen ist.
Die variable Region kann eine Spezifität für ein gewünschtes Antigen besitzen. Das gewünschte Antigen kann aus Bakterien, Viren, Toxinen, Allergenen sowie krank heitsspezifischen Antigenen, wie tumorassoziierten Antigenen, ausgewählt werden. Ein Gen für eine variable Region, das eine variable Region mit einer gewünschten Antigenspezifität kodiert, kann aus einem Hybridom erhalten werden, das einen monoklonalen Antikörper mit der gewünschten Antigenspezifität produziert. Ein Hybridom, das einen Antikörper mit der gewünschten Spezifität produziert kann auch unter Verwendung von Techniken hergestellt werden, die im Stand der Technik bekannt sind. Kurz gesagt, kann ein Tier (wie ein Huhn, eine Maus oder ein Kaninchen) mit dem gewünschten Antigen immunisiert werden, und Lymphozyten, welche die Antikörper produzieren, können erhalten werden. Die Lymphozyten können durch Fusion mit unsterblichen Zellen, wie Myelomzellen, immortalisiert werden, wodurch ein Hybridom hergestellt wird. Ein Hybridom, das den gewünschten Antikörper produziert, kann unter Verwendung von Techniken selektiert werden, die im Stand der Technik bekannt sind (siehe zum Beispiel Köhler und Milstein, Nature 256:495-497, 1975). Das gewünschte Gen für die variable Region kann dann aus den Hybridomen unter Verwendung bekannter Techniken , wie Polymerasekettenreaktion (PCR), isoliert werden.
Eifunktionelle Antikörper können ebenfalls hergestellt werden, die zwei verschiedene variable Regionen mit zwei verschiedenen Antigenspezifitäten enthalten.
Die DNA-Sequenzen, welche die menschliche konstante Region codieren, können aus verfügbaren Quellen erhalten oder aus einer Hybridomzelllinie, die einen Antikörper mit einer menschlichen konstanten Region produziert, unter Verwendung der oben beschriebenen Techniken isoliert werden.
Rekombinante Expressionsvektoren mit der DNA-Sequenz, die eine menschliche konstante Region kodiert, und der DNA-Sequenz, die die gewünschte variable Region kodiert, können hergestellt werden. Die Vektoren enthalten zusätzlich Expressionskontroll- oder regulatorische Sequenzen, wie einen Promotor, einen Enhancer und Terminationssequenzen. Bevorzugte regulatorische Sequenzen stammen von Immunglobulingenen, aber zusätzliche regulatorische Regionen, wie die von Viren stammenden, können nützlich sein. Der Vektor kann aus einer Reihe von Vektoren ausgewählt werden, einschließlich Plasmiden, Viren, Retroviren und Adenoviren.
Vorgeformte Expressionsvektoren können ebenfalls hergestellt werden mit der DNA-Sequenz, welche die konstante Region kodiert, und die benötigten regulatorischen Sequenzen enthalten. Eine DNA-Sequenz für eine gewünschte variable Region kann in den vorgeformten Vektor zur Herstellung eines Antikörpers mit einer gewünschten Antigenspezifität eingesetzt werden. Der vorgeformte Vektor erleichtert so die Herstellung des gewünschten humanisierten Antikörpers.
(b) Rekombinante Fusionsproteine
Wie oben erwähnt, haben die Erfinder gezeigt, dass Immunglobuline an Vogeleier binden und dort hinein transportiert werden. Zudem haben die Erfinder festgestellt, dass der Anteil des Immunglobulins, der für die Bindung des Ig an und seine Aufnahme in einer Hühnerei verantwortlich ist, in der CH2-CH3-Region der Fc-Domäne enthalten ist. Dieser Befund der Erfinder ermöglicht die Herstellung jedes beliebigen rekombinanten Proteins in einem Ei durch Koppeln des gewünschten Protein mit der Sequenz des Immunglobulins, die für die Bindung an das Ei genügt.
Unter einem Aspekt lehrt die Anmeldung also ein Expressionssystem zum Zuführen eines rekombinanten Proteins an ein Ei, umfassend (i) eine erste DNA-Sequenz, welche das rekombinant Protein kodiert, operativ verknüpft mit (ii) einer zweiten DNA-Sequenz, die einen Teil eines Immunglobulinproteins kodiert, der genügt, damit Bindung an das Ei erfolgt und zur Aufnahme des rekombinanten Proteins führt.
Der Begriff "Teil eines Immunglobulinprotein, der für die Bindung an das Ei genügt" (als "Teil" abgekürzt) beinhaltet jede Aminosäuresequenz, die von einem Immunglobulin stammt und an einen Rezeptor auf einem Ei binden und anschließend in das Ei transportiert werden kann. Der "Teil" bindet vorzugsweise an den Fc-Rezeptor auf dem Ei, stärker bevorzugt an Hühner-FcRn.
Bei einer spezifischen Ausführungsform stammt die zweite DNA von einer konstanten Immunglobulinregion. Vorzugsweise kodiert die zweite DNA-Sequenz einen Teil der CH2-CH3-Region der Domäne mit der konstanten Region des Immunglobulins.
Das rekombinante Protein wird als Fusionsprotein mit dem Immunglobulinprotein hergestellt. Das rekombinante Protein kann aus dem Fusionsprotein unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Techniken freigesetzt werden.
Das Expressionssystem enthält zudem die benötigten regulatorischen Sequenzen, damit eine Expression des rekombinanten Proteins möglich ist, wie einen Promotor, einen Enhancer und Terminationssequenzen. Das Expressionssystem kann ein viraler oder nicht-viraler Vektor sein und unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren konstruiert werden. Phagemide sind ein Beispiel für geeignete Vektoren, well sie als Plasmide oder Bakteriophagenvektoren verwendet werden können. Beispiele für andere Vektoren sind u.a. Viren, wie Bakteriophagen, Baculoviren und Retroviren, DNA-Viren, Liposomen und andere Rekombinationsvektoren. Die Vektoren können auch Elemente enthalten, damit sie in eukaryotischen Wirtssystemen, vorzugsweise in einem Vogel-Wirtsystem verwendbar sind.
2. ZUFUHR UND STEUERUNG ZUM EI
Die oben beschriebenen Expressionssysteme können in ein eierlegendes Tier unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Techniken eingebracht werden.
Bei einer Ausführungsform wird der Expressionsvektor direkt in das eierlegende Tier eingebracht.
Die Erfindung stellt somit ein Verfahren bereit zur Herstellung eines rekombinanten Immunglobulinproteins in einem Ei, bei dem man:

a) in ein eierlegendes Tier ein Expressionssystem einbringt, das Folgendes umfasst: (i) eine erste DNA-Sequenz, welche das rekombinante Protein kodiert, operativ verknüpft mit (ii) einer zweiten DNA-Sequenz, welche die Zufuhr des Proteins zu einem Ei eines Tiers erleichtern kann;
b) man das Tier ein Ei legen lässt;
c) man das Ei gewinnt, das das rekombinante Protein enthält, und gegebenenfalls
d) das rekombinante Protein aus dem Ei isoliert.

