ES2255247T3 - Gen genomico que codifica la proteina antigenica hm1.24 y su promotor. - Google Patents
Gen genomico que codifica la proteina antigenica hm1.24 y su promotor.Info
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Abstract
Un ADN genómico que codifica proteína de antígeno HM1.24, conteniendo dicho ADN 4 regiones de exones que codifican la secuencia de aminoácidos como se indica en SEQ ID NO 3, y tres intrones; en el que el primer intrón está situado entre el ADN que codifica los aminoácidos Val 95 y Met 96 de SEQ ID NO 3; en el que el segundo intrón está situado entre el ADN que codifica los aminoácidos Gly 118 y Glu 119 de SEQ ID NO 3; y en el que el tercer intrón está situado entre el ADN que codifica los aminoácidos Arg 138 y Arg 139 de SEQ ID NO 3.
Description
Gen genómico que codifica la proteína antigénica
HM1.24 y su promotor.
La presente invención se refiere a un gen
genómico que codifica proteína de antígeno HM1.24, a un promotor
del gen que codifica proteína de antígeno HM1.24 y a los usos de los
mismos.
Se ha preparado anticuerpo monoclonal
anti-HM1.24 de ratón usando un linaje celular de
mieloma humano KPC-32 como inmunógeno (Goto, T.
et al., Blood 84: 1922-1930, 1994). El
antígeno HM1.24 que es reconocido por este anticuerpo es una
proteína de membrana que tiene un peso molecular de 29 a 33 kDa que
se sobreexpresa en la superficie de células de mieloma. Además, se
ha confirmado su expresión para células normales en células B
productoras de inmunoglobulina (células de plasma, células
linfoplasmacitoides), pero la expresión se observa raramente en las
otras células y tejidos (Goto, T. et al., supra). Sin
embargo, no se sabe nada del antígeno HM1.24 excepto su
distribución de expresión y peso molecular.
Según la presente invención, como resultado de la
clonación de ADN genómico que codifica antígeno HM1.24, la
determinación de su secuencia de nucleótidos y la secuencia de
aminoácidos deducida, y búsqueda de homología adicional, se
demostró que el antígeno HM1.24 es una molécula idéntica a BST2, que
es un antígeno superficial expresado en las células de estroma
aisladas de la médula ósea de pacientes con mieloma, y la médula
ósea y la membrana sinovial de pacientes con artritis reumatoide.
Se ha mostrado que BST2 tiene capacidad de soportar el crecimiento
de pre-células B y se piensa que está implicado en
la patología de artritis reumatoide, pero sus otras funciones
fisiológicas no son conocidas (Ishikawa J. et al., Genomics
26: 527-534, 1995).
En la producción de un producto génico útil
derivado de un animal mediante ingeniería genética, ocurre a menudo
que el gen no se expresa, un producto génico o proteína no toma una
conformación correcta, la modificación
post-traducción no tiene lugar correctamente y
similares, cuando se usa un microorganismo hospedante tal como
Escherichia coli, Bacillus subtilis o levadura. Con el fin de
resolver tales problemas, se usan a menudo como hospedantes células
de animales, en cuyo caso la selección de un promotor tiene un gran
impacto en la eficacia de expresión. Los promotores convencionales,
usados frecuentemente para células de animales incluyen promotor de
SV40, promotor de citomegalovirus, promotor de actina y
similares.
Considerando el estado anterior de la técnica, se
proporciona un ADN genómico que codifica proteína de antígeno
HM1.24.
Se proporciona también un procedimiento para
producir proteína de antígeno HM1.24 usando células de animales por
medio de dicho ADN genómico.
Cuando ha de producirse un producto génico útil
en grandes cantidades usando como hospedante células de animales,
los promotores usados convencionalmente para células de animales no
son siempre satisfactorios en términos de actividad de
transcripción, y de aquí que haya una gran necesidad de desarrollo
de promotores más fuertes. Así, un objeto de la presente invención
es proporcionar un ADN que tiene una actividad de promotor más
fuerte como promotor para células de animales y usos del mismo.
Con el fin de resolver los problemas anteriores,
la presente invención proporciona un ADN genómico que codifica
proteína de antígeno HM1.24, comprendiendo dicho ADN 4 regiones de
exones que codifican la secuencia de aminoácidos como se indica en
SEQ ID NO: 3, y tres intrones; en el que el primer intrón está
situado entre el ADN que codifica los aminoácidos Val 95 y Met 96
de SEQ ID NO 3; en el que el segundo intrón está situado entre el
ADN que codifica los aminoácidos Gly 118 y Glu 119 de SEQ ID NO 3; y
en el que el tercer intrón está situado entre el ADN que codifica
los aminoácidos Arg 138 y Arg 139 de SEQ ID NO 3. Como ejemplo del
ADN genómico anterior, la presente invención proporciona un ADN
genómico que tiene la secuencia de nucleótidos como se indica en
SEQ ID NO: 2.
La presente invención proporciona también una
variante de empalme del ADN genómico anterior, codificando dicho
ADN proteína de antígeno HM1.24. Un ejemplo específico de la
presente invención es una variante de empalme que carece de los
exones 2 y 3.
A título de información, otros ejemplos incluyen
una variante de empalme que carece del exón 2, y similares.
La presente invención proporciona también un
procedimiento para producir proteína de antígeno HM1.24, cuyo
método comprende cultivar células de animales transformadas con un
vector de expresión que comprende el ADN genómico anterior.
Se proporciona también un ADN de secuencia de
promotor que tiene la secuencia de nucleótidos de la región no
codificante 5' como se indica en SEQ ID NO: 4 o un fragmento de ADN
de dicha secuencia que tiene actividad de promotor en células de
animales.
Se proporciona también un ADN que se hibrida con
el ADN anterior o un fragmento del mismo bajo una condición
rigurosa y que tiene actividad de promotor en células de animales.
El ADN anterior que tiene actividad de promotor se deriva
preferiblemente de células de animales, en particular células de
mamíferos.
Se proporciona también un ADN que se ha
modificado por supresión, adición y/o sustitución con otros
nucleótidos, de uno o una pluralidad de nucleótidos de la secuencia
de nucleótidos de la región no codificante 5' como se indica en SEQ
ID NO: 4 y que tiene actividad de promotor en células de
animales.
Se proporciona también un ADN recombinante en el
que un gen útil está enlazado operativamente al ADN anterior que
tiene actividad de promotor. Como los anteriores genes útiles,
pueden mencionarse, por ejemplo, ácidos nucleicos seleccionados del
grupo constituido por ácidos nucleicos que codifican proteínas
útiles, ADN antisentido, ARN antisentido, ácidos nucleicos que
codifican señuelos y ribozima.
Se proporciona también un vector que comprende el
ADN recombinante anterior. El vector es un vector plásmido o un
vector de virus.
Se proporcionan también células de animales en
las que se ha introducido el ADN recombinante anterior.
Se proporcionan también células de animales que
se han transformado con el vector anterior.
Se proporciona también un animal que tiene las
anteriores células de animal.
Se proporciona también un método para expresar un
gen útil, cuyo método comprende cultivar células de animales en las
que se ha introducido el ADN recombinante anterior.
Se proporciona también un procedimiento para
producir una proteína útil, cuyo procedimiento comprende cultivar
células de animales transformadas con un vector de expresión que
comprende un ácido nucleico que codifica una proteína útil enlazada
operativamente al ADN anterior que tiene actividad de promotor.
La Fig. 1 es un dibujo que muestra la secuencia
de nucleótidos de cADN que codifica proteína de antígeno HM1.24 y
la correspondiente secuencia de aminoácidos. La parte subrayada
muestra un motivo de unión de cadena de azúcar de tipo N.
La Fig. 2 es un dibujo que muestra la secuencia
de nucleótidos de cADN que codifica proteína de antígeno HM1.24 y
la correspondiente secuencia de aminoácidos.
La Fig. 3 es un diagrama esquemático que muestra
un clon P3.19 aislado usando el método de lavado en batea y 5
clones (IS1 a IS5) aislados por el método de inmunoexamen.
La Fig. 4 es un dibujo que muestra el resultado
de análisis de citometría de flujo usando anticuerpo
anti-HM1.24 (A: CHO/NEO, B: CHO/HM). El histograma
de anticuerpo anti-HM1.24 se representa por una
línea continua, y el del anticuerpo testigo (UPC10) que presentaba
un isotipo de adaptación se representa por una línea quebrada. En
la figura, la abscisa se refiere a intensidad de fluorescencia y la
ordenada a cuenta de células.
La Fig. 5 es una fotografía en la que se detectó
la expresión de antígeno HM1.24 en cada linaje celular y células de
CHO que expresan antígeno HM1.24 por el método de
inmunoprecipitación/manchas de Western usando anticuerpo anti-
HM1.24. Después de inmunoprecipitación usando la Sepharose 4B unida
a anticuerpo anti-HM1.24 (pistas
1-6) o Sepharose 4B no unida (pistas 7 y 8), las
manchas de Western se realizaron usando anticuerpo
anti-HM1.24 para detectar antígeno HM1.24 (mostrado
a la derecha). (*: cadena H de anticuerpo
anti-HM1.24).
La Fig. 6 es un dibujo que muestra un mapa de
restricción de la región 5'-no traducida que
comprende la región de promotor del gen de proteína de antígeno
HM1.24.
