JP2002513276A - Ｓ―アデノシル―ｌ―ホモシステイン加水分解酵素（ａｈｃｙ）型活性を有する酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、AHCY型活性を有する酵素、およびこの酵素をコードするDNA配列を提供する。この酵素は、特に、免疫抑制剤として有用な化合物を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて、有用性を有する。

Description

【発明の詳細な説明】 S-アデノシル-L-ホモシステイン加水分解酵素（AHCY）型活性を有する酵素 本発明は、S-アデノシル-L-ホモシステイン加水分解酵素型の新規な酵素、お よびこの酵素を用いる方法に関する。 背景 S-アデノシル-L-ホモシステイン加水分解酵素（AHCY）は、S-アデノシルメチ オニン代謝の経路に関与する酵素である。S-アデノシルメチオニン（AdoMet）は 、無数の生物学的および生化学的事象において、メチルドナーとして中枢的役割 を果たす。例えば、AdoMetはメチル基を、小分子様のノルエピネフリンに与え、 強力な産物のエピネフリンを生じる；ホスファチジルエタノールアミンのような 中くらいの大きさの分子に与え、最終的に脂質二重層においてホスファチジルコ リンを形成し；RNAおよびDNAに与え、それによって転写プロセスおよび翻訳プロ セスを調節する。AdoMet-依存性メチル化反応は、タンパク質のカルボキシメチ ル化において見られるように、転写後修飾によって生物学的現象を調節すること 、およびおそらく膜リン脂質のメチル化を介して膜機能を調節すること¹⁶が仮定 されてきた。 S-アデノシルホモシステイン（AdoHcy）は、メチルアクセプターへのAdoMetの メチル基の供与後に形成され、次いで、AdoHcy加水分解酵素（AHCY）によって、 アデノシン（Ado）およびホモシステイン（Hcy）に加水分解される。Adoは、Ado デアミナーゼ（ADA）によってイノシンに脱アミノ化されるか、またはAdoデアミ ナーゼによってリン酸化されてAMPになるかのいずれかであり得る。 AHCYの阻害は、AdoMet依存性メチル化反応の強力なインヒビターであるAdoHy の細胞内レベルの増加を生じる^{2 〜4}。AdoHcyはまた、PIキナーゼの拮抗的なイン ヒビターであることが報告されている⁵。PIキナーゼは、PI代謝に必要であり、 またレセプター媒介性の細胞内カルシウムの増加、および細胞膜を介する生化学 的シグナルの伝達に関与する。 出願人はこのたび、AHCY型の新規な酵素を同定した。本発明は、特に、概して 、この酵素、この酵素をコードするDNA、およびこの酵素を用いる方法に関する 。 発明の要旨 それゆえ、第１の局面において、本発明は、図１のアミノ酸配列のアミノ酸17 7〜314を含む、AHCY型活性を有する酵素、または該酵素の機能的部分もしくは機 能的等価物を提供する。 酵素は、図１のアミノ酸配列のアミノ酸183〜614、または１〜614を含むのが 好都合である。 さらに別の局面において、本発明は、上述のAHCY型酵素をコードするDNA配列 を提供し、この配列は、以下からなる群から選択される： （ａ）上述において規定される酵素、またはその機能的部分もしくは機能的等価 物をコードする配列； （ｂ）配列（ａ）の相補である配列； （ｃ）配列(a)の逆相補である配列；および （ｄ）配列（ａ）の逆配列である配列。 好ましくは、配列（ａ）は、図１の配列のヌクレオチド529〜945、図１の配列 のヌクレオチド549〜1844、または図１の配列のヌクレオチド１〜1844を含む。 さらに別の局面において、本発明は、上述で規定されるDNA配列を含むDNA構築 物を提供する。 さらに別の局面において、本発明は、患者において、上述で規定されるAHCY型 酵素の活性を調節する方法を提供し、この方法は、上述で規定されるDNA構築物 を、この患者に投与する工程を包含する。 さらなる局面において、本発明は、試験物質（特に、化合物）の調節潜在力を 測定する方法を提供し、この方法は、上述で規定されるAHCY型酵素の活性を調節 する、この物質の能力を測定する工程を包含する。 試験される調節潜在力は、上述で規定されるAHCY型 酵素を阻害する試験化合物の能力であるのがより好都合である。