JP2003219894A - Ｈｍ１．２４抗原タンパク質をコードするゲノム遺伝子及びそのプロモーター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 新規なプロモーターの提供。 【解決手段】 ヒトＨＭ１．２４抗原遺伝子の５’−非
コード領域の塩基配列を有するプロモーター配列ＤＮ
Ａ、又は動物細胞においてプロモーター活性を有する該
配列のＤＮＡ断片を提供する。さらに該プロモーター活
性を有するＤＮＡに作用可能に連結された有用タンパク
質をコードする核酸を含んでなる発現ベクターにより形
質転換された動物細胞を培養することを特徴とする有用
タンパク質の製造方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ＨＭ１．２４抗原
タンパク質をコードするゲノミックＤＮＡ、並びにＨＭ
１．２４抗原タンパク質の遺伝子のプロモーター及びそ
の利用に関する。

【０００２】

【従来の技術】マウス抗ＨＭ１．２４モノクローナル抗
体はヒトミエローマ細胞株ＫＰＣ−３２を免疫原として
作製された（Goto T. ら、Blood 84：1922-1930, 1994
）。本抗体が認識するＨＭ１．２４抗原は骨髄腫細胞
表面に高発現する分子量２９−３３kDa の膜タンパクで
ある。さらに、正常細胞においてはイムノグロブリン産
生Ｂ細胞（plasma cell, lymphoplasmacitoide cell ）
で発現が確認され、それ以外の細胞、組織においてはほ
とんどその発現は認められていない（Goto T. ら同
上）。しかしながら、ＨＭ１．２４抗原はその発現分布
および分子量以外には明らかになっていない。

【０００３】本発明においては、ＨＭ１．２４抗原をコ
ードするゲノムＤＮＡをクローニングし、その塩基配列
及びそれから推定されるアミノ酸配列を決定し、さらに
ホモロジー検索の結果、ＨＭ１．２４抗原は骨髄腫患者
の骨髄ならびにリウマチ関節炎患者の骨髄および滑膜よ
り単離されたストローマ細胞に発現している表面抗原で
あるＢＳＴ２と同一の分子であることが明らかとなっ
た。ＢＳＴ２はｐｒｅ−Ｂ細胞増殖支持能を有するとさ
れており、リウマチ関節炎の病態に関与している可能性
が推察されているが、それ以外の生理的な機能について
は明らかになっていない（Ishikawa J. ら、Genomics 2
6: 527-534, 1995 ）。

【０００４】動物由来の有用遺伝子産物を遺伝子工学的
に製造する場合、大腸菌、枯草菌、酵母等の微生物宿主
を用いると遺伝子が発現しなかったり、遺伝子産物であ
る蛋白が正しい立体構造をとらない、翻訳後修飾が正し
くなされない等の理由で活性を持たなかったりすること
がしばしば起こる。その問題の解決のために動物細胞が
宿主として用いられることが多く、この場合プロモータ
ーの選択が発現効率に大きな影響を与える。従来、頻繁
に用いられてきた動物細胞用プロモーターとしては、Ｓ
Ｖ４０プロモーター、サイトメガロウイルスプロモータ
ー、アクチンプロモーター等がある。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上記のごとき技術の現
状に鑑み、本発明は、ＨＭ１．２４抗原タンパク質をコ
ードするゲノムＤＮＡを提供する。本発明はまた、上記
ゲノムＤＮＡを利用しての、動物細胞を用いたＨＭ１．
２４抗原タンパク質の製造方法を提供する。動物細胞を
宿主として有用遺伝子産物を大量に生産する場合、従来
用いられてきた動物細胞用プロモーターは転写活性の点
で必ずしも満足のいくものではなく、更に強力なプロモ
ーターの開発が待ち望まれている。従って、本発明の他
の目的は、動物細胞用のプロモーターとして強力なプロ
モーター活性を有するＤＮＡ及びその用途を提供するこ
とにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
め、本発明は配列番号：２に示すアミノ酸配列をコード
する４個のエクソン領域を含むＨＭ１．２４抗原タンパ
ク質をコードするゲノムＤＮＡを提供する。前記のゲノ
ムＤＮＡの例として、本発明は配列番号：２に示すアミ
ノ酸配列をコードする４個のエクソンと３個のイントロ
ンを有するゲノムＤＮＡを提供する。本発明はまた、前
記のゲノムＤＮＡのスプライシングバリアントを提供す
る。この具体例としては、エクソン２を欠くスプライシ
ングバリアント、エクソン２及び３を欠くスプライシン
グバリアントなどが挙げられる。

【０００７】本発明はまた、前記のゲノミックＤＮＡを
含んで成る発現ベクターにより形質転換された動物細胞
を培養することを特徴とする、ＨＭ１．２４抗原タンパ
ク質の製造方法を提供する。本発明はさらに、配列番
号：４に示す５′−非コード領域の塩基配列を有するプ
ロモーター配列ＤＮＡ、又は動物細胞においてプロモー
ター活性を有する該配列のＤＮＡ断片を提供する。本発
明はまた、上記のＤＮＡ又はその断片と、ストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズし、且つ動物細胞におい
てプロモーター活性を有するＤＮＡを提供する。前記プ
ロモーター活性を有するＤＮＡは好ましくは動物細胞、
特に哺乳動物細胞に由来する。

【０００８】本発明はまた、配列番号：４に示す５′−
非コード領域の塩基配列において、１〜複数個の塩基の
欠失、付加及び／又は他の塩基による置換により修飾さ
れており、且つ動物細胞においてプロモーター活性を有
するＤＮＡを提供する。本発明はまた、上記のプロモー
ター活性を有するＤＮＡと有用な遺伝とを作用可能に連
結してなる組換えＤＮＡを提供する。前記有用な遺伝子
として、例えば、有用タンパク質をコードする核酸、ア
ンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、デコイをコー
ドする核酸、及びリボザイムから成る群から選択される
核酸が挙げられる。

【０００９】本発明はまた、上記の組換えＤＮＡを含ん
で成るベクターを提供する。このベクターはプラスミド
ベクター又はウイルスベクターである。本発明はまた、
上記の組換えＤＮＡが導入された動物細胞を提供する。
本発明はまた、上記のベクターにより形質転換された動
物細胞を提供する。本発明はまた、上記の動物細胞を有
する動物を提供する。本発明はまた、前記の組換えＤＮ
Ａを導入した動物細胞を培養することを特徴とする、有
用遺伝子の発現方法を提供する。本発明はまた、前記の
プロモーター活性を有するＤＮＡに作用可能に連結され
た有用タンパク質をコードする核酸を含んで成る発現ベ
クターにより形質転換された動物細胞を培養することを
特徴とする、有用蛋白質の製造方法を提供する。

【００１０】

【発明の実施の形態】ヒトＨＭ１．２４抗原ゲノムＤＮ
Ａおよびプロモーター領域を含むゲノム遺伝子は適当な
プライマーを用い、ＰＣＲ法により容易に増幅すること
ができる。すなわち、ヒトＨＭ１．２４抗原ゲノムＤＮ
Ａは配列番号２に示すゲノムＤＮＡ配列の５′端にハイ
ブリダイズするセンスプライマーと３′端にハイブリダ
イズするアンチセンスプライマーをデザインし、定法に
従い調製したヒトゲノムＤＮＡを鋳型として用い、Ampl
iTaq（PerkinElner), LA-Taq（宝酒造）等のポリメラー
ゼを用いＰＣＲ反応を行うことにより増幅できる。ＰＣ
Ｒ産物は直接クローニングベクター、例えばｐＣＲII
（Invitrogen）あるいはｐＧＥＭ−Ｔ（Promega ）に挿
入することができる。

【００１１】また、センスプライマー及びアンチセンス
プライマーに制限酵素認識部位を挿入することにより、
所望のベクターに挿入することができる。また、ヒトＨ
Ｍ１．２４抗原のプロモーター領域を含むゲノムＤＮＡ
も同様の方法により増幅することができる。すなわち、
配列番号４に示す配列の５′端にハイブリダイズするセ
ンスプライマー及び３′端にハイブリダイズするアンチ
センスプライマーをデザインし、ヒトゲノムＤＮＡを鋳
型にし、ＰＣＲ法により増幅することにより所望のＤＮ
Ａ断片を得ることができる。

【００１２】本発明の、ＨＭ１．２４抗原タンパク質を
コードするゲノムＤＮＡは図１０に示すごとく４個のエ
クソンとそれらを連結する３個のイントロンから成り、
その具体的な塩基配列及びエクソン領域の推定されるア
ミノ酸配列は図１１及び１２（配列番号：２）に示す通
りである。すなわち、エクソン１は１位のアミノ酸Ｍｅ
ｔから９５位のアミノ酸Ｖａｌまでをコードしており、
エクソン２は９６位のアミノ酸Ｍｅｔから１１７位のア
ミノ酸Ｇｌｕまでをコードしており、エクソン３は１１
８位のアミノ酸Ｇｌｕから１３８位のアミノ酸Ａｒｇま
でをコードしており、そしてエクソン４は１３９位のア
ミノ酸Ａｒｇから１８０位のアミノ酸Ｇｌｎまでをコー
ドしている。

【００１３】本発明はまた、ＨＭ１．２４抗原タンパク
質をコードするゲノムＤＮＡのスプライシングバリアン
トを提供する。スプライシングバリアントは、エクソン
１〜４の内の少なくとも１個、すなわち１〜３個が除去
されたものであり、例えばエクソン２もしくは３、又は
これら両エクソンが除去されたものである。本発明はま
た、エクソンの内部の塩基配列がスプライシングにより
削除された結果、エクソンの各々のアミノ酸に対応する
コドンがずれたＤＮＡの塩基配列を有するＨＭ１．２４
抗原タンパク質をコードするゲノムＤＮＡのスプライシ
ングバリアントを提供する。

【００１４】このスプライシングバリアントは、異なる
アミノ酸配列のリーディングフレームを有するため、エ
クソン１〜４にコードされるＨＭ１．２４抗原タンパク
質とは異なるアミノ酸配列を有する。このようなスプラ
イシングバリアントの一つの例として配列番号：１７に
示される塩基配列及びアミノ酸配列を有するスプライシ
ングバリアントが挙げられる。

【００１５】本発明のＨＭ１．２４抗原タンパク質をコ
ードするゲノムＤＮＡは、まず、ＨＭ１．２４抗原タン
パク質をコードするｃＤＮＡをクローニングし、次にこ
のｃＤＮＡを用いてプライマーオリゴヌクレオチドを設
計し、これを用いてＰＣＲ法によりゲノムＤＮＡライブ
ラリーを鋳型として増幅を行うことにより得られる。ｃ
ＤＮＡをクローニングするには、ＨＭ１．２４抗原を発
現している動物細胞、例えばＫＰＭＭ２細胞を培養し、
培養細胞から常法に従って全ＲＮＡを抽出し、次にｍＲ
ＮＡを濃縮する。

【００１６】本発明においては、上記ｍＲＮＡに基い
て、常法によりｃＤＮＡを合成し、低融点アガロースゲ
ルを用いて分画し、０．７kbp 以上のサイズを有するｃ
ＤＮＡを発現ベクターｐＣＯＳ１又はλＥｘＣｅｌｌベ
クターに挿入して直接発現クローニング（dirert expre
sion cloning）すなわちパンニング（panning ）による
スクリーニングに用いるライブラリーＡ、及び免疫スク
リーニング（immunoscreening ）用ライブラリーＢを作
製した。

【００１７】Ｐａｎｎｉｎｇ法によるスクリーニングの
ため、ライブラリーＡを構成する発現プラスミドをエレ
クトロポレーションによりＣＯＳ−７細胞に導入し、こ
れを培養し、付着細胞を剥がした後、抗ＨＭ１．２４抗
体をコートしたｐａｎｎｉｎｇプレートと接触させ、Ｈ
Ｍ１．２４を発現している細胞をプレートに付着せしめ
た。次に、プレートに付着した細胞からプラスミドＤＮ
Ａを抽出し、大腸菌内で増殖し、次のｐａｎｎｉｎｇに
使用した。このｐａｎｎｉｎｇ操作を３回反復すること
により、抗ＨＭ１．２４抗体と反応する抗原を発現する
クローンを選択し、その１つをクローンＰ３．１９と命
名した。

