JPH10507343A

JPH10507343A - 網膜芽細胞腫タンパク質相互作用性ジンクフィンガータンパク質

Info

Publication number: JPH10507343A
Application number: JP8508227A
Authority: JP
Inventors: シファン，
Original assignee: ラホヤキャンサーリサーチファウンデーション
Priority date: 1994-08-18
Filing date: 1995-08-18
Publication date: 1998-07-21
Also published as: WO1996006168A2; CA2197890A1; US6069231A; EP0776365A2; US5811304A; WO1996006168A3; US6468985B1; US5831008A; AU3408695A

Abstract

(57)【要約】本発明は、哺乳動物の網膜芽細胞腫（Rb）タンパク質相互作用性ジンクフィンガー（RIZ）タンパク質、RIZをコードする核酸分子、およびRIZに特異的な抗体を提供する。本発明はまた、RIZと、RIZに結合し得る第２の分子との会合を効果的に変化させる薬剤を同定するためのスクリーニングアッセイを提供する。本発明はまた、転写を調節し得る、PRドメインを含有するRIZの活性フラグメントを提供する。さらに、本発明は、RIZをコードする核酸分子を細胞に導入するための方法、および細胞と、細胞の機能を調整するために有効な薬剤とを接触させるための方法を提供する。このような方法は、例えば、被検体における心臓細胞またはニューロン細胞の増殖を誘導するため、および腫瘍細胞に正常な増殖制御をもたらすため、または腫瘍細胞の分化を引き起こすために有用である。本発明はさらに、RIZまたはRIZをコードする核酸分子を検出することにより、サンプル中のRIZを検出するための方法を提供する。このような方法は、細胞におけるRIZのレベルの増加もしくは減少により、または細胞における変異RIZの発現により特徴付けられる病理を診断するために有用である。

Description

【発明の詳細な説明】網膜芽細胞腫タンパク質相互作用性ジンクフィンガータンパク質本発明は、一部、国立衛生研究所により授与されたCA57496、および癌治療センターにより授与された5T30 CA30199の下での政府の援助によりなされた。合衆国政府が本発明の特定の権利を所有する。発明の背景発明の分野本発明は、分子生物学分野、特にRb相互作用性ジンクフィンガー（RIZ）タンパク質をコードする核酸分子、および遺伝子転写の調節に関係するRIZの保存ドメインに関する。背景情報網膜芽細胞腫Rbタンパク質は、正常な細胞増殖および分化の制御において重要な役割を果たすことが知られている。細胞の分裂能は、細胞が細胞周期の種々の期を通過することを要求する。Rbは、細胞周期のG₁またはG₀として知られる期に正常細胞を保持することにより、その細胞が分裂するのを防止すると考えられているが、Rb機能の基礎をなす正確な機構は知られていない。しかし、Rbは、遺伝子転写の調節に関係するタンパク質を含む種々の細胞性タンパク質を結合し得ることが知られている。従って、Rbは、このような細胞性タンパク質との相互作用により、その作用を発揮し得る。細胞増殖の制御においてRbが果たす役割は、Rbの作用のために通常増殖しない組織の増殖の促進に対して興味深い標的にすることである。例えば、細胞死により機能を失った心筋組織および神経組織は、残存する生存細胞のその後の増殖により通常修復されない。従って、Rbの増殖制御機能をブロックする方法は、心臓細胞死または神経細胞死の状況における組織修復を誘導するのに有用であり得る。 Rbはまた、腫瘍サプレッサーとして知られている。なぜなら、ガン細胞の異常増殖は、Rbタンパク質の不活性化の結果であり得るからである。このような不活性化は、腫瘍形成腫瘍ウイルスの産物であるウイルス腫瘍タンパク質の結合に続くRbタンパク質の変異または不活性化のいずれかにより起こり得る。Rbポケットと呼ばれるRb中の特定の領域は、その増殖制御機能にとって重要であるようである。なぜなら、変異または腫瘍タンパク質結合によるRb不活性化は、この領域に影響を与えるからである。 Rbの機能化、およびウイルス腫瘍タンパク質がポケットに結合することにより Rbを調節し得るという理解におけるRbポケットの重要性は、ポケットに結合することによりRbの機能を調節し得る正常な細胞性タンパク質が存在し得ることを示唆する。このようなタンパク質の同定は、心機能または神経機能の欠損を含む疾患、あるいはガンの制御において、Rbにより媒介される細胞増殖の制御を調節するための新規なアプローチを提供する。従って、細胞増殖および分化を制御するための新規なアプローチを提供するために、Rbに結合し得、そしてRbを調節し得るタンパク質を同定することの必要性が存在する。本発明は、この必要性を満たし、そして関連する有利性を同様に提供する。発明の要旨本発明は、例えば、ヒトRIZおよびラットRIZを含む、実質的に精製された哺乳動物のRb相互作用性ジンクフィンガータンパク質（RIZ）を提供する。さらに、本発明は、Rbを結合する、配列EIRCEEKPEDL（配列番号６）およびEIRCDEKPEDL（配列番号91）のようなRIZの活性フラグメントを提供する。本発明はまた、RIZまたは変異RIZに特異的に結合し得る抗体を提供する。本発明はさらに、哺乳動物RIZおよびその活性フラグメントをコードする核酸分子、その核酸分子を含むベクター、およびそのベクターを含む宿主細胞を提供する。さらに、本発明は、RIZをコードする核酸分子またはRIZをコードする変異核酸分子に特異的にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を提供する。さらに、本発明は、PRドメインを含むペプチドを提供する。このPRドメインは、種々のタンパク質中に保存され、そして標的遺伝子の転写の調節に関係し得る。一般的に、PRドメインペプチドは、約100〜約120個のアミノ酸を含む。このPR ドメインは、各約10〜約12個のアミノ酸の一連の３つの高度に保存された配列として特徴的に配列しており、この保存配列は、各約24〜約34個のアミノ酸のあまり保存されていない配列により互いに分離されている。本発明のPRドメインは、本明細書に開示されるRIZタンパク質に存在するPRドメイン、およびタンパク質PRD I-BF1、Evi-1およびegl-43に存在するPRドメインにより例示される。本発明はさらに、DNA調節因子に結合し得るペプチドに作動可能に結合した本発明のPRドメインを含む融合タンパク質を提供する。例えば、本発明の融合タンパク質は、特定の遺伝子プロモーターまたはエンハンサーに結合するペプチドに作動可能に結合したPRドメインを含み得、ここで融合タンパク質の、特定のプロモーターまたはエンハンサーを含む遺伝子である標的遺伝子への結合は、標的遺伝子の発現を変化させ得る。従って、本発明の融合タンパク質は、１つ以上の標的遺伝子の転写の調節に有用であり得る。さらに、本発明は、転写因子、およびPRドメインペプチドまたはPRドメインを含むRIZ活性フラグメントを結合する腫瘍タンパク質を同定する方法をさらに提供する。このような因子およびタンパク質の同定は、細胞分化および形質転換を操作するための新規なアプローチを提供する。本発明はまた、Rbのような第２の分子とのRIZの会合を有効に変化させ得るか、またはRIZの活性を有効に変化させ得る薬剤の同定に有用なスクリーニングアッッセイを提供する。第２の分子とのRIZの会合を変化させるか、またはRIZの活性を変化させることにより、有効な薬剤は細胞増殖のような細胞機能を調整し得る。本発明はさらに、細胞を有効な薬剤と接触させることにより、細胞（例えば、神経細胞または心筋細胞）の増殖を促進するための方法を提供する。例えば、細胞増殖は、有効な薬剤（例えば、RIZの活性フラグメントをコードするヌクレオチド配列に作動可能に結合した発現制御配列を有する発現ベクター（ここで、活性フラグメントは、完全なRIZタンパク質の増殖抑制特性を欠く））を細胞に導入することにより促進され得る。さらに、本発明は、完全なRIZタンパク質をコードする発現可能な核酸分子をガン細胞に導入することにより、ガン細胞に対して正常な細胞増殖の制御を回復するための方法を提供する。本発明はまた、RIZタンパク質またはRIZをコードする核酸分子の存在を検出することにより、サンプル中のRIZを検出する方法を提供する。このような方法は、細胞におけるRIZの発現レベルの増加または減少、あるいは変異RIZの発現により特徴付けられる病理を診断するために使用され得る。このような方法はまた、 RIZをコードする変異核酸分子により特徴付けられる病理を診断するために使用され得る。本発明はさらに、サンプルからRb腫瘍サプレッサータンパク質または変異Rbを単離するために有用な方法を提供する。例えば、Rbは、RIZまたはRIZ活性フラグメント（例えば、配列EIRCEEKPEDL（配列番号６）またはEIRCDEKPEDL（配列番号 91））を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより、サンプルから単離され得る。図面の簡単な説明図1Aおよび1Bは、別のヌクレオチド配列（配列番号１および94）および全長ラットRIZタンパク質の推定アミノ酸（a.a.）配列（配列番号２）を示す。図1Aは、全長ラットRIZタンパク質のcDNA配列（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。右側の数字はヌクレオチド位置を示し；左側の数字はアミノ酸位置を示す。以下の特徴に下線を付す：上流インフレーム停止コドン（ヌクレオチド位置100〜102）、cr2コアモチーフ（アミノ酸位置304〜309 ）、８個のジンクフィンガー（アミノ酸位置357〜377、478〜499、387〜407、11 25〜1203（フィンガー４〜６）、1323〜1343および1445〜1466）および推定核局在化シグナル（アミノ酸位置867〜874）。推定ロイシンジッパーは、アミノ酸位置667〜695から位置し；このジッパー内のＴ、ＨおよびＬ残基に下線を付す。１文字アミノ酸記号を使用する。図1Bは、ラットRIZをコードするヌクレオチド配列（配列番号２）の5'末端に存在する別のヌクレオチド配列（配列番号94）を示す。この別のヌクレオチド配列（配列番号94）は、図1Aに示すヌクレオチド配列（配列番号１）の5'末端でヌクレオチド１〜91を置き換える。図2A〜2Cは、ラットRIZと種々の他のタンパク質との間の相同性を示す。１文字アミノ酸記号を使用する。数字は、完全なタンパク質に関するアミノ酸位置を示す。図2Aは、RIZアミノ酸配列と種々のE1A配列とを比較する。アデノウイルスの異なる株のE1A配列は、Kimelmanら、J ．Virol. 53:399-409(1985)、MoranおよびMa thews、Cell 48:177-178(1987)、およびIshinoら、Virology 165:95-102(1988) からである。同一または密接に関連する残基を四角で囲む。１文字アミノ酸記号を使用する。配列ドメイン、RIZ cr1（配列番号79）、Ad2E1A cr1（配列番号44 ）、Ad5 cr1（配列番号45）、Ad7 cr1（配列番号46）、Ad12 cr1（配列番号47 ）、EA7 cr1（配列番号48）、Ad40 cr1（配列番号49）、RIZ cr2（配列番号65）、Ad2E1A cr2（配列番号66）、Ad5 cr2（配列番号67）、Ad7 cr2（配列番号68）、Ad12 cr2（配列番号69）、EA7 cr2（配列番号70）、Ad40 cr2（配列番号71）、RIZ ce1（配列番号72）、Ad2E1A ce1（配列番号73）、Ad5 ce1（配列番号74）、Ad7 ce1（配列番号75）、Ad12 ce1（配列番号76）、EA7 ce1（配列番号77）およびAd40 ce1（配列番号78）を示す。図2Bは、RIZの推定SH3およびSH3結合ドメインを示す。パネルａ：RIZと他の公知のSH3ドメイン含有タンパク質（Lowensteinら、Cell 70:431-442(1992)）との配列比較。同一または密接に関連する残基を四角で囲み、そしてRIZ中のリン酸結合ループ（配列番号80）に下線を付す。GRB2 Ｎ末端（配列番号50）、GRB2 Ｃ末端（配列番号51）、P85（配列番号52）、v-abl（配列番号53）、c-srv（配列番号54）、GAP（配列番号55）、PLC（配列番号56）およびv-crk（配列番号57）由来の配列を示す。パネルｂ：公知のSH3結合タンパク質（Renら、Science 259: 1157-1161(1993)）由来のSH3モチーフと比較したRIZの推定SH3結合モチーフ。同一または密接に関連する残基を四角で囲む。（配列番号81）、ホルミン（formin ）（配列番号58）、3BP1（配列番号59）、3BP2（配列番号60）およびm4mAChR（配列番号61）由来の配列を示す。図2Cは、RIZとPRDI-BF1タンパク質（KellerおよびManiatis、Genes Devel. 5: 868-879(1991)）との間の相同性を示す。パネルａ：RIZジンクフィンガー４〜６（配列番号82）のPRDI-BF1ジンクフィンガー１〜３（配列番号62）とのアライメント。コンセンサス配列を、点により示される同一でない残基と共に示す。潜在的DNA接触残基に星印を付ける（PavletichおよびPabo、Science 252:809-817(19 91)）。パネルｂ：RIZ（アミノ酸位置39-115：配列番号83およびアミノ酸位置11 6-145：配列番号84）とPRDI-BF1（アミノ酸位置60-139：配列番号63およびアミノ酸位置140-169：配列番号64）との間のアミノ末端相同性。コンセンサス配列を、点により示される同一でない残基と共に示す。図３：RIZドメイン構造の略図。PR：PRDI-BF1に相同なドメイン；AR：酸性領域またはE1A関連領域；LZ：ロイシンジッパー；cr1およびcr2：保存領域１および２；ce1：共通のエピトープ１。ジンク（Zn）フィンガー、GTPaseおよびSH3ならびにSH3結合ドメインも示す。図４は、³⁵S標識RIZ（アミノ酸位置１〜575）がインビトロでRbに特異的に結合することを示す。RIZまたはSV40ラージＴ抗原由来のペプチドの非存在下または存在下で結合アッセイを行った。T-pep：ラージＴ抗原のペプチド（アミノ酸位置101-118）；T-pep^*：T-pepの１アミノ酸残基の変異体（107^Glu）；RIZ-pep ：RIZのペプチド（アミノ酸位置304-314）；RIZ-pep^*：RIZ pepの１アミノ酸変異体（307^Gly）。図5Aおよび図5B：RbのRIZ結合部位をマッピングするためのRb欠失変異体の使用。図5A：Ｃ末端RIZフラグメント（アミノ酸位置245-573）を含む精製グルタチオン（glutathionine）S-トランスフェラーゼ融合タンパク質を、図5Bに示すような³⁵S標識Rb野生型（wt-Rb）および種々の欠失変異体（レーン２〜５）への結合について試験した。野生型（wt）全長Rb（A9）、全長RbのCysからPheへの変異（ H209）、アミノ酸位置515-619（NM）、585-697（PP）および804-928（B3）由来のRb欠失変異体を示す。図5B：Rb野生型（wt-Rb）およびRb欠失変異体の略図。Rbポケットの２つのサブドメインを、黒四角で表す。グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）RIZ（アミノ酸位置245-573）を結合する変異体を、「＋」記号で示す。p56 Rb：アミノ酸位置379-928由来のRbの56kDフラグメント。図６は、HT1080細胞由来のRbのグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）とＣ末端融合した精製ラットRIZ（アミノ酸位置215-462）とのインビトロ結合を示す。HT1080細胞抽出物由来の低リン酸化（hypophosphorylated）Rb（pRb）およびリン酸化Rb（ppRb）の位置を、レーン４に示す。左側の数字は、分子量マーカー（キロダルトン）の移動を示す。図7A〜7Cは、ラットRIZタンパク質がDNAを結合することを示す。図7A：SDS-PAGE（10％アクリルアミド）およびGSTのクマシーブルー染色；GST Z13：GST-RIZ（ジンクフィンガー１〜３を含むアミノ酸位置245-573）；およびG STZ46：GST-RIZ（ジンクフィンガー４〜６を含むアミノ酸位置1114-1260）。KD は、分子量マーカーの移動を示す。図7B：亜鉛イオン存在下での、³²P標識ラットゲノムDNAのGST、GSTZ13およびG STZ46への結合。図7C：亜鉛イオンを添加しなかったこと以外は図7Bの通り。図8Aおよび図8Bは、ラットRIZ GTPaseドメイン（アミノ酸位置760-949）のGTP 結合活性を示す。図8A：SDS-PAGE（10％アクリルアミド）および精製GST-Gのクマシーブルー染色：GST-RIZ（760-949：グルタチオンS-トランスフェラーゼとＣ末端融合したRI Z GTPaseドメイン）。図8B：GST（レーン１）およびGST-G（レーン２〜６）による³²P-GTP結合。示すように、過剰の非標識ヌクレオチドの非存在下または存在下（レーン３〜６）で、結合を行った。図9A〜9Cは、別のヌクレオチド配列（配列番号３および配列番号95〜96）、全長ヒトRIZの推定アミノ酸配列（配列番号４）、およびヒトRIZ cDNAのさらなる3 '非翻訳配列（配列番号97）を示す。図9Aは、全長ヒトRIZの完全なヌクレオチド配列（配列番号３）および推定アミノ酸配列（配列番号４）を示す。３文字アミノ酸記号を使用する。右側の数字はヌクレオチド位置を示す。図9Bは、２つの別のヌクレオチド配列（配列番号95〜96）を示し、これらは、図9Aに示すヌクレオチド配列（配列番号３）の5'末端で存在する最初の129ヌクレオチドを置換する。クローン5Yおよび1Yに対するコードアミノ酸配列を示す（それぞれ、配列番号102および103）。図9Cは、ポリＡテールを含むヒトRIZ cDNAの3'非翻訳配列（配列番号97）を示す。この配列は、cDNAの3'末端の遠隔で、すなわち図9Aに示す3'非翻訳配列（配列番号３）の下流でヒトRIZ cDNA中に位置する。さらなる非翻訳配列が、配列番号３の3'末端と配列番号97の5'末端との間に存在する。図10は、完全なヒトRIZアミノ酸配列（hRIZと示される；配列番号４）と、完全なラットRIZアミノ酸配列（rRIZと示される；配列番号２）とを比較する。コンセンサス配列を示す。１文字アミノ酸記号を使用する。hRIZおよびrRIZにおいて同一のアミノ酸を「．」として示す。図11Aおよび図11Bは、示すように、成体および胎児ラット組織におけるRIZ mR NA発現を示す。ロードしたRNAの相対量を、アクチンに対してプローブすることにより比較した（各ブロットの下部を参照のこと）。各図の左側の数字は、示すように分子量マーカー（Kb：キロベース）の位置を示す。