この方法におい て、免疫抑制剤物質が同定され得る。 さらなる局面において、本発明は、本発明の酵素に特異的な抗体、および必要 に応じて標識された核酸プローブ（上述で規定されるDNA配列に基づく）を提供 する。このような抗体およびプローブは、細胞学的調製物および組織切片におけ る異常なHD細胞を同定する上で、ならびにインサイチュ（in situ）ハイブリダ イゼーションによって、それぞれ、有用性を有する。 図面の説明 本発明は、概して、上記のようであるが、本発明はまた、以下に記載される実 施態様を含むことが理解されよう。特に、当業者には、以下の添付の図面を参照 することによって、本発明がより良好に理解されることが分かるであろう： 図１は、DD4b5.3のcDNAおよび翻訳される推定のアミノ酸配列を示す。全５'ヌ クレオチド配列についての、停止コドンを含まないで伸長するオープンリーディ ングフレームが存在する。開始コドンがさらに同定されるべきである； 図２は、DD4b5.3 AHCYドメインと、ヒト（hm）、マウス（mu）、およびショウ ジョウバエ（dr）の完全長のAHCYアミノ酸配列とのアラインメントである。AHCY 機能に重要であることが分かっているいくつかの保存される特徴が同一である； 図３は、DD4b5.3配列の特徴の要約である； 図４は、異なる白血球集団におけるDD4b5.3 mRNA発現のRT-PCR解析結果を示す 。特異的な内部プローブでプローブされた産物のサザンブロットが示される； 図５は、DD4b5.3 mRNAの発現を試験するための、精製された異なるDC集団のRT -PCR解析の結果を示す。異なるサイクル数での半定量的な分析（エチジューム染 色）が示される； 図６は、AdoMetおよびAco Hcyの代謝サイクルを示す；ならびに 図７は、RAP-PCRプロトコルの要約である。 本発明の説明 樹状細胞の一般的な研究の一部として、出願人は、AHCY型の酵素をコードする 遺伝子を同定した。同定された遺伝子の配列は、AHCY自身の遺伝子配列と共通の 特徴を有することが見出された。 出願人はまた、この遺伝子が、新鮮な血液樹状細胞および培養された血液樹状 細胞において見出されるが、Ｔ細胞白血球またはＢ細胞白血球においては見出さ れないという制限された発現パターンを有することを特定した。それゆえ、この 遺伝子がコードする酵素は、実質的に樹状細胞に制限されると考えられる。外来 抗原に対する一次免疫応答の開始において樹状細胞が果たす中枢的役割ゆえに、 樹状細胞内におけるこの酵素の活性の操作（特に、阻害）は、宿主の免疫応答に 対して直接的な効果を有する。これは、本発明の、主たるものであるが単独では ない用途である。 それゆえ、本発明の利用性の第１の局面において、本発明は、酵素自身を提供 する。上述のように、本発明の酵素はAHCY型活性を有し、図１のアミノ酸配列の アミノ酸177〜314；より好ましくは、図１のアミノ酸配列のアミノ酸183〜614； および最も好ましくは、図１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜614を含む。 本発明はまた、酵素の機能的部分も意図する。本明細書中で使用する場合、酵 素の「機能的部分」とは、代謝工程に作用するのに必須の活性部位を含む部分、 すなわち、１つ以上の反応物を結合し得るか、または反応速度を向上または調節 し得る分子の部分である。活性部位は、１つ以上のポリペプチド鎖に存在する別 々の部分から構成される場合もあり、一般に高い基質特異性を示す。 本発明はまた、上記の酵素の機能的等価物を含む。酵素はタンパク質である。 タンパク質が、元のタンパク質と免疫学的に交差反応する場合、および元のタン パク質と同じ機能を有する場合、そのタンパク質は、特異的機能についてもう１ つ別のタンパク質の機能的等価物とみなされる。等価物は、例えば、タンパク質 のフラグメント、またはタンパク質の置換、付加、もしくは欠失変異体であり得 る。 例えば、従来の技術を用いて、配列中のアミノ酸を等価なアミノ酸で置換する ことが可能である。等価であることが通常知られるアミノ酸の群は以下のとおり である： （ａ）Ala（A）Ser（S）Thr（T）Pro（P）Gly（G）； （ｂ）Asn（N）Asp（D）Glu（E）Gln（Q）； （ｃ）His（H）Arg（R）Lys（K）； （ｄ）Met（M）Leu（L）Ile（I）Val（V）；および （ｅ）Phe（F）Tyr（Y）Trp（W）。 