La Fig. 7 es un dibujo que muestra la secuencia
de nucleótidos de la región 5'-no traducida que
comprende la región de promotor del gen de proteína de antígeno
HM1.24. Se ha subrayado cada motivo de unión de factor de
transcripción.
La Fig. 8 es un dibujo que muestra la secuencia
de nucleótidos de la región 5'-no traducida que
comprende la región de promotor del gen de proteína de antígeno
HM1.24. Se ha subrayado cada motivo de unión de factor de
transcripción, la secuencia tipo TATA se ha encajonado, el punto de
iniciación de la transcripción está representado por una flecha y
la región que codifica 7 aminoácidos en el terminal N de la proteína
está representada por el código de aminoácidos de una letra.
En la Fig. 9, (A) muestra la posición de un
cebador correspondiente al genoma que codifica proteína de antígeno
HM1.24, y (B) muestra la secuencia de bases de cada cebador.
La Fig. 10 es un dibujo que muestra un mapa de
restricción de ADN genómico que codifica proteína de antígeno
HM1.24, y las posiciones de los correspondientes exones e
intrones.
La Fig. 11 es un dibujo que muestra un mapa de
restricción de ADN genómico que codifica proteína de antígeno
HM1.24, y la correspondiente secuencia de aminoácidos (lado aguas
arriba). La flecha muestra el punto de iniciación de la
transcripción y el subrayado muestra el motivo de unión de cadena de
azúcar tipo N.
La Fig. 12 es un dibujo que muestra la secuencia
de nucleótidos de ADN genómico que codifica proteína de antígeno
HM1.24 y la correspondiente secuencia de aminoácidos (lado aguas
abajo). El doble subrayado muestra la señal de poli
A-adición.
La Fig. 13 es un dibujo que muestra la secuencia
de nucleótidos de una variante de empalme de proteína de antígeno
HM1.24 humana y la correspondiente secuencia de aminoácidos. La
parte subrayada muestra dónde es diferente la secuencia de
aminoácidos de la de proteína de antígeno HM1.24 humana.
La Fig. 14 es un dibujo que muestra la secuencia
de nucleótidos del ADN genómico de proteína de antígeno HM1.24.
Estaba presente un genoma que tiene mutaciones, a \rightarrow g en
posición 178, g \rightarrow a en posición 262 y t \rightarrow c
en posición 323, así como una supresión de uno de 9 a's cerca de la
posición 360. El símbolo "*" representa un punto de iniciación
de transcripción. Había también un genoma en el que 19 pb en
posiciones 93-111 se repiten en tándem. El símbolo
"\rightarrow" muestra la posición del cebador sentido.
La Fig. 15 muestra la secuencia de nucleótidos
del ADN genómico de proteína de antígeno HM1.24 y la
correspondiente secuencia de aminoácidos. Había también un genoma en
el que estaban suprimidas 8 pares de bases en posiciones
551-558. El símbolo "\leftarrow" muestra la
posición del cebador antisentido.
La Fig. 16 es un dibujo que muestra la secuencia
de nucleótidos del ADN genómico (lugar de intrón) de proteína de
antígeno HM1.24. La \rightarrow muestra la posición del cebador
sentido.
La Fig. 17 muestra la secuencia de nucleótidos
del ADN genómico de proteína de antígeno HM1.24 y la
correspondiente secuencia de aminoácidos. La \rightarrow muestra
el cebador sentido y la \leftarrow indica el cebador
antisentido.
La Fig. 18 muestra la secuencia de nucleótidos
del ADN genómico de proteína de antígeno HM1.24 y la
correspondiente secuencia de aminoácidos. Había también un genoma en
el que 3 de los 5 c's cerca de la posición 2315 estaban suprimidos.
La \leftarrow muestra la posición del cebador antisentido.
Un gen genómico que comprende un ADN genómico y
una región de promotor de antígeno HM1.24 humano puede
multiplicarse fácilmente por un método de PCR usando cebadores
adecuados. Así, un ADN genómico de antígeno HM1.24 humano puede
multiplicarse diseñando un cebador sentido que se hibride con el
extremo 5' de una secuencia de ADN genómico como se indica en SEQ
ID NO:2 y un cebador antisentido que se hibride con el extremo 3', y
realizando después una reacción PCR usando una polimerasa, tal como
AmpliTaq (Perkin Elmer), LA-Taq (Takara Shuzo) y
similares, y usando como plantilla ADN genómico humano preparado
según un método estándar. Un producto de PCR puede insertarse
directamente en un vector de clonación tal como pCRII (Invitrogen) o
pGEM-T (Promega).
Introduciendo un lugar de reconocimiento de
enzima de restricción en un cebador sentido o un cebador
antisentido, puede insertarse en un vector deseado.
Puede multiplicarse también por el mismo método
ADN genómico que contenga una región de promotor de antígeno HM1.24
humano. Así, puede obtenerse un fragmento de ADN deseado diseñando
un cebador sentido que se hibride con el extremo 5' de la secuencia
como se indica en SEQ ID NO: 4 y un cebador antisentido que se
hibride con el extremo 3', y multiplicando después por una reacción
PCR usando como plantilla ADN genómico
humano.
humano.
Un ADN genómico que codifica proteína de antígeno
HM1.24 de la presente invención comprende, como se muestra en la
Fig. 10, 4 exones y 3 intrones enlazándolos, y sus secuencias de
nucleótidos específicas y secuencias de aminoácidos deducidas de
las regiones de exón son como se muestra en las Figs. 11 y 12 (SEQ
ID NOs: 2 y 3). Así, el exón 1 codifica del aminoácido Met en
posición 1 al aminoácido Val en posición 95; el exón 2 codifica del
aminoácido Met en posición 96 al aminoácido Gly en posición 118; el
exón 3 codifica del aminoácido Glu en posición 119 al aminoácido
Arg en posición 138; y el exón 4 codifica del aminoácido Arg en
posición 139 al aminoácido Gln en posición 180.
La presente invención proporciona también
variantes de empalme de ADN genómico que codifica proteína de
antígeno HM1.24, en las que se separan los exones 2 y 3.
Se proporcionan también variantes de empalme de
ADN genómico que codifica proteína de antígeno HM1.24 que tienen
una secuencia de nucleótidos de ADN en las que el codón
correspondiente a cada aminoácido de un exón está fuera de posición
porque la secuencia de nucleótidos en un exón estaba suprimida
debido a empalme.
Puesto que las variantes de empalme tienen los
marcos de lectura de diferentes secuencias de aminoácidos, tienen
secuencias de aminoácidos diferentes de las de la proteína de
antígeno HM1.24 codificada por los exones 1 a 4. Como ejemplo de
tales variantes de empalme, puede mencionarse una variante de
empalme que tiene la secuencia de nucleótidos y la secuencia de
aminoácidos como se indica en SEQ ID NO: 17.
Un ADN genómico que codifica proteína de antígeno
HM1.24 de la presente invención puede obtenerse clonando un cADN
que codifica proteína de antígeno HM1.24, usando después este cADN
para diseñar un cebador oligonucleótido, que se multiplica por el
método de PCR usando como plantilla ADN genómico. Con el fin de
clonar cADN, se cultivan células de animales que expresan antígeno
HM1.24, por ejemplo células KPMM2, y del cultivo de células se
extrae ARN total según un método estándar y se enriquece después
mARN.
A modo de información, en base al mARN anterior,
se sintetiza cADN por un método estándar, que se fracciona usando
un gel de agarosa de bajo punto de fusión. Se inserta después cADN
que tiene un tamaño de 0,7 kpb o mayor en un vector de expresión
pCOS1 o vector \lambdaExCell para preparar una genoteca A que se
usa para examinar por clonación de expresión directa, es decir,
lavado en batea, y una genoteca B que se usa para inmunoexamen.
Para examinar por el método de lavado en batea,
se introdujo un plásmido de expresión que constituye la genoteca A
en células COS-7 usando electroporación. Después de
cultivar, se rasquetearon células incorporadas y se pusieron en
contacto con una placa de lavado en batea revestida con anticuerpo
anti-HM1.24 para permitir incorporarse a la placa
las células que expresan HM1.24. Se extrajo después ADN plásmido de
las células incorporadas a la placa, se multiplicó en E.
coli y se usó para el lavado en batea subsiguiente. El
procedimiento de lavado en batea se repitió tres veces para
seleccionar clones que expresan antígeno que reacciona con
anticuerpo anti-HM1.24, y se designó a uno de los
clones como clon P3.19.
La determinación de secuencia reveló que el clon
P3.19 consiste en 1.012 pb y contiene un marco de lectura abierto
que codifica 180 aminoácidos. La secuencia de nucleótidos del
inserto de cADN en este clon P3.19 y la correspondiente secuencia
de aminoácidos se muestran en la Fig. 1 y SEQ ID NO: 1. La secuencia
de aminoácidos sola es muestra en SEQ ID NO: 3.
Para inmunoexamen, por otra parte, se cultivó un
fago que constituye la genoteca B junto con E. coli NM522 en
una placa de agar, el producto de expresión se transfirió a un
filtro de nitrocelulosa y el filtro se puso en contacto con una
solución de anticuerpo anti-HM1.24. Se detectó el
anticuerpo anti-HM1.24 que se unió al filtro
mediante unión con el producto de expresión con suero
anti-inmunoglobulina (Ig) de ratón marcado.