図11Aは、32P標識ラットRIZ（アミノ酸位置245-883を表す1.9Kbフラグメント）でプローブされた成体mRNAのノーザンブロットを示す。Att-20は、マウス下垂体細胞株である。図11Bは、³²P標識ラットRIZ（アミノ酸位置463-574を表す）でプローブされた、16日齢胎児ラット（E16）および成体ラット由来のRNAを用いるRNase保護実験を示す。図12は、種々のヒト細胞株およびラット細胞株（GCと示す）由来のmRNAを用いるRNase保護実験を示す。321塩基対マーカー（321b）は、³²P標識ラットRIZ（アミノ酸位置457-579）の保護を示すが、一方、130塩基対マーカー（130b）はアクチンの保護を示す。図13は、４つの転写調節タンパク質中に存在するPRドメインペプチドのアラインメントを示す。配列は、相同性を最大にするためにアラインメントされる。「 −」は、相同性を保持するために導入された空白を示す。配列の上部を横切る数字は、PRドメインペプチドにおけるアミノ酸の数を示す。各配列の開始の数字は、各タンパク質のＮ末端からのアミノ酸位置を示す。４つのペプチドの少なくとも３つにおいて特定の位置で見出される同一または類似の残基を網かけにする。 PRドメインペプチドにおいてある位置で同一のアミノ酸を黒網かけで示し、そして保存領域を灰色網かけで示す。「PRDI-BF1」は、ヒト陽性調節ドメイン１−結合因子１（配列番号98）を示し；「RIZ」は、ヒトRIZタンパク質（配列番号99）を示し；「EVI1」は、ヒトエコトロピック（ecotropic）ウイルス組込み部位− １骨髄形質転換遺伝子産物（配列番号100）を示し；「egl-43」は、C.elegans e gl-43遺伝子産物（配列番号101）を示す。図14は、マウスRIZのコードエキソン４〜６のヌクレオチド配列（配列番号104 ）および推定アミノ酸配列（配列番号105）を示す。右側の数字はヌクレオチド位置を示す。発明の詳細な説明本発明は、新規な哺乳動物のRb相互作用性ジンクフィンガータンパク質（RIZ と称する）を提供する。RIZは、核のリンタンパク質であり、細胞分化因子として作用する。RIZは、細胞増殖の調節に関与する網膜芽細胞腫（Rb）タンパク質と結合することにより、細胞の機能を調整し得る。さらに、RIZは、転写を調節するために作用し得る。 Rbは、110キロダルトン（kD）の核のリンタンパク質であり、DNAと結合可能であり、そして調べた限りすべての組織タイプにおいて発現される。Rb機能の完全な欠如は、小児網膜芽細胞腫の発症と関連する。さらに、Rbは、種々のガン腫（ carcinoma）および肉腫を含む種々のガン（cancer）タイプにおいて変異している。このことは、腫瘍形成におけるRbの役割を示す。種々のタイプの腫瘍細胞における外因性Rbの発現は、腫瘍の表現型を抑制する（総説については、Leeら、J ．Cell Biochem. 38：213-227(1988)を参照のこと）。細胞内での生化学的レベルのRbの機能は、十分に理解されていない。Rbは、リン酸化形態および非リン酸化形態で細胞内に存在する。Rbのリン酸化状態は、細胞周期中、低リン酸化形態を伴って変動し、細胞周期のG₁期に細胞を保つことと相関する。従って、リン酸化の状態は、Rb機能において重要な役割を果たす。 Rbタンパク質は、アデノウイルスE1Aタンパク質、SV40ラージＴ抗原およびヒト乳頭腫ウイルスのE7タンパク質を含む、いくつかのDNA腫瘍ウイルス腫瘍タンパク質に結合する（DeCaprioら、Cell 54：275-283(1988)；Whyteら、Cell 56： 67-75(1989)；Dysonら、Science 243：934-937(1989)）。腫瘍タンパク質である E1AおよびラージＴ抗原は、Rbポケットとして知られているRbタンパク質の類似する領域に結合する。Rbポケットは、タンパク質内で２つの不連続のアミノ酸配列により形成される（Huら、EMBO J. 9：1147-1155(1990)；Huangら、EMBO J. 9 ：1815-1822(1990)；Kaelinら、Mol ．Cell．Biol. 10：3761-3769(1990)、これらのそれぞれは、本明細書中で参考として援用される）。これらのウイルス腫瘍タンパク質によるRbへの結合は、正常なRb機能を変化させ得る。 Rbはまた、種々の細胞性因子と結合し得る。そのような因子として、例えば、 c-MycおよびN-Myc（Rustgiら、Nature 352：541-544(1991)）、E2F（Bagchiら、Cell 65：1063-1072(1991)）、活性化転写因子-2（ATF-2；Kimら、Nature 358： 331-334(1992)）、c-Abl（WelchおよびWang、Cell 75：779-790(1993)、MyoD（G uら、Cell 72：309-324(1993)）およびbrahma関連遺伝子-1（BRG-1；Dunaiefら、Cell 79：119-130(1994)）が含まれる。これらの細胞性因子は、例えば、遺伝子調節および細胞分化に関与しているため、Rbは、細胞の転写因子および分化因子の活性を調節する役割を有し得る。本明細書中で開示されるように、RIZは、Rbポケットに結合する正常な細胞タンパク質である。RbへのRIZ結合は、腫瘍タンパク質の結合と異なる。なぜなら、RIZは、細胞周期のG₀またはG₁期に細胞を保つことを助ける分化因子として機能するからである。このことは、RIZが細胞内でRb（これは、細胞増殖および細胞分化の既知の調節因子である）に結合し得るという事実、およびRIZは、既知の分化因子および転写因子であるPRD1-BF1/Blimp-1と構造的に関連しているという事実に基づく（Huang、Cell 78：9(1994)）。細胞増殖を調節する能力は、種々のヒトの疾患または病状の重要な示唆を有する。ガンは、細胞がその増殖を調節する能力の崩壊に起因する疾患の例である。対照的に、細胞増殖の制御の維持が、細胞死を生じる疾患または傷害後の器官または組織の機能における持続性の喪失に寄与する心筋細胞および神経細胞のような例がある。これらの場合において、傷害を受けた組織または器官は、完全には再生しない。なぜなら、残りの生存細胞は、喪失した機能を戻すために増殖し得ないからである。心臓疾患は、虚血または他の傷害による心筋の細胞死が心機能の喪失をもたらす例である。一般的に、残りの生存している心臓細胞が増殖して、喪失した心筋機能を再生することは、成人においては起こらない。心筋細胞の増殖は、胚発生および新生（neonatal）成長中に生じ得るが、この増殖能は、出生後速やかに失われる。同様に、外傷または疾患に起因する神経の損傷は、神経機能の再生を通常伴わない。なぜなら、残りの神経細胞は、細胞周期のG₁期に保たれているからである。Rbのような転写調節因子は、細胞が細胞周期に入り、そして増殖し得るか否かを制御する重要な役割を果たす。対照的に、Rbの不活性化は、ガン細胞の調節されない増殖に関与する。本明細書中で開示されるように、RIZはRbに結合し得、そして細胞周期のG₁期に細胞を保つRbの能力を調節し得る。RbおよびRIZの会合能に影響する方法、またはRIZの活性に影響する方法を用いて、細胞増殖を調整し得る。RIZは、心筋の細胞死後、細胞が増殖することを阻止することにより正常な成人の心筋細胞の増殖を調節し得る。RIZは、RIZのcr2ドメインを介してRbと相互作用することにより、G₁に細胞を維持するように機能し得る。さらに、細胞の機能的分化状態（これは、G₁における細胞の維持に関与する）が影響を受け、その一部は、他のRIZ ドメイン、例えば、PRドメイン、GTP結合ドメインおよびジンクフィンガードメインの作用を介する。本発明は、実質的に精製されたRIZタンパク質を提供する。特定の実施態様において、本発明は、実質的に精製された哺乳動物のRIZを提供する。例えば、本発明は、図9A（配列番号４）または配列番号102もしくは配列番号103（図9Bに示す）により置換される最初の３個のアミノ酸を有する図9Aに示すアミノ酸配列を実質的に有するヒトRIZ、図1A（配列番号２）に示すアミノ酸配列を実質的に有するラットRIZ、および図14（配列番号105）に示すアミノ酸配列を実質的に有するマウスRIZを提供する。本明細書中で使用する用語「アミノ酸配列を実質的に」は、開示したアミノ酸配列に類似する配列を意味する。例えば、ヒトRIZ（配列番号４）またはラットR IZ（配列番号２）に実質的に類似するアミノ酸配列は、RIZと同様に機能するようにコードされるタンパク質の能力を実質的に変化させない、１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、または置換を有し得る。この定義により、例えば、図1A（配列番号２）に示すラットRIZ配列（これは、ヒトRIZ配列に対して84％の相同性である）は、ヒトRIZ（配列番号４）のアミノ酸配列を実質的に有する。同様に、ラットRIZ cr2フラグメント配列EIRCEEKPEDL（配列番号６）は、実質的にヒトRIZ cr2フラグメント配列EIRCDEKPEDL（配列番号91）の配列である。後者の２つの配列の差は、Cysの次の残基が、ヒトではAspである代わりに、ラットではGluであるという１つの保存的置換による。本明細書中で使用される用語「実質的に精製された」は、細胞内でタンパク質と通常会合する脂質、タンパク質、核酸、または他の細胞性物質が比較的混入していない形態にあるタンパク質を意味する。実質的に精製されたヒトRIZタンパク質は、例えば、周知の生化学的精製方法を用いて、または配列番号３として示される核酸分子のようなRIZをコードする組換え核酸分子を発現させることにより得られ得る。さらに、配列番号４のアミノ酸配列の少なくとも一部からなるアミノ酸配列は、化学的に合成され得るか、または、配列番号３として示されるヌクレオチド配列の一部を発現させることにより生成され得る。本明細書中で使用される用語「タンパク質」または「ポリペプチド」は、細胞性遺伝子または組換え核酸配列によりコードされ得るかあるいは化学的に合成され得るアミノ酸の配列を意味するための最も広い意味で用いられる。いくつかの場合では、用語「ポリペプチド」は、全長タンパク質をコードするアミノ酸配列の一部を示すために用いられる。RIZの活性フラグメントは、このようなポリペプチドの一例である。タンパク質は、完全で、全長の遺伝子産物であり得、これはアミノ酸改変のないコアタンパク質であり得るか、あるいは、リンタンパク質、糖タンパク質、プロテオグリカン、リポタンパク質、または核タンパク質のような翻訳後改変された形態のタンパク質であり得る。全長ラットRIZタンパク質は、1706アミノ酸を含み、そして算定分子量187,437 ダルトンを有する（図1A；配列番号２）。ラットRIZは、cr2コアモチーフとして知られる６残基のE1A関連モチーフ（アミノ酸304〜309位）を含み、これはE1Aの LXCXE（配列番号５）コアモチーフに関連する。さらにRIZ中のE1A関連モチーフは、cr1モチーフおよび「保存エピトープ１」（ce1）と称されるＣ末端モチーフ（E1AのＣ末端の同種モチーフに対する抗原関連性による（実施例IIを参照のこと））を含む。ラットRIZはまた、８個のジンクフィンガー、推定GTPaseドメイン、推定ロイシンジッパー、および推定核局在化シグナルを含む（図１および図３）。ラットRIZの３つすべてのE1A関連モチーフは、約150残基（AR；図３）からなり、そしてE1A 12Sタンパク質の高酸性領域に類似する酸性領域に位置される（M oranおよびMatthews、Cell 48:177-178(1987)）。RIZおよびE1Aの両方において、関連するモチーフは同程度に配置され、そしてcr1とcr2との間の間隔はほぼ同じである。しかし、ce1モチーフは、E1AよりもRIZにおいて、cr2により近傍に位置される（図2Aを参照のこと）。ラットRIZタンパク質配列は、規則正しく編成され、そして共通間隔により分けられた公知のGTPaseモチーフ（表１）を含む（Bourneら、Nature 349:117-127 (1991)）。G1またはWalkerＡ型モチーフ（GX₄GKX₇(I/V)；配列番号14）は、リン酸結合ループ（P-ループ）を表し、RIZのアミノ酸749位に生じ、そしてグアニンまたはアデニン核酸結合部位を同定する（Walkerら、EMBO J. １:945-951(1982) ;Sarasteら、Trends Biochem ．Sci. 15:430-434(1990)）。残基749位の周辺の配列はまた、多くの非レセプターチロシンキナーゼおよび他のタンパク質において保存されるsrc相同３（SH3）ドメインに類似である(図2B、パネルａ)；PawsonおよびGish、Cell 71:359-362(1992)）。RIZはまた、いくつかの潜在的なSH3結合モチーフを有するプロリンリッチ領域を含む(図2B、パネルｂ)；Renら、Science ，259:1157-1161(1993)）。配列の相同性は、哺乳動物RIZタンパク質が、Ｎ末端領域（フィンガー１〜３）およびＣ末端領域（フィンガー４〜６）において、２つに広く分けられたクラスターとして編成された８個のジンクフィンガーモチーフを含むことを示す。Na tional Biomedical Research Foundationタンパク質データベースの調査は、ジンクフィンガーについて最も有意な相同性を示すのは、RIZのフィンガー４〜６である（これはヒト転写リプレッサーPRDI-BF1のフィンガー１〜３と約39％（85 のうち33）が同一である）ことを示した（図2C参照；KellerおよびManiatis、前出、1991）。 RIZはまた、Ｎ末端の近傍に約100残基の領域を含み、これは「PR」と称される。なぜなら、それはPRDI-BF1（図2C参照）およびBlimp-1（Huang、前出、1994）の類似のＮ末端領域と42％の相同性を示すからである。PR（本明細書中で「PRドメインペプチド」とも呼ばれる）は、哺乳動物Evi-1タンパク質のＮ末端の一部に相同性を示し（Morishitaら、Cell 54:831-840(1988);Morishitaら、Oncogene ５:936-971(1990)）、そしてEvi-1の相同体であるC．elegansのegl-43タンパク質のＮ末端の一部に相同性を示す（Garrigaら、Genes Devel. ７:2097-2109(199 3)；図13参照）。 Evi-1タンパク質は、エコトロピックウィルス融合部位-１骨髄形質転換遺伝子の産物である。Evi-1遺伝子の異常発現は、ヒト急性骨髄形成異常性白血病（AML ）、脊髄形成異常症（MDS）、および慢性ミエロサイト白血病（CML）に生じる。これは、染色体バンド3q26を含む遺伝子の転座または転位によるためである（例えば、Morishitaら、Proc ．Natl．Acad．Sci.，USA 89:3937-3941(1992)を参照のこと）。図13に示されるEvi-1タンパク質の最初の102アミノ酸（配列番号100 ）は、5'非翻訳配列であることが以前に報告されたヌクレオチドによりコードされる（Morishitaら、前出、1990）；図13において108位に存在するメチオニン（すなわち、図13において示されるEvi-1の103番目のアミノ酸）は、開始コドンとして指定された。しかし、本明細書中で開示されるように、さらに上流のATGコドンの開始コドンとしての指摘は、図13に示されるように、Evi-1のPRドメインペプチドのブロックＡおよびＢを解明する（配列番号100）。一般に、PRドメインペプチドは約100〜約120のアミノ酸長であり、そして３つの高保存配列（ブロックＡ、Ｂ、およびＣと称される）を含み、これらは約10〜約12のアミノ酸からなり、約20〜約35のアミノ酸の低保存配列により分離される（図13参照）。RIZ、Evi-1、およびegl-43のそれぞれのブロックＡ、Ｂ、およびＣは、個々のエキソンによりコードされる。ラットRIZのPRドメインペプチド（アミノ酸36〜151位；配列番号２）およびヒトRIZのPRドメイン（アミノ酸37〜15 2位；図13、配列番号99参照）は、ヒトRIZがアミノ酸70位にリジンを含むのに対して、ラットRIZは等位（アミノ酸位69位）にアルギニンを含むこと以外は同一である。さらに、マウスRIZタンパク質（PRドメインペプチドのブロックＢおよびＣ（図14；配列番号104および105）を含む）の一部をコードするcDNAの分析は、推定アミノ酸配列（すなわち、図14の最初の75アミノ酸（配列番号105））がヒトRIZのPRドメインの対応する領域（すなわち、図13の45〜120位のヒトRIZと称されるアミノ酸；配列番号99）と同一であることを明らかにした。 PRドメインタンパク質の間の相同性は、図13に示されるアミノ酸配列を調べることにより明白である（配列番号98〜101）。保存アミノ酸の置換を考慮する場合、哺乳動物PRドメインペプチド（配列番号98〜100）は、示されるそれら全長のそれぞれの間で約33％以上の相同性を示す。さらに、高保存ブロックＡ、Ｂ、およびＣは、それぞれ、３つの哺乳動物タンパク質の間で、約75％、50％、および55％の相同性を示す。加えて、X101と称される配列（ブロックＢとＣとの間に位置する）は、示される哺乳動物PRドメインペプチドの間で約38％の相同性を示す。一般に、PRドメインペプチドはアミノ酸配列Y-A-X100-B-X101-C-Zにより定義され得る。ここで、Yは独立的に選択された約８〜13個のアミノ酸である；X100 は独立的に選択された約20〜35個のアミノ酸である；X101は独立的に選択された約20〜35個のアミノ酸である；Zは独立的に選択された約８個のアミノ酸である；Aは、Ile-X2-X3-Gly-X4-X5-X6-Gly-X7-X8-X9-X10であり、ここでX6はPheまたはIle、X7はProまたはVal、X10はGlyまたはLys、そしてX2、X3、X4、X5、X8およびX9はそれぞれ独立的に選択されたアミノ酸であり、好ましくは、X3はLysまたはVal、X5はArgまたはLys、X6はPhe、X7はPro、X9はIleまたはVal、そしてX10 はGlyである。Bは、Ile-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21であり、ここでX11はAspまたはCys、X15はProまたはGlu、X16はGluまたはAsp、X20はTr pまたはPhe、X21はMetまたはLeu、そしてX12、X13、X14、X17、X18およびX19はそれぞれ独立的に選択されたアミノ酸であり、好ましくは、X11はAsp、X12はGly またはAla、X17はLysまたはVal、X18はSerまたはGly、X19はAsnまたはSer、そしてX20はTrpである。そしてCは、X22-X23-L-X24-X25-X26-X27-X28-X29-X30-Dであり、ここでX22はGluまたはGln、X23はGluまたはAsn、X24はLeuまたはIle、X25は ValまたはLeu、X30はArgまたはGlu、X27およびX29はそれぞれ独立的に選択されたアミノ酸であり、そしてX26およびX28はそれぞれ独立的に存在しないかまたは１個のアミノ酸であり、好ましくは、X23はGlu、X24はLeu、X26はTrpまたはPhe 、X27はTryまたはMet、そしてX28は、存在する場合、AsnまたはLysである。