Vorzugsweise kodiert die zweite DNA-Sequenz einen Teil eines Immunglobulinproteins, der genügt, dass ein Ei gebunden wird und zur Aufnahme des rekombinanten Protein in das Ei führt. Genauer gesagt, kodiert die zweite DNA-Sequenz einen Teil der CH2-CH3-Region der Domäne mit der konstanten Region des Immunglobulins.
Bei einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Antikörpers in einem Ei bereit, bei dem man:

a) in ein eierlegendes Tier einen Expressionsvektor einbringt, der Folgendes umfasst: (i) eine erste DNA-Sequenz, welche eine konstante Immunglobulinregion kodiert, (ii) eine zweite DNA-Sequenz, welche eine variable Immunglobulinregion kodiert, und (iii) eine regulatorische Region, die ausreicht, dass der Antikörper exprimiert wird;
b) man das Tier ein Ei legen lässt;
c) man das Ei gewinnt, das den rekombinanten Antikörper enthält, und gegebenenfalls
d) das rekombinante Protein aus dem Ei isoliert.

Die Expressionssysteme können in die Zellen oder Gewebe des eierlegenden Tiers durch eines von einer Reihe im Stand der Technik bekannter Verfahren eingebracht werden. Man findet diese Verfahren allgemein beschrieben in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual, Cold Springs Harbor Laborstory, New York (1989, 1992), in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989), Chang et al., Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, MI (1995), Vega et al., Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor, MI (1995), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston MA (1988) und Gilboa et al. (1986) und beinhalten zum Beispiel stabile oder transiente Infektion, Lipofektion, Elektroporation und Infektion mit rekombinanten viralen Vektoren.
Das Einbringen eines Expressionssystem, wie eines Vektors, mittels Infektion bietet mehrere Vorteile. Aufgrund ihrer infektiösen Natur kann eine höhere Wirksamkeit erzielt werden. Zudem sind Viren sehr stark spezialisiert und infizieren in der Regel nur spezielle Zelltypen, in denen sie sich vermehren. So kann ihre natürliche Spezifität dazu verwendet werden, die Vektoren in vivo oder in einem Gewebe oder einer gemischten Kultur von Zellen zu speziellen Zelltypen zu steuern. Virale Vektoren können zudem mit speziellen Vektoren oder Liganden modifiziert werden, so dass ihre Zielspezifität über rezeptorvermittelte Ereignisse verändert wird.
Weitere Merkmale können zu dem Vektor hinzugefügt werden, damit dieser sicher und/oder wirksamer wird. Zu solchen Merkmalen gehören zum Beispiel Marker, die für eine negative Selektion gegen Zellen verwendet werden, die mit dem rekombinanten Virus infiziert sind. Ein Beispiel für einen solchen negativen Selektionsmarker ist das oben beschriebene TK-Gen, welches eine Empfindlichkeit für das antivirale Gancyclovir verleiht. Negative Selektion ist daher ein Mittel, mit dem eine Infektion kontrolliert werden kann, weil sie einen induzierbaren Selbstmord durch Zugabe eines Antibiotikums bereitstellt. Ein solcher Schutz gewährleistet, dass keine Zelttransformation auftritt, wenn es beispielsweise zu Mutationen kommt, die veränderte Formen des viralen Vektors oder der viralen Sequenz produzieren. Merkmale, die die Expression auf bestimmte Zelltypen beschränken, können ebenfalls eingeschlossen werden. Zu solchen Merkmalen gehören zum Beispiel Promotor- und regulatorische Elemente, die für den gewünschten Zelltyp spezifisch sind.
Rekombinante virale Vektoren sind ein weiteres Beispiel für Vektoren, die sich zum Einbringen einer gewünschten Nukleinsäure in vivo eignen, weil sie Vorteile bieten, wie laterale Infektion und Steuerungsspezifität. Eine laterale Infektion liegt zum Beispiel im Lebenszyklus eines Retrovirus und ist der Vorgang, durch den eine einzige infizierte Zelle viele Virionnachkommen erzeugt, die ausknospen und Nachbarzellen infizieren. Das Ergebnis ist, dass ein großer Bereich schnell infiziert wird, der größtenteils nicht mit dem ursprünglichen Viruspartikeln infiziert wurde. Dies steht im Gegensatz zu vertikalen Infektion, bei der sich der Erreger nur über die Tochternachkommen ausbreitet. Es können auch virale Vektoren erzeugt werden, die zur lateralen Ausbreitung nicht in der Lage sind.
Dieses Merkmal kann nützlich sein, wenn der gewünschte Zweck in dem Einbringen eines speziellen Gens nur in eine örtlich begrenzte Zahl von angesteuerten Zellen besteht.
Es können retrovirale Vektoren hergestellt werden, die als infektiöse Partikel wirken oder nur einen einzigen anfänglichen Infektionsdurchgang durchmachen. Im ersteren Fall wird das Genom des Virus derart modifiziert, dass es die gesamten notwendigen Gene, regulatorischen Sequenzen und Verpackungssignale für die Synthese neuer viraler Proteine und viraler RNA beibehält. Sind diese Moleküle synthetisiert, verpackt die Wirtszelle die RNA in neue Viruspatrtikel, die weitere Infektionsdurchgänge durchmachen können. Auch das Genom des Vektors ist gentechnisch derart verändert, dass es das gewünschte rekombinante Gen kodiert und exprimiert. Im Falle nicht-infektiöser viraler Vektoren ist das Vektorgenom in der Regel mutiert, so dass das virale Verpackungssignal zerstört ist, das zum Einkapseln der RNA in Viruspartikel benötigt wird. Ohne ein solches Signal, enthalten alle gebildeten Partikel kein Genom und können daher keine weiteren Infektionszyklen durchlaufen Der spezielle Vektortyp hängt von der beabsichtigten Anwendung ab. Die tatsächlichen Vektoren sind zudem im Stand der Technik bekannt und leicht erhältlich oder können durch den Fachmann auf diesem Gebiet unter Verwendung von bekannter Methodik konstruiert werden.
Transfektionsvehikel, wie Liposomen, können ebenfalls zum Einbringen der oben beschriebenen nicht-viralen Vektoren in Empfängerzellen in dem beimpften Bereich verwendet werden. Diese Trans ektionsvehikel sind dem Fachmann bekannt.
Bei einer zweiten Ausführungsform kann das rekombinante Immunglobulinprotein dem ei zugeführt werden, ir dem man eine Wirtszelle, die mit einem Expressionssystem transformiert wurde, in das eierlegende Tier einbringt. Die transformierte Zelllinie sezerniert dann das rekombinante Protein, das in das Ei transportiert wird. Vorzugsweise ist die Wirtszelle eine Vogelzelllinie, insbesondere eine pluripotente oder multipotente embryonale Zelllinie, eine der Keimbahn zugehörige Zelllinie oder jede Zelllinie, die zu somatischen Geweben und zur Keimbahn beitragen kann.
Die Erfindung stellt allso ein Verfahren bereit zur Herstellung eines rekombinanten Immunglobulinproteins in einem Ei, umfassend:

a) Einbringer einer transformierten Vogelzelllinie, die ein rekombinantes Protein sezerniert, in ein eierlegendes Tier, wobei die Vogelzelllinie mit einem Expressionssystem transformiert ist, das Folgendes umfasst: (i) eine erste DNA-Sequenz, die ein rekombinantes Protein kodiert, und (ii) eine zweite DNA-Sequenz, welche die Zufuhr des Proteins zu einem Ei eines Tiers erleichtert;
b) Gewinnen des Eis, welches das rekombinante Protein enthält; und gegebenenfalls
c) Isolieren des rekombinanten Proteins aus dem Ei.