Esto produjo 5 clones positivos:
IS-1 a IS-5. Se determinaron las
secuencias de nucleótidos de estos insertos de cADN y se compararon
con la secuencia de nucleótidos del cADN del anterior P3.19. La
comparación reveló, como se muestra en la Fig. 3, que cualquier
cADN en los clones IS-1 a IS-5 era
parte del cADN de P3.19 y que el extremo 5' se había suprimido en
P3.19.
Después, tras introducir P3.19 en células CHO
para transformar las células, se realizó citometría de flujo usando
anticuerpo anti-HM1.24. El resultado confirmó, como
se muestra en la Fig. 4, que se expresaba antígeno HM1.24. Además,
como se muestra en la Fig. 4, se confirmó que P3.19 codificaba
también antígeno HM1.24 por inmunoprecipitación.
Después, como se muestra en la Fig. 9A, la
secuencia de cADN se dividió en cuatro regiones, y se diseñaron
pares de cebadores como se muestra en la Fig. 9B para multiplicar
cada parte. La genoteca genómica preparada según un método estándar
se multiplicó por PCR usando cada par de cebadores anteriores, que
se ligaron después entre sí para obtener un ADN genómico de
longitud completa.
El resultado se muestra en las Figs. 11 y 12 y la
SEQ ID NO: 2. Como puede verse, el ADN genómico que codifica
proteína de antígeno HM1.24 tiene 4 exones y 3 intrones que los
enlazan. Estas relaciones se muestran esquemáticamente en la Fig.
10, que muestra también un mapa de restricción de ADN genómico.
La presente invención se refiere también a un
procedimiento para producir proteína de antígeno HM1.24, cuyo
método comprende cultivar células de animales transformadas con un
vector de expresión en el que se ha insertado el anterior ADN
genómico. Como células de animales para uso en este procedimiento,
pueden usarse diversas células de animales, por ejemplo, descritas
después con respecto a los promotores mencionados aquí
posteriormente, y se prefieren cultivos de células de seres humanos,
mamíferos distintos de seres humanos, insectos y similares. Por
ejemplo, se usan HeLa, etc. como cultivo de células de seres
humanos; se mencionan CHO, COS, mieloma, BHK, Vero, etc. como
cultivos de células de mamíferos distintos de seres humanos; y se
mencionan cultivos de células de gusano de seda, etc. como cultivos
de células de insectos. Como vectores para introducir ADN que
codifica la proteína de antígeno HM1.24 de la presente invención en
células de animales, se usan por ejemplo vectores fagos
tales
como M13.
como M13.
Puede realizarse cultivo de células de animales
para producir proteína de antígeno HM1.24 según un método estándar,
y puede realizarse también el aislamiento de proteína de antígeno
HM1.24 del cultivo según un método estándar.
El hibridoma HM1.24 que produce anticuerpo
monoclonal anti-HM1.24 de ratón, que reconoce
específicamente proteína de antígeno HM1.24, se ha depositado
internacionalmente bajo las disposiciones del Tratado de Budapest
como FERM BP-5233 el 14 de Septiembre de 1995 en el
National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of
Industrial Science and Technology, de 1-3, Higashi
1-chome, Tsukuba-shi, pref. de
Ibaraki, Japón.
El promotor mencionado aquí y sus usos se
explicarán ahora seguidamente.
El término "promotor" según se usa aquí
incluye, aunque sin limitarse a ella, una región que está situada
20-30 pares de bases aguas arriba del punto de
iniciación de la transcripción (+1) y que incluye una caja TATA o
una región de tipo caja TATA responsable de dirigir polimerasa de
ARN para iniciar la transcripción en una posición correcta, y,
además de esta región, puede incluir regiones que se requieren para
asociarse con proteínas, distintas de polimerasa de ARN, para
ajustar la expresión. Cuando se menciona aquí la expresión
"región de promotor", significa una región que incluye el
promotor según se usa aquí.
La expresión "actividad de promotor" según
se usa aquí significa una capacidad o una función de ligarse a un
gen útil aguas abajo del promotor en un estado que permite la
expresión, de modo que cuando se introduce en un hospedante (célula
de animal) puede producir intracelular o extracelularmente un
producto génico del gen útil. En general, la presencia o ausencia
y/o intensidad de un promotor se expresa como la actividad del
promotor ligando, aguas abajo del promotor, un gen (gen informador)
que codifica una proteína fácilmente cuantificable en un estado que
permite la expresión, introduciéndole en un hospedante, y
determinando después la cantidad de la proteína expresada. Así,
cuando se confirma la expresión de productos génicos de un gen útil
intracelular o extracelularmente después de ligarse el gen útil
aguas abajo del promotor e introducirse en un hospedante, el
promotor debe tener una actividad de promotor en el hospedante en el
que se introdujo el gen.
La expresión "células de animales" según se
usa aquí incluye células derivadas de seres humanos, pero no están
limitadas a ellas en tanto en cuanto el promotor mencionado aquí
tenga una actividad de promotor en una célula de animal. Por
ejemplo, pueden mencionarse mamíferos distintos de seres humanos
(por ejemplo, ratones, ratas, conejos, cabras, cerdos, vacas,
caballos, perros, monos y chimpancés), aves (por ejemplo, pollos,
pavos, codornices, patos y gansos), reptiles (por ejemplo,
serpientes, cocodrilos y tortugas), anfibios (por ejemplo, ranas,
salamandras y tritones), peces (por ejemplo, scads, caballa, lubina,
besugos, perca de mar, colas amarillas, atún, salmón, trucha,
carpa, ayu, anguila, lenguados, tiburones, rayas y esturiones).
La expresión "genes útiles" según se usa
aquí incluye, por ejemplo, ácidos nucleicos que codifican proteínas
que pueden expresarse en células de animales, ADN antisentido o ADN
sentido de genes derivados de células de animales, ácidos nucleicos
que codifican señuelos que tienes genes que codifican las proteínas
de unión de factores de transcripción derivados de células de
animales o secuencias de los lugares de unión de factores de
transcripción o secuencias similares, y ribozimas que dividen mARN
derivado de células de animales.
Los ácidos nucleicos que codifican proteína que
puede expresarse en células de animales incluyen, aunque sin
limitarse a ellos, los derivados de animales y siempre que puedan
expresarse en células de animales, los derivados de microorganismos
tales como bacterias, levaduras, actinomicetos, hongos,
Ascomicetos y Basidiomicetos, o también se incluyen
los derivados de organismos vivos tales como plantas e insectos en
los genes útiles mencionados en esta memoria descriptiva.
La expresión "ácidos nucleicos que codifican
señuelos" según se usa aquí significa ADN que tiene genes que
codifican las proteínas de unión de factores de transcripción
derivados de células de animales o secuencias de los lugares de
unión de factores de transcripción o secuencias similares, que se
introducen como "señuelos" en células para suprimir la acción
de los factores de transcripción. El término "ribozimas" según
se usa aquí significa aquellas que dividen mARN de proteínas
específicas, y que inhiben la traducción de estas proteínas
específicas.
La ribozima puede diseñarse a partir de
secuencias de genes que codifican proteínas específicas y, para una
ribozima de tipo cabeza de martillo, por ejemplo, puede usarse el
método según se describe en FEBS Letter, 228:
228-230 (1988). Además de las ribozimas de tipo
cabeza de martillo, pueden incluirse en la ribozima según se usa
aquí cualquier tipo de ribozimas, incluyendo las ribozimas de tipo
horquilla, las ribozimas de tipo delta y similares, que dividen
mARN de estas proteínas específicas y que inhiben la traducción de
estas proteínas específicas.
Ligando un gen útil aguas debajo de un fragmento
de ADN que tiene la actividad de promotor como se describe aquí en
un estado que permite la expresión, puede aumentarse la expresión
del gen útil. Así, se expresan genes útiles en células de animales
en las que se ha introducido, con o sin uso de un vector, ADN
recombinante que comprende ADN que tiene la actividad de promotor
descrita aquí y un gen útil ligado en un estado que permite la
expresión. Como vector, se usan preferiblemente vectores plásmidos o
vectores de virus. Cuando no se usan vectores, pueden introducirse
fragmentos de ADN según los métodos descritos en la bibliografía
[Virology, 52: 456 (1973); Molecular and Cellular Biology, 7: 2745
(1987); Journal of the Nacional Cancer Institute, 41: 351 (1968);
EMBO Journal, 1: 841 (1982)].
Están también abarcados aquí células de animales
que tienen tales fragmentos de ADN recombinante descritos aquí y
animales que tienen tales células de animales. Como genes útiles
cuya expresión puede aumentarse, pueden mencionarse, como se ha
descrito antes, ADN que codifica proteína, ADN antisentido, ARN
antisentido, polinucleótidos que codifican un señuelo, secuencias
de nucleótidos que funcionan como un señuelo, ribozimas y
similares. También se describen métodos para producir proteínas de
interés y métodos para expresar genes útiles usando un fragmento de
ADN que tiene la actividad de promotor descrita aquí.
