JPH07502886A - 精子表面タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 精子表面タンパク質 １．９ 本発明は、成熟した精子の表面に存在し、哺乳動物の受精の際に卵への精子の結 合に関与する、を−複合体関連精巣発現−１（ｔ−ｃｏｍｐｌｅｘ　ａｓｓｏｃ ｉａｔｅｄ　ｔｅｓｔｅｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ−１：　ｔ　ｃ　ｔ　ｅ　−１ ）と呼ばれるタンパク質に関する。本発明は、少なくとも一部が、ｔｃｔｅ−１ タンパク質をコードするヒトおよびマウスｃ　ＤＮＡのクローニング並びに特性 決定に基づいている。

受精の過程は決められた順序で起こる多くの段階から成っている（Ｗａｓｓａｒ ｍａｎ、　１９８７．５ｃｉｅｎｃｅ　２３５：５５３−５６０）　ｏこれらの 段階は正しく整然と行われ、卵と１個の精子との間の種特異的認識をもたらし、 これにより異種間交雑や倍数体を防いでいる。

受精への第１段階は、自由に泳ぎ回っている精子が、透明帯（ｚｏｎａ　ｐｅｌ ｌｕｃｉｄａ）と呼ばれる卵の厚い細胞外膜の表面で、排卵された卵と比較的ゆ るい非特異的な結合を形成するときに起こる。

次に、付着した精子は卵とのより強い種特異的な結合を形成する。この段階は結 合と呼ばれ、精子の原形質膜に存在する相補的な非結合タンパク質と相互に作用 する、透明帯に存在する受容体により仲介される。

卵に結合した後、精子は透明帯を通って卵の原形質膜に達することを可能にする 多数の酵素を放出する。これらの酵素（プロテイナーゼ、グリコシダーゼ、ホス ファターゼ、アリールスルファダーゼおよびホスホリパーゼを含む）は精子の頭 部の前方にある光体（ａｃｒｏｓｏｍｅ）と呼ばれる、膜に結合したリゾソーム 様小器官の中に貯蔵されている。光体反応（ａｃｒｏｓｏｍｅ　ｒｅａｃｔｉｏ ｎ）と呼ばれる酵素放出は多くの部位での光体外膜と精子原形質膜との融合を伴 い、その結果として精子頭部の前方からハイブリッド小胞（ｈｙｂｒｉｄ　ｖｅ ｓｉｃｌｅｓ）が放出される。

その後、光体反応を起こした精子は透明帯に侵入することができ、約１マイクロ メーター／分の速度で掘り進み、精子頭部の幅より小さい幅のトンネルを作る。

ひとたび精子が透明帯と卵の原形質膜の間の内腔に達すると、精子は卵と融合す ることができ、これにより受精が完了する。その後で卵の原形質膜に達した精子 は卵膜の速やかな減極によって卵との融合を妨げられる。別の精子による受精（ 多積）は、結合した精子を侵入させないようにしかつ他の精子が結合するのを防 止する透明帯の変化によってさらに防止される。一般に透明帯反応（ＺＯｎａ　 ｒｅａｃｔｉｏｎ）と呼ばれる、これら透明帯の変化は、表層反応と呼ばれる過 程で卵の原形質膜のすぐ下にある表層顆粒から酵素が放出されることによって起 こる。

２．２．　精子表面タンパク質 ウニでは、精子と卵との緊密な結合が精子の光体内膜に存在するタンパク質のバ インディン（ｂｉｎｄｉｎ）により仲介され（Ｇｌａｂｅｅ＋　ａｔ、、　＋９ ８２．　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　９４：１２３；　Ｖａｃｑｕｉｅｒ　ａ ｎｄ　Ｍｏｙ、　１９７８゜Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　 Ｕ、Ｓ、Ａ、　７４：２４５６）、該タンパク質は光体反応が起こった後でのみ 結合に利用される。これは、光体反応を受けた精子が卵と結合する能力をもたな い哺乳動物の受精とは相違している。

哺乳動物の精子表面タンパク質の多くは、現在のところ、卵と結合する過程で存 在しうるバインディン類似体と見なされている。

これらには次のものが含まれる； Ｂｌｅｉｌ　とＷａｓｓｅｒｍａｎ　（１９９０，Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、　８７ ：５５６３−５５６７）は、ＺＰ３（光体無傷精子の一部レセプターとして作用 すると思われるマウス卵の透明帯の表面に存在する８３．０００ダルトンの糖タ ンパク質）と結合するマウス精子の５６．０００ダルトンのタンパク質を同定し た。この５６．０００ダルトンタンパク質は、　１６１で標識した光活性化可能 なヘテロ三官能性架橋剤に結合させたＺＰ３と精子との光親和性架橋により放射 性標識されることが見いだされ、ＺＰ３−アフィニティーカラムに非常に強固に 結合することが観察された。

ＰＨ−２０は、２つの異なる集団として存在すると思われる約６０、０００ダル トンのモルモット精子の膜タンパク質である（Ｃａｒｒｏｎａｎｄ　Ｓａｌｉｎ ｇ、　”Ｅｌｅｍｅｎｔｓ　ｏｆ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔ ｉｏｎ　”　、第１■巻、　Ｗａｓｓａｒｍａｎ編集、　ＣＲＣＰｒｅｓｓ、ボ ストン、第１４７−１７６頁）。精巣上体尾の精子において、ＰＨ−２０の発現 は光体後領域の表面と光体内膜の管腔表面に限られることが見いだされた（Ｐｈ ｅｌｐｓａｎｄ　Ｍｙｌｅｓ、　１９８７．　Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、　１２３： ６３）。これら２つの集団はそれぞれＰＨ−２０，ｆｆｉおよびＰＨ−２０，、 と命名され、ＰＨ−２０１，が全体の約７０％を占めている（Ｃｏｗａｎ　ｅｔ 　ａｌ、、　１９８７．　Ｊ。

Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　１０３：１２８９）　。ＰＨ−２０に対するモノクロー ナル抗体は、光体反応を起こした（光体が無傷ではない）モルモット精子の相同 な透明帯への結合を濃度依存的にブロックすることが観察された（Ｐｒｉｍａｋ ｏｆｆ　ｅｔ　ａｔ、、　１９８８．　Ｎａｔｕｒｅ　３３５：５４３）。

受精抗原１　（ＦＡ−１）は、最初にＭＡ２４モノクローナル抗体によって同定 された、ヒトとマウスの両生類細胞において見いだされた精子特異的糖タンパク 質である（Ｃａｒｒｏｎ　ａｎｄ　Ｓａｌｉｎｇ。

“Ｅｌｅｍｅｎｔｓ　ｏｆ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ”、第１１巻。

Ｗａｓｓａｒｍａｎ編集、　ＣＲＣＰｒｅｓｓ、ボストン、第１４７−１７６頁 ；　Ｎａｚ　ｅｔａｔ、、　１９８４．５ｃｉｅｎｃｅ　２２５：３４２）。Ｍ Ａ２４モノクローナル抗体は４６、０００ダルトン形態に二量体化しうる２３． ０００ダルトンのモノマーを認識し、精子頭部の光体後領域と尾の中片部および 主部に存在することが見いだされた（同上）。ＭＡ２４は透明帯のないハムスタ ー卵のヒト精子侵入およびマウス透明帯からのマウス精子侵入を阻止することが 観察された（同上）。

Ｍ４２抗原はマウス精子の光体稜（ａｃｒｏｓｏｍａｌ　ｃｒｅｓｔ）に存在す る高分子量（約２２０．０００ダルトン）タンパク質である（Ｃａｒｒｏｎａｎ ｄ　Ｓａｌｉｎｇ、“Ｅｌｅｍｅｎｔｓ　ｏｆ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｆｅｒｔ ｉｌｉｚａｔｉｏｎ”、第１■巻、　Ｗａｓｓａｒｍａｎ編集、　ＣＲＣＰｒｅ ｓｓ、ボストン、第１．４７−１７６頁；Ｓａｔｉｎｇ　ａｎｄ　Ｌａｋｏｓｋ ｉ、　１９８５．　Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｐｒｏｄ、　３３：５２７）　ｏ　Ｍ　４ ２モノクローナル抗体は、透明帯への精子の結合または侵入を妨げることなく、 光体反応の誘導を阻止するよってある（Ｓａｌｉｎｇ、　１９８６゜Ｄｅｖ、　 Ｂｉｏｌ、　＋３２：１７４）。

ＰＩ−Ｉ−３０モノクローナル抗体は、モルモット精子の光体後領域に存在する 標的抗原に結合し、かつ透明帯のないモルモット卵の受精を濃度依存的に抑制す ることが判明した。ＰＨ−３０抗体は分子量６０．０００および４４．０００ダ ルトンの２つのポリペプチドと結合するようだ（Ｃａｒｒｏｎ　ａｎｄ　Ｓａｔ ｉｎｇ、　”Ｅｌｅｍｅｎｔｓ　ｏｆＭａｍｍａｌｉａｎ　Ｆｅｒｔｉｌｉｚａ ｔｉｏｎ″、第１１Ｌ　Ｗａｓｓａｒｍａｎ編集、　ＣＲＣＰｒｅｓｓ、ボスト ン、第１４７−１７６頁；　Ｐｒｉｍａｋｏｆｆ　ａｎｄ　Ｍｙｌｅｓ、　１９ ８３゜Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、　９８：４１７；　Ｐｒｉｍａｋｏｆｆ　ｅｔ　ａ ｌ、、　１９８７．　Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ。

１０４：１４１）。

Ｍ２９２９モノクローナル抗、マウス精子頭部の赤道領域にある約４０．０００ −６０．０００ダルトンの分子量を有する標的抗原に結合することが見いだされ た。Ｍ２９抗体はいろいろな種の精子と交差反応する　（Ｃａｒｒｏｎ　ａｎｄ 　Ｓａｌｉｎｇ、　”Ｅｌｅｍｅｎｔｓ　ｏｆ　ＭａｍｍａｌｉａｎＦｅｒｔｉ ｌｉＺａｔｉＯｎ″、第１Ｉ巻、　Ｗａｓｓａｒｍａｎ編集、　ＣＲＣＰｒｅｓ ｓ、ボストン、第１４７−１７６頁；　Ｓａｌｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８ ５．　Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｐｒｏｄ、　３３：５１５；　Ｓａｌｉｎｇ、　１９８ ６．　Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、　１１７：５１１−５１９）。

ＹＷＫ　ＩＩは対応するＹＷＫ　ＩＩモノクローナル抗体を使ってイムノアフィ ニティークロマトグラフィーによりヒト精子から同定された　（Ｃａｒｒｏｎ　 ａｎｄ　Ｓａｌｉｎｇ、　”Ｅｌｅｍｅｎｔｓ　ｏｆ　ＭａｍｍａｌｉａｎＦｅ ｒｔｉｌｉＺａｔｉＯｎ”、第１＋巻、　Ｗａｓｓａｒｍａｎ編集、　ＣＲＣＰ ｒｅｓｓ、ボストン、第１４７−１７６頁；　Ｙａｎ　ｅｔ　ａｔ、、　１９８ ７．　Ａｒｃｈ、　Ａｎｄｒｏｌ、　１８：２４５）。ＹＷＫ　Ｉ＋抗原は６０ ．０００および／または７２．０００ダルトンの分子量をもつようであり、ラク トフェリンと関係があるかもしれない（同上）。

ＡＰｚ　（イノシシ精子の原形質膜一体化タンパク質）はＺＰ３のブタ同等物を 介する卵への精子の付着に関与することが観察された（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ　ａｎ ｄ　ｔ（ｕｎｔ、　１９８９．　Ｇａｍｅｔｅ　Ｒｅｓ、　２３：１０３；Ｐｅ ｔｅｒｓｏｎ　ａｎｄ　１ｌｕｎｔ、　１９８９．　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ 、　１０９：１２５ａ　ａｂｓｔｒａｃｔｎｏ、６７３）。

ＬｅｙｔｏｎとＳａｔｉｎｇ　（１９８９，Ｃｅ１ｌ　５７：１１２３−１１３ ０）は、分離した精子タンパク質のプロットへの放射性標識したネズミ透明帯ま たは精製ＺＰ３の結合について研究し、９５．０００および４２．０００ダルト ンの分子量を有する２つの透明帯結合タンパク質を同定した。また、ＺＰ３に結 合する９５．０００ダルトンタンパク質は抗ホスホチロシン抗体と反応すること が観察された。９５．０００ダルトンタンパク質はＺＰ３によって精子表面上で 凝集され、これによりチロシンキナーゼ活性を刺激し、そして光体エキソサイト ーシスを引き起こすことが示唆された。

精子のＺＰ３結合タンパク質の候補として提案された分子に関する池の報告書と して、分子量約５７．０００−６０．０００ダルトンを有するマウス精子のガラ クトシルトランスフエラーゼに関するＭａｃｅｋａｎｄ　５ｈｕｒ　（１９８８ ，Ｇａｍｅｔｅ　Ｒｅｓ、２０：９３−１０９）ＨＲａｍら　（１９８９゜Ｇａ ｍｅｔｅ　Ｒｅｓ、２２：３２１−３３２）Ｈｌｌｕａｎｇら　（１９８２，Ｇ ａｍｅｔｅ　Ｒｅｓ、５：３５５−３６１）：　Ｔｏｐｆｅｒ−Ｐｅｔｅｒｓｏ ｎら（１９８５，旧ｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　８３：１３９−１４５）；分子 量約４９．０００−５４．０００ダルトンを有するラット精子のガラクトース結 合タンパク質に関するＡｂｄｕｌｌａｈ　ａｎｄ　Ｋｉｅｒｓｚｅｎｂａｕｍ（ ＋９８９．　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、１０８：３６７−３７５）；　Ｔｕｌ ｓｉａｎｉら　（１９８９，Ｊ。

Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　１０９：１２５７−１２６７）；分子量５３．０００を 有するイノシシ精子ブロアクロシンに関するＪｏｎｅｓら（１９８８，Ｄｅｖｅ ｌｏｐｍｅｎｔ　１０２ニア８ｌ−７９２）＋　Ｓａｌｉｎｇ　（１９８１，Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Δｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７８：６２３１− ６２３５）；　Ｂｅｎａｕ　ａｎｄ　５ｔｏｒｅｙ　（１９８７，Ｂｉｏｌ、　 Ｒｅｐｒｏｄ、　３６：２８２−２９２）；　Ｏ’Ｒａｎｄら　（１９８５，Ｊ 、ＥＸｐ、Ｚｏｏｌ、２３５：４２３−４２８）＋　Ｐｅｔｅｒｓｏｎら（＋９ ８５．　Ｇａｍｅｔｅ　Ｒｅｓ、　１２：９ｌ−１００）；　５ｕｌｌｉｖａｎ 　ａｎｄ　Ｂｌｅａｕ　（１９８５゜Ｇａｍｅｔｅ　Ｒｅｓ、　１２：１０１− １１６）；およびＢｒｏｗｎ　ａｎｄ　Ｊｏｎｅｓ　（１９８７゜Ｄｅｖｅｌｏ ｐｍｅｎｔ　９９：３３３−３３９）を挙げることができる。しかしながら、本 発明以前に、ＺＰ３結合タンパク質を決定的に同定したものは雌雄両方の免疫系 は精子を異物として認識する（Ｃａｒｒｏｎ　ａｎｄＳａｌ　ｉｎｇ、“Ｅｌｅ ｍｅｎｔｓ　ｏｆ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　”　、 第１＋巻。

Ｗａｓｓａｒｍａｎ編集、　ＣＲＣＰｒｅｓｓ、ボストン、第１４７−１７６頁 ）。従って、受精過程に関与する精子成分は避妊法において免疫学的標的として 役立つだろう　（Ｎａｚ、　１９９０．　Ｃｕｒｒ、　０ｐｉｎｉｏｎ　Ｉｍｍ ｕｎｏｌ、　２ニア４８−７５１；　Ｐｒｉｍａｋｏｆｆ　ｅｔ　ａｌ、、　１ ９８８．　Ｎａｔｕｒｅ　３３５：５４３−５４６；　ｌｓｏｊｉｍａ。

１９９０、Ｃｕｒｒ、０ｐｉｎｉｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、２ニア５２−７５６； 　Ｎａｚ　ａｎｄ　Ｍｅｎｇｅ。

１９９０、　Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　５：５１１−５１８；　 Ｔａｌｗａｒ　ａｎｄ　Ｒａｇｈｕｐａｔｈｙ。

１９８９、　Ｖａｃｃｉｎｅ　７：９７−１０１；　Ｇｒｉｆｆｉｎ、　１９９ １．　ｌ（ｕｍａｎ　Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ６：１６６−１７２；　Ｉｓｏ ｊｉｍａ　ｅｔ　ａｔ、、１９８６．　Ａｍ、Ｊ、Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ［ ｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１０：９Ｏ−９２）にのような方法は 、ホルモンの投与を必要としない点とホルモン療法の副作用を回避できる点で現 在使われている避妊薬よりも優れていることが分かるだろう。

精子に対する抗体媒介免疫反応は、免疫系が雌雄両方の生殖路のいろいろな位置 で精子に接近する可能性があるので、多くの部位のいずれか１つで受精を妨害し うるだろう（同上）。例えば、精子は凝集または不動化のような非特異的メカニ ズムにより機能的集団から排除されるだろう（同上）。また、受精過程の一部で ある特定の細胞現象が妨げられるだろう（同上）。

全精子および精子抽出物は動物実験において妊娠を防止するのに効果的であると 分かったが、様々な理由によりこのような調製物を実際的なレベルで用いること はできないだろう　（同上およびＮａｚ、　１９８８．　Ａｍ、　Ｊ、　Ｒｅｐ ｒｏｄ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１６６：２１）　ｏ　１種または２゜３種の精子 タンパク質を提示するワクチンがより望ましい。しかし、多くの精子抗原（上記 参照）の同定にもかかわらず、はとんどはｉｎ　ｖｉｖｏで中和抗体の標的であ ることが実証されておらず、能動免疫研究を可能にする程度に精製されていない （Ｃａｒｒｏｎ　ａｎｄＳａｌｉｎｇ、“Ｅｌｅｍｅｎｔｓ　ｏｆ　Ｍａｍｍａ ｌｉａｎ　Ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ″、第１１巻。

