JP3420032B2 - 発ガン抑制遺伝子 - Google Patents
発ガン抑制遺伝子Info
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Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、発ガン抑制遺伝子
に関する。
に関する。
【0002】
【従来の技術】インプリンティング遺伝子とは、父方又
は母方のいずれか一方由来のゲノムのみから発現する遺
伝子である。父親由来のゲノムからのみ発現するインプ
リンティング遺伝子Peg (Paternally expressed genes)
としては、これまで5つの遺伝子がクローニングされて
おり、その他にも、本発明者らにより8つのPeg 遺伝子
(Peg1-8 )がクローニングされている。
は母方のいずれか一方由来のゲノムのみから発現する遺
伝子である。父親由来のゲノムからのみ発現するインプ
リンティング遺伝子Peg (Paternally expressed genes)
としては、これまで5つの遺伝子がクローニングされて
おり、その他にも、本発明者らにより8つのPeg 遺伝子
(Peg1-8 )がクローニングされている。
【0003】このうち、Peg3遺伝子は、分子量が 200 k
D の巨大な DNA結合タンパク質をコードしている(Kuro
iwa, Y. et al., Nature Genetics 12,186-190, 199
6)。Peg3遺伝子によってコードされるタンパク質は、
亜鉛フィンガーモチーフ(zinc finger motif) と呼ばれ
る DNAとの結合に必須な配列を11箇所有するが、モチー
フの並び方、及びモチーフを構成するアミノ酸配列は従
来のDNA結合タンパク質には見られない特徴的なもので
ある。Peg3遺伝子は、マウスにおいて新生児致死に関係
するインプリンティング領域である7番染色体の近位部
に位置するが (Searle, A.G. and Beechey, C.V. Genet
ic Research. 56, 237-244 1990, Kuroiwa,Y. et al.,
Nature Genetics 12,186-190, 1996)、Peg3遺伝子自身
がこの致死性に関係しているか否かについては明らかで
ない。
D の巨大な DNA結合タンパク質をコードしている(Kuro
iwa, Y. et al., Nature Genetics 12,186-190, 199
6)。Peg3遺伝子によってコードされるタンパク質は、
亜鉛フィンガーモチーフ(zinc finger motif) と呼ばれ
る DNAとの結合に必須な配列を11箇所有するが、モチー
フの並び方、及びモチーフを構成するアミノ酸配列は従
来のDNA結合タンパク質には見られない特徴的なもので
ある。Peg3遺伝子は、マウスにおいて新生児致死に関係
するインプリンティング領域である7番染色体の近位部
に位置するが (Searle, A.G. and Beechey, C.V. Genet
ic Research. 56, 237-244 1990, Kuroiwa,Y. et al.,
Nature Genetics 12,186-190, 1996)、Peg3遺伝子自身
がこの致死性に関係しているか否かについては明らかで
ない。
【0004】一方、インプリンティング遺伝子はヒトに
存在することも知られており、マウスのPeg3遺伝子に対
応するヒトPEG3遺伝子は、ヒト染色体 19q13.3-4に位置
することが明らかにされた(Kim, J. et al. Genome Re
search 7, 532-540, 1997)。この染色体領域は片親性
由来のゲノムの喪失(Loss of Heterozigosity;LOH)
により、脳腫瘍であるグリオーマを発症することが知ら
れている (Louis, D.N. and Gusella, J.F. Trends in
Genetics 11, 412-415 1995)。
存在することも知られており、マウスのPeg3遺伝子に対
応するヒトPEG3遺伝子は、ヒト染色体 19q13.3-4に位置
することが明らかにされた(Kim, J. et al. Genome Re
search 7, 532-540, 1997)。この染色体領域は片親性
由来のゲノムの喪失(Loss of Heterozigosity;LOH)
により、脳腫瘍であるグリオーマを発症することが知ら
れている (Louis, D.N. and Gusella, J.F. Trends in
Genetics 11, 412-415 1995)。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】本発明は発ガン抑制遺
伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該組換えベクタ
ーによって形質転換された形質転換体を提供することを
目的とする。
伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該組換えベクタ
ーによって形質転換された形質転換体を提供することを
目的とする。
【0006】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題に
基づいて鋭意研究を行った結果、マウスの発生初期胚よ
りサブトラクションハイブリダイゼーションを行うこと
により分離されたマウスPeg3遺伝子をプローブとし、ヒ
ト胎児腎臓および成体脳の cDNA ライブラリーをスクリ
ーニングすることにより目的の遺伝子をクローニングす
ることに成功し、本発明を完成するに至った。すなわ
ち、本発明は、配列番号2で表されるアミノ酸配列又は
該アミノ酸配列において少なくとも1個のアミノ酸が欠
失、置換若しくは付加された配列を含み、発ガン抑制活
性をもたらすタンパク質である。
基づいて鋭意研究を行った結果、マウスの発生初期胚よ
りサブトラクションハイブリダイゼーションを行うこと
により分離されたマウスPeg3遺伝子をプローブとし、ヒ
ト胎児腎臓および成体脳の cDNA ライブラリーをスクリ
ーニングすることにより目的の遺伝子をクローニングす
ることに成功し、本発明を完成するに至った。すなわ
ち、本発明は、配列番号2で表されるアミノ酸配列又は
該アミノ酸配列において少なくとも1個のアミノ酸が欠
失、置換若しくは付加された配列を含み、発ガン抑制活
性をもたらすタンパク質である。
【0007】さらに、本発明は、配列番号2で表される
アミノ酸配列又は該アミノ酸配列において少なくとも1
個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含
み、発ガン抑制活性をもたらすタンパク質をコードする
DNAである。該DNAとしては、例えば配列番号1で
表されるものが挙げられる。さらに、本発明は、前記D
NAを含む組換えベクターである。さらに、本発明は、
前記組換えベクターによって形質転換された形質転換体
である。以下、本発明を詳細に説明する。
アミノ酸配列又は該アミノ酸配列において少なくとも1
個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含
み、発ガン抑制活性をもたらすタンパク質をコードする
DNAである。該DNAとしては、例えば配列番号1で
表されるものが挙げられる。さらに、本発明は、前記D
NAを含む組換えベクターである。さらに、本発明は、
前記組換えベクターによって形質転換された形質転換体
である。以下、本発明を詳細に説明する。
【0008】
【発明の実施の形態】ヒトPEG3遺伝子は脳で多く発現し
ているが、グリオーマを発症した脳のサンプルでは発現
が全く見られないか、非常に低下している。また、グリ
オーマ由来の細胞株にヒトPEG3遺伝子を導入することに
より、その細胞株の発ガン性を抑制することができる。
この結果、ヒトPEG3遺伝子のコードしているPEG3タンパ
ク質が発ガン抑制効果を有することが確かめられた。
ているが、グリオーマを発症した脳のサンプルでは発現
が全く見られないか、非常に低下している。また、グリ
オーマ由来の細胞株にヒトPEG3遺伝子を導入することに
より、その細胞株の発ガン性を抑制することができる。
この結果、ヒトPEG3遺伝子のコードしているPEG3タンパ
ク質が発ガン抑制効果を有することが確かめられた。
【0009】したがって、本発明の遺伝子は、根本的な
治療方法がなく、遺伝子治療の必要とされる脳腫瘍(グ
リオーマ)の原因遺伝子の一つであることから、ヒト脳
腫瘍(グリオーマ)の遺伝子治療、診断薬として利用し
得る。また、例えばニューロブラストーマや肺ガン等、
通常であれば高い発現を示している組織が、この遺伝子
の発現低下が原因でガンになった場合における他種の癌
の遺伝子治療、診断薬として利用し得る。さらに、本発
明のタンパク質はモノクローナル抗体作製のための材料
として利用し得る。
治療方法がなく、遺伝子治療の必要とされる脳腫瘍(グ
リオーマ)の原因遺伝子の一つであることから、ヒト脳
腫瘍(グリオーマ)の遺伝子治療、診断薬として利用し
得る。また、例えばニューロブラストーマや肺ガン等、
通常であれば高い発現を示している組織が、この遺伝子
の発現低下が原因でガンになった場合における他種の癌
の遺伝子治療、診断薬として利用し得る。さらに、本発
明のタンパク質はモノクローナル抗体作製のための材料
として利用し得る。
【0010】1.ヒトPEG3遺伝子のクローニング
本発明の遺伝子は、ヒト第19番染色体上に存在するイン
プリンティング遺伝子PEG3であり、サブトラクションハ
イブリダイゼーションを行うことによりクローニングさ
れたマウスPeg3遺伝子をプローブとし、ヒト胎児腎臓又
は成体脳由来のcDNA ライブラリーをスクリーニングす
ることによりクローニングすることができる。
プリンティング遺伝子PEG3であり、サブトラクションハ
イブリダイゼーションを行うことによりクローニングさ
れたマウスPeg3遺伝子をプローブとし、ヒト胎児腎臓又
は成体脳由来のcDNA ライブラリーをスクリーニングす
ることによりクローニングすることができる。
【0011】サブトラクションハイブリダイゼーション
とは、極微量の生物材料間で発現に差のある遺伝子を得
る(濃縮する)ことを可能にする方法である。すなわ
ち、極微量の生物材料(例えば母親由来のゲノムのみを
持つ雌性単為発生胚)から抽出した mRNA より cDNA 合
成を行い、この cDNA の両端にPCR用のリンカーを結合
させ、増幅してサブトラクションに必要な量の cDNA を
作製する(試料1とする)。次に前記生物材料とは別の
生物材料(例えば父親、母親由来の両方のゲノムを持つ
正常受精胚)に前記リンカーとは別のリンカーを連結
し、増幅してサブトラクションに必要な量の cDNA を作
製する(試料2とする)。得られた2種類のcDNA (試
料1及び2)を混合した後、高温での熱変性、低温での
再結合を行うことにより、両 cDNA に共通に含まれる遺
伝子はハイブリッドを形成する。上記リンカーのいずれ
か一方にビオチン等を結合させたものを用いることによ
り、アビジンを結合させた磁気ビーズでハイブリッドを
形成した cDNAを除去する。そして、最終的に一本鎖の
まま残った cDNAをプローブとして cDNA ライブラリー
をスクリーニングすることによりマウスPeg3遺伝子を得
ることができる。
とは、極微量の生物材料間で発現に差のある遺伝子を得
る(濃縮する)ことを可能にする方法である。すなわ
ち、極微量の生物材料(例えば母親由来のゲノムのみを
持つ雌性単為発生胚)から抽出した mRNA より cDNA 合
成を行い、この cDNA の両端にPCR用のリンカーを結合
させ、増幅してサブトラクションに必要な量の cDNA を
作製する(試料1とする)。次に前記生物材料とは別の
生物材料(例えば父親、母親由来の両方のゲノムを持つ
正常受精胚)に前記リンカーとは別のリンカーを連結
し、増幅してサブトラクションに必要な量の cDNA を作
製する(試料2とする)。得られた2種類のcDNA (試
料1及び2)を混合した後、高温での熱変性、低温での
再結合を行うことにより、両 cDNA に共通に含まれる遺
伝子はハイブリッドを形成する。上記リンカーのいずれ
か一方にビオチン等を結合させたものを用いることによ
り、アビジンを結合させた磁気ビーズでハイブリッドを
形成した cDNAを除去する。そして、最終的に一本鎖の
まま残った cDNAをプローブとして cDNA ライブラリー
をスクリーニングすることによりマウスPeg3遺伝子を得
ることができる。
【0012】このマウスPeg3遺伝子をプローブとして、
ヒト胎児腎臓又は脳由来の cDNA ライブラリーをスクリ
ーニングすることにより目的の遺伝子を得ることができ
る。具体的には、以下のようにして本発明の遺伝子をク
ローニングする。まず、マウスにおいて、発生工学的手
法により未受精卵を単為発生させた胚を仮親の子宮に移
植して発生させた10日胚胎児(雌性単為発生胚)、及び
正常に受精させた10日胚胎児(正常受精胚)を調製する
(図1(1) )。次に、得られた胚を用いてサブトラクシ
ョンハイブリダイゼーションを行う。
ヒト胎児腎臓又は脳由来の cDNA ライブラリーをスクリ
ーニングすることにより目的の遺伝子を得ることができ
る。具体的には、以下のようにして本発明の遺伝子をク
ローニングする。まず、マウスにおいて、発生工学的手
法により未受精卵を単為発生させた胚を仮親の子宮に移
植して発生させた10日胚胎児(雌性単為発生胚)、及び
正常に受精させた10日胚胎児(正常受精胚)を調製する
(図1(1) )。次に、得られた胚を用いてサブトラクシ
ョンハイブリダイゼーションを行う。
【0013】すなわち、雌性単為発生胚は父親からの精
子による受精なしに、人工的に発生を開始させているた
め、父親由来のゲノムを持っていない。従って、この胚
には父親由来のゲノムからのみ発現するインプリンティ
ング遺伝子Peg(Paternally expressed genes)が発現し
ていない(図1(2) )。一方、正常受精胚では、これら
の遺伝子群は発現している。そこで、Peg遺伝子を発現
したものと発現しないものとの間でサブトラクションハ
イブリダイゼーションを行い、マウスPeg3遺伝子をクロ
ーニングする。
子による受精なしに、人工的に発生を開始させているた
め、父親由来のゲノムを持っていない。従って、この胚
には父親由来のゲノムからのみ発現するインプリンティ
ング遺伝子Peg(Paternally expressed genes)が発現し
ていない(図1(2) )。一方、正常受精胚では、これら
の遺伝子群は発現している。そこで、Peg遺伝子を発現
したものと発現しないものとの間でサブトラクションハ
イブリダイゼーションを行い、マウスPeg3遺伝子をクロ
ーニングする。
【0014】上記生物材料について、市販の mRNA精製
キット(Invitrogen 社製、Fast Track)を用い、マニュ
アルに記載された量を、実際の生物材料の量に応じて加
減することにより mRNAを調製する。次に、市販の cDNA
合成キット(Stratagene 社、ラムダZAPII cDNA合成キ