【００１８】クローンＰ３．１９は、１，０１２bpから
成り１８０個のアミノ酸をコードするオープンリーディ
ングフレームを含むことが、配列決定により明らかとな
った。このクローンＰ３．１９中のｃＤＮＡインサート
の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を図１及び配列番
号：１に示す。また、アミノ酸配列のみを配列番号：３
に示す。他方、免疫スクリーニングのため、ライブラリ
ーＢを構成するファージを大腸菌ＮＭ５２２と共に寒天
プレート上で培養し、発現生成物をニトロセルロースフ
ィルターに移した後、このフィルターを抗ＨＭ１．２４
抗体溶液と接触せしめ、発現生成物との結合を介してフ
ィルターに結合した抗ＨＭ１．２４抗体を、標識した抗
マウスイムノグロブリン（Ｉｇ）血清により検出した。

【００１９】これにより５個の陽性クローンＩＳ−１〜
ＩＳ−５を得た。これらのｃＤＮＡインサートの塩基配
列を決定し、前記Ｐ３．１９のｃＤＮＡインサートの塩
基配列と比較したところ、図３に示すごとく、クローン
ＩＳ−１〜ＩＳ−５中のｃＤＮＡはいずれもＰ３．１９
のｃＤＮＡの一部分であってＰ３．１９の５′−末端側
が欠けていることが明らかになった。次に、Ｐ３．１９
をＣＨＯ細胞に導入して形質転換した後、抗ＨＭ１．２
４抗体を用いてフローサイトメトリーを行った結果、図
４に示す通り、ＨＭ１．２４抗原が発現していることが
確認された。また、図４に示す通り、Ｐ３．１９がＨＭ
１．２４抗原をコードしていることは、免疫沈降にあっ
ても確認された。

【００２０】次に、図９のＡに示すごとく、ｃＤＮＡ配
列を４個に分割し、各部分を増幅するためのプライマー
対を図９のＢに示すごとく設計する。次に、常法に従っ
て作製したゲノムＤＮＡライブラリーを、前記の各対の
プライマーを用いてＰＣＲ増幅し、それを継ぎ合わせる
ことにより、全長のゲノムＤＮＡが得られる。その結果
を、図１１及び図１２、並びに配列番号：２に示す。こ
れらから明らかな通り、ＨＭ１．２４抗原タンパク質を
コードするゲノムＤＮＡは４個のエクソン及びそれらを
連結する３個のイントロンを有する。これらの関係を模
式的に図１０に示す。図１０はさらに、ゲノムＤＮＡの
制限酵素地図をも示す。

【００２１】本発明はまた、上記のゲノムＤＮＡを挿入
した発現ベクターにより形質転換された動物細胞を培養
することを特徴とするＨＭ１．２４抗原タンパク質の製
造方法に関する。この方法において使用する動物細胞と
しては、例えば、本発明のプロモーターの使用に関して
後記する種々の動物の細胞を使用することができ、ヒ
ト、ヒト以外の哺乳類、昆虫等の培養細胞が好ましい。
例えば、ヒトの培養細胞として、ＨｅＬａ等が用いら
れ、ヒト以外の哺乳類の培養細胞としてＣＨＯ、ＣＯ
Ｓ、ミエローマ、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ等が挙げられ、昆虫
の培養細胞としてカイコの培養細胞等が挙げられる。こ
れらの動物細胞に本発明のＨＭ１．２４抗原タンパク質
をコードするＤＮＡを導入するためのベクターとして
は、例えばファージベクター、例えばＭ１３等が使用さ
れる。

【００２２】ＨＭ１．２４抗原タンパク質を生産するた
めの動物細胞の培養は、常法に従って行うことができ、
また培養物からのＨＭ１．２４抗原タンパク質の単離精
製中常法に従って行うことができる。なお、ＨＭ１．２
４抗原タンパク質を特異的に認識するマウス抗ＨＭ１．
２４モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマＨＭ
１．２４は、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城
県つくば市東１丁目１番３号）に、平成７年９月１４日
にＦＥＲＭ ＢＰ−５２３３としてブダペスト条約に基
づき国際寄託されている。

【００２３】次に、本発明のプロモーター及びその使用
について記載する。本明細書で言う「プロモーター」と
は、転写開始点（＋１）から２０〜３０塩基対上流にあ
って、正確な位置からＲＮＡポリメラーゼに転写を開始
させる機能を担っているＴＡＴＡボックスまたはＴＡＴ
Ａボックス類似の領域が含まれるが、必ずしもこれらの
領域の前後に限定されるものではなく、この領域以外
に、発現調整のためにＲＮＡポリメラーゼ以外のタンパ
ク質が会合するために必要な領域を含んでいてもよい。
また本明細書中で「プロモーター領域」と記載する場合
があるが、これは本明細書で言うプロモーターを含む領
域のことを示す。

【００２４】本明細書で言う「プロモーター活性」と
は、プロモーターの下流に発現可能な状態で有用遺伝子
を連結し、宿主（動物細胞）に導入した際、宿主内また
は宿主外において有用遺伝子の遺伝子産物を生産する能
力および機能を有することを示す。一般的に、プロモー
ターの下流に、定量が容易に行えるタンパク質をコード
する遺伝子（レポーター遺伝子）を発現可能な状態で連
結させ、宿主に導入し、これらタンパク質の発現量を測
定することでプロモーターの有無や強弱をプロモーター
の活性として表す。このようにプロモーターの下流に発
現可能な状態で有用遺伝子を連結し、宿主に導入した
際、宿主内または宿主外において有用遺伝子の遺伝子産
物の発現が確認された場合、そのプロモーターは導入し
た宿主においてプロモーター活性を有することになる。

【００２５】本明細書で言う「動物細胞」としてはヒト
由来の細胞が挙げられるが、本発明のプロモーターがそ
の動物細胞内においてプロモーター活性を有するもので
あれば特に限定されるものではない。例えば、ヒト以外
の哺乳類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ブ
タ、ウシ、ウマ、イヌ、サル、チンパンジー等）、鳥類
（例えば、ニワトリ、七面鳥、ウズラ、アヒル、カモ
等）、爬虫類（例えば、ヘビ、ワニ、カメ等）、両生類
（例えば、カエル、サンショウウオ、イモリ等）、魚類
（例えば、アジ、サバ、スズキ、タイ、ハタ、ブリ、マ
グロ、サケ、マス、コイ、アユ、ウナギ、ヒラメ、サ
メ、エイ、チョウザメ等）が挙げられる。

【００２６】本明細書で言う「有用遺伝子」には、動物
細胞において発現可能なタンパク質をコードする核酸、
動物細胞由来の遺伝子のアンチセンスＤＮＡ又はアンチ
センスＲＮＡ、動物細胞由来の転写因子の結合タンパク
質をコードする遺伝子あるいは転写因子の結合部位の配
列または類似の配列を持つデコイをコードする核酸、動
物細胞由来のｍＲＮＡを切断するリボザイムが挙げられ
る。

【００２７】動物細胞において発現可能なタンパク質を
コードする核酸としては動物由来のものが挙げられる
が、本発明においてこれは限定されるものではなく、動
物細胞において発現可能であれば、細菌類、酵母類、放
線菌類、糸状菌類、子嚢菌類、担子菌類等の微生物由来
のもの、あるいは植物、昆虫等の生物由来のものも本明
細書で言う有用遺伝子に含まれる。

【００２８】本明細書で言う「デコイをコードする核
酸」とは、動物細胞由来の転写因子の結合タンパク質を
コードする遺伝子あるいは転写因子の結合部位の配列ま
たは類似の配列を持つＤＮＡを示し、これらを「おと
り」として細胞内に導入することで転写因子の作用を抑
制するものを言う。本明細書で言う「リボザイム」と
は、特定のタンパク質のｍＲＮＡを切断するものをい
い、これら特定のタンパク質の翻訳を阻害するものを言
う。

【００２９】リボザイムは特定のタンパク質をコードす
る遺伝子配列より設計可能であり、例えば、ハンマーヘ
ッド型リボザイムとしては、フェブス レター（FEBS L
etter ）、第２２８巻、第２２８−２３０頁（１９８
８）に記載の方法が用いることができる。また、ハンマ
ーヘッド型リボザイムだけでなく、ヘアピン型リボザイ
ム、デルタ型リボザイムなどのリボザイムの種類に関わ
らず、特定のタンパク質のｍＲＮＡを切断するもので、
これら特定のタンパク質の翻訳を阻害するものであれば
本明細書で言うリボザイムに含まれる。

【００３０】本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡ
断片の下流に有用遺伝子を発現可能な状態で連結するこ
とにより、有用遺伝子の発現を増強することができる。
即ち、本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡと有用
遺伝子とを発現可能な状態で連結してなる組換えＤＮＡ
がベクターを介してまたはベクターを用いずに導入され
た動物細胞において、有用遺伝子が発現する。ベクター
としては、プラスミドベクターまたはウイルスベクター
が好ましく使用される。ベクターを使用しない場合に
は、ＤＮＡ断片を文献記載の方法で導入できる〔Virolo
gy, 52, 456 (1973), Molecular and Cellular Biolog
y,7, 2745 (1987), Journal of the National Cancer I
nstitute, 41, 351 (1968), EMBO Journal, 1, 841 (19
82) 〕。

【００３１】本発明のこのような組換えＤＮＡ断片を持
つ動物細胞およびこのような動物細胞を持つ動物も本発
明の範囲に含まれる。本発明により発現を増強すること
ができる有用遺伝子としては、前記のように例えばタン
パク質をコードするＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、アン
チセンスＲＮＡ、デコイをコードするポリヌクレオチ
ド、デコイとして機能するヌクレオチド配列、リボザイ
ムなどが挙げられる。また、本発明は目的のタンパク質
を生産する方法、本発明のプロモーター活性を有するＤ
ＮＡ断片を使用する有用遺伝子の発現方法を開示してい
る。

【００３２】即ち、本発明のプロモーター活性を有する
ＤＮＡの下流にタンパク質をコードする核酸を発現可能
に連結し、得られる組換えＤＮＡを含有するベクターで
形質転換された動物細胞を培養し、培養物から該タンパ
ク質を採取するタンパク質の製造方法も本発明の範囲に
含まれる。同様に、本発明のプロモーター活性を有する
ＤＮＡの下流に有用遺伝子を発現可能に連結し、得られ
る組換えＤＮＡを動物細胞に導入し、培養することによ
る有用遺伝子の発現方法、あるいは該組換えＤＮＡを含
有するベクターで動物細胞を形質転換し、その動物細胞
を培養することによる動物細胞による有用遺伝子の発現
方法も本発明の範囲に含まれる。

【００３３】本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡ
は、配列番号：４に示す５′−末端非コード領域に示す
塩基配列を有するＤＮＡ又は、プロモーター活性を維持
しているその断片である。５′−非コード領域とは配列
番号：４の２０４０位までの塩基配列を意味する。動物
細胞においてプロモーター活性を発揮するためには、５
塩基以上のサイズが必要であることが知られている。従
って、本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡの断片
は少なくとも５塩基以上のサイズを有し、好ましくは３
０塩基以上のサイズを有し、さらに好ましくは２０００
塩基以上のサイズを有する。

【００３４】本発明はまた、配列番号：４に示す塩基配
列を有するＤＮＡとストリンジェント条件下でハイブリ
ダイズすることができ且つプロモーター活性を有するＤ
ＮＡを含む。ハイブリダイズするＤＮＡは天然由来であ
り、例えば哺乳類、例えば、ヒト、マウス、ラット、サ
ル等の、例えばゲノムＤＮＡライブラリーである。スト
リンジェント条件下とは、例えば低ストリンジェントな
条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件として
は、例えば４２℃、５×ＳＳＣ、０．１％ドデシル硫酸
ナトリウム、５０％ホルムアミドにより与えられる洗浄
条件である。より好ましくは、高ストリンジェントな条
件が挙げられる。高ストリンジェントな条件としては、
例えば６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ドデシル硫酸
ナトリウムにより与えられる洗浄条件である。

【００３５】本発明はまた、配列番号：４に示すプロモ
ーターの塩基配列において、１又は複数個の塩基の欠
失、付加及び／又は他の塩基による置換により修飾され
ており、且つプロモーター活性を維持しているＤＮＡ断
片をも含む。修飾の程度は、配列番号：４に示す塩基配
列に対して７０％相同性の範囲であり、好ましくは８０
％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有す
る。なお、本発明において「相同性」とは、二つ以上の
相補的ではない塩基配列またはアミノ酸配列により示さ
れる残基の同一性（identity）の程度を示す（GeneClon
ing 2^nd edition, T.A.Brown, Chapman and Hall, 1990
）。すなわち、９０％の相同性とは、二つ以上の配列
において、１００残基のうち９０以上の残基が同一であ
ることを意味する。

