JPH05219959A

JPH05219959A - 新規なｄｎａおよびそれによってコードされる蛋白質

Info

Publication number: JPH05219959A
Application number: JP4028090A
Authority: JP
Inventors: Juichi Osada; 重一長田
Original assignee: Osaka Bioscience Institute
Current assignee: Osaka Bioscience Institute
Priority date: 1992-02-14
Filing date: 1992-02-14
Publication date: 1993-08-31

Abstract

(57)【要約】【構成】マウスＦａｓ蛋白質をコードする新規なＤＮ
Ａを、マウスマクロファ−ジ細胞株ＢＡＭ３細胞から調
製したｃＤＮＡライブラリ−をヒトＦａｓｃＤＮＡ断片
でスクリーニングすることにより得た。該ＤＮＡによっ
てコードされている成熟蛋白質は３０６アミノ酸からな
り、分子量は約３５，０００であって、アミノ酸配列で
ヒトＦａｓ蛋白質と４９．３％の相同性を示した。【効果】実験動物を用いてのＦａｓ蛋白質の遺伝子の
構造や、該蛋白質が発現制御に果たす機能の解析等の細
胞生物学的な研究を行うこと、および遺伝子工学を利用
してマウスＦａｓ蛋白質を大量生産し、医学、薬学分野
での基礎並びに応用研究を推進することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業の利用分野】本発明は新規な塩基配列を有するＤ
ＮＡおよびそれによってコードされる新規な蛋白質に関
する。詳しくは、ヒトＦａｓ蛋白質の機能的同族体であ
ると考えられるマウスのＦａｓ遺伝子およびそれによっ
てコードされるマウスのＦａｓ蛋白質に関する。

【０００２】

【従来技術】本発明に係わるＦａｓ蛋白質は、それ単独
で培養ヒト細胞に細胞障害を惹起するモノクローナル抗
体の認識する細胞表面抗原として見いだされたものであ
る［ヨネハラら（Yonehara, S., et al.）, J. Exp. Me
d. 169 ( 5 ) 1747-1756, 1989 ］。その後ヒトＦａｓ
蛋白質はその遺伝子がクローニングされ、その蛋白質と
しての構造についての詳細が明かとなった［イトウら
（Itoh, N., et al.）,Cell 66 ( 2 ) 233-243, 199
1］。すなわち、ヒトＦａｓ蛋白質は３１９アミノ酸か
ら成る膜貫通型蛋白質で、腫瘍壊死因子受容体や神経成
長因子受容体と構造的に類似性を示す一群の蛋白質の１
つであることが判明した。また、このヒトＦａｓ蛋白質
を細胞表面に発現するように遺伝子工学的に形質転換さ
せたマウス培養細胞は、前述のモノクローナル抗体の処
理により障害を受ける（死滅する）ようになることが確
認された［Itoh, N., et al., Cell 66 (2) 233-243, 1
991］。

【０００３】さらにこの細胞障害の過程は「アポトーシ
ス」と呼ばれる細胞死の過程と極似していることが明か
となった。「アポトーシス」とは細胞死の１つの態様
で、例えばカエル幼生の尾の組織やヒト胎児指間組織の
退縮、自己成分反応性Ｔ細胞の消失、神経細胞ネットワ
ークの形成あるいは正常白血球や単球の代謝（turnove
r）の過程に見られ、予めプログラム化された細胞死で
あると考えられている。従って、Ｆａｓ蛋白質はこのよ
うな細胞の生死の制御系に深く関与していることが予想
され、このＦａｓ蛋白質の機能の解析は、細胞生物学の
ような基礎学問分野のみならず、医学・薬学のような応
用分野にも新たな知見をもたらすことができると考えら
れている。一般的に高等生物の種々の生命現象を研究す
るためには、in vitro、in situ、in vivo などの方法
があるが、個体レベルでの現象を総合的に研究するには
実験動物を用いた in vivo 研究が最も好ましい。

【０００４】しかしながら、現在Ｆａｓ蛋白質の実体
が、蛋白質レベルおよび遺伝しレベルで明かとなってい
るのはヒトのみである。周知のことながら、ヒト細胞や
ヒト個体を用いた研究には限度があり、このような条件
下ではＦａｓ蛋白質の持つ機能の充分な解析は到底不可
能であり、細胞生物学分野のみならず、医学・薬学分野
にとっても重大な問題である。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、Ｆａｓ蛋白
質の機能を実験的により詳細に検討し、その結果を医学
や薬学分野に還元するために有用なヒト以外の実験動物
のＦａｓ蛋白質を同定することを目的とする。一般的に
使用される実験動物、例えばマウス、ラット、モルモッ
ト、ウサギ、イヌやサルなどにヒトＦａｓ蛋白質に相当
する物質が存在するならば、ヒト細胞やヒト個体を使用
した場合より、より様々な、且つ、より詳細な実験検討
が可能となり、その機能解析にとって非常に有用であ
り、そこから得られる知見はヒトＦａｓ蛋白質の機能を
推定する上で非常に重要である。

【０００６】

【課題を解決する為の手段】以上のような現状に鑑み、
本発明者らは現在最も一般的に使用されている実験動物
種の１つであるマウスを用いて、ヒトＦａｓ蛋白質に相
当する物質の同定について鋭意研究を重ねてきた。その
結果、マウスのＦａｓ蛋白質をコードする遺伝子を単離
することに成功し、その結果を基に本発明を完成させ
た。