ット) を用い、プライマーとして市販のオリゴdTプライ
マー(Boehringer Mannheim社)を用いて cDNA 合成を行
う。 cDNA に連結させるための PCRリンカーとしては、
化学合成したオリゴヌクレオチド 20merとそれに相補的
な 17merを用いる。図1において、雌性単為発生胚につ
いてはP-リンカー、正常受精胚についてはF-リンカーと
呼ぶ。PCR のプライマーには、それぞれリンカーに用い
た 20merを用いる。なお、雌性単為発生胚の増幅に用い
るプライマーの5’末端には、後のサブトラクションに
用いるためビオチンを結合させておく(図1(3) )。こ
れらのリンカー及びプライマーは化学合成により得るこ
とができる。このようにして得られた cDNA を鋳型とし
て所定の条件下で PCRを行う。PCR 反応は、Stratagene
社のPfu DNA ポリメラーゼを用い、添付の反応溶液中で
伸長反応時間を伸ばした条件下で行う。こうして雌性単
為発生胚から作製したcDNA を試料1、正常受精胚から
作製した cDNA を試料2とする。
キット(Invitrogen 社製、Fast Track)を用い、マニュ
アルに記載された量を、実際の生物材料の量に応じて加
減することにより mRNAを調製する。次に、市販の cDNA
合成キット(Stratagene 社、ラムダZAPII cDNA合成キ
ット) を用い、プライマーとして市販のオリゴdTプライ
マー(Boehringer Mannheim社)を用いて cDNA 合成を行
う。 cDNA に連結させるための PCRリンカーとしては、
化学合成したオリゴヌクレオチド 20merとそれに相補的
な 17merを用いる。図1において、雌性単為発生胚につ
いてはP-リンカー、正常受精胚についてはF-リンカーと
呼ぶ。PCR のプライマーには、それぞれリンカーに用い
た 20merを用いる。なお、雌性単為発生胚の増幅に用い
るプライマーの5’末端には、後のサブトラクションに
用いるためビオチンを結合させておく(図1(3) )。こ
れらのリンカー及びプライマーは化学合成により得るこ
とができる。このようにして得られた cDNA を鋳型とし
て所定の条件下で PCRを行う。PCR 反応は、Stratagene
社のPfu DNA ポリメラーゼを用い、添付の反応溶液中で
伸長反応時間を伸ばした条件下で行う。こうして雌性単
為発生胚から作製したcDNA を試料1、正常受精胚から
作製した cDNA を試料2とする。
【0015】PCR 産物である試料1と試料2を混合し、
高温による変性、低温による再結合を行い、DNA のハイ
ブリッドを形成させる(図1(4) )。好ましくは、変性
は100℃で15分、再結合は68℃で20時間反応させる。ハ
イブリッドを形成した DNAは、ビオチンと高親和性のア
ビジンを結合した磁気ビーズ (Dynal 社、Dynabeads- M
280) に吸着させることにより除去される(図1(5)
)。次に、F-リンカーを用いたPCR を行った後、好ま
しくは2次及び3次サブトラクションを行うことにより
マウスPeg3遺伝子を含む一本鎖 DNAを得ることができる
(図1(6) )。ハイブリッド鎖を除くためにリンカーに
結合させる物質は、上記ビオチンのほか、抗原と抗体の
関係のように、ある物質とその結合相手を有するもので
あれば特に限定されるものではない。
高温による変性、低温による再結合を行い、DNA のハイ
ブリッドを形成させる(図1(4) )。好ましくは、変性
は100℃で15分、再結合は68℃で20時間反応させる。ハ
イブリッドを形成した DNAは、ビオチンと高親和性のア
ビジンを結合した磁気ビーズ (Dynal 社、Dynabeads- M
280) に吸着させることにより除去される(図1(5)
)。次に、F-リンカーを用いたPCR を行った後、好ま
しくは2次及び3次サブトラクションを行うことにより
マウスPeg3遺伝子を含む一本鎖 DNAを得ることができる
(図1(6) )。ハイブリッド鎖を除くためにリンカーに
結合させる物質は、上記ビオチンのほか、抗原と抗体の
関係のように、ある物質とその結合相手を有するもので
あれば特に限定されるものではない。
【0016】こうして得られた一本鎖 DNAをプローブと
してマウスの cDNA ライブラリーをスクリーニングする
ことによってマウスPeg3遺伝子のクローンが得られる。
そして、このマウスPeg3遺伝子のクローンをプローブと
してヒト胎児腎臓又は成体脳の cDNA ライブラリー遺伝
子(例えばClonetech社)をスクリーニングすることに
よって、目的のヒトPEG3遺伝子がクローニングされる。
してマウスの cDNA ライブラリーをスクリーニングする
ことによってマウスPeg3遺伝子のクローンが得られる。
そして、このマウスPeg3遺伝子のクローンをプローブと
してヒト胎児腎臓又は成体脳の cDNA ライブラリー遺伝
子(例えばClonetech社)をスクリーニングすることに
よって、目的のヒトPEG3遺伝子がクローニングされる。
【0017】このようにして得られたPEG3遺伝子は、公
知手法に従ってアガロースゲル電気泳動を行い、目的と
するDNA断片を切り出した後、BIO/101社のGene Cleanを
用いてDNAの回収を行う。一方、上記DNA断片を保持する
ためのベクターについては、公知のプラスミドベクター
(例えばStratagene社のpBluescriptII-SK(-)、pUC18
等)を用いることができる。なお、プラスミドベクター
は、上記DNAを消化した同一の制限酵素で消化してお
く。
知手法に従ってアガロースゲル電気泳動を行い、目的と
するDNA断片を切り出した後、BIO/101社のGene Cleanを
用いてDNAの回収を行う。一方、上記DNA断片を保持する
ためのベクターについては、公知のプラスミドベクター
(例えばStratagene社のpBluescriptII-SK(-)、pUC18
等)を用いることができる。なお、プラスミドベクター
は、上記DNAを消化した同一の制限酵素で消化してお
く。
【0018】PEG3遺伝子とプラスミドベクターとを、公
知のライゲーションキット(宝酒造株式会社製)を用い
て連結させ、組換えベクターを得る。PEG3遺伝子の塩基
配列は、公知方法(例えばジデオキシ法)により決定す
るが、Pharmacia社の自動塩基配列決定装置等を用いて
もよい。
知のライゲーションキット(宝酒造株式会社製)を用い
て連結させ、組換えベクターを得る。PEG3遺伝子の塩基
配列は、公知方法(例えばジデオキシ法)により決定す
るが、Pharmacia社の自動塩基配列決定装置等を用いて
もよい。
【0019】このようにして決定されるヒトPEG3遺伝子
の塩基配列を例えば配列番号1に、また、PEG3遺伝子に
よりコードされる PEG3 タンパク質のアミノ酸配列を配
列番号2に示すが、本質的に本発明の遺伝子が PEG3 タ
ンパク質を発現し発ガン抑制活性を有する限り、当該タ
ンパク質に含まれるアミノ酸配列又は当該遺伝子の塩基
配列の少なくとも1個(好ましくは1個又は数個)に欠
失、置換、付加等の変異が生じてもよいことを意味す
る。
の塩基配列を例えば配列番号1に、また、PEG3遺伝子に
よりコードされる PEG3 タンパク質のアミノ酸配列を配
列番号2に示すが、本質的に本発明の遺伝子が PEG3 タ
ンパク質を発現し発ガン抑制活性を有する限り、当該タ
ンパク質に含まれるアミノ酸配列又は当該遺伝子の塩基
配列の少なくとも1個(好ましくは1個又は数個)に欠
失、置換、付加等の変異が生じてもよいことを意味す
る。
【0020】従って、例えば配列番号2で表されるアミ
ノ酸配列に含まれる第1番目のメチオニン(Met)が欠失
しているものなども、このアミノ酸配列の変化によるタ
ンパク質に含まれる。また、本発明のタンパク質に含ま
れるアミノ酸をコードする塩基配列のほか、縮重コドン
においてのみ異なる同一のポリペプチドをコードする縮
重異性体も本発明の遺伝子に含まれる。
ノ酸配列に含まれる第1番目のメチオニン(Met)が欠失
しているものなども、このアミノ酸配列の変化によるタ
ンパク質に含まれる。また、本発明のタンパク質に含ま
れるアミノ酸をコードする塩基配列のほか、縮重コドン
においてのみ異なる同一のポリペプチドをコードする縮
重異性体も本発明の遺伝子に含まれる。
【0021】2.形質転換体の作製
本発明の形質転換体は、本発明の組み換えベクターを、
該組み換えベクターを作製する際に用いた発現ベクター
に適合する宿主中に導入することにより得られる。宿主
としては、目的とする遺伝子を発現できるものであれば
特に限定されず、例えば、大腸菌(Escherichia coli)
、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis) 等の細
菌、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerev
isiae)等の酵母、COS細胞、CHO細胞等の動物細胞
などが挙げられる。
該組み換えベクターを作製する際に用いた発現ベクター
に適合する宿主中に導入することにより得られる。宿主
としては、目的とする遺伝子を発現できるものであれば
特に限定されず、例えば、大腸菌(Escherichia coli)
、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis) 等の細
菌、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerev
isiae)等の酵母、COS細胞、CHO細胞等の動物細胞
などが挙げられる。
【0022】大腸菌等の細菌を宿主として用いる場合
は、本発明の組換え体DNAが該宿主中で自立複製可能
であると同時に、プロモーター、本発明のDNA、転写
終結配列を含む構成であることが好ましい。発現ベクタ
ーとしては、例えばStratagene社のpBluescriptII-SK
(-) 、pUC18 等が挙げられる。プロモーターとしては、
大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用
いてもよい。例えば、trpプロモーター、lac プロモー
ター、PL プロモーター、PR プロモーターなどの大腸
菌やファージ等に由来するプロモーターが用いられる。
細菌への組み換え体DNAの導入方法としては、例えば
塩化カルシウム法やエレクトロポレーション法等が挙げ
られる。
は、本発明の組換え体DNAが該宿主中で自立複製可能
であると同時に、プロモーター、本発明のDNA、転写
終結配列を含む構成であることが好ましい。発現ベクタ
ーとしては、例えばStratagene社のpBluescriptII-SK
(-) 、pUC18 等が挙げられる。プロモーターとしては、
大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用
いてもよい。例えば、trpプロモーター、lac プロモー
ター、PL プロモーター、PR プロモーターなどの大腸
菌やファージ等に由来するプロモーターが用いられる。
細菌への組み換え体DNAの導入方法としては、例えば
塩化カルシウム法やエレクトロポレーション法等が挙げ
られる。
【0023】酵母を宿主として用いる場合は、発現ベク
ターとして、例えばYEp13 、YCp50等が挙げられる。プ
ロモーターとしては、例えばgal 1 プロモーター、gal
10プロモーター等が挙げられる。酵母への組換えベクタ
ーの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション
法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられ
る。
ターとして、例えばYEp13 、YCp50等が挙げられる。プ
ロモーターとしては、例えばgal 1 プロモーター、gal
10プロモーター等が挙げられる。酵母への組換えベクタ
ーの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション
法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられ
る。
【0024】動物細胞を宿主として用いる場合は、発現
ベクターとして例えばpCEP4(Stratagene社) 、pMAMneo
(Clonetech 社) 等が挙げられる。PEG3発現ベクタープ
ラスミドを、lipofectin(LIFE TECHNOLOGY社) を用いた
リポソーム法にてヒトグリオーマ細胞株(例えばU87)に
導入する。プラスミドの導入は、LIFE TECHNOLOGY 社の
マニュアルに従えばよい。その後、ハイグロマイシンB
を含む選択培地にて1カ月間培養を行い、薬剤耐性を示
す細胞のコロニーを得る。出現したコロニーを単離し、
PEG3遺伝子発現細胞株の候補とする。これらの細胞株に
ついて、ノーザンハイブリダイゼーション法によるPEG3
遺伝子の発現の確認、通常の培養条件での増殖速度の測
定、軟寒天上でのコロニー形成能の検定及びヌードマウ
スにおける造腫瘍性の検定を行う。
ベクターとして例えばpCEP4(Stratagene社) 、pMAMneo
(Clonetech 社) 等が挙げられる。PEG3発現ベクタープ
ラスミドを、lipofectin(LIFE TECHNOLOGY社) を用いた
リポソーム法にてヒトグリオーマ細胞株(例えばU87)に
導入する。プラスミドの導入は、LIFE TECHNOLOGY 社の
マニュアルに従えばよい。その後、ハイグロマイシンB
を含む選択培地にて1カ月間培養を行い、薬剤耐性を示
す細胞のコロニーを得る。出現したコロニーを単離し、
PEG3遺伝子発現細胞株の候補とする。これらの細胞株に
ついて、ノーザンハイブリダイゼーション法によるPEG3
遺伝子の発現の確認、通常の培養条件での増殖速度の測
定、軟寒天上でのコロニー形成能の検定及びヌードマウ
スにおける造腫瘍性の検定を行う。
【0025】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範
囲が限定されるものではない。 〔実施例1〕ヒトインプリンティング遺伝子,PEG3のク
ローニング ヒトインプリンティング遺伝子PEG3のクローニングはマ
ウスインプリンティング遺伝子Peg3をプローブに用い
て、ヒト胎児腎臓又は脳由来cDNAライブラリー(Clonet
ech社)をスクリーニングすることにより行った。
説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範
囲が限定されるものではない。 〔実施例1〕ヒトインプリンティング遺伝子,PEG3のク
ローニング ヒトインプリンティング遺伝子PEG3のクローニングはマ
ウスインプリンティング遺伝子Peg3をプローブに用い
て、ヒト胎児腎臓又は脳由来cDNAライブラリー(Clonet
ech社)をスクリーニングすることにより行った。
【0026】マウスインプリンティング遺伝子Peg3は以
下の通り調製した。公知のWhitten 培地に15 mM 乳酸カ
ルシウム、10μM 2-メルカプトエタノールを加え(以
後、改変Whitten 培地と呼ぶ)、これに7%となるよう