Así, también se abarca aquí un procedimiento para
producir proteína, en el que dicho procedimiento comprende ligar un
ácido nucleico que codifica proteína aguas debajo de ADN que tiene
la actividad de promotor como se describe aquí en un estado que
permite la expresión, cultivar una célula de animal transformada con
un vector que contiene el ADN recombinante obtenido así, y cosechar
dicha proteína del cultivo. De manera similar, se describe aquí un
método para expresar un gen útil que comprende ligar un gen útil
aguas abajo de ADN que tiene la actividad de promotor descrita aquí
en un estado que permite la expresión, introducir el ADN
recombinante obtenido así en una célula de animal y cultivar, o el
método para expresar un gen útil usando una célula de animal,
comprendiendo dicho método transformar una célula de animal con un
vector que contiene dicho ADN recombinante y cultivar dicha célula
de animal.
ADN que tiene actividad de promotor descrita aquí
es ADN que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la región
no codificante de extremo 5' como se indica en SEQ ID NO: 4 o un
fragmento de ella que conserve actividad de promotor. La región no
codificante de extremo 5' significa la secuencia de nucleótidos
hasta la posición 2040 en SEQ ID NO: 4. Se sabe que se requiere un
tamaño de 5 nucleótidos o mayor para presentar una actividad de
promotor en células de animales. Así, fragmentos de ADN que tienen
la actividad de promotor descrita aquí tienen un tamaño de al menos
5 nucleótidos o superior, preferiblemente 30 nucleótidos o mayor, y
más preferiblemente 2000 nucleótidos o superior.
También se describe aquí ADN que puede hibridarse
con ADN que tiene la secuencia de nucleótidos como se indica en SEQ
ID NO: 4 bajo una condición rigurosa y que tiene actividad de
promotor. El ADN hibridante es por ejemplo una genoteca de ADN
genómico derivada de fuentes naturales, por ejemplo mamíferos tales
como seres humanos, ratones, ratas y monos. Como condición
rigurosa, puede mencionarse por ejemplo una condición rigurosa
baja. A modo de ejemplo, una condición rigurosa baja es una
condición de lavado proporcionada por 42ºC en 5 x SSC, 0,1% de
dodecilsulfato sódico y 50% de formamida. Más preferiblemente, puede
mencionarse una condición rigurosa alta. A modo de ejemplo, una
condición rigurosa alta es una condición de lavado proporcionada
por 60ºC en 0,1 x SSC y 0,1% de dodecilsulfato sódico.
También se describe aquí un fragmento de ADN que
se ha modificado por supresión, adición y/o sustitución con otras
bases, de uno o una pluralidad de nucleótidos en la secuencia de
nucleótidos del promotor como se indica en SEQ ID NO: 4 y que
conserva actividad de promotor. El grado de modificación está en el
intervalo del 70% de homología con la secuencia de nucleótidos como
se indica en SEQ ID NO: 4, preferiblemente una homología del 80% o
mayor, y más preferiblemente una homología del 90% o superior.
"Homología" según se usa aquí significa el
grado de identidad de residuos presentado por dos o más secuencias
de nucleótidos o secuencias de aminoácidos complementarias (Gene
Cloning 2ª edición, T.A. Brown, Chapman y Hall, 1990). Así, una
homología del 90% significa que 90 residuos o más de 100 son
idénticos en dos o más secuencias.
Se explicarán ahora seguidamente un procedimiento
para producir ADN que tiene la actividad de promotor descrita aquí,
un fragmento y una versión modificada del mismo. El ADN que tiene la
secuencia de nucleótidos como se indica en SEQ ID NO: 4 se
multiplicó por PCR usando un cebador AP1
(5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3') (SEQ
ID NO: 5) correspondiente a un adaptador y el cebador HM1
(secuencia: 5'- ATC CCC GTC TTC CAT GGG CAC TCT GCA -3' (SEQ ID NO:
6) correspondiente a los nucleótidos Nos. 47-72 de
clon P3.19 de cADN clonado por el método de lavado en batea
mencionado antes, y una genoteca de ADN genómico humano como
plantilla y después, usando como plantilla el producto multiplicado
por PCR, se realiza una PCR encajada usando el cebador AP2
(secuencia: ACTATAGGGCACGCGTGGT) (SEQ ID NO: 7) y el cebador HM2
(secuencia: 5'- ATA GTC ATA CGA AGT AGA TGC CAT CCA G -3') (SEQ ID
NO: 8) correspondiente a los nucleótidos 19-40 del
clon P3.19 para subclonar en un vector de clonación pCRII
(Invitrogen). Por determinación de secuencia, se obtuvo ADN que
tenía la secuencia de nucleótidos como se indica en SEQ ID NO:
4.
Puede obtenerse un fragmento de ADN que tenga un
promotor, por ejemplo, de la siguiente manera. Pueden usarse un
método para digerir un ADN subclonado en el vector de clonación
pCRII anterior con enzimas de restricción, ScaI, BamHI, PvuII,
PstI, etc., un método usando un tratamiento de ultrasonicación, una
síntesis química por el método de fosforamidita, un método de
preparación usando un método de reacción en cadena de polimerasa,
etc. Por ejemplo, puede prepararse fácilmente un fragmento de ADN
deseado preparando un cebador como sea apropiado a partir de la
secuencia de ADN de SEQ ID NO: 4 y realizando después una reacción
en cadena de polimerasa.
Puede usarse un método de hibridación que utiliza
la secuencia de nucleótidos del promotor descrito aquí para obtener
un promotor de un gen derivado de otras células. En este caso, por
ejemplo, puede usarse el siguiente método. Primero, un ADN
cromosómico obtenido de una fuente de genes de otras células se liga
a un vector plásmido o fago y se introduce después en un hospedante
según un método estándar para construir una genoteca. La genoteca
se cultiva en una placa, y las colonias o placas desarrolladas se
transfieren a una membrana de nitrocelulosa o nylon, que se somete
a desnaturalización para inmovilizar ADN sobre la membrana. La
membrana se incuba en una solución que contiene una sonda (como
sonda, un fragmento de ADN como se indica en SEQ ID NO: 4 o una
porción del mismo) marcada previamente con ^{32}P, etc. para
formar un híbrido entre el ADN en la membrana y la sonda.
Por ejemplo, una membrana con ADN inmovilizado se
somete a hibridación con una sonda en una solución que contenga 6 x
SSC, 1% de dodecilsulfato sódico (SDS), 100 \mug/ml de ADN de
esperma de salmón, 5 x Denhardt a 65ºC durante 20 horas. Después de
hibridar, se separa por lavado la adsorción no específica, y se
realiza autoradiografía, etc. para identificar clones que se
hibridaron con la sonda. El procedimiento se repite hasta obtener
un clon simple que formó un híbrido. En un clon obtenido así, debe
insertarse ADN que codifique un promotor deseado.
El promotor anterior que se ha modificado por
supresión, adición y/o sustitución de nucleótidos puede prepararse
mediante, por ejemplo, métodos conocidos convencionalmente tales
como mutagénesis dirigida por el lugar o un método de PCR.
Se determina del gen obtenido su secuencia de
nucleótidos, por ejemplo, de la siguiente manera para confirmar que
el gen obtenido es un promotor de interés. Para determinar la
secuencia de nucleótidos, en el caso de un clon obtenido por
hibridación, se cultiva el transformante en un tubo de ensayo si es
El coli, y se extrae de él un plásmido según un método
estándar. Éste se divide con una enzima de restricción para extraer
un fragmento insertado, que se subclona en el vector fago M13, etc.,
y se determina la secuencia de nucleótidos por el método didesoxi o
similar.
Cuando el transformante es un fago, pueden
emplearse etapas esencialmente similares para determinar la
secuencia de nucleótidos. Se realizan procedimientos básicos de
cultivo para determinar secuencia de nucleótidos en, por ejemplo,
Molecular Cloning: A laboratory Manual, Segunda edición, T.
Maniatis, Capítulo Uno, págs. 90-104, Cold Spring
Harbor Laboratory, 1989.
Puede determinarse si el gen obtenido es un
promotor de interés o no comparando la secuencia de nucleótidos
determinada con el promotor de la presente invención y estimando a
partir de su homología. Si se piensa que el gen obtenido no
contiene un promotor completo, se construye un cebador de ADN
sintético en base al gen obtenido, se multiplican por PCR regiones
que faltan y, usando el fragmento de gen obtenido como sonda de
ADN, se examinan genotecas de ADN o genotecas de cADN de manera que
pueda determinarse la secuencia de nucleótidos de la región de
codificación completa del promotor que se hibrida con el promotor
descrito aquí.
El método para expresar genes útiles descrito
aquí se caracteriza porque un fragmento de ADN obtenido ligando, en
un estado que permite la expresión, un gen útil aguas abajo del
promotor descrito aquí y, obtenido así, se introduce en una célula
de animal y se cultiva la célula resultante. Con el fin de ligar, en
un estado que permite la expresión, un gen útil aguas abajo del
fragmento de ADN del promotor descrito aquí preparado como antes,
pueden usarse el método de ligasa de ADN o el método de
homopolímero.