Ｗａｓｓａｒｍａｎ編集、　ＣＲＣＰｒｅｓｓ、ボストン、第１４７−１７６頁 ）。モルモット抗原ＰＩ（−２０、マウスおよびヒト生殖細胞のＦＡ−１抗原、 並びに精子表面に存在する精子特異的ミトコンドリア抗原ＬＤＨ−Ｃ４は、ｉｎ 　ｖｉｔｒｏ受精阻止および能動免疫プロトコールでの不妊の誘導により実証さ れた中和抗体の既知標的である３つの抗原に相当する（同上およびＧｏｌｄｂｅ ｒｇ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８１．　“ｌｕｍａｎＲｅｐｒＯｄｕＣｔ　ｉｏｎ ″、Ｓｅｍｍ　ａｎｄ　Ｍｅｔｔｌｅｒ編集、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ−ＮｏｒｔｈＨ ｏｌｌａｎｄ、アムステルダム、第３６０頁；　５ｈｅｌｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、 、　１９８３゜Ｊ、　Ｒｅｐｒｏｄ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　５ｕｐｐ１．７：２６ ；　５ｈｅｌｔｏｎ　ａｎｄ　Ｇｏｌｄｂｅｒｇ。

１９８６、　Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｐｒｏｄ、　３５：８７３）。

２．４．　を−複合体および精巣特異的遺伝子を一複合体（マウス染色体１７の 近位領域に存在する遺伝子群）は胚発生と生殖に関係しており、単一遺伝子変異 または複数の遺伝子座の複雑な相互作用により生じる表現型を発現する。例えば 、単一のｔ一致死遺伝子についてのホモ接合は特定の段階で発生している胚の停 止をもたらし、一方、複数の遺伝子座での変異はへテロ接合ｔハブロタイブ保有 雄（１／＋）において伝達比のゆがみを引き起こし、あるいはｔハブロタイブに ついて二重にヘテロ接合性である雄（’ｔ°／ｌｒ）において生殖不能を引き起 こす（Ｋｌｅｉｎ、　１９８６．“Ｎａｔｕｒａｌ　Ｈｉｓｔｏｒｙ　ｏｆ　ｔ ｈｅ　ＭａｊｏｒＨｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　Ｃｏｍｐｌｅｘ”、 　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　ＮｅｗＹｏｒｋ；　５ｉｌｖｅｒ、 　１９８５．　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、　１９：１７９−２０８およ び下記参照）。

積厚細胞（精子を形成する幹細胞）は精器細胞と呼ばれる未分化の精子形成細胞 を生じさせる。各精器細胞は２回の減数分裂を経て４つの半数体精子を形成する 。その後、半数体精子は成熟精子へと分化する。精子形成と呼ばれる、この全過 程は精巣の精細管において行われる。を−複合体と関連した遺伝子、あるいは染 色体１７に存在する遺伝子の多くはネズミの精子形成にかなりの影響を与えるこ とが見いだされた。ここではそれらが発現する表現型に従ってそれらを分類する ことにする。

初めに、１組のｔ−ハブロタイブ遺伝子は、を−保有精子にそれらの野生型減数 分裂パートナ−を不活性化させるように協力して働くことが見いだされた（Ｓｅ ｉｔｚ　ａｎｄ　Ｂｅｎｎｅｔｔ、　１９８５．　Ｎａｔｕｒｅ３１３：１４３ −１４４；　５ｉｌｖｅｒ　ａｎｄ　０１ｄｓ−Ｃ１ａｒｋｅ、　１９８４．　 Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、　１０５：２５０−２５２）。その結果、ｔ−ハブロタイ ブについてヘテロ接合性の雄はその子孫の９０％以上にｔ−染色体を伝達するだ ろう。この現象は伝達比ゆがみ（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ　ｒａｔｉｏ　ｄｉ ｓｔｏｒｔｉｏｎ：ＴＲＤ）と呼ばれる。同じ遺伝子型の雌マウスは古典的なメ ンデルの分布に従って子孫をつくるので、ＴＲＤは胚致死性の結果ではない。

精子形成に影響を及ぼす２番目の種類の遺伝子は２つの完全なｔハブロタイブを 有する雄マウスに見られる。Ｌｙｏｎは、ｉ　−ノｚプロタイプが少なくとも２ つのｔ−複合体不妊遺伝子（Ｔｃｓ’）を保有することを見つけた（Ｌｙｏｎ、 　１９８６．　Ｃｅ１ｌ　４４：３５７−３６３）。いずれか一方についてのホ モ接合は雄の生殖能を損なうらしかった。

精子形成に影響を与える遺伝子の３番目の種類は異種間交雑、つまりＭｕｓ　ｍ ｕｓｃｕｌｕｓとＭｕｓ　ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ　ＳＭｕｓ　ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｉｕｓ（Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓとＭｕｓ　ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓとの混合 株）とＭｕｓ　５ｐｒｅｔｕｓ。

およびｔ−ハブロタイブ保有Ｍｕｓ　ＩａｂＯｒａｔＯｒｉＵＳとＭｕｓ　５ｐ ｒｅｔｕｓの株を交配させることによって発見された。これらの遺伝子座は、そ れらがこれらの交雑のＦｌ雄に不妊を生じさせるので、交雑不妊（Ｈｓｔ）遺伝 子座と呼ばれる。これまでに、少なくとも２つのＨｓｔ遺伝子がｔ−複合体にあ ることが分かつている（Ｆｏｒｅｊｔａｎｄ　１ｖａｎｙｉ、　１９７５．　Ｇ ｅｎｅｔ、　Ｒｅｓ、　２４：１８９−２０６）。このクラスの遺伝子は、ＴＲ Ｄに関係した遺伝子と同様に、動物が遺伝子座についてヘテロ接合性であるか、 または異なる遺伝的背景のもとてその遺伝子座についてホモ接合性であるときだ け、それらの作用を発現する。

精子形成の間に発現される最後の２種類の遺伝子は、単純な劣性単一因子変異で あるクエーキング（ｑｕａｋｉｎｇ：　Ｑ　ｋ　）　（Ｂｅｎｎｅｔｔｅｔ　ａ ｌ、、　１９７１．　Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｐｒｏｄ、　５：３Ｏ−５８）　、およ び丸い精子として知られる精子形成の段階で発現されるホスホグリセレートキナ ーゼ２　（Ｐ　ｇ　ｋ　−２）　（Ｋｒａｍｅｒ　ａｎｄ　Ｅｒ１ｃｋｓｏｎ、 　１９８１．　Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ。

８７：３７−４５）である。これらの遺伝子は初めの３つのクラスの遺伝子が関 与する過程あるいは経路に加わらないよってある。

雄マウスの生殖細胞分化におけるマウス染色体１７の近位領域の役割をさらに調 ぺるために、５ａｒｖｅｔｎｉｃｋら　（１９８９゜Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉ ｃｓ　３０：３４−４１）は、精巣特異的に発現されるこのゲノム領域からの遺 伝子をクローン化し、特性決定を行った。簡単に述べると、約２０．０００クロ ーンのマウス精巣ｃＤＮＡライブラリーを、マウス精巣または肝臓から単離した ポリ（Ａ）＋ＲＮＡに相補的なｃＤＮＡクローンを用いてスクリーニングし、そ して精巣プローブに選択的にハイブリダイズする１６のｃＤＮＡクローンを同定 した。ノーザンブロットハイブリダイゼーションにより、これらのクローンの１ ５に対応する転写物の精巣特異的発現を確認した。ハムスターの遺伝的背景でマ ウス染色体１７に特徴がある体細胞ハイブリッドから調製したＤＮＡを用いてサ ザンプロット分析を行うことにより、ただ１つのクローン（ｐＮＳ２と命名）が 染色体１７にあることが分かった。ｐＮｓ２は比較的大きい遺伝子Ｄ１７Ｓｉｌ ｌの一部を含むことが判明した。この遺伝子の配列解析から、（ｉ）二本鎖のヘ アピン様二次構造を形成しうる対応ＲＮＡ転写物内にある相補的な組の交互のプ リンおよびピリミジン残基；および（ｉｉ　）転写物自体に存在する最長の可能 なオーブン・リーディング・フレームのサイズの３倍であると思われる精巣転写 物に相補的な仮説上の長いオーブン・リーディング・フレーム；が実証された。

配列解析に基づいた精巣転写物は、せいぜい長さが１８７アミノ酸残基（約２１ ．０００ダルトンの分子量に相当）のポリペプチドをコードすると予想された。

あとで、この転写物は５０６アミノ酸（５７，０００の分子量に相当）をコード するオーブン・リーディング・フレームを実際に含むことが分かった（Ｓａｒｖ ｅｔｎｉｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０．　Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　 ３１：２８３−２８４）。先の刊行物での過小評価は配列決定の誤りによるもの だった。

ｌ１ｉｂｂｉｎｓら（１９８９，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　５：ｌ３９−１４３）は、 マウスＤｉ　７Ｓｉｌｌ遺伝子のヒト相同体のクローニングを報告している。体 細胞ハイブリッド分析により、ヒト遺伝子は染色体６の短腕（ｐＨｐ２１．１） に存在することが分かった。

３、　発明の概要 本発明は、成熟した精子の表面に存在し、哺乳動物の受精の際に卵への精子の結 合に関与する、を−複合体関連精巣発現−１（ｔｃｔｅ−１）と呼ばれるタンパ ク質に関する。本発明は、少なくとも一部が、ｔｃｔｅ−１タンパク質をコード するヒトおよびマウスｃＤＮＡのクローニング並びに特性決定に基づいている。

本発明は、ヒトＴＣＴＥ−１配列を含めて、ｔｃｔｅ−１をコードする実質的に 精製した核酸配列を提供する。このような核酸配列はプロモーター配列あるいは 第２遺伝子の少なくとも一部に連結させても、核酸ベクター中に挿入しても、ト ランスジェニック動物内にトランスジーン（導入遺伝子）として存在させてもよ い。

本発明は、さらに、ヒトＴＣＴＥ−１タンパク質を含めて、実質的に精製したｔ ｃｔｅ−１タンパク質、並びにその免疫原性断片および誘導体を提供する。

他の態様において、本発明は、ｔｃｔｅ−１タンパク質またはその免疫原性断片 もしくは誘導体を含有するワクチンを提供する。

また、本発明は、ｔ、ｃｔｅ−１タンパク質またはその免疫原性断片をコードす る遺伝子を保有している非病原性ウィルスを含有するワクチンを提供する。

本発明は、さらに、避妊を必要とする対象者に、（ｉ）ｔｃｔｅ−１タンパク質 またはその断片もしくは誘導体、あるいは（ｉｉ）ｔｃｔｅ−１またはその免疫 原性断片をコードする遺伝子を保有しているウィルス、を含有する免疫原性組成 物を投与することからなる避妊方法を提供する。

本発明は、また、ｔｃｔｅ−１に対する抗体（モノクローナル抗体を含む）、お よび有効量の上記抗体を対象者に投与することからなる避妊方法を提供する。

さらに、本発明は、ｔｃｔｅ−ｔタンパク質の発現および／または機能の異常を 検出することからなる不妊症の判定および／または診断方法、並びにこのような 方法に用いるキットを提供する。

更なる態様において、本発明は、ｔｃｔｅ−１タンパク質の発現および／または 機能の異常を修正することからなる不妊症の治療方法を提供する。

３．１．　略語の説明 ｔｃｔｅ−１を一複合体関連精巣発現−１、種に無関係Ｔｃｔｅ−１ネズミを一 複合体関連精巣発現−１ＴＣＴＥ−１ヒトを一複合体関連精巣発現−１４、図面 の説明 図１．Ｔｃｔｅ−１およびＴＣＴＥ−１ゲノムクローンの制限地図。

マウスＴｃｔｅ−１遺伝子座はｔｗ　ｔ、　ｕ　ｂ　ｌ　／　ｊ　Ｗ　Ｓ　？ウ スコスミドライブラリーからの２つの重複するコスミドにクローニングした（Ａ ）。ヒトＴＣＴＥ−１遺伝子座はヒトゲノムライブラリーからの２つの重複する ファーンクローンにクローニングした（Ｂ）。

黒の太線はｃＤＮＡとハイブリダイズする領域を表すが、インドロンおよびエク ソンの正確な接合部は決定しなかった。酵素Ｅｃｏ旧、ＢａｍＨｌ　、Ｘｈｏｌ 、５ａ１１、Ｃ１ａｌ、ｌ１ｉｎｄｌｌｌおよびＸｂａ　Ｉにより観察された制 限部位の位置は、下の長方形のボックス内に示した記号で示しである。拡張領域 は稀にしか切断しない制限酵素Ｎｒｕｌ　、　Ｂｓ５ｌｌｌＬ　５ａｃｌｌおよ びＸｈｏ　Ｉを用いてさらに分析し、これらの酵素を四角のボックス内に示した 略号で示しである。転写の方向は左から右の方向である。

図２．３つのクラスのヒトＴＣＴＥ−１ｃＤＮＡの模式図。

ヒトＴＣＴＥ−１ｃＤＮＡは、プローブとしてマウスＴｃｔｅ−１０ＤＮＡクロ ーンを用いてヒト精巣ライブラリーをスクリーニングすることにより得た。３つ のクラスのクローンが得られた。

同じ模様のボックスは、個々のクローンが同じ配列を共有することを示す。ＴＣ ＴＥ−１クローンの領域に隣接するＤＮＡ配列には下線が引いてあり、ポリＡ付 加配列でありうる配列はボックスで囲っである。スケールを線で示す。

図３．ＴＣＴＥ−１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列および推定上のアミノ酸配列。

２つのヒトＴＣＴＥ−１ｃＤＮＡクローン、ｐＨＩ　（配列番号：Ｉ）およびｐ ｈＴＣＴＥ−１（配列番号：２）のヌクレオチド配列を５゛から３゛の方向で示 してあり、数字“１″は転写物の５゛末端を表す。ｐｈＴＣＴＥ−１配列をｐＨ Ｉ配列の上に示す。配列の同一性はダッシュで示す。ｐ　Ｈ１配列はｐｈＴＣＴ Ｅ−１よりかなり小さいタンパク質をコードするので、ｐｈＴＣＴＥ−１のアミ ノ酸配列（配列番号：３）を示しである。ヌクレオチド配列のナンバリングを右 側に示し、ｐｈＴＣＴＥ−１のちのには下線が引いである。アミノ酸残基のナン バリングを左側に示す。コード領域中のパリンドローム配列および３°非翻訳領 域中の（ＣＡ／ＧＴ）繰り返しモチーフにも下線が引いである。

図４．ドツトマトリックス解析（ｄｏｔ　ｍａｔｒｉｘ　ａｎａｌｙｓｉｓ）に よるヒトＴＣＴＥ−１およびマウスＴ　ｃ　ｔ　ｅ　−１（Ｓａｒｖｅｔｎｉｃ ｋ　ｅｔ　ａｌ。

、　１９９０．１ｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　３１：２８３−２８４）のヌク レオチド配列の比較。

図５．ヒトＴＣＴＥ−１（配列番号＝４）およびマウスＴｃｔｅ−１（配列番号 ：５）のタンパク質配列の相同性。

ヒトｐｈＴＣＴＥ−１（配列番号＝２）はすべての単離物の中で最長のオーブン ・リーディング・フレームをコードする。翻訳されたオープン・リーディング・ フレームを上段に示す。比較のために、マウスタンパク質配列をヒト配列の下に 示す。線は同一性を示し、１つの点は保存的変化を表す。

図６．Ｔｃｔｅ−１およびＴＣＴＥ−１タンパク質のバイトロバシー（ｈｙｄｒ ｏｐａｔｈｙ）プロフィール。

マウスＴｃｔｅ−１（配列番号＝５）およびヒトＴＣＴＥ−１（配列番号：４） のＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ　バイトロバジ−プロフィールをそれぞれＡお よびＢに示す。タンパク質の疎水性領域はゼロの線より上に、そして親水性領域 はゼロの線より下に延びている。

図７．Ｔｃｔｅ−１およびＴＣＴＥ−１タンパク質の重複アミノ酸モチーフ。

Ｔｃｔｅ−１遺伝子の残基３３７〜４３６のポリペプチド配列（配列番号、６） およびＴＣＴＥ−１遺伝子の残基３３４〜４３３のポリペプチド配列（配列番号 ；７）をそれぞれＡおよびＢに示す。同一の残基には下線が引いである。重複モ チーフをボックスで囲っである。

図８．７ＣＴＥ−１とＴｃｔｅ−１との融合タンパク質の形成および該融合タン パク質を認識する抗体。

（Ａ）ｐ７７．１プラスミド（レーン１）、ｐ７７．３プラスミド（レーン２） 、ｐ７７．４プラスミド（レーン３）およびｐ７７．２プラスミド（レーン４） を保有する細菌からの全タンパク質溶解液。Ｍはマーカーのレーンである。

（Ｂ）ｐ７７．１保有細菌からのタンパク質溶解液の不溶性画分。

（Ｃ）マウスＴｃｔｅ−１融合タンパク質に対する抗血清による精巣細胞の細胞 上画分由来のタンパク質の免疫沈降。マウス精巣細胞（Ｔ）を単離し、［”Ｓ） −メチオニンで標識した。次に、これらの細胞に対して分画化を行って、核（Ｎ ）、細胞質および膜（Ｃ）、ミトコンドリア画分（Ｍ）を分離した。タンパク質 溶解液を調製し、抗Ｔｃｔｅ−１血清（右のパネル）または免疫前血清（左のパ ネル）を用いて沈殿させた。

図９．精巣からのｐ５６がＴｃｔｅ−１タンパク質であるという証拠。

Ａ、精巣細胞またはｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳産物からのＩ：”Ｓ）−メチオニン標 識タンパク質を免疫前血清またはアフィニティー精製した抗Ｔｃｔｅ−１抗体で 沈殿させ、５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析にかけた。

レーン１および２では、全精巣タンパク質溶解液を使用した。レーン３および４ ては、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写により作られたアンチセンス鎖Ｔｃｔ、ｅ−ＩＲＮ Ａのｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳産物を使用した。レーン５および６ては、Ｔｃｔｅ− ＩＲＮＡのセンス鎖のｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳産物を使用した。レーン１．４およ び６では、精製したウサギ免疫前１ｇＧにより沈殿させた産物を使用した。レー ン２．３および５では、アフィニティー精製した抗Ｔｃｔｅ−１抗体で沈殿させ た産物を使用した。