にエタノールを加えた溶液で、実験用マウス (C57BL/6
x CBA) F1 のメスからホルモンで誘発した未受精卵を4
分間処理して人工的に細胞分裂を開始させた。次に、サ
イトカラシンB (10 mg/ml)(Sigma社)を加えた改変Whit
ten 培地で37℃で24時間培養することにより、細胞のゲ
ノムを2倍体化した後、さらに5日間改変Whitten 培地
中で in vitro 培養し、未受精卵を胞胚期 (blastocys
t) まで発生させた。
下の通り調製した。公知のWhitten 培地に15 mM 乳酸カ
ルシウム、10μM 2-メルカプトエタノールを加え(以
後、改変Whitten 培地と呼ぶ)、これに7%となるよう
にエタノールを加えた溶液で、実験用マウス (C57BL/6
x CBA) F1 のメスからホルモンで誘発した未受精卵を4
分間処理して人工的に細胞分裂を開始させた。次に、サ
イトカラシンB (10 mg/ml)(Sigma社)を加えた改変Whit
ten 培地で37℃で24時間培養することにより、細胞のゲ
ノムを2倍体化した後、さらに5日間改変Whitten 培地
中で in vitro 培養し、未受精卵を胞胚期 (blastocys
t) まで発生させた。
【0027】次に、雌マウス (ICR)を、精管けっさく手
術を施して精子の出ない雄マウスと交配し、偽妊娠状態
になった 3.5日目の雌マウスの子宮に前記胞胚を移植し
た。移植した胚が 9.5日胚になった時点で胚を子宮から
取り出し、液体窒素で凍結保存した。一方、 9.5日の正
常受精胚は、(C57BL/6 x CBA) F1同士の交配によって、
交配の確認された雌マウスの子宮から 9.5日目に取り出
し、同様に液体窒素で凍結保存した。なお、改変Whitte
n 培地 (100 ml中)の組成は以下の通りである。
術を施して精子の出ない雄マウスと交配し、偽妊娠状態
になった 3.5日目の雌マウスの子宮に前記胞胚を移植し
た。移植した胚が 9.5日胚になった時点で胚を子宮から
取り出し、液体窒素で凍結保存した。一方、 9.5日の正
常受精胚は、(C57BL/6 x CBA) F1同士の交配によって、
交配の確認された雌マウスの子宮から 9.5日目に取り出
し、同様に液体窒素で凍結保存した。なお、改変Whitte
n 培地 (100 ml中)の組成は以下の通りである。
【0028】
【0029】これらの胚から mRNA を分離するために I
nvitrogen 社のキット(Fast TrackmRNA isolation kit
)を10分の1の量にして使用した。まず、凍結した胚
(雌性単為発生胚は8個、正常受精胚は12個の胚を使
用)に 500μl の溶解バッファー(キットのもの)を加
え溶解した。この溶液を、21Gの注射針の中を何度か通
すことによりゲノム DNAを切断細分化した。これに 5M
NaClを 31.6 μl 加えて良く混ぜた後、キットに含まれ
るオリゴdTセルロースタブレットの8分の1量を加え m
RNA を結合させた。このオリゴdTセルロースをカラムに
充填し、非特異的に結合した不純物を結合バッファー
(キットのもの) で3回流し出した後、350μl の溶出
バッファー(キットのもの)で mRNA を溶出させる。こ
の溶出液に 52.5μl の 2M 酢酸ナトリウム、 1μl の
グリコーゲン溶液 (20 mg/ml) (Boehringer Mannheim
社)、及び1000μl のエタノールを加えることにより m
RNA を沈殿させ、回収した。
nvitrogen 社のキット(Fast TrackmRNA isolation kit
)を10分の1の量にして使用した。まず、凍結した胚
(雌性単為発生胚は8個、正常受精胚は12個の胚を使
用)に 500μl の溶解バッファー(キットのもの)を加
え溶解した。この溶液を、21Gの注射針の中を何度か通
すことによりゲノム DNAを切断細分化した。これに 5M
NaClを 31.6 μl 加えて良く混ぜた後、キットに含まれ
るオリゴdTセルロースタブレットの8分の1量を加え m
RNA を結合させた。このオリゴdTセルロースをカラムに
充填し、非特異的に結合した不純物を結合バッファー
(キットのもの) で3回流し出した後、350μl の溶出
バッファー(キットのもの)で mRNA を溶出させる。こ
の溶出液に 52.5μl の 2M 酢酸ナトリウム、 1μl の
グリコーゲン溶液 (20 mg/ml) (Boehringer Mannheim
社)、及び1000μl のエタノールを加えることにより m
RNA を沈殿させ、回収した。
【0030】mRNAペレットを0.1% DEPC (diethylpyroca
rbonate) (Sigma 社)処理した蒸留水で溶解したのち、
Stratagene社のラムダZAPII cDNA合成キットのマニュア
ルに従い、 oligo(dT)12-18 (Boehringer Mannheim
社)をプライマーとして、逆転写反応を行った。反応条
件の詳細は以下の通りである。下記の組成の反応溶液を
エッペンドルフチューブで混ぜた後、室温で10分静置し
た。
rbonate) (Sigma 社)処理した蒸留水で溶解したのち、
Stratagene社のラムダZAPII cDNA合成キットのマニュア
ルに従い、 oligo(dT)12-18 (Boehringer Mannheim
社)をプライマーとして、逆転写反応を行った。反応条
件の詳細は以下の通りである。下記の組成の反応溶液を
エッペンドルフチューブで混ぜた後、室温で10分静置し
た。
【0031】
【0032】続いてM-MuLV逆転写酵素 1.0μl を加え、
37℃で1時間反応させた。この反応液に、下記の試薬を
加え16℃で2.5時間反応し、cDNAを合成した。
37℃で1時間反応させた。この反応液に、下記の試薬を
加え16℃で2.5時間反応し、cDNAを合成した。
【0033】
【0034】上記反応液にT4 DNAポリメラーゼ 3.5μl
を加えて、37℃で15分反応し、cDNAの両端を平滑化し
た。0.5 M EDTA 4.0μl を加え反応を止めた後、フェノ
ール・クロロホルム溶液でタンパク質の変性、脱タンパ
ク質を行い、3Mの酢酸ナトリウム 7.0μl 、エタノール
226.0μl及びグリコーゲン(20mg/ml) 1.0 μl を加え
て沈殿させた。これを水に溶解し、cDNA溶液として用い
た。
を加えて、37℃で15分反応し、cDNAの両端を平滑化し
た。0.5 M EDTA 4.0μl を加え反応を止めた後、フェノ
ール・クロロホルム溶液でタンパク質の変性、脱タンパ
ク質を行い、3Mの酢酸ナトリウム 7.0μl 、エタノール
226.0μl及びグリコーゲン(20mg/ml) 1.0 μl を加え
て沈殿させた。これを水に溶解し、cDNA溶液として用い
た。
【0035】一方、化学合成したオリゴマー、すなわち
相補的な塩基配列をもつ 20mer及び17mer からなるリン
カー (P-リンカー及びF-リンカー) を並行して作製し
た。 P-リンカー 20 mer 5'-GATTACTCGAGACTAATATC-3'(配列番号3) 17 mer 5'-GATATTAGTCTCGAGTA-3' (配列番号4) F-リンカー 20 mer 5'-TCGACTCGAGTATAGTTACA-3'(配列番号5) 17 mer 5'-TGTAACTATACTCGAGT-3' (配列番号6) F-リンカー、P-リンカーともに、リンカーに用いる 17
merの 5'末端のリン酸化をするために下記の反応液をを
加えて37℃で1時間反応させた。
相補的な塩基配列をもつ 20mer及び17mer からなるリン
カー (P-リンカー及びF-リンカー) を並行して作製し
た。 P-リンカー 20 mer 5'-GATTACTCGAGACTAATATC-3'(配列番号3) 17 mer 5'-GATATTAGTCTCGAGTA-3' (配列番号4) F-リンカー 20 mer 5'-TCGACTCGAGTATAGTTACA-3'(配列番号5) 17 mer 5'-TGTAACTATACTCGAGT-3' (配列番号6) F-リンカー、P-リンカーともに、リンカーに用いる 17
merの 5'末端のリン酸化をするために下記の反応液をを
加えて37℃で1時間反応させた。
【0036】
【0037】上記反応後、70℃で5分加熱して酵素を失
活させた後、30μl に溶かした 7.95 mg(1.2 nmole) の
リンカーの 20 mer を加え、再び70℃で5分加熱し、1
時間かけて室温まで冷却することにより相補的な2本鎖
を形成させ、リンカーを作製した。上記で作製した cDN
A と 90 pmole のリンカーとを混合し、T4 DNAリガーゼ
でcDNA の両端にリンカーを結合した。結合に用いた反
応液は下記の通りである。
活させた後、30μl に溶かした 7.95 mg(1.2 nmole) の
リンカーの 20 mer を加え、再び70℃で5分加熱し、1
時間かけて室温まで冷却することにより相補的な2本鎖
を形成させ、リンカーを作製した。上記で作製した cDN
A と 90 pmole のリンカーとを混合し、T4 DNAリガーゼ
でcDNA の両端にリンカーを結合した。結合に用いた反
応液は下記の通りである。
【0038】
【0039】上記反応液を最終10μl で16℃で20時間反
応させた。反応後、未反応のリンカーと反応副産物であ
るリンカーダイマーを、ゲルろ過(Clonetech社 クロ
マスピンTE-400)で除去した。PCR反応は、Stratagene
社の Pfu DNAポリメラーゼを用い、それぞれリンカーに
用いたものに含まれる 20merのオリゴヌクレオチドをプ
ライマーとして用い、以下の条件で行い、 cDNA を増幅
した。
応させた。反応後、未反応のリンカーと反応副産物であ
るリンカーダイマーを、ゲルろ過(Clonetech社 クロ
マスピンTE-400)で除去した。PCR反応は、Stratagene
社の Pfu DNAポリメラーゼを用い、それぞれリンカーに
用いたものに含まれる 20merのオリゴヌクレオチドをプ
ライマーとして用い、以下の条件で行い、 cDNA を増幅
した。
【0040】雌性単為発生胚から作製した cDNA を試料
1、正常受精胚からから作製した cDNA を試料2とす
る。なお、雌性単為発生胚の増幅に用いるプライマーの
5’末端には、後のサブトラクションに用いるためビオ
チンを化学結合させたものを用いた。 雌性単為発生胚の cDNAの増幅に用いるプライマー 20 mer: 5'-biotin-GATTACTCGAGACTAATATC-3'(配列番
号3) 正常受精胚の cDNAの増幅に用いるプライマー 20 mer: 5'-TCGACTCGAGTATAGTTACA-3' (配列番号5) PCR 反応液を下記に示す。
1、正常受精胚からから作製した cDNA を試料2とす
る。なお、雌性単為発生胚の増幅に用いるプライマーの
5’末端には、後のサブトラクションに用いるためビオ
チンを化学結合させたものを用いた。 雌性単為発生胚の cDNAの増幅に用いるプライマー 20 mer: 5'-biotin-GATTACTCGAGACTAATATC-3'(配列番
号3) 正常受精胚の cDNAの増幅に用いるプライマー 20 mer: 5'-TCGACTCGAGTATAGTTACA-3' (配列番号5) PCR 反応液を下記に示す。
【0041】
【0042】PCR反応条件は、95℃3分で変性処理を行
った後、95℃で1分、65℃で1分及び72℃で10分のサ
イクル条件で20サイクルかけて増幅した。PCR 産物で
ある試料1(1μg)と試料2(10ng)とを混合し、10μl の
反応液中で100℃で15分の変性処理の後、68℃で20時間
反応させることにより再結合させ、ハイブリッドを形成
させた。ハイブリッドの形成に用いた反応液の組成を以
下に示す。
った後、95℃で1分、65℃で1分及び72℃で10分のサ
イクル条件で20サイクルかけて増幅した。PCR 産物で
ある試料1(1μg)と試料2(10ng)とを混合し、10μl の
反応液中で100℃で15分の変性処理の後、68℃で20時間
反応させることにより再結合させ、ハイブリッドを形成
させた。ハイブリッドの形成に用いた反応液の組成を以
下に示す。
【0043】
【0044】得られた DNAについてエタノール沈殿を行
い回収した後、以下のバッファー20μl に溶解し、
アビジンを結合した磁気ビーズ (Dynal 社、Dynabeads-
M280) 4mgを加え、室温で1時間結合させた。結合に用
いた反応液の組成を以下に示す。
い回収した後、以下のバッファー20μl に溶解し、
アビジンを結合した磁気ビーズ (Dynal 社、Dynabeads-
M280) 4mgを加え、室温で1時間結合させた。結合に用
いた反応液の組成を以下に示す。
【0045】
【0046】結合したハイブリッドは磁石によって除去
し、上清液を回収した。上清液にはPeg遺伝子が濃縮さ
れているが、さらに濃縮をかけるため、一旦回収した D
NAを、F-リンカーの増幅に用いる上記プライマーで PCR
を行い量を増やした後、再度サブトラクションを繰り返
した。
し、上清液を回収した。上清液にはPeg遺伝子が濃縮さ
れているが、さらに濃縮をかけるため、一旦回収した D
NAを、F-リンカーの増幅に用いる上記プライマーで PCR
を行い量を増やした後、再度サブトラクションを繰り返
した。
【0047】最終的に3度のサブトラクションをおこな
って回収した cDNA をサブトラクティッドDNAとして、P
eg遺伝子のスクリーニングに用いた。サブトラクティッ
ドDNA 25 ngを宝酒造のランダムプライマーキットで32
P-dCTPを含んだ溶液で反応し、高比活性のプローブを作
製した。まず、下記の溶液を調製し、100℃で3分間、
熱変性させた後、氷冷した。
って回収した cDNA をサブトラクティッドDNAとして、P
eg遺伝子のスクリーニングに用いた。サブトラクティッ
ドDNA 25 ngを宝酒造のランダムプライマーキットで32
P-dCTPを含んだ溶液で反応し、高比活性のプローブを作
製した。まず、下記の溶液を調製し、100℃で3分間、
熱変性させた後、氷冷した。
【0048】
【0049】次に、上記反応液に下記の反応液を加え、
37℃で15分間反応させた。これを100℃で5分間、熱変
性させ、プローブとして用いた。
37℃で15分間反応させた。これを100℃で5分間、熱変
性させ、プローブとして用いた。
【0050】
【0051】正常受精胚の9.5日胚から、Stratagene社
のラムダZAPII cDNA合成キットのマニュアルに従い作製
した cDNA ライブラリーのラムダファージ約5万個を、
直径15cmのLプレート1枚にまいた。これから形成さ
れたファージプラークをアマシャム社のハイボンドN+の
膜に移し取り、0.5 M NaOH, 1M NaCl で DNAを変性後、
0.5 M Tris Buffer (pH 7.8), 1M NaCl 溶液で中和し
た。これをUV照射(ストラタリンカー; 1200J/cm2)で
クロスリンクした。
のラムダZAPII cDNA合成キットのマニュアルに従い作製