【００３６】次に、本発明のプロモーター活性を有する
ＤＮＡ、その断片及び修飾体の製造方法について説明す
る。配列番号：４に示す塩基配列を有するＤＮＡは、ア
ダプターに対するプライマーＡＰ１（５′−GTAATACGAC
TCACTATAGGGC−３′)(配列番号：５）と、前記Ｐａｎｎ
ｉｎｇ法によりクローニングしたｃＤＮＡクローンＰ
３．１９の塩基番号：４７〜７２に対応するＨＭ１プラ
イマー（配列：５′−ATC CCC GTC TTC CAT GGG CAC TC
T GCA −３′）（配列番号：６）とを用い、ヒトゲノム
ＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲ増幅し、次にこ
のＰＣＲ増幅生成物を鋳型として、ＡＰ２プライマー
（配列：ACTATAGGGC ACGCGTGGT）（配列番号：７）とク
ローンＰ３．１９の塩基１９〜４０に対応するＨＭ２プ
ライマー（配列：５′−ATA GTC ATA CGA AGT AGA TGC
CAT CCA G −３′）（配列番号：８）とによりnested P
CRを行い、クローニングベクターｐＣＲII（Invitroge
n）にサブクローニングする。配列決定の結果、配列番
号：４に示す塩基配列を有するＤＮＡが得られた。

【００３７】プロモーターを有するＤＮＡ断片は、例え
ば次のようにして得られる。前記クローニングベクター
ｐＣＲIIにサブクローニングされたＤＮＡを、制限酵
素、ＳｃａＩ、ＢａｍＨＩ、ＰｖｕII、ＰｓｔＩ等によ
り消化する方法、超音波処理による方法、ホスホルアミ
ダイト法で化学合成する方法、ポリメラーゼ連鎖反応法
等を利用して調製する方法等も利用できる。例えば、配
列番号：４のＤＮＡ配列から適宜プライマーを調製し、
ポリメラーゼ連鎖反応法により所望のＤＮＡ断片を容易
に調製することができる。

【００３８】本発明のプロモーターの塩基配列を利用す
るハイブリダイゼーション法により、他の細胞由来の遺
伝子から本発明のプロモーターを得ることもできる。こ
の場合は、例えば以下の方法が適用できる。まず他の細
胞の遺伝子源から得た染色体ＤＮＡを常法に従いプラス
ミドやファージベクターに接続して宿主に導入し、ライ
ブラリーを作製する。そのライブラリーをプレート上で
培養し、生育したコロニー又はプラークをニトロセルロ
ースやナイロンの膜に移し取り、変性処理によりＤＮＡ
を膜に固定する。この膜をあらかじめ³²Ｐ等で標識した
プローブ（プローブとしては、配列表の配列番号：４に
記載したＤＮＡ断片、またはその一部）を含む溶液中で
保温し、膜上のＤＮＡとプローブとの間でハイブリッド
を形成させる。

【００３９】例えばＤＮＡを固定化した膜を、６×ＳＳ
Ｃ、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１００μ
ｇ／mlのサケ精子ＤＮＡ、５×デンハルツを含む溶液中
で６５℃で２０時間、プローブとハイブリダイゼーショ
ンを行う。ハイブリダイゼーション後、非特異的吸着を
洗い流し、オートラジオグラフィー等によりプローブと
ハイブリッド形成したクローンを同定する。この操作を
ハイブリッド形成したクローンが単一になるまで繰り返
す。こうして得られたクローンの中には、目的のプロモ
ーターをコードするＤＮＡが挿入されている。前記の、
塩基の欠失、付加及び／又は置換により修飾されたプロ
モーターは、例えば、部位特定変異誘発、ＰＣＲ法等の
周知の方法により作製することができる。

【００４０】得られた遺伝子は、例えば次のように塩基
配列を決定し、得られた遺伝子が目的のプロモーターで
あるかを確認する。塩基配列の決定は、ハイブリダイゼ
ーションにより得られたクローンの場合、組換体が大腸
菌であれば試験管等で培養を行い、プラスミドを常法に
従い抽出する。これを制限酵素により切断し挿入断片を
取り出し、Ｍ１３ファージベクター等にサブクローニン
グし、ジデオキシ法により塩基配列を決定する。

【００４１】組換体がファージの場合も基本的に同様の
ステップにより塩基配列を決定することが出来る。これ
ら培養から塩基配列決定までの基本的な操作法について
は、例えば、モレキュラー クローニングア ラボラト
リー マニュアル（Molecular Cloning A Laboratory M
anual ）、第２版、Ｔ．マニアティス（T.Maniatis）、
第１章、第９０〜１０４頁、コールド スプリング ハ
ーバー ラボラトリー社、１９８９年発行に記載されて
いるとおりに行うことができる。

【００４２】得られた遺伝子が目的のプロモーターであ
るかどうかは、決定された塩基配列を本発明のプロモー
ターと比較してその相同性から推定することができる。
得られた遺伝子がプロモーターの全てを含まないと考え
られる場合には、得られた遺伝子を基にして合成ＤＮＡ
プライマーを作製し、ＰＣＲにより足りない領域を増幅
したり、得られた遺伝子の断片をプローブとして、更に
ＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスク
リーニングすることにより、本発明のプロモーターにハ
イブリダイズするプロモーターの全コード領域の塩基配
列を決定することができる。

【００４３】本発明の有用遺伝子の発現方法は、このよ
うにして得られる本発明のプロモーターの下流に有用遺
伝子を発現可能に連結して得られるＤＮＡ断片を動物細
胞に導入し、得られた細胞を培養することを特徴とする
ものである。上記のようにして調製された本発明のプロ
モーターを含むＤＮＡ断片の下流に目的の有用遺伝子を
発現可能に連結するには、ＤＮＡリガーゼやホモポリマ
ー法を利用することができる。

【００４４】ＤＮＡリガーゼにより連結する場合は、例
えば両者が同一の制限酵素部位を有するときはこの制限
酵素で消化した後、例えばモレキュラー クローニング
アラボラトリー マニュアル、第２版、Ｔ．マニアテ
ィス他著、第１章、第６２頁、コールド スプリング
ハーバー ラボラトリー社、１９８９年発行に記載され
た反応緩衝液中で両方のＤＮＡ断片を混合し、ＤＮＡリ
ガーゼを加えることにより、また両者が同一の制限酵素
部位を有しないときは末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ
（宝酒造社製）で平滑末端化した後上記のようにＤＮＡ
リガーゼで処理することにより連結する。

【００４５】一方、ホモポリマー法を用いる場合は、制
限酵素で直鎖状にしたベクターの３′末端にターミナル
デオキシリボヌクレオチジルトランスフェラーゼとｄＧ
ＴＰによってポリＧ鎖を付加し、また、インサートＤＮ
Ａの３′末端には同様にポリＣ鎖を付加し、これらのポ
リＧ鎖とポリＣ鎖をアニールさせ、例えば塩化カルシウ
ム法により大腸菌に導入する〔プロシーディングス オ
ブ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ
オブ ザ ＵＳＡ、第７５巻、第３７２７頁（１９７
８）〕ことにより連結する。

【００４６】本発明に使用できる目的の有用遺伝子とし
ては、例えばインターロイキン１〜１２遺伝子、インタ
ーフェロンα，β，γ遺伝子、腫瘍壊死因子遺伝子、コ
ロニー刺激因子遺伝子、エリスロポエチン遺伝子、形質
転換増殖因子−β遺伝子、免疫グロブリン遺伝子、組織
プラスミノーゲン活性化因子遺伝子、ウロキナーゼ遺伝
子、西洋ホタルルシフェラーゼ遺伝子等が挙げられる
が、これらに限定されるものではない。例えばスーパー
オキシドジスムターゼ、ツモアー・ネフローシス・ファ
クター、インスリン、カルシトニン、ソマトスタチン、
セクレチン、グロスホルモン、エンドルフィン、ウイル
ス蛋白、アミラーゼ、リパーゼ、アルコールオキシダー
ゼなどの遺伝子が挙げられる。

【００４７】上記のようにして得られる本発明のＤＮＡ
断片と有用遺伝子が連結したＤＮＡ断片は動物細胞用の
適当なベクターに組み込んで遺伝子発現用のプラスミド
を得ることができる。かかるベクターとしては、ｐＴＭ
〔ヌクレイック アシッズリサーチ（Nucleic AcidsRes
earch）、１０巻、６７１５頁（１９８２）〕、ｃｏｓ
２０２〔ジ エンボ ジャーナル（The EMBO Journa
l）、第６巻、第３５５頁（１９８７）〕、ｐ９１２０
３（Ｂ）〔サイエンス（Science ）、第２２８巻、第８
１０頁（１９８５）〕、ＢＣＭＧＳＮｅｏ〔ジャーナル
オブ エクスペリメンタル メディシン（Journal of
Experimental Medicine）、第１７２巻、第９６９頁
（１９９０）〕等が挙げられる。

【００４８】得られた遺伝子発現用のプラスミドは、リ
ン酸カルシウム法〔モレキュラーアンド セルラー バ
イオロジー（Molecular and Cellular Biology）、第７
巻、第２７４５頁（１９８７）〕、電気穿孔法〔プロシ
ーディングス オブ ナショナル アカデミー オブ
サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ、第８１巻、第７１
６１頁（１９８４）〕、ＤＥＡＥ−デキストラン法〔メ
ソッズ イン ヌクレイック アシッズ リサーチ（Me
thods in Nucleic Acids Research ）、第２８３頁、カ
ラムら編、ＣＲＣプレス、１９９１年発行〕、リポソー
ム法〔バイオテクニークス（BioTechniques ）、第６
巻、第６８２頁（１９８９）〕等によって適当な宿主細
胞に導入することができる。

【００４９】かかる宿主細胞としては、ＣＯＳ細胞、Ｈ
ｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ−２１細胞等が挙げら
れる。得られた形質転換細胞を適当な培地で培養するこ
とにより、目的の有用遺伝子産物を効率よく製造するこ
とができる。

【００５０】

【実施例】次に、実施例及び参考例により本発明をさら
に具体的に説明する。参考例１ ．ＨＭ１．２４抗原をコードするｃＤＮＡのク
ローニング １）細胞株 ヒト骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６，Ｕ２６６は１０％
ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培
地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）にて培養を行い、ヒト骨髄腫
細胞株ＫＰＭＭ２（特開平７−２３６４７５）は２０％
ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地にて培養
を行った。

【００５１】２）ｃＤＮＡライブラリーの構築 １×１０⁸ 個のＫＰＭＭ２細胞よりチオシアン酸グアニ
ン／塩化セシウム法により全ＲＮＡを単離し、Fast Tra
ck mRNA IsolationKit(Invitrogen）を用いてｍＲＮＡ
の精製を行った。１０μｇのｍＲＮＡよりNot Ｉ／olig
o-dT₁₈（Time Saver cDNA Synthesis Kit; Pharmacia B
iotech ）を用いてｃＤＮＡを合成した後、EcoRＩ adap
terを連結した。０．７kbp 以上のｃＤＮＡを１．０％
低融点アガロースゲル（Ｓｉｇｍａ）を用いて分画し、
ＮｏｔＩにて消化しｐＣＯＳ１発現ベクター又はλＥｘ
Ｃｅｌｌベクター（PharmaciaBiotech ）のEcoRＩ／Not
Ｉ site に挿入し、直接発現クローニング（ｐａｎｎｉ
ｎｇによるスクリーニング）に用いるライブラリー（ラ
イブラリーＡ）及び免疫スクリーニング用のライブラリ
ー（ライブラリーＢ）をそれぞれ構築した。

【００５２】なお、ｐＣＯＳ１発現ベクターは、 HEF-P
Mh-gγ1 （WO92-19759参照）から、ＥｃｏＲＩおよびＳ
ｍａＩ消化により含有される遺伝子を削除し、EcoRI-No
tI-BamHI Adaptor（宝酒造）を連結することにより構築
した。

【００５３】３）Ｐａｎｎｉｎｇ ライブラリーＡをエレクトロポレーション法によりＣＯ
Ｓ−７細胞に導入した。すなわち、２０μｇのプラスミ
ドＤＮＡ（５×１０⁵ 個の独立クローンを含む）を０．
８mlの細胞（１×１０⁷ 細胞／ml in PBS ）と混合し、
Gene Pulser (Bio-Rad）を用いて１．５kV、２５μFDの
条件にてエレクトロポレーションを行った。室温にて１
０分間清置した後、細胞を１０％ ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ
（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）に懸濁し４枚の１００mm培養デ
ィッシュに分け３７℃にて７２時間培養した。