生じる等価的な酵素が、ネイティブな酵素と免疫交差反応性であり、かつネイ ティブな酵素と本質的に同じ機能を有する限り、酵素における置換、付加、およ び／または欠失がなされ得る。 等価的な酵素は、通常、ネイティブな酵素と実質的に同じアミノ酸配列を有す る。別の配列と実質的に同じであるが、１つ以上の置換、付加、および/または 欠失の手段によって他の配列とは異なるアミノ酸配列は、等価な配列であるとみ なされる。ネイティブな酵素のアミノ酸配列において、好ましくは、25％未満、 より好ましくは10％未満、最も好ましくは５%未満の数のアミノ酸残基が、置換 、付加、または欠失される。 本発明の酵素は、最も好都合には組換え技術を用い て生成される。それゆえ、さらなる実施態様において、本発明は本発明の酵素を コードする、もしくは部分的にコードする、単離された完全なDNA配列または部 分的なDNA配列を提供する。具体的には、本発明は、図１の配列のヌクレオチド5 29〜945；549〜1844；または1〜1844を含む、単離されたDNA配列を提供する。こ のような単離されたDNA配列の相補物、このような単離されたDNA配列の逆相補物 、このような単離されたDNA配列の逆配列、このような配列の変異体も提供され る。本発明によって包含されるDNA配列としては、cDNA、ゲノムDNA、組換えDNA 、および全体的にまたは部分的に化学合成されたDNA分子が挙げられる。 本明細書中で使用される、用語「相補物」、「逆相補物」、および「逆配列」 の定義は、以下の例によって最も良好に説明される。配列５'AGGACC３'の場合、 相補物、逆相補物、および逆配列は以下のとおりである： 相補物 ３'TCCTGG５' 逆相補物 ３'GGTCCT５' 逆配列 ５'CCAGGA３'。 本明細書中で使用する場合、用語「変異体」は、本発明の配列に対して少なく とも約70%、より好ましくは少なくとも約90%の同一性を示す任意の配列を含む。 最も好ましくは、「変異体」は、本発明の配列と同じである少なくとも約99％の 確率を有する任意の配列 である。DNA配列についての確率は、コンピューターアルゴリズムFASTA（バージ ョン2.0u4、1996年２月；Pearson W.R．ら、Proc.Natl.Acad.Sci.，85：2444-24 48、1988）によって測定される。 DNA配列は、cDNAライブラリーの高い処理量の配列決定によって単離され得る 。あるいは、配列ID番号４〜6において提供される配列に基づくオリゴヌクレオ チドプローブを合成して、ハイブリダイゼーションまたはPCR技術によって、cDN AライブラリーまたはゲノムDNAライブラリーのいずれかにおいてポジティブクロ ーンを同定するために使用することもできる。プローブは、少なくとも約10の、 好ましくは約15の、最も好ましくは約20の長さのヌクレオチドであるべきである 。このようなオリゴヌクレオチドプローブとともに使用するのに適切なハイブリ ダイゼーション技術およびPCR技術は当該分野において周知である。ポジティブ クローンは、制限酵素消化、DNA配列決定などによって分析され得る。 さらに、本発明のDNA配列は、当該分野において周知の技術を用いた合成手段 によって生成され得る。オリゴヌクレオチドの自動化分析用の装置は、Perkin E lmer/Applied Biosystems Division（Foster City，CA）のような供給者から市 販されており、製造業者の指示に従って操作され得る。 本発明はDNA構築物も提供する。１つの実施態様に おいて、本発明のDNA構築物は、本発明の酵素の少なくとも機能的部分をコード するオープンリーディングフレームを含む。 酵素活性の増幅が所望される適用では、オープンリーディングフレームは、DN A構築物にセンスの方向に挿入され、これによってDNA構築物での形質転換が遺伝 子のコピー数の増加、それゆえ酵素の量の増加をもたらす。活性のダウンーレギ ュレーションが所望される場合、オープンリーディングフレームは、DNA構築物 にアンチセンスの方向に挿入され、それによってDNA配列の転写によって産生さ れるRNAは、内因性mRNA配列に完全に相補的である。その結果、これは遺伝子の コピー数の減少、それゆえ、酵素の量の減少を生じる。