Ｂ、Ｖ８プロテアーゼによるｐ５６およびｐ６２の一部元ペプチドマッピング。

精巣細胞から沈殿させた放射性標識ｐ５６およびｐ６２を含有するゲル切片を最 初の５ＤＳ−ＰＡＧＥ後に切り出し、大腸菌に産生させたＴｃｔｅ−１融合タン パク質と混合し、そして２回目の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析にかけた。２回目の電気 泳動の間に２００ｎｇの■８プロテアーゼでタンパク質を消化した。

右のパネル（Ｒ）は電気泳動後のゲルのクーマシーブルー染色パターンを示し、 左のパネル（Ｌ）は同じゲルからの放射性標識ペプチドパターンである。分析し たタンパク質は次のとおりであった：レーンＡ、ｐ６２およびＴｃｔｅ−１融合 タンパク質；レーンＢ、’ｐ５６およびＴｃｔｅ−１融合タンパク質。２つの異 なる実験より得られた結果を示す。対応するバンドを線でつないである。

図１０．　ウェスタン分析により測定したＴｃｔｅ−１タンパク質の組織および 細胞上分布。

アフィニティー精製した抗Ｔｃｔｅ−１抗体（右のパネル）または免疫前ウサギ ＩｇＧ（左のパネル）を用いて、種々の組織からのタンパク質溶解液と、雄１２ ９マウスの精巣細胞および精子の異なる細胞上画分についてウェスタンブロッテ ィング分析を行った。Ｂ、脳：Ｋ、腎臓；し、肝臓；Ｓ、膵臓；Ｔ、全精巣細胞 ；ＳＰ、精子ＳＤＳ可溶性画分、ＴＭ、ＴＣおよびＴＮはそれぞれ精巣細胞のミ トコンドリア画分、細胞質画分および核両分の略号である。

図１１．　ｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼーシヨンによるＴｃｔｅ−ＩＲＮＡの 精巣における位置確認。

Ｔｃ　ｔ　ｅ−１ｃＤＮＡの３“非翻訳領域のＰｓｔｌ−ＥｃｏＲＩ断片を含む Ｂ　Ｉ　ｕｅｓｃｒ　ｉ　ｐ　を系プラスミドｐｊ２６．１を線状化し、Ｔ３お よびＴ７ボリメラーゼを用いて転写し、それぞれアンチセンス（ＡＳ）およびセ ンス（Ｓ）プローブを作製した。ＰＳ＋太糸期の精器細胞、Ｒ８，丸い精器細胞 。精巣切片に対するｉｎ　５ｉｔｕ　／％イブリダイゼーション実験は「材料お よび方法」に記載したとおりに行った。

図１２．免疫蛍光によるＴｃｔｅ−１タンパク質の精巣切片における位置確認。

オムニ（Ｏｍｎ　ｉ　）−固定したマウス精巣切片を、まず５μｇの免疫前ウサ ギｒｇＧ（対照）およびアフィニティー精製したウサギ抗Ｔｃｔｅ−１抗体（ａ −Ｔｃ　ｔ　ｅ−１）で染色し、次にビオチン結合ヤギ抗ウサギＩｇＧで処理し た。抗原−抗体複合体はＦＩＴＣ標識ストレプトアビジンを用いて検出した。核 はＤＡＰＩで染色した。Ｚｅｉｓｓ位相差蛍光顕微鏡を用いて写真を撮った。■ 。

精細管の横断面の位相差顕微鏡写真。２．同一視野のＤＡＰＩ染色パターン。３ ．同一視野のＦＩＴＣ染色１＜ターン。

図１３．免疫蛍光によるＴｃｔｅ−１タンパク質の精子における位置確認。

用いた方法は図１２で採用したものと同じであった。１．、＜ラホルムアルデヒ ドで固定した精子の位相差顕微鏡写真。２．同一視野のＤＡＰＩ染色パターン。

３、同一視野のＦＩＴＣ染色パターン。

図１４．無傷の光体の原形質膜に存在するＴｃｔｅ−１タンパク質。

図１５．Ｔｃｔｅ−１−ＬＴ）ランスジェニックマウスの分析。

Ａ、Ｔｃｔｅ−１−ＬＴ）ランスジーン構築の模式図。

マウスＴｃｔｅ−１遺伝子の５．８Ｋｂの上流領域を含むＫｐｎｌとＨｉｎｄｌ ｌｌで線状化したｐｊ５９．１プラスミドにｐＵＣＴの２゜３　Ｋｂ　Ｈｉｎｄ ｌｌｌ−Ｋｐｎｌ断片をクローニングして、Ｔｃｔｅ−１−ＬＴ融合遺伝子を構 築した。得られたプラスミドｐ３６６．１の３’　Ｋｐｎ１部位をＢａｍ１１１ 部位に変換してプラスミドｐｊ６６．２を作製した。８．ｌＫｂのＢａｍ１ｌｌ 断片を用いてトランスジェニックマウスをつくった。

８．４つのトランスジェニック系のサザン分析。

異なるトランスジェニック系からのＰｓｔｌ消化ゲノムＤＮＡを電気泳動にかけ 、プロットし、そしてＣ３２Ｐ）−ｄＣＴＰ標識大型Ｔ抗原プローブとハイブリ ダイズさせた。

Ｃ，）ランスジェニックマウスの組織からのＲＮＡのノーザンブロノト分析。

６つの組織からの全ＲＮＡｌ０μｇをノーザン分析に使用した。

Ｂ、脳；Ｋ、腎臓；し、肝臓；Ｓ、膵臓、Ｔ、精巣；Ｌｇ、肺。

図１６．標識マウスＴｃｔｅ−１プローブにハイブリダイズさせた各種動物から のＤＮＡのサザンプロット。レーン１−１２（左から右へ）のＤＮＡはそれぞれ 雌ウシ、ブタ（レーン２および３）、イヌ、ウサギ、モルモット、ヒト、サル、 ニワトリ、アフリカッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　Ｉａｅｖｉｓ）　、ゼブラフ ィッシュ（ｚｅｂｒａ　ｆｉｓｈ）および分子マーカーである。

図１７．ヒトＴＣＴＥ−］融合タンパク質（レーン２）へのモノクローナル抗体 ４Ｆ７の結合、および対照（ＴＣＴＥ−１コ一ド配列を欠くベクターにより発現 されたタンパク質）への該抗体の非結合を示すウェスタンプロット分析。

図１８．ＴＣＴＥ−１に対するポリクローナル抗血清によるヒト精子の免疫蛍光 染色。

（本頁以下余白） ５、　発明の詳細な説明 限定の目的でなく、明瞭化のために、本発明の詳細な説明を以下の項に分けて記 載する： （１）核酸； （２）タンパク質およびペプチド： （３）本発明の抗体； （４）ワクチン； （５）免疫避妊：および （６）本発明の他の利用法。

５．１．　核酸 本発明は、ヒトＴＣＴＥ−１をコードする核酸分子を含む、ｔｃｔｅ−１をコー ドする実質的に精製した核酸分子を提供する。

特に本発明は、以下のいずれかをもつ実質的に精製した核酸分子を提供する： ■）ヒトＴＣＴＥ−１に対応する図３に実質的に示す配列（配列番号、２）； ２）ＴＣＴＥ−１タンパク質のＮ−末の６０アミノ酸残基をコードする、およそ ヌクレオチド１４９がらおよそヌクレオチド３２８まで延びる部分（配列番号： ２）に対応する図３に実質的に示す配列。

３）およそヌクレオチド３２９がらおよそヌクレオチド１６７２まて延びる部分 に対応するＴＣＴＥ−１（配列番号：２）の図３に実質的に示す配列； ４）図５に実質的に示すアミノ酸配列（配列番号：４）を有するヒトＴＣＴＥ− １タンパク質をコードする配列；５）アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク ションに受託番号７５０９５て寄託しであるｐｈＴｃＴＥｌ中に含まれる配列（ 配列番号；２）； ６）アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに受託番号７５０９７て寄 託しであるＩ　ｈＴＣＴＥ　Ｉ　ｇ中に含まれる配列：および ７）アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに受託番号７５０９６て寄 託しであるｐｍＴＣＴＥＩ中に含まれる配列。

本発明の核酸分子は、これに限定されるものではないが、プラスミド、コスミド 、バクテリオファージまたはウィルスを含む核酸ベクター中に含まれることがで き、あるいは本発明の核酸分子を非ヒトトランスジェニック動物中にトランスジ ーンを作製するために用いる場合には、外来ゲノム中に含まれることができる。

“実質的に示す”の語は、本発明の核酸分子が全配列の５％を越えない残基数で 図に示す配列と配列が異なるかも知れないことを意味すると解釈されるべきであ る。

組換え体がｔｃｔｅ−１を発現できるように、本発明の核酸分子を発現ベクター 中に挿入することが好ましい。このようなベクターはｔｃｔｅ−１の発現を制御 するのに用いられつるプロモーター要素をも含んでいることが好ましい。

本発明は、ベクターに含まれるか、または含まれていないかもしれないプロモー ター要素に連結した実質的に純粋なｔ　ｃ　ｔ　ｅ　−１核酸分子を提供する。

これに限定するものではないが、適当なプロモーター要素にはホスホグリセリン 酸キナーゼ２プロモーターのような精子または精巣特異的プロモーター、ならび に精子または精巣特異的ではない以下のプロモーター：ＣＭＶプロモーター、Ｓ Ｖ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｒｎｏｉｓｔ　ａｎｄ　Ｃｈａｍｂｏｎ、　 １９８１、　Ｎａｔｕｒｅ　２９０＋３０４−３１０）　、ラウス肉腫ウィルス の３“の長い末端反復配列中に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ　ｅｔ 　ａｌ、、　１９８０゜Ｃｅ１ｌ　２２ニア８７−７９７）　、ヘルペスチミジ ンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８１．　Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７８：１４４０−１ ４４５　）　、メタロチオネイン遺伝子の制御配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ　ｅｔａ ｔ、、　１９８２．　Ｎａｔｕｒｅ　２９６：３９−４２）　；β−ラクタマー ゼプロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ　ｅｔ　ａｌ、、　１９７８． 　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ。

Ｓ、Ａ、　７５：３７２７−３７３１　）　、またはｔａｃプロモーター（Ｄｅ Ｂｏｅｒ　ｅｔａｔ、、　１９８３．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８０：２ｌ−２５）のような真核発現ベクター（“組 換えバクテリアからの有用なタンパク質”　、５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒ ｉｃａｎ、　１９８０．２４２＋７４−９４も参照されたい）；Ｇａ１４プロモ ーター、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ　（ホス ホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリ性ホスファターゼプロモータ ーのような酵母またはその他の菌由来のプロモーター要素、および組織特異性を 示し、かつトランスジェニック動物に用いられている以下の動物転写制御領域： 膵臓豚房細胞で活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔ　ｅｒ　ａｔ 、、　＋９８４．　Ｃｅ１ｌ　３８：６３９−６４６；　０ｒｎｉｔｚ　ｅｔ　 ａｌ、、　１９８６゜Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ、　Ｑ ｕａｎｔ、　Ｂｉｏｌ、　５０：３９９−４０９；　ＭａｃＤｏｎａｌｄ、　１ ９８７．　Ｉｌｅｐａｌｏｌｏｇｙ　７：４２５−５１５）　；膵臓β細胞で活 性なインシュリン遺伝子制御領域（ｔ（ａｎａｈａｎ、　１９８５．　Ｎａｔｕ ｒｅ　３１５：１１５−１２２）、リンパ球細胞で活性な免疫グロブリン遺伝子 制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８４．　Ｃｅ１ｌ　３ ８：６４７−６５８；　Ａｄａｍｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５．　Ｎａｔｕ ｒｅ　３１８：５３３−５３８；　Ａｌｅｘａｎｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９ ８７．　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ。

７・１４３６−１４４４）　、精巣、胸、リンパ球およびマスト細胞で活性なマ ウス乳癌ウィルス制御領域（Ｌｅｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６．　Ｃｅ１ ｌ　４５：４８５−４９５）　、肝臓で活性なアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉ ｎｋｅｒｔ　ｅｔａｌ、、　１９８７．　Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌ、　 ｌ：２６８−２７６）　、肝臓で活性なα−フェトプロティン遺伝子制御領域（ Ｋｒｕｍｌａｕｆ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５．　Ｍｏ１、　Ｃｅ１１．　Ｂｉ ｏｌ、　５：１６３９−１６４８；　Ｈａｍｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７ ．５ｃｉｅｎｃｅ　２３５：５３−５８）　；肝臓で活性なαｌ−ｌ−抗トリプ シン子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７．　Ｇｅｎｅｓ　ａ ｎｄ　Ｄｅｖｅｌ、　１：１６１−１７１）　、骨髄細胞で活性なβ−グロビン 遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５．　Ｎａ１ｕｒｅ　 ３１５：３３８−３４０：　Ｋｏｌｌｉａｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６．　Ｃ ｅ１ｌ　４６：８９−９４）　；脳の乏突起神経膠細胞で活性なミニリン塩基性 タンパク賀遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ　ｅｔ　ａｌ、、　＋９８７．　 Ｃｅ１ｌ　４８ニア０３−７１２）　；骨格筋で活性なミオンンＬ鎖−２遺伝子 制御領域（Ｓａｎｉ、　１９８５．　Ｎａ１ｕｒｅ３１４：２８３−２８６）　 、および視床下部で活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａ ｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６．５ｃｉｅｎｃｅ　２３４：１３７２−１３ ７８）を含む。

プロモーターと連結したｔ、　ｃ　ｔ　ｅ　−１をコードする核酸分子に加えて 、本発明は、ｔｃｔｅ−１をコードし、かつ例えば融合タンパク質をコードする 別の遺伝子の少なくとも一部と連結した核酸分子も提供する。このような構築物 はベクター分子中に含まれていても、含まれていなくてもよい。例えば、ｔｃｔ ｅ−１遺伝子、またはその一部は免疫グロブリン分子、またはその一部をコード する核酸と連結することができる。

本発明はさらに、長さが少なくとも約ＩＯ塩基対であり、かつ（１）図３に実質 的に示すＴＣＴＥ−１に対する核酸配列（配列番号＝２）の一部に対応する、あ るいは（２）図５に実質的に示すＴＣＴＥ−１に対するアミノ酸配列（配列番号 ：４）の一部をコードする、実質的に精製した核酸分子を提供する。このような 分子はプロモーターおよび／または別の遺伝子の少なくとも一部と連結していて もよく、また核酸ベクター中に含まれていてもよい。

本発明はさらに、その中に本発明の核酸分子を導入した微生物、遺伝子操作した 細胞、またはトランスジェニック動物を提供する。

核酸分子は当業界で公知のいかなる方法を用いて微生物、細胞またはトランスジ ェニック動物中に導入してもよく、その方法にはマイクロインジェクション、ト ランスフェクション、形質導入、エレクトロポレーション等を含むが、これに限 定されない。あるいはこのような方法で本発明の核酸分子を受け取った親の微生 物、細胞またはトランスジェニック動物から核酸分子が受け継がれる。

本発明はさらに、ＴＣＴＥ−１またはＴ　ｃ　ｔ　ｅ−１（Ｓａｒｖｅｔｎｉｃ ｋ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０．　Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　３１：２８ ３−２８４）のＣ−末端側半分と少なくとも８０％相同なタンパク質をコードす る別の種のｔｃｔｅ−１をコードする配列に対応する実質的に精製した核酸分子 を提供する。

５．２、　タンパク質およびペプチド 本発明は実質的に精製したｔｃｔｅ−１タンパク質およびペプチド分子、ならび にこのような分子の誘導体および機能的な等価物を提供する。このセクションに 記載するタンパク質の全てをｔｃｔｅ−１タンパク質といってもよい。

特に、本発明は以下のものを提供する：（１）ヒトＴＣＴＥ−１（配列番号；４ ）について図５に実質的に示す配列を有する実質的に精製したタンパク質：（２ ）ヒトＴＣＴＥ−１（配列番号：４）についてアミノ酸ｌから６０に延びる部分 に対する図５に実質的に示す配列を有する実質的に精製したタンパク質： （３）ヒトＴＣＴＥ−１（配列番号＝４）についてアミノ酸６１から５０３に延 びる部分に対する図５に実質的に示す配列を有する実質的に精製したタンパク質 ； （４）化学的修飾またはアジュバントとの同時投与によって免疫原性を与えられ たタンパク質の断片を含む、ヒトＴＣＴＥ−１（配列番号・４）について図５に 実質的に示す配列を有する実質的に精製したタンパク質の免疫原性断片。

本発明によるタンパク質断片は長さが少なくとも５アミノ酸である。

本発明はさらに、より大きいタンパク質分子中に含まれるこのようなタンパク質 およびタンパク質断片を提供する。例えば、このようなタンパク質およびタンパ ク質断片は融合タンパク質中に含まれてもよい。

本発明はさらに、上記のタンパク質およびタンパク質断片の機能的等価物を提供 する。機能的な等偏分子においては、機能的に等価なアミノ酸残基が配列中の残 基と置換してサイレント変化をもたらすこと以外は、アミノ酸配列が図５に実質 的に示されるものである。例えば、配列中の１または２以上のアミノ酸が機能的 な等価物として作用する同様の極性をもつ他のアミノ酸で置換されてサイレント 変化をもたらす。配列中のアミノ酸の置換体は、そのアミノ酸が属するクラスの 他のものから選択することができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸はアラ ニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプ トファンおよびメチオニンを含む。極性中性アミノ酸はグリシン、セリン、スレ オニン、システィン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンを含む。正に荷 電した（塩基性）アミノ酸はアルギニン、リジンおよびヒスチジンを含む。負に 荷電した（酸性）アミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。

さらに本発明の範囲にはこのようなタンパク質またはその断片の誘導体を含み、 これにはグリコジル化、タンパク質分解、リン酸化、抗体分子または他の細胞リ ガンドへの結合などによって形成される誘導体を含む。

本発明のタンパク質およびタンパク質断片は当業界で公知の方法によって製造す ることができ、これには天然物からの精製（ポリアクリルアミドゲル電気泳動、 免疫沈降またはアフィニティークロマトグラフィーによる精製を含む）、化学合 成、および組換えＤＮＡ技法による発現系を含む。

“実質的に示す”の語は、本発明のタンパク質分子または断片が、全配列の５％ を越えない非機能的に等価な残基数で図５に示す配列と配列が異なるかもしれな いことを意味すると解釈されるべきである。機能的に等価な残基はどのような数 で置換してもよいが、全配列の２０％を越えないことが好ましい。