した cDNA ライブラリーのラムダファージ約5万個を、
直径15cmのLプレート1枚にまいた。これから形成さ
れたファージプラークをアマシャム社のハイボンドN+の
膜に移し取り、0.5 M NaOH, 1M NaCl で DNAを変性後、
0.5 M Tris Buffer (pH 7.8), 1M NaCl 溶液で中和し
た。これをUV照射(ストラタリンカー; 1200J/cm2)で
クロスリンクした。
【0052】合計で20万個(プレート4枚分)のラムダ
ファージを移し取った膜を上記のプローブを用いてチャ
ーチ溶液中でハイブリダイズさせ、洗浄液で3回の洗浄
後イメージングプレート(富士写真フィルム)に20時間
感光させ、イメージングアナライザーBAS2000 で検出を
行った。検出されたラムダファージプラークから、常法
通り pBluescriptベクターにクローニングされた DNAと
して回収した。
ファージを移し取った膜を上記のプローブを用いてチャ
ーチ溶液中でハイブリダイズさせ、洗浄液で3回の洗浄
後イメージングプレート(富士写真フィルム)に20時間
感光させ、イメージングアナライザーBAS2000 で検出を
行った。検出されたラムダファージプラークから、常法
通り pBluescriptベクターにクローニングされた DNAと
して回収した。
【0053】
【0054】検出された場所にあるラムダファージプラ
ークはSMバッファーに懸濁しておいた。
ークはSMバッファーに懸濁しておいた。
【0055】
【0056】大腸菌 XL1-Blue (Stratagene社)をNZY培
地で培養し、OD660 が 1.0になったところで、大腸菌を
集菌し、10 mM 硫酸マグネシウム溶液に懸濁した。これ
に上記のラムダファージ(1x105 pfu)と ExAssist ヘ
ルパーファージ(Stratagene社)を 1×106pfu加え、37
℃で15分間培養した。これに3mlのL培地を加え、37℃
で3時間培養した。この培養上清からファージミドを回
収した。
地で培養し、OD660 が 1.0になったところで、大腸菌を
集菌し、10 mM 硫酸マグネシウム溶液に懸濁した。これ
に上記のラムダファージ(1x105 pfu)と ExAssist ヘ
ルパーファージ(Stratagene社)を 1×106pfu加え、37
℃で15分間培養した。これに3mlのL培地を加え、37℃
で3時間培養した。この培養上清からファージミドを回
収した。
【0057】一方、大腸菌 SOLR(Stratagene社)がOD
660 が 1.0になったところで、大腸菌を集菌し、10 mM
硫酸マグネシウム溶液に懸濁しておいた。上記ファージ
ミド溶液を、大腸菌 SOLRの懸濁液に加え、37℃で15分
間培養した。これをL培地で作製したプレート上で大腸
菌コロニーを形成させ、これから目的の遺伝子部分を含
んだ pBluescript SK(-)ベクターの形で回収した。
660 が 1.0になったところで、大腸菌を集菌し、10 mM
硫酸マグネシウム溶液に懸濁しておいた。上記ファージ
ミド溶液を、大腸菌 SOLRの懸濁液に加え、37℃で15分
間培養した。これをL培地で作製したプレート上で大腸
菌コロニーを形成させ、これから目的の遺伝子部分を含
んだ pBluescript SK(-)ベクターの形で回収した。
【0058】上記ベクターをAmersham社の DNAシーケン
スキット(Cycle sequence kit)で反応させ、塩基配列を
決定した。プラスミド DNA 3μg/24μl 、及びFITC蛍光
ユニバーサルプライマー 1μl を混ぜた溶液を 6μl づ
つ4本チューブに分注した。各チューブに反応ミックス
(dNTP、ddNTP、Thermosequenase、バッファー入り)を
2μl 加え、ミネラルオイルを重層した後、PCR 反応を
行った。PCR は、95℃、2分で変性処理を行った後、95
℃で30秒、50℃で30秒及び72℃で1分のサイクルを36サ
イクル行った。
スキット(Cycle sequence kit)で反応させ、塩基配列を
決定した。プラスミド DNA 3μg/24μl 、及びFITC蛍光
ユニバーサルプライマー 1μl を混ぜた溶液を 6μl づ
つ4本チューブに分注した。各チューブに反応ミックス
(dNTP、ddNTP、Thermosequenase、バッファー入り)を
2μl 加え、ミネラルオイルを重層した後、PCR 反応を
行った。PCR は、95℃、2分で変性処理を行った後、95
℃で30秒、50℃で30秒及び72℃で1分のサイクルを36サ
イクル行った。
【0059】PCR 反応溶液にストップバッファー 8μl
を加え、そのうち 3μl をシーケンスゲルで泳動した。
ここで分離された遺伝子にはPeg1〜Peg4までのものが含
まれるが、得られた塩基配列がPeg3に特徴的な亜鉛フィ
ンガーモチーフをもつものをPeg3クローンと同定した。
次に、ここで得られたマウスPeg3クローンを用いて、ヒ
トPEG3遺伝子を分離した。
を加え、そのうち 3μl をシーケンスゲルで泳動した。
ここで分離された遺伝子にはPeg1〜Peg4までのものが含
まれるが、得られた塩基配列がPeg3に特徴的な亜鉛フィ
ンガーモチーフをもつものをPeg3クローンと同定した。
次に、ここで得られたマウスPeg3クローンを用いて、ヒ
トPEG3遺伝子を分離した。
【0060】ヒトの胎児腎臓および成体脳のcDNAライブ
ラリー(Clonetech 社)を、前述のマウスPeg3クローン
のSacI断片をプローブとして用いてスクリーニングを行
った。ファージライブラリーのプレーティング、プロー
ブの標識、ハイブリダイゼーションの条件は前述サブト
ラクテッドプローブによるスクリーニングと同一条件で
行った。ただし、フィルターの洗浄は2 x SSC洗浄液を
用い、65℃にて30分間3回洗浄を行った。
ラリー(Clonetech 社)を、前述のマウスPeg3クローン
のSacI断片をプローブとして用いてスクリーニングを行
った。ファージライブラリーのプレーティング、プロー
ブの標識、ハイブリダイゼーションの条件は前述サブト
ラクテッドプローブによるスクリーニングと同一条件で
行った。ただし、フィルターの洗浄は2 x SSC洗浄液を
用い、65℃にて30分間3回洗浄を行った。
【0061】
【0062】前述サブトラクテッドプローブによるスク
リーニングと同一条件にてシグナルの検出を行い、対応
するプラークを単離した。得られたファージから以下の
ようにDNAを抽出した。すなわち、前述の方法に従っ
てファージを105pfuでプレーティングし、37℃にて15時
間培養し、全面溶菌を確認して3mlのSMバッファーを重
層し、4℃にて20時間ファージの溶出を行った。得られ
た溶出液に5M NaClを100 μl、50% PEG6000を200 μl
加え攪拌した後、氷浴上で30分静置した。11000x gにて
10分間遠心し、沈殿を集めた。200 μlのTE(10mM Tris
HCl (pH 7.5)、 1mM EDTA)に懸濁し、20μl の10% SD
Sと1 μlの0.5mg/ml Proteinase Kを加え攪拌後、37℃
で1時間インキュベートした。反応終了後フェノール抽
出、エタノール沈殿を行いファージDNAとした。
リーニングと同一条件にてシグナルの検出を行い、対応
するプラークを単離した。得られたファージから以下の
ようにDNAを抽出した。すなわち、前述の方法に従っ
てファージを105pfuでプレーティングし、37℃にて15時
間培養し、全面溶菌を確認して3mlのSMバッファーを重
層し、4℃にて20時間ファージの溶出を行った。得られ
た溶出液に5M NaClを100 μl、50% PEG6000を200 μl
加え攪拌した後、氷浴上で30分静置した。11000x gにて
10分間遠心し、沈殿を集めた。200 μlのTE(10mM Tris
HCl (pH 7.5)、 1mM EDTA)に懸濁し、20μl の10% SD
Sと1 μlの0.5mg/ml Proteinase Kを加え攪拌後、37℃
で1時間インキュベートした。反応終了後フェノール抽
出、エタノール沈殿を行いファージDNAとした。
【0063】約1μgのファージDNAを495 μl Hバッフ
ァー(High Buffer;宝酒造)に溶解し、5 μl EcoRI
(宝酒造)を加えて37℃で18時間反応した。反応液をエ
タノール沈殿したのち50μl のサンプルローディング液
に溶解し、0.7%アガロースゲルで電気泳動してインサー
ト部分を切り出した。 BIO/101社のGene Cleanを用い添
付マニュアルにしたがってDNAの回収を行った。
ァー(High Buffer;宝酒造)に溶解し、5 μl EcoRI
(宝酒造)を加えて37℃で18時間反応した。反応液をエ
タノール沈殿したのち50μl のサンプルローディング液
に溶解し、0.7%アガロースゲルで電気泳動してインサー
ト部分を切り出した。 BIO/101社のGene Cleanを用い添
付マニュアルにしたがってDNAの回収を行った。
【0064】pBluescriptII-SK(-)を100ngを45μl のH
バッファー(宝酒造)に溶解し、5μl EcoRI(宝酒造)
を加えて37℃で18時間反応した。フェノール抽出、エタ
ノール沈殿後、45μl のアルカリホスファターゼバッフ
ァー(宝酒造)に溶解し、5 μl 細菌アルカリホスファ
ターゼ(宝酒造)を加えて37℃で30分間反応させた。再
びフェノール抽出、エタノール沈殿後、前述のインサー
トDNAとともに3 μlの蒸留水に溶解した。これに3 μl
の3 x ライゲーションバッファー(下記)と3mM ATPを
加えて攪拌後、1 μl T4 DNAリガーゼを加え、37℃で1
時間反応させた。このうち3μl をとって大腸菌XL1Blu
e(Stratagene社)に形質転換した。
バッファー(宝酒造)に溶解し、5μl EcoRI(宝酒造)
を加えて37℃で18時間反応した。フェノール抽出、エタ
ノール沈殿後、45μl のアルカリホスファターゼバッフ
ァー(宝酒造)に溶解し、5 μl 細菌アルカリホスファ
ターゼ(宝酒造)を加えて37℃で30分間反応させた。再
びフェノール抽出、エタノール沈殿後、前述のインサー
トDNAとともに3 μlの蒸留水に溶解した。これに3 μl
の3 x ライゲーションバッファー(下記)と3mM ATPを
加えて攪拌後、1 μl T4 DNAリガーゼを加え、37℃で1
時間反応させた。このうち3μl をとって大腸菌XL1Blu
e(Stratagene社)に形質転換した。
【0065】
【0066】得られたクローンの塩基配列を前述の条件
にしたがって決定し、相互にオーバーラップしている部
分を考慮して全体のORFを推定した。その結果、配列
番号1で表される塩基配列が得られた。また、この塩基
配列によりコードされるアミノ酸配列を配列番号2に示
す。
にしたがって決定し、相互にオーバーラップしている部
分を考慮して全体のORFを推定した。その結果、配列
番号1で表される塩基配列が得られた。また、この塩基
配列によりコードされるアミノ酸配列を配列番号2に示
す。
【0067】〔実施例2〕形質転換体の作製及びPEG3の
発現 得られたクローンを用い、これらを連結してORF全体
約6kbをカバーする一続きのcDNAを作成し、これを哺乳
類細胞で働く発現ベクターpCEP4(Stratagene社)に連
結した。なお、本発明の遺伝子が組み込まれたベクター
を保有する大腸菌hPEG3は、工業技術院生命工学工
業技術研究所(茨城県つくば市東1丁目1番3号)に、
FERM-P 16394として寄託されている。
発現 得られたクローンを用い、これらを連結してORF全体
約6kbをカバーする一続きのcDNAを作成し、これを哺乳
類細胞で働く発現ベクターpCEP4(Stratagene社)に連
結した。なお、本発明の遺伝子が組み込まれたベクター
を保有する大腸菌hPEG3は、工業技術院生命工学工
業技術研究所(茨城県つくば市東1丁目1番3号)に、
FERM-P 16394として寄託されている。
【0068】得られたPEG3発現ベクタープラスミドを持
つ大腸菌(XL1Blue, Stratagene社)を50μg/mlの濃度
でアンピシリンを含む100mlのL培地で充分培養し、こ
こからプラスミドをアルカリ法により抽出した。すなわ
ち、37℃で18時間培養し、遠心して集菌後、溶液I(50
mMグルコース、25mM Tris HCl pH 8.0、10mM EDTA)を1
ml加え、これに懸濁した。2mlの溶液II(2N NaOH、1%
SDS)を加え、十分に攪拌して溶菌した。さらに溶液III
(5M酢酸カリウム (3M酢酸,5Mカリウム))を1.5ml加
えてよく攪拌し、氷浴上で30分静置した。3000回転で10
分遠心し、上清を回収した。これに4.5mlのイソプロパ
ノールを加え攪拌後、同様に遠心して沈殿を回収した。
3.8mlのTEに溶解し、これに3.8gの塩化セシウムを加え
て溶解した。400 μl の10mg/ml臭化エチジウム溶液を
加え、超遠心機にて77000回転で15時間遠心した。シリ
ンジでプラスミドのバンドを回収し、2倍容のTEを加え
てエタノール沈殿し、精製プラスミドとした。
つ大腸菌(XL1Blue, Stratagene社)を50μg/mlの濃度
でアンピシリンを含む100mlのL培地で充分培養し、こ
こからプラスミドをアルカリ法により抽出した。すなわ
ち、37℃で18時間培養し、遠心して集菌後、溶液I(50
mMグルコース、25mM Tris HCl pH 8.0、10mM EDTA)を1
ml加え、これに懸濁した。2mlの溶液II(2N NaOH、1%
SDS)を加え、十分に攪拌して溶菌した。さらに溶液III
(5M酢酸カリウム (3M酢酸,5Mカリウム))を1.5ml加
えてよく攪拌し、氷浴上で30分静置した。3000回転で10
分遠心し、上清を回収した。これに4.5mlのイソプロパ
ノールを加え攪拌後、同様に遠心して沈殿を回収した。
3.8mlのTEに溶解し、これに3.8gの塩化セシウムを加え
て溶解した。400 μl の10mg/ml臭化エチジウム溶液を
加え、超遠心機にて77000回転で15時間遠心した。シリ
ンジでプラスミドのバンドを回収し、2倍容のTEを加え
てエタノール沈殿し、精製プラスミドとした。
【0069】得られたプラスミド5μgを、リポフェク
チン(lipofectin;LIFE TECHNOLOGY社)を用いマニュ
アルに従ってリポソーム法にてヒトグリオーマ細胞株U8
7に導入した。ヒトグリオーマ細胞の培養は10%の牛胎
児血清を含むダルベッコ変法MEM培地を用い、5%炭
酸ガス存在下37℃で培養を行った。
チン(lipofectin;LIFE TECHNOLOGY社)を用いマニュ
アルに従ってリポソーム法にてヒトグリオーマ細胞株U8
7に導入した。ヒトグリオーマ細胞の培養は10%の牛胎
児血清を含むダルベッコ変法MEM培地を用い、5%炭
酸ガス存在下37℃で培養を行った。
【0070】104個の細胞を直径6cmのディッシュに接着
させた。培地を除いた後PBSにて2回洗浄し、2.4mlのOpt
iMEM(キット)を加えた。5 μgのプラスミドを300 μl
のOptiMEMに溶解し、室温にて30分静置した。15μl のL