本発明は、PRドメインを転写調節因子の構成要素として提供する。転写調節因子は、ドメインを特定の遺伝子プロモーターまたはエンハンサーに作動可能に連結する。ここで、融合タンパク質の標的遺伝子への結合は、標的遺伝子の発現を変化し得る。本明細書中で使用される用語「転写調節」は、転写の抑制および転写の活性化を包含する。特に好ましくは、PRドメインを含む転写調節因子が、配列番号２のアミノ酸17〜900位または配列番号４のアミノ酸18〜910位を含む。さらに本発明は、PRドメインまたはPRドメインを含むRIZ活性フラグメントを、PRドメインを結合する細胞において転写因子または発ガン性タンパク質を同定するためのプローブとして提供する。ペプチドと別の細胞分子との間の相互作用を検出する方法は、PRドメインと転写因子または発ガン性タンパク質との間の結合の検出に有用である。このような方法は当該分野において周知であり、そして、例えば、２酵母ハイブリッド系を包含する（FieldsおよびSong、Nature 340:2 45-246(1989);Vojtekら、Cell 74:205-214(1993);Durfeeら、Genes Devel. ７:5 55-569(1993)、それぞれが本明細書中で参考として援用される）。２酵母ハイブリッド系のようなインビボ転写活性化アッセイは、特に、タンパク質の会合を同定および操作するために有用である。このようなアッセイを用いて得られた結果は、細胞中に自然に生じる相互作用を反映するようである。またインビトロアッセイの利用（例えば、GST融合PRドメイン（実施例IIを参照））は、PRドメイン結合標的を同定するおよび単離する、簡単、迅速ならびに安価な方法を提供し得る。このようなインビトロアッセイは、特に、インビボで得られた結果の確認に有用である。ヒトRIZを、ラットRIZcDNAをハイブリダイゼーションプローブとして用いて、ヒトcDNAおよびゲノムDNAライブラリーよりクローニングした。完全ヒトRIZ cDN A配列は図9Aに示される（配列番号３）。これは1719アミノ酸残基を有するポリペプチドをコードする（図9A、配列番号４を参照）。ヒトRIZの２つの代替5'末端をコードするクローンもまた得られた（図9B、配列番号95および96を参照）。ヒトRIZ遺伝子コード領域は８個のエキソンによりコードされ、そして染色体1 p36上に位置される（実施例VIを参照）。ヒトRIZ遺伝子の対立遺伝子変異体が本明細書において開示される。RIZ D283対立遺伝子は、Asp残基をアミノ酸283位に有する（配列番号４）。一方、RIZ E283対立遺伝子はGluを有する（図9A、D283 対立遺伝子を参照）。RIZ D283対立遺伝子は、RIZ E283対立遺伝子と比較して、ヒト集団において２倍よりも多い頻度で生じることが見積もられる。２つの対立遺伝子間の差異は、RIZ D283対立遺伝子のヌクレオチド969位のＴ（配列番号３）とRIZ E283対立遺伝子の同位置のＡである。ヒトRIZの283位の残基をコードするヌクレオチド（配列番号４）は、図9Aに示されるヌクレオチド952〜981位のトリプレット（triplet）反復ヌクレオチド領域（配列番号３）内に包含される。D283対立遺伝子をコードするトリプレット領域は(GAA)₅(GAT)₅（5-5と称される）である。一方、E283対立遺伝子をコードするトリプレット領域は(GAA)₆(GAT)₄（6-4と称される）である。他の対立遺伝子または変異体は、Malme 3M黒色腫細胞株の１対立遺伝子において検出された(GAA )₄(GAT)₄トリプレット配列（4-4と称される）、ならびにSK-MEl-64およびMeWo黒色腫細胞株の１対立遺伝子において検出された(GAA)₇(GAT)₄配列（7-4と称される）を包含する（実施例VIを参照）。推定ラットRIZアミノ酸配列（配列番号２）と推定ヒトRIZアミノ酸配列（配列番号４）とは、84％の相同性を示す。ラットおよびヒトRIZタンパク質は、類似の配列モチーフを有し、cr1、cr2、ce1、PR、ジンクフィンガー、SH3、SH2、および核局在化シグナルを包含し、そして同様の大きさである；ラットRIZ（配列番号２）は、1706アミノ酸を含み、そして算定分子量187,437ダルトンを有する。一方、ヒトRIZ（配列番号４）は、1719アミノ酸を含み、算定分子量188,894ダルトンを有する。ラットRIZに対して産生されたウサギ抗血清は、ヒトRIZと交差反応する（実施例IIを参照）。 RIZタンパク質は、最初、細胞核内に存在する。RIZ mRNAは、最初に細胞の神経分泌内起源において発現され、そして成体よりも胎児においてより多い量で発現される（図11を参照）。RIZはラット細胞において、250kDのリンタンパク質として発現される。本明細書中で使用される用語「RIZ」は、図9A（配列番号４）に示されるヒトR IZまたは図1A（配列番号２）に示されるラットRIZのアミノ酸配列を実質的に有することを意味する。用語「RIZ」は、RIZの5'末端変異体のような正常変異体（図9B、配列番号95および96、102および103を参照）および本明細書中で開示される対立遺伝子変異体を包含する。このような正常変異体はアミノ酸配列において異なるが、GTP、DNA、またはRbに結合するような同一または同様の機能活性を共有する（実施例を参照）。RIZは、「正常RIZ」または「野生型RIZ」と呼ばれ、これらすべては変異RIZと区別される。対立遺伝子変異体に加え、RIZはまた、RI Zエキソンのサブセットによりコードされ、そしてRIZと同様に機能する短縮型RI Zタンパク質であり得る。このような変異RIZは、選択的RNAスプライシングにより細胞中で生成され得る。これは、ヒトRIZの３つの5'末端変異体に起因し得る（図9Aおよび図9B、配列番号３、４、95、96、102および103を参照のこと）。用語「RIZ」はまた、RIZの活性フラグメントを含む、RIZのペプチドフラグメントを包含する。本明細書中で使用される用語「活性フラグメント」は、全長RI Zタンパク質のペプチドの一部を意味し、これは、対応する全長タンパク質に特徴的な活性を少なくとも１つ有する。ラットRIZのペプチドの一部（配列EIRCEEK PEDLを有する（配列番号６））またはヒトRIZのペプチドの一部（配列EIRCDEKPE DLを有する（配列番号91）は、Rbに結合し得るRIZの活性フラグメントの例である。さらに、PRドメインを含むRIZのペプチド部分（例えば、ラットRIZのアミノ酸36〜151位（配列番号２）またはヒトRIZのアミノ酸37〜152位（配列番号４；また、配列番号99を参照のこと））は、RIZタンパク質の活性フラグメントの例である。これは、転写因子と相互作用し得、そして転写の調節に関与し得る。いくつかの場合において、RIZタンパク質の活性フラグメントは、核に存在する場合のみ活性である。このような場合、活性フラグメントは、核局在化シグナル（例えば、ヒトRIZのアミノ酸880〜884位（配列番号４）またはラットRIZのアミノ酸867〜874位（配列番号２）を含む）を含み得る。核局在化シグナルは、RIZの活性フラグメントの別の例である。RIZの活性フラグメントに会合し得る他のRIZ 活性としては、亜鉛イオン依存形式でDNAに結合する能力、GTPまたは抗RIZ抗体に結合する能力、あるいは抗RIZ抗体を得るためにハプテンまたは免疫原として作用する能力が挙げられる。本発明は、RIZの活性フラグメント（例えば、EIRCEEKPEDL（配列番号６）またはEIRCDEKPEDL（配列番号91））を提供し、これはRIZ cr2コアモチーフのアミノ酸配列を実質的に含み、フラグメントの活性がRb結合であるときにシステイン残基が必要とされる。ヒトRIZまたはラットRIZのフラグメントを含むcr2コアモチーフは、RIZの活性フラグメントの例である。このような活性フラグメントは、組換えDNA法により、ペプチド合成により、またはRIZタンパク質の酵素的切断により産生され得る。本発明はまた、本明細書中で援用されるRIZ cr2コアモチーフを有する天然に存在しないポリペプチドを提供する。このようなポリペプチドは、例えば、周知の組換えDNA法を用いて、またはペプチド合成により産生され得る。 cr2配列（例えば、アミノ酸配列EIRCEEKPEDL（配列番号６）およびEIRCDEKPED L（配列番号91））を含むRIZタンパク質またはRIZポリペプチドは、Rbに結合し得、そしてそれゆえ、サンプルよりRbを単離するために有用である。精製Rbは、例えば、被験体が変異Rbを有するか否かを検出する臨床試験においてコントロール標的として使用され得る。さらにRbは、サンプルがRbと結合し得るRIZを有するかまたはRbに結合し得ない変異RIZを有するかを検出する試薬として使用され得る。Rbの機能に影響し、そしてガンに特徴的な変異体は当該分野において周知である（例えば、Leeら、Tumor Suppressor Genes、第11章、Marcell Decker(19 90)を参照のこと）。 Rbを精製するために、RIZタンパク質が適切な条件下において、Rbを含有するサンプルと接触させ得、これはRIZ-Rb複合体の形成を許容する。複合体形成の適切な条件は経験に基づいて決定され得、そして、例えば、RIZのRbへの結合を許容する適切な緩衝液濃度、pH、時間、およびインキュベーション温度を包含する。RIZ-Rb複合体はサンプル中の未結合物質より分離され得、そしてRbは複合体より解離され得、そして実質的に精製された形態で得られ得る。実質的に精製されたRbが、例えば、アフィニティクロマトグラフィーの使用により得られ得る。これは、RIZを固体支持体に結合する工程、サンプルがRBのRIZ への結合を許容する支持体に載せられる工程、未結合物を除去するために支持体を洗浄する工程、およびRbを支持体より溶出する工程を含む。有用な固体支持体としては、例えば、アガロース、Sepharose^TM、またはプラスチックが挙げられる。RIZは、直接化学結合により、または非直接的な手段（例えば、支持体に結合された抗RIZ抗体と親和性相互作用）により固体支持体に接合され得る。RIZの支持体への結合のための他の非直接的手段は、RIZに実在する公知のリガンド／レセプター対を組み込む工程、対応する実在物を直接支持体に結合する工程とともに包含する。例えば、ビオチンはRIZと結合され得、そしてアビジンはRIZを支持体に結合するために直接固体支持体に結合され得る。また、RIZはグルタチオンＳ-トランスフェラーゼの融合物として発現され得（実施例IIを参照）、そして融合タンパク質はグルタチオン結合支持体に結合され得る。本発明はまた、RIZ結合試薬を提供する。本明細書中で使用される表現「RIZ結合試薬」は、RIZと特異的に結合する化学的または生物学的分子を意味する。RIZ に関して本明細書中で使用される用語「特異的な結合」は、定義された一連の条件下で、RIZ結合試薬がRIZと相互作用するが、関係しない分子または変異RIZとは相互作用しないことを意味する。Rbおよび抗RIZ抗体はRIZ結合試薬の例である。本発明はまた、変異RIZ結合試薬を提供する。本明細書中で使用される表現「変異RIZ結合試薬」は、変異RIZに特異的に結合するが、野生型RIZには結合しない化学的または生物学的分子を意味する。この場合、変異RIZ結合試薬は、定義された一連の条件下で、変異RIZと相互作用するが、野生型RIZとは相互作用しない。 RIZに特異的なRbおよび抗体は、RIZに特異的に結合し得る試薬の例である。本明細書中で使用される用語「抗体」は、広範な意味で使用され、以下を包含する：ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ならびに抗体のポリペプチドフラグメント（特定抗原への特異的結合活性を少なくとも１×10⁵M^-1を保持する）。例えば、抗RIZ抗体のFab、F(ab')₂、Fv、およびFdフラグメントのようなフラグメントが、RIZに対する特異的な結合活性を保持し得、これにより、フラグメントが抗体の定義の範囲内に含まれることは当業者の範囲内である。さらに、本明細書中で使用される用語「抗体」は、天然に存在する抗体、ならびに天然に存在しない抗体および結合活性を保持する抗体のフラグメントを包含する。このような天然に存在しない抗体は、固相ペプチド合成法を用いて構築され得るか、組換え的に産生され得るか、または例えば、可変重鎖および可変軽鎖からなる組み合わせライブラリーのスクリーニング（Huseら、Science 246:1275-1281(1989 )、これは本明細書中において参考として援用される）により得られ得る。 RIZに特異的な抗体が、例えば、HarlowおよびLane、Antibodies: A laborator y manual（Cold Spring Harbor Laboratory Press、1988）に記載され、本明細書中で参考として援用される周知の方法の使用により調製され得る。例えば、RI Zタンパク質またはRIZタンパク質の一部は、免疫原として用いられ得、これは、天然の供給源から調製され得るか、組換え的に産生され得るか、または、RIZタンパク質の一部の場合、化学的に合成され得る。RIZタンパク質の非免疫原性ペプチドは、血清アルブミンまたはキーホールリンペット（keyhole limpet）ヘモシアニンのようなキャリア分子に結合することにより免疫原を作製し得る（例えば、HarlowおよびLane、前出、1988に記載）。さらに、RIZ融合タンパク質は、実施例IIに記載されるように発現され得る。このような融合タンパク質は容易に精製され得、そして免疫原として用いられ得る（実施例IIを参照）。これらの方法は、種々の抗RIZ抗体の産生に用いられ得る。ポリクローナル抗体は、例えば、ウサギまたはヤギにおいて惹起され得る。さらに、モノクローナル抗体は、周知の方法(例えば、Reedら、Anal ．Biochem. 20 5:70-76(1992)を参照のこと、この文献は本明細書中で参考として援用される；H arlowおよびLane、前記、1988も参照のこと)を用いて入手し得る。例えば、RIZ で免疫したマウス由来の脾臓細胞を、適切なミエローマ細胞株(例えば、SP2/0またはP3x653.Ag8ミエローマ細胞)と融合してハイブリドーマ細胞を作製し得る。クローン化ハイブリドーマ細胞株を、標識RIZ免疫原を使用してスクリーニングしてモノクローナル抗体を分泌するクローンを同定し得る。所望の特異性および親和性を有する抗体を発現するハイブリドーマを単離し、そして抗体の連続的な供給源として利用し得る。モノクローナル抗体の信頼できる供給源は、例えば、以下に記載するような診断キットを調製するために望ましい。変異RIZタンパク質に特異的な抗体はまた、全長変異RIZタンパク質または変異を含むそのタンパク質のフラグメントのいずれかで免疫することによって上記の方法を使用して調製され得る。変異配列に対する免疫応答を導く方法もまた、当該分野において周知であり、そして例えば、特定のアジュバントを使用することまたは野生型RIZ配列に対して動物を予め寛容化すること(pre-prior tolerizati on)を包含する。このような寛容化は、抗Ｔ細胞抗体または免疫抑制剤の投与と組み合わせて、動物を野生型RIZで免疫することによって実行され得る。変異配列に対するモノクローナル抗体は、ハイブリドーマの集団を、変異RIZ配列と結合するが野生型RIZ配列とは結合しない抗体を発現するハイブリドーマについてスクリーニングすることによって入手され得る。本発明はまた、実質的に精製された核酸分子を提供する。この核酸分子は、哺乳動物RIZのようなRIZをコードする。例えば、本発明は、ヒトRIZ(図9A；配列番号３)およびラットRIZ(図1A；配列番号１)をコードするヌクレオチド配列を実質的に有する、実質的に精製された核酸分子を提供する。このヌクレオチド配列は、ヒトRIZ(図9B；配列番号95および96)ならびにラットRIZ(図1B；配列番号94)の別(alternative)の5'ヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を包含する。図9Aに示されるヒトRIZをコードするcDNA配列(配列番号３)は、さらに、その一部分が図9Cに示される(配列番号97)3'非翻訳配列を包含する。さらに、本発明は、図14に示されるヌクレオチド配列(配列番号104)を実質的に含むマウスRIZをコードする、実質的に精製された核酸分子を提供する。本明細書で用いられる用語「実質的に精製された核酸分子」は、細胞内で核酸分子と通常会合している脂質、タンパク質、核酸または他の細胞性物質が比較的混入していない形態である核酸分子を意味する。実質的に精製された核酸分子は、例えば、本明細書中に記載の組換えDNA法(Sambrookら、Molecular Cloning: A l aboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)も参照のこと；この文献は本明細書中で参考として援用される)によって入手され得るかまたは化学的に合成され得る。 RIZに関して本明細書で用いられる用語「実質的に(その)ヌクレオチド配列("s ubstantially the nucleotide sequence")」は、例えば、ヒトRIZ(配列番号３、 95および96)、ならびに例えば、配列番号３、95および96に示されるものとは異なるヌクレオチドを含むが、遺伝コードの縮重の結果として、配列番号４、102 および103にそれぞれ示されるものと同じアミノ酸配列をコードする同様な配列を意味する。さらに、ラットRIZヌクレオチド配列(配列番号１および94)、ならびにラットRIZ配列に対応するマウスRIZヌクレオチド配列(配列番号104)はヒトR IZをコードするヌクレオチド配列(配列番号３)と実質的に同様であると考えられる。簡便のために、RIZをコードする核酸分子のコード鎖を示す。しかし、相補鎖もまた開示された核酸分子に包含されることを認識すべきである。従って、他に示されなければ、本明細書中での核酸分子またはヌクレオチド配列に対する言及は、相補的配列を包含することを意味する。本発明の核酸分子は、本明細書中で開示される対立遺伝子RIZ変種、および選択的RNAスプライシングにより細胞中で生成され得る遺伝子の特定のエキソンのみを含むRIZの変種のような変種RIZをコードし得る。さらに、本発明の核酸分子は、ポリペプチドEIRCEEKPEDL(配列番号６)およびEIRCDEKPEDL(配列番号91)を含むRIZの活性フラグメントのようなRIZの一部分をコードし得る。これらのポリペプチドは、RbポケットまたはPRドメインペプチド(これは、転写因子に結合し得、そして転写調節に関与し得る)を含むRIZフラグメントに結合する(例えば、図1 3；配列番号98〜101を参照)。本発明はまた、哺乳動物RIZをコードする核酸分子の一部分と、比較的ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を提供する。