本発明はさらに、精子溶解物中に見られるタンパク質と実質的に同一である、ｔ ｃｔｅ−１配列の対応する長さと少なくとも８０％の相同性をもつ実質的に精製 したタンパク質を提供する。好ましい態様においては、このタンパク質は約５０ ｋＤの分子量をもつ。

本発明はまた、肝臓および脳抽出物中に見られるタンパク質と実質的に同一であ る、ｔｃｔｅ−ｉ配列の対応する長さと少なくとも７５％相同である少なくとも ２０アミノ酸の相同性領域をもつ実質的に精製したタンパク質を提供する。好ま しい態様においては、このタンパク質は約３５ｋＤの分子量をもつ。

本発明はさらに、分子のＣ−末端側半分においてＴＣＴＥ−１またはＴｃｔｅ− １と少なくとも８０％相同である他の種のｔｃｔｅ−１タンパク質を提供する。

本発明はさらに、ヒトＴＣＴＥ−１タンパク質のようなｔｃｔｅ−１タンパク質 の全てまたは一部を含む融合タンパク質を提供する。これに限定するのではない が、本発明は例えば、ＴＣＴＥ−１の全てまたは一部、ならびに免疫グロブリン タンパク質の全てまたは一部を含む融合タンパク質を提供する。本発明の別の非 限定的態様においては、融合タンパク質は、ＴＣＴＥ−１タンパク質の４３０ア ミノ酸を含むＢａｍＨＩ断片を適当な発現ベクターとライゲートして構築するこ とができる。

５．３．　本発明の抗体 本発明によると、本発明のｔｃｔｅ−１タンパク質、タンパク質断片、および誘 導体がポリクローナルまたはモノクローナルな抗体を産生ずるための免疫原とし て使用できる。

免疫応答をもたらす可能性をさらに改良するために、本発明のタンパク質のアミ ノ酸配列を分析して、増強した免疫原性と関連する分子の部分を同定することが できる。例えば、アミノ酸配列をコンピューター分析に付して、図６に示すよう に、マウスＴｃｔｅ−１およびヒトＴＣＴＥ−１のカイト・ドーリトルバイトロ バシイ（Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｊｔｌｅ　ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ　）の性質を示 す表面エピトープを同定することができる。親水性領域は疎水性領域よりも細胞 表面にさらされる可能性が高く、それゆえより免疫原性でありうる。

あるいは、異なる種からのｔｃｔｅ−ｔの波峰されるアミノ酸配列を比較して、 相対的に非相同領域を同定することができる。

これらの非相同領域は異なる種を通じて免疫原性である可能性がより高いかもし れない。例えば、マウスおよびヒトｔｃｔｅ−１のアミノ末端の６０アミノ酸残 基は異なる配列をもつと思われる。

ｔｃｔｅ−１のこれらの部分は種を通じて免疫原性であることが証明されるかも しれない。

モノクローナル抗体の製造には、抗体分子を生産するための全ての方法を用いる ことができる。例えば、コーラ−（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルスタイン（Ｍｉｌ ｓｔｅｉｎ）　（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５−４９７）によって 最初に開発されたハイブリドーマ法、ｌ・リオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドー マ法（Ｋｏｚｂｏｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８３．　１ｍｍｕｎｏｌｏｇｙＴｏ ｄａｙ　４ニア２）　、およびモノクローナル抗体生産のためのＥＢＶ−ハイブ リドーマ法（Ｃｏｌｅ　ｅｔ　ａｌ、、１９８５．　”モノクローナル抗体と癌 治療”Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、Ｉｎｃ、、　ｐｐ、７７−９６）などが本発明 の範囲に含まれる。

治療に用いるモノクローナル抗体はヒトモノクローナル抗体またはキメラヒト− マウス（または他の種）モノクローナル抗体でありうる。ヒトモノクローナル抗 体は当業界で公知の多数の方法によって生産できる（例えば、Ｔｅｎｇ　ｅｔ　 ａｌ、、　＋９８３．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８０ニア３０８−７３１２；　Ｋｏｚｂ ｏｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８３．　１ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ　４ニ ア２−７９；　０ｌｓｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８３．　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎ ｚｙｍｏｌ。

９２：３−１．６）。キメラ抗体分子は、マウス抗原結合ドメインとヒト定常部 領域とを含むように調製できる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８４ ゜Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８１：６８ ５１；　Ｔａｋｅｄａ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５、　Ｎａｔｕｒｅ　３１４： ４５２）。

ｔｃｔｅ−１のエピトープに対するポリクローナル抗体の生産には当業界で公知 の各種の方法を用いることができる。抗体の生産には各種の宿主動物にｔｃｔｅ −ｔタンパク質、もしくはその断片または誘導体を注射することによって免疫で き、該動物はウサギ、マウス、ラットなどを含むが、これに限定されない。宿主 の種に応して免疫応答を増強するために各種のアジュバントを用いることができ 、これらはフロインドアジュバント（完全および不完全）、水酸化アルミニウム などの鉱物ゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプ チド、オイルエマルション、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェ ノール、〜ｉＰＬ＋ＴＩ）Ｍ＋ＣＷＳ　（ＲＩＢＩ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）など の界面活性物質、Ｂ　ＣＧ　（Ｂａｃｉｌｌｅ　Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉ ｎ　）などの使用可能なヒトアンユバント、およびコリネバクテ　リウム・パル ブム（Ｃ。

ｒｙｎｅｂａｃ＋ｅｒｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍ）を含むが、これに限定されない。

ｔｃｔｅ−１エピトープに対する抗体の分子クローンは公知の方法によって作製 できる。組換えＤＮＡ法（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９８２ ．　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａ ｎｕａｌ、　ＧｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　ｆ＋ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ１ａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋを参照）を用 いてモノクローナル抗体分子、またはその抗原結合領域をコードする核酸配列を 構築することができる。

抗体分子は公知の方法、例えば免疫吸収または免疫アフィニティークロマトグラ フィー、ＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）などのクロマトグラフィー 法、またはこれらの組み合わせなとによって精製することができる。

分子のイディオタイプを含む抗体断片を公知の方法によって作製することができ る。例えば、これに限定するのではないが、これらの断片は抗体分子のペプシン 消化によって作製されるＦ（ａｂ“）２断片；Ｆ（ａｂ“）２断片のジスルフィ ド架橋の還元によって作製されるＦａｂ’　断片、ならびに抗体分子をパパイン および還元剤で処理することによって作製される２ＦａｂまたはＦａｂ断片を含 む。

下記のセクション６、　２．　３．で記載するように、Ｔｃｔｅ−１融合タンパ ク質に対するウサギポリクローナル抗血清を作製した。

下記のセクション８で記載するように、ＴＣＴＥ−１に対するモノクローナル抗 体４Ｆ７を作製した。したがって、本発明はモノクローナル抗体４Ｆ７、ならび にその標的エピトープとの結合でモノクローナル抗体４Ｆ７と競合することので きる他の全ての抗体を提供する。

５．４．　ワクチン 本発明は、（１）ｔｃｔｅ−１タンパク質またはその断片、あるいは（２）ｔｃ ｔｅ−１タンパク質またはその免疫原性断片をコードする遺伝子を保有している 非病原性ウィルスのいずれかを含有するワクチンを提供する。

本発明によると、上記のセクション５．２．で記載したｔｃｔｅ−１タンパク質 またはその断片またはその誘導体を含有するワクチンはさらに、フロインドアジ ュバントまたはＢａｃｉｌｌｅＣａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ　（ＢＣＧ）な どのアジュバント（ただし、これに限定するものではない）を含むことができ、 また食塩水、デキストロースまたは他の水溶液（ただし、これに限定するもので はない）を含む適当な医薬担体も含むことができる。有効量を投与すべきである が、ここで”有効量”とは被験者に免疫応答をもたらすことのできるｔｃｔｅ− １タンパク質またはその断片または誘導体の員と定義される。必要量は使用する ｔｃｔｅ−１タンパク質、断片、または誘導体の抗原性、予防接種すべき被験者 の種および体重により異なるが、標準的方法を用いて決定できる。本発明の好ま しい非限定的態様においては、有効量のワクチンは予防接種前の抗体力価の少な くとも３倍まで抗ｔｃｔｅ−１抗体力価の上昇をもたらしうる。本発明の好まし い、特定の、非限定的態様においては、約５０μｇから１．　ｍ　ｇ、好ましく は５０　ｌ１ｇから２００ｍｇのＴＣＴＥ−１をヒト被験者に投与しうる。

本発明はさらに、ｔｃｔｅ−１タンパク質またはその免疫原性断片をコードする 遺伝子を保有する非病原性ウィルスを含有するワクチンを提供し、ここで該ウィ ルスは生ウィルスであるか、あるいは不活化されていてよい。該ウィルスは予防 接種の後しばらく穏やがて一時的な不快感を生じるかも知れないが、予防接種し た被験者に持続的な有害な効果を及ぼさないという意味において非病原性である 。

使用できる適当なウィルスはワクシニア、アデノ関連ウィルス、レトロウィルス およびその他のＤＮＡウィルスを含むが、これに限定されない。

ｔ、　ｃ　ｔ　ｅ　−１タンパク質またはその免疫原性断片をコードする遺伝子 は、ｔｃｔｅ−１タンパク質または断片のみをコードすることもできるし、ある いは融合タンパク質中に含まれるｔｃｔｅ−■タンパク質または断片をコードす ることもできる。例えば、ｔｃｔｅ−１タンパク質または断片を操作して、例え ばウィルスコートタンパク質の一部としてウィルスの表面上に発現されるように することが望ましい。ｔｃｔｅ−１タンパク質または断片をコードする遺伝子は 標準的分子生物学的方法を用いてウィルスゲノム中に挿入することができる。該 遺伝子は上記のセクション５．１に記載する核酸を含んでもよい。

本発明の不活化ウィルスは複製および／または感染のできないウィルスである。

例えば、該ウィルスは細胞に入ることはできても、複製に必要な酵素を欠いてい てもよい。あるいは、該ウィルスは化学的に不活化されているか、または複製お よび／または感染できないように、熱または照射などの物理的方法で不活化され 別の態様においては、本発明は免疫避妊の方法を提供する。”免疫避妊”の語は 、抗体および／または細胞によって影響されうる免疫応答によって仲介される避 妊、すなわち受精阻害をいう。

阻害の程度は非処置対照と比較して少なくとも約５０％であるべきである。

特定の態様においては、本発明はこのような処置を必要とする対象者に上記のセ クション５．４で記載した有効量のワクチンを投与することからなる免疫避妊法 を提供する。このようなワクチンはｔｃｔｅ−１タンパク質または断片またはそ の誘導体、あるいはｔ　ｃ　ｔ　ｅ　−１タンパク質またはその免疫原性断片を コードする遺伝子を保有する非病原性ウィルスを含有する。

あるいは、本発明は、このような処置を必要とする対象者に上記のセクション５ ，３て記載したｔｃｔｅ−１に対する有効量の抗体を投与することからなる免疫 避妊法を提供する。有効量の抗体とは、約５０％、好ましくは約７５％の受精を 阻害する量をいう。

本発明の方法によって処置される対象は、これに限定するものではないが、ヒト 、非ヒト霊長目、イヌ、ネコ、げつし類、家畜類なとのｔｃｔｅ−１タンパク質 を生産する全ての生物を含む。

ともらの性でも処置できるが、本発明によってもたらされる不妊は雄に比べて雌 の方がより簡単に回避できる（例えば、体外受精または抗体力価測定によって） ので、雌を対象として用いることが好ましい。

ワクチンまたは抗体は当業界で公知のいかなる方法によっても局所または全身投 与することができ、これらには静脈内、皮下、筋肉内、膣内、または経口投与を 含むが、これに限定されない。

ワクチンまたは抗体は適当な非毒性医薬担体中で投与されうるか、ミクロカプセ ル中に含有させるか、および／または徐放性移植物中に含有させることができる 。

抗体レベルを維持するためにワクチンは定期的に投与することが好ましい。

本発明のワクチンまたは抗体はその他の避妊法と組み合わせて使用することがで きる。

セクション６、　２．　６で記載するように、抗−ｔｃｔｅ−１抗体は精子が卵 に結合するのを阻害することが観察された。

５．６．　本発明のその他の利用法 本発明はまた、（１）特定の遺伝子型の精子を選択する；（２）不妊を同定し、 および／または検出する；　（３）受精を改善する。そして（４）種間雑種を作 製する、ための方法にも用いることができる。

特定の態様においては、本発明は、（１）第２の動物種に由来する内在または別 のプロモーターとともにｔｃｔｅ−１タンパク質をコードするトランスジーンを 保有しているある種のトランスジェニックな非ヒト動物を作製し、その際該トラ ンスジーンは対象の遺伝子と同じ染色体にあり、それ故トランスジェニック動物 の二倍体細胞が該トランスジーンと対象の遺伝子をその種型中に保有する染色体 を１コピーだけ含むこと（すなわち、対象の遺伝子とｔｃｔｅ−１）ランスジー ンとのへテロ接合体である）；（２）該トランスジェニック動物から精子を回収 すること；　（３）タンパク質の回収を可能にする担体に結合されている、ｔｃ ｔｅ−１タンパク質と結合するタンパク質に、該タンパク質へのｔｃｔｅ−１の 結合を促進する条件下で、精子をさらすこと；　（４）ｔｃｔｅ−１を介して精 子に結合したタンパク質を回収すること：および（５）該タンパク質から精子を 放出させること、を含む特定の遺伝子型の精子を選択する方法を提供する。

上記タンパク質は、これに限定するものではないが、例えば抗体または卵母細胞 タンパク質のようなｔｃｔｅ−１に特異的に結合するどのようなタンパク質であ ってもよい。

該タンパク質は、これに限定するものではないが、卵（天然卵母細胞タンパク質 の場合など）、プラスティック、ガラス、磁気ビーズ、樹脂、ラテックスなどを 含む担体と結合でき、タンパク質と結合した分子を介して結合できる。

タンパク質は担体を回収することによって回収できる。例えば、プラスティック またはガラス片に結合したタンパク質を、ｔｃｔｅ−１のタンパク質への結合を 許す条件下で、ｔｃｔｅ−１を発現する（ｔｃｔｅ−１（＋））か、あるいはｔ ｃｔｅ−１を発現しない（ｔｃｔｅ−１（−））精子にさらすことができる。次 いでｊ、　ｃ　ｔ　ｅ−］、（−）精子を洗い流すと、プラスティックまたはガ ラス上に結合したｔｃｔｅ−１（＋）精子が残る。同様に、タンパク質が磁気ビ ーズに結合している場合には、ｔｃｔｅ−１のタンパク質への結合を許す条件下 で、ビーズをｔｃｔｅ−１（＋）およびｔｃｔｅ−１（−）精子にさらし、次い てｔｃｔｅ−１（＋）精子と結合したビーズを磁気によって回収できる。同様の 態様が当業者には推論できるであろう。

ｔｃｔｅ−１のタンパク質への結合を促進する条件とは、これに限定するもので はないが、生体内での条件と同様の条件または抗原抗体結合に典型的に用いられ る条件を含む。

精子は標準法、例えばイムノアフィニティーカラムからタンパク質を放出するの に用いられる方法によってタンパク質から放出される。

減数分裂の結果、トランスジェニック動物の精子は２つの集団からなっており、 そのうちの１つだけがｔｃｔｅ−１トランスジーンおよび対象の遺伝子を保有す る染色体をもっているので、この方法は対象の遺伝子をもつ精子を選択するのに 用いることができる。次に選択された精子を用いて卵母細胞を受精させ、対象の 遺伝子をもつ動物を発生させることができる。

これに限定するものではないが、例えば、特定の性をもつ動物を作製することが 望ましいことがある。したがって、トランスジーンをトランスジェニック動物の ＸまたはＹ染色体中に挿入してよい。次に前述した方法によってＸまたはＹ染色 体をもつ精子を選択する。

トランスジーンは当業界で公知のどのような方法を用いても特定の染色体中に挿 入することができる。例えば、多数のトランスジェニック動物を作製し、次に例 えば、染色体に対するヌクレオチドプローブのインサイチュハイブリダイゼーシ ョン、体細胞ハイブリッド分析、または古典的遺伝学などの方法によって、所望 の染色体上にトランスジーンをもつ動物を選択することができる。

これに限定するものではないが、別の例では、本発明の方法はトランスジーンで ある対象の遺伝子の遺伝の有効性を改良するのに用いることができる。トランス ジェニック動物中で遺伝子“Ａ″の産物を発現することが望ましく、また遺伝子 “Ａ”の産物を同様に発現するそのトランスジェニック動物の子孫を生産するこ とが望ましい場合がある。遺伝子“Ａ”についてペテロ接合であるトランスジェ ニック動物は遺伝子“Ａ”をその子孫の半分にしか受け渡さないという困難さが あった。本発明によると、遺伝子Ａをｔｃｔｅ−ａで“標識する”（ｔａｇｇｉ ｎｇ）ことにより、遺伝子“Ａ”をもつ精子を選択して胚の作製に用いることが でき、それゆえ事実止金ての動物子孫が遺伝子“Ａ”をもつことが確実になる。

対象の遺伝子は、」二記したように遺伝子“Ａ”を保有する染色体と同じ染色体 上にｔｃｔｅ−１を挿入することによって標識することができる。あるいは、遺 伝子Ａをｔｃｔｅ−１をコードする遺伝子と連結させて、次いてこれを用いて両 方の遺伝子を縦列にもつトランスジェニック動物を作製することができる。

トランスジェニック動物は当業界で公知のいかなる方法を用いて作製してもよく 、該方法はこれに限定するものではないが、例えばワグナ−（Ｗａｇｎｅｒ）お よびホッペ（Ｉ＋ｏｐｐｅ　）による１９８９年１０月ＩＯ日に発行された米国 特許第４，８７３，１９１号に記載の方法によるマイクロインジェクション、ト ランスフェクション、形質導入、エレクトロポレーション、胚幹細胞などを含む 。

これに限定するものではないが、げつ歯頚、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、 非ヒト霊長目などを含むいかなる非ヒトトランスンエニック動物種を用いてもよ い。

これに限定するものではないが、グロビン、Ｖｌｌｌ因子、成長ホルモン、イン ツユリン、ＬＤＬレセプターなとを含む事実上あらゆる対象の遺伝子を用いるこ とができる。

別の態様においては、本発明は雄または雌における不妊の同定および／′または 診断法を提供する。例えば、被験者の不妊状態を同定し、および／または不妊の 原因を診断できる。被験者はヒトまたは非ヒト被験体である。