ipofectinを300 μlのOptiMEMに加え、室温にて30分静
置した。プラスミドおよびLipoectinの溶液を混合し、
室温で15分静置し、前述の細胞に添加した。炭酸ガスイ
ンキュベータ中で24時間培養後、3mlの培地を加え、再
び24時間培養した。細胞をトリプシンにて剥離し、直径
10cmのディッシュ2枚に播きなおした。その後、100U/ml
ハイグロマイシンB(Hygromycin B;Sigma)を含む選択
培地にて1ヶ月間培養を行い、薬剤耐性を示す細胞のコ
ロニーを得た。出現したコロニーをペニシリンキャップ
を用いてそれぞれ単離し、PEG3発現細胞株の候補とした
(US87S1 、US87S2、US87S3、US87S4及びUS87S5) 。これ
らの候補について、以下の試験を行った。
させた。培地を除いた後PBSにて2回洗浄し、2.4mlのOpt
iMEM(キット)を加えた。5 μgのプラスミドを300 μl
のOptiMEMに溶解し、室温にて30分静置した。15μl のL
ipofectinを300 μlのOptiMEMに加え、室温にて30分静
置した。プラスミドおよびLipoectinの溶液を混合し、
室温で15分静置し、前述の細胞に添加した。炭酸ガスイ
ンキュベータ中で24時間培養後、3mlの培地を加え、再
び24時間培養した。細胞をトリプシンにて剥離し、直径
10cmのディッシュ2枚に播きなおした。その後、100U/ml
ハイグロマイシンB(Hygromycin B;Sigma)を含む選択
培地にて1ヶ月間培養を行い、薬剤耐性を示す細胞のコ
ロニーを得た。出現したコロニーをペニシリンキャップ
を用いてそれぞれ単離し、PEG3発現細胞株の候補とした
(US87S1 、US87S2、US87S3、US87S4及びUS87S5) 。これ
らの候補について、以下の試験を行った。
【0071】(1) 通常の培養条件での増殖速度の測定
24穴のマイクロタイタープレートに検定する細胞(U87S
1〜U87S5)を104ずつ播き、1mlの培地にて培養し、24時
間毎にトリプシン溶液で細胞を培養基から剥離し、PBS
に懸濁した後、ヘモサイトメーターにて細胞数を1週間
にわたって計測した。なお、対照として野生型(U87(w
t)) のものを用いた。その結果、図2に示すように、PE
G3発現細胞において増殖の抑制された細胞が認められた
(図2,U87S2, U87S3, U87S4)。
1〜U87S5)を104ずつ播き、1mlの培地にて培養し、24時
間毎にトリプシン溶液で細胞を培養基から剥離し、PBS
に懸濁した後、ヘモサイトメーターにて細胞数を1週間
にわたって計測した。なお、対照として野生型(U87(w
t)) のものを用いた。その結果、図2に示すように、PE
G3発現細胞において増殖の抑制された細胞が認められた
(図2,U87S2, U87S3, U87S4)。
【0072】(2) 軟寒天上でのコロニー形成能の検定
直径3.5cmのディッシュに0.7%寒天を含む培地2mlをかた
めたものの上に、103個の細胞を懸濁した0.35%寒天を含
む培地を重層し、室温で30分放置して固化させた後に炭
酸ガスインキュベータ中で3週間培養した。培養後、倒
立顕微鏡にてコロニーが形成されているか検定した。そ
の結果、対照の細胞ではコロニー形成が認められたのに
対し(図3,U87(wt)) 、PEG3発現細胞(図3,U87S1 及
びU87S4)では認められなかった。
めたものの上に、103個の細胞を懸濁した0.35%寒天を含
む培地を重層し、室温で30分放置して固化させた後に炭
酸ガスインキュベータ中で3週間培養した。培養後、倒
立顕微鏡にてコロニーが形成されているか検定した。そ
の結果、対照の細胞ではコロニー形成が認められたのに
対し(図3,U87(wt)) 、PEG3発現細胞(図3,U87S1 及
びU87S4)では認められなかった。
【0073】(3) ヌードマウスにおける造腫瘍性の検定
107の細胞(U87S1、U87S4 又はU87(wt))を300 μl の培
地に懸濁し、ヌードマウス(BALB/c nu/nu)に皮下注射し
た。注射後1週間毎にノギスで腫瘍の大きさを計測し、
造腫瘍性を検定した。その結果、PEG3発現細胞(U87S1
及びU87S4 )では、腫瘍は15mm3 以上の大きさにはなら
なかった(図4)。
地に懸濁し、ヌードマウス(BALB/c nu/nu)に皮下注射し
た。注射後1週間毎にノギスで腫瘍の大きさを計測し、
造腫瘍性を検定した。その結果、PEG3発現細胞(U87S1
及びU87S4 )では、腫瘍は15mm3 以上の大きさにはなら
なかった(図4)。
【0074】
【発明の効果】本発明により、発ガン抑制遺伝子、該遺
伝子を含む組換えベクター、該組換えベクターによって
形質転換された形質転換体、ならびに該遺伝子の発現に
より得られるタンパク質が提供される。本発明の遺伝子
は、脳腫瘍などの遺伝子治療に使用し得る点で有用であ
る。
伝子を含む組換えベクター、該組換えベクターによって
形質転換された形質転換体、ならびに該遺伝子の発現に
より得られるタンパク質が提供される。本発明の遺伝子
は、脳腫瘍などの遺伝子治療に使用し得る点で有用であ
る。
【0075】
配列番号:1
配列の長さ:5970
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA to mRNA
配列の特徴
特徴を表す記号:CDS
存在位置:344..4729
配列:
CGGGGCGCAG GAGATGTCCA CCCTGGGCTG GTGGCGCCGC GGGCGGGGCG CATGAGGGTG 60
CGCTAGGCGG CTGCTCGTGC CCGAGGCTGC GCAACTGAGG GTGAGCTTTG CCTTCTTGAT 120
CTTCCGTCCT TCTTGGAGAC GACTGGCGAG AGGAAGAGGG ACTAGGTCCA AACGTTAGGT 180
GGCTGGGTCC AGCCGGGAGA CCCGCACCAA GGGAGGAGAT CATCGAGCTC TTGGTCCTTG 240
AGCAGTACCT GACCATCATC CCTGAAAAGC TCAAGCCTTG GGTGGCGAGC AAAAAAGGCG 300
GAGATCTGTG AGAACTCTAC ACTCTGCTGG AGATTACAAG GAG ATG TAC CAA CCA 355
Met Tyr Gln Pro
1
GAA GAC GAC AAC AAC AGT GAC GTG ACC AGT GAC GAC GAC ATG ACC CGG 403
Glu Asp Asp Asn Asn Ser Asp Val Thr Ser Asp Asp Asp Met Thr Arg
5 10 15 20
AAC AGA AGA GAG TCC TCA CCA CCT CAC TCA GTC CAT TCT TTC AGT GGT 451
Asn Arg Arg Glu Ser Ser Pro Pro His Ser Val His Ser Phe Ser Gly
25 30 35
GAC CGG GAC TGG GAC CGG AGG GGC AGA AGC AGA GAC ATG GAG CCA CGA 499
Asp Arg Asp Trp Asp Arg Arg Gly Arg Ser Arg Asp Met Glu Pro Arg
40 45 50
GAC CGC TGG TCC CAC ACC AGG AAC CCA AGA AGC AGG ATG CCT CCG CGG 547
Asp Arg Trp Ser His Thr Arg Asn Pro Arg Ser Arg Met Pro Pro Arg
55 60 65
GAT CTT TCC CTT CCT GTG GTG GCG AAA ACA AGC TTT GAA ATG GAC AGA 595
Asp Leu Ser Leu Pro Val Val Ala Lys Thr Ser Phe Glu Met Asp Arg
70 75 80
GAG GAC GAC AGG GAC TCC AGG GCT TAT GAG TCC CGA TCT CAG GAT GCT 643
Glu Asp Asp Arg Asp Ser Arg Ala Tyr Glu Ser Arg Ser Gln Asp Ala
85 90 95 100
GAA TCA TAC CAA AAT GTG GTG GAC CTC GCT GAG GAC AGG AAG CCT CAC 691
Glu Ser Tyr Gln Asn Val Val Asp Leu Ala Glu Asp Arg Lys Pro His
105 110 115
AAC ACA ATC CAG GAC AAC ATG GAA AAC TAC AGG AAG CTG CTC TCC CTC 739
Asn Thr Ile Gln Asp Asn Met Glu Asn Tyr Arg Lys Leu Leu Ser Leu
120 125 130
GGA GTG CAG CTT GCT GAA GAC GAT GGC CAC TCC CAC ATG ACG CAG GGC 787
Gly Val Gln Leu Ala Glu Asp Asp Gly His Ser His Met Thr Gln Gly
135 140 145
CAC TCA CAA GAT CCA AGA GAA TGT GCC TAC CCA ACG CAC CAG TCG AGG 835
His Ser Gln Asp Pro Arg Glu Cys Ala Tyr Pro Thr His Gln Ser Arg
150 155 160
TCA ACT ATC CCT GAA GCC AAA AAT CAA CCC GCG CGG GGG ATT TGT GAA 883
Ser Thr Ile Pro Glu Ala Lys Asn Gln Pro Ala Arg Gly Ile Cys Glu
165 170 175 180
GAT GAA TCT CCC CCC GGA GTG ATA ATG GAA AAA TTC ATC AAG GAT GTG 931
Asp Glu Ser Pro Pro Gly Val Ile Met Glu Lys Phe Ile Lys Asp Val
185 190 195
TCA CGC AGT TCC AAA TCG GGA AGA GCA AGG GAG TCA AGC GAC CGG TCA 979
Ser Arg Ser Ser Lys Ser Gly Arg Ala Arg Glu Ser Ser Asp Arg Ser
200 205 210
CAG AGA TTC CCC AGA ATG TCA GAT GAT AAC TGG AAG GAC ATT TCA TTG 1027
Gln Arg Phe Pro Arg Met Ser Asp Asp Asn Trp Lys Asp Ile Ser Leu
215 220 225
AAC AAG AGG GAG TCA GTG ATC CAG CAG CGG GTT TAT GAA GGG AAT GCA 1075
Asn Lys Arg Glu Ser Val Ile Gln Gln Arg Val Tyr Glu Gly Asn Ala
230 235 240
TTT AGG GGA GGC TTT AGG TTT AAT TCA ACC CTT GTT TCC AGA AAG AGA 1123
Phe Arg Gly Gly Phe Arg Phe Asn Ser Thr Leu Val Ser Arg Lys Arg
245 250 255 260
GTT CTT GAA AGA AAG AGG CGC TAT CAT TTT GAC ACA GAT GGG AAG GGC 1171
Val Leu Glu Arg Lys Arg Arg Tyr His Phe Asp Thr Asp Gly Lys Gly
265 270 275
TCG ATT CAC GAT CAA AAA GGC TGT CCC AGG AAG AAG CCC TTT GAA TGT 1219
Ser Ile His Asp Gln Lys Gly Cys Pro Arg Lys Lys Pro Phe Glu Cys
280 285 290
GGT AGT GAG ATG AGA AAA GCC ATG AGC GTG AGC AGC CTG AGC AGC CTC 1267
Gly Ser Glu Met Arg Lys Ala Met Ser Val Ser Ser Leu Ser Ser Leu
295 300 305
AGC TCC CCC TCC TTT ACC GAG TCA CAG CCA ATT GAT TTT GGG GCA ATG 1315
Ser Ser Pro Ser Phe Thr Glu Ser Gln Pro Ile Asp Phe Gly Ala Met
310 315 320
CCA TAT GTA TGT GAT GAG TGT GGG AGG TCG TTC AGT GTC ATC TCA GAA 1363
Pro Tyr Val Cys Asp Glu Cys Gly Arg Ser Phe Ser Val Ile Ser Glu
325 330 335 340
TTT GTT GAG CAC CAG ATC ATG CAT ACT AGA GAG AAC CTC TAT GAG TAT 1411
Phe Val Glu His Gln Ile Met His Thr Arg Glu Asn Leu Tyr Glu Tyr
345 350 355
GGT GAG TCC TTT ATC CAC AGT GTG GCT GTC AGT GAA GTT CAG AAA AGT 1459
Gly Glu Ser Phe Ile His Ser Val Ala Val Ser Glu Val Gln Lys Ser
360 365 370
CAG GTT GGA GGG AAA CGG TTT GAA TGT AAG GAC TGT GGA GAG ACC TTC 1507
Gln Val Gly Gly Lys Arg Phe Glu Cys Lys Asp Cys Gly Glu Thr Phe
375 380 385
AAT AAG AGT GCC GCC TTG GCT GAA CAT CGG AAG ATT CAT GCT AGA GGT 1555
Asn Lys Ser Ala Ala Leu Ala Glu His Arg Lys Ile His Ala Arg Gly
390 395 400
TAT CTT GTG GAA TGT AAG AAT CAG GAA TGT GAG GAA GCC TTC ATG CCT 1603
Tyr Leu Val Glu Cys Lys Asn Gln Glu Cys Glu Glu Ala Phe Met Pro
405 410 415 420
AGC CCC ACC TTT AGT GAG CTT CAG AAA ATA TAT GGC AAA GAC AAA TTC 1651
Ser Pro Thr Phe Ser Glu Leu Gln Lys Ile Tyr Gly Lys Asp Lys Phe
425 430 435