【００５４】培養後細胞をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗
浄し、５mM ＥＤＴＡを含むＰＢＳを加え細胞を剥が
し、５％ ＦＢＳ、０．０２％ ＮａＮ₃ 添加ＰＢＳに
て１−２×１０⁶cells／mlの細胞懸濁液を調整した。続
いて細胞は抗ＨＭ１．２４抗体をコーティングしたｐａ
ｎｎｉｎｇプレート（後述）上で２時間清置し、プレー
トを５％ ＦＢＳ、０．０２％ ＮａＮ₃ を含む３mlの
ＰＢＳで穏やかに３回洗浄した。洗浄後、プレート上に
結合した細胞から、Ｈｉｒｔの溶液（Hitt J., Mol.Bio
l. 26 : 365-369, 1983 ）（０．６％ ＳＤＳ、１０mM
ＥＤＴＡ）を用いてプラスミドＤＮＡを回収した。回
収したプラスミドＤＮＡは大腸菌内で増幅し、次のｐａ
ｎｎｉｎｇに使用した。

【００５５】Ｐａｎｎｉｎｇプレートの調製は次のよう
にして行った。３mlの抗ＨＭ１．２４抗体溶液（１０μ
ｇ／ml in ５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH９．５）を６
０mmディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ）に加え、室温にて２時
間清置し、０．１５Ｍ ＮａＣｌにて３回洗浄した後、
３mlの５％ ＦＢＳ、１mM ＥＤＴＡ、０．０２％Ｎａ
Ｎ₃ 添加ＰＢＳを加え、室温にて２時間清置しブロッキ
ングを行った。ブロッキング溶液を除去した後ｐａｎｎ
ｉｎｇプレートは使用するまで−２０℃で保存した。

【００５６】５×１０⁵ 個のクローンを含むプラスミド
ライブラリー（ライブラリーＡ）を出発材料としてｐａ
ｎｎｉｎｇを３回繰り返すことにより、約０．９kbp の
ｃＤＮＡをインサートとして持つプラスミドＤＮＡが濃
縮された。Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (App
lied Biosystems ）を用いて３７３Ａもしくは377DNASe
quencer (Applied Biosystems）により塩基配列の決定
を行った結果、クローンＰ３．１９は１，０１２bpのｃ
ＤＮＡから成り、１８０アミノ酸をコードするオープン
リーデングフレーム（２３−５４９）を持つことが明ら
かとなった（図１及び図２）（配列番号：１）。このｃ
ＤＮＡより予想されるアミノ酸配列はタイプIIの膜タン
パクに特徴的な構造を示し、２箇所のＮ型糖鎖結合部位
を有していた。

【００５７】４）免疫スクリーニング ライブラリーＢは抗ＨＭ１．２４抗体を用いた免疫スク
リーニングに供した。すなわち、１．５×１０⁵ 個の独
立クローンを含むファージライブラリーを大腸菌ＮＭ５
２２（Pharmacia Biotech ）と共に寒天上に重層し、４
２℃にて３．５時間培養した。培養後、プレート上に１
０mM ＩＰＴＧで前処置したニトロセルロースフィルタ
ー（Schleicher & Schuell）を重ね、さらに３７℃にて
３時間培養した。Ｆｉｌｔｅｒは０．０５％（ｖ／ｖ）
Ｔｗｅｅｎ−２０添加ＴＢＳ（２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、pH７．４、１５０mM ＮａＣｌ）で洗浄した後、１
％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ添加ＴＢＳを加え、室温にて１時間
インキュベートしてブロッキングを行った。

【００５８】ブロッキング後、抗ＨＭ１．２４抗体溶液
（１０μｇ／mlブロッキング緩衝液）を加え、室温にて
１時間インキュベートし、洗浄後５，０００倍希釈した
アルカリホスファターゼ結合抗マウスＩｇ抗血清（pico
Blue Immunoscreening kit；Stratagene）を加え、さら
に室温にて１時間インキュベートした。抗体と反応した
スポットは０．３mg／mlニトロブルーテトラゾリウム、
０．１５mg／ml ５−ブロモ−４−クロロ−３−インド
リルホスフェートを含む発色溶液（１００mMＴｒｉｓ−
ＨＣｌ、pH９．５、１００mM ＮａＣｌ、５mM ＭｇＣ
ｌ₂ ）にて発色させた。

【００５９】免疫スクリーニングにより５個の陽性クロ
ーンが単離され、それら全てがＰ３．１９の部分配列と
一致した（図３）。ホモロジー検索の結果、Ｐ３．１９
は骨髄または滑膜ストローマ細胞に発現するＢＳＴ−２
（Ishikawa J. ら、Genomics, 26；527-534, 1995 ）の
塩基配列と同一のものであることが明らかとなった。二
通りのスクリーニング法により同一の分子が得られ、Ｐ
３．１９がコードする膜タンパクはＨＭ１．２４抗原分
子であることを強く示唆している。

【００６０】なお、前記ヒトＨＭ１．２４抗原タンパク
質と同一の配列を有するヒトタンパク質をコードするＤ
ＮＡをｐＵＣベクターのＸｂａＩ切断部位間に挿入した
プラスミドｐＲＳ３８−ｐＵＣ１９を含有する大腸菌は
Escherichia coli DH5 α（pRS38-pUC19 ）と命名さ
れ、平成５（１９９３）年１０月５日に工業技術院生命
工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３
号）に寄託番号ＦＥＲＭＢＰ−４４３４として、ブダペ
スト条約に基づき国際寄託されている。

【００６１】５）ＦＡＣＳ解析 さらに、Ｐ３．１９によってコードされるタンパクが確
かに抗ＨＭ１．２４抗体と結合するのかを確認するため
に、Ｐ３．１９を導入したＣＨＯ形質転換細胞株を樹立
した。すなわち、Ｐ３．１９クローンをエレクトロポレ
ーション法によりＣＨＯ細胞に導入した後、５００μｇ
／mlのＧ４１８（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）の存在下で培養
し、ＨＭ１．２４抗原発現ＣＨＯ細胞株を得た。

【００６２】１×１０⁶ 個の培養細胞をＦＡＣＳ緩衝液
（ＰＢＳ（−）／２％ ＦＣＳ／０．１％ ＮａＮ₃ ）
に懸濁し、ＨＭ１．２４抗体を添加し、氷中で３０分間
反応した。ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄後、ＧＡＭ−ＦＩＴＣ
溶液（２５μｇ／ml in ＦＡＣＳ緩衝液；Becton Dicki
nson）で再懸濁し、さらに氷中で３０分間反応した。Ｆ
ＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、６００μｌのＦＡＣＳ
緩衝液に再懸濁しＦＡＣＳｃａｎ（Becton Dickinson）
にて測定した。

【００６３】なお、陰性対照抗体としてＵＰＣ１０を用
いた。ＦＡＣＳ解析の結果、Ｐ３．１９を導入したＣＨ
Ｏ細胞は抗ＨＭ１．２４抗体と強く反応したのに対し、
コントロールの発現ベクターのみを導入したＣＨＯ細胞
（ＣＨＯ／ＮＥＯ）では有意な結合は認められなかった
（図４）。したがって、Ｐ３．１９によってコードされ
るタンパク質は抗ＨＭ１．２４抗体と結合することが確
認された。

【００６４】６）免疫沈降 細胞はＰＢＳ（−）で２回洗浄した後、細胞溶解緩衝法
（５０mM萌酸ナトリウム、１５０mM ＮａＣｌ、０．５
％デオキシコール酸ナトリウム、１％ Nonidet P-40、
０．１mg／mlフェニルメチルスルホニルフルオリド、プ
ロテアーゼ阻害剤カクテニル〔Boehringer Mannheim
〕）内で超音波破砕を行い、可溶化画分を得た。可溶
化画分は抗ＨＭ１．２４抗体をコンジュゲートしたSeph
arose 4Bビーズに加えた。遠心後、沈殿物はＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ（１２％ ｇｅｌ）により分離し、ＰＶＤＦ膜に
転写した。ＰＶＤＦ膜は抗ＨＭ１．２４抗体、続いてPO
D-anti-mouse IgGと反応させた後、ＥＣＬキット（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ）を用いて検出を行った。

【００６５】ＫＰＭＭ２，ＲＰＭＩ８２２６及びＵ２６
６の各種ミエローマ細胞株はＨＭ１．２４抗原を強く発
現し、これらの細胞溶解物を抗ＨＭ１．２４抗体で免疫
沈降を行うと、分子量が約２９〜３３kDa のタンパクが
特異的に検出された（図５）。Ｐ３．１９を導入したＣ
ＨＯ細胞株（ＣＨＯ／ＨＭ）においても同様の実験を行
った結果、ＣＨＯ／ＨＭ細胞においてもミエローマ細胞
株と同様に免疫沈降物が確認され（図５、レーン４）、
発現ベクターｐＣＯＳ１のみを導入したコントロール細
胞（ＣＨＯ／ＮＥＯ）ではそのような免疫沈降物は確認
されなかった（図５、レーン５）。

【００６６】Ｐ３．１９は１８０アミノ酸からなる推定
分子量１９．８kDa のタンパクをコードしており、２カ
所のＮ型糖鎖結合モチーフが存在している（図１）。従
って、免疫沈降により認められた分子量の異なったもの
の存在は、Ｎ型糖鎖の修飾の違いによることが考えられ
た。事実、免疫沈降物が数種のレクチンと結合すること
が確認されている。

【００６７】参考例２．マウス抗HM1.24モノクローナル
抗体産生ハイブリドーマの調製 Goto, T. et al., Blood (1994) 84, 1992-1930 に記載
の方法にて、マウス抗HM1.24モノクローナル抗体産生ハ
イブリドーマを調製した。ヒト多発性骨髄腫患者骨髄由
来の形質細胞株KPC-32（1x10⁷ 個）（Goto, T. et al.,
Jpn. J. Clin. Hematol. (11991) 32, 1400）をBALB/C
マウス（チャールスリバー製）の腹腔内に6 週間おきに
2回注射した。このマウスを屠殺する3 日前にマウスの
抗体産生価をさらに上昇させるために、1.5 x 10⁶ 個の
KPC-32をマウスの脾臓内に注射した（Goto, T. et al.,
Tokushima J. Exp. Med. (1990) 37, 89 ）。マウスを
屠殺した後に脾臓を摘出し、Groth, de St. & Schreide
ggerの方法（Cancer Research (1981) 41, 3465 ）に従
い摘出した脾臓細胞とミエローマ細胞SP2/0 を細胞融合
に付した。

【００６８】KPC-32を用いたCell ELISA（Posner, M.
R. et al., J. Immunol. Methods (1982) 48, 23 ）に
よりハイブリドーマ培養上清中の抗体のスクリーニング
を行った。5 x 10⁴ 個のKPC-32を50 ml のPBSに懸濁
し、96穴プレート（U 底型、Corning, Iwaki製）に分注
し37℃で一晩風乾した。1%ウシ血清アルブミン（BSA ）
を含むPBS でブロックした後、ハイブリドーマ培養上清
を加え４℃にて2 時間インキュベートした。次いで、4
℃にて1 時間ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG ヤギ抗
体（Zymed 製）を反応させ、洗浄後室温にて30分間o-フ
ェニレンジアミン基質溶液（Sumitomo Bakelite 製）を
反応させた。

【００６９】2N硫酸で反応を停止させ、ELISA reader
（Bio-Rad 製）で492nmにおける吸光度を測定した。ヒ
ト免疫グロブリンに対する抗体を産生するハイブリドー
マを除去するために、陽性ハイブリドーマ培養上清をヒ
ト血清にあらかじめ吸着させ、他の細胞株に対する反応
性をELISA にてスクリーニングした。陽性のハイブリド
ーマを選択し、種々の細胞に対する反応性をフローサイ
トメトリーで調べた。最後に選択されたハイブリドーマ
クローンを二度クローン化し、これをプリスタン処理し
たBALB/Cマウスの腹腔に注射して、腹水を取得した。

【００７０】モノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム
による沈澱とプロテインA アフィニティクロマトグラフ
ィーキット（Ampure PA 、Amersham製）によりマウス腹
水より精製した。精製抗体は、Quick Tag FITC結合キッ
ト（ベーリンガーマンハイム製）を使用することにより
FITC標識した。その結果、30のハイブリドーマクローン
が産生するモノクローナル抗体がKPC-32およびRPMI 822
6 と反応した。クローニングの後、これらのハイブリド
ーマの培養上清と他の細胞株あるいは末梢血単核球との
反応性を調べた。