特定の非限定的態様においては、本発明は、被験者から得た精子の表面上のｔｃ ｔｅ−１タンパク質の存在を検出し、１つの精子上または精子集団中の該タンパ ク質の存在または不在についてか、あるいは１つの精子または精子集団によって 発現されるｔｃｔｅ−１の絶対量について、ｔｃｔｅ−１タンパク質の量を定量 しくこれに限定するものではないが、免疫蛍光法、フローソーティング、組織化 学、ウェスタンプロットなどの標準法による）、そして次に定量したｔｃｔｅ− １量を正常な雄被験者からの精子の比較しうる試料中に発現したｔｃｔｅ−１タ ンパク質量と比較し、ここで正常な被験者と比較したときの試験被験者における 常軌逸脱は試験被験者が不妊であり、不妊と強く関連することを示唆する、こと からなる雄の試験被験者における不妊の同定および／または診断法を提供する。

ｔｃｔｅ−１は先住（ａｃｒｏｓｏｍｅ）そのものに存在し、先住反応した精子 には存在しないので、ｔｃｔｅ−１発現の常軌逸脱は試験被験者における先住ま たは先住反応の異常を反映しているのかも知れない。

ｔｃｔｅ−１は例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体あるいはｔｃ ｔｅ−１に結合する卵タンパク質を含むｔｃｔｅ−１リガンドを用いて検出でき ；リガンドの結合はリガンドを直接または間接（例えば第２抗体を介して）に標 識することによって検出できる。

例えば、ちしもｔｃｔｅ−１タンパク質が試験被験者から得たどの精子の表面上 にも発現していないならば、それはこの試験被験者が不妊であることを示唆する 。

また、個々の精子上におけるｔｃｔｅ−１タンパク質の存在または不在によって ｔｃｔｅ−１タンパク質の定量を行うことに関しては、精子の３０％以上、好ま しくは５０％以上、最も好ましくは７５％以上におけるｔｃｔｅ−１タンパク質 の不在が不妊の診断を支持する。同様に、被験者の精子の３０％以上、好ましく は５０％以上、最も好ましくは７５％以上におけるｔｃｔｅ−１タンパク質の不 在により該被験者が不妊であると同定できる。

ｔｃｔｅ−１タンパク質の定量を精子集団中のｔｃｔｅ−１タンパク質の量を測 定することにより実施する本発明のさらに関連する態様においては、正常被験者 に見られる量の７０％以下、好ましくは５０％以下、最も好ましバは２５％以下 であるｔｃｔｅ−１タンパク質の量が不妊の診断を支持し、かつ試験被験者が不 妊であると同定しうる。

別の態様においては、本発明は、試験被験者のｔｃｔｅ−１（精子と結合してい るか、またはその他のもの）の、リガンドとの結合に関して正常被験者からのｔ ｃｔｅ−１と競合する能力を測定することを含む試験被験者のｔｃｔｅ−１タン パク質の異常機能を同定する方法を提供する。適当なリガンドは卵母細胞によっ て発現されるようなｔｃｔｅ−１に対する天然リガンド、ならびにｔｃｔｅ−１ に対するモノクローナルまたはポリクローナルな抗体を含む。好ましい態様にお いては、リガンドはモノクローナル抗体４Ｆ７である。例えば、試験被験者から の非標識ｔｃｔｅ−■の“Ｘ″量がリガンドと結合する能力を、正常被験者の“ ｙ″量からの標識ｔｃｔｅ−１の存在下または不在下に測定し、次いで正常被験 者からの標識ｔｃｔｅ−１の“ｙ″員の存在下または不在下に正常被験者からの 非標識ｔｃｔｅ−１の“Ｘ”量がリガンドと結合する能力と比較する。もしも試 験被験者からのｔｃｔｅ−１が正常被験者からのｔｃｔｅ−ｔとは異なって標識 ｔｃｔｅ−１と競合する場合には、特にもしも試験被験者からのｔｃｔｅ−１が リガンド結合での競合が乏しい場合には、これは不妊を支持し、試験被験者が不 妊であるとの同定ができる。

さらに別の態様においては、雌試験被験者からの天然りガントへのｔｃｔｅ−１ タンパク質の結合能力を用いて雌被験者における不妊の診断および／または同定 ができる。例えば、もしも雌試験被験者からのリガンドがｔｃｔｅ−１結合につ いて正常被験者からのリガンドと効率よく競合しないならば、これは不妊の診断 を支持し、被験者が不妊と同定されうろことを示唆する。

本発明はさらに、雄の不妊を診断および／または同定するのに用いることのでき る診断キットを提供する。キットは好ましくはポリクローナルまたはモノクロー ナルな第１抗−ｔｃｔｅ−１抗体を検出可能な標識第２抗体とともに含む。例え ば、第２抗体は蛍光標識するか、あるいは西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵 素で標識することができる。キットはさらに参照用標準品および／または陽性対 照として用いるための正常ｔｃｔｅ−１を含むことができる。

蛍光標識した第２抗体と結合した第１抗−ＴＣＴＥ−１ポリクロ一ナル抗体が、 試験被験者から得た全てではないが、その幾つかの精子上で検出しうる程度にｔ ｃｔｅ−１を標識する能力を図１８に示す。

本発明はさらに、精子によって発現されるｔｃｔｅ−１の量を増加させることを 含む不妊の改善法を提供する。精子表面において発現したｔｃｔｅ−］の量の増 加は、精子の卵への接着増加をもたらしうる。ｔｃｔｅ−ルベルを増加させるた めには、（１）比較的強いプロモーター（誘導可能なプロモーターでありうる） の制御下にあり；　（２）卵への結合親和性が増加したｔｃｔｅ−１をコードす るように操作されており；および／または（３）複数コピーで存在する、ような ｔｃｔｅ−ｔをコードする遺伝子をトランスジーンとしてもつ非ヒトトランスジ ェニック動物を作製することができる。

さらに別の態様においては、本発明は、一定の精子にｔｃｔｅ−１が不足してい る精子集団からｔｃｔｅ−１を発現する精子を選択することを含む不妊の改善法 を提供する。例えば、直接または間接の蛍光標識した抗−ｔｅｔｅ−１抗体を介 し、次いで蛍光活性化細胞ソーティングによってｔｃｔｅ−１を保有する精子を 選択することができる。次いてｔｃｔｅ−１発現に富む精子集団を用いて体外受 精または人工授精することができる。

さらに別の態様においては、正常なｔｃｔｅ−１の不足する精子を人工的に正常 なｔｃｔｅ−１とカップリングさせて、これによって精子が卵と結合できるよう にする。例えば、ｔｃｔｅ−１（または非結合に関与するその一部）を例えば融 合タンパク質の一部として、またはその他の化学的カップリング（共有または非 共有）を介して、抗精子抗体とカップリングさせてもよい。特に、精子／非結合 を体外で行う場合には、抗精子抗体は、組織特異的抗原ならびに組織非特異的抗 原（例えばＰＨ−２０、ＰＨ−３０、アクロシン、５ＰＩＯなど）を含む精子表 面上のいかなる抗原に対するものでもよい。抗精子抗体を介して達成される精子 と正常ｔｃｔｅ−１タンパク質との会合は精子に受精能力を与え、それゆえ不妊 を改善する。

本発明はさらに、第１の種の非ヒト動物と、トランスジェニック動物の精子によ って発現される第１の種に由来するｔ　ｃ　ｔ　ｅ　−１タンパク質の特性を有 するタンパク質をコードする遺伝子をトランスジーンとして保有する第２の種の 非ヒトトランスジェニック動物とを交配させることからなる、種間雑種の作製方 法を提供する。

（本頁以下余白） ６、　実施例：ｔｃｔｅ−１のクローニングおよび特性づけクローニングおよび ライブラリースクリーニングは、マニアテイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等が“Ｍｏ ｒｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ ″、＋９８２、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ、　ＮＹ：Ｃｏ１ｄ　 Ｓｐｒｉｎｇ　ｔ（ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに記述する標準的方法に 従って行なった。組換えＤＮＡ技術に含まれる酵素反応は、市販の酵素を用いて 製造者［ニュー・イングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏ ｌａｂ、　）　］が推奨する条件で行なった。サザンプロット法実験で　は、ナ イロン膜［ジェネスクリーン＠　（ＧｅｎｅｓｃｒｅｅｎＯ）］へのアルカリ性 移行を実施した。ハイブリダイゼーションは、チャーチ（Ｃｈｕｒｃｈ）及びギ ルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ　）　（１９８４、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ ｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８１：　１９９１−１９９５　）が開発した方 法に従って行なった。

′ｊｐ標識プローブの作製には、ランダムプライマー法［フエインバーグ（Ｆｅ ｉｎｂｅｒｇ）及びブオーゲルステイン（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ）　、　１９８ ４、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１３７：　２６６−２６７　］を用いた 。ＤＮＡシークエンシングは、ジデオキシ　チェーン　ターミネーション法［サ ンガー（Ｓａｎｇｅｒ）等、１９７７、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ　、Ｕ、Ｓ、Ａ、　７４：５４６３−５４６７　］により、Ｔ７シークエ ナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ　）キット［ユナイテッド　スティソ　バイオケミ カル（Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　）製コを用いて 行なった。

６、］、］処　コスミド・マツピング ｔ“ｉ／ｌ１ｕｂｌ二重へテロ接合体マウスから作製されたマウスコスミドライ ブラリーが、ジョン・シメンティ　（Ｊｏｈｎ　Ｓｃｈｉｍｅｎｔｉ）より提供 された。

各コスミドクローンの制限酵素地図を、シメンティ（Ｓｃｈｉｍｅｎｔｉ）等（ １９８７、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　１９４：　５８３−５９４）が記述する部 分切断／間接末端標識法に従って作成した。要約すると、各コスミドクローンの ＤＮＡを、ベクターＤＮＡ内ではただ一つの部位しか認識せず、挿入されたマウ スＤＮＡ内では比較的少数の部位を認識する５ａｌｌまたはＣ１ａｌを用いて切 断した。こうすると、すべてのコスミドＤＮＡがベクター配列内の定まった部位 で線形にされる。次に、完全に切断したＤＮＡを、より切断頻度の高い酵素で部 分的に切断した。そのＤＮＡサンプルを０．　５％（Ｗ　／　Ｖ）ＴＢＥ　（９ ０ｍＭ）リス塩基、９０ｍＭホウ酸及び２ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８，３）アガロ ースゲル上で大きさにより分画化して、２枚のナイロン膜にプロットした。プロ ットしたＤＮＡは、プローブとして、線形にしたクローンの両腕に相当する単離 したベクターＤＮＡの断片を使って検出した。各オートラジオグラフ上に分解さ れたバンドの大きさは、コスミドクローンの一端と、使用した制限酵素の認識部 との間の距離に対応する。こうして作成した地図は、各クローンを個々の制限酵 素または複数の酵素の組合わせを用いて完全に切断したものを電気泳動分析に付 して確い、精巣細胞を単離して培養下で［”Ｓ］メチオニンで標識した。

要約すると、２〜６個の精巣を、１ｍｇ／ｒｎｌのコラゲナーゼ溶液を２５ｍ１ 入れた５０ｍ１の試験管にプールし、精細管が分離するまで３３°Ｃで１０〜２ ０分間培養した。次に、この精細管を培地で２回洗浄し、トリプシン／ＤＮＡア ーゼ１　（ｔｒｙｐｓｉｎ／ＤＮＡａ　ｓ　ｅ　Ｉ）溶液２５ｍ１中に再度懸濁 した。試験管を３３℃の水浴中に５〜ｌＯ分間入れた。この細胞混合物を、切り 離した使い捨てピペット先端を用いて５０回上げ下げし、１％ＢＳＡ　ｌ０ｍ１ のクソンヨンの上に載せ、１１０００ｒｐ、１０°Ｃで１０分間遠心分離を行な った。得られた細胞ペレットをＰＢＳ中に再度懸濁し、細胞密度がＩｘｌＯ’個 ／ｍｌとなるよう調節した。２００マイクロキユリーの［”Ｓ］メチオニンを加 え、細胞を３３°Ｃ１５％Ｃ０２のもとて６時間培養した。標識した細胞をＰＢ Ｓで３回洗浄し、−８０°Ｃで保存した。

６．１．４．　Ｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼーシヨン成熟雄マウスの精巣をＯ ，Ｃ，Ｔ、化合物［マイルズ（Ｍｉｌｅ３）製〕中に埋め込み、−８０℃で冷凍 した。１０ｍｍのやや薄い切片を切りだし、あらかじめ０．１ｍｇ／ｍｌのポリ ーＬ−リジン［シグマ（Ｓ　ｉ　ｇｍａ）］で処理したスライドに付着させ、− ８０℃で保存した。使用の直前に、スライドを空気乾燥し、新たに調製したＰＢ Ｓ中の４％バラホルムアルデヒド［シグマ（Ｓｉ　ｇｍａ）］で１１分間室で固 定し、次に７０％エタノールで５分間０℃で固定した。シブラス（Ｓｉｄｅｒａ ｓ　）等（１９８８、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｌｌ、Ｓ、Ａ 、８５：２１８−２２１　）の方法に従って、スライドを［３５Ｓ］−ＵＴＰで 標識したりボブローブとハイブリダイズし、室温で４〜６日間感光させ、Ｉ／２ Ｘデクドール（Ｄｅｋｔｏｌ）［コダソク（Ｋｏｃｌａｋ）製］中で現像し、メ ーヤー（Ｍａｙｅｒ）ヘモトキンン溶液［シグマ（Ｓ　ｉ　ｇｍａ）製］で対比 染色しｔこ。

６、１．５．　融合タンパク質の調製 マウスｃＤＮＡ　ｐｍＴｃｔｅ−１からのＮａｅ　Ｉ−ＥｃｏＲ１断片を、４種 のｄＮＴＰすべでの存在下で、フレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）酵素により修復し、次 に発現ベクターｐＡＲ３０３ＢをＢａｍＨｌて線形にし平滑末端とした断片と連 結した。適切な配向を有するクローンを、標準的方法［マニアティスＱｌａｎｉ ａｔｉｓ）等、１９８２、上記参照］によって同定した。

Ｔｃｔｅ−１融合遺伝子を発現させるため、組換え体プラスミドをＬａｃＵＶ５ プロモーターの制御下にあるＴ７　ＲＮＡ　ポリメラーゼ遺伝子のコピーを持つ Ｅ、ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。こうして得た菌株を、１５０μ ｇ／ｍｌのアンピシリンを加えた１００ｍ１のＴＢ培地中で３７℃で振とうしな がら増殖させた。イソプロピル　β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ） を、培養物が０Ｄ６００＝０．５に達した時に、最終濃度が０．５ｍＭとなるよ うに加えた。３７℃でさらに１時間振とうした後、細菌を回収し、４ｍｌの溶解 緩衝液（５０ｍＭトリス−塩酸　ｐ　Ｉ−１８，２ｍＭ　ＥＤＴＡおよび２０ｍ Ｍ塩化ナトリウム）に再度懸濁した。リゾチームを最終濃度がＩ　ｍ　ｇ　／　 ｍｌとなるように、またデオキシコール酸ナトリウムを最終濃度が０．０４％と なるように加え、細胞を一晩かけて氷上で溶解した。

溶解物を超音波で処理し、さらにンーバル（Ｓｏｒｖａ　１　］）ＳＳ−３４０ −タリーにいれて１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離に付した。こうして得 たベレットを溶解緩衝液で２回洗浄し、２　ｍ　ｌの溶解緩衝液中に再度懸濁し た。溶解物を分離用ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。ゲルの 一部をクーマシーブルーで染色して、融合タンパク質を可視化し、ＴＡＥ−３Ｄ Ｓ緩衝液を用いた電気溶出により回収した。

６、１．６．　ウサギの免疫感作 ニューシーラント白つサギ雌二匹を使用して、バクテリアが産生じたＴｃｔｅ− １タンパク質に対する抗血清を調製した。１００マイクログラムの精製タンパク 質を生理食塩水（０，８５％の塩化すトリウム）に溶かし、フロイント完全アジ ュバント［ディフコ（Ｄｉｒｃｏ　）製］またはＭＰＬ＋ＴＤ、Ｍ＋ＣＷＳアジ ュバント［アールアイビーアイ　イミュノケム（ＲＩ　Ｂ　Ｉ　Ｉｍｍｕｎｏｃ ｈｅｍ）製コで乳化して、ウサギの腰から肩にかけて数箇所に皮下注射した。感 染の危険を最小限にするため、注射に先立って皮膚を剃っておいた。第一回の注 射後、４週問おきに２〜３回、精製タンパク質を不完全アジュバントで乳化した ものを注射して追加免疫を行った。追加免疫注射ては、生理食塩水に溶かした５ ０マイクログラムの可溶性タンパク質を耳静脈へ注射した。各追加免疫注射の後 、９〜１０日目にローギから採血した。

６、１．７．　細胞上分画化及び免疫沈殿反応精子形成細胞をダウンス（Ｄｏｕ ｎｃｅ）ホモジナイザーを用いて、滅菌１０ｍＭトリス（ｐＨ７，５）溶液中で ホモジナイズし、次に同容量のｌＯｍＭ）リス・１Ｍスクロース溶液を加えた。

ついて、エッペンドルフ変速微量遠心機を用いて、細胞懸濁液を３０００ｒｐｍ で１０分間回転した。得られたペレットは、核両分として回収した。上澄み液は 更に１４，０００ｒｐｍで５分間回転し、ミトコンドリアを回収した。上澄み液 は、細胞質ゾル画分を含有していた。種々の細胞上画分を、ＲＩＰＡ緩衝液［５ ０ｍＭトリス（ｐＨ８）　、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００．１％デオキシコール酸ナトリウム、０．５％ＳＤＳ］に種々のプロテア ーゼインヒビター［０、２ｍ　ｇ　／　ｍ　１フエニルメチルスルフオニルフル オリド（ＰＭＳＦ）；　ｌμｇ／ｍｌ　ロイペプチン；２μｇ／ｍｌ　アンチバ イン；ｌＯμｇ／ｍｌベンズアミド：１μｇ／ｍｌ　キモスタチン；ｌμｇ／ｍ １　ペプスタチン；Ｉμｇ／ｍｌ　アプロチニン；０．２ｍｇ／ｍ１　大豆トリ プシンインヒビター（ＳＢＴＩ）］を加えたものの中でポルテックス攪拌して、 タンパク質溶解物を得た。溶解物はＴｉ５０ｏ−ターで４０．ＯＯＯｒｐｍで１ 時間回転して、破片を除去した。免疫沈殿反応を、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　［バ ーロー　（ｌ（ａｒｌｏｗ）及びレイン（Ｌａｎｅ）　、１９８８、Ａｎｔｉｂ ｏｄｉｅｓ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎ ｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ］に記述されている方法に以下の変更 を加えて行なった。抗体を直接溶解物に加える代わりに、あらかじめ抗体を担持 させたスタフ（Ｓｔａｐｈ）Ａビーズを用いた。このビーズは、５〜ＩＯμｌの ウサギ抗血清または１ｍｌのハイブリドーマ上澄み液に、スタフＡビーズ１０％ 懸濁液１００μｍを加えて、インキュベートして作られた。未結合抗体はＲＩＰ Ａ緩衝液で洗浄して、除去した。この操作を２回繰り返し、ペレット化したビー ズをＯ，１Ｍホウ酸塩と０．１５Ｍ塩化ナトリウムよりなるホウ酸塩カップリン グ緩衝液１００μｍ中に再度懸濁した。