TAC GAG TGC AGG GTG TGT AAG GAA ACC TTC CTT CAT AGT TCT GCC CTG 1699
Tyr Glu Cys Arg Val Cys Lys Glu Thr Phe Leu His Ser Ser Ala Leu
440 445 450
ATT GAG CAC CAG AAA ATC CAC TTT GGG GAT GAC AAA GAT AAT GAG CGT 1747
Ile Glu His Gln Lys Ile His Phe Gly Asp Asp Lys Asp Asn Glu Arg
455 460 465
GAA CAT GAA CGT GAA CGT GAA CGT GAG CGC GGG GAA ACC TTT AGG CCC 1795
Glu His Glu Arg Glu Arg Glu Arg Glu Arg Gly Glu Thr Phe Arg Pro
470 475 480
AGC CCA GCC CTT AAT GAG TTT CAG AAA ATG TAT GGT AAA GAG AAA ATG 1843
Ser Pro Ala Leu Asn Glu Phe Gln Lys Met Tyr Gly Lys Glu Lys Met
485 490 495 500
TAC GAA TGT AAG GTG TGT GGG GAG ACT TTC CTT CAT AGC TCA TCC CTG 1891
Tyr Glu Cys Lys Val Cys Gly Glu Thr Phe Leu His Ser Ser Ser Leu
505 510 515
AAA GAA CAT CAG AAA ATC CAT ACT AGA GGG AAC CCA TTT GAA AAC AAG 1939
Lys Glu His Gln Lys Ile His Thr Arg Gly Asn Pro Phe Glu Asn Lys
520 525 530
GGT AAA GTG TGT GAG GAA ACC TTT ATT CCT GGT CAG TCC CTT AAA AGG 1987
Gly Lys Val Cys Glu Glu Thr Phe Ile Pro Gly Gln Ser Leu Lys Arg
535 540 545
CGT CAG ATA ACT TAC AAT AAG GAG AAG CTC TGT GAC TTT ACA GAT GCC 2035
Arg Gln Ile Thr Tyr Asn Lys Glu Lys Leu Cys Asp Phe Thr Asp Ala
550 555 560
CGG GAT GCC TTC ATG CAA AGC TCA GAG CTC AGT GAG CAT CAG AAA ATT 2083
Arg Asp Ala Phe Met Gln Ser Ser Glu Leu Ser Glu His Gln Lys Ile
565 570 575 580
CAT TCT CGA AAG AAC CTC TTT GAA GGC AGA GGG TAT GAG AAA TCT GTC 2131
His Ser Arg Lys Asn Leu Phe Glu Gly Arg Gly Tyr Glu Lys Ser Val
585 590 595
ATT CAC AGT GGG CCA TTC ACT GAA TCT CAG AAG AGT CAT ACT ATA ACA 2179
Ile His Ser Gly Pro Phe Thr Glu Ser Gln Lys Ser His Thr Ile Thr
600 605 610
AGA CCT CTT GAA AGT GAT GAG GAC GAA AAG GCG GTC ACC ATT AGC TCT 2227
Arg Pro Leu Glu Ser Asp Glu Asp Glu Lys Ala Val Thr Ile Ser Ser
615 620 625
TAC CCC TAT GAA AAC CAG AAG ATT CCC ACT AAG GAA AAT GTC TAT GAG 2275
Tyr Pro Tyr Glu Asn Gln Lys Ile Pro Thr Lys Glu Asn Val Tyr Glu
630 635 640
GCA AAA TCA TAT GAG AGG TCT GTT ATT CAT AGC TTA GCC TCT GTG GAA 2323
Ala Lys Ser Tyr Glu Arg Ser Val Ile His Ser Leu Ala Ser Val Glu
645 650 655 660
GCT CAG AAA AGT CAC AGT GTA GCA GGG CCC AGT AAA CCA AAA GTA ATG 2371
Ala Gln Lys Ser His Ser Val Ala Gly Pro Ser Lys Pro Lys Val Met
665 670 675
GCA GAG TCT ACC ATT CAG AGC TTC GAT GCT ATC AAC CAT CAG AGA GTT 2419
Ala Glu Ser Thr Ile Gln Ser Phe Asp Ala Ile Asn His Gln Arg Val
680 685 690
CGT GCT GGA GGG AAC ACC TCT GAA GGA AGG GAA TAC AGT AGG TCT GTT 2467
Arg Ala Gly Gly Asn Thr Ser Glu Gly Arg Glu Tyr Ser Arg Ser Val
695 700 705
ATC CAT AGC TTA GTG GCT TCC AAA CCT CCA AGA AGT CAC AAT GGA AAT 2515
Ile His Ser Leu Val Ala Ser Lys Pro Pro Arg Ser His Asn Gly Asn
710 715 720
GAA TTG GTG GAA TCT AAT GAG AAG GGA GAA TCC TCC ATT TAT ATC TCA 2563
Glu Leu Val Glu Ser Asn Glu Lys Gly Glu Ser Ser Ile Tyr Ile Ser
725 730 735 740
GAC CTT AAT GAT AAG CGA CAG AAG ATT CCT GCC AGA GAG AAC CCT TGT 2611
Asp Leu Asn Asp Lys Arg Gln Lys Ile Pro Ala Arg Glu Asn Pro Cys
745 750 755
GAA GGG GGC AGT AAG AAT CGC AAC TAT GAA GAC TCT GTC ATA CAG AGT 2659
Glu Gly Gly Ser Lys Asn Arg Asn Tyr Glu Asp Ser Val Ile Gln Ser
760 765 770
GTA TTC CGT GCC AAA CCT CAG AAA AGT GTT CCT GGA GAG GGA TCT GGT 2707
Val Phe Arg Ala Lys Pro Gln Lys Ser Val Pro Gly Glu Gly Ser Gly
775 780 785
GAG TTT AAG AAG GAT GGC GAA TTC TCT GTT CCC AGC TCA AAT GTC CGT 2755
Glu Phe Lys Lys Asp Gly Glu Phe Ser Val Pro Ser Ser Asn Val Arg
790 795 800
GAA TAC CAG AAG GCT CGT GCT AAA AAG AAA TAC ATT GAG CAT AGG AGC 2803
Glu Tyr Gln Lys Ala Arg Ala Lys Lys Lys Tyr Ile Glu His Arg Ser
805 810 815 820
AAT GAG ACC TCT GTA ATT CAC TCT CTG CCT TTT GGT GAA CAA ACA TTT 2851
Asn Glu Thr Ser Val Ile His Ser Leu Pro Phe Gly Glu Gln Thr Phe
825 830 835
CGC CCT CGA GGG ATG CTC TAT GAA TGT CAG GAG TGT GGG GAG TGC TTT 2899
Arg Pro Arg Gly Met Leu Tyr Glu Cys Gln Glu Cys Gly Glu Cys Phe
840 845 850
GCT CAT AGC TCT GAC CTC ACT GAG CAC CAG AAG ATT CAT GAT AGG GAG 2947
Ala His Ser Ser Asp Leu Thr Glu His Gln Lys Ile His Asp Arg Glu
855 860 865
AAG CCC TCT GGA AGC AGA AAC TAT GAA TGG TCT GTC ATT CGC AGC TTG 2995
Lys Pro Ser Gly Ser Arg Asn Tyr Glu Trp Ser Val Ile Arg Ser Leu
870 875 880
GCC CCT ACT GAC CCT CAA ACC AGT TAC GCC CAA GAG CAG TAT GCT AAA 3043
Ala Pro Thr Asp Pro Gln Thr Ser Tyr Ala Gln Glu Gln Tyr Ala Lys
885 890 895 900
GAG CAA GCG CGG AAC AAA TGT AAG GAC TTC AGA CAA TTT TTT GCT ACC 3091
Glu Gln Ala Arg Asn Lys Cys Lys Asp Phe Arg Gln Phe Phe Ala Thr
905 910 915
AGC GAA GAC CTC AAC ACA AAC CAG AAA ATC TAT GAC CAA GAG AAG TCT 3139
Ser Glu Asp Leu Asn Thr Asn Gln Lys Ile Tyr Asp Gln Glu Lys Ser
920 925 930
CAT GGC GAG GAG TCT CAA GGC GAG AAT ACT GAT GGG GAG GAG ACC CAC 3187
His Gly Glu Glu Ser Gln Gly Glu Asn Thr Asp Gly Glu Glu Thr His
935 940 945
AGC GAG GAG ACC CAT GGT CAG GAG ACA ATT GAA GAC CCT GTC ATT CAG 3235
Ser Glu Glu Thr His Gly Gln Glu Thr Ile Glu Asp Pro Val Ile Gln
950 955 960
GGC TCA GAC ATG GAA GAC CCT CAG AAG GAT GAC CCT GAT GAC AAA ATC 3283
Gly Ser Asp Met Glu Asp Pro Gln Lys Asp Asp Pro Asp Asp Lys Ile
965 970 975 980
TAT GAA TGT GAG GAC TGT GGC CTG GGC TTT ATG GAT CTC ACA GAC CTC 3331
Tyr Glu Cys Glu Asp Cys Gly Leu Gly Phe Met Asp Leu Thr Asp Leu
985 990 995
ACA GAC CAT CAG AAA GTC CAC AGC AGG AAG TGC CTG GTT GAC AGT CGG 3379
Thr Asp His Gln Lys Val His Ser Arg Lys Cys Leu Val Asp Ser Arg
1000 1005 1010
GAG TAC ACA CAT TCT GTA GTT CAC ACC CAT TCC ATC AGC GAG TAT CAG 3427
Glu Tyr Thr His Ser Val Val His Thr His Ser Ile Ser Glu Tyr Gln
1015 1020 1025
AGA GAT TAC ACT GGA GAG CAG CTG TAT GAA TGT CCA AAG TGT GGG GAA 3475
Arg Asp Tyr Thr Gly Glu Gln Leu Tyr Glu Cys Pro Lys Cys Gly Glu
1030 1035 1040
TCT TTT ATT CAT AGC TCA TTC CTT TTC GAG CAT CAG AGA ATC CAT GAA 3523
Ser Phe Ile His Ser Ser Phe Leu Phe Glu His Gln Arg Ile His Glu
1045 1050 1055 1060
CAA GAC CAG TTG TAT TCC ATG AAG GGG TGT GAT GAT GGT TTT ATT GCC 3571
Gln Asp Gln Leu Tyr Ser Met Lys Gly Cys Asp Asp Gly Phe Ile Ala
1065 1070 1075
CTC TTG CCC ATG AAG CCA CGG AGG AAT CGT GCT GCA GAG AGG AAT CCT 3619
Leu Leu Pro Met Lys Pro Arg Arg Asn Arg Ala Ala Glu Arg Asn Pro
1080 1085 1090
GCT CTT GCT GGG TCG GCC ATT CGA TGC CTT TTG TGT GGA CAA GGC TTC 3667
Ala Leu Ala Gly Ser Ala Ile Arg Cys Leu Leu Cys Gly Gln Gly Phe
1095 1100 1105
ATT CAT AGC TCT GCC CTT AAT GAG CAT ATG AGA CTT CAT AGG GAA GAT 3715
Ile His Ser Ser Ala Leu Asn Glu His Met Arg Leu His Arg Glu Asp
1110 1115 1120
GAT TTA CTG GAG CAG AGC CAG ATG GCT GAG GAA GCT ATC ATT CCA GGC 3763
Asp Leu Leu Glu Gln Ser Gln Met Ala Glu Glu Ala Ile Ile Pro Gly
1125 1130 1135 1140
TTA GCC CTC ACT GAG TTT CAG AGA AGT CAG ACC GAA GAG AGA CTC TTT 3811
Leu Ala Leu Thr Glu Phe Gln Arg Ser Gln Thr Glu Glu Arg Leu Phe
1145 1150 1155
GAA TGT GCA GTC TGT GGA GAA TCT TTC GTC AAC CCA GCA GAA CTT GCA 3859
Glu Cys Ala Val Cys Gly Glu Ser Phe Val Asn Pro Ala Glu Leu Ala
1160 1165 1170