RIZに関して本明細書中で使用される場合、用語「特異的にハイブリダイズする」は、規定されたハイブリダイゼーション条件のセット下で、ヌクレオチド配列が、RIZをコードする核酸分子と相互作用し得るが関連のない核酸分子とは相互作用し得ないことを意味する。RIZと特異的にハイブリダイスするヌクレオチド配列は、RIZをコードするヌクレオチド配列に相補的であり得るか、またはRIZをコードする配列またはその一部分であり得る。 RIZをコードする核酸分子、またはRIZをコードする変異核酸分子に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列は、長さが少なくとも10ヌクレオチドであるべきであり、そして例えば、RIZをコードするクローン化核酸分子の制限エンドヌクレアーゼ消化、または図1Aまたは1B(配列番号１または94)もしくは図9A、9B または9C(配列番号３、95、96および97)に示される核酸分子の一部分のPCR増幅、あるいは化学合成によって調製され得る。RIZ PRドメインペプチド(図13を参照)の高度に保存されたブロックＡ、ＢまたはＣをコードするヌクレオチド配列の１つ以上とハイブリダイズし得るヌクレオチド配列は、例えば、PRドメインペプチド含有ファミリーのタンパク質の他のメンバーをコードする核酸分子を同定するに特に有用であり得る。比較的ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、経験的に決定され得るか、または例えば、ハイブリダイズするヌクレオチド配列および標的配列の相対的なGC：AT含量、ハイブリダイズするヌクレオチド配列の長さ、ならびに存在する場合には、ハイブリダイスするヌクレオチド配列と標的配列との間のミスマッチの数に基づいて推定され得る。所望であれば、ハイブリダイズするヌクレオチド配列は、検出可能に標識され、そしてプローブとして使用され得るか、またはPCRのプライマーとして使用され得る。ヌクレオチド配列を検出可能に標識するための方法は、当該分野において周知である(例えば、Sambrookら、前記、1 989を参照のこと：またAusubelら、Current Protocols in Molecular Biology、第２巻第10章(Greene Publ.、NY、1989)この文献は本明細書中で参考として援用される)。本明細書で使用される場合、用語「RIZをコードする変異核酸」は、エキソンに変異を有し、従って変異RIZタンパク質をコードする核酸分子、ならびにエキソン以外のRIZ遺伝子領域に変異を有する核酸分子を包含する。エキソンの外側で生じるRIZ遺伝子の変異は、細胞においてRIZの発現を調整する遺伝子の調節エレメントを包含し得る。変異され得るこのような調節エレメントには、例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、またはイントロン−エキソンスプライシング部位が挙げられる。用語「変異RIZ」もまた、変異RIZのペプチドを包含し、これは変異RIZの活性フラグメントを含む。 RIZ遺伝子の調節エレメントに生じる変異は、細胞におけるRIZの発現レベルに対して重大な影響力を有し得る。さらに、RIZのリーディングフレーム内の終止コドンをコードするRIZエキソンにおける変異は、不活性であり得るか、変化した活性を有し得るか、または細胞において迅速なタンパク質分解を受け得る短縮型RIZを生成し得る。同様に、RIZをコードする遺伝子の実質的な部分を含む欠失は、RIZ発現の喪失を生じ得る。本明細書において使用される場合、用語「変異RIZ」は、RIZエキソンに変異を有する任意のRIZを包含する。この変異は、細胞によって通常発現される野生型RIZ の機能的活性とは異なる機能的活性を有するRIZの発現を生じる。変異RIZに特徴的な機能的活性の変化は、野生型RIZ配列における１以上のアミノ酸の付加、欠失または置換に起因し得る。このような変異は自然に生じ得るか、または例えば、Rbについて生じるように、集団中に内在して、世代間で遺伝し得る。変異RIZ は、ヒトRIZ(配列番号３)の437位のヌクレオチドのＧからＡへの変化を有し得る。これは、アミノ酸106位でCys残基の代わりにTyr残基を有する変異RIZの発現を生じる(配列番号４)。本発明はまた、比較的ストリンジェントな条件下で、RIZをコードする変異核酸分子に特異的にハイブリダイスするが、野生型RIZにはハイブリダイスしないヌクレオチド配列を提供する。この場合、ハイブリダイズする配列は、RIZ遺伝子の変異を含む部分に相補的であるべきである。特定のRIZ対立遺伝子の発現は、RIZ遺伝子の変異のために、ガン細胞において変化され得る。本明細書中で開示されるように、いくつかの黒色腫腫瘍細胞は、この細胞に存在する２つのRIZ対立遺伝子のうちの１つをコードするmRNAを発現できない(実施例VIを参照)。発現されない対立遺伝子は、RIZの発現に影響を及ぼす、RIZをコードする配列の外側の変異を含むようである。RIZタンパク質またはRIZ遺伝子を介するこのような変異の検出は、ガンのような病理状態の診断となり得る。変異RIZは、例えば、RIZをコードする核酸分子を部位特異的変異誘発し、次いで変異誘発した核酸分子をスクリーニングしてコードされた変異RIZを同定することによって入手し得る。RIZの機能的活性(例えば、Rb結合、DNA結合またはGTP 結合)に影響を及ぼす変異は、このような活性を喪失した変異体についてスクリーニングすることによって検出され得る。変異RIZ、例えば、変異ヒトRIZ(これは例えば、Rbに結合し得るが別のRIZ活性を欠く)の細胞における発現は、野生型 RIZのRbとの会合を変化させ得、そして細胞の機能(例えば、細胞の増殖能)に影響を及ぼし得る。 RIZの核における発現能力は、そのDNA、RbおよびGTP結合能力(実施例IIおよび IVを参照のこと)ならびにそのBlimp-1(PRDI-BF1)分化因子との相同性とともに、 RIZが転写調節タンパク質または細胞分化因子として機能し得ることを示す。従って、細胞の機能は、細胞において(ここで、発現されたRIZは、細胞中のRbおよびDNAに結合し得る)RIZを発現させることによって調整され得る。細胞機能はまた、完全なRIZタンパク質またはPRドメインペプチドを含むRIZの活性フラグメントが転写調節因子として作用する能力によって調整され得る(実施例VIIを参照) 。本明細書中で使用する場合、用語「細胞の機能」は、例えば、増殖および分化を含む細胞活性を意味する。本明細書中で使用される場合、用語「調整する」は増加させることまたは減少させることを意味する。本明細書中で開示されるように、細胞の機能は、細胞におけるRIZの発現または変異RIZの発現の変化したレベルにより調整され得る。本発明は、RIZまたはRIZの活性フラグメントをコードするDNA配列を、細胞において発現させることによって、この細胞の機能を調整するための方法を提供する。このようなDNA配列は、宿主細胞に、RIZをコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結された遺伝子調節エレメントを有する適切な発現ベクターを導入することによって発現され得る。発現ベクターは、ポリペプチドの構成的発現、または所望であれば、誘導性発現を提供し得る。適切な遺伝子調節エレメントを有する発現ベクターは、発売元から購入可能であるか、または周知の方法を使用して構築され得る。治療目的のためには、細胞を、組織培養においてトランスフェクトし、次いで被験体に投与し得るか、あるいは、ウイルスベクターを使用して RIZをコードする核酸を被験体の細胞に導入し得る。 RIZの転写活性は、RIZが細胞核に局在化することを必要とするので、RIZの活性フラグメントは、そのフラグメントのサイズに依存して、核局在化シグナルを包含することを必要とし得る。例えば、RIZ活性フラグメントは、アミノ酸867位〜874位(配列番号２)でラットRIZに、またはアミノ酸880位〜884位(配列番号４) でヒトRIZに内在する核局在化シグナルを包含し得る。あるいは、RIZ活性フラグメントに含まれる核局在化シグナルは、非RIZタンパク質に由来し得る。細胞核にタンパク質を導き得る種々の核局在化配列が、当該分野において公知である( 例えば、Dingwallら、EMBO J. 8:69-71(1987)を参照のこと；この文献は本明細書中で参考として援用される)。本明細書中で開示されるように、RIZは、正常な成体心筋細胞の成長を調節し得、そして心筋細胞死に続く生存細胞の増殖を防止し得る。RIZは、RIZのcr2ドメインを介してRbと相互作用することによって、細胞周期のG₁期において細胞を維持するように機能し得る。さらに、細胞の機能的分化状態(細胞周期のG₁期での細胞の維持を含む)は、他のRIZドメイン(例えば、GTP結合ドメインおよびジンクフィンガードメイン)の作用を介して影響され得る。心臓損傷を有する被験体における心筋細胞の再生は、RIZ活性を直接的に減少させることにより、またはRIZの結合に続いて生じるRb活性を減少させることにより促進され得る。RIZ活性を、このような細胞において、発現ベクターをこの細胞に導入することによって減少させ得る。この発現ベクターは、変異RIZポリペプチドまたは活性フラグメント(Rbに結合し得るがRIZの成長抑制特性を欠く) をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を有する。配列EIRCEEKPEDL(配列番号６)およびEIRCDEKPEDL(配列番号91)は、このようなペプチドの例である。本明細書中で使用される場合、用語「RIZの成長抑制特性」は、RIZがG₁での細胞の分化および維持をもたらす能力を意味する。実際、この細胞は、延長されたG₁ 期またはG₀期にあり得るか、あるいはG₀/G₁境界でブロックされ得る。簡便のために、任意のこのような細胞を、G₁において維持または抑制されているという。 RIZの成長抑制特性または分化特性は、cr2ドメイン以外のこの分子の領域によってまたはRbポケットへの結合に関与するcr2と共同して媒介され得る。ニューロンは、心筋細胞と同様に、通常、成体では増殖しない。RIZは、優先的に、神経細胞において発現される(実施例Ｖ)。このことは、これらの細胞のG₁ 抑制および分化を媒介することにおけるRIZの役割を示す。神経細胞において増殖を誘導する能力は、神経組織の損傷後の治癒をして、神経変性疾患(neurodege nerative disease)(例えば、パーキンソン病、ハンチントン病またはアルツハイマー病)あるいは麻痺すなわち運動神経障害を処置することのために有用であり得る。従って、筋肉細胞においてRIZタンパク質の活性を減少させるための開示された方法は、同様に神経変性疾患の治療法を提供し得る。本明細書中で開示されるように、RIZ遺伝子は染色体バンド1p36に存在する。従って、RIZをコードするヌクレオチド配列の変異は、ガン、特に黒色腫、神経芽腫、白血病、および乳ガンのような、1p36を含む欠失または再配置(rearrange ment)に関連することが知られているガンの発症に関与し得る。黒色腫細胞は、R IZの対立遺伝子の発現の減少または欠落、ならびにこの細胞において発現される RIZタンパク質の全体量の減少を示し得る。これらの結果は、黒色腫がRIZタンパク質レベルの減少、およびこのためのRIZ機能レベルの減少によって特徴付けられ得ることを示す。これらのことは、遠位染色体1pにおける変化に続いて生じる黒色腫腫瘍細胞の選択的成長優勢を説明し得る(Dracopolら、Proc ．Natl．Acad. Sci.，USA 86:4614-4618(1989))。RIZの発現レベルに影響を及ぼす遠位染色体1 pにおける変異は、遺伝性網膜芽細胞腫の生存個体(survivor)において観察される黒色腫(Rb遺伝子のホモ接合型不活化(homozygous inactivation)なしで生じる )の危険性の増加の原因であり得る。RbはRIZに結合するので、RIZ対立遺伝子の発現の減少に起因する、腫瘍細胞におけるRb-RIZ複合体のレベルの減少は、Rb変異を伴わなずにこの細胞においてRb腫瘍抑制性活性の喪失を生じ得る。 RIZが分化因子であるという開示によって、RIZ機能の喪失およびガン発症はさらに支持される。そのようなものとして(例えば)、変異RIZは、Rbポケット(細胞増殖の調節に関与するRb分子中の部位)への結合によって細胞成長の調節に影響を及ぼし得る。従って、本発明は、変異したまたは失われたRIZ対立遺伝子を有するガン細胞に、この細胞中で正常なRIZタンパク質を発現させることによって、正常な細胞成長を回復させるための方法を提供する。実施例VIに示されるように、腫瘍細胞におけるRIZの発現を、この細胞をRIZ発現ベクターでトランスフェクトすることによって増加させることは、細胞成長の減少を生じる。 RIZが、第２の分子(例えば、Rb、あるいはDNAまたはRNAのような核酸)と結合することによって細胞の機能を調整し得るという開示は、細胞においてRIZと第２の分子との会合を有効に変化させ、そしてその結果、細胞の機能を調整し得る薬剤を同定する手段を提供する。従って、本発明は、RIZと第２の分子との会合を変化させ得る有効な薬剤を同定するために有用なスクリーニングアッセイを提供する。RIZと結合する第２の分子はまた、転写因子またはガン原性タンパク質であり得る。このような第２の分子は、RIZのPRドメインと結合し得る。 RIZと第２の分子(例えば、Rb)との会合を減少させ得るか、またはRIZの活性を減少させ得る有効な薬剤は、細胞を、Rbに媒介されるG₁停止から解放するために有用であり得る。あるいは、RIZと第２の分子(例えば、RbまたはDNA)との会合を増加させるか、あるいはRIZの活性を増加させる有効な薬剤は、ガン細胞の無制限の成長を、細胞においてより強力なG₁停止シグナルを提供することによって減少させるために有用であり得る。 RIZに特異的に結合するヌクレオチド配列は、当該分野において周知である方法を使用することによって検出され得る(例えば、El-Deiryら、Nat ．Genet. 1:4 5(1992)を参照のこと；この文献は、本明細書中で参考として援用される)。ゲノムDNAを、例えば、超音波処理により処理して均一サイズのフラグメントを作製し得る。このフラグメントをRIZに対する結合能についてスクリーニングし得る。RIZに結合するゲノムDNA配列は、例えば、抗RIZ抗体およびプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して単離され得る。単離されたDNA配列は、PCRによって増幅され得る。この増幅は、もとのゲノムDNAフラグメントを、PC Rプライマーへのアニーリングに適切な「キャッチリンカー」(El-Deiryら、前記、 1992)に連結することによって容易にされ得る。少なくとも約10ヌクレオチドからなり、そして「キャッチリンカー」を含むランダムオリゴヌクレオチドもまた、RIZと結合し得る配列を同定するためにスクリーニングされ得る。例えば、RIZタンパク質は、フィルターに固定化され、次いでオリゴヌクレオチドとともに、RIZがRIZ結合配列に比較的特異的に結合することを可能にする条件下でインキュベートされ得る。非結合オリゴヌクレオチドはフィルターから洗い落とされ得、次いで特異的に結合した配列が溶出されそして PCRによって増幅され得る。３以上のサイクルの結合、溶出および増幅の後、コンセンサスRIZ結合配列が得られ得る。所望であれば、コンセンサスRIZ結合配列は、ゲノムDNAライブラリーをスクリーニングしてRIZ結合配列を含むゲノムDNA 配列を得るために使用され得る。薬剤は、単純なまたは複雑な有機分子、ペプチド、ペプチド模倣物(peptido-m imetic)、タンパク質、炭水化物またはオリゴヌクレオチドのような、RIZと第２の分子との会合を変化させるかまたはRIZの活性を変化させる能力を有する化学的または生物学的分子であり得る。RIZに関して、用語「有効な薬剤」は、RIZと第２の分子との会合を実際に変化させ得るか、またはRIZの活性を実際に変化させ得る薬剤を意味する。有効な薬剤は、例えば、RIZまたは変異RIZをコードするか、あるいはRIZまたは変異RIZをコードするヌクレオチド配列に相補的である核酸分子であり得る。このような核酸分子は、発現制御配列に作動可能に連結されたRIZコード配列を有する発現ベクター中に含まれ得る。有効な薬剤はまた、RIZ mRNA配列に相補的な、アンチセンスRIZまたはリボザイムであり得る。このような薬剤は、細胞におけるRIZの発現レベルを減少させ得、その結果、細胞において第２の分子と会合しているRIZの量を変化させ得る。 RIZに関して本明細書で用いられる場合、用語「会合を変化させる」は、RIZと第２の分子との会合が、有効な薬剤の存在によって、増大するかまたは減少するかのいずれかであることを意味する。細胞中のRIZと第２の分子との会合が変化する結果、RIZの活性または第２の分子の活性が増大または減少し得、このことが細胞の機能を調整し得る。RIZに関して本明細書で用いられる場合、用語「活性を変化させる」は、有効な薬剤が、例えば、第２の分子への結合の結果生じる RIZの活性を改変することによって、上記のようにRIZと第２の分子との会合を変化させるようなことによって、細胞におけるRIZの活性を増大または減少し得ることを意味する。 RIZと第２の分子との会合を変化させる有効な薬剤は、RIZと第２の分子とが会合する能力を妨害し得るか、または結合したRIZ−第２の分子の複合体の解離を引き起こし得る。有効な薬剤の存在下で、RIZと第２の分子との会合が改変され得、このことが細胞におけるRIZまたは第２の分子の活性を変化させ得る。変化した活性の結果、細胞の増殖能のような細胞機能が調整され得る。従って、RIZ と第２の分子との会合を変化させる有効な薬剤の同定は、細胞増殖を調整するための手段を提供する。 RIZとRbとの会合を変化させる有効な薬剤は、ガン細胞において生じるような過剰な細胞増殖によって、または細胞死に応答して再生することができない組織において生じるような不十分な細胞増殖によって一部特徴付けられる病的状態を処置するための医薬として有用であり得る。配列EIRCEEKPEDL(配列番号６)またはEIRCDEKPEDL(配列番号91)を有するペプチド(これは、RIZのcr2コアモチーフを含む)は、有効な薬剤の例である。いずれのペプチドも、RIZとRbとの間の会合を変化させ得(実施例II)、そして成体の心筋細胞または成体の神経細胞のような細胞に増殖を誘導し得る。このことにより、損傷または疾患後に、それぞれ、心機能または神経機能を再生させ得る。本発明はまた、有効な薬剤を検出するためのインビトロスクリーニングアッセイを提供する。このようなスクリーニングアッセイは、それらが自動化され得る点で特に有用である。自動化は、RIZと第２の分子との会合を有効に変化させるかまたは細胞の機能を有効に調整する薬剤を同定するために、例えば、ランダムにまたは合理的に設計された薬剤(薬物、ペプチド模倣物またはペプチドなど)の大量処理(high through-put)スクリーニングを可能にする。インビトロスクリーニングアッセイは、例えば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ-RIZ融合タンパク質(GST-RIZ；実施例II参照のこと)のようなRIZまたは RIZ融合タンパク質を利用し得る。