【０００７】すなわち、本発明の第１の態様は、マウス
のＦａｓ蛋白質をコードする新規な塩基配列を有するＤ
ＮＡを提供するものである。具体的には、配列表の配列
番号１に示したＤＮＡ塩基配列を提供する。本発明のＤ
ＮＡは、それと完全に一致する既知のマウスの遺伝子塩
基配列は存在せず、新規なものである。なお、本発明の
ＤＮＡを有するプラスミドｐＭＦ１によって形質転換さ
れた大腸菌株（Ｅscherichia coli ｐＭＦ１）は通商産
業省工業技術院微生物工業技術研究所に寄託された（受
託番号：微工研菌寄第１２７５２号；受託日：平成４年
２月１０日）。

【０００８】本発明のマウスＦａｓ蛋白質をコードする
ＤＮＡを得るには、本明細書の開示に基づいてその一部
あるいは全部を合成すればよい。固相法等の一般的なポ
リヌクレオチド合成法が適用できるが、市販のＤＮＡ合
成装置を用いることもできる。しかしながら、マウスＦ
ａｓ蛋白質をコードするＤＮＡを得るには、マウスＦａ
ｓ蛋白質のｍＲＮＡを得た後、そのｃＤＮＡとして得る
のが好適である。マウスＦａｓ蛋白質ｍＲＮＡは、Ｆａ
ｓ蛋白質を発現している細胞株、例えばマウスマクロフ
ァージ様細胞株ＢＡＭ３、マウス線維芽細胞株Ｌ９
２９、またはＦａｓ蛋白質を発現している組織、例えば
心臓、肝臓、胸腺、卵巣等より常法に従い抽出すること
ができる。得られたｍＲＮＡより常法に従い、ｃＤＮＡ
ライブラリーを得ることができる。例えば市販のλｇｔ
１０またはλｇｔ１１を用いたｃＤＮＡライブラリーと
して得ることができる。また、市販のマウス組織ｃＤＮ
Ａライブラリーとしても入手可能である。

【０００９】得られたマウスｃＤＮＡライブラリーより
本発明のマウスＦａｓ蛋白質ｃＤＮＡをスクリーニング
するには、すでにクローニングされているヒトＦａｓ蛋
白質のｃＤＮＡを用いることができる。例えば、本出願
人の出願にかかる特願平３−１２５２３４号に記載のヒ
トＦａｓ蛋白質をコードするｃＤＮＡを適当な制限酵素
認識部位、例えばＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ等で切断し、適
当な長さのＤＮＡ断片を得、次いでこれらの断片を放射
標識した後プローブとして用いることにより、上記ｃＤ
ＮＡライブラリーより目的のｃＤＮＡを選択することが
できる。このヒトＦａｓ蛋白質をコードするｃＤＮＡの
ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片のヌクレオチド配列は配列表
の配列番号３に示されている。

【００１０】また配列番号１に示されたＤＮＡ配列を基
に、ＰＣＲプライマー、例えば、センスプライマーとし
てＤＮＡ番号３０番から５９番目、アンチセンスプライ
マーとして１０１４番から１０４３番目をＤＮＡ合成装
置等を用いて合成し、マウスＦａｓ蛋白質が発現してい
る組織、例えば心臓、肝臓、胸腺、卵巣等、あるいはマ
ウスＦａｓ蛋白質を発現している細胞株、例えばマウス
マクロファージ様細胞株ＢＡＭ３、マウス線維芽細胞株
Ｌ９２９より常法に従い抽出したｍＲＮＡをテンプレー
トにして常法に従いＰＣＲを行うことによりマウスＦａ
ｓ蛋白質をコードする塩基配列を得ることができる。

【００１１】一方、Ｆａｓ蛋白質を発現しているマウス
細胞でラットを免疫し、モノクローナル抗体を作製し、
次いで得られたモノクローナル抗体より上記マウス細胞
に障害性を示すモノクローナル抗体を選択し、この抗体
を用いて上述のλｇｔ１１ｃＤＮＡライブラリーをスク
リーニングすることにより本発明の塩基配列を有するｃ
ＤＮＡを得ることができる。得られた本発明のマウスＦ
ａｓ蛋白質ｃＤＮＡは、常法に従い、例えばチェーンタ
ーミネーション法によりその塩基配列を決定することが
できる。