Bei einer speziellen Ausführungsform sezerniert die Vogelzelllinie einen rekombinanten Antikörper, vorzugsweise einen humanisierten Antikörper. Die Vogelzelllinie kann in Legehennen injiziert werden. Die Antikörper werden in der Henne in vivo produziert und werden dem Dotter der Eier zugeführt, aus dem sie erhalten werden können.
Bei einer speziellen Ausführungsform sezerniert die Vogelzelllinie einen rekombinanten Antikörper, vorzugsweise einen humanisierten Antikörper. Die Vogelzelllinie kann in Legehennen injiziert werden. Die Antikörper werden in der Henne in vivo produziert und werden dem Dotter der Eier zugeführt, aus dem sie erhalten werden können.
Die Erfindung stellt also ein Verfahren bereit zur Herstellung eines rekombinanten Immunglobulinantikörpers in einem Geflügelei, umfassend:

a) Einbringen einer transformierten Vogelzelllinie, die einen rekombinanten Antikörper sezerniert, in ein eierlegendes Geflügel, wobei die Vogelzelllinie mit einem Expressionssystem transformiert ist, das Folgendes umfasst: (i) eine erste DNA-Sequenz, die eine konstante Immunglobulinregion kodiert, (ii) eine zweite DNA-Sequenz, die eine variable Immunglobulinregion codiert, und (iii) eine regulatorische Region, die genügt, dass der Antikörper exprimiert wird;
b) Gewinnen des Eis, welches den rekombinanten Antikörper enthält; und gegebenenfalls
c) Isolieren des rekombinanten Antikörpers aus dem Ei.

Bei einer dritten und bevorzugten Ausführungsform können die rekombinanten Proteine in einem eierlegenden Tier durch Herstellen eines transgenen Tiers hergestellt werden, welches das rekombinante Protein sezerniert, das in die Eier transportiert wird. Die Erfindung stellt somit ein Verfahren bereit zur Herstellung eines rekombinanten Immunglobulinproteins in einem Ei eines eierlegenden Tiers, umfassend:

a) Herstellen eines transgenen eierlegenden Tiers, dessen somatische und Keimbahnzellen ein Expressionssystem enthalten, das Folgendes umfasst: (i) eine erste DNA-Sequenz, die ein rekombinanten Immunglobulinprotein kodiert, das operativ verknüpft ist mit (ii) einer zweiten DNA-Sequenz, welche die Zufuhr des rekombinanten Proteins an das Ei erleichtert;
b) Gewinnen des Eis aus dem Tier und
c) gegebenenfalls Isolieren des rekombinanten Proteins aus dem Ei.

Vorzugsweise kodiert die zweite DNA-Sequenz einen ausreichenden Teil eines Immunglobulinproteins, dass das rekombinante Protein zu dem Ei gesteuert und in das Ei aufgenommen wird. Stärker bevorzugt kodiert die zweite DNA-Sequenz einen Teil der CH2-CH3-Region der Domäne mit der konstante Region des Immunglobulins.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform kann ein rekombinanter Antikörper in einem Geflügel hergestellt werden durch Herstellen eines transgenen Geflügels, welches den Antikörper, vorzugsweise einen humanisierten Antikörper, sezerniert. Die Erfindung stellt somit ein Verfahren bereit zur Herstellung eines rekombinanten Antikörpers in einem Ei eines eierlegenden Tiers, umfassend:

a) Herstellen eines transgenen eierlegenden Tiers, dessen somatische und Keimbahnzellen ein Expressionssystem enthalten, das Folgendes umfasst: (i) eine erste DNA-Sequenz, die eine konstante Immunglobulinregion kodiert, (ii) eine zweite DNA-Sequenz, die eine variable Immunglobulinregion codiert, (iii) eine regulatorische Region, die genügt, dass der Antikörper exprimiert wird; und
b) Gewinnen des Eis aus dem Tier.