インビトロスクリーニングアッセイのために、接着したRIZが、特定の第２分子と会合する能力を維持するとすれば、RIZまたはRIZ融合タンパク質は、固体基質に接着され得る。例えば、ヒトRIZをアッセイに用いる場合、固体基質は、RIZを固体基質に結合するために、共有結合した抗R IZ抗体を含み得る（実施例IIを参照のこと）。あるいは、GST-RIZ融合タンパク質がアッセイで使用され得、そして固体基質は、共有結合グルタチオンを含み得、それにGST-RIZ融合タンパク質のGST成分が結合する。同様に、第２分子またはGS T-第２分子融合タンパク質が、本明細書で記載されるようにインビトロアッセイで用いられ得る。インビトロスクリーニングアッセイは、例えば、RIZまたはRIZ融合タンパク質を固体支持体に結合させ、次いで第２分子および試験されるべき薬剤を加えることにより、実施され得る。あるいは、第２分子または第２分子の融合タンパク質が、固体支持体に接着され、そして試験されるべきRIZおよび薬剤が添加される。薬剤を含有しないコントロール反応が平行して行われ得る。RIZと第２分子との結合を許容する適切な緩衝液濃度およびpHおよび時間およびインキュベーション温度を含む適切な条件下でのインキュベーションの後、薬剤非存在下および薬剤存在下で会合したRIZおよび第２分子の量が測定され得る。 RIZと第２分子との会合は、例えば、検出可能な部分（例えば、放射性核種または蛍光標識）を第２分子に結合し、そして固体支持体と会合している標識の量を測定することにより検出され得、ここで検出された標識の量は、第２分子とRI Zとの会合量を示す。結合のコントロールレベルと比較して、薬剤存在下での特異的結合の量を比較することにより、RIZと第２分子との会合を改変する有効な薬剤が同定され得る。このようなアッセイは、有効な薬剤を検出するために、ペプチドライブラリーのような薬剤のパネルをスクリーニングするために特に有用である。本明細書中で開示されるインビトロスクリーニングアッセイでは、成分が添加される順序は情報として有益であり得る。例えば、検出されるべき薬剤は、第２分子を添加する前にRIZと混合され得るか、RIZを添加する前に第２分子と混合され得るか、またはRIZと第２分子と結合させた後に添加され得る。反応混合物中の成分の互いに対する相対的親和性に依存して、添加の順序および最初の２つの成分の混合工程と、残りの成分の添加工程との間の時間が操作され、特性が変化する有効な薬剤を検出し得る。 RIZと第２分子との会合を改変する有効な薬剤を同定する方法が行われ、例えば、薬剤がRIZ-第２分子の結合複合体を解離し得るか否かを決定し得る。この目的のために、RIZを、まずRIZ-第２分子複合体を形成するために適切な条件下で、第２分子と接触させ、そしてその後、この複合体を有効な薬剤と接触させる。本発明はまた、RIZおよび第２分子を含有する試験サンプル中で、RIZと第２分子との会合を改変する有効な薬剤を同定する方法を提供する。本明細書で使用する用語「試験サンプル」は、被験体から得られ、そしてRIZタンパク質またはRIZ をコードする核酸分子の発現について試験される細胞標本または組織標本を意味する。試験サンプルは、例えば、手術中、または針バイオプシー（needle biops y）によって得られ得る。この試験サンプルは、例えば、非イオン性界面活性剤のような可溶化剤で細胞を処理することによって得られる細胞調製物の可能性溶解物であり得る。可溶性溶解物または他の形態試験のサンプルは、ゲルシフトアッセイによって試験され、複合体として会合しているRIZおよび第２分子の割合を決定し得る。このアッセイでは、試験サンプルは、50mM Tris（pH8.5）、0.4Mグリシン、２mM EDTAおよび３％グリセロールを含有する緩衝液を用いて、低いパーセントのポリアクリルアミドゲルのような非変性ゲルで電気泳動される。緩衝液条件、ゲル濃度、または当該分野で周知の電気泳動の他のパラメーターを調整することによって、試験サンプル中の遊離の第２分子、遊離のRIZ、および第２分子-RIZ複合体の電気泳動的分離を達成し得る。電気泳動後、ゲル中のタンパク質の同一性を、第２分子またはRIZに特異的な抗体を用いるイムノブロットによって決定し得る。酵素または放射性同位体で標識された一次抗体または二次抗体を用いてイムノブロットを行う方法は、当該分野で周知である（例えば、HarlowおよびLane、前掲、1988参照）。所望であれば、分離ゲルを作製し得、そして抗第２分子抗体または抗RIZ抗体のいずれかを用いてイムノブロットし得る。各ゲルは、検出される第２分子およびRIZ両者の既知量を含み得、ブロットの定量および特異性のための標準を提供し得る。有効な薬剤を同定するために、第２分子とRIZとの会合を改変し得ると考えられる薬剤と処理した試験サンプル中の第２分子-RIZ複合体の量を、薬剤で処理していないコントロール試験サンプルと比較し得る。有効な薬剤は、コントロール試験サンプルに比較して処置したサンプル中の第２分子-RIZ複合体の割合を増加または減少させる。本発明は、細胞を有効な薬剤と接触させることによって、細胞の機能を調節する方法を提供する。本明細書中で使用される用語「接触」は、有効な薬剤が標的と相互作用し得るように十分な接近を提供することを意味する。従って、有効な薬剤が細胞内に入り、RIZまたは第２分子と相互作用し得るとすれば、有効な薬剤は、インビトロでRbと接触し得るか、または細胞と接触し得る。例えば、小分子の有効な薬剤は、細胞膜中の孔を通じてかまたは細胞の脂質二重層を通じてのように、受動的に細胞に侵入し得る。有効な薬剤はまた、例えば、飲作用、食飲作用、食作用によるか、あるいはエネルギー駆動特異的輸送機構によるような活性手段により細胞に侵入し得る。細胞中でRIZを導入または発現する方法は、周知の発現ベクターおよび遺伝子移入方法を用いて実施され得る（例えば、Sambrookら、前掲、1989を参照のこと；Kriegler，Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual（W.H．Free man and Co.；New York，1990）もまた参照のこと、これらは参考として本明細書に援用される）。このような遺伝子移入法としては、例えば、リン酸カルシウム沈澱、エレクトロポレーション、またはリポフェクション、あるいはウイルス感染のようなトランスフェクション法が挙げられる。簡便のために、用語「トランスフェクト細胞」は、その中に導入される外因性核酸分子を有する任意の細胞を含むことを意味する。大量のRIZタンパク質を発現するために有用なトランスフェクト細胞は、原核生物または真核生物であり得、例えば、細菌細胞（例えば、E.coli）、酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞（例えば、COＳ細胞またはチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞）が挙げられる。細胞でのRIZまたは変異RIZの発現に有用な発現ベクターは、RIZをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む。核酸配列に作動可能に連結された発現制御配列は、インビトロまたは適切な宿主細胞中で核酸配列の転写および翻訳を指示し得る。発現制御エレメントが、当該分野で周知であり、例えば、プロモーター、エンハンサー、および適切な開始コドンおよび停止コドンが挙げられる。特に、組織特異的発現制御エレメントは、RIZまたは変異R IZを細胞中で選択的に発現させる手段を提供し得る。組織特異的制御エレメントは当該分野で周知であり、例えば、筋肉細胞に対して発現を制限するための筋肉クレアチンキナーゼエンハンサー、およびPurkinje細胞に対して発現を制限するためのPurkinje細胞プロテイン-2プロモーター（Vandaeleら、Genes Devel. 5:1 136〜1148(1991)、これは本明細書中に参考として援用される）が挙げられる。標的細胞と適合するウイルスベクターは、RIZまたは変異RIZをコードする核酸分子を細胞に導入するために特に有用である。例えば、一般的または組織特異的プロモーターを有する組換えアデノウイルスは、RIZをコードする核酸を、種々の組織中の種々の細胞型に送達するために使用され得、そして標的細胞中で核酸の発現を指示し得る（Lebkowskiら、米国特許第5,354,678号、1994年10月11日発行、これは本明細書中に参考として援用される）。組換えアデノ関連ウイルスはまた、RIZをコードする核酸を細胞に導入するために有用であり、そして組換えウイルスが、休止非増殖細胞（例えば、中枢神経系および末梢神経系のニューロン）のクロマチンにさえ安定に組込まれ得るというさらなる利点を有する（Lebk owskiら、Mol.Cell.Biol．8:3988〜3996(1988)、これは本明細書中に参考として援用される）。このようなウイルスベクターは、RIZまたは変異RIZをコードする核酸分子を、例えば、遺伝子治療のために被験体中の細胞に導入することが所望される場合に特に有用である。ウイルスは、宿主防御機構を逃れ得、そして特定の細胞型に感染および増殖し得る特殊感染因子である。特定の細胞型に対するウイルスベクターの特異性は、所定の細胞型を標的とするために使用され得る。従って、ウイルスベクターの選択は、部分的には、標的にされるべき細胞型に依存する。例えば、神経変性疾患が、疾患に冒されたニューロン細胞中のRIZレベルを減少させることにより処置される場合、ニューロン細胞を標的にするウイルスベクターが使用され得る。単純ヘルペスウイルス由来のベクターは、ニューロン細胞を標的にするウイルスベクターの例である（Battlemanら、J.Neurosci. 13:941-951(1993 )、これは本明細書中に参考として援用される）。造血系の病状的症状を有する被験体由来の造血細胞にRIZまたはRIZ変異体をコードする核酸配列を導入するために、特定の血液細胞またはその前駆体細胞に特異的なウイルスベクターが使用され得る。ヒト免疫不全ウイルスに基づくベクターは、このようなウイルスベクターの例である（Carrollら、J.Cell Biochem. 1 7E:241(1993)、これは本明細書中に参考として援用される）。さらに、ウイルスベクターまたは他のベクターが、組織特異的プロモーターまたはエンハンサーをベクターに取り込むことにより、組織特異的様式で、RIZをコードする核酸を発現させるために構築され得る（Daiら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 89:10892-1089 5(1992)、これは本明細書中に参考として援用される）。レトロウイルスベクターは、RIZまたは変異RIZをコードする核酸をインビボで細胞に導入するために特に有用であり得る。レトロウイルスベクターは、感染粒子として機能するため、または感染の最初の一回のラウンドのみを行う非感染粒子としてに構築され得る。前者の場合、ウイルスゲノムは、新たなウイルスタンパク質およびRNAを合成するために必要な遺伝子、調節配列およびパッケージングシグナルを維持するように改変される。しかし、これらのウイルスの腫瘍形成能を与える遺伝子は、破壊または除去される。ウイルスタンパク質が合成された後、宿主細胞は、RNAを新たなウイルス粒子にパッケージングし、このウイルス粒子は、さらなる感染のラウンドを行い得る。ウイルスゲノムはまた、所望の組換え遺伝子をコードし発現するように操作される。非感染性ウイルスベクターの場合、ヘルパーウイルスゲノムがウイルスの構造タンパク質をコードするために必要な構造遺伝子を提供するために必要である。しかし、ヘルパーウイルスは、ヘルパーウイルスRNAをウイルス粒子に封入するために必要なウイルスパッケージングシグナルを破壊するために変異され得る。従って、目的の遺伝子および機能的パッケージングシグナルを含むが、ウイルスの構造遺伝子を欠損する組換えウイルスベクターのみが、ウイルス粒子に取り込まれ得る。この新しいウイルスは標的細胞に感染し得るが、ウイルス構造遺伝子が提供されないのでさらなる感染ウイルスは産生されない。ウイルスベクターを構築し、使用する方法は、当該分野で公知であり、そして例えば、Millerおよび Rosman、Biotechniques 7:980-990(1992)（これは本明細書中に参考として援用される）に概説されている。特定の型のベクターは、意図される用途に依存する。これらのベクターは、周知であり、そして当該分野で用意に入手可能であるか、または当業者により構築され得る。遺伝子治療のために、RIZまたは変異RIZをコードする核酸を含有するベクターは、種々の方法により、被検体に投与され得る。例えば、ウイルスベクターが使用される場合、投与は、ベクターの標的特異性を利用し得る。このような場合、ベクターを疾患部位に局所的に投与する必要がない。しかし、局所投与は、核酸分子を投与する特に有効な方法であり得る。さらに、投与は、被検体への静脈内注射または皮下注射によりなされ得る。注射後、ウイルスベクターは、感染に対して適切な標的特異性を有する宿主細胞を認識するまで循環する。脊髄液へのウイルスベクターの注射はまた、例えば、神経変性疾患の処置において、有効な投与様式であり得る。レセプター媒介DNA送達アプローチもまた、架橋分子を介して核酸分子と非共有結合によって複合体化している組織特異的リガンドまたは抗体を用いる組織特異的様式で、RIZまたは変異RIZをコードする核酸分子を細胞に送達するために使用され得る（Curielら、Hum.Gene Ther. 3:147-154(1992)；WuおよびWu、J.Biol .Chem. 262:4429〜4432(1987)、これらの各々は本明細書中に参考として援用される）。むき出しの（naked）または、例えば、カチオン性リポソームに封入された核酸分子の直接注入もまた、インビボでの非分裂細胞または分裂細胞への安定な遺伝子移入に使用され得る（Ulmerら、Science 259:1745〜1748(1993)、これは本明細書中に参考として援用される）。さらに、RIZをコードする核酸分子は、パーティクルボンバードメント法（Williamsら、Proc.Natl.Acad.Sci ．USA 88:2726〜2730(1991)、これは本明細書中に参考として援用される）を用いて種々の組織へ移入され得る。このような核酸分子は、転写および翻訳に必要とされる適切なヌクレオチド配列に連結され得る。 RIZまたは変異RIZをコードする核酸の特に有用な投与様式は、疾患または病状的症状の部位での局所的な直接接種による。局所投与は有利であり得る。なぜなら、希釈効果がなく、それゆえ標的とされた細胞の大部分が核酸分子と接触する可能性が増大するからである。従って、局所接種は、他の投与形態で必要な標的化必要条件を軽減し得、そして所望であれば、接種領域の全ての細胞型に感染するベクターが使用され得る。発現が、接種領域内の特定のサブセットの細胞のみにおいて所望される場合、所望のサブセットの細胞に特異的なプロモーター、エンハンサーまたは他の発現エレメントが、核酸分子に連結され得る。このような核酸分子および調節エレメントを含むベクターは、ウイルスベクター、ウイルスゲノム、プラスミド、ファージミドなどであり得る。リポソームのようなトランスフェクションビヒクルもまた、非ウイルスベクターをレシピエント細胞に導入するために使用され得る。このようなビヒクルは、当該分野で周知である。細胞の機能を調節する別の方法は、アンチセンスRIZまたはRIZ mRNAに特異的なリボザイムをコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子を細胞に導入することである。このようなヌクレオチド配列は、RIZの発現レベルを改変し得、従ってRIZと第２分子との会合を改変し得るので、有効な薬剤の範囲内に含まれる。アンチセンスRIZまたはRIZ mRNAに特異的なリボザイムは、RIZのヌクレオチド配列（例えば、図1A（配列番号１）、図9A（配列番号３）、または図14（配列番号104））に相補的であり得る。アンチセンスRIZまたはRIZ mRNAに特異的なリボザイムは、上記の方法およびベクターを用いて細胞に導入され得る。化学合成されたヌクレオチド配列もまた直接細胞に投与され得る。合成アンチセンスまたはリボザイムオリゴヌクレオチドは、周知の方法を用いて調製され得るか、または市販の供給源から購入され得、そして所望であれば、細胞中のヌクレアーゼによる分解に対するオリゴヌクレオチドの耐性を増加させるために核酸アナログを組み込み得る。合成アンチセンスまたはリボザイム配列は、細胞に接触させ、そして取り込まれた後に細胞中で活性であり得る。有効な薬剤を、有効な薬剤および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物としてインビボで投与し得る。薬学的に受容可能なキャリアは当該分野で周知であり、例えば、生理学的に緩衝化された生理食塩水のような水性溶液、または他の溶媒、グリコール、グリセロール、油（例えば、オリーブ油）、または注射可能な有機エステルのようなビヒクルが挙げられる。薬学的組成物を処方する方法は当該分野で周知である（例えば、Renasoら、Remington Pharmaceutical S ciences ，Mack Publishing Co.，Eaton，Penn．(1990)、これは本明細書中に参考として援用される）。薬学的に受容可能なキャリアは、例えば、有効な薬剤の吸収を安定化するため、または有効な薬剤の吸収を増加させるために作用する生理学的に受容可能な化合物を含み得る。このような生理学的に受容可能な化合物としては、例えば、炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、またはデキストラン）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、グルタチオン）、キレート剤、低分子量タンパク質、または他の安定化剤、あるいは賦形剤が挙げられる。当業者には、薬学的に受容可能なキャリア（生理学的に受容可能な化合物を含む）の選択が、例えば、組成物の投与経路に依存することが公知である。当業者には、有効な薬剤を含有する薬学的組成物が、例えば、直接点滴により、経口によりまたは非経口的により、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、または腹腔内を含む種々の経路により被験体に投与され得ることが公知である。組成物はまた、注射または挿管法により投与され得る。薬学的組成物はまた、所望であれば、リポソームまたはマイクロスフェアに取り込まれ得るか、あるいは他のポリマーマトリックス中にマイクロカプセル化され得る（Gregoriadis，Liposome Technology，第１巻（CRC Press，Boca Ra ton，FL 1984）、これは本明細書中に参考として援用される）。例えば、リポソームは、リン脂質または他の脂質からなり、作製および投与することが比較的単純な、非毒性の生理学的に受容可能でありかつ代謝可能なキャリアである。