【００７１】このうち、3 つのクローンが形質細胞に特
異的に反応するモノクローナル抗体であった。これらの
3 つのクローンのうち、最もフローサイトメトリー分析
に有用であり、かつRPMI 8226 に対するCDC活性を有す
るハイブリドーマクローンを選択し、HM1.24と名付け
た。このハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体
のサブクラスを、サブクラス特異的抗マウスウサギ抗体
（Zymed 製）を用いたELISA にて決定した。抗HM1.24抗
体は、IgG2a κのサブクラスを有していた。抗HM1.24抗
体を産生するハイブリドーマHM1.24は、工業技術院生命
工学工業研究所（茨城県つくば市東1 丁目1 番3 号）
に、平成7 年9 月14日にFERM BP-5233としてブタペスト
条約に基づき国際寄託された。

【００７２】実施例１．ＨＭ１．２４抗原遺伝子のプロ
モーター領域のクローニング これまでに解析した全てのミエローマ細胞でＨＭ１．２
４抗原が強く発現し、ＨＭ１．２４抗原の発現は多発性
骨髄腫の生理的な特性に深く関与している可能性が考え
られる。そこでＨＭ１．２４抗原発現調節機構の解明は
重要な課題であり、プロモーター領域遺伝子構造を明ら
かにした。

【００７３】ＨＭ１．２４抗原遺伝子のプロモーター領
域はPromoterFinder DNA Walking kit (Clontech）を用
いて単離した。Panning により単離したクローンＰ３．
１９の５′−端塩基配列より２本のＰＣＲプライマー；
ＨＭ１（５′−ATC CCC GTCTTC CAT GGG CAC TCT GCA−
３′）（配列番号：６）及びＨＭ２（５′−ATA GTCATA
CGA AGT AGA TGC CAT CCA G −３′）（配列番号：
８）をデザインした。１回目のＰＣＲではアダプターに
対するプライマーＡＰ１（キット添付）とＨＭ１プライ
マーを用いてキット添付マニュアルに準じて行い、ＰＣ
Ｒ産物は引き続きＡＰ２プライマー（キット添付）とＨ
Ｍ２プライマーを用いたnested PCRに供した。最終的な
ＰＣＲ産物は精製した後、ｐＣＲIIクローニングベクタ
ー（Invitrogen）にサブクローニングした。

【００７４】プロモーター領域遺伝子はＰＣＲ法により
簡便に単離した。すなわち、約２．０kb，０．７kb，
０．３kbのＰＣＲ産物がそれぞれＥｃｏＲＶ，ＰｖｕII
およびＤｒａＩライブラリー（PromoterFinder Kit；Cl
ontech）から特異的に増幅された。制限酵素による切断
パターンよりそれぞれ同一のゲノムＤＮＡ由来のもので
あることが明らかになった（図６）。次にそれらの塩基
配列を決定した結果、ｃＤＮＡの５′−端から１９５９
bp上流までの遺伝子配列が決定された（図７及び図８）
（配列番号：４）。既知の転写因子の結合モチーフ検索
を行った結果、ＡＰ−２、Ｓｐ１、ＮＦ−ＩＬ６、ＮＦ
−κＢ、ＳＴＡＴ３またはＩＳＧＦ３等の転写調節エレ
メントが存在し、ＩＬ−６またはＩＦＮ−αといった炎
症性サイトカインの刺激により発現が調節されている可
能性が示唆された。

【００７５】また、ＩＬ−６は骨髄腫細胞の増殖因子と
して働いていることが知られており、ＩＬ−６の下流で
働く転写因子であるＮＦ−ＩＬ６およびＳＴＡＴ３が骨
髄腫細胞におけるＨＭ１．２４抗原の発現調節に関与し
ている可能性が強く示唆された（図７及び図８）。転写
開始点はCapSwitch oligonucleotide (CapFnder Kit; C
lontech）を用いて増幅されたＰＣＲ産物の塩基配列よ
り推定し、その上流−２７位にＴＡＴＡｂｏｘ様配列
（ＴＡＡＴＡＡＡ）が認められた（図７及び図８）。

【００７６】実施例２．ＨＭ１．２４抗原ゲノムＤＮＡ
のクローニング ＨＭ１．２４抗原ゲノムＤＮＡはヒトゲノムＤＮＡライ
ブラリー（PromoterFinder DNA walking kit；Clontec
h）もしくは末梢血より調製したヒトゲノムＤＮＡ（Clo
ntech）より図９に示す各ＰＣＲプライマーを用いて増
幅した。ＰＣＲ産物はそれぞれ精製した後ｐＣＲIIベク
ターにサブクローニングし、塩基配列の決定を行った。

【００７７】ＨＭ１．２４抗原をコードしているゲノム
ＤＮＡは４本の断片に分け、ヒト胎盤より調製したヒト
ゲノムＤＮＡライブラリー（PromoterFinder Kit；Clon
tech）もしくはヒト末梢血より調製したヒトゲノムＤＮ
Ａより増幅した（図９）。それらの塩基配列を確認した
後、ＨＭ１．２４抗原ｃＤＮＡの塩基配列と比較した結
果、ＨＭ１．２４抗原遺伝子は４つのエクソンにより構
成され、８５０bp，１８３bpおよび３０７bpの３つのイ
ントロンが存在した（図１０）。

【００７８】しかしながら、ヒト胎盤組織より調製した
ヒトゲノムＤＮＡライブラリーからはイントロン３が欠
如した３エクソンからなる遺伝子のみ増幅され、エクソ
ン・イントロン構造の異なるゲノム遺伝子の存在が示唆
された。いずれの構造においても、ＨＭ１．２４抗原の
細胞外領域に存在する２カ所のＮ型糖鎖結合部位ならび
に３カ所のシステイン残基は全てエクソン１に存在した
（図１１及び図１２）（配列番号：２）。

【００７９】実施例３．ＨＭ１．２４抗原スプライシン
グバリアントの確認 ＨＭ１．２４抗原にスプライシングバリアントが存在す
るのかを確認するために、前述の方法によりヒト骨髄腫
細胞株ＫＰＭＭ２より調製したｃＤＮＡを鋳型として用
い、ＰＣＲ法によりＨＭ１．２４抗原ｃＤＮＡを増幅し
た。ＰＣＲに用いたセンスプライマーＢＳＴ２−Ｎ（配
列番号１７；ATG GCA TCT ACT TCG TATGAC ）は今回単
離したＰ３．１９（配列番号１）の塩基１０〜３０に対
応し、アンチセンスプライマーＳ３（配列番号１８；AA
C CGT GTT GCC CCATGA ）はＰ３．１９の塩基６４１〜
６５８に対応している。

【００８０】ＰＣＲにより増幅された産物はクローニン
グベクターPcrii （Invitrogen）にサブクローニング
し、得られた独立のクローンからプラスミドＤＮＡを回
収した結果、約６５０bpと約５５０bpの２種類の異なる
サイズのインサートが認められた。それぞれ塩基配列を
決定した結果、約６５０bpのインサートはＰ３．１９と
同一の配列を示したが、約５５０bpのインサートはＰ
３．１９の塩基２９４〜４２２に相当する部分の欠損が
認められた（配列番号１９）。欠損が認められた部位は
ヒトＨＭ１．２４ゲノムＤＮＡのエクソン２，３に相当
し、スプライシングの違いによるバリアントの存在が示
された。

【００８１】実施例４．ＨＭ１．２４遺伝子のポリモル
フィズムの解析 ＨＭ１．２４遺伝子に見いだされたポリモルフィズムに
関して、多発性骨髄腫との関連を検討した。健常人末梢
血は日本赤十字徳島血液センターより献血材料のバフィ
ーコートの提供を受けた。骨髄腫患者については徳島大
学第一内科及びその関連病院の患者より末梢血または骨
髄液を採取した。血液サンプルはFicoll-Conrey 比重遠
心法にて単核細胞を分離した。骨髄腫細胞株は１０％牛
胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（GIBCO-BRL, Roc
kville MD U.S.A.)にて５％炭酸ガス恒温槽３７℃中で
培養した。末梢血単核細胞または骨髄腫細胞株をＤＮＡ
ｚｏｌ試薬（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を用い、ｐｒｏｔｏ
ｃｏｌに従って処理し、細胞からゲノムＤＮＡを抽出し
た。

【００８２】塩基配列はＰＣＲ−direct sequencing 法
により決定した。５′プロモーター領域はプライマー６
Ｓ（TCCATAGTCCCCTCGGTGG)（配列番号：２２）およびＢ
ＳＴ２Ｂ（ATAGTCATACGAAGTAGATGCCATCCAG)(配列番号：
２３）を用い、ampliTaq DNApolymerase(Perkin-Elme
r、千葉）によるＰＣＲ（９４℃１分、５５℃１分、７
２℃１分を３０サイクル）を行った。またＨＭコード領
域はプライマーＨＭＰ２Ｋ（AAAGGTACCAGCTGTCTTTCTGTC
TGTC)(配列番号：２４）およびＢＳＴ２−Ｒ４（GTGCTC
TCCCCGCTAACC)(配列番号：２５）を用い、LA Taq DNA P
olymerase(宝酒造、大津）によるＰＣＲを行った。反応
液を鋳型として、さらにプライマー８Ｓ（GGACGTTTCCTA
TGCTAA)(配列番号：２６）及びＢＳＴ２−Ｒ１（AAAGCG
GCCGCTCATCACTGCAGCAGAGCGCTGAG) (配列番号：２７）を
用い、Ex Taq ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造）によるＰ
ＣＲを行った。

【００８３】反応液をQIA Quick PCR Purification Kit
(QIAGEN、東京）にて精製し、得られたＰＣＲフラグメ
ントを鋳型とし、５′プロモーター領域では６Ｓまたは
ＢＳＴ２Ｂ，ＨＭコード領域は８Ｓ， ＨＭＩＮＴＩＦ
（AGGGGAACTCACCAGACC)(配列番号：２８）、ＨＭＥＸ２
Ｆ（ATGGCCCTAATGGCTTCC)(配列番号：２９）、ＨＭＥＸ
３Ｆ（CATTAAACCATAAGCTTCAGG) (配列番号：３０）、Ｈ
ＭＥＸ２Ｒ（CCCTCAAGCTCCTCCACT)(配列番号：３１）、
またはＢＳＴ２−Ｒ１をプライマーとしてBigDye Termi
nator Cycle Sequencing Kit (Perkin-Elmer) にて反応
した。塩基配列の決定はABI377 DNA Sequencer (Perkin
-Elmer) により行った。

【００８４】ＨＭ１．２４遺伝子の開始コドン上流２０
塩基対付近の８塩基対欠失頻度はＰＣＲにより検出し
た。すなわち、プライマー８Ｓ及びＢＳＴ２−Ｒ３（GA
CGGATCCTAAAGCTTACAGCGCTTATC) (配列番号：３２）を用
い、ampliTaq DNAポリメラーゼ（Perkin-Elmer）による
ＰＣＲ（９４℃１分、５５℃１分、７２℃１分を３０サ
イクル）を行った。反応液を４％アガロースゲルにて電
気泳動し、エチジウムブロマイド染色により検出した。

【００８５】ＨＭ１．２４遺伝子５′プロモーター領域
のポリモルフィズム 健常人および患者検体についてＨＭ１．２４遺伝子５′
プロモーター領域の塩基配列を決定した。結果を図１４
〜図１８（配列番号：３３）に示した。下線を引いた図
１４の１８７、２６２及び３２３に塩基置換並びに図１
４の３６０付近及び図１５の５５５付近に欠失のある検
体が認められ、また３６６〜５５８の間が解読不能な検
体が存在した。

【００８６】図１４〜図１８（配列番号：３３）に記載
した配列をＡタイプ、上記の塩基置換・欠失のある変異
タイプをＢタイプとすると、３６６〜５５８の間が解読
不能な検体はＡとＢのヘテロ接合体（ＡＢ）であり、Ａ
またはＢタイプに解読できた検体はＡのホモ接合体（Ａ
Ａ）あるいはＢのホモ接合体（ＢＢ）であると考えられ
る。上述のポリモルフィズムの他に、骨髄腫細胞株ＨＳ
−ｓｕｌｔａｎでは二重下線の部分がタンデムに１９bp
挿入していることも明らかにした（Ｍタイプ）。