【００１２】遺伝子工学の技術分野では、それがコード
するアミノ酸配列を変化させることなくその塩基配列中
の塩基を別の塩基配列と置換することが可能であること
が知られている。すなわち、ほとんどのアミノ酸は複数
個の遺伝暗号でコードされており、例えばＶal はＧ
ＴＴ、ＧＴＡ、ＧＴＣ、ＧＴＧの何れか、Ａla はＧＣ
Ａ、ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＧの何れかで各々コードされ
る。従って本発明の遺伝子塩基配列は、このような遺伝
暗号の縮重に伴う塩基配列の置換変異体も包含する。ま
た本発明が開示されれば、この塩基配列にコードされる
蛋白質の形質転換体での産生量を増大させるためにその
５’末端側にプロモーターやエンハンサーといった塩基
配列を付加することや、（転写後のｍＲＮＡを安定化さ
せるために）３’末端側にＰoly Ａ付加シグナル塩基配
列を付加すること、あるいは本発明の塩基配列にコード
される蛋白質のより深い機能解析のための、部分的にそ
のアミノ酸を欠失あるいは付加した変異蛋白質を得るた
めに、本発明の塩基配列内に塩基の欠失や挿入を行うこ
となどは当業者にとっては極めて容易なことである。従
って、本発明の塩基配列の５’末端側や３’末端側およ
び／またはそれらの間に１つ以上の塩基の付加、欠失、
挿入を有する塩基配列も本発明の塩基配列に包含され
る。さらに本発明のＤＮＡは、本発明のＤＮＡに相補的
なＤＮＡ、本発明のＤＮＡと相補的なＤＮＡにハイブリ
ダイズするＤＮＡおよびヒトＦａｓ蛋白質ｃＤＮＡ断片
と遺伝子工学的にハイブリダイズするＤＮＡをも包含す
る。

【００１３】本発明の第２の態様は、本発明のＤＮＡに
よってコードされる蛋白質を提供するものである。これ
は今までその存在が不明であったマウスのＦａｓ蛋白質
である。本発明のマウスＦａｓ蛋白質は、ヒトＦａｓ蛋
白質の機能的同族体と定義される。すなわち、マウスＦ
ａｓ蛋白質を特異的に認識するモノクローナル抗体によ
って認識され、補体等の他の細胞障害性因子の存在なし
にその抗体のみで細胞にアポプトーシスを惹起せしめる
細胞表面蛋白質である。具体的には配列表の配列番号２
に示したアミノ酸配列を有する蛋白質を提供する。現在
の当該科学分野の技術水準をもってすれば、当該蛋白質
の基本的な性質（物性、活性、免疫学的活性等）を変化
させることなく、そのアミノ酸配列に欠失、付加あるい
は置換といった変異を導入することは容易に考え得る。
例えば、疎水性アミノ酸残基の他の疎水性アミノ酸残基
への置換、陽性電荷を持つアミノ酸の他の陽性電荷を持
つアミノ酸への置換、ＧluとＡspあるいはＬysとＨisと
Ａrgでの相互置換、またはＩle、Ｖal、Ｍet、Ｌeuの群
間、Ｇly、Ａla、Ｓer、Ｃysの群間、およびＴrp、Ｔy
r、Ｐheの群間での置換は充分に推定できる。さらに本
発明の蛋白質の精製を容易にする為に本蛋白質のＮ末端
側やＣ末端側に別の蛋白質、例えば大腸菌のβ−ガラク
トシダーゼ、マウスＩｇＧＦｃフラグメントを遺伝子
工学的手法等を用いて付加すること、あるいは本蛋白質
の機能をより深く解析する為に同様の方法を用いてアミ
ノ酸配列の一部を欠失、置換することなどは当業者にと
って極めて容易である。従って、このようなマウスＦａ
ｓ蛋白質アミノ酸変異体も本発明に包含される。

【００１４】本発明のマウスＦａｓ蛋白質は、本明細書
に開示のアミノ酸配列に基づいてメリフィールド法のよ
うな標準的なポリペプチド合成を行うことによって得る
ことができる。あるいはマウスＦａｓ蛋白質を発現して
いる組織や細胞、例えば心臓、肝臓、胸腺、卵巣等、ま
たはサイトカイン類やＬＰＳでＦａｓ蛋白質の発現を誘
導した細胞株などから得ることができる。しかしなが
ら、本発明のマウスＦａｓ蛋白質を得るには、本発明の
ｃＤＮＡ塩基配列を用いて遺伝子工学的に得るのが好ま
しい。すなわち、本発明のマウスＦａｓ蛋白質のｃＤＮ
Ａを、それを発現させ得るようなプロモーターを有する
ベクターの制御領域下流に挿入し、それを用いて適当な
細胞を形質転換させ、その形質転換体を培養後、その細
胞体あるいは培養上清よりマウスＦａｓ蛋白質を回収す
るのがよい。例えば、ＳＶ４０プロモーターやＥlongat
ion factor１αのプロモーターの下流にマウスＦａｓ蛋
白質ｃＤＮＡや遺伝子を連結し、動物細胞、例えばＣＯ
Ｓ細胞、ＣＨＯ細胞等に導入することにより容易にＦａ
ｓ蛋白質をそれらの細胞膜上に得ることができる。ま
た、トリプトファンプロモーターやラクトースプロモー
ターの下流に連結し、大腸菌に導入することにより容易
にマウスＦａｓ蛋白質を大腸菌内に得ることができる。
さらにマウスＦａｓ蛋白質に、蛋白工学的手法を適用す
ることにより、各種変異体を得ることができ、これら変
異体も本発明の範囲である。また細胞外領域のみを有す
る可溶型のマウスＦａｓ蛋白質、あるいはアミノ酸欠
失、置換、挿入の生じたＦａｓ蛋白質を得ることもでき
る。例えば可溶型蛋白質として配列表の配列番号２記載
のアミノ酸番号１から１４８までを有する蛋白質を得る
ことができる。それらは点突然変異法あるいはＰＣＲ法
を用いて遺伝子工学的に容易に達成できる。