：１９５−２０３　）が記述する標準的方法に本質的にしたがって行なった。簡 単に述べれば、タンパク質溶解物をＳＤＳ　ＰＡＧＥ　（１０％）によって分離 し、２０ｍＭ）リス塩基、１５０ｍＭグリシン、２０％メタノール及び１％ＳＤ Ｓを含有する溶液を使い、イモピロン−ビー（ｒｍｍｏｂ　ｉ　Ｊｏｎ−Ｐ）膜 ［ミリボアコーポレーション、ベッドフォード、マサチューセッツ州（Ｍｉｌｌ ｉｐｏｒｅＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　Ｂｅｄｆｏｒｄ、　ＭＡ）　］に移した 。膜はＴＢＳ（２０ｍＭトリス、ｐＨ７，５；　０．５Ｍ塩化ナトリウム）中の ３％ゼラチン及び５％無脂ミルクを加えて非特異的結合をブロックし、また特定 のタンパク質は抗体溶液６ｍｌ　［１％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０．１％ゼラ チン、及びＴＢＳ］の中でアフィニティー精製した抗血清５μｇとハイブリッド 形成させた。結合した抗体は、ベクタスティン　ニービーソー（Ｖｅｃｔａｓｔ ａｉｎ　ＡＢＣ）キット［ベクター　ラボラトリ−バーリンガム、カリフォルニ ア州（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）　］ を用いて、イムノペルオキシダーゼ染色により可視化した。

６、１．９．　クリーブランド（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ）切断タンパク質サンプル をＳＤＳポリアクリルアミド・ゲル電気泳動により分離し、対象のバンドを切り 取って、１０％グリセロール含有の２５％緩衝液Ａ　（０，５ＭトリスＣＬｐＨ ６，８；。

、４％５ＤＳ）に浸した。１５％ポリアクリルアミド・ゲルを流し入れ、ゲル・ ランニング緩衝液を満たす前にウェルを２５％緩衝液Ａて洗浄した。平衡化させ たストリップをこれらウェルに挿入し、つぎに２０μｌの２Ｘサンプル緩衝液（ ４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、０．０８％ブロモフェノールブルー、４％β −メルカプトエタノール含有のＯ，ＩＭ）リス、ｐＨ６，８）で覆った。次に、 上記のサンプル緩衝液の上に、２０μｌの■８プロテアーゼ（１ｍｇ／ｍｌの酵 素原液を、１０％グリセロール中の２５％緩衝液Ａで２００倍に希釈したもの） を加えた。ゲル電気泳動は４Ｖ／ｃｍで行なった。

６．１．１０．　Ｔｃｔｅ−１タンパク質を認識する抗体のアフィニティー精製 数百マイクログラムの精製したＴｃｔｅ−１融合タンパク質を、ＣＮＢＲ活性化 セファ０−ス（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）４Ｂビーズ［ファルマシア社（Ｐｈ　ａ　 ｒｍａ　ｃ　ｉ　ａ）製コと製造者の推奨条件にしたがって結合させた。ビーズ を充填したカラムに、１５ｍ１のウサギ抗Ｔｃｔｅ−１血清を通した。結合した 抗体を０，１ＭグリシンｐＨ２，５で溶離し、Ｏ，１Ｍトリス−ＣＩ、ｐＨ８Ａ ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　［バーｏ−（Ｈａｒｌｏｗ）及びレイン（Ｌａｎｅ）　、 １９８８、上記参照］に記述された方法でＴｃｔｅ−１タンパク質を可視化した 。要約すると、成熟Ｂ６Ｄ２　Ｆｌマウスの精巣組織をオムニフィックス２．０ ［アン−コン　ジエネテイクス、インク。

（Ａｎ−Ｃａｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｉｎｃ、　）製］て固定した。パラフィ ンに埋め込んだ切片を７μｍの厚さに切断し、４°Ｃて保存した。マウス精巣上 体の精子を、４％パラホルムアルデヒドを用いてポリービーリジンを塗布したス ライド上に固定した。５μｇのアフイニテイ精製した抗Ｔｃｔｅ−１抗体、また は免疫前１ｇＧをスライドに加えた。室温で４時間インキュベートした後、スラ イドをＰＢＳで洗浄し、結合したＩｇＧをビオチニル化したヤギの抗ウサギＩｇ Ｇ［ｌ：２００；ベセスダ　リサーチ　ラボラトリ−（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓ ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）製］及びストレプトアビジン結合フルオレ セイン複合体［１：２００；アマ−ジャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）製コと反応させ た。４゛、６−ジアミンノー２フエニルインドール（ＤＡＰＩ）を最終濃度が１ μｇ／ｍｌとなるように加え、核が見えるようにした。次に、光漂白を防ぐため 、トリスｐＨ７，５で緩衝化した、Ｉｍｇ／ｍｌのｐ−フェニレンジアミンを含 有する９０％グリセロールを使ってスライドを作成し蛍光顕微鏡のもとて可ホー ガン（ｔ（ｏｇａｎ　）等、１９８６、”Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　 ｍｏｕｓｅ　ｅｍｂｒｙｏ：　Ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ １ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｔ（ａｒｂａｒ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂａｒ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに記述された方法に従って、トランスジェニックマウス を作製した。ｐｊ６６．２由来の８．ｌｋｂ　ＢａｍＨＩ断片に含まれるＴｃｔ ｅ−１−ＬＴ融合構築体（図１４Ａ参照）の約１００〜１０００コピーを一細胞 期の受精卵に注入した。

尾生検て得たＤＮＡを分析し、トランスジーンを獲得したかどうかについてマウ スのスクリーニングを行なった。可能な場合は、ホモ接合体系統を確立し、維持 した。

６．１．１３．　トランスジェニックマウスの核酸分析マウス尾の生検材料を、 １％ＳＤＳ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ　ＴｒｉｓＣＩ　（ｐｈＴＣ ＴＥ−１，５）、１００ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐ）（８，０）　、および０．５ｍ ｇ／ｍｌプロティナーゼにの中で５５℃で一晩回転しながら消化した。ゲノムＤ ＮＡは、フェノール抽出とそれに続くフェノール−クロロホルム抽出によって精 製し、次に酢酸アンモニウムを１．２５Ｍまでと、同量の冷エタノールとを加え て、沈殿させた。精製したＤＮＡｌ０μｇを適切な酵素で切断し、０．　８％ア ガロースゲル中で電気泳動にかけ、ナイロン膜［シーンスクリーン（Ｇｅｎｅｓ ｃｒｅｅｎ）　］上に移し、ＵＶ架橋し、３２ｐで標識したＳＶ４０大型Ｔ抗原 プローブとハイブリッド形成させた。グアニジニウム・イソチオシアネート／　 Ｃｓ　ＣＩ勾配技法［チャーゲイン（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ）等、１９７９、Ｂｉｏ ｃｈｅｍ、　１８：５２９４−５２９９］を用いて、種々のマウス組織から全Ｒ ＮＡを単離した。全ＲＮＡｌ０μｇを、標準的ノーサンプロット法［マニアティ ス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等、１９８２、上記参照コで解析した。

ただし、ゲルには（２，２Ｍではな（）０．６６Ｍのホルムアルデヒドを使用し た。

（本頁以下余白） ６．２．　結果 ６、２．　Ｉ。　マウスおよびヒトのｔｃｔｅ−１ゲノムＤＮＡのクローニング と特性づけ マウスＴｃｔｅ−１のｃＤＮＡクローンｐＮＳ２を用いて、ｔ−１／ｌｌ＝”１ に重へテロ接合体マウスから作製したコスミドライブラリーをスクリーニングし た。３つの独立したクローンを得た。

６種類の酵素（ＢａｍＨｌ、Ｃ１ａｌ、ＥｃｏＲｌ、ＨｉｎｄｌＩＴ、Ｎｒｕｌ 及び５ａｌｌ）によって検出された制限部位を、各コスミドクローンごとに地図 にした。その結果、３つのこれらクローンは重複して６５ｋｂのＤＮＡをカバー していることが分かった（図１．　Ａ参照）。遺伝子の配向は、制限部位で切断 したコスミドＤＮＡをｃＤＮΔクローンの異なった断片とハイブリダイズさせて 決定した。転写ユニットの大きさは、約１０ｋｂと推定された。哺乳類遺伝子の ５゛末端にはしばしばＣｐＧアイランドが存在し、転写制御に重要な役割を果た すと考えられているので、切断頻度の低い酵素の認識配列（通常２個のＣｐＧを 含む）を探すことによってＣｐＧアイランドを検索した。そのような酵素４種類 （ＢｓｓＨＩＩ　Ｎｒｕｌ、５ａｃｌｌ、Ｘｈｏ　ｌ）の制限部位は、この遺伝 子の３′末端から３ｋｂ下流に集中していることが判明した（図１参照）。驚く べきことに、この遺伝子座の５“末端付近にはそのような認識部位はまったく存 在しない。

この現象が重要かとうか知るために、ヒトＴＣＴＥ−１遺伝子座についても、ヒ トゲノムクローン１　ｈＴＣＴＥ　ｌ　ｇを用いて同様の分析を行なった。ヒト 遺伝子についても低頻度切断部位の同様の構造が見られ（図１．　Ｂ参照）、こ の遺伝子座の３゛末端におけるＣｐＧアイランドの存在は進化の過程で保存され てきたことが示された。

６、２．２．　ヒトＴＣＴＥ−１ｃＤＮＡの単離、及びヒトとマウスのｔｃｔｅ −１遺伝子の比較分析 ヒト精巣ｃＤＮＡライブラリーから得た大量のプラークを、マウスＴｃｔｅ−１ ｃＤＮＡ（ｐｍＴｃＴＥｌ）の断片をプローブとしてスクリーニングし、６つの 陽性クローンを同定した。これらクローンの特性をさらに調べ、３クラスに分類 した。第１のクラスはｐＨ１という１個のクローンからなり、このクローンは２ ．６ｋｂの挿入配列を有し、マウス配列の５゛末端とも３′末端とも強力にハイ ブリダイズした。第２のクラスはｐＨ７クラスと称し、４個のクローン、すなわ ちｐＨ２，ｐＨ５，ｐｈＴＣＴＥ−１（最初ｐＨ７と名つけられた）およびｐＨ ８からなった。

これらのクローンは、１．６ｋｂの挿入配列を有し、５′マウスプローブとは非 常に強力にハイブリダイズするが３°プローブとは弱くハイブリダイズすること が判明した。第３のクラスはクローンｐＨ６からなり、このクローンは１．６ｋ ｂの挿入配列を有し、３′プローブと強力にハイブリダイズしたが、５゛プロー ブとはハイブリダイゼーションが弱かった。

これら３クラスのクローンはすべて完全に配列決定を行なった。

その結果、ヒ）ＴＣＴＥ−１遺伝子座の転写パターンは、ただ一つの転写産物し か産生じないマウスＴｃｔｅ−１遺伝子の単純な転写パターンとは対照的に、複 雑であることが分かった（図２参照）。

これら３クラスのクローン間の相違は、クローニングによる人為的結果が引き起 こしたものとは考えられなかった。たとえば、最長のクローンｐＦ（Ｉ（配列番 号：Ｉ）は、ｐｈＴＣＴＥ−１（配列番号＝２）の配列に比べると、オーブンリ ーディングフレーム内に４５０塩基対の欠失があって、１５０アミノ酸のフレー ム内欠失を有していた。この欠失は、ｐ　Ｈ６クローンにはなかった。

しかし、ｐｈＴＣＴＥ−１クラスには、ｃＤＮＡの他の両クラスにはある３′末 端非翻訳領域１．５ｋｂがなかった。ｐｂ’ｒｃ’ｒＥ−１クラスでは３つの独 立したクローンが単離されたので、この相違はおそらく異なったポリアデニル化 部位の使用からきたものであろう。さらに、クローンｐＨ１とｐＨ６は同じ３′ 末端１、［３ｋｂ断片を共有しているが、ｐＨ６の５°末末端列はクローンｐＨ １のとこにもないので（ｐｈＴＣＴＥ−１クローンにはあるが）、ｐ）−１６は ｐＩ−（１の部分クローンではない（図２参照）。

ｐＨ１クローンの塩基配列は、ドツトマトリックス分析が示すように（図４参照 ）、３′末端非翻訳領域でさえ対応するマウス遺伝子のそれと非常に相同性であ る。興味深いことに、ＴＣＴＥ−１遺伝子の相補的ＣＡ／ＧＴモチーフは、位置 と方向の点でマウスのそれと似ている。図３に示すように、ＣＡモチーフはＧＴ モチーフの５°側にあり、ＧＴモチーフと８４０塩基対離れて存在している。Ｔ ｃｔｅ−１遺伝子のもう一つの面白い点は、ｐｈＴＣＴＥ−］　（配列番号＝２ ）に見られるパリンドローム（自己相補的）配列の存在て、ＴＣＣＴＣＣＡＣｒ ＧＧＡＧＧＡがヌクレオチド２１８〜２３２ｉ：、ＡＴＣＣＧＴＣＧＧＡＴＧＣ ＧＣＣＧＧＡＴがヌクレオチド３１９〜３３９に存在している（図３参照）。第 ２の配列は、ヒトとマウスの間で良く保存されている。

ｐｈＴＣＴＥ−１クローン（配列番号＝２）はヌクレオチド１４９から始まりヌ クレオチドｌ６５２で終わる最も長いオーブンリーディングフレームを有した（ 図３参照）。ヌクレオチド１４９〜１５１にあるＡＴＧコドンは、おそらく開始 コドンであろう。

なぜなら、このコドンは、高等真核細胞の翻訳開始のためのコザック（Ｋｏｚａ ｋ）共通配列に非常によく似た配列（ＧＣＣＴＣＣＡＧＣＡＵＧＧ）の中に埋め 込まれているからである［コザック（Ｋｏｚａｋ　）　、　１９８７．　Ｎｕｃ ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　１５：　８１２５−８１４８　）　ｏこの仮説 的なオーブンリーディングフレームは、対応するマウスのそれと大きさにおいて 類似している５０１個のアミノ酸からなるポリペプチドをコードしている可能性 がある。

予測されるタンパク質の配列を、シーンバンク（Ｇｅｎｂａ口ｋ）のデータベー スにある配列と比較してみたが、相同配列は発見されなかった。Ｔｃｔｅ−１（ 配列番号・５）とＴＣＴＥ−１（配列番号：４）の予測されるアミノ酸配列を比 較するき、これら二つのタンパク質の間には驚くべき相同性があることが分かる （図５参照）。全般的な配列相同性は８４％で、同一性は７７％であることが判 明した。しかし、Ｎ末端部６０個のアミノ酸は二つのオーブンリーディングフレ ームの間で非常に異なっている。この領域を除くと、類似性は９０％にも達した 。

これら二つの配列のバイトロバシー特性を、カイ）　（Ｋｙｔｅ）及びトウーリ ットル（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ　）のプログラムに従ってグラフにしたところ（図 ６参照）、両者は非常に似ていることがわかった。

マウスＴｃｔｅ−１タンパク質とヒトＴＣＴＥ−１タンパク質は、ある領域、た とえばＴｃｔｅ−１のアミノ酸残基６８−７８及び４０８、−４２８、ＴＣＴＥ −１のアミノ酸残基７０−９０．２６２−２８８及び４０３−４２３を除けば、 圧倒的に親水性であるように見える。また、膜貫通へリックスを形成する可能性 があるのは、上記のアミノ酸残基である。

どちらの遺伝子にも、図７に示すようにアミノ酸の重複モチーフがある。これら の重複配列の機能的意義は不明である。マウスの配列とは異なって、ヒトＴＣＴ Ｅ−１転写産物の相補鎖には重要なオーブンリーディングフレームはない。得ら れたオーブンリーディングフレームのうち最長のものは大きさが１２ｋｄで、こ れはＴｃｔｅ−１の相補鎖によってコードされている４０Ｋｄのものよりはるか に小さい。

６、２．３　ヒト及びマウスｔｃｔｅ−１タンパク質発現のための遺伝子融合体 の構築、及び特異的抗血清の調製予測したオーブンリーディングフレームが、正 しい大きさであることをさらに証拠つけるために、ヒトＴＣＴＥ−１またはマウ スＴｃｔｅ−１からなる遺伝子融合体を構築し、対応するタンパク質を犬腸閑（ Ｅ、ｃｏｌｉ）の中で発現させるのに用いた。マウスＴｃｔｅ−１タンパク質の ５００個のアミノ酸をコードするＮａｅ　Ｉ−ＥｃｏＲＩ断片を平滑末端とし、 ＢａｍＨＩで切断して平滑末端としたｐＡＲ３０３８ベクターに連結した。挿入 配列を両方の配向てもつプラスミドを得て、これらをｐ７７．１及びｐ７７．３ と名つけた。次に、プラスミドをＢｇｌＩＩで切断して、ｐ７７．１の方か正し い配向であることがわかった。

ＴＣＴＥ−１タンパク質の４３０個のアミノ酸を有するＢａｍＨ１断片を、Ｂａ ｍＨＩで切断して直線にしたｐＡＲ３０３９ベクターに連結した。両方の配向を もつ組換え体プラスミド（ｐ７７．２及びｐ７７．４）を得た。これらをｓｐｈ 　＋で切断して、ｐ７７．２の方が正しい配向をもっことががわかった。次に、 「材料及び方法」の所で述べたように、これらのプラスミドをもつ細菌を培養し ＩＰＴＧでタンパク質の発現を誘導した。タンパク質溶解物はすべて５ＤＳ−ポ リアクリルアミドゲル電気泳動に付して分析した。