Si se usa ligasa de ADN para ligar los dos, se
ligan digiriendo con enzimas de restricción y, si tienen el mismo
lugar de enzima de restricción, ambos fragmentos de ADN se mezclan
en un tampón de reacción como se describe en Molecular Cloning: A
laboratory Manual, Segunda edición, T. Maniatis et al. red.,
Capítulo Uno, pág 62, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, y
añadiendo a ellos ligasa de ADN o, si no comparten el mismo lugar
de enzima de restricción, los extremos se hacen romos con polimerasa
de ADN T4 (fabricada por Takara) y se trata después con ligasa de
ADN como se ha descrito antes.
Por otra parte, cuando se usa el método de
homopolímero, se efectúa la ligación incorporando una cadena de
poli G al extremo 3' de un vector linealizado con una enzima de
restricción usando desoxiribonucleotidil transferasa terminal y
dGTP, incorporando de modo similar una cadena de poli C al extremo
3' del ADN inserto, y reasociando después estas cadena de poli G y
cadena de poli C mediante, por ejemplo, el método de cloruro
cálcico para introducir en E. coli (Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A., 75: 3727 (1978)).
Los genes útiles de interés que pueden usarse
como se ha descrito aquí incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el
gen de interleuquina 1-12, los genes de interferón
\alpha, \beta, \gamma, el gen de factor de necrosis de
tumores, el gen de factor estimulante de colonias, el gen de
eritropoyetina, el gen de factor-\beta de
crecimiento transformante, el gen de inmunoglobulina, el gen de
activador de plasminógeno de tejidos, el gen de uroquinasa, el gen
de peroxidasa de rábano picante y similares.
Pueden mencionarse, por ejemplo, genes de
dismutasa superóxido, factor de necrosis de tumores, insulina,
calcitonina, somatostatina, secretina, hormona del crecimiento,
endorfina, proteína vírica, amilasa, lipasa, alcohol deshidrogenasa
y similares.
El fragmento de ADN obtenido como antes en el que
se ligan el ADN genómico de la presente invención y un gen útil
puede integrarse en un vector apropiado para obtener un plásmido
para expresión génica. Los ejemplos de tales vectores incluyen pTM
[Nucleic Acids Research, 10: 6715 (1982)], cos202 [The EMBO Journal,
6: 355 (1987)], p91203 (B) [Science, 228: 810 (1985)], BCMGSNeo
[Journal of Experimental Medicine, 172: 969 (1990)] y
similares.
El plásmido obtenido así para expresión génica
puede introducirse en un hospedante adecuado por el método de
fosfato cálcico [Molecular and Cellular Biology, 7: 2745 (1987)], el
método de electroporación [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81: 7161
(1984)], el método de DEAE-dextrano [Methods in
Nucleic Acids Research, página 283, Column et al., red., CRC
Press, publicado en 1991], el método de liposoma [BioTechniques, 6:
682 (1989)] y similares.
Los ejemplos de tales células hospedantes
incluyen células COS, células HeLa, células CHO, células
BHK-21 y similares. Cultivando las células
transformadas resultantes en un medio adecuado, puede obtenerse de
una manera eficaz el producto génico útil de interés.
Se explicará ahora con más detalle la presente
invención con referencia a los siguientes Ejemplos de Trabajo y
Ejemplos de Referencia.
Ejemplo de Referencia
1
Se cultivaron linajes celulares de mieloma
múltiple humano RPMI8226 y U266 en un medio RPMI1640
(GIBCO-BRL) suplementado con 10% de suero de bovino
fetal (FBS), y se cultivó un linaje celular de mieloma múltiple
humano KPMM2 (Publicación de patente japonesa no examinada (Kokai)
Nº 7-236745) en un medio RPMI1640
(GIBCO-BRL) suplementado con 20% de suero de bovino
fetal.
Se aisló ARN total de 1 x 10^{8} células KPMM2
mediante un método de tiocianato de guanidina/cloruro de cesio, y
se purificó mARN usando el Fast Track mRNA Isolation Kit
(Invitrogen). Después de sintetizar cADN a partir de 10 \mug de
mARN usando cebador NotI/oligo-dT_{18} (Time Saver
cDNA Synthesis Kit; Pharmacia Biotech), se ligó a él un adaptador
EcoRI. Se fraccionó un cADN mayor de 0,7 kpb usando gel de azarosa
del 1,0% de bajo punto de fusión (Sigma) y se digirió con NotI. Se
insertó después en el lugar de EcoRI/NotI de un vector de expresión
pCOS1 o un vector \lambdaExCell (Pharmacia Biotech) para preparar
una genoteca (genoteca A) de uso en clonación por expresión directa
(examen por lavado en batea) y una genoteca (genoteca B) de uso en
inmunoexamen, respectivamente.
El vector de expresión pCOS1 se construyó a
partir de HEF-PMh-g\gamma1 (véase
documento WO92-19759) suprimiendo el gen contenido
por digestión con EcoRI y SmaI, y ligando después el adaptador
EcoRI-NotI-BamHI (Takara Shuzo).
La genoteca A se introdujo en células
COS-7 por el método de electroporación. Así, 20
\mug de un ADN plásmido (que contenía 5 x 10^{5} clones
independientes) se mezclaron con 0,8 ml de células (1 x 10^{7}
células/ml en PBS), y la mezcla se sometió a electroporación bajo
una condición de 1,5 kv y una capacidad de 25 \muF usando el Gene
Pulser (Bio-Rad). Después de permitirse estar a
temperatura ambiente durante 10 minutos, las células se
suspendieron en un DMEM (fabricado por GIBCO-BRL)
que contenía 10% de FBS, divididas en cuatro placas de cultivo de
100 ml, y se cultivaron a 37ºC durante 72 horas.
Después de cultivar, se lavaron las células con
un tampón de solución salina con fosfato (PBS), y se rasquetearon
añadiendo PBS que contenía EDTA 5 mM para ajustar la suspensión de
células en 1 a 2 x 10^{6} células /ml en PBS que contenía 5% de
FBS y 0,02% de NaN_{3}. Se dejó después permanecer las células en
una placa de lavado en batea (véase después) revestida con
anticuerpo anti-HM1.24 durante 2 horas, y se lavó
suavemente la placa tres veces con 3 ml de PBS que contenía 5% de
FBS y 0,02% de NaN_{3}. Después de lavar, se recuperó ADN
plásmido de las células unidas a la placa usando solución de Hirt
(Hitt J., Mol. Biol. 26: 365-369, 1983) (0,6% de
SDS, EDTA 10 mM). El ADN plásmido recuperado se multiplicó en E.
coli y se usó para el siguiente lavado en batea.
Se preparó como sigue una placa de lavado en
batea. Se añadieron tres mililitros de una solución de anticuerpo
anti-HM1.24 (10 \mug/ml en
Tris-HCl 50 mM, pH 9,5) a una placa de cultivo de
células (Falcon) con un diámetro de 60 mm y se incubó a temperatura
ambiente durante 2 horas. Después de lavar tres veces en NaCl 0,15
M, se añadieron a la placa 3 ml de PBS que contenía 5% de FBS, EDTA
1 mM y 0,02% de NaN_{3}. Después de bloquear dejando permanecer a
temperatura ambiente durante 2 horas, la placa de lavado en batea se
guardó a -20ºC hasta usar.
Repitiendo el lavado en batea tres veces usando
una genoteca de plásmido (genoteca A) que contenía 5 x 10^{5}
clones como material de partida, se concentró un ADN plásmido que
tenía un cADN de aproximadamente 0,9 kpb como inserto. Usando un
Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (fabricado por Applied
Biosystems), se determinó la secuencia de nucleótidos usando el
Sequencer 373A o 377DNA (Applied Biosystems). El resultado reveló
que el clon P3.19 comprende cADN de 1.012 pb y tiene un marco de
lectura abierto (23-549) que codifica 180
aminoácidos (Figs. 1 y 2) (SEQ ID NO: 1). La secuencia de
aminoácidos deducida del cADN tenía una estructura característica
de proteínas de membrana de tipo II y tenía dos lugares de unión de
cadena de azúcar de tipo N.
La genoteca B se sometió a inmunoexamen usando
anticuerpo anti-HM1.24. Así, se estratificó en agar
una genoteca de fagos que contenía 1,5 x 10^{5} clones
independientes junto con E. coli NM522 (Pharmacia Biotech) y
se cultivó a 42ºC durante 3,5 horas. Después de cultivar, se
estratificó en la placa un filtro de nitrocelulosa (Schleicher
& Schuell) pretratado con IPTG 10 mM, y se cultivó
adicionalmente a 37ºC durante 3 horas. Se lavó después el filtro
con 0,05% (v/v) de TBS añadido con Tween 20
(Tris-HCl 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM), se añadió a
ello 1% (p/v) de TBS añadido con BSA, y se bloqueó incubando a
temperatura ambiente durante 1 hora.
Después de bloquear, se añadió una solución de
anticuerpo anti-HM1.24 (un tampón de bloqueo de 10
\mug/ml), se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora y se
añadió antisuero anti-Ig de ratón conjugado con
fosfatasa alcalina diluido 5.000 veces (picoBlue Immunoscreening
kit; Stratagene), lo que se incubó adicionalmente a temperatura
ambiente durante 1 hora. Se dejaron desarrollar color manchas que
reaccionaron con el anticuerpo con una solución de revelado
(Tris-HCl 100 mM, pH 9,5, NaCl 100 mM, MgCl_{2} 5
mM) que contenía 0,3 mg/ml de nitroazul tetrazolio y 0,15 mg/ml de
fosfato de
5-bromo-4-cloro-3-indolilo.