【００１５】また、マウス細胞表面より抽出精製したＦ
ａｓ蛋白質のアミノ酸配列をアミノ酸シークエンサーに
より決定することによりＦａｓ蛋白質を化学合成するこ
とも可能であり、遺伝子配列より推測されるアミノ酸配
列に基づき化学合成することも可能である。以上のよう
にして産生されたマウスＦａｓ蛋白質は常法に従って単
離精製することができる。例えば一般的に用いられてい
る塩析、酸・アルカリ沈澱法、限外ろ過法、イオン交換
クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎
水クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、各種
クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、クロマトフォーカシン
グ、超遠心分離法、免疫沈澱法、電気泳動法等を適宜組
み合わせることによって実施できる。

【００１６】

【実施例】以下に本発明を実施例をもってより具体的に
示すが、これは本発明の実施様態の一つの例示であり、
本発明はこれに限定されるものではない。なお、実施例
中の学術用語、略語等は特に断らない限り当該技術分野
で一般的に使用されているものに従った。また、遺伝子
組換えに関わる基本的操作は、文献記載の方法［サムブ
ルックら（Sambrook, J. et al.) “Molecular Clonin
g,A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laborato
ry 2nd ed. 1989］を参考として実施した。各種機器お
よび試薬の使用法は各々、附属の使用説明書に従った。

【００１７】実施例１マウスマクロファ−ジ細胞株Ｂ
ＡＭ３細胞ｃＤＮＡライブラリ−の作製マウスマクロファ−ジ細胞株ＢＡＭ３細胞（佐賀医科大
学大木博士より分与）を１０％ウシ胎児血清を含有す
るダルベッコ改変イ−グル培地にて３７℃、５％ＣＯ₂
下で培養した。１０μｇ／ｍｌのＬＰＳを添加後、さら
に２４時間培養した。次いでＢＡＭ３細胞を遠心により
集めた。ＢＡＭ３細胞のＲＮＡをＡＧＰＣ法［チョモジ
ンスキイら（Chomczynski,P. et al.）, Anal.Biochem.
162 1561987］により抽出した。すなわち、溶液Ｄ（４
Ｍグアニジンオキシアネ−ト、２５ｍＭクエン酸ナトリ
ウム（ｐＨ７．０）、０．５％（Ｗ／Ｗ）ザルコシル、
０．１Ｍβ−メルカプトエタノ−ル）を加え、ＢＡＭ３
細胞を溶解後、１／１０量の２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ
４．０）、等量の水飽和フェノ−ル、１／５量のクロロ
ホルム・イソアミルアルコ−ル（４９：１）混液を添加
した。１５分間氷冷後、１００００ｇにて２０分間遠心
し、水層を分離した。等量のイソプロパノ−ルを添加
し、−２０℃にて、１時間放置した後、８０００ｇにて
２０分間遠心した。沈澱を溶液Ｄに溶解し、等量のイソ
プロパノ−ルを添加後、−２０℃にて、１時間放置し
た。１００００ｇにて２０分間遠心し、得られた沈澱を
８０％エタノ−ルで洗浄した後、終濃度として０．５ｍ
ＭＥＤＴＡに溶解した。

【００１８】この溶液を７０℃、１０分間インキュベ−
トした後、終濃度として２００ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）、４００ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭＥ
ＤＴＡとなるように調製した。つづいて、２００ｍＭ
Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、４００ｍＭＮａＣ
ｌ、２０ｍＭＥＤＴＡで平衡化したＯｌｉｇｏ（ｄ
Ｔ）セルロ−スカラムにアプライした。１００ｍＭＴ
ｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭＮａＣ
ｌ，１０ｍＭＥＤＴＡでカラムを洗浄後、滅菌水に
て、ポリＡ⁺ ＲＮＡを溶出した。エタノ−ル沈澱後、ポ
リＡ⁺ ＲＮＡを０．５ｍＭＥＤＴＡに溶解した。

【００１９】２本鎖ｃＤＮＡの合成はグプラ−ホフマン
法［ナガタら（Nagata.S.et al.）,Nature 319 415 198
6］により実施した。すなわち、ポリＡ⁺ ＲＮＡとＯｌ
ｉｇｏ（ｄＴ）プライマ−を混合後、基質と逆転写酵素
とを添加することにより一本鎖ｃＤＮＡを合成した。次
いで基質とＥ．ＣｏｌｉＲＮａｓｅＨ、Ｅ．Ｃｏｌｉ
ＤＮＡポリメラ−ゼＩを添加することにより二本鎖ｃ
ＤＮＡを合成した。

【００２０】二本鎖ｃＤＮＡは、ＥｃｏＲＩメチレ−ス
によりＥｃｏＲＩ認識部位をメチル化後、ＥｃｏＲＩリ
ンカ−をライゲ−ションした。４℃、１６時間インキュ
ベ−トした後、ＥｃｏＲＩで切断し、低融点アガロ−ス
ゲルを用いて電気泳動を行った後、７００ｂｐ以上の二
本鎖ｃＤＮＡをゲルより回収した。二本鎖ｃＤＮＡと、
末端が脱リン酸化されたλｇｔ１１ア−ム（stratagene
社製）とをライゲ−ション後、in vitro パッケ−ジン
グを実施した。大腸菌Ｙ１０９０に感染させることによ
り、３．２ｘ１０⁶ プラ−クフォ−ミングユニットより
成るｃＤＮＡライブラリ−を作製した。