Zur Herstellung eines transgenen Tiers kann ein erfindungsgemäßes Expressionssystem in Embryonen (wie Geflügelembryonen) unter Verwendung im Stand der Technik bekannter Techniken eingebracht werden, wie Mikroinjektion, Elektroporation, Spermientransfektion, Liposomenfusion und Mikroprojektilbeschuss. Die Embryonen, die das Expressionssystem enthalten, werden dann in eine Scheinschale überführt. Tiere, die das Transgen enthalten, können bis zur sexuellen Reife gezüchtet werden, und das Vorliegen des rekombinanten Proteins kann in den eiern des reifen Tiers analysiert werden.
Die Erfindung beinhaltet auch die hier beschriebenen transgenen eierlegenden Tiere.
3. EIPRÄPARATIONEN
Die Erfindung beinhaltet auch die Eier, die die rekombinanten Proteine enthalten, sowie die Verwendung der Eier bei allen Anwendungen. Weil Eier eine essbare Nahrungsquelle sind, müssen die rekombinanten Protein nicht aus dem Ei isoliert oder gereinigt werden. Die Eier mit dem rekombinanten Protein können direkt konsumiert oder vor dem Verzehr gekocht oder in Rezepte eingebracht werden (wie Omeletts, Shakes, Backwaren).
Wenn gewünscht, kann das rekombinante Protein vor der Verabreichung aus dem Ei isoliert und in eine pharmazeutische Formulierung eingebracht werden. Zum Beispiel können die humanisierten Antikörper unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren (siehe zum Beispiel USP 5,420,253 ) aus dem Hühnerei entnommen werden. Die Antikörper sind in der Regel im Dotter des Eis enthalten, das von dem restlichen Ei abgetrennt wird, wodurch die Antikörper erhalten werden. Die Dotterpräparation, welche die Antikörper oder anderes rekombinantes Protein enthält, kann für die Lagerung lyophilisiert werden. Die lyophilisierte Präparation kann wiederaufgelöst werden, wenn sie gebrauchsfertig ist.
Die Antikörper können je nach der Spezifität der variablen Region zur Behandlung oder zum Nachweis verschiedener Krankheiten oder Pathogene verwendet werden. Zur Behandlung einer Erkrankung können die Antikörper allein, konjugiert oder in Kombination mit anderen Verbindungen verabreicht werden. Die Antikörper können mit einem Toxin konjugiert werden, so dass die Zerstörung der erkrankten oder infizierten Zellen erleichtert wird, nachdem der Antikörper daran gebunden hat. Solche konjugierten Antikörper sind als Immuntoxine bekannt und können unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden (Thorpe et al., Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine, Academic Press, S. 168-190, 1982).
Die rekombinanten Antikörper können in einer pharmazeutische Zusammensetzung zubereitet werden, die sich zur In-vivo-Verabreichung eignet. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann das Protein oder den Antikörper in einem biologisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel oder in einem Trägersystem enthalten, wie Liposomen. Die Protein- oder Antikörperzusammensetzung kann auf geeignete Weise verabreicht werden, wie mittels Injektion, oraler Verabreichung, Inhalation, transdermaler Applikation oder rektaler Verabreichung. Je nach dem Verabreichungsweg kann der Wirkstoff auf ein Material geschichtet werden, dass die Verbindung vor der Einwirkung von Enzymen, Säuren oder anderen natürlichen Bedingungen schützt, die den Antikörper inaktivieren können. Die Zusammensetzung enthält eine therapeutisch wirksame Menge des Pro teins oder Antikörpers und wird in Dosierungen und für Zeiträume bereitgestellt, die zur Erzielung der gewünschten Ergebnisse notwendig sind.
Die Antikörper können zur Diagnose oder zum Nachweis einer Krankheit in vivo oder in vitro verwendet werden. Für die In-vivo-Diagnostik werden die Antikörper in geeigneten pharmazeutischen Formulierungen zubereitet, wie oben erläutert. Die Antikörper werden auch allgemein mit einem nachweisbaren Marker markiert, so dass sie nachgewiesen werden können. Die verwendbaren nachweisbaren Marker sind u.a. verschiedene Enzyme, fluoreszierende Materialien, lumineszierende Materialien und radioaktive Materialien. Beispiele für geeignete Enzyme sind u.a. Meerrettichperoxidase, Biotin, alkalische Phosphatase, β-Galactosidase oder Acetylcholinesterase; Beispiele für geeignete fluoreszierende Materialien sind u.a. Umbelliferon, Fluorescein, Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin, Dichlortriazinylaminfluorescein, Dansylchlorid oder Phycoerythrin; ein Beispiel für ein lumineszierendes Material ist u.a. Luminol; Beispiele für geeignete radioaktive Materialien sind u.a. S-35, Cu-64, Ga-67, Zr-89, Ru-97, Tc-99m, Rh-105, Pd-109, In-111, I-123, I-125, I-131, Re-186, Au-198, Au-199, Pb-203, At-211, Pb-212 und Bi-212. Die Antikörper können auch mit einem anderen Partner eines Ligandenbindungspaars konjugiert sein. Repräsentative Beispiele sind u.a. Avidin-Biotin und Riboflavin-Riboflavinbindungsprotein. Verfahren zum Konjugieren oder Markieren der oben erläuterten Antikörper mit den oben dargelegten repräsentativen Markierungen können leicht durchgeführt werden.
Die Antikörper können auch zum Nachweis einer Erkrankung oder von Pathogenen in vitro unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren verwendet werden. Die Verfahren beruhen auf einer Bindungswechselwirkung zwischen den Antikörpern und einer Antigendeterminante von einem Protein, das für das Pathogen oder die Krankheit spezifisch ist. Beispiele für solche Verfahren sind Radioimmuntests, Enzymimmuntests (z.B. ELISA), Immunfluoreszenz, Immunfällung, Latexagglutinierung, Hämagglutinierung und histochemische Tests, wie enzym-verknüpfter Immunosorbent-Test (ELISA) und Western-Blot.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können zur Behandlung enterischer Infektionen verwendet werden, wie eine Rotavirus-Infektion und enterotoxigene Escherichia coli (ETEC), das diese die hauptsächlichen Erreger von Erkrankungen bei Neugeborenen und Kindern sind. Antikörper können hergestellt werden, die variable Regionen enthalten, die für diese Pathogene oder Teile der Pathogene spezifisch sind.
Die Erfindung kann auch zur Herstellung pathogenfreier Eier verwendet werden. Zum Beispiel kann ein für ein bestimmtes Pathogen spezifischer Antikörper in einem eier legenden Tier produziert und in das Ei transportiert werden, in dem es das bestimmte Pathogen neutralisiert. Bei einer Ausführungsform kann der Antikörper ein Salmonellen-Antikörper sein und zur Herstellung salmonellenfreier Eier verwendet werden.
Unter einem Aspekt betrifft die Anmeldung somit die Herstellung eines Eis, das frei von einem bestimmten Pathogen ist, wobei man:

Die folgenden nicht-beschränkenden Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen.
BEISPIELE
Beispiel 1
Aufnahme von Human-Antikörpern in das Hühnerei
Zur Bestimmung, ob Human-IgG (hIgG) in den sich entwickelnden Hühnerfollikel transportiert werden kann, wurden in drei Hyline SC^TM-Hennen jeweils 10 μg gereinigtes IgG injiziert, dessen Vorliegen in Eidotter und Eiklar mittels ELISA untersucht wurde. Human-IgG wurde in Eidotter erstmals am Tag 2 entdeckt, wobei am Tag 5 maximale Spiegel bis zu 89 ng/ml nachgewiesen wurden (1). Kein IgG wurde in den dünnen Albumenextrakten nachgewiesen, was zeigte, dass die Konzentration unter 3,12 ng/ml (die Nachweisgrenze des ELISA-Assays) betrug.
Zudem wurden 10 μg Human-IgA (hIgA) intravenös in drei Hyline SCTM-Hennen injiziert, wodurch bestimmt werden sollte, ob auch IgA im Ei abgelagert werden konnte. Human-IgA wurde in Eidotter erstmals am Tag 2 entdeckt, wobei am Tag 5 maximale Spiegel bis zu 33 ng/ml nachgewiesen wurden (2A), also signifikant weniger als die für IgG gemessene maximale Ablagerung (Analyse wiederholter Messungen, p < 0,01). Im Gegensatz zu IgG wurde IgA in Eiklar nachgewiesen. Human-IgA wurde erstmals in Eiklarextrakten von Eiern des Tages 1 entdeckt und blieb an den Tagen 2-8 konstant bei etwa 8 ng/ml Albumen (2B).
Beispiel 2
Aufnahme von rekombinantem IgG in Hühnereier
Materialien und Verfahren
Kultur und Transfektion von Zelllinien
Die Hühner-B-Lymphoblasten-Zelllinie DT40, die von Hyline-SC^TM-Hühnern stammt (Hyline International, Dallas Center, Iowa), wurde von Dr. Craig Thompson erhalten und zur Etablierung transfizierter Zelllinien verwendet, die chimäre Human/Maus-Antikörper produzierten. Die Zellen wurden bei 1-10 × 10⁶ Zellen/ml in IMDM^TM (Gibco BRL) mit 8% (vol./Vol.) Kälberserum (BCS und 2% (Vol./Vol.) Hühnerserum (CS) kultiviert. Die Zellen (1 × 10⁷) wurden jeweils mit 20 μg linearisierter schwerer Kette (chimäres Anti-Dansylgamma 1) und leichter Kette (chimäre leichte Anti-Dansyl-Kette mit Human-kappa) mithilfe von elektroporation unter Verwendung eines Bio-Rad-Elektroporators unter optimierten Elektroporationsbedingungen (200 V, 960 μF und 1000 msec Impuls) transfiziert. Die Zellen wurden zwei Tage lang in den obigen Kulturmedien in Mikrotiterschalen mit 96 Vertiefungen (2,5 × 10⁴ Zellen/Vertiefung) gehalten, und anschließend wurde ein Selektionsmedium zugefügt, das 3 μg/ml Mycophenolsäure, 7,5 μg/ml Hypoxanthin und 125 μg/ml Xanthin enthielt. Die überlebenden Kolonien wurden mittels enzymverknüpftem Immunosorbent-Assay (ELISA) unter Verwendung von Dansyl-BSA-beschichteten Mikrotiterplatten und mit alkalischer Phosphatase verknüpftem Anti-Human-kappa als Nachweisreagenzein gescreent. Stark positive Kolonien wurden dann für die weitere Charakterisierung in größere Schalen überführt. Zellen aus diesen expandierten Kolonien wurden mittels Wachstum über Nacht in Gegenwart von ³⁵S-Methionin markiert. Nach dem Wachstum über Nacht wurden Kulturüberstand und Cytoplasmalysate hergestellt. Die Inhalte wurden unter Verwendung von Kaninchen-Anti-Human-Ig und Staph A (IgSorb) immungefällt. Die Proben wurden auf 5%igen Polyacrylamidgelen ohne Reduktion und auf 12%igen Gelen nach Reduktion analysiert. Die Position der Banden wurden mittels Autoradiographie bestimmt. Zellen von Kolonien, die die gewünschten chimären Antikörper produzierten, wurden dann bei 1-10 × 10⁶ Zellen/ml in Kulturmedium gehalten.
Erzeugung von Tumoren in Hyline-SC-Hennen
Die transfizierte DT40-Zelllinie TAOD 7.4, die chimäres Human-Anti-Dansylgamma3 produziert, wurde in einer Konzentration von 1 × 10⁶ Zellen/ml in Opti-MEM I^TM (Gibco BRL, Burlington) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) kultiviert. Die Zellen wurden mittels 5-minütiger Zentrifugation bei 300 × g geerntet, und das Kulturmedium wurde entfernt. Die Zellen wurden in einer Konzentration von 5 × 10⁷ Zellen/ml in Dulbecco's phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, Gibco BRL, Burlington, Ontario) resuspendiert. Es wurden insgesamt 5 × 10⁶ Zellen in 100 μl PBS subkutan in den Bereich zwischen dem Oberschenkel und der Körperwand von Hyline-SC^TM-Hennen injiziert. Die Tumorentwick lung wurde täglich untersucht. Die Hennen wurden vor der Injektion und dann zweimal wöchentlich zur Überwachung von Gewichtsschwnkungen gewogen.
Reinigung und Analyse von Dotterantikörpern
Von den Hennen wurden nach der Injektion täglich Eier gesammelt. Der Dotter wurde vom Albumin abgetrennt, und die Antikörper wurden aus dem Dotter mithilfe des gammaYolk^TM-Präparierkits (Pharmacia Biotech, Morgan Blvd., Quebec) gereinigt. Gereinigter Dotterantikörper wurde in Carbonatpuffer, pH 9,6, resuspendiert und hinsichtlich des Vorliegens von chimärem Human-Anti-Dansyl-gamma3 mit einem Sandwich-Antikörper-ELISA analysiert. Immulon^TM-Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen wurden über Nacht bei 4°C mit 50 μl einer 5 μg/ml-Lösung von Ziege-Anti-Human-IgG (H+L) (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA, USA) in Carbonatepuffer, pH 9,6, beschichtet. Nach der Inkubation über Nacht wurde das Beschichtungsgemisch verworfen, und die Platten wurden dreimal mit PBS gewaschen. Die Platten wurden dann 1 Std. lang bei Raumtemperatur durch Zugabe von 100 μl Blockierungspuffer (PBS mit 3% (Gew./Vol.) Rinderserumalbumin) blockiert. Der Blockierungspuffer wurde verworfen, und die Platten wurden dreimal mit PBS gewaschen. Einzelnen Dotterantikörperpräparationen oder Verdünnungsreihen von Standards (Cromopure Human IgG, Jackson Immunoresearch, West Grove PA, USA) (50 μl) wurden zu jeder Vertiefung gegeben, und die Platte wurde über Nacht bei 4°C inkubiert. Nach der Inkubation über Nacht wurden die Testlösungen verworfen und die Platten dreimal mit PBS gewaschen. Mit meerrettichperoxidase konjugiertes Ziege-Anti-Human-IgG (H+L) (Jackson Immunoresearch, West Grove PA, USA) (50 μl) in einer Konzentration von 125 ng/ml in Blockierungspuffer wurde zu den Vertiefungen der Platten zugegeben. Es wurde eine 2-ständige Inkubation bei Raumtemperatur durchgeführt. Das Peroxidase-Konjugat wurde dann verworfen, und die Platten wurden dreimal mit PBS gewaschen. Meerrettichperoxidase-Substrat (Ammoniumacetat-Citronensäurepuffer (pH 5,0) mit 0,05% (Gew./Vol.) o-Phenylendiamindihyrochlorid und 0,05% (Vol./Vol.) 30% Wasserstoffperoxid) wurde dann zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Die Platten wurden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Schwefelsäure (50 μl einer 5 M-Lösung) wurde in jede Vertiefung gegeben, und die Platten wurden 10 min lang langsam auf einem Tischschüttler geschüttelt. Die Farbentwicklung wurde dann unter Verwendung eines Titertek-Multiskan^TM PLUS ELISA-Plattenlesegeräts mit einem 492-nm-Filter untersucht.
Ergebnisse
