JPH07289297A - 癌抑制遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 癌の原因遺伝子を同定し、該遺伝子およびそ
れがコードする蛋白質を用いて癌の治療薬・診断薬を提
供することにある。 【構成】 ヒト第１１番染色体について詳細な遺伝子地
図を作製し、多発性内分泌腺腫瘍１型家系の患者の腫瘍
組織に共通の決失領域を同定し、リンケージ解析により
原因遺伝子を単離構造決定した。このＤＮＡは転写因子
と相同性を有することから、新しい癌抑制遺伝子である
ことが期待される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はヒト癌抑制遺伝子、それ
がコードするポリペプチドおよび該遺伝子を用いる遺伝
子解析方法に関し、医薬の分野で利用される。

【０００２】

【従来の技術】癌の発症には細胞の遺伝子の変異が重要
な役割を演ずるという考え方は古くから知られている。
近年の遺伝子工学の発達は特定ＤＮＡの増幅や癌細胞に
おける遺伝子変異の解析を可能にし、癌研究の分野にお
いても飛躍的な発展をもたらした。これまでに細胞の癌
化、癌細胞の異常増殖に関与すると考えられている癌遺
伝子の解析、同定が進み、その数は数十に及んでいる。
一方これと反対に作用する癌抑制遺伝子がここ数年脚光
を浴びており、これまでに癌抑制遺伝子として、網膜芽
細胞腫のＲｂ遺伝子（Friend,S.H.et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA.84, 9095, 1987)、大腸癌の p53遺伝
子（Lane,D.P. et al., Nature, 278, 261, 1979) およ
び APC遺伝子( Kenneth,W.K., et al, Science 253, 6
61, 1991)、 Wilms 腫瘍の WT1遺伝子(Call,K.M. et a
l., Cell, 60, 509, 1990) などが発見されており、 p53
遺伝子の場合には、変異遺伝子を germ-lineを通じて
伝えている家系がある（”Li-Fraumeni 症候群”(Maki
n, D. et al, Science 250, 1233, 1990; Srivastava,
S. et al, Nature 348, 747, 1990 ) ）ことが知られて
いるが、 さらに多くの未同定の癌抑制遺伝子が存在する
ものと考えられている。

【０００３】多発性内分泌腺腫瘍症１型（ MEN1 ）は、
副甲状腺、膵ラ氏島、下垂体などの内分泌臓器に腫瘍も
しくは過形成を生じる常染色体優性の遺伝性疾患であ
る。ヒト第１１番染色体長腕（１１ｑ）には、その疾患
家系を通じて伝えられている変異遺伝子の存在が推定さ
れており、また患者の腫瘍組織において高頻度に欠失し
ている領域が知られている。このことから、この部位に
MEN1 の発症に関わる癌抑制遺伝子が存在すると考えら
れる。このため、その癌抑制遺伝子の単離、疾病におけ
る役割の解明、生物学的機能の解明は、今や世界中の医
師や研究者の関心を集めており、この領域の癌抑制遺伝
子が早急に単離されることが切望されていた。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、新規な癌抑
制遺伝子、該遺伝子がコードする蛋白質、さらにそれら
を用いた癌の研究、検査、診断、治療の方法を提供する
ことにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ヒト第１
１番染色体について多数の RFLP マーカーを含むコスミ
ドクローンを単離し、詳細な遺伝子地図を作成した。こ
の多数の RFLP マーカーを用いて、MEN1患者の腫瘍組織
に共通の欠失領域を同定し、さらに患者家系のリンケー
ジ解析から目的の癌抑制遺伝子の存在すべき領域を絞っ
た。その結果11q13 にこれらに共通の領域が特定され
た。この領域のコスミドクローンからエクソン部分を含
むものを選別し、その断片をプロ−ブとしてｃＤＮＡラ
イブラリーをスクリーニングした結果、ヒトウィルムス
腫瘍抑制遺伝子（WT1 ）産物やヒトearly growth respo
nce protein 2 ( EGR2 )などの転写因子と相同性のある
アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡが単離された。生物
はさまざまな外因性、あるいは内因性の刺激に対し、神
経系・免疫系・循環系そして内分泌系などを動員して特
異的な応答を示す。入力された情報は、いわゆる情報伝
達系を利用したり、あるいは直接核内に入ることによ
り、遺伝子あるいは転写調節因子に作用し、遺伝子の発
現を変化させ、細胞を分化、増殖（癌化）、あるいは死
滅といった方向に向かわせる。そもそも生物が発生して
形態形成を行う過程、あるいは生命を維持すること自
体、遺伝子発現のカスケードが動く結果にすぎず、生物
を生物たらしめる具現化の手段が「転写を中心とする遺
伝子発現の協調」であり、癌はこの協調の乱れによると
いっても過言ではない。

【０００６】そこで我々は、このクローンを癌抑制遺伝
子の１つであると考え、その全長ｃＤＮＡの単離構造解
析の結果、全長ｃＤＮＡのコードする蛋白は核移行シグ
ナル、Proline-richドメイン、Zinc Finger モチーフを
有し、核内の転写調節因子であることが判明した。すな
わち本発明は、（１）配列番号１で表されるＤＮＡの、
全部または一部を含むものからなるＤＮＡ、（２）配列
番号１で表されるＤＮＡがコードするポリペプチドの、
全部または一部を含むものからなるポリペプチド、
（３）配列番号１で表されるＤＮＡの全部または一部を
発現可能なプラスミドに組み込み、それで形質転換され
た宿主細胞、（４）上記ポリペプチドを抗原とする抗
体、（５）配列番号１で表されるＤＮＡ配列の一部を含
むＤＮＡをプライマー、プローブまたはマーカーとして
使用し、被検ＤＮＡとハイブリダイズさせることを特徴
とする遺伝子解析方法に関する。