【００２１】実施例２マウスＦａｓ蛋白質ｃＤＮＡの
スクリ−ニングマウスＦａｓ蛋白質ｃＤＮＡのスクリ−ニングは、実施
例１で調整したＢＡＭ３ｃＤＮＡライブラリ−をヒトＦ
ａｓｃＤＮＡ断片［ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片約０．５
ｋｂ（配列表の配列番号３）：イトウら（Itoh，N.et a
l.）CELL 66 233 1991］をプロ−ブに用いて、常法の
プラ−クハイブリダイゼ−ション法により実施した。ｃ
ＤＮＡクロ−ンを大腸菌Ｙ１０９０とともにＬＢプレ−
トにまいた後、４２℃、１２時間培養した。ニトロセル
ロ−スフィルタ−にプラ−クを写しとった後、アルカリ
処理、次いでＵＶ照射することにより、ファ−ジＤＮＡ
をフィルタ−に固定した。フィルタ−をプレハイブリダ
イゼ−ション処理の後、ランダムラベル法により、³²Ｐ
標識したヒトＦａｓｃＤＮＡプロ−ブと２８℃、１６時
間ハイブリダイゼ−ションを実施した。

【００２２】フィルタ−は、２ｘＳＳＣ（１ｘＳＣＣ：
１５０ｍＭＮａＣｌ／１５ｍＭＮａ₃ −Ｃｉｔｒａｔ
ｅ（ｐＨ７．０））／０．１％ＳＤＳ溶液中で室温で３
０分間２回洗浄した。次いで、１ｘＳＳＣ／０．１％Ｓ
ＤＳにて３７℃、３０分間３回洗浄した。次いで、オ−
トラジオグラフィ−を行った。６５万個のｃＤＮＡクロ
−ンより５つの陽性クロ−ンを選択し、大腸菌Ｙ１０９
０に感染させた後、ファ−ジＤＮＡを回収した。ファ−
ジＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断後、挿入されているｃＤＮ
Ａ鎖長をアガロ−ス電気泳動により確認した。最も鎖長
の長いｃＤＮＡ断片を有するファ−ジＤＮＡをＥｃｏＲ
Ｉで切断後、低融点アガロ−スゲルを用いて電気泳動
し、ｃＤＮＡ断片を回収した。ベクタ−としてプラスミ
ドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（Stratagene社製）を
ＥｃｏＲＩで切断後、ウシ小腸アルカリフォスファタ−
ゼにより末端を脱リン酸化した。ベクタ−とｃＤＮＡと
をライゲ−ション後、大腸菌ＤＨ５αをトランスフォ−
メ−ションすることにより、ｃＤＮＡをサブクロ−ニン
グした。得られた目的のプラスミドをｐＭＦ１と命名し
た。

【００２３】実施例３マウスＦａｓｃＤＮＡ塩基配列
の決定マウスＦａｓｃＤＮＡ塩基配列をチェ−ンタ−ミネ−シ
ョン法により決定した。その配列を配列表の配列番号１
に示す。マウスＦａｓ蛋白質ｃＤＮＡは、３２７アミノ
酸をコ−ドしており、２１アミノ酸からなるシグナル配
列を有していた。成熟蛋白は３０６アミノ酸からなり、
分子量は約３５，０００であって、アミノ酸配列でヒト
Ｆａｓ蛋白質と４９．３％の相同性を示した。また、１
７アミノ酸よりなる細胞膜貫通領域が存在していた。こ
の膜貫通領域を境に１４８アミノ酸よりなる細胞外領域
と１４１アミノ酸よりなる細胞内領域が存在していた。
この塩基配列から導かれるアミノ酸配列を配列表の配列
番号２に示す。

【００２４】

【発明の効果】本発明のＤＮＡおよびそのＤＮＡによっ
てコードされる蛋白質が本明細書に開示されたことの、
基礎的学問分野あるいは応用的産業分野に及ぼす効果を
以下に述べる。本発明のＤＮＡの少なくともその一部を
用いることにより、それに対応するｍＲＮＡの発現組織
の種類やその発現量について検討することができる。こ
の結果は、それによってコードされる蛋白質の生体内で
の機能を推定する上で、非常に有用な情報となる。ま
た、この塩基配列の少なくともその一部を用いることに
より、マウスＦａｓ蛋白質ゲノムＤＮＡを単離すること
ができる。この結果は、Ｆａｓ遺伝子の構造解析やその
発現制御機序を推定する上で重要な情報を与える。ま
た、Ｆａｓ蛋白質遺伝子の遺伝子多型の検討にも本発明
の配列を用いることができ、遺伝性疾患とＦａｓとの相
関について詳細な検討が可能となる。もちろん、マウス
以外の実験動物種のＦａｓ蛋白質に相当する遺伝子を単
離する為のプローブとしても本発明のＤＮＡを使用する
ことができる。