Eine typische Standardkurve für den Assay von Human-Immunglobulinen in Eidotter ist in Tabelle 1 gezeigt. Die Extinktion in Gegenwart von Eidotter unterscheidet sich nicht von der Extinktion einer Vertiefung mit einer negativen Kontrolle, die nur Puffer enthält. Das zeigt, dass Eidotter den Assay nicht stört. Der Regressionskoeffizient zwischen der Extinktion bei 492 nm und den log10-Konzentrationen von Human-Immunglobulin (hIgG) beträgt 0,99, somit beschreibt die Gleichung y = 1,1683x – 0,0185 genau die Beziehung zwischen Extinktion und Konzentration an hIg.
Die Wirkung von Dotter im Assay wurde zudem untersucht, indem eine Standardkurve in Gegenwart von Dotterextrakt erstellt wurde. Wie in dem nachstehenden Diagramm angegeben, war die Extinktion in Gegenwart von Dotter bei allen Standardkonzentrationen im Assay unverändert. Die Extinktion von Dotterextrakten aus Hennen ohne Injektion war gleich der Extinktion jedes Standards unter 1,56 ng/ml, was zeigte, dass Konzentrationen an Human-Ig unter 1,56 ng/ml nachgewiesen werden konnten.
Die Konzentration von Human-Immunglobulin in Eiern der Henne Nr. 9185 (Käfig 2) sind in Tabelle 2 dargestellt. In diese Henne wurden am Tag 1 5 Millionen Zellen injiziert, die mit Human-IgG3 transfiziert waren (TAOD7.4). Bis zum Tag 11 blieb der Tumor ein kleiner Knoten. Zu diesem Zeitpunkt traten Blutungen in dem Bereich um den Tumor auf. Die Ablagerung im Dotter war in eiern ersichtlich, die am Tag 13 und 15 gelegt wurde, wobei anschließende Eier nicht nachweisbare Mengen an hIg enthielten.
Diskussion
Es wurde gezeigt, dass der ELISA zum Nachweis von Human-Immunglobulin in Eidotter bis 1,56 ng/ml empfindlich war, für Human-Immunglobulin spezifisch und reproduzierbar war. Die Rückgewinnung von Human-Immunglobulin aus Eidotter betug etwa 15% (Daten nicht gezeigt).
Das Vorliegen eines Tumor in der Henne Nr. 9185 zeigt, dass DT40-Zellen ein Wirtshuhn besiedeln und somatische Chimären bilden. Eine Untersuchung der Konzentrationen an hIg im Dotter dieser Henne zeigt, dass Human-Immunglobuline durch gentechnisch veränderte DT40-Zellen in vivo produziert und anschließend in Eidotter transportiert werden. Weil ein Eidotter etwa 10-15 ml ausmacht und die Rückgewinnung an hIg in dem Assay etwa 15% betrug, wird erwartet, dass etwa 625 ng hIg in dem von der Henne Nr. 9185 am Tag 13 gelegten ei abgelagert worden waren.
Diese Daten liefern ein Protokoll für die Entwicklung einer Technologie zur Produktion von Human-Immunglobulinen in Hühnereiern im großen Maßstab.
Es wurden 10⁷ DT40-hIgG3-Zellen intravenös in 8 Hyline-SC^TM-Hennen injiziert. Von den 8 Hennen, denen DT40-IgG3-Zellen intravenös injiziert worden waren, entwickelten 3 Tumoren an der Injektionsstelle, was zeigt, dass einige oder alle Zellen subkutan injiziert und nicht intravenös zugeführt worden waren. Eier von Hühnern, die einen Tumor an der Injektionsstelle entwickelten, hatten sehr wenig rhIgG3 im Eidotter und keines im dünnen Albumen (Daten nicht gezeigt). rhIgG3 wurde im Eidotter der verbleibenden 5 Hennen erstmals am Tag 7 nachgewiesen (3A und 3B). Die maximale Ablagerung von rhIgG3 in vier dieser Hennen betrug 33 ng pro ml Dotterund lag in den am Tag 10 gelegten Eiern vor. Eine der Hennen (Vogel 6, 3B) legte an den Tagen 10 oder 11 kein Ei, und das am Tag 12 gelegte Ei enthielt 0,3 μg rhIgG3/ml Dotter. Diese Henne legte an den Tagen 13 und 14 kein Ei, und kein rhIgG3 war in den an den Tagen 15 und 16 gelegten Eiern nachweisbar.
Hühner-Anti-rhIgG3 wurde am Tag 6 im Eidotter aller Hennen nachgewiesen, denen DT4O-IgG3-Zellen injiziert worden waren, ungeachtet des Vorliegens oder Fehlens eines Tumors an der Injektionsstelle, und maximale Spiegel an Hühner-Anti-rhIgG3 wurden im Eidotter am Tag 9 beobachtet (Daten nicht gezeigt). Alle Hennen, denen DT40-IgG3-Zellen intravenös injiziert worden waren, wurden am Tag 17 getötet. Bei der Autopsie wurden keine inneren Tumoren bei einem der Vögel, die einer Injektion erhalten hatten, beobachtet. Um zu bestimmen, ob die DT40-IgG3-Zellen als Leukämie erhalten geblieben waren, wurden Blutproben von den Vögeln entnommen und mittels Lichtmikroskopie und Immunfluoreszenzfärbung auf die stetige Awensenheit von DT40-IgG3-Zellen hin untersucht. Keine DT4O-IgG3-Zellen wurden in Blutproben von Hennen beobachtet, die Tumoren an der Injektionsstelle entwickelt hatten, obwohl von diesen Tumoren stammende Zellen erfolgreich wieder in Kultur etabliert wurden und eine fortgesetzte Produktion von rhIgG3 aufweisen (Daten nicht gezeigt). Bei Hennen, die keine Tumoren an der Injektionsstelle entwickelten, wurden in verdünnten Blutproben Cluster von Zellen beobachtet, die DT40-IgG3-Zellen morphologisch ähnelten (4A). Mittels immunhistochemischer Anfärbung von intrazellulärem hIgG wurde bestätigt, dass es sich dabei um DT40-IgG3 Zellen handelte (4B).
Beispiel 3
Aufnahme von rekombinantem IqA in Hühnereier
Ähnlich den DT4-IgG3-Zellen wurde die DT40-Zelllinie DT40hIgA hergestellt, die chimäre Maus/Human-Anti-Dansyl-Antikörper (rhIgA) sezerniert. Um zu zeigen, dass eine Henne mit Populationen transfizierter B-Zellen, die rhIgA produzieren, das rhIgA in das Ei transportieren, wurden 10 DT40-hIgA-Zellen intravenös in 8 Hyline-SC^TM-Hennen injiziert. Fünf der Hennen, denen DT4-hIgA-Zellen injiziert worden waren, entwickelten Tumoren an der Injektionsstelle. Eine geringe Ablagerung des rhIgA in Albumen wurde bei allen Hennen mit Injektion nachgewiesen, aber sehr wenig rhIgA-Ablagerung wurde im Dotter der Hennen entdeckt, die Tumoren entwickelten (Daten nicht gezeigt). Die 3 Hennen, die keine Anzeichen für eine Tumorbildung an der Injektionsstelle entwickelten, lagerten am Tag 9 bis zu 20 ng rhIgA/ml Dotter ab (5).
Beispiel 4
Charakterisierung des Fc-Rezeptors auf dem Hühnerei
In dieser Studie wurde ein Panel modifizierter rhIgGs herstellt, womit versucht werden sollte, die Fc-Sequenzen aufzudecken, die an der Aufnahme von Ig in den sich entwickelnden Vogeloozytenfollikel beteiligt sind. Die Erfinder sind die ersten, die darüber berichten, dass der Fc-Rezeptor auf der Membran der sich entwickelnden Vogeloozyte, der für den Transport von IgG in das Eidotter verantwortlich ist, ein Homolog des Säuger-FcRn zu sein scheint. FcRn ist ein mit dem Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Klasse I verwandter Rezeptor, der eine Rolle bei der Überführung von IgGs über die Mutter-Kind-Barriere, die Transzytose mütterlicher IgGs und die Regulation der Serum-IgG-Spiegel bei Mäusen spielt. Beim Menschen wurde ein Homolog gefunden, das anscheinend dieselbe Rolle spielt.
Verfahren und Materialien
Zur Erleichterung der Beschreibung der Modifikationen, die an den rhIgGs vorgenommen wurden, kann eine schwere Wildtype-IgG-Kette als V-CH1-H-CH2-CH3 dargestellt werden. Dabei ist V die variable Region, CH_ die Domäne der jeweiligen schweren Ketten und H die Hinge- (Scharnier-) Region.
Ein Panel von 6 (im Folgenden aufgeführten) rhIgGs wurde in Hennen im Wesentlichen wie zuvor im Beispiel 1 beschrieben injiziert.