【００８７】ＨＭ１．２４遺伝子のポリモルフィズム ゲノム遺伝子領域についてＡＡタイプの細胞株（Ｕ２６
６，ＨＳ−ｓｕｌｔａｎ）およびＢＢタイプの健常人検
体２例について塩基配列を決定した。この結果、Ｂタイ
プの配列ではイントロン３の２３１５付近でｃが３塩基
欠失していることが明らかになったが、コード領域には
全く変異は認められなかった。

【００８８】Ａ，Ｂタイプの遺伝子頻度 ポリモルフィズムと疾患感受性について検討した。ＨＭ
１．２４遺伝子の開始コドン上流２０塩基対付近の８塩
基対欠失をＰＣＲにより検出した結果、健常人９４例と
骨髄腫患者４６例の間にポリモルフィズムの頻度に差は
見いだされなかった（表１）。健常人、骨髄腫患者とも
にＡタイプの遺伝子が多く、およそＡ：Ｂ＝２：１でこ
れらの遺伝子が分布していることが判明した。細胞株に
ついては１１例中９例がＡＡタイプで、Ａタイプに偏り
があった。ＨＭ１．２４プロモーター領域のポリモルフ
ィズムに骨髄腫疾患感受性との関連は認められなかっ
た。

【００８９】

【表１】

【００９０】

【発明の効果】本発明によれば、骨髄腫細胞すべてに高
発現しているＨＭ１．２４抗原のゲノム遺伝子を得るこ
とができた。ＨＭ１．２４抗原をコードするゲノム遺伝
子はＨＭ１．２４抗原の解析に有用である。また、ＨＭ
１．２４抗原は強く発現されていることから、そのプロ
モーター領域は強いプロモーター活性を有していると考
えられ、有用遺伝子の発現に有用である。