Por inmunoexamen, se aislaron cinco clones
positivos, todos los cuales eran consecuentes con la secuencia
parcial de P3.19 (Fig. 3). La búsqueda de homología de ellos reveló
que P3.19 es idéntico a la secuencia de ADN de
BST-2 (Ishikawa J. et al., Genomics, 26:
527-534, 1995) expresado en las células de la médula
ósea o estromales sinoviales. Se obtuvo la misma molécula de dos
tipos de examen, lo que sugirió intensamente que la proteína de
membrana codificada por P3.19 es la molécula de antígeno HM1.24.
Se denominó Escherichia coli DH5\alpha
(pRS38-pUC19) a E. coli que tiene el plásmido
pRS38-pUC19 en el que se ha insertado ADN que
codifica una proteína humana que tiene la misma secuencia que la
proteína de antígeno HM1.24 humano mencionada antes entre los
lugares de XbaI de vector pUC, y se depositó internacionalmente bajo
las disposiciones del Tratado de Budapest el 5 de Octubre de 1993
en el National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency
of Industrial Science and Technology, de 1-3,
Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, pref.
de Ibaraki, Japón, con el Nº de admisión FERM
BP-4434.
Además, con el fin de confirmar que la proteína
codificada por P3.19 se une realmente a anticuerpo
anti-HM1.24, se estableció un linaje celular
transformante de CHO en el que se introdujo P3.19. Así, después de
introducir el clon P3.19 en células CHO por el método de
electroporación, se cultivó en presencia de 500 \mug/ml de G418
(GIBCO-BRL) para obtener un linaje celular de CHO
que expresa antígeno HM1.24.
Las células cultivadas (1 x 10^{6}) se
suspendieron en el tampón FACS (PBS (-)/2% de FCS/0,1% de
NaN_{3}), se añadió a ello anticuerpo de HM1.24, y se hizo
reaccionar en hielo durante 30 minutos. Después de lavar en el
tampón FACS, se resuspendió en una solución de
GAM-FITC (25 \mug/ml en el tampón FACS; Becton
Dickinson) y se hizo reaccionar adicionalmente en hielo durante 30
minutos. Después de lavar dos veces con el tampón FACS, se
resuspendió en 600 \mul del tampón FACS para medir mediante el
FAGScan (Becton Dickinson).
Como testigo negativo, se usó UPC10.
Como resultado del análisis FACS, se mostró que
células CHO en las que se introdujo P3.19 reaccionaban fuertemente
con anticuerpo anti-HM1.24, mientras que no se
observó unión en células CHO (CHO/NEO) en las que se introdujo el
vector de expresión testigo (Fig. 17). Se confirmó por tanto que la
proteína codificada por P3.19 se une a anticuerpo
anti-HM1.24.
Después de lavar las células dos veces en PBS
(-), se destruyeron por ultrasonicación en el método de tampón de
lisado de células (borato sódico 50 mM, NaCl 150 mM, 0,5% de
desoxicolato sódico, 1% de Nonidet P-40, 0,1 mg/ml
de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, cóctel inhibidor de proteasa
[Boehringer Mannheim]) para obtener una fracción soluble. La
fracción soluble se añadió a perlas de Sepharose 4B conjugadas a
anticuerpo anti-HM1.24. Después de centrifugar, se
separó el precipitado en SDS-PAGE (gel al 12%), que
se transfirió a una membrana PVDF. La membrana PVDF se hizo
reaccionar con anticuerpo anti-HM1.24, y después con
POD-anti-IgG de ratón y se detectó
usando el equipo ECL (Amersham).
Cada uno de los linajes celulares de mieloma
KPMM2, RPMI8226 y U266 expresaba fuertemente antígeno HM1.24, y la
inmunoprecipitación de los lisados de células de los mismos con
anticuerpo anti-HM1.24 permitió la detección
específica de proteína con un peso molecular de aproximadamente 29 a
33 kDa (Fig. 5). En un experimento similar para linajes celulares
de CHO (CHO/HM) en los que se introdujo P3.19, se confirmaron
inmunoprecipitantes en las células CHO/HM como para los linajes
celulares de mieloma (Fig. 5, pista 4). Tales inmunoprecipitantes
no podían observarse en las células testigo (CHO/NEO) en las que
sólo se introdujo el vector de expresión pCOS1 (Fig. 5, pista
5).
P3.19 codifica una proteína que tiene un peso
molecular estimado de 19,8 kDa, que comprende 180 aminoácidos (Fig.
1) y tiene dos motivos de unión de cadena de azúcar de tipo N (Fig.
1). Así, ello sugirió que la presencia de sustancias que tienen
diferentes pesos moleculares observada por inmunoprecipitación era
debida a diferencias en la modificación de cadenas de azúcar de tipo
N. De hecho, se confirmó que los inmunoprecipitantes se unen a
varias lectinas.
Ejemplo de Referencia
2
Según el método de Goto, T. et al., Blood
(1994) 84, 1992-1930, se prepararon hibridomas que
producen anticuerpo monoclonal anti-HM1.24 de
ratón.
Un linaje celular de plasma
KPC-32 (1 x 10^{7}) derivado de la médula ósea de
un paciente humano con mieloma múltiple (Goto, T. et al.,
Jpn. J. Clin. Hematol. (1991) 32, 1400) se inyectó en la cavidad
abdominal de un ratón BALB/c (engendrado por Charles River) dos
veces cada seis semanas.
Tres días antes de sacrificar al animal, se
inyectaron en el bazo del ratón 1,5 x 10^{6}
KPC-32 para aumentar adicionalmente la capacidad
productora de anticuerpo del ratón (Goto, T. et al.,
Tokushima J. Exp. Med. (1990) 37, 89). Después de sacrificar al
animal, se extrajo el bazo y el órgano extraído se sometió a fusión
de células con la célula de mieloma SP2/0 según el método de Groth,
de St. Schreidegger (Cancer Research (1981) 41, 3465).
Por ELISA de células (Posner, M.R. et al.,
J. Immunol. Methods (1982) 48, 23) usando KPC-32, se
examinó anticuerpo de un sobrenadante de cultivo de un hibridoma.
Se suspendieron 5 x 10^{4} KPC-32 en 50 ml de PBS
y se dividió después en partes alícuotas en una placa de 96 pocillos
(de fondo en U, Corning, fabricada por Iwaki), que se secó después
al aire a 37ºC durante la noche. Después de bloquear con PBS que
contenía 1% de albúmina de suero de bovino (BSA), se añadió a ello
el sobrenadante de cultivo del hibridoma y se incubó a 4ºC durante
2 horas. Después, se hizo reaccionar a 4ºC durante 1 hora anticuerpo
de cabra anti-IgG de ratón marcado con peroxidasa
(fabricado por by-Zymed). Después de lavar, se hizo
reaccionar a temperatura ambiente durante 30 minutos solución
sustrato de solución de o-fenilendiamina (fabricada
por Sumitomo Bakelite).
Se detuvo la reacción añadiendo ácido sulfúrico 2
N y se midió la absorbancia a 492 nm usando el lector ELISA
(fabricado por Bio-Rad). Con el fin de separar los
hibridomas que producen anticuerpos contra inmunoglobulina humana,
un sobrenadante de cultivo de hibridomas positivos había adsorbido
previamente suero humano y se examinó por ELISA la reactividad para
otros linajes celulares. Se seleccionaron hibridomas positivos, y
se investigó por citometría de flujo su reactividad para diversas
células. El clon de hibridoma seleccionado en último lugar se clonó
dos veces y se inyectó en la cavidad abdominal de un ratón BALB/c
tratado con pristano. Se obtuvieron las ascitas del ratón.
Se purificó anticuerpo monoclonal de las ascitas
del ratón por precipitación con sulfato amónico y un equipo de
cromatografía de afinidad de Proteína A (Ampure PA, fabricado por
Amersham). El anticuerpo purificado se marcó con FITC usando el
equipo de unión Quick Tag FITC (fabricado por Boehringer
Mannheim).
Como resultado, anticuerpos monoclonales
producidos por 30 clones de hibridoma reaccionaron con
KPC-32 y RPMI 8226. Después de clonar, se investigó
la reactividad de los sobrenadantes de cultivo de estos hibridomas
con otros linajes celulares o células mononucleares de sangre
periférica.
De ellos, 3 clones eran anticuerpos monoclonales
que reaccionaban específicamente con la célula del plasma. De los 3
clones, se seleccionó un clon de hibridoma que era más útil para
análisis de citometría de flujo y tenía una actividad CDC para RPMI
8226 y se denominó HM1.24. Se determinó por un ELISA la subclase
del anticuerpo monoclonal producido por este hibridoma usando un
anticuerpo de conejo anti-ratón específico para la
subclase (fabricado por Zymed). El anticuerpo
anti-HM1.24 tenía una subclase de IgG2a \kappa. El
hibridoma HM1.24 que produce anticuerpo anti-HM1.24
se depositó internacionalmente bajo las disposiciones del Tratado
de Budapest como FERM BP-5233 el 14 de Septiembre de
1995 en el National Institute of Bioscience and Human Technology,
Agency of Industrial Science and Technology, de 1-3,
Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, pref.
de Ibaraki, Japón.