細胞の機能を調節するために、有効な薬剤が有効量で投与される。有効量は当業者に周知の方法を用いて決定され得る（例えば、Renasoら、前掲、1990を参照のこと）。本明細書中で使用される用語「有効量」は、所望の効果を生じる量を意味する。従って、有効な薬剤の有効量は、細胞中のRIZおよびRbの会合を改変し得、そして標的細胞の能力に対して機能的な効果を有し得、細胞周期に入る標的細胞の能力を増加および減少させ得る。インビボでの有効な薬剤の有効量の投与は、処置される疾患に関連する症状を減少させ得る。全有効量が、単回投与として、ボーラスとしてまたは比較的短期間にわたる注入によるかのいずれかで被験体に投与され得るか、または画分化された処置プロトコルを用いて投与され得る。画分化された処置プロトコルでは、複数の用量がより延長された期間にわたって投与される。当業者には、被験体において有効量を得るために必要とされる有効な薬剤の濃度が、多くの要素（被験体の年齢および一般的健康状態、ならびに投与経路および投与されるべき処置の数、そして有効な薬剤の化学的形態を包含する）に依存することが公知である（例えば、Rena soら、前掲、1990を参照のこと）。これらの要素を考慮して、当業者は処置する被験体に対する有効量を得るように特定の用量を調整する。本発明はまた、試験サンプル中のRIZの存在を、RIZタンパク質またはRIZをコードする核酸分子を検出することによって検出する方法を提供する。さらに、細胞増殖、またはその欠損が、例えば、細胞中のRIZまたは変異RIZの増加したまたは減少した発現に起因するか否かを決定することによって、細胞周期に入る増加または減少した細胞の能力により、部分的に特徴づけられる病理を診断する方法を開示する。このような病理の同定は、上記のような有効な薬剤を用いる介入療法（intervention therapy）を可能にし得る。試験サンプルは、増加または減少した細胞機能により特徴づけられる病状を有する被験体から得られ得、そして正常な健常被験体由来のコントロールサンプルと比較して、試験サンプル中の細胞が増加または減少したレベルのRIZまたは変異RIZを有するか否かを決定し得る。細胞中のRIZタンパク質のレベルは、サンプルをRIZ結合試薬（例えば、抗RIZ抗体またはRb）と接触させることによって決定され得る。例えば、細胞中のRIZのレベルは、抗RIZ抗体を用いて、周知のイムノアッセイまたは免疫組織化学的方法によって決定され得る（例えば、Reedら、前掲、1992を参照のこと；HarlowおよびLane、前掲、1988もまた参照のこと）。さらに、変異RIZの発現は、例えば、変異RIZには特異的に結合するが、野生型RIZ には結合しない抗体によって検出され得る。抗体およびRbに結合させることによりRIZを検出することで、補足情報を提供し得る。例えば、抗体は発現されるRIZの総レベルを決定するために使用され得、一方、Rb結合はRbに結合しているRIZの画分を決定するために使用され得る。R bは細胞中で他のタンパク質に結合し得るので、Rbに結合しているRIZ画分を検出する前に、細胞からRIZをまず単離することが有益である。試験サンプル中の細胞における増加したまたは減少したRIZの発現レベルは、特定の細胞型におけるRIZの予測される正常レベルと比較することによって決定され得る。種々の細胞型におけるRIZレベルの正常な範囲は、統計学的に有意な数の正常な細胞型をサンプリングすることによって決定され得る。この正常な細胞型は健常な被験体から得られ得る。さらに、コントロールサンプルが、増加または減少した細胞機能によって特徴づけられる病理が、増加または減少したRIZ の発現によるか、あるいは変異RIZ発現によるか否かを決定するために試験サンプルと平行して評価され得る。試験サンプルは、例えば、上記の免疫組織化学的法を用いて試験され得るか、またはサンプルはさらに処理されて試験され得る。例えば、試験サンプルの抽出物が調製され得、そしてサンプル中の細胞において発現されるRIZがコントロール細胞由来のRIZと同じ様式でRbと会合し得るか否かを、または正しくRbと会合しないRIZ改変体が試験サンプル中の細胞において発現されるか否かを決定するために試験され得る。試薬（例えば、抗RIZ抗体またはRb）を取り込む診断アッセイキットは、細胞中での改変されたRIZ発現または変異RIZの発現による病理を検出するために有用であり得る。このようなキットは、特に有用である。なぜなら、このようなキットは、アッセイ条件の標準化を可能にするからである。キットは、試薬に加えて、アッセイを実施するために適切な反応条件を提供する反応カクテル、および所望であれば既知量のRIZを含有するコントロールサンプルを含み得る。さらに、キットは、試薬に対して特異的である抗体を含み得る。RbがRIZを検出するための試薬として用いられる場合、キットはまた、EIRCEEKPEDL（配列番号６）またはEIRCDEKPEDL（配列番号91）のような競合剤分子を含み得る。競合剤分子はRIZ とRbとの会合を阻害し、それゆえ結合反応の特異性を確認し得る。診断アッセイは、試薬に結合される、サンプル中のRIZの量を検出する簡単な方法を包含すべきである。周知の方法を用いて、試薬を標識し、そして標識の存在を検出することにより検出が行われ得る（抗体の標識について、例えば、Harl owおよびLane、前掲、1988；第９章、を参照のこと）。試薬は、種々の検出可能な部分（放射線標識、酵素、ビオチンまたは蛍光色素を包含する）で標識され得る。試薬を標識するための材料は、診断キットに含まれ得るか、または市販の供給元から別個に購入され得る。標識試薬と試験サンプルおよび、所望であればコントロールサンプルとの接触後、特異的に結合した試薬が、特定の部分を検出することにより同定され得る。試薬を特異的に結合し得る標識抗体はまた、非標識試薬の特異的結合を同定するために使用され得る。例えば、試薬が抗RIZ抗体である場合、第２の抗体が、抗RIZ抗体の特異的結合を検出するために使用され得る。第２の抗体は、一般に第１の抗体の特定のクラスに対して特異的である。例えば、抗RIZ抗体がIgGクラスの抗体である場合、第２の抗体は抗IgG抗体である。このような第２の抗体は、市販の供給元から容易に入手可能である。第２の抗体は、上記のような検出可能な部分を用いて標識され得る。サンプルが第２の抗体を用いて標識される場合、サンプルを、まず第１の抗体と接触させ、次いでサンプルを、標識された第２の抗体と接触させ、この第２の抗体が第１の抗体と特異的に結合し、そして標識サンプルを生じる。 RIZの異常なレベルの発現によって特徴づけられる病理を診断する方法は、サンプル中のDNAまたはRNAの発現レベルを測定する工程を包含し得る。同様に、変異RIZの発現によって、またはRIZをコードする変異核酸分子の存在によって特徴づけられる病理を診断することには、RIZ遺伝子またはこの遺伝子によりコードされるRNAにおける変異を検出することを包含し得る。例えば、RIZをコードする核酸分子は、相補的ヌクレオチド配列を用いて試験サンプル中で検出され得る。所望であれば、標的核酸分子は、当該分野で周知の方法によって試験サンプルから抽出され得る（Sambrookら、前掲、1988を参照のこと）。核酸分子の集団内で特定の核酸分子の存在を検出する方法は、当業者には周知であり、例えば、サザンブロット、ノーザンブロット、スロットブロット、およびPCR増幅が挙げられる。（例えば、Sambrookら、前掲、1989を参照のこと）。インサイチュハイブリダイゼーションはまた、細胞または遊離の染色体を含有するサンプル中で核酸分子を直接同定するために使用され得る（例えば、Pa rdue，Nucleic Acid Hybridisation: A practical approach（IRL Press，1991 ）を参照、これは本明細書中に参考として援用される）。サンプル中のRIZをコードする核酸を検出するために、サンプルを相補的ヌクレオチド配列と接触させる。この相補的ヌクレオチド配列は、比較的ストリンジェントな条件下でRIZをコードする核酸分子にハイブリダイズし得る。ヌクレオチド配列は、放射性同位体のような検出可能な標識を有し得る。サンプル中のRI Zをコードする核酸分子の存在が、例えば、特異的に結合したヌクレオチド配列のレベルを検出することにより決定され得る。ヌクレオチド配列の正常な結合レベルがまた、コントロールサンプルにおいて決定され得る。コントロールサンプルと比較した試験サンプル中のRIZをコードする核酸分子のレベルの増加または減少は、RIZの異常な発現によって特徴づけられる病理を示す。RIZの相補的ヌクレオチド配列はまた、プローブによるハイブリダイゼーションのためにRIZを増幅するためのPCR反応においてプライマーとして使用され得る。変異RIZは、比較的ストリンジェントな条件下で相補的核酸分子を用いてハイブリダイズすることによって検出され得る。この条件は、相補的配列が、ハイブリダイゼーションのために選択された条件下で、変異配列に対して選択的ハイブリダイゼーションを可能とするが、野生型配列にはハイブリダイゼーションを可能とし得ないために十分に小さなサイズである点を除いて本質的には上記のようである。あるいは、RIZ遺伝子またはRNAは試験サンプルから直接精製され得、そして所望であれば、PCRによってサンプルから増殖され得る。変異配列は標準的なヌクレオチド配列決定法によって決定され得る（例えば、Sambrookら、前掲、 1989を参照のこと）。RIZをコードする変異核酸配列または変異RIZをコードする核酸はまた、細胞または遊離染色体のサンプル中でインサイチュハイブリダイゼーション技術により検出され得る（例えば、Pardue、前掲、1991を参照のこと）。以下の実施例は、本発明を説明することを意図するが、本発明を限定することは意図しない。実施例１哺乳動物のRIZ cDNAのクローニング本節では、哺乳動物のcDNAライブラリーおよびゲノムライブラリーからのRIZ をコードする核酸分子をクローニングする方法を記載する。ラットRIZ cDNAをラット新生児心筋細胞λgt11 cDNA発現ライブラリー(Zhuら、Mol ．Cell．Biol.、13:4432(1993)(これは本明細書中で参考として援用される ))から得た。このライブラリーを、以前に記載された方法(Macgregorら、Oncoge ne 、5:451-458(1991)(これは本明細書中で参考として援用される))に従って、Rb ポケット結合部位およびEEエピトープを含む56kDフラグメント(p56EERb)を用いてスクリーニングした。 p56EERbを、相補的ポリヌクレオチドの合成対をクローニングすることにより作製した。この相補的ポリヌクレオチドの合成対は、ハイブリダイズして、EEエピトープ(EEEEYMPME)(配列番号８；Grussenmeyerら、Proc ．Natl．Acad．Sci.、 USA. 、82:7952-7954(1985)およびWalter、J ．Immune Meth. 88:149-161(1986)、 (これらの両方は、本明細書中で参考として援用される))をコードし、かつBsmI 接着末端を有する２本鎖リンカーを形成する。リンカーの末端をT4キナーゼでリン酸化し、そしてこのリンカーをプラスミドpET8Rbc(Huangら、Nature、350:160 -162(1991)(これは本明細書中で参考として援用される))に連結し、プラスミドp 56EERbを作製する。リンカーを作製するために使用した合成ヌクレオチドは：5' -AATCGATGAA GAAGAAGAAT ATATGCCTAT GGAACA-3'(配列番号９)、および5'-TTCCAT AGGC ATATATTCTT CTTCTTCATC GATTTG-3'(配列番号10)であった。EEリンカーの４つのタンデムコピーを有するクローンを選択し、そして以前に記載されたように (Huangら、前出、1991)、これを用いてE.coli BL21(DE3)pLysS株でp56EERBを直接発現した。 56EERbの誘導の後、この細菌細胞を(Huangら、前出、1991)に記載のように溶解し、そして56EERbを硫酸アンモニウム(60％飽和)により沈澱させた。沈澱物を透析緩衝液(20mM Tris-HCl、pH7.5、50mM NaCl、１mM EDTA、１mM DTT、１mM PM SF)中で透析し、そしてジエチルアミノエチル(DEAE)Sepharose^TMクロマトグラフィー(Pharmacia；Piscataway NJ)によるさらなる精製に供した。部分的に精製されたp56EERbを、50mM〜500mM NaClの塩濃度勾配によりDAEAから溶出した。56EER bのDEAE部分精製画分および透析硫酸アンモニウム沈澱物の両方を用いてcDNAライブラリーをスクリーニングした。結合特異性コントロールとして、p56EERbを、５μMのポリＬ-リジン(Sigma)または50μMのＴ-ペプチドまたはＫ-ペプチド(Huangら、前出、1991)とプレインキュベートして、フィルターに付与した。Ｔペプチドは、SV40ラージＴ抗原の残基 101〜118に由来する18残基の合成ペプチドであり、一方Ｋペプチドは、SV40ラージＴ抗原の107位のグルタミン酸残基がリジン残基で置換されていることを除いてＴペプチドと同一である(Huangら、前出、1991)。ＴペプチドはRbポケットに結合するが、Ｋペプチドは結合しない。 RIZタンパク質を発現するクローンへのp56EERbの結合を、抗EEハイブリドーマのスペント培養培地として得られる抗EEモノクローナル抗体(Walter、前出、198 6)およびマウス免疫グロブリンに特異的なアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスIgG抗体(Promega；Madison WI)を用いて検出した。１×10⁶のライブラリーのファージプラークを含むフィルターをp56EERbを用いてスクリーニングし、そして３ラウンドのプラーク精製で残った10個のポジティブクローンを選択した。非特異的阻害物質であるポリＬ-リジンの存在下ではp56 EERbとの反応性を維持し、Ｔペプチドの存在下ではp56EERbとの結合が阻害されるが、Ｋペプチドの存在下では阻害を受けなかった５つのクローンをさらなる研究のために選択した。Ｔペプチドによる阻害により、選択されたクローンが、Rb ポケットと結合する産物を発現することが示された。最後の５つのクローンのうち、４つは同一の1.9キロベース(kb)の挿入物を含んでいた。これらのクローンのうちの１つであるクローン7.1をヌクレオチド配列決定に供した。配列決定をDNAの両方の鎖について行い、そしてSequenase^TM(U nited States Biochemical Corp.；Arlington Hts．IL)を利用した。クローン7. 1は、638アミノ酸をコードする推定オープンリーディングフレームを有する部分的なcDNA配列を含んでいた。この638アミノ酸は、２つのタイプの容易に認識可能なモチーフである、cr2コアモチーフおよび３個のジンクフィンガーモチーフを形成した(以下を参照のこと)。クローン7.1によりコードされるタンパク質を、「Rb相互作用性ジンクフィンガー」タンパク質、RIZと命名した。 1.9kbの挿入物を用いて、心筋細胞ライブラリーをさらにスクリーニングし、そして標準的な方法(Sambrookら、前出、1989を参照のこと)によりλZAPベクター中で生成したラット脳B49細胞cDNAライブラリー、または市販の供給者から購入したラット脳B49細胞cDNAライブラリーをスクリーニングした。重複するオープンリーディングフレームを含むいくつかのクローンを得た。重複する配列を、 6171ヌクレオチドの連続するストレッチ(stretch)に組立て、ラットRIZのcDNA配列を得た(図1A；配列番号１)。また、ラットの脳cDNAラブラリーのスクリーニングにより、図1Aに示される配列と比較して、別の5'非翻訳領域をコードするヌクレオチド配列を含むクローン 12.1が明らかになった(図1B；配列番号94を参照のこと)。従って、少なくとも２つの形態のRIZ mRNAがラットの脳中で発現され、これは、RIZ mRNA分子は、異なるスプライシングにより生じ得ることを示唆する。完全ラットRIZ cDNA配列(配列番号１)の分析により、ヌクレオチド157で始まり、ヌクレオチド5274で終わる大きなオープンリーディングフレームが明らかになった(配列番号２を参照のこと)。ヌクレオチド157の開始コドンは、ヌクレオチド100のインフレームの上流の停止コドンから最初のATGであること、そしてKo zakのコンセンサス配列(Kozak、Nucl ．Acids Res. 15:8125-8148(1987))との一致に基づき、翻訳開始部位であると考えられた。この開始部位の同一性を、ヌクレオチド92の上流の配列が異なる以外は、ラットRIZの組み立てたcDNA配列と同一である独立したcDNAクローンの分析により確認した。完全なラットRIZ cDNA配列から、1706アミノ酸からなる、分子量187,437ダルトンのタンパク質が予測された(図1A；配列番号２)。ノーザンブロット分析は、 7.2kbの主なラットRIZ mRNA種を示した。サザンブロット分析は、ラットRIZゲノムが１コピーのRIZ遺伝子を含むことを示した。この結果およびラットRIZをコードする別のcDNA分子の5'末端の同一性から、選択的スプライシングにより異なる mRNA分子が生じることが示される。ヒト胎児脳cDNAライブラリー(Clonetech；Palo Alto CA)およびヒト胎盤ゲノムコスミドDNAライブラリー(Stratagene；San Diego CA)から、ラットRIZ cDNA コード領域をハイブリダイゼーションプローブとして用いて(クローン7.1)、ヒトRIZをコードする核酸分子をクローニングした。このヒトRIZ cDNAは、1719アミノ酸残基のポリペプチドをコードする(図9A；配列番号４を参照のこと)。コード配列に加えて、このヒトRIZ cDNAは、5'非翻訳配列および部分的な3'非翻訳配列(図9A；配列番号３)を含む。このヒトRIZ cDNAのさらなる3'非翻訳配列(未決定)は、配列番号３の下流に位置し、そして図9C(配列番号97；Washington Unive rsity Merck EST Project；Genbank受託番号R56425から得られた配列)に示す3' 非翻訳配列の上流に位置する。ゲノムライブラリーから得たヒトRIZ遺伝子は、R IZコード配列が８つの別々のエキソンの間に分離されていることを示した。また、ヒトRIZ遺伝子の対立遺伝子変異体を同定した。この変異体は、T₉₆₉から A₉₆₉への１つのヌクレオチドの変化を有し、これによりアミノ酸残基D₂₈₃からE₂ ₈₃ への変化が導かれる。T₉₆₉対立遺伝子は、A₉₆₉対立遺伝子より２倍以上多いことが推定された。さらなるヒトRIZタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、Y79網膜芽細胞腫細胞から標準的な手順により調製したcDNAライブラリーから単離した。図9Bに示すように、ヒトRIZの２つの異なる5'配列をコードするcDNA分子を同定した(配列番号95および96；それぞれクローン5Yおよび1Y)。