【０００７】これらＤＮＡとポリペプチドに関しては、
それと実質的に同等であるものも本発明に含まれる。実
質的に同等であるとは、構成塩基または構成アミノ酸の
削除、変換、付加、挿入などにより修飾されたもの、あ
るいはその誘導体を意味し、もとのものと同じ効果を発
現するＤＮＡまたはポリペプチドを意味する。この際、
効果の大小は関係しない。またＤＮＡの一部とは、１０
個以上の塩基配列からなる断片を意味する。例えば、Ｄ
ＮＡ断片をプライマ−として用いる場合、通常１０〜３
０個の塩基配列からなる断片が用いられ、１５〜２５個
の塩基配列からなる断片を用いるのが好ましい。また、
ＤＮＡ断片をプロ−ブとして用いる場合、通常１５個以
上の塩基配列からなる断片が用いられるが、２０個以上
の塩基配列からなる断片を用いるのが好ましい。ポリペ
プチドの一部とは、少なくとも６個のアミノ酸配列から
なるペプチドを意味する。例えば、ポリペプチドの一部
を抗体作成用の抗原として用いる場合、あるいは抗体検
出用のエピト−プとして使用する場合、６個のアミノ酸
配列からなるペプチドが抗体と結合することは公知であ
る（公表特許公報 60-500684号）。通常１０個以上のア
ミノ酸配列からなるペプチドが用いられ、２０個以上の
アミノ酸配列からなるペプチドを用いるのが好ましい。
６個のアミノ酸配列からなるペプチドでは抗体産生の効
率は良くないと予想されるが、融合ペプチドとして利用
することも可能である。さらに本発明は、配列番号１に
表されるＤＮＡから翻訳されるＲＮＡまたはその一部を
含むものからなるＲＮＡ、またはそれと実質的に同等で
あるＲＮＡも含まれる。以下に本発明を詳細に説明す
る。

【０００８】（１）ｃＤＮＡの単離 ヒト第１１染色体の目的のコスミド・ライブラリーは、
例えばヒト第１１番染色体だけを含むヒトーマウスの雑
種細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、常法（Maniatis,T.
et al., Molecular Cloning 2nd.ed., Cold Spring Har
bor LaboratoryPress, N.Y.1989) により雑種細胞のゲ
ノムＤＮＡ断片を pWE15などのベクターに組み込むこと
により作成することができる。ヒト染色体由来のインサ
ートを持つクローンは全ヒトＤＮＡをプローブとしてコ
ロニーハイブリダイゼーションを行って選び出すことが
できる。こうして得られるヒト第１１染色体由来ＤＮＡ
を含むコスミド・クローンについて、蛍光in situ ハイ
ブリダイゼーション（FISH）法（Takahashi et al, Am.
J.Hum.Genet. 86,14-16,1990）により、染色体上の局在
を決定し、染色体地図を作成することができる。また、
ヒトのＤＮＡをいくつかの制限酵素を用いて切断したパ
ネルを用いて RFLP を単離することができる（Nakamura
et al, Am.J.Hum.Genet. 43,854-859,1988 ）。このう
ち、11q13 付近に存在するクローンを FISH 法やリンケ
ージ解析に用いることによって、さらに詳しい遺伝子地
図の作成を行う。この地図をもとに、 RFLP を利用して
患者癌組織のＤＮＡについてヘテロ接合性の消失（ LO
H; loss of heterozygosity）を調べ、目的の癌抑制遺
伝子の存在部位をさらに限局化することができる。この
限局化された領域のコスミド・クローンよりエクソン・
トラッピング法（Buckler A, et al, Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 88,4005-4009,1991）によって発現されて
いる遺伝子断片を単離することができる。更にこのよう
にして得られた遺伝子断片をプローブとして用いること
により、ヒト第１１番染色体のｑ１３の限局化された領
域に存在する遺伝子のｃＤＮＡをクローニングすること
ができる。

【０００９】（２）遺伝子の全構造の確認 塩基配列の構造は、マキサム・ギルバ−ト法（ Maxam,
A.M. and Gilbert,W.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74
,560,1977 )あるいはジデオキシ法( Messing,J.,Nucle
ic Acid Res.,9, 309,1981 )によって決められる。上記
の方法によって得られるｃＤＮＡは 5' RACE法、3' RAC
E 法、Northernブロッティングなどによって全蛋白翻訳
領域を含んでいることを確認できる。

【００１０】（３）組換え発現ベクターとその形質転換
体 上記記載の方法により得られた癌抑制遺伝子ｃＤＮＡを
適切なベクターに組み込み、該ベクターを適切な宿主細
胞に移入することにより形質転換体を得ることができ
る。これを常法により培養し培養物より癌抑制遺伝子を
大量に生産することができる。癌抑制遺伝子ｃＤＮＡを
その発現に適したベクターのプロモーター下流に制限酵
素とＤＮＡリガーゼを用いる公知の方法により再結合し
て組換発現ベクターを作成することができる。使用でき
るベクターとしては、例えば大腸菌由来のプラスミド p
RB322, pUC18，枯草菌由来のプラスミド pUB110,酵母菌
由来のプラスミド pRB15，バクテリオファージλgt10，
λgt11あるいは SV40 などが挙げられるが宿主内で複
製、増幅可能なベクターであれば特に限定されない。プ
ロモーターおよびターミネーターに関しても癌抑制遺伝
子をコードする塩基配列の発現に用いられる宿主に対応
したものであれば特に限定されず、宿主に応じて適切な
組み合わせも可能である。用いるｃＤＮＡは癌抑制遺伝
子産物をコードするＤＮＡであれば何れでも良く、また
化学合成によって合成されたものでも良い。さらに発現
される蛋白質が癌細胞増殖抑制の生理活性を有するもの
ならば、配列番号１記載の塩基配列に限定されるもので
はなく、塩基配列の一部が置換、欠損、挿入、あるいは
これらが組み合わされた塩基配列を有するＤＮＡであっ
てもよい。このようにして得られた組換え発現ベクター
はコンピテント細胞法（J. Mol.Biol., 53, 154, 197
0）、プロトプラスト法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
75, 1929, 1978）、リン酸カルシウム法（Science, 22
1, 551, 1983)、インビトロパッケージング法（Proc. N
atl, Acad. Sci. USA, 72, 581, 1975)、ウイルスベク
ター法（Cell, 37, 1053, 1984）などにより宿主に導入
し、形質転換体が作製される。宿主としては大腸菌、枯
草菌、酵母および動物細胞などが用いられ、得られた形
質転換体はその宿主に応じた適切な培地中で培養され
る。培養は通常20℃〜45℃、pH５〜８の範囲で行われ、
必要に応じて通気、攪拌が行われる。培養物からの癌抑
制遺伝子産物の分離・精製は公知の分離・精製法を適宜
組み合わせて実施すれば良い。これらの公知の方法とし
ては塩析、溶媒沈殿法、透析ゲル濾過法、電気泳動法、
イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマ
トグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィーなどが
挙げられる。