Ejemplo
1
Puesto que el antígeno HM1.24 se expresaba
fuertemente en todas las células de mieloma analizadas hasta aquí,
es muy probable que la expresión de antígeno HM1.24 esté implicada
intensamente en características fisiológicas de mieloma múltiple.
Así, la aclaración del mecanismo de expresión de antígeno HM1.24 es
un reto importante, y los inventores han clarificado la estructura
génica de la región de promotor.
La región de promotor del gen de antígeno HM1.24
se aisló usando el equipo PromoterFinder DNA Walking (Clontech). De
la secuencia de nucleótidos del extremo 5' del clon P3.19 aislado
por lavado en batea, se diseñaron dos cebadores de PCR: HM1
(5'-ATC CCC GTC TTC CAT GGG CAC TCT GCA -3') (SEQ ID
NO: 6) y HM2 (5'-ATA GTC ATA CGA AGT AGA TGC CAT
CCA G -3') (SEQ ID NO: 8). La primera PCR se realizó usando cebador
AP1 (incorporado al equipo) correspondiente al adaptador y el
cebador HM1 según el manual de instrucciones incorporado al equipo,
y se sometió después el producto de PCR a una PCR encajada usando el
cebador AP2 (incorporado al equipo) y el cebador HM2. Después de
purificar el producto de PCR final, se subclonó en el vector de
clonación pCRII (Invitrogen).
El gen de la región de promotor se aisló
simplemente por el método de PCR. Así, se multiplicaron
específicamente productos de PCR de aproximadamente 2,0 kb, 0,7 kb y
0,3 kb a partir de las genotecas EcoRV, PvuII y DraI (Promoter
Finder Kit; Clontech), respectivamente. Se demostró que derivaban
del mismo ADN genómico en base a los modelos de división con
enzimas de restricción (Fig. 6). Como resultado de la determinación
de secuencia de las secuencias de nucleótidos, se determinó la
secuencia génica de cADN del extremo 5' a 1959 pb aguas arriba
(Figs. 7 y 8) (SEQ ID NO: 4). Mediante una búsqueda de motivos de
unión de factores de transcripción conocidos, se observó la
presencia de elementos controladores de transcripción de
AP-2, Sp1, NF-IL6, NF\kappa;B,
STAT3 o ISGF3 y similares, sugiriendo la posibilidad de que la
expresión esté controlada por el estímulo mediante citoquinas
inflamatorias tales como IL-6 o
IFN-\alpha.
Se sabe que IL-6 sirve como
factor de crecimiento de células de mieloma, y por tanto ello
sugería fuertemente que NF-IL6 y STAT3, que son
factores de transcripción que actúan aguas abajo de
IL-6, están implicados en el control de expresión
de antígeno HM1.24 en células de mieloma (Figs. 7 y 8). El punto de
iniciación de la transcripción fue un nucleótido estimado en la
secuencia de nucleótidos de productos de PCR multiplicados usando
el oligonucleótido CapSwitch (CapFnder Kit; Clonetech), y se observó
a 27 posiciones aguas arriba de él una secuencia de tipo caja TATA
(TAATAAA) (Figs. 7 y 8).
Ejemplo
2
Se multiplicó ADN genómico para antígeno HM1.24 a
partir de ADN genómico humano (Clontech) preparado a partir de una
genoteca de ADN genómico humano (Promoter Finder DNA Walking Kit;
Clontech) o sangre periférica usando cada cebador de PCR mostrado
en la Fig. 9. Después de purificar, se subclonó cada uno de los
productos de PCR en el vector pCRII y se determinó la secuencia de
nucleótidos.
Se dividió ADN genómico que codifica antígeno
HM1.24 en cuatro fragmentos, que se multiplicaron a partir de ADN
genómico humano preparado a partir de una genoteca de de ADN
genómico (Promoter Finder Kit; Clontech) o sangre periférica humana
(Fig. 9). Después de confirmar sus secuencias de nucleótidos, se
compararon con la secuencia de nucleótidos de cADN de antígeno
HM1.24, con el resultado de que el gen de antígeno HM1.24 está
compuesto por cuatro exones y tres intrones de 850 pb, 183 pb y 307
pb (Fig. 10).
Sin embargo, de la genoteca de ADN genómico
humano preparada a partir del tejido de placenta humana, se
multiplicó sólo un gen consistente en 3 exones carente del intrón 3,
sugiriendo la presencia de un gen genómico que tenía una estructura
de exones/intrones diferente. En cualquier estructura, estaban todos
presentes en el exón I (Figs. 11 y 12) (SEQ ID NO: 2) dos lugares
de unión de cadena de azúcar de tipo N y tres residuos de cisteína
en la región extracelular de antígeno HM1.24.
Ejemplo
3
Con el fin de confirmar la presencia de variantes
de empalme de antígeno HM1.24, se multiplicó cADN de antígeno
HM1.24 por el método de PCR usando como plantilla cADN preparado a
partir de un linaje celular de mieloma humano KPMM2 según el método
descrito antes. El cebador sentido BST2-N (SEQ ID
NO: 17; ATG GCA TCT ACT TCG TAT GAC) usado en la PCR corresponde a
las bases 10 a 30 de P3.19 (SEQ ID NO: 1) aislado aquí, y el
cebador antisentido S3 (SEQ ID NO: 18; AAC CGT GTT GCC CCA TGA)
corresponde a las bases 641-658 de P3.19.
Los productos multiplicados por PCR se
subclonaron en un vector de clonación pCRII (Invitrogen) y de los
clones independientes resultantes se recuperó ADN plásmido, con el
resultado de que se observaron dos insertos que tenían diferentes
tamaños de aproximadamente 650 pb y aproximadamente 550 pb. Después
de determinar cada secuencia de nucleótidos, se encontró que el
inserto de aproximadamente 650 pb tenía una secuencia idéntica a la
de P3.19, mientras que el inserto de aproximadamente 550 pb tenía
una supresión correspondiente a las bases 294 a 422 de P3.19 (SEQ
ID NO: 19). La región en la que se observó la supresión corresponde
a los exones 2 y 3 de ADN genómico de antígeno HM1.24 humano,
indicando la presencia de variantes debida a diferente empalme.
Ejemplo
4
En relación con el polimorfismo encontrado en el
gen de HM1.24, se investigó su relación con mieloma múltiple. Se
suministraron muestras de sangre periférica de seres humanos sanos
normales como revestimiento marrón claro de muestras de sangre
donadas del Japan Red Cross Tokushima Blood Center. Para pacientes
con mieloma, la sangre periférica de fluido de médula ósea se
recogió de pacientes del Tokushima University First Internal
Medicine Hospital u hospitales afiliados. Se sometieron muestras de
sangre a centrifugación con densidad de
Ficoll-Conrey para separar células mononucleares. Se
cultivaron linajes celulares de mieloma en un medio RPMI1640
(GIBCO-BRL, Rockville, MD, EE.UU.) que contenía 10%
de suero de bovino fetal a 37ºC en un incubador con 5% de CO_{2}.
Las células mononucleares de sangre periférica o los linajes
celulares de mieloma ser trataron con el reactivo DNAzol
(GIBCO-BRL) según el protocolo para extraer de las
células ADN genómico.
Se determinó la secuencia de nucleótidos por el
método de determinación de secuencia directo por PCR. La región de
promotor 5' se multiplicó por PCR (30 ciclos de 94ºC durante 1
minuto, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 1 minuto) con
polimerasa de ADN ampliTaq (Perkin Elmer, Chiba) usando cebador 6S
(TCCATAGTCCCCTCGGTGG) (SEQ ID NO: 22) y BST2B
(ATAGTCATACGAAGTAGATGCATCCAG) (SEQ ID NO: 23). La región de
codificación de HM se multiplicó por PCR con polimerasa de ADN LA
Taq (Takara Shuzo, Otsu) usando cebador HMP2K
(AAAGGTACCAGCTGTCTTTCTGTCTGTC) (SEQ ID NO: 24) y
BST2-R4 (GTGCTCTCCCCGCTAACC) (SEQ ID NO: 25). Con la
mezcla de reacción como plantilla, se realizó adicionalmente PCR
con polimerasa de ADN Ex Taq (Takara Shuzo) usando cebador 8S
(AAAGCGGCCGCTCATCACTGCAGCAGAGCGCTGAG) (SEQ ID NO: 26) y
BST2-R1 (AAAGCGGCCGCTCATCACTGAGCAGAGCGCTGAG) (SEQ ID
NO: 27).