GAT CAC GTA ACT GTT CAT AAG AAT GAG CCC TAT GAG TAC GGG TCC TCC 3907
Asp His Val Thr Val His Lys Asn Glu Pro Tyr Glu Tyr Gly Ser Ser
1175 1180 1185
TAT ACT CAC ACC TCA TTT CTT ACT GAG CCC CTC AAA GGA GCT ATA CCA 3955
Tyr Thr His Thr Ser Phe Leu Thr Glu Pro Leu Lys Gly Ala Ile Pro
1190 1195 1200
TTC TAT GAA TGC AAG GAT TGT GAT AAG CCC TTT ATT CAT AGC ACA GTC 4003
Phe Tyr Glu Cys Lys Asp Cys Asp Lys Pro Phe Ile His Ser Thr Val
1205 1210 1215 1220
CTC ACT AAA CAT AAG GAG CTT CAT CTG AAG AAG AAG AAG AAG ATG AAT 4051
Leu Thr Lys His Lys Glu Leu His Leu Lys Lys Lys Lys Lys Met Asn
1225 1230 1235
GCA GCA GCA GCT GCA GCA GCA GCA GCC CAG GAA GTT GAA GCC AAT GTC 4099
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gln Glu Val Glu Ala Asn Val
1240 1245 1250
CAT GTT CCA CAA GTA GTT CTG AGG ATT CAG GGC TTA AAC GTA GAG GCT 4147
His Val Pro Gln Val Val Leu Arg Ile Gln Gly Leu Asn Val Glu Ala
1255 1260 1265
GCT GAG CCA GAA GTG GAG GCT GCC GAG CCA GAA GTG GAG GCT GCT GAG 4195
Ala Glu Pro Glu Val Glu Ala Ala Glu Pro Glu Val Glu Ala Ala Glu
1270 1275 1280
CCA GAA GTG GAG GCT GCT GAG CCA AAC GGA GAG GCT GAA GGG CCA GAT 4243
Pro Glu Val Glu Ala Ala Glu Pro Asn Gly Glu Ala Glu Gly Pro Asp
1285 1290 1295 1300
GGA GAG GCT GCA GAG CCC ATT GGA GAG GCT GGA CAG CCA AAT GGA GAG 4291
Gly Glu Ala Ala Glu Pro Ile Gly Glu Ala Gly Gln Pro Asn Gly Glu
1305 1310 1315
GCC GAG CAG CCA AAT GGG GAT GCT GAT GAG CCA GAT GGT GCA GGT ATT 4339
Ala Glu Gln Pro Asn Gly Asp Ala Asp Glu Pro Asp Gly Ala Gly Ile
1320 1325 1330
GAA GAC CCA GAA GAA AGA GCT GAA GAG CCA GAG GGA AAA GCT GAA GAG 4387
Glu Asp Pro Glu Glu Arg Ala Glu Glu Pro Glu Gly Lys Ala Glu Glu
1335 1340 1345
CCA GAG GGA GAT GCC GAC GAG CCT GAC GGT GTG GGA ATT GAA GAC CCA 4435
Pro Glu Gly Asp Ala Asp Glu Pro Asp Gly Val Gly Ile Glu Asp Pro
1350 1355 1360
GAA GAA GGT GAA GAT CAA GAG ATT CAG GTA GAA GAA CCA TAC TAT GAC 4483
Glu Glu Gly Glu Asp Gln Glu Ile Gln Val Glu Glu Pro Tyr Tyr Asp
1365 1370 1375 1380
TGC CAT GAA TGC ACA GAA ACC TTC ACT TCC AGC ACA GCA TTC AGT GAA 4531
Cys His Glu Cys Thr Glu Thr Phe Thr Ser Ser Thr Ala Phe Ser Glu
1385 1390 1395
CAC CTG AAA ACT CAT GCC AGC ATG ATC ATA TTT GAG CCT GCA AAT GCC 4579
His Leu Lys Thr His Ala Ser Met Ile Ile Phe Glu Pro Ala Asn Ala
1400 1405 1410
TTT GGG GAG TGC TCA GGC TAC ATC GAA CGT GCC AGC ACC AGC ACA GGT 4627
Phe Gly Glu Cys Ser Gly Tyr Ile Glu Arg Ala Ser Thr Ser Thr Gly
1415 1420 1425
GGT GCC AAT CAA GCT GAT GAG AAG TAC TTC AAA TGT GAC GTC TGT GGG 4675
Gly Ala Asn Gln Ala Asp Glu Lys Tyr Phe Lys Cys Asp Val Cys Gly
1430 1435 1440
CAG CTC TTC AAC GAC CGC CTG TCC CTC GCC AGA CAC CAG AAT ACC CAC 4723
Gln Leu Phe Asn Asp Arg Leu Ser Leu Ala Arg His Gln Asn Thr His
1445 1450 1455 1460
ATG GGC TGAGGGCATG GGGTAAAGGT TAGAAAACCT TCCCTTAGGA CTTGACCCTT 4779
Met Gly
ACCAAACCAA GAGAATCCAA CCAATCCCAT GATAATGTCA GTAGGAGACT TAACCTTAGT 4839
GTGTTACACA CCTGACTTAA CATCTCTAAA CTCAGATTGA AAAGAGACCG AATGTGCAGA 4899
TTCCACAGTC TTAAGCTTTC CCCTTCAGAT GTCAGTGTCT GCATGTGGGA AAGCCATAGC 4959
ACACATCTTA CCTTTCCAAG TAATCAGATT GAGAAAACCC TATGAGTATT CCAGACTACA 5019
GAGTTTGCCC AAATCAACTG TAAATGACAC TTGTGTAACG TATATATAGT GTTTCATGAG 5079
GTGTATATAA AATAGCAAAT TATGACAGAA CAGTGATCAC ATATATTTGG ATTTATATGA 5139
TATACAGTTA CAGTTTACTC TGCAGAGGTA CCTTACCTGG TATTCTTTGA ATTTTTTTTT 5199
TTTTTGGAGG AGGAAGAGAG CAACAAATTT GATTATATTT TTAAGTGTCT TAGATCCTGA 5259
GAAAGATTTA TTGTGCATTA TTTGAACCCT GTCAATATCT TTTTGAGTAA TTGTTTTGTT 5319
TCTTACCCTT AAATAGTCTT GTGAAGCTGT AGGCATGATA GATAACATGG CTTTTACTCC 5379
TTACTGTTTG AAAAGATAAG TACTTTAGCT TCTTTCTGCA GCCATTTCAT CTGCGCCAAC 5439
ACTTTGGAAC CTAATACTGT GTAAGGCTTT ACAATATACG GATTGGCTTT TTGTGACCCA 5499
GATTGATTGG TTGCCACATG TTATGTTTGT TGAAGTGGTT CTCATGCAAA AATATTACAC 5559
ATTTGTGTTC TGGGTTTTTT TTTTTTAACC AACTCAATAT GTGTTTGATG ATAGTGAATT 5619
GATAAAACCC GAAGCTTTTC CCTGTAAATC TTACATCTTT GCCTTTAAAG AATGGGTTAC 5679
AACCATCACT AGATCACAGT AGTGCCTAAT GAAGGTTGAG AACCGTAGGA GAGGCTCTCA 5739
TGCTGTAAAT AATGTTGCAG GCTAATAACC TTTCATCACT TCCTTTGTGC GCTTCCTGCC 5799
TTAAGTGACA AGTAGCAACA TGGCTTGGGT CCCCTGTGCA GCATCAGCTT ATGCTGCCAC 5859
AAGTCAGTTT ACCCTAGGTG CCCAGGAGCT AGTATCCTTA GATCTTTCTA TCGCTAACTT 5919
AATTCTCTTC GTTATTTATC TGACCCTCTA ACTCCATGTC TAACTTGCAT T 5970
【0076】配列番号:2
配列の長さ:1462
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:タンパク質
配列:
Met Tyr Gln Pro Glu Asp Asp Asn Asn Ser Asp Val Thr Ser Asp Asp
1 5 10 15
Asp Met Thr Arg Asn Arg Arg Glu Ser Ser Pro Pro His Ser Val His
20 25 30
Ser Phe Ser Gly Asp Arg Asp Trp Asp Arg Arg Gly Arg Ser Arg Asp
35 40 45
Met Glu Pro Arg Asp Arg Trp Ser His Thr Arg Asn Pro Arg Ser Arg
50 55 60
Met Pro Pro Arg Asp Leu Ser Leu Pro Val Val Ala Lys Thr Ser Phe
65 70 75 80
Glu Met Asp Arg Glu Asp Asp Arg Asp Ser Arg Ala Tyr Glu Ser Arg
85 90 95
Ser Gln Asp Ala Glu Ser Tyr Gln Asn Val Val Asp Leu Ala Glu Asp
100 105 110
Arg Lys Pro His Asn Thr Ile Gln Asp Asn Met Glu Asn Tyr Arg Lys
115 120 125
Leu Leu Ser Leu Gly Val Gln Leu Ala Glu Asp Asp Gly His Ser His
130 135 140
Met Thr Gln Gly His Ser Gln Asp Pro Arg Glu Cys Ala Tyr Pro Thr
145 150 155 160
His Gln Ser Arg Ser Thr Ile Pro Glu Ala Lys Asn Gln Pro Ala Arg
165 170 175
Gly Ile Cys Glu Asp Glu Ser Pro Pro Gly Val Ile Met Glu Lys Phe
180 185 190
Ile Lys Asp Val Ser Arg Ser Ser Lys Ser Gly Arg Ala Arg Glu Ser
195 200 205
Ser Asp Arg Ser Gln Arg Phe Pro Arg Met Ser Asp Asp Asn Trp Lys
210 215 220
Asp Ile Ser Leu Asn Lys Arg Glu Ser Val Ile Gln Gln Arg Val Tyr
225 230 235 240
Glu Gly Asn Ala Phe Arg Gly Gly Phe Arg Phe Asn Ser Thr Leu Val
245 250 255
Ser Arg Lys Arg Val Leu Glu Arg Lys Arg Arg Tyr His Phe Asp Thr
260 265 270
Asp Gly Lys Gly Ser Ile His Asp Gln Lys Gly Cys Pro Arg Lys Lys
275 280 285
Pro Phe Glu Cys Gly Ser Glu Met Arg Lys Ala Met Ser Val Ser Ser
290 295 300
Leu Ser Ser Leu Ser Ser Pro Ser Phe Thr Glu Ser Gln Pro Ile Asp
305 310 315 320
Phe Gly Ala Met Pro Tyr Val Cys Asp Glu Cys Gly Arg Ser Phe Ser
325 330 335
Val Ile Ser Glu Phe Val Glu His Gln Ile Met His Thr Arg Glu Asn
340 345 350
Leu Tyr Glu Tyr Gly Glu Ser Phe Ile His Ser Val Ala Val Ser Glu
355 360 365
Val Gln Lys Ser Gln Val Gly Gly Lys Arg Phe Glu Cys Lys Asp Cys
370 375 380
Gly Glu Thr Phe Asn Lys Ser Ala Ala Leu Ala Glu His Arg Lys Ile
385 390 395 400
His Ala Arg Gly Tyr Leu Val Glu Cys Lys Asn Gln Glu Cys Glu Glu
405 410 415
Ala Phe Met Pro Ser Pro Thr Phe Ser Glu Leu Gln Lys Ile Tyr Gly
420 425 430
Lys Asp Lys Phe Tyr Glu Cys Arg Val Cys Lys Glu Thr Phe Leu His
435 440 445
Ser Ser Ala Leu Ile Glu His Gln Lys Ile His Phe Gly Asp Asp Lys
450 455 460
Asp Asn Glu Arg Glu His Glu Arg Glu Arg Glu Arg Glu Arg Gly Glu
465 470 475 480
Thr Phe Arg Pro Ser Pro Ala Leu Asn Glu Phe Gln Lys Met Tyr Gly
485 490 495
Lys Glu Lys Met Tyr Glu Cys Lys Val Cys Gly Glu Thr Phe Leu His
500 505 510
Ser Ser Ser Leu Lys Glu His Gln Lys Ile His Thr Arg Gly Asn Pro