【００１１】（４）抗体の作成 癌抑制遺伝子産物を抗原として抗体を作成する。 ポリ
クローナル抗体は常法に従い例えばマウス、モルモッ
ト、ウサギ等の動物の皮下、筋肉内、腹腔内、静脈に複
数回接種し十分に免疫した後、斯かる動物から採血、血
清分離し抗体を作製する。なお、市販のアジュバントも
使用できる。モノクローナル抗体は公知の方法により作
製し得る。たとえば、癌抑制遺伝子で免疫したマウスの
脾細胞と市販のマウスミエローマ細胞との細胞融合によ
り得られるハイブリドーマを作成後、該ハイブリドーマ
培養上清、または該ハイブリドーマ投与マウス腹水から
モノクローナル抗体を調製することができる。抗原とす
る癌抑制遺伝子産物は全アミノ酸構造を有する必要はな
く、部分構造を有するペプチド、その産物、修飾された
ペプチド、誘導体あるいは他のペプチドとの融合ペプチ
ドであってもよく、調製法は生物学的手法、化学合成手
法いずれでもよい。これら抗体はヒト生体試料中の本発
明ポリペプチドの同定や定量を可能とし、該ポリペプチ
ドが関係する疾患の診断試薬などへの応用が期待され
る。本ポリペプチドの免疫学的測定法は、公知の方法に
準ずればよく、たとえば蛍光抗体法、受身凝集反応法、
酵素抗体法などいずれの方法においても実施できる。

【００１２】（５）ヒト生体組織の遺伝子解析 遺伝子解析される生体試料はヒト正常組織、各種ヒト癌
組織をはじめヒト血液、体液、分泌物などを用いること
ができる。ＤＮＡの抽出、調製は, たとえば（Sato T.,
et al., Cancer Res.,50,7184,1990）の方法で行う。本
発明により提供されるＤＮＡ塩基配列の中から適切な位
置の塩基配列を適宜選択し、その配列またはそれに相補
的な配列の合成オリゴヌクレオチドをプライマー、プロ
ーブあるいはマーカーとして用いることによりヒトにお
ける該遺伝子の変異の有無、変異の形態を解析すること
ができる。また、試料中の該遺伝子における挿入、欠失
などの異常もこれらの解析により検知することができ
る。選択する塩基配列の部位は該遺伝子のいずれの部分
も選択し得る。また用いる塩基配列を人為的に改変した
ものを用いることができるのは言うまでもなく、これに
より対応する遺伝子変異を検出することができる。解析
の方法としては、例えば選ばれた２種の配列のプライマ
ーによりＰＣＲ法で部分配列を増幅させ、増幅産物の塩
基配列を直接解析するか、あるいはこの増幅産物を前記
と同様にプラスミドに組み込み、宿主細胞を形質転換さ
せて培養し、得られるクローンの塩基配列を解析するこ
とができる。あるいはまた、LigaseChain Reaction 法
も増幅に利用することができる（Wu et al.,Genomics,
4,560-569,1989 ）。さらに、アレル特異的 PCR（Ruano
and Kidd,Nucleic Acid Research,17,8392,1989 ）、A
RMS法（C.R.Newton et al.,Nucleic Acid Research,17,
2503-2517,1989 ）を利用することにより試料中の該遺
伝子の特定の変異を検出することができる。また同様
に、選ばれたＤＮＡ配列あるいはこれに由来するＲＮＡ
配列を含むプローブを用いて、 SSCP 法（Orita et a
l.,Proc. Natl.Acad.Sci.USA,86,2766-2770,1989）（Ge
nomics,5,874-879,1989 ）、RNase-Protection法により
点突然変異の検出を行うことができる。またこれらのプ
ローブを用いることにより、サザンハイブリダイゼーシ
ョン法での試料中の該遺伝子の変異の検出、ノーザンハ
イブリダイゼーション法での試料中の該遺伝子の発現量
の異常を検出することができる。なお、この癌抑制遺伝
子のｃＤＮＡを含むプラスミドを保有するEscherichiac
oli DH5αF'/pAB1,pFL2,pCE9 は通商産業省工業技術院
生命工学工業技術研究所に寄託番号FERM P-14127,1412
8,14129 として平成６年２月８日寄託され、平成６年１
２月９日、FERM BP-4923、4924、4925として国際寄託され
た。

【００１３】

【発明の効果】本発明のＤＮＡは転写因子と相同性を持
つ構造を有し、 MEN1 患者の腫瘍組織に共通の欠失領域
を起源とすることから新しい癌抑制遺伝子として期待さ
れる。該ＤＮＡは遺伝子治療のツ−ルとして、またその
ＤＮＡ断片は該ＤＮＡ遺伝子解析に利用され、該ＤＮＡ
が関係する疾患の診断に利用できる。該ＤＮＡがコ−ド
するポリペプチドは研究試薬としてまた抗体作成に利用
され、その抗体は生体試料の該ポリペプチドの定性、定
量に用いることで新しい診断試薬として期待される。