1. Wildtyp-IgG diente als positive Kontrolle
2. V-CH3 (d.h. ohne, jeweils einschließlich, CH1 bis CH2)
3. V-CH1-H-CH3 (d.h. ohne CH2-Domäne)
4. V-CH1-H-CHJ2-*CH3 (d.h. mit einer ortsspezifischen Mutation an der CH2-CH3-Grenze, die bewirkt, dass das rhIgG nicht an FcRn binden kann). NB. Keine Deletion.
5. **V-CHI-H-CH2-CH3** (d.h. ein aglycosyliertes rhIgG, das nicht mehr Komplement aktivieren oder an die meisten bekannten Fc-Rezeptoren, aber weiterhin an FcRn binden kann). NB. Keine Deletion.
6. V-αOH1-H-CH2-CH3 (d.h. die konstante CH1-Domäne wurde gegen eine IgA-CH1-Domäne ausgetauscht. Dadurch wurde gezeigt, dass von der CH2-CH3-Grenze entfernte Regionen ausgetauscht werden können, ohne die Bindung an den Rezeptor zu beeinträchtigen).

Ergebnisse
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. V-CH3, V-CH1-H-CH3 und V-CH1-H-CH2*-CH3 wurden in Eidotterproben nicht nachgewiesen. **V-CH1-H-CH2-CH3** und V-αCH1-H-CH2-CH3 wurden genauso effizient abgelagert wie die Kontroll-Wildtyp-hIgG.
Dieses Beispiel zeigt, dass die rhIgGs die Vogeloozytenmembran nicht mehr überqueren können, wenn die CH2-CH3-Grenze durch eine Deletion auseinander gerissen wird. Gibt es zudem ortsspezifische Mutationen in den Aminosäureresten der CH2-CH3-Grenze, von denen man weiß, dass sie mit FcRn Wechselwirken, können die rhIgGs ebenfalls die Vogeloozytenmembran nicht mehr überqueren. Es wurde jedoch gezeigt, dass die Grenze zwischen den CH2-CH3-Domänen an andere Fc-Rezeptoren, einschließlich Fcγ I-III, bindet. Das aglycosylierte rhIgG **V-CH1-H-CH2-CH3** wurde zur Bestätigung der Art des Oozytenrezeptors gewählt, weil die Aglycosylierung von IgGs die Komplementaktivierung und die Bindung an die meisten Fc-Rezeptoren, aber nicht die Bindung an FcRn stört. Weil das aglycosylierte rhIgG genauso effizient wie Wildtyp-hIgG im Eidotter eingelagert wird, ist zusammen mit anderen Befunden dieser Experimente wahrscheinlich, dass ein Vogelhomolog von FcRn für den Transport von IgGs über die Vogeloozytenmembran verantwortlich ist. Diese Befunde sollten eine Optimierung der gentechnologischen Herstellung therapeutischer Antikörper für die Produktion in einem transgenen Hühnermodell sowie möglicherweise die Einlagerung jedes gewünschten Proteins im Eidotter durch Einbringen der für die Bindung an FcRn benötigten Sequenzen ermöglichen.
Beispiel 5
Herstellung transgener Hühner
Es können transgene Hühner hergestellt werden, die rekombinante Proteine produzieren, wie humanisierte Antikörper. Zur Herstellung des transgenen Huhns werden Embryonen des Stadiums X (40b) aus nicht inkubierten Eiern gewonnen, die von Barred-Plymouth-Rock-Hennen gelegt werden. Blastodermzellen werden mittels enzymatischem Verdau der intrazellulären Matrix geerntet, und die DNA wird in die dispergierten Zellen unter Verwendung von Lipofektionsreagenzien eingebracht, wie von Brazolot et al. und Fraser et al. beschrieben. Die dispergierten Zeilen werden dann in bestrahlte Empfängerembryonen des Stadiums X, die von Weißen-Leghorn-Hennen gelegt werden, wie von Carscience et al. beschrieben injiziert. Am vierten Tag nach der Injektion werden die Embryonen in eine Scheinschale (109, 109b) überführt, welche die Schlüpfrate von etwa 10% der Embryonen mit Injektion auf etwa 40% der Embryonen mit Injektion erhöht (Cochran und Etches, unveröffentlicht). Beim Schlüpfen erkennt man die Chimären am schwarzen Flaum, der vom Donor (Barred Plymouth Rock) stammt, und am gelben Flaum, der vom Empfänger (White Leghorn) stammt. Die Küken, bei denen keine Anzeichen für den Einbau von Donorzellen gefunden werden, werden verworfen. Am Tag des Schlüpfens bzw. im alter von 4 Wochen werden Kammgewebe und -blut entnommen. Das Vorliegen der DNA-Sequenz, welche die Produktion des rekombinanten Proteins (wie eines chimären Antikörpers) kodiert, wird mittels PCR bestimmt. Das Vorliegen von rekombinantem Protein wird mittels ELISA untersucht, der an einer im Alter von 4 Wochen entnommenen Blutprobe durchgeführt wird. Hühner, die das Transgen tragen, werden bis zur Geschlechtsreife gezüchtet. Die einlagerung des rekombinanten Proteins in sich entwickelnde Eier wird mittels ELISA untersucht, der an Dotterextrakten von Eiern durchgeführt wird, welche die weiblichen Chimären legen. Männliche und weibliche Chimären werden gepaart. Die erhaltenen Nachkommen werden mittels PCR gescreent, wodurch diejenigen mit dem Konstrukt identifiziert werden.