【００９１】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha <120> Genomic Gene Coding for HM1.24 Antigenic Protein and P romoter Therefor <130> F924 <150> JP 10-060617 JP 10-093883 <151> 1998-02-25 1998-03-24 <160> 33 <210> 1 <211> 1014 <212> DNA <213> Homosapiens <223> cDNA coding for HM1.24 antigenic protein <400> 1 gaattcggca cgagggatct gg atg gca tct act tcg tat gac tat tgc aga 52 Met Ala Ser Thr Ser Tyr Asp Tyr Cys Arg 1 5 10 gtg ccc atg gaa gac ggg gat aag cgc tgt aag ctt ctg ctg ggg ata 100 Val Pro Met Glu Asp Gly Asp Lys Arg Cys Lys Leu Leu Leu Gly Ile 15 20 25 gga att ctg gtg ctc ctg atc atc gtg att ctg ggg gtg ccc ttg att 148 Gly Ile Leu Val Leu Leu Ile Ile Val Ile Leu Gly Val Pro Leu Ile 30 35 40 atc ttc acc atc aag gcc aac agc gag gcc tgc cgg gac ggc ctt cgg 196 Ile Phe Thr Ile Lys Ala Asn Ser Glu Ala Cys Arg Asp Gly Leu Arg 45 50 55 gca gtg atg gag tgt cgc aat gtc acc cat ctc ctg caa caa gag ctg 244 Ala Val Met Glu Cys Arg Asn Val Thr His Leu Leu Gln Gln Glu Leu 60 65 70 acc gag gcc cag aag ggc ttt cag gat gtg gag gcc cag gcc gcc acc 292 Thr Glu Ala Gln Lys Gly Phe Gln Asp Val Glu Ala Gln Ala Ala Thr 75 80 85 90 tgc aac cac act gtg atg gcc cta atg gct tcc ctg gat gca gag aag 340 Cys Asn His Thr Val Met Ala Leu Met Ala Ser Leu Asp Ala Glu Lys 95 100 105 gcc caa gga caa aag aaa gtg gag gag ctt gag gga gag atc act aca 388 Ala Gln Gly Gln Lys Lys Val Glu Glu Leu Glu Gly Glu Ile Thr Thr 110 115 120 tta aac cat aag ctt cag gac gcg tct gca gag gtg gag cga ctg aga 436 Leu Asn His Lys Leu Gln Asp Ala Ser Ala Glu Val Glu Arg Leu Arg 125 130 135 aga gaa aac cag gtc tta agc gtg aga atc gcg gac aag aag tac tac 484 Arg Glu Asn Gln Val Leu Ser Val Arg Ile Ala Asp Lys Lys Tyr Tyr 140 145 150 ccc agc tcc cag gac tcc agc tcc gct gcg gcg ccc cag ctg ctg att 532 Pro Ser Ser Gln Asp Ser Ser Ser Ala Ala Ala Pro Gln Leu Leu Ile 155 160 165 170 gtg ctg ctg ggc ctc agc gct ctg ctg cag tgagatccca ggaagctggc 582 Val Leu Leu Gly Leu Ser Ala Leu Leu Gln 175 180 acatcttgga aggtccgtcc tgctcggctt ttcgcttgaa cattcccttg atctcatcag 642 ttctgagcgg gtcatggggc aacacggtta gcggggagag cacggggtag ccggagaagg 702 gcctctggag caggtctgga ggggccatgg ggcagtcctg ggtgtgggga cacagtcggg 762 ttgacccagg gctgtctccc tccagagcct ccctccggac aatgagtccc ccctcttgtc 822 tcccaccctg agattgggca tggggtgcgg tgtggggggc atgtgctgcc tgttgttatg 882 ggtttttttt gcgggggggg ttgctttttt ctggggtctt tgagctccaa aaaaataaac 942 acttcctttg agggagagca caccttaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaattc 1002 gggcggccgc ca 1014 <210> 2 <211> 2337 <212> DNA <213> Homosapiens <220> <221> exon <222> (51)…(335) <220> <221> intron <222> (336) …(1188) <220> <221> exon <222> (1189)…(1255) <220> <221> intron <222> (1256)…(1436) <220> <221> exon <222> (1437)…(1497) <220> <221> intron <222> (1498)…(1804) <220> <221> exon <222> (1805)…(1931) <223> Nucleic requence of genomic DNA coding for HM.24 antigenic protein <400> 2 ccctccccta actccaggcc agactccttt cagctaaagg ggagatctgg atg gca 56 Met Ala 1 tct act tcg tat gac tat tgc aga gtg ccc atg gaa gac ggg gat aag 104 Ser Thr Ser Tyr Asp Tyr Cyr Arg Val Pro Met Glu Asp Gly Asp Lys 5 10 15 cgc tgt aag ctt ctg ctg ggg ata gga att ctg gtg ctc ctg atc atc 152 Arg Cys Lys Leu Leu Leu Gly Ile Gly Ile Leu Val Leu Leu Ile Ile 20 25 30 gtg att ctg ggg gtg ccc ttg att atc ttc acc atc aag gcc aac agc 200 Val Ile Leu Gly Val Pro Leu Ile Ile Phe Thr Ile Lys Ala Asn Ser 35 40 45 50 gag gcc tgc cgg gac ggc ctt cgg gca gtg atg gag tgt cgc aat gtc 248 Glu Ala Cys Arg Asp Gly Leu Arg Ala Val Met Glu Cys Arg Asn Val 55 60 65 acc cat ctc ctg caa caa gag ctg acc gag gcc cag aag ggc ttt cag 296 Thr His Leu Leu Gln Gln Glu Leu Thr Glu Ala Gln Lys Gly Phe Gln 70 75 80 gat gtg gag gcc cag gcc gcc acc tgc aac cac act gtg gtaagctcct 345 Asp Val Glu Ala Gln Ala Ala Thr Cys Asn His Thr Val 85 90 95 caactccttt ggatggccta gtactaggcg gtgggaggga caagaatctc tccccagaaa 405 tctgacccag ggtgggtctc cagggagatg caggggaggt cctgaaactg ctcctgggcc 465 cccacatcaa gggacctagg ttcccctacc agggtttgtg ggcccctaac ccagtccagg 525 gcactggtgt aggggcaggg tgttaaaact ctccagatcc cccaaatcgg ggacctcagt 585 atccccctgg gacttaggtg aatttataaa ttctttccag ggcactggtg tcgggggcct 645 tgaaactcct cgtgggcacc agtcctgggg gagtgaaaat ccctattcag ggttgaaggg 705 ggacctcacc agaccctgaa aaagggggct tttgaaattt tcacttcatc cctaagaaac 765 tgaaatattc acctgggtcc tgatatgggg gatcttgaaa ctctcgctgg gcatgtcact 825 tgggcgggga aatcccactg cattctggat ttggtagggc cctctaactt ttcttgggcc 885 attgctcagg caatctggaa atgtccacta aactttggtt atcgatagcc tccaagtttc 945 cacgtggggt ggcctcaaaa ctcccatttt gaggacccac atgcttatgg gtggccctgg 1005 gagagtgtgt ggttgtggct gttctttaag gttggagacc atggtgcaga gagggttgga 1065 agaaaacctg aaaggggttt gcatttaagc ccctctgtcc ccaggaccta gggaggaggc 1125 ccaggtccca ggggcagcag ccaaactccc caggccaaaa ccccagattc taactcttct 1185 tag atg gcc cta atg gct tcc ctg gat gca gag aag gcc caa gga caa 1233 Met Ala Leu Met Ala Ser Leu Asp Ala Glu Lys Ala Gln Gly Gln 100 105 110 aag aaa gtg gag gag ctt gag g gtgagaaagg gagaagggag agggccgggg 1285 Lys Lys Val Glu Glu Leu Glu G 115 aggggtgagt caggtatgga agagggggtg ggggcaggga gaccagggct ggaggttggg 1345 gtaaggggga ggttctgtcc cagagtggag cagggcccca gcatggccac atgctgaccc 1405 gccccctgtt tctgtcctcc caccctacca g ga gag atc act aca tta aac cat 1459 ly Glu Ile Thr Thr Leu Asn His 120 125 aag ctt cag gac gcg tct gca gag gtg gag cga ctg ag gtcagagata 1507 Lys Leu Gln Asp Ala Ser Ala Glu Val Glu Arg Leu Ar 130 135 gccttccccc gctaccctcc acctgccaca ttcctctcac ccccacatcc ctagcccaag 1567 acccaggatc tcctttgctc ccaaaatccc cattgcccca agggataaag tttgagtccc 1627 acaaaaggat aacttagccc ctagggtcac agagccatgg gtggccgctg tccattccct 1687 ccccggtgac ttggattggg gcggtgcggg gggaactccc gggggcggtg ggcttacagg 1747 gagggcggca ggagccagga cgagcagatg cctgatttgc ccccatctgt accgcag a 1805 g aga gaa aac cag gtc tta agc gtg aga atc gcg gac aag aag tac tac 1853 Arg Glu Asn Gln Val Leu Ser Val Arg Ile Ala Asp Lys Lys Tyr Tyr 140 145 150 ccc agc tcc cag gac tcc agc tcc gct gcg gcg ccc cag ctg ctg att 1901 Pro Ser Ser Gln Asp Ser Ser Ser Ala Ala Ala Pro Gln Leu Leu Ile 155 160 165 170 gtg ctg ctg ggc ctc agc gct ctg ctg cag tgagatccca ggaagctggc 1951 Val Leu Leu Gly Leu Ser Ala Leu Leu Gln 175 180 acatcttgga aggtccgtcc tgctcggctt ttcgcttgaa cattcccttg atctcatcag 2011 ttctgagcgg gtcatggggc aacacggtta gcggggagag cacggggtag ccggagaagg 2071 gcctctggag caggtctgga ggggccatgg ggcagtcctg ggtgtgggga cacagtcggg 2131 ttgacccagg gctgtctccc tccagagcct ccctccggac aatgagtccc ccctcttgtc 2191 tcccaccctg agattgggca tggggtgcgg tgtggggggc atgtgctgcc tgttgttatg 2251 ggtttttttt gcgggggggg ttgctttttt ctggggtctt tgagctccaa aaaaataaac 2311 acttcctttg agggagagca cacctt 2337 <210> 3 <211> 180 <212> PRT <213> Homosapiens <223> Amino acid requence of HM1.24 antigenic protein <400> 3 Met Ala Ser Thr Ser Tyr Asp Tyr Cys Arg Val Pro Met Glu Asp Gly 1 5 10 15 Asp Lys Arg Cys Lys Leu Leu Leu Gly Ile Gly Ile Leu Val Leu Leu 20 25 30 Ile Ile Val Ile Leu Gly Val Pro Leu Ile Ile Phe Thr Ile Lys Ala 35 40 45 Asn Ser Glu Ala Cys Arg Asp Gly Leu Arg Ala Val Met Glu Cys Arg 50 55 60 Asn Val Thr His Leu Leu Gln Gln Glu Leu Thr Glu Ala Gln Lys Gly 65 70 75 80 Phe Gln Asp Val Glu Ala Gln Ala Ala Thr Cys Asn His Thr Val Met 85 90 95 Ala Leu Met Ala Ser Leu Asp Ala Glu Lys Ala Gln Gly Gln Lys Lys 100 105 110 Val Glu Glu Leu Glu Gly Glu Ile Thr Thr Leu Asn His Lys Leu Gln 115 120 125 Asp Ala Ser Ala Glu Val Glu Arg Leu Arg Arg Glu Asn Gln Val Leu 130 135 140 Ser Val Arg Ile Ala Asp Lys Lys Tyr Tyr Pro Ser Ser Gln Asp Ser 145 150 155 160 Ser Ser Ala Ala Ala Pro Gln Leu Leu Ile Val Leu Leu Gly Leu Ser 165 170 175 Ala Leu Leu Gln 180 <210> 4 <211> 2061 <212> DNA <213> Homosapiens <220> <221> promoter <222> (1) …(2040) <220> <221> CDS <222> (2041)…(2061) <223> DNA fragnt cotus aivy promoter regien of HM1.24 antigenic protein ghe <400> 4 actaaaagtc tctgatatgc agaaataatg gcataagctg tctttctgtc tgtcccctct 60 ctctctctct gcctcggctg ccaggcaggg aagggccccc tgtccagtgg acacgtgacc 120 cacatgacct tacctatcat tggagatgac tcacactctt taccctgccc cttttgcttt 180 gtatccaata aataacagca cagccagaca ttcggggcca ctaccagtct ccgcgcattg 240 ctggtagtgg tcccccgggc ccagctgtct tttcttttat ctcttcgtct tgtgtcttta 300 tttctacact ctctcgtcgc cgcacacagg gagagaccca ctgaccctgt ggggctggtc 360 cctacagtaa ttttaaaggg aagagcaaca aactttcggt ttgcagggct gggactgttt 420 acagctgcaa aatttagaga ggacatcaat ctattattat ccacatttta cagctgggga 480 aatcaatgct aagagaggaa attcatttgc ccagaggtgc accaccctgg cctccaatgt 540 gcaattcatg caattgtgat ttccgacctg gtcccaaact aaccctaaag ttagcaggcc 600 agaacagtgc tgctcaaata agtcagctta gtcaaataag tcaggcaaag gtcgtgtctt 660 tgcacctgga gtcctggcca ggctggtagg tccctcctcc tgggacaagt tcaccctcag 720 aattttcagc aagatcatct cccacagctt gttaattggt tcttggttct aagtgatttt 780 tttgtttatt ggtttaagag atgggatccc actctatcac ccaggcttga gtgccgtggc 840 acaatcatag ctcgctgcag cctcaaactc ctgggctcga gtgatcctcc tgcctcagcc 900 tcccagcctc agcctgggac cacaggcatg taccaccatg cctggctcta agtggcttta 960 atggggtcct tctgagggat gttggagtca gggcctgggg ggagttcccc aggccttctg 1020 ggaggcctgg gctctggact tgacctcgcc tactgtctgg ccctgctgaa aagaaaaaaa 1080 aacatggaaa tggcagacct aacagaatct gggctgtggt caggatgtgg ctgaagaagc 1140 cacaagaaaa acatgcagtc ccctttcagc ggtcatgccc agcagttggg tgccgataat 1200 gggcctgatt tcctgtagga agccctggct ctcttggcca catggacagt gtctgaggct 1260 ggccctgtta ttcccctttg cagatgaaga aacaggctca gagagtttac ctggtatcct 1320 ggagtcccag gagcactttt tctggaagta ggagcttgtt tcctgcaggt gccaagacag 1380 agaccgacat tgtttgttgg ctgggtcggt ctcccagttt tcagctggct ccagtctcac 1440 ctgttgctca cacaccctcc atgtctccca tagtcccctc ggtggggaca gaggcactgg 1500 atgaagccct gctcgtcacc acagagacac ctgaacacaa aaaccagtcc ctggggtcag 1560 acccaggccc cgcccccaga cccaggccct gccctcactc caccacgcaa ctgtgcaacc 1620 tcagtttccc caggtggaga ccggaccaac aatgatggcc tctgcctctt caggtcatag 1680 tacagatgaa tacaggctgg cacggcctag gcactcagta acacacggca gaggcacagg 1740 gacttaagat ggagtgtccc aggcagccac agttggctgg cacccagttg ggaagggccc 1800 aagggctttt aaagcagggt gaaaaaaaaa gcccacctcc tttctgggaa actgaaactg 1860 aaaacctaat taatcctctg cctgtaggtg cctcatgcaa gagctgctgg tcagagcact 1920 tcctggaact tgctattggt caggacgttt cctatgctaa taaaggggtg gcccgtagaa 1980 gattccagca ccctccccta actccaggcc agactccttt cagctaaagg ggagatctgg 2040 atg gca tct act tcg tat gac 2061 Met Ala Ser Thr Ser Tyr Asp 5 <210> 5 <211) 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 gtaatacgac tcactatagg gc 22 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Primer <400> 6 atccccgtct tccatgggca ctctgca 27 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 actatagggc acgcgtggt 19 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 atagtcatac gaagtagatg ccatccag 28 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 actatagggc acgcgtggt 19 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Primer <400> 10 cctcgctgtt ggccttgatg gtgaa 25 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 gccaacagcg aggcctgc 18 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 gcatccaggg aagccatt 18 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 actccccagg ccaaaacc 18 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 14 cgcgtcctga agcttatggt tt 22 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 15 gcgtctgcag cggtggag 18 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 16 cgaaaagccg agcaggac 18 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 17 atggcatcta cttcgtatga c 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 18 aaccgtgttg ccccatga 18 <210> 19 <211> 471 <212> DNA <213> Homosapience <223> cDNA coding for a splicing variant of human HM1.24 antiguenic protein <400> 19 atg gca tct act tcg tat gac tat tgc aga gtg ccc atg gaa gac ggg 48 Met Ala Ser Thr Ser Tyr Asn Tyr Cys Arg Val Pro Met Glu Asp Gly 1 5 10 15 gat aag cgc tgt aag ctt ctg ctg ggg ata gga att ctg gtg ctc ctg 96 Asp Lys Arg Cys Lys Leu Leu Leu Gly Ile Gly Ile Leu Val Leu Leu 20 25 30 atc atc gtg att ctg ggg gtg ccc ttg att atc ttc acc atc aag gcc 144 Ile Ile Val Ile Leu Gly Val Pro Leu Ile Ile Phe Thr Ile Lys Ala 35 40 45 aac agc gag gcc tgc cgg gac ggc ctt cgg gca gtg atg gag tgt cgc 192 Asn Ser Glu Ala Cys Arg Asp Gly Leu Arg Ala Val Met Glu Cys Arg 50 55 60 aat gtc acc cat ctc ctg caa caa gag ctg acc gag gcc cag aag ggc 240 Asn Val Thr His Leu Leu Gln Gln Glu Leu Thr Glu Ala Gln Lys Gly 65 70 75 80 ttt cag gat gtg gag gcc cag gcc gcc acg tgc aac cac act gtg aag 288 Phe Gln Asp Val Glu Ala Gln Ala Ala Thr Cys Asn His Thr Val Lys 85 90 95 aga aaa cca ggt ctt aag cgt gag aat cgc gga caa gaa gta cta ccc 336 Arg Lys Pro Gly Leu Lys Arg Glu Asn Arg Gly Gln Glu Val Leu Pro 100 105 110 cag ctc cca gga ctc cag ctc cgc tgc ggc gcc cca gct gct gat tgt 384 Gln Leu Pro Gly Leu Gln Leu Arg Cys Gly Ala Pro Ala Ala Asp Cys 115 120 125 gct gct ggg cct cag cgc tct gct gca gtg aga tcc cag gaa gct ggc 432 Ala Ala Gly Pro Gln Arg Ser Ala Ala Val Arg Ser Gln Glu Ala Gly 130 135 140 aca tct tgg aag gtc cgt cct gct cgg ctt ttc gct tga 471 Thr Ser Trp Lys Val Arg Pro Ala Arg Leu Phe Ala 145 150 155 <210> 20 <211> 156 <212> PRT <213> Homosapiens <223> Amino acid requence of a splicing variant of human HM.24 antigenic protein <400> 20 Met Ala Ser Thr Ser Tyr Asn Tyr Cys Arg Val Pro Met Glu Asp Gly 1 5 10 15 Asp Lys Arg Cys Lys Leu Leu Leu Gly Ile Gly Ile Leu Val Leu Leu 20 25 30 Ile Ile Val Ile Leu Gly Val Pro Leu Ile Ile Phe Thr Ile Lys Ala 35 40 45 Asn Ser Glu Ala Cys Arg Asp Gly Leu Arg Ala Val Met Glu Cys Arg 50 55 60 Asn Val Thr His Leu Leu Gln Gln Glu Leu Thr Glu Ala Gln Lys Gly 65 70 75 80 Phe Gln Asp Val Glu Ala Gln Ala Ala Thr Cys Asn His Thr Val Lys 85 90 95 Arg Lys Pro Gly Leu Lys Arg Glu Asn Arg Gly Gln Glu Val Leu Pro 100 105 110 Gln Leu Pro Gly Leu Gln Leu Arg Cys Gly Ala Pro Ala Ala Asp Cys 115 120 125 Ala Ala Gly Pro Gln Arg Ser Ala Ala Val Arg Ser Gln Glu Ala Gly 130 135 140 Thr Ser Trp Lys Val Arg Pro Ala Arg Leu Phe Ala 145 150 155 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Homosapiens <223> N-terminal partial amino acid requence of HM1.24 antigenic protein <400> 21 Met Ala Ser Thr Ser Tyr Asp 1 5 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 22 tccatagtcc cctcggtgg 19 <210> 23 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Primer <400> 23 atagtcatac gaagtagatg ccatccag 28 <210> 24 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 24 aaaggtacca gctgtctttc tgtctgtc 28 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 25 gtgctctccc cgctaacc 18 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 26 ggacgtttcc tatgctaa 18 <210> 27 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 27 aaagcggccg ctcatcactg cagcagagcg ctgag 35 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Primer <400> 28 aggggaactc accagacc 18 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 29 atggccctaa tggcttcc 18 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 30 cattaaacca taagcttcag g 21 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Primer <400> 31 ccctcaagct cctccact 18 <210> 32 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 32 gacggatcct aaagcttaca gcgcttatc 29 <210> 33 <211> 2456 <212> DNA <213> Homosapiens <220> <221> exon <222> (576) …(860) <220> <221> intron <222> (861) …(1713) <220> <221> exon <222> (1714)…(1781) <220> <221> intron <222> (1782)…(1961) <220> <221> exon <222> (1962)…(2022) <220> <221> intron <222> (2023)…(2329) <220> <221> exon <222> (2330)…(2456) <223> Nucleic requence of genomic DNA coding for HM.24 antigenic protein <400> 33 tcccatagtc ccctcggtgg ggacagaggc actggatgaa gccctgctcg tcaccacaga 60 gacacctgaa cacaaaaacc agtccctggg gtcagaccca ggccccgccc ccagacccag 120 gccctgccct cactccacca cgcaactgtg caacctcagt ttccccaggt ggagaccgga 180 ccaacaatga tggcctctgc ctcttcaggt catagtacag atgaatacag gctggcacgg 240 cctaggcact cagtaacaca cggcagaggc acagggactt aagatggagt gtcccaggca 300 gccacagttg gctggcaccc agttgggaag ggcccaaggg cttttaaagc agggtgaaaa 360 aaaaagccca cctcctttct gggaaactga aactgaaaac ctaattaatc ctctgcctgt 420 aggtgcctca tgcaagagct gctggtcaga gcacttcctg gaacttgcta ttggtcagga 480 cgtttcctat gctaataaag gggtggcccg tagaagattc cagcaccctc ccctaactcc 540 aggccagact cctttcagct aaaggggaga tctgg atg gca tct act tcg tat gac 596 Met Ala Ser Thr Ser Tyr Asp 1 5 tat tgc aga gtg ccc atg gaa gac ggg gat aag cgc tgt aag ctt ctg 644 Tyr Cys Arg Val Pro Met Glu Asp Gly Asp Lys Arg Cys Lys Leu Leu 10 15 20 ctg ggg ata gga att ctg gtg ctc ctg atc atc gtg att ctg ggg gtg 692 Leu Gly Ile Gly Ile Leu Val Leu Leu Ile Ile Val Ile Leu Gly Val 25 30 35 ccc ttg att atc ttc acc atc aag gcc aac agc gag gcc tgc cgg gac 740 Pro Leu Ile Ile Phe Thr Ile Lys Ala Asn Ser Glu Ala Cys Arg Asp 40 45 50 55 ggc ctt cgg gca gtg atg gag tgt cgc aat gtc acc cat ctc ctg caa 788 Gly Leu Arg Ala Val Met Glu Cys Arg Asn Val Thr His Leu Leu Gln 60 65 70 caa gag ctg acc gag gcc cag aag ggc ttt cag gat gtg gag gcc cag 836 Gln Glu Leu Thr Glu Ala Gln Lys Gly Phe Gln Asp Val Glu Ala Gln 75 80 85 gcc gcc acc tgc aac cac act gtg gtaagctcct caactccttt ggatggccta 890 Ala Ala Thr Cys Asn Hrs Thr Val 90 95 gtactaggcg gtgggaggga caagaatctc tccccagaaa tctgacccag ggtgggtctc 950 cagggagatg caggggaggt cctgaaactg ctcctgggcc cccacatcaa gggacctagg 1010 ttcccctacc agggtttgtg ggcccctaac ccagtccagg gcactggtgt aggggcaggg 1070 tgttaaaact ctccagatcc cccaaatcgg ggacctcagt atccccctgg gacttaggtg 1130 aatttataaa ttctttccag ggcactggtg tcgggggcct tgaaactcct cgtgggcacc 1190 agtcctgggg gagtagaaat ccctattcag ggttgaaggg ggacctcacc agaccctgaa 1250 aaagggggct tttgaaattt tcacttcatc cctaagaaac tgaaatattc acctgggtcc 1310 tgatatgggg gatcttgaaa ctctcgctgg gcatgtcact tgggcgggga aatcccactg 1370 cattctggat ttggtagggc cctctaactt ttcttgggcc attgctcagg caatctggaa 1430 atgtccacta aactttggtt atcgatagcc tccaagtttc cacgtggggt ggcctcaaaa 1490 ctcccatttt gaggacccac atgcttatgg gtggccctgg gagagtgtgt ggttgtggct 1550 gttctttaag gttggagacc atggtgcaga gagggttgga agaaaacctg aaaggggttt 1610 gcatttaagc ccctctgtcc ccaggaccta gggaggaggc ccaggtccca ggggcagcag 1670 ccaaactccc caggccaaaa ccccagattc taactcttct tag atg gcc cta atg 1725 Met Ala Leu Met gct tcc ctg gat gca gag aag gcc caa gga caa aag aaa gtg gag gag 1773 Ala Ser Leu Asp Ala Glu Lys Ala Gln Gly Gln Lys Lys Val Glu Glu 100 105 110 115 ctt gag gg tgagaaaggg agaagggaga gggccgggga ggggtgagtc aggtatggaa 1831 Leu Glu Gl gagggggtgg gggcagggag accagggctg gaggttgggg taagggggag gttctgtccc 1891 agagtggagc agggccccag catggccaca tgctgacccg ccccctgttt ctgtcctccc 1951 accctaccag g a gag atc act aca tta aac cat aag ctt cag gac gcg 1999 y Glu Ile Thr Thr Leu Asn His Lys Leu Gln Asp Ala 120 125 130 tct gca gag gtg gag cga ctg ag gtcagagata gccttccccc gctaccctcc 2052 Ser Ala Glu Val Glu Arg Leu Ar 135 acctgccaca ttcctctcac ccccacatcc ctagcccaag acccaggatc tcctttgctc 2112 ccaaaatccc cattgcccca agggataaag tttgagtccc acaaaaggat aacttagccc 2172 ctagggtcac agagccatgg gtggccgctg tccattccct ccccggtgac ttggattggg 2232 gcggtgcggg gggaactccc gggggcggtg ggcttacagg gagggcggca ggagccagga 2292 cgagcagatg cctgatttgc ccccatctgt accgcag a aga gaa aac cag gtc 2345 g Arg Glu Asn Gln Val 140 tta agc gtg aga atc gcg gac aag aag tac tac ccc agc tcc cag gac 2393 Leu Ser Val Arg Ile Ala Asp Lys Lys Tyr Tyr Pro Ser Ser Gln Asp 145 150 155 tcc agc tcc gct gcg gcg ccc cag ctg ctg att gtg ctg ctg ggc ctc 2441 Ser Ser Ser Aln Ara Ala Pro Gln Leu Leu Ile Val Leu Leu Gly Leu 160 165 170 175 agc gct ctg ctg cag 2456 Ser Ala Leu Leu Gln 180