あるいは、適切な配列（ 例えば、DNAもしくはRNA）をリボザイム構築物に挿入することによって、調節を 達成することもできる。 第２の実施態様において、DNA構築物は、本発明の酵素をコードする遺伝子の 非コード領域を含むヌクレオチド配列、またはこのような非コード領域に相補的 なヌクレオチド配列を含む。本明細書中で使用する場合、用語「非コード領域」 は、翻訳されない転写される配列と、翻訳される配列またはオープンリーディン グフレームの５'または３'の約2000塩基対内の非転写配列との両方を含む。本発 明の構築物において有用に用いられ得る非コード領域の例としては、イントロン および５'非コードリーダー配列が挙げられる。このようなDNA構築物での形質転 換は、コサプレッションのプロセスによって合成される酵素の量の減少を導き得 る。 本発明のDNA構築物はさらに、転写されるDNA配列に操作可能に連結される遺伝 子プロモーター配列および遺伝子終結配列を含み、これらは遺伝子の発現を制御 する。遺伝子プロモーター配列は、通常、転写されるDNA配列の５'末端に配置さ れ、DNA配列の転写を開始するのに用いられる。遺伝子プロモーター配列は、遺 伝子の５'非コード領域において一般に見出されるが、イントロン（Luehrsen，K .R.，Mol.Gen.Genet．225:81-93，1991）またはコード領域にも存在し得る。構 築物が、オープンリーディングフレームをセンス方向に含む場合、遺伝子プロモ ーター配列はまた、オープンリーディングフレームの翻訳を開始する。アンチセ ンス方向のオープンリーディングフレームまたは非コード領域のいずれかを含む DNA構築物の場合、遺伝子プロモーター配列は、RNAポリメラーゼ結合部位を有す る転写開始部位のみからなる。 本発明のDNA構築物において用いるのに有用な多様な遺伝子プロモーター配列 が当該分野において周知である。プロモーターが宿主において機能的であること を条件として、プロモーター遺伝子配列および遺伝子終結配列は、内因性であっ てもよいし外因性であって もよい。好ましくは、遺伝子プロモーター配列および遺伝子終結配列は本発明の 配列そのものに由来する。 転写されるDNA配列の３'に位置する遺伝子終結配列は、遺伝子プロモーター配 列と同じ遺伝子に由来するか、異なる遺伝子に由来してもよい。当該分野におい て公知の多くの遺伝子終結配列が本発明において有用に用いられ得る。しかし、 好ましい遺伝子終結配列は、元の酵素遺伝子からの配列である。 DNA構築物の構成要素を操作可能に連結するための技術は当該分野において周 知であり、例えば、Maniatisら（Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Co ld Spring Harbor Laboratories，Cold Spring Harbor，NY，1989）によって記 載されるような、１つ以上の制限酵素エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカ ーの使用を含む。本発明のDNA構築物は、少なくとも１つの複製系（例えば、E.c oli）を有するベクターに連結することができるため、各操作後、得られた構築 物をクローン化および配列決定して、操作の正確性を判定することができる。 これまで酵素およびDNA構築物について記載してきたが、今度は以下の制限す ることを意図しない実施例を参照して本発明を説明する。 実施例１ （ａ）酵素をコードする遺伝子の同定 Hodgkins細胞株L428および単球細胞株U937を使用して、ディファレンシャルデ ィスプレイ（DD）技術のRAP-PCRを用いた。RAP-PCRプロトコルは図７に示すとお りであり、以下のようにして行った： L428およびU937細胞株から抽出した全RNA（工程１）を、任意のオリゴヌクレ オチドプライマーを用いて、１本鎖cDNAを合成するために使用した（工程２）。 RT反応のアリコートを、32P標識化dCTPの存在下、同じ任意のプライマーを用い るその後のPCRにおいて使用した。PCRの最初の５サイクルを、40℃の低いアニー リング温度（低ストリンジェンシー）で行って、任意のプライマーとcDNA鋳型と の間にミスマッチを生じさせ（工程３）、次いで、60℃のアニーリング温度（高 ストリンジェンシー）で30サイクル行って、任意のプライマーを組込んだ産物を 特異的に増幅した（工程４）。