【００１４】

【実施例】以下の実施例により本発明を詳細かつ具体的
に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるも
のではない。 実施例１．１１番染色体特異的コスミドクローンの単離
とリンケージ解析 MEN1の発症に関わる遺伝子は当初ＰＹＧＭ（ｍｕｓｃｌ
ｅ ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ
ｇｅｎｅ）マーカーとのリンケージから１１番染色体長
腕に存在することが示され（Ｌａｒｒｓｏｎ ｅｔ ａ
ｌ， Ｎａｔｕｒｅ ３３２，８５−８７，１９８
８）、次いで 11q13の D11S149と INT2 のマーカーの間
の12cMの領域に存在することが示された（Nakamura et
al, Am.J.Hum.Genet. 44,751-755,1989 ）。我々はヒト
第１１番染色体のみを含むチャイニーズハムスター／ヒ
トハイブリッド細胞株よりコスミドライブラリーを作製
し、全ヒトＤＮＡをプローブとしてヒトゲノムＤＮＡを
含むコスミドクローンを選別した（Tokino et al, Am.
J.Hum.Genet. 48,258-268,1991; Tanigami et al, Am.
J.Hum.Genet. 50,56-64,1992）。これらのクローンの染
色体上の位置をヒト第１１番染色体の一部のみを含むハ
イブリッド細胞株パネルとのハイブリダイゼーション
（Tanigami et al, Am.J.Hum.Genet. 50,56-64,1992 ）
および蛍光in situ ハイブリダイゼーション（ FISH ）
（Hori et al, Genomics, 13, 129-133,1992）によって
マッピングした。これらのうち、 RFLP を検出できるマ
ーカーを利用し、リンケージ解析によって MEN1 遺伝子
の存在部位を１１番染色体q13 上 D11S480（cCI11-319
)から D11S546（ cCI11-363 )に至る８ｃＭの領域に限
局した（Fujimori et al, Am.J.Hum.Genet. 50,399-40
3,1992 ）（図１）。

【００１５】実施例２． MEN1 における１１番染色体
の欠失地図の作成 一方、 MEN1 に関連する腫瘍組織における第１１番染色
体のヘテロ接合性の消失（LOH ）の検討からもこの領域
に癌抑制遺伝子が存在することが示唆され（Friedman e
t al, N.Engl.J.Med. 321,213-218,1989; Thakker et a
l, N.Engl.J. Med. 321,218-224,1989; Bale et al, Ca
ncer Res. 51,1154-1157,1991 ）、さらに、これらの腫
瘍の１１ｑの欠失領域のマッピングからＭＥＮ１遺伝子
が PYGMのテロメア側に存在することが示された（Bystr
oem et al, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,1968-1972,199
0）。 LOHの検討の結果とリンケージ解析の結果を統合
するとPYGMと D11S546の間、約３ｃＭの領域にＭＥＮ１
遺伝子が存在すると考えられた（図１）。

【００１６】実施例３． 11q13 領域の物理的地図の作
製 われわれはヒトゲノムＤＮＡを希な切断点を持つ制限酵
素８種で切断し、パルスフィールドゲル電気泳動でＤＮ
Ａ断片を分離し、11q13 に存在する５０個以上のコスミ
ドクローンをプローブとしたサザンブロット解析を行
い、共通のゲノムＤＮＡ断片にハイブリダイズすること
を指標としてコスミドクローン間の相互の位置関係を明
らかにした。その結果、cCI11-4 ，cCI11-367 ，cCI11-
364,cCI11-247 ，cCI11-363 ，cCI11-254 ，PYGMは互い
に関連したゲノムＤＮＡ断片とハイブリダイズし、ゲノ
ム上、PYGMよりテロメア側約１Ｍｂ内の範囲に存在する
ことが明らかとなった（Tanigami et al, Genomics 13,
21-24,1992）。このうち、PYGMとcCI11-4 はＭＥＮ１遺
伝子に最も近いマーカー（lod 値 5.03 及び5.13）であ
ることが示されている（Fujimori et プローブとum.Gen
et. 50,399-403,1992）。PYGMをプローブとして単離し
た YACクロ−ン 1908F2 及び 199A7の制限酵素切断点マ
ッピングの結果、上記６個のコスミドクローンのうち c
CI11-367もまたPYGMと近接離していることが明らかとな
った。

【００１７】実施例４． 11q13 領域からのエクソン配
列の単離 上記のように cCI11-4と cCI11-367は MEN1 遺伝子に最
も近いコスミドクローンである。そこで、この２つのコ
スミドクローンからエクソントラッピング法（Buckler
A, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 4005-400
9, 1991 ）によりエクソンの単離を試みた。コスミドＤ
ＮＡはBglII またはBamHI または両者で切断し、エクソ
ンスプライシングベクターpSPL1 のBamHI 部位に結合し
た。COS-7 細胞へのトランスフェクション、逆転写 PCR
（ RT-PCR ）によるエクソン配列の単離は原著者の方法
に従って行った。その結果、cCI11-367 に由来するエク
ソン配列が３個得られ、s367E1、s367E2、s367E4と命名
した。各エクソン配列のサイズはそれぞれ 147bp、76b
p、129bp であった。