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ＨＭ１．２４抗原タンパク質をコード
するｃＤＮＡの塩基配列及び対応するアミノ酸配列を示
す図である。下線部はＮ型糖鎖結合モチーフを示す。

【図２】図２は、ＨＭ１．２４抗原タンパク質をコード
するｃＤＮＡの塩基配列及び対応するアミノ酸配列を示
す図である。

【図３】図３は、Ｐａｎｎｉｎｇ法を用いて単離したク
ローンＰ３．１９及び免疫スクリーニング法により単離
された５つのクローン（ＩＳ１〜ＩＳ５）の模式図であ
る。

【図４】図４は、抗ＨＭ１．２４抗体（Ａ；ＣＨＯ／Ｎ
ＥＯ，Ｂ；ＣＨＯ／ＨＭ）を用いたフローサイトメトリ
ー解析の結果を示す図である。抗ＨＭ１．２４抗体のヒ
ストグラムは実線で、アイソタイプの一致したコントロ
ール抗体（ＵＰＣ１０）のヒストグラムは波線で示す。
なお、横軸は蛍光強を、縦軸は細胞数を示す。

【図５】図５は、各種細胞株およびＨＭ１．２４発現Ｃ
ＨＯ細胞におけるＨＭ１．２４抗原の発現を抗ＨＭ１．
２４抗体を用いた免疫沈降・ウエスタンブロッティング
法により検出した結果を示す図面代用写真である。抗Ｈ
Ｍ１．２４抗体結合セファロース４Ｂ（レーン１〜６）
または非結合セファロース４Ｂ（レーン７及び８）を用
いて免疫沈降を行った後、抗ＨＭ１．２４抗体を用いて
ウエスタン・ブロッティングを行い、ＨＭ１．２４抗原
の検出を行った（右側に表示）。（^* ；抗ＨＭ１．２４
抗体Ｈ鎖）

【図６】図６は、ＨＭ１．２４抗原タンパク質遺伝子の
プロモーター領域を含む５′−非翻訳領域の制限酵素地
図を示す図である。

【図７】図７は、ＨＭ１．２４抗原タンパク質遺伝子の
プロモーター領域を含む５′−非翻訳領域の塩基配列を
示す図である。各種転写因子結合モチーフを下線で示
す。

【図８】図８は、ＨＭ１．２４抗原タンパク質遺伝子の
プロモーター領域を含む５′−非翻訳領域の塩基配列を
示す図である。各種転写因子結合モチーフを下線で示
し、ＴＡＴＡ様配列を囲み線で示し、転写開始点を矢印
で示し、そしてタンパク質のＮ−末端の７個のアミノ酸
をコードする領域をアミノ酸の１文字標記により示す。

【図９】図９のＡは、ＨＭ１．２４抗原タンパク質をコ
ードするゲノムに対応するプライマーの位置を示し、Ｂ
は各プライマーの塩基配列を示す。

【図１０】図１０は、ＨＭ１．２４抗原タンパク質をコ
ードするゲノムＤＮＡの制限酵素地図、及び対応するエ
クソン及びイントロンの位置を示す図である。

【図１１】図１１は、ＨＭ１．２４抗原タンパク質をコ
ードするゲノムＤＮＡの塩基配列及び対応するアミノ酸
配列（上流側）を示す図である。矢印は転写開始点を示
し、そして下線はＮ型糖鎖結合モチーフを示す。

【図１２】図１２は、ＨＭ１．２４抗原タンパク質をコ
ードするゲノムＤＮＡ塩基配列及び対応するアミノ酸配
列（下流側）を示す図である。２重下線はｐｏｌｙＡ付
加シグナルを示す。

【図１３】図１３は、ヒトＨＭ１．２４抗原タンパク質
のスプライシングバリアントの塩基配列及び対応するア
ミノ酸配列を示す図である。下線部はヒトＨＭ１．２４
抗原タンパク質とアミノ酸配列が異なる部分を示す。

【図１４】図１４は、ＨＭ１．２４抗原タンパク質のゲ
ノムＤＮＡの塩基配列を示す図である。１７８位のａ→
ｇ、２６２位のｇ→ａ、３２３位のｔ→ｃ、３６０位付
近の９個のａの内の１個の欠失を有するゲノムも存在し
た。＊は転写開始部位を示す。また、９３位〜１１１位
の１９bpがタンデムに反復するゲノムも存在した。→は
センスプライマーの位置を示す。

【図１５】図１５は、ＨＭ１．２４抗原タンパク質のゲ
ノムＤＮＡの塩基配列及び対応するアミノ酸配列を示
す。５５１位〜５５８位の８塩基対が欠失したゲノムも
存在した。←はアンチセンスプライマーの位置を示す。

【図１６】図１６は、ＨＭ１．２４抗原タンパク質のゲ
ノムＤＮＡ（イントロン部位）の塩基配列を示す図であ
る。→はセンスプライマーの位置を示す。

【図１７】図１７は、ＨＭ１．２４抗原タンパク質のゲ
ノムＤＮＡの塩基配列及び対応するアミノ酸配列を示
す。→はセンスプライマーを示し、←はアンチセンスプ
ライマーを示す。

【図１８】図１８は、ＨＭ１．２４抗原タンパク質のゲ
ノムＤＮＡの塩基配列及び対応するアミノ酸配列を示
す。２３１５位付近の５個のｃの内３個が欠失したゲノ
ムも存在した。←はアンチセンスプライマーの位置を示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (72)発明者 小石原 保夫 静岡県御殿場市駒門１丁目135番地 中外 製薬株式会社内 (72)発明者 小阪 昌明 徳島県徳島市八万町千鳥11−10

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号：４に示す５′−非コード領域
   の塩基配列を有するプロモーター配列ＤＮＡ、又は動物
   細胞においてプロモーター活性を有する該配列のＤＮＡ
   断片。
2. 【請求項２】 請求項１に記載のＤＮＡ又はその断片
   と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且
   つ動物細胞においてプロモーター活性を有するＤＮＡ。
3. 【請求項３】 前記プロモーター活性を有するＤＮＡが
   動物細胞由来である、請求項２に記載のプロモーター活
   性を有するＤＮＡ。
4. 【請求項４】 前記動物細胞が哺乳動物細胞である、請
   求項３に記載のプロモーター活性を有するＤＮＡ。
5. 【請求項５】 配列番号：４に示す５′−非コード領域
   の塩基配列において、１〜複数個の塩基の欠失、付加及
   び／又は他の塩基による置換により修飾されており、且
   つ動物細胞においてプロモーター活性を有するＤＮＡ。
6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか１項に記載のプ
   ロモーター活性を有するＤＮＡと有用な遺伝子とを作用
   可能に連結してなる組換えＤＮＡ。
7. 【請求項７】 前記有用な遺伝子が、有用タンパク質を
   コードする核酸、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲ
   ＮＡ、デコイをコードする核酸、及びリボザイムから成
   る群から選択される核酸である、請求項６に記載の組換
   えＤＮＡ。
8. 【請求項８】 請求項６又は７に記載の組換えＤＮＡを
   含んで成るベクター。
9. 【請求項９】 ベクターがプラスミドベクター又はウイ
   ルスベクターである、請求項８に記載のベクター。
10. 【請求項１０】 請求項６又は７に記載の組換えＤＮＡ
    が導入された動物細胞。
11. 【請求項１１】 請求項８又は９に記載のベクターによ
    り形質転換された動物細胞。
12. 【請求項１２】 請求項１０又は１１に記載の動物細胞
    を有する動物。
13. 【請求項１３】 請求項６又は７に記載の組換えＤＮＡ
    を導入した動物細胞を培養することを特徴とする、有用
    遺伝子の発現方法。
14. 【請求項１４】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の
    ＤＮＡに作用可能に連結された有用タンパク質をコード
    する核酸を含んで成る発現ベクターにより形質転換され
    た動物細胞を培養することを特徴とする、有用蛋白質の
    製造方法。