PCR産物を、非変性配列決定ゲルに電気泳動させ てオートラジオグラフィーに供した。L428レーンに存在するがU937レーンには存 在しないPCR産物を、オートラジオグラムを手引きとして用いて、ゲルから切り 出し（工程５）、そして鋳型として使用して、任意のプライマーを用いて産物を 再増幅した（工程６）。再増幅されたL428特異的バンドを、pBluescriptにクロ ーン化し、そしてDNA配列決定した。 DD4b.5.3と呼ばれる１つのクローンが、本発明の酵素の416bpフラグメントコ ーディング部分を含んでい た。 （ｂ）DD4b5.3の完全長cDNAの単離 DD4b5.3 cDNAフラグメントを使用して、本実験室で生成されたLambda ZAP exp ress（Stratagene）L428 cDNAライブラリーをプローブした。2.2kbのほとんど完 全長のクローンが同定され（6.1222(1)）、これをLI-COR自動化シーケンサーを 用いて配列決定した（図１、ヌクレオチド241-2563）。 cDNA末端の迅速増幅（RACE）を使用して、L428 cDNAを鋳型として用いて、さ らに５' cDNA配列を同定した。RACE産物をクローン化し、配列決定し、さらなる ５'配列を明らかにした。その後、第２のcDNAクローン（2.11(1)b）をL-428ライ ブラリーから単離した。これから別の第１のクローンと５'配列（図１；ヌクレ オチド1〜240）が得られたが、この配列は重なる２つの同一な塩基を有していた 。 核酸配列の比較から、L-アデノシン-Sホモシステイン加水分解酵素（AHCY）と 呼ばれる酵素のcDNA配列との有意な同一性部分が明らかになった。 DD4b5.3のcDNA配列の翻訳は、図１に示されるようなオープンリーディングフ レームを明らかにした。推定のDD4b5.3アミノ酸配列と、ヒト１、マウス（Genba nkアクセス番号L32836）およびショウジョウバエ（Genbankアクセス番号X95636 ）のAHCYの配列と の比較は、AHCY配列の高度な類似を明らかにした（図２）。構造のさらなる解析 を図３に示す。 DD4b5.3は、AHCY関連配列における有意な同一性に基づき、AHCYと類似の酵素 機能を有する。従って、DD4b.5.3は以下を有する： i）Cys¹¹³およびCys¹⁹⁵（AHCYアミノ酸配列（DD4b5.3配列）に基づいて番号付け する）は、保存される。これらの改変は、酵素学的機能に影響を及ぼす¹³。対照 的に、Cys⁴²¹は非必須¹³であり、これはDD4b5.3において置換される（Lys）。 ii）AHCY機能に重要であると同定されたLys⁴²⁶は、DD4b5.3において保存される^{1 4} （図２）。 iii）Ade環結合に関与することが予測されるVal¹⁷⁵およびLys¹⁸⁶は、DD4b5.3に おいて保存される¹⁵。対照的に、同じく関与する¹⁵ことが予測されるVal³¹⁹およ びArg³²⁷は、保存されないが、その間にQVD配列があり、このことは、代替的な 特異性が見込まれ得ることを示唆する。 iv）同じく活性酵素部位に関連するGlu^{197 16}およびセリン¹⁹⁸は、DD4b5.3にお いて保存される。 ｖ）コファクターNAD結合部位¹⁷は、高度に保存され（Lys²¹⁴〜Asp²³⁵）、重要 なG-G--G結合部位は、DD4b5.3に存在する（図２）。 vi）８個のCys残基は、ジスルヒド結合に関与すると考えられる。これらは、哺 乳動物においてテトラマー （約190,000まで）AHCY分子を構成する、４つのサブユニット（約47,000まで） の球状構造を維持することに寄与する。８つのうちの７つは、DD4b5.3アミノ酸 配列において保存される。 実施例２ 組織分布 実験１ 方法 ノザンブロッティング L428細胞株およびU937細胞株から全RNAを抽出し、ホルムアルデヒド変性アガ ロースゲルに電気泳動し、ナイロンメンブレンに写して32P標識化DDクローンで プローブした。 RT-PCR解析 配列データに基づき、クローン特異的オリゴヌクレオチドプライマーを合成し て、RT-PCRによって組織分布を評価した。造血細胞集団の２つのパネルをスクリ ーニングした： １）培養された細胞株。