【００１８】実施例５． 全長ｃＤＮＡの単離 実施例４によって得られたエクソン配列の一つ、s367E4
をプローブとして大脳皮質ｃＤＮＡライブラリーをスク
リーニングし、１kbのｃＤＮＡインサートを有するクロ
ーン、ＡＢ１を得た。さらに、ＡＢ１をプローブとして
胎児肝ｃＤＮＡライブラリーよりｃＤＮＡクローンＦＬ
２を、また小脳ｃＤＮＡライブラリーよりｃＤＮＡクロ
ーンＣＥ５、ＣＥ９、ＣＥ１６を得た。これらのクロー
ンはもとのコスミドクローン cCI11-367とハイブリダイ
ズし、ハイブリッド細胞株パネルで染色体 11q13にマッ
プされることを確認した。これらのｃＤＮＡクローンを
共通部分で重ね合わせた配列は 3200bp の ZFM1 ｃＤＮ
Ａ（配列番号１）を構成した。ZFM1ｃＤＮＡは配列番号
１の 383番から 2251 番までの配列に相当する1869bpの
オープンリーディングフレーム（ORF ）を含んでいた。
この配列番号１及び各クロ−ンの配列は、以下に述べる
情報から６個のドメイン、Ａ（配列番号１の塩基番号１
-413 )、Ｂ（配列番号１の塩基番号 414-542 )、Ｃ（配
列番号１の塩基番号 543-618 )、Ｄ（配列番号１の塩基
番号 619-1964 ) 、Ｅ（配列番号１の塩基番号 1965-22
18 )、Ｆ（配列番号１の塩基番号 2219-3200 )と全く別
のドメインＧおよびＨとにわけて考えられることが判明
した。即ち、実施例４で得たエクソン配列 s367E2 及び
s367E4 がそれぞれドメインＣおよびＢに相当してい
た。またｃＤＮＡクローンＣＥ５は配列番号１の 1965
番から 2218 番までの配列に相当する２５４塩基対から
なるドメインＥを欠いていた。これはスプライシングの
違いによると考えられた。ｃＤＮＡクローンAB1 はドメ
インＡ、Ｂおよび全く別のドメインＧを含んでいたが、
ドメインＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆを含んでいなかった。また、ｃ
ＤＮＡクローン CE16 はドメインＤ、Ｅおよび全く別の
ドメインＨから構成されていた（図２）。

【００１９】実施例６． 該癌抑制遺伝子のコードする
蛋白の構造の特徴 ZFM1ｃＤＮＡのコードする蛋白は 623アミノ酸残基から
なり、そのＮ末端側には塩基性のアミノ酸を含む核移行
シグナルが存在していた。さらに、C-X2-C-X4-H-X4-C
（アミノ酸番号 279-292 )の配列はＤＮＡ結合蛋白に存
在するZinc finger モチーフの特徴を有していた。 ZF
M1蛋白には 118個のプロリン残基が含まれており、中で
もアミノ酸番号 420から 623に至る領域には 69 個のプ
ロリン残基が含まれていた。この領域の配列はウィルム
ス腫瘍の癌抑制遺伝子産物である WT1（Gessler et al,
Nature 343,774-778,1990）及び転写因子であるearly
growth response 2 （ EGR2 ) 蛋白と高いホモロジーを
有していた（ 27.3%及び 24.0%）（図３）。 WT1はKrup
pel 様のZinc finger モチーフ(Rosenberg et al, Natu
re 319,336-339, 1986) を有する転写因子である。ＥＧ
Ｒ２はマウスの培養細胞において細胞周期の GO-G1の境
界で発現される初期増殖刺激反応性遺伝子Krox-20 （Ch
avier et al, EMBO J. 7,29-35,1988 ）のヒトホモログ
であり、やはり転写因子である（Joseph et al, Proc.N
atl.Acad.Sci.USA 85,7164-7168,1988）。さらにＺＦＭ
１蛋白は７個のプロリン反復配列（各々が４個以上の連
続したプロリン残基よりなる）をＣ末端側に有している
が、この一つはグルタミン反復配列の後に続いており、
ミネラルコルチコイドレセプターのヒンジドメインとほ
とんど同じ構造を形成している（Arriza et al, Scienc
e 237,268-275,1987）。このようなヒンジ構造はホルモ
ン結合ドメインとＤＮＡ結合ドメインとのコミュニケー
ションに必要な構造である（Krust et al, EMBO J. 5,8
91-897,1986; Giguere et al, Cell 46,645-652,198
6）。しかも、ZFM1遺伝子に由来する複数のタイプのｍ
ＲＮＡは膵、胸腺、副腎、卵巣などのホルモン産生臓器
に発現している（実施例８）。以上のことは、 ZFM1 蛋
白が核に局在し、ＤＮＡに結合して細胞増殖を制御する
ことによって機能を発揮する癌抑制遺伝子であり、 ZFM
1 が MEN1 の発症に関わる遺伝子であることを示してい
る。

【００２０】実施例７． ゲノム遺伝子の構造 ZFM1 遺伝子を含むコスミドクローンをもとに ZFM1 遺
伝子のゲノム構造を決定した。 ZFM1 遺伝子はゲノムＤ
ＮＡ上約２０ｋｂにまたがって存在し、１４個のエクソ
ンによって構成されていた（図４）。これらのエクソン
（No.1-14)と実施例６に記載したドメイン（Ａ〜Ｈ）と
は図４に示すように、ドメインＡ＝エクソン１、ドメイ
ンＢ＝エクソン２、ドメインＣ＝エクソン３、ドメイン
Ｄ＝エクソン４、５、６、７、８、９、10、 11および 1
2 、ドメインＥ＝エクソン 13 および 14 の一部、ドメ
インＦ＝エクソン 14 の一部、ドメインＧ＝エクソン２
ａ、ドメインＨ＝エクソン３ａ、という関係にあること
が判明した。配列番号１の配列は、このうちエクソン２
ａとエクソン３ａを除くこれら１４個のエクソンをすべ
て含んでいる。Ｄ−ＦドメインからなるｃＤＮＡクロー
ンCE5 の配列はエクソン１３とエクソン１４の一部に相
当するドメインＥを欠いていた。一方、Ａ−Ｂ−Ｇドメ
インからなるｃＤＮＡクローンＡＢ１のＧドメインはド
メインＢをコードするエクソン２に直接続くエクソン２
ａによってコードされていた。またＨ−Ｄ−Ｅドメイン
からなるｃＤＮＡクローンＣＥ１６のＨドメインはドメ
インＤをコードするエクソン４の直前に存在するエクソ
ン３ａによってコードされていた。