図9Aに示す最初の129ヌクレオチドを置換するクローン5Y(配列番号95)および1Y(配列番号96)は、ATG開始コドンをコードしない(それぞれ、配列番号102および104を参照のこと)。これらの結果は、種々のRIZタンパク質が選択的にスプライシングされたmRNA分子によりコードされ得ることを示す。ラットRIZおよびヒトRIZタンパク質の両方は、cr1、cr2、ce1、ジンクフィンガー、SH3、SH2および核局在化シグナルを包含する類似の配列モチーフを有する。推定ラットRIZアミノ酸および推定ヒトRIZアミノ酸配列は、83％の同一性を示す。さらに、ラットRIZに対して調製されたウサギ抗血清は、ヒトRIZと交差反応する。さらに、マウスRIZの一部をコードする391ヌクレオチド配列を、ラットcDNA P Rドメインプローブにより、マウスゲノムライブラリー129SVJ(Strategene)から選択したいくつかのクローンの配列を合わせることにより得た。このマウスcDNA は、ラットRIZのアミノ酸77位〜206位(配列番号２)およびヒトRIZのアミノ酸78 位〜207位(配列番号４)に等価な130アミノ酸をコードする(配列番号105)。特に、コードされるマウスペプチドは、PRドメインペプチドのブロックＢおよびブロックＣを含む。コードされるマウスPRドメインペプチドの一部は、対応するヒトおよびラットのRIZ PRドメインペプチド配列と同一である。実施例II RIZ-Rb 結合の検出および特徴付け本節では、RIZおよびRbの結合を示し、そしてRIZおよびRbの結合を効果的に変化させる薬剤を同定するための方法が記載される。 RIZとRbとの間の相互作用を特徴付けるために、アミノ酸245位〜883位のラットRIZの³⁵S標識フラグメント(RIZ(245-883))をクローン7.1の1.9kb挿入物をpBKS +(Stratagene)にサブクローニングしてプラスミドpBKS+7.1を作製することにより作製した。サブクローニングの後、次いでRIZ挿入物を取り出し、そしてベクターpSP64-xβm(KriegおよびMelton、Nucl ．Acids Res.、12:7057-7070(1984)) 中のβ-グロブリンの5'非翻訳配列の下流に挿入した。RIZ(245-883)をコードするSP6 RNA転写物を、SalIでこのフラグメントをコードするプラスミドを線状化することにより作製し、そして³⁵S-メチオニンを含有するウサギ網状赤血球溶解物インビトロタンパク質翻訳系(Promega)を用いてRIZフラグメントを翻訳した。この標識RIZフラグメントは、硫酸ドデシルナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)により、125kDの見かけの分子量を有した。この分子量は、R IZのこのフラグメントについての推定分子質量より約55kD大きかった。SDS-PAGE により得られたより大きなサイズは、ゲル上のRIZフラグメントの変則的な移動に起因すると思われる。以前に記載されたように(Huangら、前出、1991)、p56Rbプラスミドから細菌発現により生成されたRbの56kDフラグメントを、放射標識RIZ(245-883)への結合についてテストした。結合を、抗Rb抗血清およびProteinＡ-Sepharose^TMを用いる免疫沈降(Huangら、前出、1990(これは本明細書中で参考として援用される)；およびHuangら、前出、1991)により検出し、続いてSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーを行った(HarlowおよびLane、前出、1988を参照のこと)。以前に記載された方法を用いて、ウサギ抗Rb抗血清を作製した(HarlowおよびLane、前出、198 8を参照のこと)。免疫沈降反応におけるRbによるRIZの結合量は、添加されるRbの濃度に依存した。³⁵S標識RIZ(245-883)の完全な結合は、3.3nM Rbではなく、10nM Rbにより達成された(示さず)。これらの結果により、RIZがRbを結合することが示された。競合実験を用いて、別のRb結合タンパク質であるSV40ラージＴ抗原と比較した Rbに対するRIZの相対的な結合親和性を比較した。上記の記載のように、インビトロ転写/翻訳および³⁵S-メチオニン標識のために、全長ラージＴ抗原cDNAを、Y -62-25-2からプラスミドpSP64にサブクローニングした。ほぼ等量のＴ抗原およびRIZを個々に、あるいは等量のRbと共に混合した場合、同様な量のＴ抗原およびRIZ、またはやや多くのRIZが共沈した(示さず)。これらのデータは、RIZがラージＴ抗原と同様のRbに対する結合親和性を有することを示す。いくつかの変異体を作製し、Rbへの結合に関与するRIZの領域を同定した。プラスミドpCMVRIZ中の全長RIZ cDNAに１つのアミノ酸置換を導入し、アミノ酸307 位のシステインをグリシンに変えた。pCMVRIZは、全長RIZ cDNAをpRc-CMVベクター(Invitrogen、San Diego、CA)にサブクローニングすることにより作製した。C ysをGlyに変えるcr2モチーフの変異誘発は、T7 GEN^TM変異誘発キット(United St ates Biochemical、Arlington Heights、IL)を用いて以下のように行った：簡単に述べると、プライマー5'-CCGGAGATCC GGGCTGAAGA AAAGCCA-3'(配列番号11)を用いて、pBSK-5.4から調製した一本鎖アンチセンステンプレート上でDNA合成を誘導した。ベクターpBSK-5.4は、B49 λZAP DNAライブラリーから得たcDNA RIZ アミノ末端クローン5.4をベクターpBSK+中にクローニングすることにより作製した。点変異を含むNsiI〜SpeIフラグメント(ヌクレオチド１〜1718)を配列決定し、そしてpRc-CMVにサブクローニングしてpCMVmRIZ(RIZ^307-gly)を作製した。アミノ酸１位〜575位からのRIZの³⁵S標識フラグメント(RIZ(1-575))および³⁵S-RIZ (1-575)^307-glyを、上記のようにSpeI線状化テンプレートのインビトロ転写/翻訳により作製した。 33nM Rbを用いる、標識RIZ(1-575)とグリシン変異体との結合を、抗Rb抗血清を用いる免疫沈降、続くSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーにより評価した。その結果により、56kD Rbフラグメントは³⁵S-RIZ(1-575)フラグメントと結合するが、³⁵S-RIZ(1-575)^307-Glycr2変異体と結合しないことが示された(示さず) 。これらの結果は、RIZ cr2モチーフがRb結合に関与することを示す。 RIZ cr2モチーフが機能的であり、Rbの結合に十分であるかを決定するために、RIZ(RIZ-Pep)のcr2モチーフの一部を表す11アミノ酸のペプチドEIRCEEKPEDL( 配列番号６)およびこのペプチドのシステインからグリシンへの変異体(RIZ-Pep^★ )を標準的な手順に従って合成し、そして標識RIZ(1-575)の56kD Rbへの結合を阻害するその能力について種々の濃度で試験した。結合は、野生型ペプチドの場合阻害されたが、Ｃ^→Ｇ変異体ペプチドの場合阻害されなかった(図４を参照のこと)。これらのデータは、RIZのcr2モチーフはRbへの結合に十分であること、およびRIZのcr2モチーフ中のアミノ酸307位のシステインが結合に関与していることを示す。同様の方法で、放射標識RIZ(1-575)と56kD Rbとの間の結合を、SV40ラージＴ抗原腫瘍タンパク質由来の17アミノ酸のRb結合タンパク質(101〜118：Ｔ-pep)およびRb結合活性を有さないＴ-pepの107位のGluからLysへの変異体(Ｔ-pep^★)(Hu angら、前出、1990およびHuangら、前出、1991)を用いる阻害について試験した。結合は、Ｔ-pepの場合阻害されたが、変異体の場合阻害されなかった(図４)。これらの結果は、RIZおよびラージT抗原はRb上の類似領域と結合することを示す。 RIZに結合する56kDフラグメントは、Rbポケット結合領域およびＣ末端拡張を含むＣ末端フラグメントである。RIZに結合する56kDフラグメントの部分をさらに明らかにするために、いくつかのRb変異ポリペプチドをRIZへの結合について試験した。変異体および全長Rbをクローニングし、そして前記のようにインビトロ転写/翻訳を行った(Huangら、前出、1990)。H209は、Rbにおける１つのアミノ酸変化を生じる点変異体であり、小細胞肺ガンH209細胞株(American Type Cultu re Collection（ATCC）#HTB 172)において同定された。種々のRb形態を、アミノ酸245位〜573位のRIZのフラグメントに融合したグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)(GST-RIZ(245-573))への結合について試験した。このRIZフラグメントは、Rb結合に関連するすべてのE1Aモチーフを含み、そしてStuI〜HpaI RIZフラグメント(ヌクレオチド795-3068)をベクターpBSK+中にクローニングし、pBSK+SH を作製することにより構築された。EcoRIフラグメントをpBSK+SHから取り出し、そしてpGEX-KGに連結し、GST-RIZ(245-573)を含むベクターpKG7.1Sを作製した。精製GST-RIZ(245-573)ならびに上記の放射標識Rb野生型および欠失変異体との間の結合を、抗RIZ抗血清を用いる免疫沈降、続くSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーにより決定した。抗血清は、通常使用される手順に従い(HarlowおよびLane、前出、1988を参照のこと)、アミノ酸245位〜573位由来のRIZフラグメント(RIZ(245 573))に融合した精製GSTをウサギに注射することにより生成した。R IZ(245-573)は、ジンクフィンガー１〜３を含む。ウサギを免疫するために使用されたGST-RIZ(245-573)は、E.coli XL-1 blue株内のプラスミドpKG7.1Sの発現により産生された。この細菌を溶解し、グルタチオンアガロースカラムクロマトグラフィーによりGST-RIZ融合タンパク質を単離した。pKG7.1Sは、pB7.1由来の1 .9kb RIZ挿入物を、ベクターpGEX-KG中に連結することにより構築した。得られたプラスミドをSpeI線状化し、DNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを用いて処理し、そして再連結し、それにより前記SpeI部位(ヌクレオチド1876)に停止コドンを導入した。抗RIZ抗血清は、インビトロで翻訳され、pB7.1から発現されたRIZ(245-883)に特異的に結合した。この結合は、免疫原であるGST-RIZ(245-573)の添加により阻害された。精製GST-RIZ(245-573)は、野生型RbおよびRb結合ポケットに対する欠失Ｃ末端を有するRbのB3変異体への結合を示したが、ポケット内に欠失を有する３つの異なる形態のRbには結合しなかった(図5A)。これらの結果は、ラージＴ抗原または E1Aのような腫瘍タンパク質の結合における役割が最初に明らかにされたRbポケットはまた、RIZへの結合に必要であることを示す。RbによるRIZ結合は、E2F(Hu angら、DNA Cell Biol.、11:539-548(1992)；Qinら、Genes Devel.、6:953-964 (1992)を参照のこと)およびc-Abl腫瘍タンパク質(WelchおよびWang、Cell 75:77 9-790(1993)を参照のこと)のような特定の細胞性タンパク質がそうであるように、ポケットの遠位側のＣ末端配列を必要としない。この結合の結果により、RbポケットのＣ末端境界の開始点の近傍において、Rbの残基803に対するRbのRIZ結合ドメインのＣ末端境界がマッピングされる。ラットRIZを、HT1080細胞(ATCC #ICCL 121)におけるRbへの結合について試験した。この細胞を、10％ウシ胎児血清を補充したDMEM中で増殖させた。細胞を、 5mM EDTA、50mM NaF、１mM オルトバナジン酸Na、１mMのDTT、アプロチニン、ロイペプチン、およびPMSFを補充したELB緩衝液(50mM HEPES、pH7.5、250mM NaCl 、0.1％ NP-40)中で溶解した。この溶解液をマイクロ遠心器中で12,000rpmで10 分間遠心分離することにより細胞破片を取り除いた。４μg GST-RIZ(215-462)およびHT1080細胞抽出物由来のRbとの間の結合を、まずこの２つを混合し、次いでGST-RIZおよび任意の結合したRbをグルタチオンアガロースビーズに結合することにより評価した。ビーズを結合緩衝液中で洗浄し、そして結合複合体をSDS緩衝液中で煮沸することにより溶出し、そして抗Rb抗血清を用いるイムノブロッティングにより分析した。イムノブロッティングは、標準的な技術により行った(例えば、HarlowおよびLane、前出、1988を参照のこと) 。 GST-RIZ(215-462)は、低リン酸化Rbを表す最も速く移動する形態のRbと結合した(図６、レーン２)。RIZと低リン酸化Rbとの間の相互作用の特異性を、E1Aタンパク質の供給源の添加が結合を阻害することを示すことにより示した(図６、レーン３)。E1Aを発現するように安定にトランスフェクトされた293由来の細胞溶解物を、E1Aの供給源として使用した。実施例III RIZ とE1Aとの間の構造および機能の比較 RIZとアデノウィルスE1Aとの間での特定のドメインの配列の類似性（図２Ａ参照のこと）、およびRb結合の共通の特性は、RIZとE1Aとの間の顕著な構造的類似性を示した。この関係をさらに研究するために、cr2、ce1およびcr1モチーフの一部を含むGST-RIZ(245-573)融合タンパク質に対して惹起された抗RIZ抗血清を、E1Aとの交差反応性について試験した。これらの実験のために、インビトロ転写／翻訳の間に、上記の方法を用いてE1Aを³⁵S-メチオニンで標識した。抗RIZ抗血清は、E1Aと弱く交差反応した（図示せず）。抗RIZとE1Aとの間の結合をさらに実証するために、抗RIZ抗血清からの交差反応性抗体を、E1A 12Sタンパク質を含むカラムでのアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。カラムは、Affi-gel 10^TMビーズ(Bio-Rad Labs; Hercules CA)と、pGSTE1A12Sから発現される精製されたGST-E1A 12S融合タンパク質（Taylorら、Mol ．Cell．Bi ol. 13:4714-4727(1993)、この文献は本明細書中に参考として援用される）とのカップリングにより調製された。抗体アフィニティー精製を、標準手順に従って、高pH溶出によって行った(HarlowおよびLane、前出、1988参照)。 E1Aアフィニティーカラムから精製された抗RIZ抗体を、RIZおよびE1Aへの結合について試験した。抗体は、両方のタンパク質を結合した。このことは、抗RIZ 抗血清とE1A 12Sとの元々の交差反応性を立証した（図示せず）。E1A抗原と交差反応するので、E1Aアフィニティー精製されたRIZ抗体を「抗ce1」と名付けた。各分子上のce1エピトープの位置をマッピングするために、抗ce1抗体を、RIZ およびE1A 12Sの種々の欠失変異体への結合について試験した。残基304の後を切り取ったRIZ変異体(RIZ304)を、pCMVRIZのBAM H1変異体由来のBAM HI切断フラグメントのインビトロ転写／翻訳によって作製した。T7 GEN^TM変異誘発キット(U.S . Biochemical)を使用して、プライマー5'-TTCACACCGG ATCCCCGGCT CTTTCGC-3' （配列番号12）を用いて、BamHI制限部位をpCMVRIZのRIZヌクレオチド1067に導入した。次いで、BamHIフラグメントを切り出し、そしてpRc-CMV中にクローニングして、RIZ304をコードするベクターを得た。残基318の後を切り取ったRIZ変異体(RIZ318)を、テンプレートとして全長RIZ を用い、そして上流T7プライマー(Stratagene)および下流RIZプライマー5'-TGGC TCTTCT AATAAGTC-3'（配列番号13）を用いて、PCRによって作製した。PCRフラグメントを、pCRSK+(Stratagene)中にクローニングし、そして使用して、インビトロT7転写／翻訳によってRIZ318ポリペプチドを作製した。残基223で切断されたE1A 12S(E1A223)を、上流SP6プライマー(Stratagene)、下流E1Aプライマー5'-GATACATTCC ACAGCCTG-3'（配列番号19）、およびテンプレートとしてプラスミドpGEM1Ad5E1A12Sを用いて、E1AのPCRフラグメントを生成することによって作製した。得られたPCRフラグメントをpCRSK+中にクローニングし、これを使用して、SP6インビトロ転写／翻訳による変異E1A 12Sタンパク質の合成を行った。全長E1A 12S(E1A243)を、他のベクターについて上述したように、インビトロ転写／翻訳によって、ベクターpGEM1Ad5E1A12Sから作製した。抗ce1抗体は、残基318で切断されたRIZに結合したが、残基304で切断されたRI Zとは反応しなかった（図示せず）。これらの結果は、ce1交差反応性抗原決定基がRIZの残基304と残基318との間に存在することを示している。抗ce1抗体は、全長E1A(E1A243)と結合したが、E1AのＣ末端欠失変異体(E1A223)とは反応しなかった（図示せず）。これらの結果は、ce1エピトープがE1A 12SのＣ末端20アミノ酸内に位置していることを示している。 ce1エピトープを含むRIZおよびE1A 12Sの領域は、顕著なアミノ酸配列相同性を示す（図２Ａ）。RIZ中の配列³¹²EDLLEE（配列番号20）およびE1A中の配列²²⁴ EDLLNE（配列番号21）が、ce1エピトープのための部位であるようである。この可能性を評価するために、RIZ(ce1ペプチド)中の残基310〜320を含む11アミノ酸ペプチドKPEDLLEEPQS（配列番号７）、およびRIZのcr2コアモチーフを含む残基304 〜314を含むオーバーラップした11アミノ酸コントロールペプチドであるペプチドEIRCEEKPEDL（配列番号６）を固相ペプチド合成によって合成し、そして抗ce1 抗体とRIZまたはE1Aとの間の結合をブロックするその能力について試験した。 ce1ペプチドは、抗ce1抗体と、³⁵S-RIZ318または³⁵S-E1A 12S(E1A243)のいずれかとの間の結合を阻害した。cr2ペプチドは、阻害しなかった（図示せず）。これらの実験は、ce1エピトープが、RIZ中の配列³¹²EDLLEE（配列番号20）およびE1A中の相同配列²²⁴EDLLNE（配列番号21）中に位置していることを示した。