図８Ａに示すように、ヒト及びマウスのｔｃｔｅ−１融合構築体は、大きさが４ ７ＫＤと５６ＫＤのタンパク質をそれぞれ産生ずることがわかった。この結果は 、配列分析に基づく予測と一致した。

推定上のＴｃｔｅ−１オープンリーデイングフレームがマウスにおいて使用され ていることを実証し、さらにその発現と機能を調べるため、全バクテリアタンパ ク質溶解物の不溶性画分中に富化したＴｃｔｅ−１融合タンパク質に対してウサ ギ抗血清を産生させた（図８Ｂ参照）。この抗血清は、ヒト融合タンパク質もマ ウス融合タンパク質も特異的に認識することができた。

この抗血清がマウス精巣タンパク質を検出てきるかどうか確認するため、免疫沈 殿反応を実施した。［”Ｓ］　−メチオニンで標識した全精巣細胞溶解物から、 大きさが５６ＫＤと６５ＫＤの二つの主要タンパク質が沈殿した（図８０参照） 。次に、この血清のＩｇＧ画分をアフィニティークロマトグラフィーにより精製 した。このアフィニティー精製した抗体を用いて免疫沈殿反応を繰返した結果、 沈殿する唯一の特異バンドは５６ＫＤタンパク質であった。

この抗体の特異性をさらに実証するために、Ｔｃｔｅ−１ｃＤＮＡの５′末端部 （オーブンリーディングフレーム全体をカバーするが３゛末端非翻訳領域はカバ ーしない）をブルースフリブ（−（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）ベクター［ストウラ ータジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）製］にクローニングした。Ｔ７及びＴ３プ ロモーターを使い、センス及びアンチセンス転写産物を産生じて、これらをｉｎ 　ｖｉｔｒｏでウサギ網状赤血球溶解物との翻訳反応に付した。この翻訳反応産 物の一部を、抗Ｔｃｔｅ−Ｉ　ＩｇＧ及び（対照として）免疫前１ｇＧとの免疫 沈殿反応に付した。図９Ａに示すように、大きさ５６ＫＤのタンパク質が、抗Ｔ ｃｔｅ−Ｉ　ＩｇＧと反応して、上記のセンス転写産物をｉｎ　ＶｉｔｒＯで翻 訳した産物（レーン５）から沈殿した。この５６ＫＤのタンパク質は、免疫前１ ｇＧによっては認識されず（レーン６）、またアンチセンス転写産物（レーン３ ）によっては産生されなかった。

全精巣溶解物から沈殿した５６ＫＤタンパク質がＴｃｔｅ−１の真正なタンパク 質であることを証明するために、この沈殿したタンパク質と細菌が発現した融合 タンパク質の両方について、部分的タンパク質加水分解分析を行なった。陰性対 照として６５ＫＤタンパク質を使用した（図８Ｃ参照）。５６ＫＤタンパク質の 部分的Ｖ８切断パターンは融合タンパク質のそれと非常に良く似゛　ており、他 方６５ＫＤタンパク質のそれはまったく異なっていたので（図Ｔ−９Ｂ参照）、 この５６ＫＤタンパク質はＴｃｔｅ−］遺伝子の産物であることが確認された。

６．２．４．　Ｔｃｔｅ−１タンパク質の組織上の分布５６ＫＤのＴｃｔｅ−１ タンパク質が精巣に特有のものかどうかを決定するため、マウスの脳、肝臓、腎 臓、肺臓、精巣及び精子からのタンパク質抽出物を５ＤＳ−ＰＡＧＥで分画化し 、これらをアフィニティー精製抗体を用いたウェスタンプロット法により解析し た。結果は、図１０に示すように、精巣及び精子抽出物に５６Ｋｄバンドが存在 することが明確に示された。興味深いことに、精子溶解物中には５０Ｋｄタンパ ク質も同定さた。これは５６Ｋｄタンパク質の修飾された形態かもしれない。驚 くべきことに、３５Ｋｄタンパク質の顕著なバンドが脳、肝臓及び腎臓の各レー ンに存在した。肝臓にはＴｃｔｅ−Ｉ　ＲＮＡの発現が検出されなかったので、 この３５Ｋｄタンパク質バンドはＴｃｔｅ−１に部分的相同性を有するタンパク 質との交差反応性に由来するものかもしれない。

６．２．５．　Ｔｃｔｅ−１タンパク質はマウスの精巣及び精子に存在する Ｔｅｔｅ−１転写産物は、日齢１４日のマウス精巣から始めて検出されしサルベ ニツク（Ｓａｒｖｅｔｎｉｃｋ）等、Ｊ９８９、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅ　ｔ　ｉ ｃｓ　３０：３４−４１　］　、このことは、Ｔｃｔｅ−１は多分大系期の精器 細胞内で機能を開始するのであろうと示唆された。この点をさらに調べるため、 冷凍した精巣切片を使用し、［”Ｓ］　−ＵＴＰて標識したセンスまたはアンチ センスＴｃｔｅ−１プローブとのＩｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼーシヨンを行な った。その結果、Ｔｃｔｅ−１の発現は最初太糸期の精器細胞内で観察され、そ して引き続き半数体精子の中に存在することが明かになった（図１１参照）。

Ｔｃｔｅ−１タンパク質産物の存在位置を調べるため、アフィニティー精製した Ｔｃｔｅ−１抗体を用いた間接的免疫蛍光法により、全精巣切片と単離した精子 を検査した。図１２に示すように、Ｔｃｔｅ−１タンパク質に対する抗体は、精 巣切片中の太糸期精母細胞と球状の精子とを染色した。精子頭部に特徴的な突起 状部分（光体）は強く染色された（図１３参照）。積厚細胞のＴｃｔｅ−１を染 色したパターンは、ＤＡＰＩによる染色パターンと似ているように見え、このこ とはＴｃｔｅ−１タンパク質が核タンパク質であるかもしれないことを示唆して いる。しかし、染色は点状に広く散っており、ゴルジ体の染色も表している可能 性がある。

６．２．６．　Ｔｃｔｅ−１はＺＰ３結合結合タンパクジ補遺伝子である Ｔ　ｃ　ｔ　ｅ　−１タンパク質の分子量と存在位置は、最近同定された５６Ｋ ｄのＺＰ３結合結合タンパクジレイル（Ｂｌｅｉｌ　）及びワノセルマン（Ｗａ ｓｓｅｒｍａｎ　）　、１９９０、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８７；　５５６３−５５６７　］に似ている。Ｔｃｔｅ− １がこのＺＰ３結合結合タンパクジかとうかを決定するために、多数の実験を行 なった。

第一に、精子上のＴｃｔｅ−１タンパク質の位置と数を免疫蛍光法で調べた。非 透過性にした精子を、抗体結合を促進する条件下で、抗Ｔｃｔｅ−１抗体にさら した。次に、精子表面に結合した抗Ｔｃｔｅ−１抗体を、蛍光標識を施した抗マ ウスＩｇＧ抗体を用いて可視化した。図１３に示すように、精子の光体部分に免 疫蛍光が観察された。

第二に、全て標識した抗Ｔｃｔｅ−１抗体を用いて、Ｔｃｔｅ−１タンパク質の 位置と数を調べた。図１４に示すように、抗Ｔｃｔｅ−１ＩｇＧは、無傷な精子 の光体部分を覆っている原形質膜を特異的に染色した。これは、免疫前の血清に はみられなかった。また、１４個の精子に結合した金の粒子数を測定した結果、 抗Ｔｃｔｅ−１ＩｇＧが無傷な精子に結合する結合部位の数は、平均６５粒子／ μｍ２であった。これは、免疫前のＩｇＧのバックグラウンド数（５〜６粒子／ μｍ２　）より有意に高かった。光体反応を起こした精子を用いた場合は、抗Ｔ ｃｔｅ−１ＩｇＧと免疫前ＩｇＧの間に非常に大きな差異はみられなかった。結 合数はそれぞれ３６粒子／μｍ２と５８粒子／μｍ２であった。光体反応を起こ した精子は粘着性に見え、これが両方のＩｇＧの結合レベルを上げるのに寄与し たかもしれない。それにもかかわらず、光体反応を起こした精子への抗Ｔｃｔｅ 　ＩｇＧの特異的結合は、まったく見られなかった。

第二に、抗Ｔｃｔｅ−１ＩｇＧが精子／卵子相互作用に与える影響を、競合的精 子結合検定により検討した。各実験に１５個の卵を使い、これから得た結果は、 精子を抗Ｔｃｔｅ−１１ｇＧと共にインキュベートしておくと、卵に結合可能な 精子数が卵１個あたり２２個（緩衝液のみ使用）から８個に低下することを示し た。抑制の度合は、ＺＰ３による抑制（卵１個あたり精子５個）と同程度であっ たが、免疫前ＩｇＧによる抑制（卵１個あたり精子１５個）より高かった。

６．２．７．　Ｔｃｔｅ−１遺伝子の上流領域は、トランスジェニックマウスに おいて精巣特異的発現をしなかったＴｃｔｅ−１遺伝子の精巣特異的発現に必要 な調節要素の位置を明かにするため、ＳＶ４０大型Ｔ抗原に融合した５、８Ｋｂ のＴｃｔｅ−］上流配列を有する構築体を用いて、トランスジェニックマウスを 作製した（図１５Ａ参照）。４つのトランスジェニック系統を確立した（図１５ Ｂ参照）。ノーサンプロット法による解析では、いずれの系統にも、Ｔ抗原転写 物の精巣特異的発現は見られなかった（図１５Ｃ参照）。この結果は、Ｔｃｔｅ −１遺伝子の適正な発現には３°末端部のＣｐＧアイランドを含有する配列が必 要なのではないかという見解に合致する。

（本頁以下余白） ６．３．　考察 ６、３．１．　マウスＴｃｔｅ−１遺伝子の反射鏡に存在するオープンリーディ ングフレームは進化論的に保存されないヒトＴＣＴＥ！−１及びマウスＴｃｔｅ −１遺伝子の間のヌクレオチド配列の比較から、サーベトニック（Ｓａｒｖｅｔ ｎｉｃｋ）、（１９８６、マウスのｔ−ハブロタイブの遺伝的及び生化学的研究 、Ｐｈ、　Ｄ、論文、ニューヨーク州立大学、５ｔｏｎｙ　Ｂｒｏｏｋ）による Ｔｃｔｅ−１転写のアンチセンス路上で確認された７０ｋｄのオープンリーディ ングフレームは数個の配列決定の誤りがあることが明らかとなった。この仮定の リーディングフレームの実際の大きさは、これらの誤りを訂正した後では４０ｋ ｄに短縮された。ＴＣＴＥ！−１遺伝子の反射鏡において、相応のオープンリー ディングフレームは、わずか１２ｋｄのサイズである。

６、３．２．　ＧＴ／ＣＡモチーフを含む、ｔｃｔｅ−１の３°非翻訳領域は、 ヒト及びマウスの間で高度に保存されているｔｃｔｅ−１の３′非翻訳領域（Ｕ ＴＲ）はヒト及びマウスの間で、相補的な反復するモチーフの存在を含め、高度 に保存されているので、３°ＵＴＲは重要な役割を有しているかもしれない。こ の領域には（ＣＡ／ＧＴ）反復体が存在するが、これは真核のゲノムには広く分 布するにも拘らず、エキソンには極めて珍しいものである。

興味あることには、この反復体の２個のコピーは、マウス及びヒトのｔｃｔｅ− １遺伝子の両方の単一のエキソンにおいて確認された。

これらの反復体は、インビトロではＺ　ＤＮＡを形成可能であるかもしれないが （ハマダ及びカクナガ、１９８２、Ｎａｔｕｒｅ　２９８　；　３９６−３９　 ；ノルドハイム及びり’ｙチ、１９８３、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、　 Ｓｃｉ、　８０：１８２１−１８２５）、インビボではそうではなく　（カサス ノバスら、１９８９、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　２０８：　５３７−５４９ ）　、遺伝子組み換えにおいて役割を果たしているのか（パルデュら、１９８７ 、ＥＭＢＯＪ、　６：　１７８１−１７８９）又はプラスミドにおいて遺伝子の 転写活性を増大するのかもしれない（ハマダら、１９８４、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１ ．　Ｂｉｏｌ、　４　：　２６２２−２６３０）。

３’　ＵＴＲは、翻訳コントロール又はＲＮＡ安定性を達成するために使用され る二次構造を形成する際に関与するかもしれない。例えば精子形成の間の翻訳コ ントロールは２つの方法により達成され得る。第１に、特定の遺伝子の翻訳は豊 富な転写物の存在にもかかわらず、妨げられ得る。第２に、後の使用のために製 造された全ての転写物は、この段階の細胞では転写が止められるため、精子完成 、精子分化の最後の段階まで安全に保存され得る。この型の翻訳の制御は、一般 に配偶子形成の間で良く報告されてきた（ゴールドら、１９８３、Ｄｅｖｅｌｏ ｐ、Ｂｉｏｌ、　９８：　３９２−３９９　；　クリーンら、＋９８４．　Ｄｅ ｖ、　Ｂｉｏｌ、　１０５：　７１−７９　；ザケリら、１９８８．　Ｄｅｖ、 　Ｂｉｏｌ、　１２５：　４１７−４２２）。

ブラウンらはぐｌ９８９、Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ、　３：　７９３−８０２）、ヒ トの成長ホルモン遺伝子をコードする配列に結合したプロタミン遺伝子の３′非 翻訳領域（ＵＴＲ）及び５’　ＵＴＲの５１個のヌクレオチドより成るキメラ構 築物が、同様の遅れた翻訳活性を示すことを明らかにするために、形質転換した マウスを使用した。配列レベルにおいて、プロタミンとＴｃｔｅ−１３°ＵＴＲ ｓの間には類似性は存在しない。同様のコントロールの下にある他の遺伝子、例 えばＰｇｋ−２がプロタミン３’　ＵＴＲといかなる相同性をも共有しないとい う事実は、この認識のための第一次シグナルは、−次配列よりもむしろ転写物の 二次構造に存することを強く示すものである。Ｔｃｔｅ−１タンパク質の翻訳及 び転写が同一の細胞段階で生ずるという観察は、その３’　ＵＴＲは翻訳を回避 することに関与しないことを示す。しかしながら、Ｔｃｔｅ−１タンパク質が成 熟精子のアクロソームに存在するという事実は、３’　ＵＴＲはＴｃｔｅ−１ｍ ＲＮＡの退化を防止するために機能しうるということを示唆している。

６．３．３．　ｔｃｔｅ−１及びｔｃｔｅ−１遺伝子の３°ｃｐｃアイランドＤ ＮＡの可能な機能 ＣｐＧアイランドは、を椎動物の遺伝子の５°フランキング領域に関連すること が見い出された。これらのアイランドのメチル化は転写を止めるためのスイッチ メカニズムとして示唆されており、このことはＣｐＧアイランドが転写を調節す る際に重要な役割を果たすことが可能であることを示している（アンテグエラら 、１９９０、Ｃｅ１ｌ　６２：　５０３−５１４；バード、１９８６、Ｎａｔｕ ｒｅ　３２１：　２０９−２１３）。数個の精巣遺伝子の転写コントロール要素 が形質転換されたマウスを使用して確認されたが（ロビンソンら、１９８９、Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、８６：　８４３７−８４４１；　スチュワードら、１９ ８８、Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、　８：　１７４８−１７５５）　、これらの要素はｃｐｃアイランド をもっているとは思われない。しかしながら、Ｔｃｔｅ−１は遺伝子の３°末端 にＣｐＧアイランドを有している。このことは、（ｉ）３°ＣＰＧアイランドは Ｔｃｔｅ−１発現の調節において役割を有しない；　（ｉｉ）　ＣｐＧアイラン ドは他の遺伝子の下流のための制御要素を表わす；又は（ｉｉｉ）アイランドは Ｔｃｔｅ−１の適当な発現のために必要とされるのいずれかであることを意味す るのであろう。

マウスＴｃｔｅ−１及びヒトＴＣＴＥ−１の配列は全く類似しているが、ヒトの 転写物はマウスの転写物よりも一層不均一であるように思われる。ヒト及びマウ スの両方のポリアデニル化されたＲＮＡのノーザン分析は、ヒトのＲＮＡでは異 なるサイズの多くの帯域が存在しているのに対し、マウスＲＮＡでは単一の２． ９ｋｂ帯域を示した。

ヒトＴＣＴＥ−１のｃＤＮＡクローン化物も、この遺伝子の座から少なくとも３ 種の転写物が存在することを示した。

９１月及びｐｈ　ＴＣＴＥ−１クローンの間の差異の詳細な分析は、転写は多数 の部位から開始するように思われること、及びｐｈ　ＴＣＴＥ−１の５゛の５６ 個のヌクレオチドは、ｐｈ　’ｒｃＴＰ、−１のヌクレオチドの４３から５６の 配列（配列番号：２を参照）　（ＣＣＴＣＴＡＣＡＣＣＣＣＡＧ）が共通スプラ イス受容体部位に極めて類似しているためｐｌ＋１転写物のイントロン配列に一 致するであろうことを明らかにした。ｐＨ１クローンからの内部欠失の原因は代 替のスプライシングの結果によるものでないであろう。というのは、ｐｈ　ＴＣ ＴＥ−１の相応の領域の周辺の配列は（配列番号、２参照）　（ＣＡＡＣＣＡＣ ＡＴＣＧＧＧＣＴＧ）、受容体共通配列に如何なる類似も有しないからである。

クローンｐＨ６はｃＤＮＡクローン化の結果てありうる先端が切断された転写物 を表わす。しかしながら、ｐｈ　ＴＣＴＥ−１は明らかに、他の２個のクラスと は異なるボＩＪ（Ａ）付加シグナルを使用しており、これが３°ＵＴＲの多くの 欠失を生ずる。

これらの特徴を有する３個の独立のクローンが得られているから、これらがクロ ーン化の人工産物であることはありえない。精巣で発現された多くの遺伝子は類 似の転写後修飾を受ける（ベンーネリアら、１９８６、Ｃｅ１１．４４：　５７ ７−５８６；　セブラートーマスら、１９９１、　Ｎａｔｕｒｅ　３４９：　２ ３９−２４１）。代わりに、これは新規な生殖細胞に特異的なスプライシングメ カニズム及びポリ（Ａ）付加要素の存在を示唆するのであろう。３°ＵＴＲが上 記したとおりＴｃｔｅ−１遺伝子の適当な翻訳のために重要であるならば、ヒト の精巣細胞にｐｈＴＣＴＥ−１転写物類が存在することは、問題となろう。