【００２５】近年では、高等動物の配偶子や発生初期胚
に対して、相同遺伝子組換え現象等を起こさせることに
より、人為的に特定の遺伝子の発現を増強、あるいは抑
制させた動物を作出する技術、いわゆるトランスジェニ
ック動物技術が実施されつつあるが、本発明のＤＮＡは
このような技術にも応用することができる。Ｆａｓ遺伝
子の発現を増強あるいは抑制したマウスは新たな疾患モ
デル動物となる可能性が推定される。さらにはこれらの
動物を用いたＦａｓ蛋白質遺伝子やＦａｓ蛋白質と疾患
との相関の検討や、新規医療用治療剤の開発も可能であ
る。

【００２６】本発明のＤＮＡを用いることにより、マウ
スＦａｓ蛋白質を遺伝子工学的手法によって大量に生産
することができる。このように産生されたＦａｓ蛋白質
はその機能解析に有用であるばかりでなく、抗血清やモ
ノクローナル抗体作製にも用いることができる。この抗
血清やモノクローナル抗体はＦａｓ蛋白質の血中や組織
中での分布あるいはその動態の解析に有用で、ひいて
は、各種疾患との相関を検討することにより、免疫学的
診断を可能とする。

【００２７】また、大量に生産されたＦａｓ蛋白質を用
いることにより、Ｆａｓ蛋白質と結合する蛋白質の遺伝
子をクローニングすることもできる。マウス組織、例え
ば胎盤の発現ライブラリーに対し、マウスＦａｓ蛋白質
との結合性を指標にしてＦａｓ蛋白質と結合する蛋白質
のｃＤＮＡをクローニングすればよい。この時、可溶化
Ｆａｓ蛋白質を用いることがより好ましい。得られたｃ
ＤＮＡを組換え技術を用いた発現系に応用することでＦ
ａｓ蛋白質と結合する蛋白質を得ることができる。ある
いは、マウスＦａｓ蛋白質を担体、例えばＤＥＡＥ−セ
ファロースに結合することによりアフィニティーカラム
を作製することができる。この時、可溶型Ｆａｓ蛋白質
を用いることがより好ましい。マウスの血清や尿をクロ
マトグラフすることにより、マウスＦａｓ蛋白質と結合
する蛋白質を得ることもできる。精製した蛋白質のアミ
ノ酸配列を指標にそのｃＤＮＡをクローニングすること
も可能である。例えば、ＰＣＲプライマーを合成し、マ
ウス組織、例えば胸腺や骨髄リンパ球よりＲＮＡを抽出
し、ＲＴ−ＰＣＲ法によりｃＤＮＡをクローニングする
ことができる。

【００２８】Ｆａｓ蛋白質に結合するものは、上記のよ
うな蛋白質のみではないことが推定される。従って、本
発明の蛋白質はそれと反応する天然あるいは人工合成分
子を検索することにも用いることができる。このような
検索で得られた物質は、Ｆａｓ蛋白質のアゴニストやア
ンタゴニストとして用いることが可能で、新規な医薬品
開発に対する重要な情報を提供する。また、Ｆａｓ蛋白
質の細胞外から細胞内への、および細胞内での２次、３
次の刺激信号伝達機序を検討することにより、その伝達
機序に作用するアゴニストやアンタゴニストの検索に用
いることができる。

【００２９】アポプトーシスは、自己成分反応性Ｔ細胞
の消失過程にも見られることより、Ｆａｓ蛋白質は関節
リウマチやＳＬＥのような自己免疫疾患の病態と深く関
連していることが予想され、上記のアゴニスト、アンタ
ゴニストはこのような疾患に対する治療薬となりうる。
このようなことは本発明の蛋白質のアミノ酸変異体につ
いても同様に考えられることは言うまでもない。

【００３０】

【配列表】配列番号：１配列の長さ：９８４配列の型：核酸鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ起源生物名：マウス細胞の種類：マクロファージセルライン：ＢＡＭ３配列 ATGCTGTGGA TCTGGGCTGT CCTGCCTCTG GTGCTTGCTG GCTCACAGTT AAGAGTTCAT 60 ACTCAAGGTA CTAATAGCAT CTCCGAGAGT TTAAAGCTGA GGAGGCGGGT TCATGAAACT 120 GATAAAAACT GCTCAGAAGG ATTATATCAA GGAGGCCCAT TTTGCTGTCA ACCATGCCAA 180 CCTGGTAAAA AAAAAGTTGA GGACTGCAAA ATGAATGGGG GTACACCAAC CTGTGCCCCA 240 TGCACAGAAG GGAAGGAGTA CATGGACAAG AACCATTATG CTGATAAATG CAGAAGATGC 300 ACACTCTGCG ATGAAGAGCA TGGTTTAGAA GTGGAAACAA ACTGCACCCT GACCCAGAAT 360 ACCAAGTGCA AGTGCAAACC AGACTTCTAC TGCGATTCTC CTGGCTGTGA ACACTGTGTT 420 CGCTGCGCCT CGTGTGAACA TGGAACCCTT GAGCCATGCA CAGCAACCAG CAATACAAAC 480 TGCAGGAAAC AAAGTCCCAG AAATCGCCTA TGGTTGTTGA CCATCCTTGT TTTGTTAATT 540 CCACTTGTAT TTATATATCG AAAGTACCGG AAAAGAAAGT GCTGGAAAAG GAGACAGGAT 600 GACCCTGAAT CTAGAACCTC CAGTCGTGAA ACCATACCAA TGAATGCCTC AAATCTTAGC 660 TTGAGTAAAT ACATCCCGAG AATTGCTGAA GACATGACAA TCCAGGAAGC TAAAAAATTT 720 GCTCGAGAAA ATAACATCAA GGAGGGCAAG ATAGATGAGA TCATGCATGA CAGCATCCAA 780 GACACAGCTG AGCAGAAAGT CCAGCTGCTC CTGTGCTGGT ACCAATCTCA TGGGAAGAGT 840 GATGCATATC AAGATTTAAT CAAGGGTCTC AAAAAAGCCG AATGTCGCAG AACCTTAGAT 900 AAATTTCAGG ACATGGTCCA GAAGGACCTT GGAAAATCAA CCCCAGACAC TGGAAATGAA 960 AATGAAGGAC AATGTCTGGA GTGA 984