515 520 525
Phe Glu Asn Lys Gly Lys Val Cys Glu Glu Thr Phe Ile Pro Gly Gln
530 535 540
Ser Leu Lys Arg Arg Gln Ile Thr Tyr Asn Lys Glu Lys Leu Cys Asp
545 550 555 560
Phe Thr Asp Ala Arg Asp Ala Phe Met Gln Ser Ser Glu Leu Ser Glu
565 570 575
His Gln Lys Ile His Ser Arg Lys Asn Leu Phe Glu Gly Arg Gly Tyr
580 585 590
Glu Lys Ser Val Ile His Ser Gly Pro Phe Thr Glu Ser Gln Lys Ser
595 600 605
His Thr Ile Thr Arg Pro Leu Glu Ser Asp Glu Asp Glu Lys Ala Val
610 615 620
Thr Ile Ser Ser Tyr Pro Tyr Glu Asn Gln Lys Ile Pro Thr Lys Glu
625 630 635 640
Asn Val Tyr Glu Ala Lys Ser Tyr Glu Arg Ser Val Ile His Ser Leu
645 650 655
Ala Ser Val Glu Ala Gln Lys Ser His Ser Val Ala Gly Pro Ser Lys
660 665 670
Pro Lys Val Met Ala Glu Ser Thr Ile Gln Ser Phe Asp Ala Ile Asn
675 680 685
His Gln Arg Val Arg Ala Gly Gly Asn Thr Ser Glu Gly Arg Glu Tyr
690 695 700
Ser Arg Ser Val Ile His Ser Leu Val Ala Ser Lys Pro Pro Arg Ser
705 710 715 720
His Asn Gly Asn Glu Leu Val Glu Ser Asn Glu Lys Gly Glu Ser Ser
725 730 735
Ile Tyr Ile Ser Asp Leu Asn Asp Lys Arg Gln Lys Ile Pro Ala Arg
740 745 750
Glu Asn Pro Cys Glu Gly Gly Ser Lys Asn Arg Asn Tyr Glu Asp Ser
755 760 765
Val Ile Gln Ser Val Phe Arg Ala Lys Pro Gln Lys Ser Val Pro Gly
770 775 780
Glu Gly Ser Gly Glu Phe Lys Lys Asp Gly Glu Phe Ser Val Pro Ser
785 790 795 800
Ser Asn Val Arg Glu Tyr Gln Lys Ala Arg Ala Lys Lys Lys Tyr Ile
805 810 815
Glu His Arg Ser Asn Glu Thr Ser Val Ile His Ser Leu Pro Phe Gly
820 825 830
Glu Gln Thr Phe Arg Pro Arg Gly Met Leu Tyr Glu Cys Gln Glu Cys
835 840 845
Gly Glu Cys Phe Ala His Ser Ser Asp Leu Thr Glu His Gln Lys Ile
850 855 860
His Asp Arg Glu Lys Pro Ser Gly Ser Arg Asn Tyr Glu Trp Ser Val
865 870 875 880
Ile Arg Ser Leu Ala Pro Thr Asp Pro Gln Thr Ser Tyr Ala Gln Glu
885 890 895
Gln Tyr Ala Lys Glu Gln Ala Arg Asn Lys Cys Lys Asp Phe Arg Gln
900 905 910
Phe Phe Ala Thr Ser Glu Asp Leu Asn Thr Asn Gln Lys Ile Tyr Asp
915 920 925
Gln Glu Lys Ser His Gly Glu Glu Ser Gln Gly Glu Asn Thr Asp Gly
930 935 940
Glu Glu Thr His Ser Glu Glu Thr His Gly Gln Glu Thr Ile Glu Asp
945 950 955 960
Pro Val Ile Gln Gly Ser Asp Met Glu Asp Pro Gln Lys Asp Asp Pro
965 970 975
Asp Asp Lys Ile Tyr Glu Cys Glu Asp Cys Gly Leu Gly Phe Met Asp
980 985 990
Leu Thr Asp Leu Thr Asp His Gln Lys Val His Ser Arg Lys Cys Leu
995 1000 1005
Val Asp Ser Arg Glu Tyr Thr His Ser Val Val His Thr His Ser Ile
1010 1015 1020
Ser Glu Tyr Gln Arg Asp Tyr Thr Gly Glu Gln Leu Tyr Glu Cys Pro
1025 1030 1035 1040
Lys Cys Gly Glu Ser Phe Ile His Ser Ser Phe Leu Phe Glu His Gln
1045 1050 1055
Arg Ile His Glu Gln Asp Gln Leu Tyr Ser Met Lys Gly Cys Asp Asp
1060 1065 1070
Gly Phe Ile Ala Leu Leu Pro Met Lys Pro Arg Arg Asn Arg Ala Ala
1075 1080 1085
Glu Arg Asn Pro Ala Leu Ala Gly Ser Ala Ile Arg Cys Leu Leu Cys
1090 1095 1100
Gly Gln Gly Phe Ile His Ser Ser Ala Leu Asn Glu His Met Arg Leu
1105 1110 1115 1120
His Arg Glu Asp Asp Leu Leu Glu Gln Ser Gln Met Ala Glu Glu Ala
1125 1130 1135
Ile Ile Pro Gly Leu Ala Leu Thr Glu Phe Gln Arg Ser Gln Thr Glu
1140 1145 1150
Glu Arg Leu Phe Glu Cys Ala Val Cys Gly Glu Ser Phe Val Asn Pro
1155 1160 1165
Ala Glu Leu Ala Asp His Val Thr Val His Lys Asn Glu Pro Tyr Glu
1170 1175 1180
Tyr Gly Ser Ser Tyr Thr His Thr Ser Phe Leu Thr Glu Pro Leu Lys
1185 1190 1195 1200
Gly Ala Ile Pro Phe Tyr Glu Cys Lys Asp Cys Asp Lys Pro Phe Ile
1205 1210 1215
His Ser Thr Val Leu Thr Lys His Lys Glu Leu His Leu Lys Lys Lys
1220 1225 1230
Lys Lys Met Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gln Glu Val
1235 1240 1245
Glu Ala Asn Val His Val Pro Gln Val Val Leu Arg Ile Gln Gly Leu
1250 1255 1260
Asn Val Glu Ala Ala Glu Pro Glu Val Glu Ala Ala Glu Pro Glu Val
1265 1270 1275 1280
Glu Ala Ala Glu Pro Glu Val Glu Ala Ala Glu Pro Asn Gly Glu Ala
1285 1290 1295
Glu Gly Pro Asp Gly Glu Ala Ala Glu Pro Ile Gly Glu Ala Gly Gln
1300 1305 1310
Pro Asn Gly Glu Ala Glu Gln Pro Asn Gly Asp Ala Asp Glu Pro Asp
1315 1320 1325
Gly Ala Gly Ile Glu Asp Pro Glu Glu Arg Ala Glu Glu Pro Glu Gly
1330 1335 1340
Lys Ala Glu Glu Pro Glu Gly Asp Ala Asp Glu Pro Asp Gly Val Gly
1345 1350 1355 1360
Ile Glu Asp Pro Glu Glu Gly Glu Asp Gln Glu Ile Gln Val Glu Glu
1365 1370 1375
Pro Tyr Tyr Asp Cys His Glu Cys Thr Glu Thr Phe Thr Ser Ser Thr
1380 1385 1390
Ala Phe Ser Glu His Leu Lys Thr His Ala Ser Met Ile Ile Phe Glu
1395 1400 1405
Pro Ala Asn Ala Phe Gly Glu Cys Ser Gly Tyr Ile Glu Arg Ala Ser
1410 1415 1420
Thr Ser Thr Gly Gly Ala Asn Gln Ala Asp Glu Lys Tyr Phe Lys Cys
1425 1430 1435 1440
Asp Val Cys Gly Gln Leu Phe Asn Asp Arg Leu Ser Leu Ala Arg His
1445 1450 1455
Gln Asn Thr His Met Gly
1460
【0077】配列番号:3
配列の長さ:20
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:他の核酸(合成DNA)
配列:
GATTACTCGA GACTAATATC 20
【0078】配列番号:4
配列の長さ:17
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:他の核酸(合成DNA)
配列:
GATATTAGTC TCGAGTA 17
【0079】配列番号:5
配列の長さ:20
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:他の核酸(合成DNA)
配列:
TCGACTCGAG TATAGTTACA 20
【0080】配列番号:6
配列の長さ:17
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:他の核酸(合成DNA)
配列:
TGTAACTATA CTCGAGT 17
T
【図1】本発明のDNAのクローニング手法の概要を示
す図である。
す図である。
【図2】細胞の増殖結果を示す図である。
【図3】コロニー形成の検定結果を示す写真である(生
物の形態)。
物の形態)。
【図4】造腫瘍性の検定結果を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名)
C12N 15/09 ZNA
C07K 14/47
C12N 5/10
SwissProt/PIR/GeneS
eq
GenBank/EMBL/DDBJ/G
eneSeq
BIOSIS/WPI(DIALOG)
Claims (5)
- 【請求項1】 配列番号2で表されるアミノ酸配列又は
該アミノ酸配列において1個又は数個のアミノ酸が欠
失、置換若しくは付加された配列を有し、発ガン抑制活
性をもたらすタンパク質。 - 【請求項2】 配列番号2で表されるアミノ酸配列又は
該アミノ酸配列において1個又は数個のアミノ酸が欠
失、置換若しくは付加された配列を有し、発ガン抑制活
性をもたらすタンパク質をコードするDNA。 - 【請求項3】 DNAが配列番号1で表されるものであ
る請求項2記載のDNA。 - 【請求項4】 請求項2又は3記載のDNAを含む組換
えベクター。 - 【請求項5】 請求項4記載の組換えベクターによって
形質転換された形質転換体。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP23620897A JP3420032B2 (ja) | 1997-09-01 | 1997-09-01 | 発ガン抑制遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP23620897A JP3420032B2 (ja) | 1997-09-01 | 1997-09-01 | 発ガン抑制遺伝子 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH1175844A JPH1175844A (ja) | 1999-03-23 |
JP3420032B2 true JP3420032B2 (ja) | 2003-06-23 |
Family
ID=16997386
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP23620897A Expired - Fee Related JP3420032B2 (ja) | 1997-09-01 | 1997-09-01 | 発ガン抑制遺伝子 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP3420032B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008220350A (ja) * | 2007-03-13 | 2008-09-25 | Cellseed Inc | 軟寒天コロニー形成試験代替法及びその利用方法 |
-
1997
- 1997-09-01 JP JP23620897A patent/JP3420032B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Hum.Mol.Genet.,1997,Vol.6,No.5,pages 781−6 |
Nat.Genet.,1996,Vol.12,No.2,pages 186−90 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH1175844A (ja) | 1999-03-23 |
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