【００２１】実施例８． ZFM1 遺伝子のヒト組織にお
ける発現 ｃＤＮＡクローンＦＬ２のインサートをプローブとして
種々の組織のｍＲＮＡのノーザンブロット解析を行った
ところ、すべての組織で 3.3kbと 2.7kbの ZFM1 ｍＲＮ
Ａの発現が認められた。大きい方のｍＲＮＡはドメイン
A-B-C-D-E-Fを含む全長ｃＤＮＡに相当し、小さい方の
ｍＲＮＡはドメイン A-B-CのかわりにドメインＨを含む
ものに対応すると考えられた（図２）。より詳細に ZFM
1 遺伝子の発現を検討するため、種々のヒト組織より抽
出したＲＮＡをもとに、各ドメインに特異的なプライマ
ーセット（図２、矢印）を用いて逆転写ＰＣＲ（ RT-PC
R) 解析を行った。その結果、スプライシングの違いに
由来すると考えられる種々のタイプのＺＦＭ１ｍＲＮＡ
の発現が広汎な組織に認められた。量的には異なってい
るものの、ほとんどすべての組織において A-B-C-D、A-
B-G 、H-D （図２）の構造を有する３種のｍＲＮＡの発
現が認められたが、ドメインＥを有するｍＲＮＡの発現
は心臓、膵臓、胸腺および卵巣に限られていた（図
５）。