【００３１】

【配列表】配列番号：２配列の長さ：３２７配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：蛋白質起源生物名：マウス細胞の種類：マクロファージセルライン：ＢＡＭ３配列 Met Leu Trp Ile Trp Ala Val Leu Pro Leu Val Leu Ala Gly Ser Gln 5 10 15 Leu Arg Val His Thr Gln Gly Thr Asn Ser Ile Ser Glu Ser Leu Lys 20 25 30 Leu Arg Arg Arg Val His Glu Thr Asp Lys Asn Cys Ser Glu Gly Leu 35 40 45 Tyr Gln Gly Gly Pro Phe Cys Cys Gln Pro Cys Gln Pro Gly Lys Lys 50 55 60 Lys Val Glu Asp Cys Lys Met Asn Gly Gly Thr Pro Thr Cys Ala Pro 65 70 75 80 Cys Thr Glu Gly Lys Glu Tyr Met Asp Lys Asn His Tyr Ala Asp Lys 85 90 95 Cys Arg Arg Cys Thr Leu Cys Asp Glu Glu His Gly Leu Glu Val Glu 100 105 110 Thr Asn Cys Thr Leu Thr Gln Asn Thr Lys Cys Lys Cys Lys Pro Asp 115 120 125 Phe Tyr Cys Asp Ser Pro Gly Cys Glu His Cys Val Arg Cys Ala Ser 130 135 140 Cys Glu His Gly Thr Leu Glu Pro Cys Thr Ala Thr Ser Asn Thr Asn 145 150 155 160 Cys Arg Lys Gln Ser Pro Arg Asn Arg Leu Trp Leu Leu Thr Ile Leu 165 170 175 Val Leu Leu Ile Pro Leu Val Phe Ile Tyr Arg Lys Tyr Arg Lys Arg 180 185 190 Lys Cys Trp Lys Arg Arg Gln Asp Asp Pro Glu Ser Arg Thr Ser Ser 195 200 205 Arg Glu Thr Ile Pro Met Asn Ala Ser Asn Leu Ser Leu Ser Lys Tyr 210 215 220 Ile Pro Arg Ile Ala Glu Asp Met Thr Ile Gln Glu Ala Lys Lys Phe 225 230 235 240 Ala Arg Glu Asn Asn Ile Lys Glu Gly Lys Ile Asp Glu Ile Met His 245 250 255 Asp Ser Ile Gln Asp Thr Ala Glu Gln Lys Val Gln Leu Leu Leu Cys 260 265 270 Trp Tyr Gln Ser His Gly Lys Ser Asp Ala Tyr Gln Asp Leu Ile Lys 275 280 285 Gly Leu Lys Lys Ala Glu Cys Arg Arg Thr Leu Asp Lys Phe Gln Asp 290 295 300 Met Val Gln Lys Asp Leu Gly Lys Ser Thr Pro Asp Thr Gly Asn Glu 305 310 315 320 Asn Glu Gly Gln Cys Leu Glu End 325 327