全RNAを細胞株から抽出し、RNアーゼ非含有DNアーゼIで 処理し、そして１本鎖cDNA合成のために使用した。cDNAのアリコートを、特異的 なオリゴヌクレオチドプライマーとのPCRにおいて使用した。 ２）新鮮に単離された細胞。１本鎖cDNA合成を、確立された方法に基づいて、ヒ ト抹消血から単離した全細胞に対して直接行った。鋳型は、500個の精製細胞か らなり、そして全反応をその後のPCRにおいて使用した。 RT-PCR産物を、アガロースゲル電気泳動によって評価した。産物の同一性を、 内部のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションによって確認した。 結果 ノザンブロット解析 ノザンブロット解析は、DD4b.5.3プローブが、L428レーンのみにハイブリダイズ することを示している。 細胞株のRT-PCR解析 L428は、Hodgkin病細胞株であるので、L428から単離されたDD産物は、他のHod gkin細胞株において発現されることが可能である。本発明者らは、RT-PCRによっ て、細胞株パネルにおけるクローンDD4b.5.3の発現を評価した（表１）。結果は 、クローンDD4b.5.3は、異なる細胞株にわたって発現の異なるパターンで発現す ることをを示している。相対的なバンド強度：+++強い、++中程度、+弱い、-バンドは可視化されず。 β２マイクログロブリンcDNAコントロールPCRも行った。 新鮮な細胞のRT-PCR解析 正常な細胞集団におけるディファレンシャルディスプレイクローンの発現をア ッセイするために、RT-PCR を新鮮に単離された細胞に対して行った。結果を表２に要約する。１半ネストPCR エチジュームブロミド染色によって比較された、相対的なバンド強度： ++中程度、+弱い、+/-非常に弱い、-産物は可視化されず。 実験２ i）細胞株 細胞株から得られたRNAを用いるノザンブロット解析は、U937においては検出 されないL428転写物への、 特異的なハイブリダイゼーションを示した。 ii）白血球集団 半定量的RT-PCRを、特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、正常な 白血球細胞集団に由来するcDNA鋳型に対して行った。125個の細胞からのcDNA等 価物を、各反応において使用した（図４）。DD4b5.3RT-PCR（ヌクレオチド529〜 944）の特異性を確認するために、産物（416bp）をナイロンメンブレン上にブロ ットし、そして内部ディグオキシゲニン（digoxigenin）（Boehringer Manheim ）標識化オリゴヌクレオチドでプローブした。コントロールβ２マイクログロブ リンのRT-PCR解析により、鋳型完全性を確認した。 １時間の暴露後、活性化DC（レーン２）および新鮮なDC（レーン１）において 、豊富なDD4b5.3メッセージが観察された。いくつかの他の白血球集団において わずかな発現が見られたが、それは延長された60分間の暴露後のみであった。 iii）DC系統 推定のDC分化/活性化経路を説明するために、一連の異なるDC集団からのcDNA 鋳型を用いてRT-PCRを行った。（図５）。一定範囲のサイクル数を用いて、各タ イプのDC集団におけるDD4b5.3 RNA情況の評価を得た 。増加されたレベルのDD4b5.3 mRNAは、血液組織および非リンパ球組織に由来す るDCの分化/活性化と関連していたが、DD4b5.3 mRNAは、「成熟した」扁桃腺DC においてはほとんど検出されなかった。 結論 本発明の酵素は、樹状細胞に制限される発現パターンを有する。 産業上の利用性 ヒトAHCYとのDD4b5.3の有意なアミノ酸同一性は、DD4b5.3が関連する酵素学的 機能を有すること（すなわち、AHCY型であること）を示唆する（図６における酵 素４を参照のこと）。（AdoMet）の回転（turn-over）は組織間で異なるので、 おそらく、異なる細胞型は、図６に示す経路または他の経路について、異なるAH CY様酵素を発現し得ると思われる。DD4b5.3は、DCにおいてこのような機能を有 し得る。DCにおけるDD4b5.3の比較的選択的な発現、およびDC分化/活性化のある 段階でのDD4b5.3のアップレギュレーションは、DD4b5.3がDC機能に重要であり得 ることを示唆する。 