【００２２】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：３２００ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 生物名：ホモサピエンス 配列の特徴 特徴を表す記号：５’ＵＴＲ 存在位置：１．．３８２ 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：３８３．．２２５４ 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ １ 存在位置：１．．４１３ 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ ２ 存在位置：４１４．．５４２ 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ ３ 存在位置：５４３．．６１８ 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ ４ 存在位置：６１９．．７７１ 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ ５ 存在位置：７７２．．８６１ 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ ６ 存在位置：８６２．．１０４５ 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ ７ 存在位置：１０４６．．１１６１ 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ ８ 存在位置：１１６２．．１２６９ 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ ９ 存在位置：１２７０．．１４５０ 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ １０ 存在位置：１４５１．．１２７４ 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ １１ 存在位置：１７２５．．１７８４ 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ １２ 存在位置：１７８５．．１９６４ 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ １３ 存在位置：１９６５．．２１３７ 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ １４ 存在位置：２１３８．．３１３２ 特徴を表す記号：３’ＵＴＲ 存在位置：２２８０．．３２００ 配列 CGTTGCTGTC GAAATGAAGT GCGCGCTGCG ACACCTCCCA GCCCACCGAA CTCCGCCGCC 60 ATTTCCTCGC TTGCCTAACG GTTCGGCCAA TCCCAGCGCG CATCAATGCC GGACTGAGGC 120 TCCGCCAATC GGAGGCCGCC GATTTCGACC CTTCGCCTCG GCCCGGCCCA ATCCATTCCC 180 CGGCCCCGCC GCCCCCGGCC CGCCCCCGCG GTGCCCTCTC TCCTCCCTCT TTGTGCGTCT 240 CGCGCCGCCG CCGCCCGCCG CGTGAGAGGA CGGGCTCCGC GCGCTCCGGC AGCGCATTCG 300 GGTCCCCTCC CCCCGGGAGG CTTGCGAAGG AGAAGCCGCC GCAGAGGAAA AGCAGGTGCC 360 GGTGCCTGTC CCCGGGGGCG CC ATG GCG ACC GGA GCG AAC GCC ACG CCG TTG 412 Met Ala Thr Gly Ala Asn Ala Thr Pro Leu 1 5 10 GAC TTC CCA AGT AAG AAG CGG AAG AGG AGC CGC TGG AAC CAA GAC ACA 460 Asp Phe Pro Ser Lys Lys Arg Lys Arg Ser Arg Trp Asn Gln Asp Thr 15 20 25 ATG GAA CAG CCG ACA GTG ATT CCA GGA ATG CCT ACA GTT ATT CCC CCT 508 Met Glu Gln Pro Thr Val Ile Pro Gly Met Pro Thr Val Ile Pro Pro 30 35 40 GGA CTT ACT CGA GAA CAA GAA AGA GCT TAT ATA GTG CAA CTG CAG ATA 556 Gly Leu Thr Arg Glu Gln Glu Arg Ala Tyr Ile Val Gln Leu Gln Ile 45 50 55 GAA GAC CTG ACT CGT AAA CTG CGC ACA GGG GAC CTG GGC ATC CCC CCT 604 Glu Asp Leu Thr Arg Lys Leu Arg Thr Gly Asp Leu Gly Ile Pro Pro 60 65 70 AAC CCT GAG GAC AGG TCC CCT TCC CCT GAG CCC ATC TAC AAT AGC GAG 652 Asn Pro Glu Asp Arg Ser Pro Ser Pro Glu Pro Ile Tyr Asn Ser Glu 75 80 85 90 GGG AAG CGG CTT AAC ACC CGA GAG TTC CGC ACC CGC AAA AAG CTG GAA 700 Gly Lys Arg Leu Asn Thr Arg Glu Phe Arg Thr Arg Lys Lys Leu Glu 95 100 105 GAG GAG CGG CAC AAC CTC ATC ACA GAG ATG GTT GCA CTC AAT CCG GAT 748 Glu Glu Arg His Asn Leu Ile Thr Glu Met Val Ala Leu Asn Pro Asp 110 115 120 TTC AAG CCA CCT GCA GAT TAC AAA CCT CCA GCA ACA CGT GTG AGT GAT 796 Phe Lys Pro Pro Ala Asp Tyr Lys Pro Pro Ala Thr Arg Val Ser Asp 125 130 135 AAA GTC ATG ATT CCA CAA GAT GAG TAC CCA GAA ATC AAC TTT GTG GGG 844 Lys Val Met Ile Pro Gln Asp Glu Tyr Pro Glu Ile Asn Phe Val Gly 140 145 150 CTG CTC ATC GGG CCC AGA GGG AAC ACC CTG AAG AAC ATA GAG AAG GAG 892 Leu Leu Ile Gly Pro Arg Gly Asn Thr Leu Lys Asn Ile Glu Lys Glu 155 160 165 170 TGC AAT GCC AAG ATT ATG ATC CGG GGG AAA GGG TCT GTG AAA GAA GGG 940 Cys Asn Ala Lys Ile Met Ile Arg Gly Lys Gly Ser Val Lys Glu Gly 175 180 185 AAG GTT GGG CGC AAA GAT GGC CAG ATG TTG CCA GGA GAA GAT GAG CCA 988 Lys Val Gly Arg Lys Asp Gly Gln Met Leu Pro Gly Glu Asp Glu Pro 190 195 200 CTT CAT GCC CTG GTT ACT GCC AAT ACA ATG GAG AAC GTC AAA AAG GCA 1036 Leu His Ala Leu Val Thr Ala Asn Thr Met Glu Asn Val Lys Lys Ala 205 210 215 GTG GAA CAG ATA AGA AAC ATC CTG AAG CAG GGT ATC GAG ACT CCA GAG 1084 Val Glu Gln Ile Arg Asn Ile Leu Lys Gln Gly Ile Glu Thr Pro Glu 220 225 230 GAC CAG AAT GAT CTA CGG AAG ATG CAG CTT CGG GAG TTG GCT CGC TTA 1132 Asp Gln Asn Asp Leu Arg Lys Met Gln Leu Arg Glu Leu Ala Arg Leu 235 240 245 250 AAT GGG ACC CTT CGG GAA GAC GAT AAC AGG ATC TTA AGA CCC TGG CAG 1180 Asn Gly Thr Leu Arg Glu Asp Asp Asn Arg Ile Leu Arg Pro Trp Gln 255 260 265 AGC TCA GGG ACC CGC AGC ATT ACC AAC ACC ACA GTG TGT ACC AAG TGT 1228 Ser Ser Gly Thr Arg Ser Ile Thr Asn Thr Thr Val Cys Thr Lys Cys 270 275 280 GGA GGG GCT GGC CAC ATT GCT TCA GAC TGT AAA TTC CAA AGG CCT GGT 1276 Gly Gly Ala Gly His Ile Ala Ser Asp Cys Lys Phe Gln Arg Pro Gly 285 290 295 GAT CCT CAG TCA GCT CAG GAT AAA GCA CGG ATG GAT AAA GAA TAT TTG 1324 Asp Pro Gln Ser Ala Gln Asp Lys Ala Arg Met Asp Lys Glu Tyr Leu 300 305 310 TCC CTC ATG GCT GAA CTG GGT GAA GCA CCT GTC CCA GCA TCT GTG GGC 1372 Ser Leu Met Ala Glu Leu Gly Glu Ala Pro Val Pro Ala Ser Val Gly 315 320 325 330 TCC ACC TCT GGG CCT GCC ACC ACA CCC CTG GCC AGC GCA CCT CGT CCT 1420 Ser Thr Ser Gly Pro Ala Thr Thr Pro Leu Ala Ser Ala Pro Arg Pro 335 340 345 GCT GCT CCC GCC AAC AAC CCA CCT CCA CCG TCT CTC ATG TCT ACC ACC 1468 Ala Ala Pro Ala Asn Asn Pro Pro Pro Pro Ser Leu Met Ser Thr Thr 350 355 360 CAG AGC CGC CCA CCC TGG ATG AAT TCT GGT CCT TCA GAG AGT TGG CCC 1516 Gln Ser Arg Pro Pro Trp Met Asn Ser Gly Pro Ser Glu Ser Trp Pro 365 370 375 TAC CAC GGC ATG CAT GGA GGT GGT CCT GGT GGG CCC GGA GGT GGC CCC 1564 Tyr His Gly Met His Gly Gly Gly Pro Gly Gly Pro Gly Gly Gly Pro 380 385 390 CAC AGC TTC CCA CAC CCA TTA CCC AGC CTG ACA GGT GGG CAT GGT GGA 1612 His Ser Phe Pro His Pro Leu Pro Ser Leu Thr Gly Gly His Gly Gly 395 400 405 410 CAT CCC ATG CAG CAC AAC CCC AAT GGA CCC CCA CCC CCT TGG ATG CAG 1660 His Pro Met Gln His Asn Pro Asn Gly Pro Pro Pro Pro Trp Met Gln 415 420 425 CCA CCA CCA CCA CCG ATG AAC CAG GGC CCC CAC CCT CCT GGG CAC CAT 1708 Pro Pro Pro Pro Pro Met Asn Gln Gly Pro His Pro Pro Gly His His 430 435 440 GGC CCT CCT CCA ATG GAT CAG TAC CTG GGA AGT ACG CCT GTG GGC TCT 1756 Gly Pro Pro Pro Met Asp Gln Tyr Leu Gly Ser Thr Pro Val Gly Ser 445 450 455 GGG GTC TAT CGC CTG CAT CAA GGA AAA GGT ATG ATG CCG CCA CCA CCT 1804 Gly Val Tyr Arg Leu His Gln Gly Lys Gly Met Met Pro Pro Pro Pro 460 465 470 ATG GGC ATG ATG CCG CCG CCG CCG CCG CCT CCC AGT GGG CAG CCC CCA 1852 Met Gly Met Met Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ser Gly Gln Pro Pro 475 480 485 490 CCC CCT CCC TCT GGT CCT CTT CCC CCA TGG CAA CAA CAG CAG CAG CAG 1900 Pro Pro Pro Ser Gly Pro Leu Pro Pro Trp Gln Gln Gln Gln Gln Gln 495 500 505 CCT CCG CCA CCC CCT CCG CCC AGC AGC AGT ATG GCT TCC AGT ACC CCC 1948 Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ser Ser Ser Met Ala Ser Ser Thr Pro 510 515 520 TTG CCA TGG CAG CAA AAT ACG ACG ACT ACC ACC ACG AGC GCT GGC ACA 1996 Leu Pro Trp Gln Gln Asn Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ser Ala Gly Thr 525 530 535 GGG TCC ATC CCG CCA TGG CAA CAG CAG CAG GCG GCT GCC GCA GCT TCT 2044 Gly Ser Ile Pro Pro Trp Gln Gln Gln Gln Ala Ala Ala Ala Ala Ser 540 545 550 CCA GGA GCC CCT CAG ATG CAA GGC AAC CCC ACT ATG GTG CCC CTG CCC 2092 Pro Gly Ala Pro Gln Met Gln Gly Asn Pro Thr Met Val Pro Leu Pro 555 560 565 570 CCC GGG GTC CAG CCG CCT CTG CCG CCT GGG GCC CCT CCC CCT CCG CCC 2140 Pro Gly Val Gln Pro Pro Leu Pro Pro Gly Ala Pro Pro Pro Pro Pro 575 580 585 CGT AGC ATC GAG TGT CTT CTT TGT CTT CTT TCT CTC CTC ACC CAA CTC 2188 Arg Ser Ile Glu Cys Leu Leu Cys Leu Leu Ser Leu Leu Thr Gln Leu 590 595 600 CCT TTG CCT CTC CCC AAA CCG GGC CGC CAG GAT CCC TCC CCG CGG CGG 2236 Pro Leu Pro Leu Pro Lys Pro Gly Arg Gln Asp Pro Ser Pro Arg Arg 605 610 615 CGA TGG CCC GAG CCA TGAGAGTGAG GACTTTCCGC GCCCATTGGT GACCCTTCCA 2291 Arg Trp Pro Glu Pro 620 623 GGCAGACAGC CTCAGCAACG CCCCTGGTGG ACAGGATGGT TCGGCAAAGC AGCCTGAGTT 2351 ATTTTTGTGG ACGGAATCGG AACACGCTGG CTCCATATCG TGAAATTTTT ATTAATTTTT 2411 TTCTTTTTCC TTTGTTACTT CTTTATCTTT TCCTTTCTTC AGACTCCGTC CAAGGAGATG 2471 CTCTCCCCGG TCTTCTGCTG CAATTTAGAT TCCTTTGGGT TCTCTCCAGT TCTCCTTCCC 2531 TTACCAAGGA GAGGGGAGCA AATGGTTTTG GGCAAGGGCT TTGGCCATTC ATGTCAAGCT 2591 GGTTGTGGGT TTTTCAAGGT GCCATAGCCA CCCCCAAATA TGTTTGTTTA AAGCGTGGGG 2651 TTTTTTAATC TCTGCCACCC TTGTCAAGGG AGTCTTGTAA AGTTGCCGAG GGTAGGTTCA 2711 TCTCCAGGTT TCGGGATTCC CATCCGTCCT GGCGATCCTG CCAGCAGTGG GTGGGCAGCC 2771 TGAGCTCCCT CGGGCTCGCC TGCCAGCCTG GAGTTCTTCC TGTGCTCCTT GATCACCTGA 2831 GCTGCCTCAG ATTCCATTTG GTCCTCTCCT TCCTGGAAGG CTTCCTTTTA TGTTTTGTTT 2891 TAATCCCAAA TGTCTGAATG TTTTGCAGTG TGTAGGGGTT TGAGCCCCTT GTTCATTCTC 2951 CTTCCTTTTT CCTCCCGCTT CCCTCTCCAT GAAGTGATTC TGTTGACAAT AATGTATACT 3011 GCGCGTTCTC TTCACTGGTT TATCTGCAGA AATTTCTCTG GGCTTTTTTC GGTGTTAGAT 3071 TCAACACTGC GCTAAAGCGG GGATGTTCCA TTGAATAAAA GAGCAGTGTG GTTTTCTGGG 3131 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 3191 AAAAAAAAA 3200