【００３２】

【配列表】配列番号：３配列の長さ：１００８配列の型：核酸鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ起源生物名：ヒト細胞の種類：Ｔリンパ腫細胞セルライン：ＫＴ−３配列ＡＴＧＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡＣＣＣＴＣＣＴＡＣＣＴＣＴＧＧＴＴ
ＣＴＴＡＣＧＴＣＴＧＴＴＧＣＴＡＧＡＴＴＡＴＣＧＴＣＣ６０ＡＡＡＡＧＴＧＴＴＡＡＴＧＣＣＣＡＡＧＴＧＡＣＴＧＡＣＡＴＣＡＡＣ
ＴＣＣＡＡＧＧＧＡＴＴＧＧＡＡＴＴＧＡＧＧＡＡＧＡＣＴ１２０ＧＴＴＡＣＴＡＣＡＧＴＴＧＡＧＡＣＴＣＡＧＡＡＣＴＴＧＧＡＡＧＧＣ
ＣＴＧＣＡＴＣＡＴＧＡＴＧＧＣＣＡＡＴＴＣＴＧＣＣＡＴ１８０ＡＡＧＣＣＣＴＧＴＣＣＴＣＣＡＧＧＴＧＡＡＡＧＧＡＡＡＧＣＴＡＧＧ
ＧＡＣＴＧＣＡＣＡＧＴＣＡＡＴＧＧＧＧＡＴＧＡＡＣＣＡ２４０ＧＡＣＴＧＣＧＴＧＣＣＣＴＧＣＣＡＡＧＡＡＧＧＧＡＡＧＧＡＧＴＡＣ
ＡＣＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＣＡＴＴＴＴＴＣＴＴＣＣＡＡＡ３００ＴＧＣＡＧＡＡＧＡＴＧＴＡＧＡＴＴＧＴＧＴＧＡＴＧＡＡＧＧＡＣＡＴ
ＧＧＣＴＴＡＧＡＡＧＴＧＧＡＡＡＴＡＡＡＣＴＧＣＡＣＣ３６０ＣＧＧＡＣＣＣＡＧＡＡＴＡＣＣＡＡＧＴＧＣＡＧＡＴＧＴＡＡＡＣＣＡ
ＡＡＣＴＴＴＴＴＴＴＧＴＡＡＣＴＣＴＡＣＴＧＴＡＴＧＴ４２０ＧＡＡＣＡＣＴＧＴＧＡＣＣＣＴＴＧＣＡＣＣＡＡＡＴＧＴＧＡＡＣＡＴ
ＧＧＡＡＴＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＴＧＣＡＣＡＣＴＣＡＣＣ４８０ＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＴＧＣＡＡＡＧＡＧＧＡＡＧＧＡＴＣＣＡＧＡ
ＴＣＴＡＡＣＴＴＧＧＧＧＴＧＧＣＴＴＴＧＴＣＴＴＣＴＴ５４０ＣＴＴＴＴＧＣＣＡＡＴＴＣＣＡＣＴＡＡＴＴＧＴＴＴＧＧＧＴＧＡＡＧ
ＡＧＡＡＡＧＧＡＡＧＴＡＣＡＧＡＡＡＡＣＡＴＧＣＡＧＡ６００ＡＡＧＣＡＣＡＧＡＡＡＧＧＡＡＡＡＣＣＡＡＧＧＴＴＣＴＣＡＴＧＡＡ
ＴＣＴＣＣＡＡＣＣＴＴＡＡＡＴＣＣＴＧＡＡＡＣＡＧＴＧ６６０ＧＣＡＡＴＡＡＡＴＴＴＡＴＣＴＧＡＴＧＴＴＧＡＣＴＴＧＡＧＴＡＡＡ
ＴＡＴＡＴＣＡＣＣＡＣＴＡＴＴＧＣＴＧＧＡＧＴＣＡＴＧ７２０ＡＣＡＣＴＡＡＧＴＣＡＡＧＴＴＡＡＡＧＧＣＴＴＴＧＴＴＣＧＡＡＡＧ
ＡＡＴＧＧＴＧＴＣＡＡＴＧＡＡＧＣＣＡＡＡＡＴＡＧＡＴ７８０ＧＡＧＡＴＣＡＡＧＡＡＴＧＡＣＡＡＴＧＴＣＣＡＡＧＡＣＡＣＡＧＣＡ
ＧＡＡＣＡＧＡＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＣＴＴＣＧＴＡＡＴ８４０ＴＧＧＣＡＴＣＡＡＣＴＴＣＡＴＧＧＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＧＣＧＴＡＴ
ＧＡＣＡＣＡＴＴＧＡＴＴＡＡＡＧＡＴＣＴＣＡＡＡＡＡＡ９００ＧＣＣＡＡＴＣＴＴＴＧＴＡＣＴＣＴＴＧＣＡＧＡＧＡＡＡＡＴＴＣＡＧ
ＡＣＴＡＴＣＡＴＣＣＴＣＡＡＧＧＡＣＡＴＴＡＣＴＡＧＴ９６０ＧＡＣＴＣＡＧＡＡＡＡＴＴＣＡＡＡＣＴＴＣＡＧＡＡＡＴＧＡＡＡＴＣ
ＣＡＡＡＧＣＴＴＧＧＴＣＴＡＧ１００８

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列表の配列番号３に示したヒトＦａｓ
蛋白質をコードするＤＮＡ配列と相補的な塩基配列を有
するＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項２】配列表の配列番号３に示したヒトＦａｓ
蛋白質をコードするＤＮＡ配列と相補的な塩基配列を有
するＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡがコードするア
ミノ酸配列を有する蛋白質あるいはポリペプチド。
【請求項３】配列表の配列番号３に示したヒトＦａｓ
蛋白質をコードするＤＮＡ配列と相補的な塩基配列を有
するＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡを発現させるこ
とによって得られる蛋白質またはポリペプチド。
【請求項４】配列表の配列番号１に示す塩基配列と相
補的な塩基配列を有するＤＮＡとハイブリダイズするＤ
ＮＡ。
【請求項５】配列表の配列番号１に示す塩基配列と相
補的な塩基配列を有するＤＮＡとハイブリダイズするＤ
ＮＡがコードするアミノ酸配列を有する蛋白質あるいは
ポリペプチド。
【請求項６】配列表の配列番号１に示す塩基配列と相
補的な塩基配列を有するＤＮＡとハイブリダイズするＤ
ＮＡを発現させることによって得られる蛋白質あるいは
ポリペプチド。
【請求項７】配列表の配列番号１に示す塩基配列を有
するＤＮＡ。
【請求項８】配列表の配列番号１に示す塩基配列と相
補的なＤＮＡ。
【請求項９】配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列
を有する蛋白質あるいはポリペプチド。