La mezcla de reacción se purificó mediante el QIA
Quick PCR Purification Kit (QIAGEN, Tokio) y se hizo reaccionar con
el fragmento de PCR resultante como plantilla, usando como cebador
6S o BST2B para la región de promotor 5', y 8S, HMINTIF
(AGGGGAACTCACCAGACC) (SEQ ID NO: 28), HMEX2F
(ATGGCCC
TAATGGCTTCC) (SEQ ID NO: 29), HMEX3F (CATTAAACCATAAGCTTCAGG) (SEQ ID NO: 30), HMEX2R (CCCTCAAGCTCCTCCACT) (SEQ ID NO: 31) o BST2-R1 para la región de codificación de HM mediante el BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Perkin Elmer). La secuencia de nucleótidos se determinó usando el ABI3777 DNA Sequencer (Perkin Elmer). La frecuencia de la supresión de 8 pares de bases en la proximidad de 20 pares de bases aguas arriba del codón de iniciación del gen de HM1.24 se detectó por PCR. Así, se realizó PCR (30 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 1 minuto) con polimerasa de ADN ampliTaq (Perkin Elmer, Chiba) usando cebadores 8S y BST-R3 (GACGGATCCTAAAGCTTACAGCGCTTATC) (SEQ ID NO: 32). La mezcla de reacción se sometió a electroforesis en un gel de azarosa del 4% y se detectó por coloración con bromuro de etidio.
TAATGGCTTCC) (SEQ ID NO: 29), HMEX3F (CATTAAACCATAAGCTTCAGG) (SEQ ID NO: 30), HMEX2R (CCCTCAAGCTCCTCCACT) (SEQ ID NO: 31) o BST2-R1 para la región de codificación de HM mediante el BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Perkin Elmer). La secuencia de nucleótidos se determinó usando el ABI3777 DNA Sequencer (Perkin Elmer). La frecuencia de la supresión de 8 pares de bases en la proximidad de 20 pares de bases aguas arriba del codón de iniciación del gen de HM1.24 se detectó por PCR. Así, se realizó PCR (30 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 1 minuto) con polimerasa de ADN ampliTaq (Perkin Elmer, Chiba) usando cebadores 8S y BST-R3 (GACGGATCCTAAAGCTTACAGCGCTTATC) (SEQ ID NO: 32). La mezcla de reacción se sometió a electroforesis en un gel de azarosa del 4% y se detectó por coloración con bromuro de etidio.
Se determinó la secuencia de nucleótidos de la
región de promotor 5' del gen de HM1.24 para muestras de seres
humanos sanos normales y pacientes. El resultado se muestra en las
Figs. 14-18 (SEQ ID NO: 33). Hubo muestras para las
que se observaron sustitución de nucleótidos en las 187, 262 y 323
subrayadas en la Fig. 14, y supresiones cerca de 360 en la Fig. 14
y cerca de 555 en la Fig. 15, y hubo una muestra para la que no
podía descodificarse la región de 366 a 558. Cuando la secuencia
descrita en las Figs. 14 a 18 (SEQ ID NO: 33) se denominó como tipo
A, y el tipo de mutación que tiene la anterior sustitución/supresión
de nucleótidos como tipo B, se piensa que la muestra para la que no
podía descodificarse la región de 366 a 558 es un heterocigoto (AB)
de A y B, y la muestra que podía descodificarse como tipo A o B se
piensa que es un homocigoto (AA) de A o un homocigoto (BB) de B.
Además del polimorfismo anterior, se clarificó que 19 pb estaban
insertadas en tándem en la región subrayada doble en un linaje
celular de mieloma HS-sultan (tipo M).
Para la región de gen genómico de linajes
celulares de tipo AA (U266, HS-sultan) y dos
muestras de tipo BB de seres humanos normales, se determinó la
secuencia de nucleótidos. Como resultado, se encontró que faltaban
3 bases de c cerca de 2315 del intrón 3 en la secuencia de tipo B,
mientras que no se observó mutación en la región de
codificación.
Se investigaron polimorfismo y sensibilidad a la
enfermedad. Cuando se detectó una supresión de 8 bases por PCR
cerca de 20 pares de bases aguas arriba del codón de iniciación del
gen de HM1.24, no hubo diferencia en la frecuencia de polimorfismo
entre 94 casos de seres humanos sanos normales y 46 casos de
pacientes con mieloma (Tabla 1). En ambos seres humanos sanos
normales y pacientes con mieloma, el gen de tipo A era dominante y
la distribución de genes era aproximadamente A : B = 2 : 1. Para
linajes celulares, había una propensión a tipo A siendo de tipo AA
9 casos de 11.
No se observaron relaciones entre el polimorfismo
de la región de promotor de HM1.24 y sensibilidad a enfermedades
con mieloma.
| AA | AB | BB | Total | |
| Seres humanos sanos normales | 43 | 37 | 14 | 94 |
| (%) | 45,7 | 39,4 | 14,9 | |
| Pacientes con mieloma | 21 | 21 | 4 | 46 |
| (%) | 45,7 | 45,7 | 8,7 | |
| Linajes celulares de mieloma | 9 | 2 | 0 | |
| (%) | 81,8 | 18,2 | 0 |
Según la presente invención, se obtuvo el gen
genómico de antígeno HM1.24 que se expresa elevadamente en todas
las células de mieloma. El gen genómico que codifica antígeno HM1.24
es útil para análisis de antígeno HM1.24. Puesto que el antígeno
HM1.24 se expresa fuertemente, se piensa que la región de promotor
tiene una actividad de promotor fuerte, y es útil por consiguiente
para la expresión de genes útiles.
Referencia a los microorganismos depositados bajo
el Tratado de Cooperación de Patentes, Regla 13-2,
y el nombre del órgano depositario
Órgano depositario
- Nombre: the Nacional Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology
- Dirección: 1-3, Higashi 1-chome, ciudad de Tsukuba, pref. de Ibaraki, Japón
Organismo (1)
- Nombre: Escherichia coli DH5\alpha (pRS38-pUC19)
- Número de admisión: FERM BP-4434
- Fecha de depósito: 5 de Octubre de 1993
Organismo (2)
- Nombre: Hibridoma de ratón HM1.24 de ratón
- Número de admisión: FERM BP-5233
- Fecha de depósito: 14 de Septiembre de 1995
<110> Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Gen genómico que codifica proteína
antígena de HM1.24 y promotor de la misma
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> F924
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 10-060617
\hskip1cmJP 10-093883
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1998-02-25
\hskip1cm1998-03-24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1014
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cADN que codifica proteína antígena
de HM1.24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2337
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> exón
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (51) ... (335)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> intrón
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (336) ... (1188)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> exón
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1189) ... (1255)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> intrón
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1256) ... (1436)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> exón
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1437) ... (1497)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> intrón
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1498) ... (1804)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> exón
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1805) ... (1931)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia nucleica de ADN genómico
que codifica proteína antígena de HM1.24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 180
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos de proteína
antígena de HM1.24
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2061
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) ... (2040)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2041) ... (2061)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de ADN de región de
promotor de gen de proteína antígena de HM1.24
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtaatacgac tcactatagg gc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatccccgtct tccatgggca ctctgca
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactatagggc acgcgtggt
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatagtcatac gaagtagatg ccatccag
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactatagggc acgcgtggt
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctcgctgtt ggccttgatg gtgaa
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccaacagcg aggcctgc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcatccaggg aagccatt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactccccagg ccaaaacc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcgtcctga agcttatggt tt
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgtctgcag cggtggag
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgaaaagccg agcaggac
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatggcatcta cttcgtatga c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaccgtgttg ccccatga
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 471
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cADN que codifica una variante de
empalme de proteína antígena de HM1.24 humana
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 156
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos de una
variante de empalme de proteína antígena de HM1.24 humana
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos parcial
N-terminal de proteína antígena de HM1.24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Ala Ser Thr Ser Tyr Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccatagtcc cctcggtgg
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatagtcatac gaagtagatg ccatccag
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaggtacca gctgtctttc tgtctgtc
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgctctccc cgctaacc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggacgtttcc tatgctaa
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaagcggccg ctcatcactg cagcagagcg ctgag
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggggaactc accagacc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatggccctaa tggcttcc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcattaaacca taagcttcag g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccctcaagct cctccact
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgacggatcct aaagcttaaa gcgcttatc
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2456
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> exón
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (576) ... (860)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> intrón
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (861) ... (1713)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> exón
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1714) ... (1781)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> intrón
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1782) ... (1961)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> exón
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1962) ... (2022)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> intrón
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2023) ... (2329)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> exón
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2330) ... (2456)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia nucleica de ADN genómico
que codifica proteína antígena de HM1.24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
Claims (5)
1. Un ADN genómico que codifica proteína
de antígeno HM1.24, conteniendo dicho ADN 4 regiones de exones que
codifican la secuencia de aminoácidos como se indica en SEQ ID NO 3,
y tres intrones;
en el que el primer intrón está situado entre el
ADN que codifica los aminoácidos Val 95 y Met 96 de SEQ ID NO
3;
en el que el segundo intrón está situado entre el
ADN que codifica los aminoácidos Gly 118 y Glu 119 de SEQ ID NO 3;
y
en el que el tercer intrón está situado entre el
ADN que codifica los aminoácidos Arg 138 y Arg 139 de SEQ ID NO
3.
2. El ADN genómico según la
reivindicación 1, que tiene la secuencia de nucleótidos como se
indica en SEQ ID NO: 2.
3. La variante de empalme del ADN
genómico como se indica en las reivindicaciones 1 o 2, cuyo ADN
codifica proteína de antígeno HM1.24.
4. La variante de empalme según la
reivindicación 3, que carece de los exones 2 y 3.
5. Un procedimiento para producir
proteína de antígeno HM1.24, cuyo método comprende cultivar células
de animales transformadas con un vector de expresión que comprende
el ADN genómico según alguna de las reivindicaciones 1 a 4.
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