【図面の簡単な説明】

【図１】リンケージ解析とＬＯＨ解析によるＭＥＮ１遺
伝子の存在領域の限局化を示した図である。

【図２】互いに重なり合うｃＤＮＡクローンとそれから
導き出されるＺＦＭ１ｃＤＮＡのドメイン構造を示した
図である。

【図３】ＺＦＭ１蛋白とＷＴ１またはＥＧＲ２とのホモ
ロジーを示した図である。

【図４】ＺＦＭ１遺伝子のエクソンの構成を示した図で
ある。各エクソンを１〜１４で、各ドメインをＡ−Ｈで
示した。

【図５】種々のヒト組織におけるｍＲＮＡの発現を示し
た図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 16/32 Ｃ１２Ｎ 1/21 8828−4Ｂ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ 21/08 9161−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/574 Ｚ // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＵ 39/395 Ｅ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１で表されるＤＮＡの、全部ま
   たは一部を含むものからなるＤＮＡ、またはそれと実質
   的に同等であるＤＮＡ。
2. 【請求項２】 配列番号１で表されるＤＮＡがコードす
   るポリペプチドの、全部または一部を含むものからなる
   ポリペプチド、またはそれと実質的に同等であるポリペ
   プチド。
3. 【請求項３】 配列番号１で表されるＤＮＡの全部また
   は一部を発現可能なプラスミドに組み込み、それで形質
   転換された宿主細胞。
4. 【請求項４】 請求項２記載のポリペプチドを抗原とす
   る抗体。
5. 【請求項５】 請求項１記載のＤＮＡ配列の一部を含む
   ＤＮＡをプライマー、プローブまたはマーカーとして使
   用し、被検ＤＮＡとハイブリダイズさせることを特徴と
   する遺伝子解析方法。