酵素の新規なＮ末端配列は、特定の細胞内区画にDD4b5.3を局在化することに 関与するか、または調節ドメインとして作用し他のタンパク質に結合することに よって、その酵素学的機能を調節する上で役割を果たし得る。 それゆえ、本発明の酵素は、多くの潜在的な利用性を有する。その中には、免 疫調節（すなわち、宿主の免疫応答の操作）が含まれる。酵素はまた、その活性 に対して刺激効果または阻害効果のいずれかを有する物質（通常、化合物）を同 定するためのスクリーニングプログラムにおける利用性を有する。より好ましく は、プログラムは、酵素活性を阻害する試験化合物の能力に関して、試験化合物 の免疫抑制潜在力を決定することに関する。 この方法において、上述のWolosら、Journal of Immunology（1993）に概説さ れる手順と同一または類似の手順を、用いることができる。酵素活性に対する試 験化合物の効果をスクリーニングするための他の従来の手順も使用してもよい。 この方法において同定された試験化合物は、複数の潜在的な利用性を有する。 AHCY自身は、多くのヌクレオシドによって阻害され得る^2,6-9。化合物MDL28,8 42は、免疫抑制性であることが報告されている。これは、ヒト抹消血単核細胞の Con AおよびPWM誘導性の増殖を阻害した¹⁰。MDL28,842は、Con A誘導性のマウス Ｔリンパ球増殖を阻害したが、LPS誘導性のＢ細胞増殖は阻害せず、またＴリン パ球IL-2およびIL-2R産生を減少させた¹⁰。インビボ で、MDL28,842は、Ｔリンパ球依存性の抗原オバルブミンに対するマウスの抗体 応答を阻害した¹⁰。この化合物は、マウスにおけるコラーゲン誘導性の関節炎を 防止した¹¹。６日間、５mg/kg/日腹腔内での投与は、皮膚移植片の生存を、コン トロールにおける8.7日に比較して、12.2日に延長したが、これはシクロスポリ ンＡを５mg/kg/日用いた場合に得られた結果よりもすぐれた結果である¹²。これ はまた、ラットにおいて心臓同種移植片拒絶を阻害することもできる¹²。 本発明の酵素を阻害する化合物についても等価な利用性が、ありそうである。 酵素DD4b5.3の活性を阻止または阻害することはまた、以下の潜在的な利用性 を生じさせる： DD4b5.3の阻害は、DC機能（例えば、移動、抗原取込み、抗原プロセシング、 およびＴリンパ球の提示または同時刺激）を阻止し得る。これは、大いに免疫抑 制性であり得る。DD4b5.3は、DD4b5.3の機能を阻害するタンパク質¹⁷ヌクレオシ ドアナログまたは他の設計された化合物とし て発現されてもよい。選択的な機能阻害についての先例は、マクロファージIL-1 合成を阻害するが、Ｔリンパ球増殖を阻害しないAHCY阻害化合物C3 adoの使用に よって示される¹⁸。 DCに対して選択的な阻害効果を有する、インビボでの使用が安全な薬剤の同定 （類似の化合物が、重要な 副作用を伴わずに動物に与えられていることに注意のこと）することにより、重 要な新規の免疫抑制薬物の設計が可能になる。これは、あらゆる形態の移植およ び自己免疫疾患において応用できるであろう。 DD4b5.3酵素機能を阻止することは、逆の機能を有し得ること、すなわちそれ らの機能的能力を高める場合があることが（理論的に）可能でる。従って、DD4b 5.3化合物は、例えば、感染性疾患に対するワクチン接種について、またはガン の免疫療法について、免疫刺激特性を有するかもしれない。 DD4b5.3を阻止することは、DC増殖および分化を改変し、治療学的使用のため にDCの回収を容易にできることも考えられる。 本発明の酵素はまた、例えば、KohlerおよびMilsteinの方法（Kohler，G.およ びMilstein，C.，Nature 256 495-497(1975)）によって抗体を生成するために使 用され得る。本発明の酵素の制限された発現に起因して、このような抗体は、細 胞学的調製物および組織切片においてDCを同定する上で潜在的な有用性を有する 。Hodkins疾患における異常な細胞は、DCに類似する多くの特徴を有する。この 酵素は、HD細胞株において発現され、この酵素を発現する異常な細胞（Reed Ste rnberg細胞および関連のHodgkin細胞）の同定は、Hodgkin病²⁰のような異常の診 断において価値がある。 