Es sollte beachtet werden, dass das Ziel der Produktion eines chimären Antikörpers in Eiern erreicht wird, wenn transfizierte Zellen das Lymphsystem besiedeln. Ein Hühnerstamm, in dem die DNA-Sequenzen, die die Produktion des chimären Antikörpers kodieren, als mendelndes Merkmal eingebracht werden, wird erhalten, wenn das Konstrukt in die Keimbahn eingebracht wird. Sogar ohne eine Keimbahntransmission erhalten wird jedoch signifikante neue Informationen über die Antikörperproduktion in Hühnern. Tabelle 1

Standardkonz. ng/ml	Log10 Standardkonz.	Abs. bei 492 nm der Standardkonz.	Durchschn. korr. auf (-)-Kontrolle		Abs. bei 492 nm der (-)-Kontrolle	Durchschn. (-)-Kontrolle
0,098	-1,00877	0,079	0,085	-0,008	0,1	0,08	0,09
0,195	-0,70997	0,101	0,109	0,015		0,09
0,39	-0,40894	0,137	0,167	0,062		0,09
0,78	-0,10791	0,207	0,198	0,1125		0,09
1,56	0,193125	0,334	0,324	0,239		0,09
3,12	0,494155	0,637	0,578	0,5175		0,09
6,25	0,79588	0,959	1,017	0,898		0,09
12,5	1,09691	1,329	1,422	1,2855		0,09
25	1,39794	1,499	1,393	1,356		0,09

Tabelle 2

Konzentration an Human-Immunglobulin in Dotter von Henne Nr. 9185 (Käfig 2)
Tag	Konzentration an hIg (ng/ml Dotter)
1	nicht nachweisbar
2	nicht nachweisbar
3	nicht nachweisbar
4	nicht nachweisbar
5	nicht nachweisbar
6	nicht nachweisbar
7	nicht nachweisbar
8	nicht nachweisbar
9	nicht nachweisbar
10	nicht nachweisbar
11	nicht nachweisbar
12	kein Ei
13	6,27
14	kein Ei
15	3,46
16	kein Ei
17	nicht nachweisbar
18	nicht nachweisbar
19	nicht nachweisbar
20	nicht nachweisbar
21	nicht nachweisbar
22	nicht nachweisbar
23	nicht nachweisbar
24	nicht nachweisbar
25	nicht nachweisbar
26	nicht nachweisbar
27	nicht nachweisbar

Tabelle 3 Mittlere Einlagerung von rhIgGs pro ml Dotter in Eiern, die von Hühnern (n = 5) gelegt wurden, denen intravenös jeweils 10 g des Panels an rhIgGs injiziert wurde.

Tage nach Injektion nach	Mittlere Ablagerung von rhIgGs pro ml Dotter (ng/ml)
Tage nach Injektion nach	Wildtyp-IgG	V-CH3	V-CH1-H-CH3	V-CH1-H-CH2-C*H#	v-CH1-H-CH2-CH3	V-αCH1-CH2-CH3
1	0	0	0	0	0	0
2	4,64	0	0	0	3,72	3,91
3	8,08	0	0	0
4	21,54	0	0	0	21,0	18,43
5	55,4	0	0	0	49,8	47,21
6	18,7	0	0	0
7	6,96	0	0	0
8	3,22	0	0	0

Claims

Verfahren zur Herstellung rekombinanter Immunoglobulinproteine in den Eiern eines eierlegenden Tiers, umfassend die Schritte Konstruieren eines Vektors mit einem Expressionssystem, umfassend (i) eine erste DNA-Sequenz, welche die konstante Region von Human-Immunglobulin Gamma-Isotyp kodiert, dessen CH2-CH3-Region in der Fc-Domäne der konstanten Region sitzt; (ii) eine zweite DNA-Sequenz, welche kodiert eine variable Region von Human-Immunglobulin und (iii) eine dritte DNA-Sequenz, umfassend einen Promotor, der von einem Immunglobulin-Gen stammt und eine Expression der konstanten Region von Human-Immunglobulin in Huhn bewirkt; Einbauen des Vektors in eine pluripotente Huhn-Zelllinie, Injizieren der Zelllinie in einen Huhnembryo, Ausbrüten eines eierlegenden Huhns, welches ein Ei produziert, dessen Eigelb Human-Immunglobulin Gamma-Isotyp enthält mit einem konstanten Bereich, der von einer ersten DNA-Sequenz kodiert ist, einem variablen Bereich, der von einer zweiten DNA-Sequenz kodiert ist, und wobei der konstante Bereich eine nicht auseinander gerissene CH2-CH3-Schnittstelle besitzt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Vektor zudem einen negativen Selektionsmarker aufweist.
Verfahren nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch, zudem umfassend den Schritt des Isolierens von Human-Immunglobulin aus Ei.
Verfahren nach Anspruch 3, zudem umfassend den Schritt des Konjugierens des Immunglobulins an ein Toxin.
Verfahren nach Anspruch 4, zudem umfassend den Schritt des Formulierens von Human-Immunglobulin in eine pharmazeutische Formulierung.
Eierlegendes Huhn, dessen somatische Lymphomzellen ein Expressionssystem enthalten, umfassend (i) eine erste DNA-Sequenz, welche kodiert die konstante Region von Human-Immunglobulin Gamma-Isotyp, dessen CH2-CH3-Bereich in einer Fc-Domäne der konstanten Region ist; (ii) eine zweite DNA-Sequenz, die kodiert den variablen Bereich von Human-Immunglobulin; (iii) eine dritte DNA-Sequenz, umfassend einen Promotor, der aus einem Immunglobulin-Gen stammt und eine Expression des konstanten Bereichs von Human-Immunglobulin in Huhn bewirkt, wobei das eierlegende Huhn Eier legt, deren Eigelb Human-Immunglobulin Gamma-Isotyp enthält mit einer konstanten Region, die von der ersten DNA-Sequenz kodiert ist und einer variablen Region, die von der zweiten DNA-Sequenz kodiert ist, wobei die konstante Region eine nicht auseinander gerissene CH2-CH3-Schnittstelle besitzt.
Huhn nach Anspruch 6, wobei das Ei mindestens 345 Nanogramm Human- Immunglobulin Gamma-Isotyp pro Milliliter Eigelb enthält.
Huhn nach Anspruch 6 oder 7, wobei das Expressionssystem ferner einen Enhancer aufweist.
Huhn nach irgendeinem Anspruch 6 bis 8, wobei die zweite DNA-Sequenz eine variable Region von Human-Immunglobulin kodiert, welche für ein Antigen spezifisch ist.
Huhn nach Anspruch 9, wobei das Antigen ein Pathogen ist.