６．３．５．　ｔｃｔｅ−１細胞は、精子形成及び受精の過程において機能する であろう Ｔｃｔｅ−１タンパク質が精子形成の間存在し、かつ、それが光体の表面に局在 するという知見は、Ｔｃｔｅ−１が生殖細胞の分化及び受精時に機能しうること を示している。数個の精子表面タンパク質が免疫学的又は生化学的基準により同 定されており、これにはマウスＭ４２抗原（２００／２２０ｋｄ）　（セーリン グ及びラコスキー、１９８５、Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｐｒｏｄ、　３３：　５２７− ５３６）、マウスホスホチロシンー含有タンパク質（９５ｋｄ）　（レイトン及 びセーリング、１９８９、Ｃｅ１ｌ　５７：　１１２３−ｉ１３０）　、マウス 精子表面がガラクトシルトランスフェラーゼ（６０ｋｄ）　、マウスＺＰ３結合 タンパク質（５６ｋｄ）　（ブレイル及びワラセルマン、１９９０、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、８７：　５５６３−５５６７）、 ラットガラクトースレセプター（５４ｋｄ）　（アブドラ及びキールスゼンバウ ム、１９８９、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ口ｉｏ１．１０８：　３６７−３７５）　、及び モルモノ１−ＰＨ２０タンパク質（６４ｋｄ）（ブリマコフら、１９８５、　Ｊ 、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　１０１：　２２３９−２２４４）が含まれる。大き さにかなりの差異があるので、Ｔｃｔｅ−１がＭ４２又は９５ｋｄタンパク質に 関係することはなさそうである。Ｔｃｔｅ−１の配列は、ガラクトシルトランス フェラーゼ遺伝子（シャーパーら、１９９０、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ ｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、　Ａ。

８７：　７９１−７９５）又はＰＨ２０（ラスロツブら、１９９０、Ｊ、　Ｃｅ １１．　旧ｏｆ、Ｉｌｌ：　２９３９−２９４９）のそれとは完全に異なる。ラ ット５４ｋｄガラクトースレセプターは精子において専ら存在するものではなく 、このことはＴｃｔｅ−１によりコード化された５６ｋｄタンパク質とは対照的 である。

３つの証拠が、Ｔｃｔｅ−１がマウス５６ｋｄ　ＺＰ３結合タンパク質に対する 候補遺伝子であることを示唆している。第１に、それらの分子量は類似している 。第２に、抗−ＴＣｌｅ−１抗体は、イムノゴールド染色データから定性及び定 量アッセイの両方において、同様にＺＰ３に反応する。すなわち、精子当たりの ＺＰ３及びＴｃｔｅ−１抗体における結合部位の数が似ており、そして、それら は両方とも無傷の精子上で光体の形質膜を染色したが、反応した精子の光体は染 色しなかった。第３に、抗−Ｔｃｔｅ−１ＩｇＧ及びＺＰ３の両方とも、インビ トロで精子の卵への結合を抑制した。

Ｎ−末端の６０個のアミノ酸及びアミノ酸残基２００から２３０の間の領域の例 外はあるが、ヒト及びマウスのｔｃｔｅ−１タンパク質は高度に保存されている 。両方の領域が高度に親水性であり、細胞表面におけるそれらの存在及び種特異 的な認識における役割に合致することを記述することは興味がある。

７、実施例　ＩＣｔｅ−１は種々の種において発現する牛、豚、犬、ウサギ、モ ルモット、ヒト、サル、ニワトリ、アフリカッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　Ｉａ ｅｖｉｓ）及びゼブラフィッシュのゲノムＤＮＡをＴａｑ　Ｉ制限酵素で消化し 、プローブとして［３２ｐ　］でラベルしたマウスＴＣｔｅ−ｉ全ｃＤＮＡを使 用してサザンプロットを行った。ハイブリッド形成の条件は６５８Ｃであり、６ ５°ＣてＯ，］　Ｘ５ＳＣて洗った。第１６図に示すように、Ｔｃｔｅ−１プロ ーブは試験したすべての種に対応するＤＮＡレーンにおいて明白なバンドにハイ ブリッド形成したが、これはｔｃｔｅ−タンパク質が異なる種々により発現され ることを示している。

８、実施例：ヒトＴＣＴＢ−１に対するモノクローナル抗体の生成マウスを上記 第６節で記載したようにＴＣＴＥ−１融合タンパク質５０μｇで免疫し、次いで ４週間後にＴＣＴＥ−１１００μｇで追加免疫しくｂｏｏｓｔｅｄ）、さらに４ 週間後にＴＣＴｆ！−１２５月ｇで追加免疫した。

１週間後に、標準的な方法を使用してハイブリドーマを生成させるための融合を 行った。ウェスタンプロットにより、ハイブリドーマの上澄みについて抗−ＴＣ ＴＥ−１抗体の存在を試験した。第１７図に示されるように、ハイブリドーマ４ Ｆ７からの上澄みは、選択的にヒトＴＣＴＥ−１融合タンパク質に結合した。

９、実施例：抗−ＴＣＴＥ−１抗体を使用するヒト精子の免疫蛍光ラベル化 ポリーＬ−リジンでコーティングしたスライド上に１１００ｎ／μｌの濃度の精 子のアリコート４０μｌを円を囲むよう適用し、２０分間接着させた。スライド を４％ホルムアルデヒドＰＢＳ溶液で１５分間固定し、グリシン１００ｍＭで、 次いで１％の通常ヤギ血清ＰＢＳ溶液で洗った。抗−ＴＣＴＥ−１ＩｇＧ又は免 疫前（ｐｒｅｉｍｍｕｎｅ）　ＩｇＧを０．１８２７８ｍの濃度で使用した。ス ライドをＰＢＳで３回洗い、ビオチン−ラベル化ヤギ抗−ウサギＩｇＧ　（１： ２００）で処理し、再び洗い、アビジンでラベルしたＦｒＴＣで処理した。最終 セットのＰＢＳ洗浄の後に、スライドを１０ｍＭのトリスｐＨ７，５ですすぎ、 ３７℃で乾燥させ、グリセロール中に載置した。ＦＩＴＣ染色の正確な位置測定 のために、紫外線による同時エビ照明（ＦＩＴＣ励起のため）及び重層している 位相差イメージのための白色光による透視によりカラー写真をとった。第１８図 はヒト精子の写真であり、ＴＣＴＥ−１タンパク質の免疫蛍光ラベル化を示して いる。

１０、微生物の寄託 以下の寄託をアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ、ロックビル 、ＭＤ）に行った。

（ｉ）ヒトＴＣＴＥ−］、　ｃＤＮＡを含有するプラスミドｐｈＴｃＴＥ！１は 、１９９１年９月９日に寄託され、寄託番号７５０９５が付与された；（ｉｉ） ヒトＴＣＴＥ−１ゲノムＤＮＡを含有するファージｌｈ　ＴＣＴＥ　１　ｇは、 １９９１年９月９日に寄託され、寄託番号７５０９７が付与された；（ｊｉ）？ ウスＴｃｔｅ−１ｃＤＮＡを含有するプラスミドｐｍ　ＴＣＴＥ　１は、１９９ １年９月９日に寄託され、寄託番号７５０９６が付与された；及び（ｉｖ）バイ ブリド−７ＴＣＴＥ　＋−４Ｆ７．１９９２年ＩＯ月１日に提出され、１９９２ 年１０月２日に受理され、その寄託番号はＨＢ１１１４４である。

種々の文献が本明細書で引用されたが、ここではそのすべてが参考として組み入 れられる。

（来貢以下余白） ■Ｉ−＋■ト　■ト　ωト　■ｒ１　（７）ト　■ｒ＼ｎＪ　ｒ＋１−？　ｌ／ ”＋　ψＩ＋＋　■ｏ）　ｗ　−＋ｕ　ｒ−＋　ｗ　ｕ”’＋−一　〜〜　内＋ −’＋　ｌｌ’ｌ　ＬＴＩ　ψψ　ｒ鳥トＪ４６　ＰＧＡＱＳＬへ１４八［△） 、ＩＮＴＮＬ■Ｆ’ＬＮＬＲＬＮＣＩＥＤＥＧＧＱＡ＋八■八ＬＥＴＮＫＣＬＳ ＶＬＨＬＧ　３９’５へ４へ　ＰＧ八へＳＬΔ）（八ＬＡＨＮＴＮＬ］５ＬＮＬ ＲＬＮＣＩＥＤ［ＧＧＱＡＬＡＨＡＬＱＴＮＫＣＬＴＴＬＨＬＧ　３９Ｂ’１９ ６　ＧＮＫＬＳＥＰＴＡＴＬＬＳＱＭＬＴＶＮＴＴＬＶＳＬＮＬＳＣＮ）ＩＩＧ ＱＩＩＧＧＫＧＬＬＥＧＩＳＩＩＮＫＴＩ　４４５３９９　６Ｎ［１−５ＬＰＴ Ａ丁を十５ＱＶＬ△Ｉ）ＪＴＴＬＴＳＩＮＩ−ＳＣＮＨＩらＬＩＩＧＧＫＯＬＩ 工Ｇ）ＩＳＤＮＫＴＬ　４４８４４６　Ｌ［ＦＤＬｌｌ’ＬＳＤＶＳＤ［Ｓ［Ｙ ＬＩＧＱＶＬＨＡＮＲＥＭＲＱＲ丁ＬＮＰＧＨｒ、５ＳＰＴＮＮＣＴ［Ｎ　４９ ４４４９　Ｌ［ＦＩ］Ｌ１１１’ＬＳＤＶ八ＱｉＩＳ［ＹＬＩＧＱＡＬＹＡＮＲ ［八＾ＲＱＲＡＩ−ＮＰＳＨＦ）ＩＳＴＪＴへＮ［Ｐ［Ｎ　４X８ ４９９　ＳＶＧ　５０１ ＦＩＧ、５Ｂ ＦＩＧ、　６Ａ 免疫前１ｇＧ　抗−Ｔｃｔｃ　ｌ　ＩｇＧ−６６ＫＤ ＦＩＧ、　１０ 旬間　（１−Ｔｃｋ−Ｉ ＦＩＧ、　１３Ａ ＦＩＧ、　１３Ｂ ＦＩＧ、　１４Ａ Ｂ６Ｄ２Ｆ　１１ 全 ＦＩＧ、１６ ↓↓ ＦＩＧ、　１７ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　１６／２８　 ８３１８−４ＨＣ１２Ｎ　１／２１　７２３６−４Ｂ Ｃ１２Ｐ　２１１０２　Ｃ９２８２−４Ｂ２１１０８　９１６１−４Ｂ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ （ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、　ＭＲ， ＳＮ、　ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　Ｃ５，Ｆ Ｉ、　ＨＵ。

Ｊ　Ｐ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　Ｎｏ、　ＰＬ、　Ｒ○、　 ＲＵ、ＳＤ、　ＵＳ ＦＩ （７２）発明者　ツァイ、ジエンーニーアメリカ合衆国　０８８７３　ニューシ ャーシー州　サマーセット、ダグラス　ガーデンアパートメンツ、ハミルトン　 ストリート４３０ディ−

Claims (40)

【特許請求の範囲】
1. １．実質的に図３に示したヒトＴＣＴＥ−１の配列を有する実質的に精製した核 酸分子。
2. ２．実質的に図３に示した、ＴＣＴＥ−１タンパク質のＮ末端６０アミノ酸残基 をコードする、およそヌクレオチド１４９からおよそヌクレオチド３２８まで延 びる部分の配列を有する請求項１の実質的に精製した核酸分子の一部分。
3. ３．ＴＣＴＥ−１について実質的に図３に示した、およそヌクレオチド３２９か らおよそヌクレオチド１６７２まで延びる部分の配列を有する請求項１の実質的 に精製した核酸分子の一部分。
4. ４．実質的に図５に示したアミノ酸配列を有するヒトＴＣＴＥ−１タンパク質を コードする実質的に精製した核酸分子。
5. ５．アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託して受託番号７５０ ９７を有する１ｈＴＣＴＥｌｇ中に含まれる配列を有する実質的に精製した核酸 分子。
6. ６．核酸ベクター中に含まれる請求項１または４の核酸分子。
7. ７．プロモーター配列に連結されている請求項１または４の核酸分子。
8. ８．他の遺伝子の少なくとも一部分に連結されている請求項１または４の核酸分 子。
9. ９．請求項１または４の核酸分子を導入した微生物。
10. １０．請求項１または４の核酸分子を導入した細胞。
11. １１．請求項１または４の核酸分子を導入したトランスジェニック動物。
12. １２．実質的に精製したヒトＴＣＴＥ−１タンパク質。
13. １３．実質的に図５に示した配列を有する請求項１２のＴＣＴＥ−１タンパク質 、またはその機能的な等価物、断片もしくは誘導体。
14. １４．実質的に図５に示したアミノ酸１から６０まで延びる部分の配列を有する 請求項１２のＴＣＴＥ−１タンパク質。
15. １５．実質的に図５に示したアミノ酸６１から５０３まで延びる部分の配列を有 する請求項１２のＴＣＴＥ−１タンパク質。
16. １６．請求項１３のＴＣＴＥ−１タンパク質、断片または誘導体からなる実質的 に精製したタンパク質。
17. １７．（ｉ）約５０ｋＤの分子量；および（ｉｉ）精子溶解液中に存在する５０ ｋＤタンパク質と実質的に同一である、対応する長さのｔｃｔｅ−１配列に対し て少なくとも８０％の相同性；を有する実質的に精製したタンパク質。
18. １８．（ｉ）約３５ｋＤの分子量：および（ｉｉ）肝臓および脳の抽出液中に存 在する３５ｋＤタンパク質と実質的に同一である、対応する長さのｔｃｔｅ−１ 配列に対して少なくとも７５％相同である少なくとも２０アミノ酸の相同領域； を有する実質的に精製したタンパク質。
19. １９．ｔｃｔｅ−１に対する実質的に精製した抗体。
20. ２０．ヒトＴＣＴＥ−１に対するものである、請求項１９の抗体。
21. ２１．ｔｃｔｅ−１タンパク質を含有するワクチン。
22. ２２．適当な製剤上の担体中に請求項１２または１３のＴＣＴＥ−１タンパク質 を含有する、請求項２１のワクチン。
23. ２３．ｔｃｔｅ−１タンパク質またはその免疫原性断片をコードする遺伝子を保 有している非病原性ウイルスを含有するワクチン。
24. ２４．前記遺伝子が請求項１または４に記載の核酸分子からなる、請求項２３の ワクチン。
25. ２５．避妊を必要とする対象者に有効量の請求項２１のワクチンを投与すること からなる免疫避妊法。
26. ２６．避妊を必要とする対象者に有効量の請求項２２のワクチンを投与すること からなる免疫避妊法。
27. ２７．避妊を必要とする対象者に有効量の請求項２３のワクチンを投与すること からなる免疫避妊法。
28. ２８．避妊を必要とする対象者に有効量の請求項２４のワクチンを投与すること からなる免疫避妊法。
29. ２９．避妊を必要とする対象者に有効量の請求項１９の抗体を投与することから なる免疫避妊法。
30. ３０．避妊を必要とする対象者に有効量の請求項２０の抗体を投与することから なる免疫避妊法。
31. ３１．特定の遺伝子型の精子を選択する方法であって、（ｉ）第２の種の動物か らのｔｃｔｅ−１タンパク質をコードするトランスジーンを保有している第１の 種のトランスジェニック非ヒト動物を作製すること、その際該トランスジーンは 対象の遺伝子と同じ染色体にあり、それ故トランスジェニック動物の二倍体細胞 が該トランスジーンおよび対象の遺伝子を保有する染色体を１コピーだけ含むこ と： （ｉｉ）トランスジェニック動物から精子を回収すること；（ｉｉｉ）タンパク 質の回収を可能にする担体に結合されている、ｔｃｔｅ−１と結合するタンパク 質に、該タンパク質へのｔｃｔｅ−１の結合を促進する条件下で、精子をさらす こと；（ｉｖ）精子に結合したタンパク質を回収すること；および（ｖ）該タン パク質から精子を放出させること；を含む上記方法。
32. ３２．精子によって発現されるｔｃｔｅ−１の量を増加させることからなる生殖 能の増強方法。
33. ３３．第１の種の非ヒト動物を、第１の種に由来するｔｃｔｅ−１タンパク質の 特性を有するタンパク質をコードする遺伝子をトランスジーンとして保有する第 ２の種の非ヒトトランスジェニック動物と交配させることからなる、種間雑種の 作製方法。
34. ３４．ＴＣＴＥ−１と結合するモノクローナル抗体。
35. ３５．ハイブリドーマ４Ｆ７により産生された抗体４Ｆ７である、請求項３４の モノクローナル抗体。
36. ３６．標的エピトープとの結合について請求項３５の抗体と競合し得るモノクロ ーナル抗体。
37. ３７．被験者の不妊症を診断する方法であって、（ｉ）被験者から集めた精子上 に発現されたｔｃｔｅ−１タンパク質の量を定量すること；および （ｉｉ）工程（ｉ）で定量したｔｃｔｅ−１タンパク質の量を、正常者の精子上 に発現されたｔｃｔｅ−１タンパク質の量と比較すること； を含み、その際被験者と正常者の精子上に発現されたｔｃｔｅ−１タンパク質量 の差は被験者が不妊でありうることを示すものである、上記方法。
38. ３８．正常者に対する被験者のｔｃｔｅ−１タンパク質量の差は、被験者により 発現されたｔｃｔｅ−１タンパク質量が正常者により発現されたｔｃｔｅ−１タ ンパク質量の７０％より少ないものである、請求項３７の方法。
39. ３９．正常者に対する被験者のｔｃｔｅ−１タンパク質量の差は、被験者により 発現されたｔｃｔｅ−１タンパク質量が正常者により発現されたｔｃｔｅ−１タ ンパク質量の５０％より少ないものである、請求項３７の方法。
40. ４０．正常者に対する被験者のｔｃｔｅ−１タンパク質量の差は、被験者により 発現されたｔｃｔｅ−１タンパク質量が正常者により発現されたｔｃｔｅ−１タ ンパク質量の２５％より少ないものである、請求項３７の方法。