本発明のDNA配列あるいはその任意の部分を、インサイチュハイブリダイゼー ションによって異常なHD細胞を判別するためのプローブとして使用することもで きる。核酸プローブの使用は、例えば、Maniatisら"Molecular Cloning:A Labor atory Manual"、Cold Spring Harbour(1982)において記載されるように、標準的 である。 他の適用としては、以下のものが挙げられる： DD4b5.3配列は、DC機能を抑制して、上記の潜在的な成果を達成する、アンチ センス（アンチmRNA）試薬を設計するために使用され得る。 AHCY様配列のＮ末端方向の新規なアミノ酸配列は、分子機能を調節す るために、適切な細胞内部位へ化合物を標的する（例えば：DD4b5.3の他のイン ヒビターを標的する）ために使用され得る。 さらなるＮ末端配列を有する新規なAHCY様配列の同定は、このような AHCY様酵素の拡張されたファミリーが存在し得ることを示唆する。DD4b5.3のcDN A配列は、一連の標準的な分子生物学技術によって、このファミリーの他のメン バーをスクリーニングするために使用され得る。 当業者は、もちろん、上述の記載は例としてのみ提供され、本発明はそれらに 制限されないことを理解するであろう。

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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．図１のアミノ酸配列のアミノ酸177〜314を含む、AHCY型活性を有する酵素、 または該酵素の機能的部分もしくは機能的等価物。 ２．請求項１に記載の酵素であって、図１のアミノ酸配列のアミノ酸183〜614を 含む酵素。 ３．請求項１に記載の酵素であって、図１のアミノ酸配列のアミノ酸１〜614を 含む酵素。 ４．以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む単離されたDNA配列 ： （ａ）請求項１に記載の酵素、またはその機能的部分もしくは機能的等価物をコ ードする配列； （ｂ）配列（ａ）の相補である配列； （ｃ）配列（ａ）の逆相補である配列；および （ｄ）配列（ａ）の逆配列である配列。 ５．請求項４に記載のDNA配列であって、前記配列（ａ）が、図１の配列のヌク レオチド529〜945を含むDNA配列。 ６．請求項４に記載のDNA配列であって、前記配列（ ａ）が、図１の配列のヌクレオチド549〜1844を含むDNA配列。 ７．請求項４に記載のDNA配列であって、前記配列（ａ）が、図１の配列のヌク レオチド１〜1844を含むDNA配列。 ８．請求項４から７のいずれかに記載のDNA配列を含むDNA構築物。 ９．５'−３'の方向に以下を含む、DNA配列： （ａ）遺伝子プロモータ配列； （ｂ）請求項１に記載の酵素の少なくとも機能的部分をコードするオープンリー ディングフレーム；および （ｃ）遺伝子終結配列。 １０．請求項９に記載のDNA構築物であって、前記オープンリーディングフレー ムが、センス方向にある構築物。 １１．請求項９に記載のDNA構築物であって、前記オープンリーディングフレー ムが、アンチセンス方向にある構築物。 １２．５'−３'の方向に以下を含むDNA構築物： （ａ）遺伝子プロモータ配列； （ｂ）請求項１に記載の酵素をコードする遺伝子の非コード領域；および （ｃ）遺伝子終結配列。 １３．請求項１に記載の酵素の活性を患者において調節するための方法であって 、請求項８から12のいずれかに記載のDNA構築物を該患者に投与する工程を包含 する方法。 １４．請求項１に記載の酵素の活性を患者において増幅する方法であって、請求 項１０に記載のDNA構築物を該患者に投与する工程を包含する方法。 １５．請求項１に記載の酵素の活性を患者において抑制する方法であって、請求 項１１または１２に記載のDNA構築物を該患者に投与する工程を包含する方法。 １６．請求項１に記載の酵素に対する、化合物の調節潜在力を測定するための方 法であって、該酵素の活性を調節する該化合物の能力を測定する工程を包含する 方法。 １７．請求項１に記載の酵素を結合する抗体。 １８．図１のヌクレオチド配列に、高いストリンジェンシー下で、ハイブリダイ ズし得る、必要に応じて標識される核酸プローブ。