抗ce1を予め形成されたRIZ-Rb複合体への結合について試験して、ce1エピトープが、RIZ-Rb結合境界面中の領域に直接的に含まれるのか、あるいは密接に関連するのかを決定した。これらの実験において、³⁵S標識された全長Rbをインビトロ翻訳されたRIZ(215-462)と共にプレインキュベートして、RIZ-Rb複合体を、免疫沈降のために抗ce1抗体を添加する前に形成させた。これらの実験において、G ST-RIZ(215-462)のGST部分をトロンビン切断によって予め除去し、そして残った未切断の融合タンパク質からグルタチオン-アガロースによる吸着によって精製した。抗ce1抗体は、予め形成されたRIZ-Rb複合体に結合した（図示せず）。この結合は弱いものとして特徴づけられたが、これはRIZとの抗ce1の結合での反応性と同様であった。RIZホモオリゴマーの形成の証拠は観察されなかったので、Rbは、RIZ（抗ce1によっても結合される）と直接的に相互作用するようである。ホモオリゴマー形成が観察されなかったことは、GST-RIZ(215-462)と³⁵S-標識全長RI Zとの間の結合の欠如に基づいた。上記の結合研究はまた、逆の順序でも行われた。まず、³⁵S-標識RIZ(1-575)を全長Rbと予め複合体化させ、次にこの複合体を抗ce1抗体への結合について試験した。その結果、RIZフラグメントは、RIZがRbと複合体化しているか否かに関わらず、抗ce1抗体と結合することが示された（図示せず）。これらの実験は、ce1 エピトープは、RIZ-Rb複合体中でRIZとRbとの間の境界面中に顕著に含まれているのではないことを示す。実施例IV RIZ のDNA結合活性およびGTP結合活性 RIZのジンクフィンガードメインがDNAと結合し得るか否かを評価するために、アミノ酸245位〜573位のRIZフィンガーモチーフ１〜３、またはアミノ酸1114位〜1260位のフィンガー４〜６を、各々、GST融合タンパク質、GSTZ13およびGSTZ4 6として発現させた。GST-RIZフラグメントを、グルタチオンアガロースクロマトグラフィーで精製し（GuanおよびDixon、Anal ．Biochem. 192:262-267(1991)、この文献は本明細書中に参考として援用される）、そしてフィルターベースの(f ilter-based)DNA結合アッセイにおける結合について評価した（SukegawaおよびB lobel、Cell 72:29-38(1993)、この文献は本明細書中に参考として援用される）。GSTZ46を得るために、RIZ(1114-1260)をコードするフラグメントを、プライマー5'-GTGGTCCAAG AAACATTC-3'（配列番号17）および5'-TCGTGTAAAG CTCTTCAG-3' （配列番号18）、ならびにテンプレートとしてpCMVRIZを用いて、PCRによって作製した。このPCRフラグメントをpBKS+中にクローニングし、次いで、pGEX-KG中にクローニングした(GuanおよびDixon、前出、1991)。フィルターベースのDNA結合アッセイを、0.5μgの精製されたGSTまたはGST-RI Z融合タンパク質をSDS-PAGEによって電気泳動し、そしてこれらのタンパク質をニトロセルロースに移すことによって、行った。このニトロセルロースを結合緩衝液（50mM Tris-HCl、pH8、100mM KCl、0.1％ Triton X-100^TM、10％グリセロール、および0.1mM ZnCl₂）中で３時間インキュベートすることによって、再生した。³²P標識されたランダムに切断されたラット卵巣ゲノムDNAを緩衝液に加え、そしてニトロセルロースをさらに３時間インキュベートした。ブロットを結合緩衝液中で５回洗浄し、乾燥し、次にオートラジオグラフを行った。いくつかの実験においては、結合緩衝液は、10mMのEDTAおよび2mMのDTTを含んでいたが、Zn Cl₂を含まなかった。 DNAフィルター結合アッセイは、ジンクフィンガー１〜３を含むGSTZ13はラットDNAに結合し、他方、ジンクフィンガー４〜６を含むGSTZ46は結合しないことを示した（図7Aおよび図7B）。さらに、ジンクフィンガー１〜３を含むRIZフラグメントは、Zn⁺⁺イオンに依存する様式でDNAに結合した（図７）。これらの結果は、RIZのジンクフィンガードメイン１〜３がDNA結合において活性であることを示す。 RIZのGTPaseドメイン（配列の相同性によって規定される）を評価して、これが機能的に活性であるかを決定した。これらの研究のために、推定GTPaseドメインを含む、アミノ酸760位〜949位のRIZフラグメント(RIZ 760-949)を、プラスミドpKG-GからGSTとの融合物として発現させ、そして放射標識したヌクレオチドへの結合について試験した。pKG-Gを、プライマー5'-TCTCCACAGC ACAGCCCT-3'（配列番号15）、および5'-GGATAAGGAG GCTGTCTG-3'（配列番号16）、ならびにテンプレートとしてpCMVRIZを用いて、RIZ(760-949)をコードするヌクレオチド配列のPCR増幅によって作製した。フラグメントをpBSK+中にクローニングし、そして次にpGEX-KG中にクローニングし、発現させ、そしてグルタチオン-アガロースで上記のように精製した。GSTをまた、ベクターpGEX-KGから発現させ、そして上記のように精製した。 GTP結合を測定するために、0.5μgのGST-RIZまたはコントロールGSTタンパク質をSDS-PAGEで分離し、そしてニトロセルロース上にブロットした。タンパク質をGTP結合緩衝液（50mM Tris-HCl、pH8、100mM KCl、10％グリセロール、0.1％T riton X-100^TM、および２mM ZnSO₂）中で再生した。ニトロセルロースを、GTP結合緩衝液中で30分間、そして次に１μMのα-³²P-GTP(800Ci/mmol)を含むGTP結合緩衝液中で２時間、インキュベートした。ニトロセルロースをGTP結合緩衝液中で５回洗浄し、乾燥し、そしてオートラジオグラフを行った。いくつかのサンプルでは、α-³²P-GTPを加える前に、20mMの非標識ヌクレオチドをニトロセルロースと共に１時間インキュベートした。 RIZ GTPase融合タンパク質(GST-G)は放射標識GTPに結合したが、コントロール GSTは結合しなかった（図8Aならびに図8Bのレーン１および２）。結合はGTPに対して特異的であった。なぜなら、過剰量の非標識GTPはRIZ GTPaseの放射標識GTP への結合を阻害したが、過剰な非標識ATP、CTP、またはUTPは結合に影響を及ぼさなかった（図8B、レーン３〜６）からである。これらのデータは、RIZのGTPas eドメインが機能的に活性であることを示す。実施例Ｖ細胞、組織、および器官におけるRIZの発現この実施例は、哺乳動物細胞、組織、および器官における、RIZをコードする核酸分子の同定方法を提供する。 RNAサンプルを、ラットの組織およびマウス下垂体細胞Att-20株(ATCC #CCL 89 )から、製造者の指示手順に従ってRNAzol(Biotecx;Houston TX)で抽出し、そして標準手順を用いて、オリゴdT mRNAキット(Qiagen)を使用したオリゴdTセルロースクロマトグラフィーによってmRNAを精製することによって得た。mRNAはまた、上記のように、American Type Culture Collection(Rockville MD)から得られる種々のヒト細胞株からも抽出された。これらの種々のmRNAを用い、そして³²P 標識ラットRIZ（アミノ酸245位〜883位を表す）とのハイブリダイゼーションを用いて、標準手順(Sambrookら、前出、1989)に従って、ノーザンブロッティングを行った。ノーザンブロッティングは、7.2kbの主要なRIZ mRNA種の多くが、主としてラットの神経内分泌組織に局在していることを示した(図11A)。これらの試験は、他の器官または組織中で検出されるRIZ mRNAよりも小さい５kbのmRNA種を示した。 RNase保護法を用いて、mRNA発現のさらなる評価を行った。この方法は、³²P標識ラットRIZ（アミノ酸463位〜574位を表す）をプローブとして用いて、標準手順に従って行われた。この結果は、16日齢のラット胎児、ならびに胎盤の種々の神経組織中に、RIZ mRNAが豊富なレベルで存在することを示した（図11B）。対照的に、この方法では、成体ラット組織中ではmRNAは検出された場合でもわずかしか検出されなかった。 RNase保護は、RIZ mRNAがヒト網膜芽細胞腫細胞株、Y79およびWeri-Rb-1中で検出可能であり、種々の他のヒト細胞株においては検出レベルが低いことを示した（図12）。これらの結果は、RIZ mRNAが哺乳動物の神経内分泌関連組織中で大量に発現され、そして胎児の発育に関与し得ることを示す。ヒトRIZ cDNAのいくつかのセグメント（全長コード領域を包含する）をプローブとして使用して、ヒト胎盤のゲノムコスミドライブラリーをスクリーニングして、RIZ遺伝子を単離した。いくつかのゲノムクローンを単離し、そしてRIZをコードするセグメントを、制限マッピングおよびヌクレオチド配列決定によってそのクローン内で位置決めした。ゲノムクローンは、RIZをコードする配列が、遺伝子内で８個のエキソンにわたって広がり、RIZ配列(4.3kb)の大部分がエキソン７に含まれることを示した。実施例VI 正常細胞および腫瘍細胞中のRIZ遺伝子の分析本実施例は、直接的染色体分析によりRIZ遺伝子を検出し、そして腫瘍細胞中のRIZ遺伝子における変異を評価する方法を提供する。Ａ．ヒトRIZ遺伝子の染色体上の位置決めヒトRIZ遺伝子の染色体位置を検出するために、エキソン７および８を含有する35kbの挿入片を有するコスミドクローンを、Ｒバンド染色された（R-banded）中期染色体上の蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（FISH）用プローブとして用いた。FISH法は、以前に記載された（Takahashiら、Hum.Genet ．88:119〜 121（1991）、これは本明細書中で参考として援用される）ように行った。Cot-1 DNA（BRL；Gaithersburg MD）を、20倍過剰のCot-1 DNAを使用するLichterらにより記載された方法（Lichterら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 87:6634〜6638（19 90）、これは本明細書中で参考として援用される）に従って、このクローン内に存在する反復配列の抑制に使用した。Ektachromeフィルム（Kodak、ASA100）を顕微写真術に用いた（フィルターの組合せ、Nikon B-2A）。 FISH法により評価した100個のＲバンド染色された中期プレートの中で、52個のプレートが、バンドｐ36.13〜ｐ36.23で、染色体１の両方の染色分体へのプローブのハイブリダイゼーションを示し、44個のプレートが染色体１の１つの染色分体のみへのプローブのハイブリダイゼーションを示し、そして４個のプレートはハイブリダイゼーションを示さなかった。染色体1p36へのRIZ遺伝子のさらなる位置決めを、YACクローニングにより分子レベルで達成した。CEPH由来ヒトmega-YACライブラリー（CEPH、France）を、２種のオリゴヌクレオチドプライマーを用いるPCRによりスクリーニングし、RIZエキソン７内の290bpフラグメントを増幅した。１×PCR緩衝液（50mM KCl／10mM T r is-HCl、pH8.3／1.5mM MgCl₂）、各々200μMのdNTP、各々0.3μMのプライマー（ SSO 81:5'CCAGAACCAGACGAGCGATT3'（配列番号92）およびSSO 82:5'AGTTCTGGGGAT TTGCATG3'（配列番号93））、0.2UのTaq DNAポリメラーゼ（Perkin Elmer、Norw alk、CT）を含有して合計10μlの容量で、YAC DNAを増幅した。プライマーの１つを、³²P-γ-ATPおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて末端標識した。PC Rフラグメントを、アクリルアミドゲル電気泳動および続いてのオートラジオグラフィーによって分析した。 RIZ遺伝子配列についてのCEPHヒトmega-YACライブラリーのPCRスクリーニングにより、２つのYACクローン、796H4および807H7を同定した。Genethonヒトゲノムデータベースの検索（Genethon；Paris France）は、これらのクローンが染色体1p36に位置する多型マーカーD1S228（Gyapayら、Nat.Genet.7:246〜339（1994 ）；Weissenbachら、Nature 359:794〜801（1992）およびCohenら、Nature 366: 698〜701（1993）、これらの各々は、本明細書中で参考として援用される）を含有することを示した。従って、これらの結果は、RIZ遺伝子が染色体1p36に位置することを示す。Ｂ．ヒト黒色腫細胞における対立遺伝子特異的RIZ発現正常な被験体の血液および胎盤のサンプルならびに腫瘍細胞株由来のゲノムDN Aを、50mM Tris-HCl、pH 8.0／100mM EDTA／0.5％ SDS／500μg／ml プロテイナーゼＫの中で細胞を55℃にて１時間インキュベートすることにより調製した。フェノール／クロロホルム抽出およびクロロホルム抽出の後、DNAを沈澱させた。R NAを、５〜10×10⁶PBS洗浄細胞のペレットから、または胎児の組織から、RNAzol (Biotecx Laboratories；Houston TX)を用いて調製した。サザンブロットを、１kbのヒトRIZ cDNAプローブ（1.1）を使用して黒色腫細胞DNAで行った。その結果は、黒色腫細胞におけるRIZ遺伝子の適切な大きさのバンドの同定を示した。これは、これらの細胞におけるRIZ遺伝子中に大きな異常がないことを示した。 RIZの両方の対立遺伝子が黒色腫細胞内で活性であるか否かを決定するために、RIZの２つの対立遺伝子変異の頻度を黒色腫について測定し、そして集団内での頻度と比較した。RIZ遺伝子型分類（genotyping）は、28人の正常個体および6 9 個のヒト黒色腫細胞株から単離したゲノムDNAでのPCRを使用して、RIZを示す290 bpフラグメント（アミノ酸残基約230〜330）の増幅により行った。290bpフラグメントのPCR増幅は、１×PCR緩衝液、各々200μMのdNTP、各々0.3μMのプライマー（SSO 81およびSSO 82）、および１UのTaq DNAポリメラーゼ（Perkin Elmer）を含有して合計50μlの容量で、100ngのゲノムDNAで行った。PCR産物を配列決定して、RIZアミノ酸283位をコードするコドンを決定した。RIZ D283対立遺伝子は、コドンGATによってアミノ酸283位でAsp残基をコードするが、RIZ E283対立遺伝子は、コドンGAAによってアミノ酸283位でGlu残基をコードする。 28人の正常個体由来のDNAの遺伝子型分類は、15人（53％）がRIZ D283対立遺伝子についてホモ接合であり、３人（10％）がE283対立遺伝子についてホモ接合であり、そして10人（35％）がヘテロ接合であることを示した。従って、研究された正常個体の集団におけるRIZ E283対立遺伝子の全体の頻度は、約28.5％であると評価された。 69個の黒色腫細胞株のDNAの遺伝子型分類は、40個（58％）がRIZ D283対立遺伝子についてホモ接合であり、９個（13％）がRIZ E283対立遺伝子についてホモ接合であり、そして20個（29％）がヘテロ接合であることを示した。 20個のヘテロ接合黒色腫細胞株由来のRNAサンプルを配列決定して、両方の対立遺伝子が細胞内で転写されるか、または１つの対立遺伝子のみが転写される（すなわち、単一対立遺伝子性発現）かを決定した。配列決定は、特異的なRIZプライマーを使用する逆転写PCR（RT-PCR）増幅により生成されたDNA産物について行った。RT-PCR増幅を、製造者の使用説明書（GeneAmp RNA PCR キット；Perkin Elmer）に従って行った。RIZエキソン５〜７をコードする640bpフラグメントを、SSO 82プライマー（配列番号93）を使用する１μgの総RNAの転写、ならびにSS O 24プライマー（5'GCGAGGAGCTCCTGGTCTGG3' ;配列番号106）およびSSO 82プライマー（配列番号93）を用いるPCR増幅により得た。増幅したフラグメントをゲル精製し、そしてSSO 82プライマーおよびCircumVent^TM Thermal Cycle DNA Seq uencingキット（New England Biolabs；Beverly MA）を使用して配列決定した。配列決定反応産物を、６％配列決定用ゲルで分析した。 20個のヘテロ接合の黒色腫細胞株由来の、増幅および転写されたRIZ mRNAの配列決定は、RIZ対立遺伝子の１つを示す転写物が、４個の細胞株において、減少したか、または存在しなかったことを示した。これらの細胞株は、D283／E283 R IZヘテロ接合（すなわち、5-5／6-4と称される）であった。D283対立遺伝子の転写物は、SK-MEL-14細胞（ATCC）において検出されなかったが、E283 RIZの転写物は、WM983C細胞株およびWM1361C細胞株において検出されなかった。SK-MEL-23 細胞株は、減少したレベルのD283 RIZ対立遺伝子を発現した。黒色腫の結果とは対照的に、RIZヘテロ接合を示す７個の非黒色腫細胞株および２個の正常ヒト胎盤組織由来の、増幅および転写されたmRNAの配列決定は、RIZ対立遺伝子発現の欠失または減少を示さなかった。 RIZについてヘテロ接合の４個の黒色腫細胞株を、評価し、細胞から産生されたRIZタンパク質の量を決定した。RIZタンパク質のレベルを、抗RIZ抗体を用いる細胞抽出物からのRIZの免疫沈降とその後の抗RIZ抗体を用いる単離されたRIZ のイムノブロッティングにより、定性的に評価した。黒色腫細胞株SK-MEL-23は、試験した他の黒色腫細胞株よりも、約50％少ないRIZタンパク質を産生した。これらのデータは、SK-MEL-23におけるRIZ D283対立遺伝子の発現の減少が、細胞内のRIZタンパク質の発現全体の減少をもたらすことを示す。 SK-MEL-23黒色腫細胞株を、３μMの脱メチル化剤5-アザシチジンとともに３〜６日間培養した。これらの細胞におけるRIZ D283転写物の発現減少は、影響を受けなかった。これは、RIZの転写レベルの減少がDNAのメチル化の増大によるものではないことを示す。 SK-MEL-23黒色腫細胞を、全長RIZ cDNAをコードする発現ベクター（pCMVRIZ）でトランスフェクトし、RIZの発現レベルの増大が細胞の増殖可能性を減少させ得るか否かを決定した。RIZでトランスフェクトしたSK-MEL-23細胞は、モノクローナル抗体D27での免疫染色により細胞核内のRIZ発現の増加を示し、そしてインビトロでコロニーを形成する能力の減少を示した。これらの結果は、RIZ発現が欠損した腫瘍細胞におけるRIZのレベルの増加が、腫瘍細胞の増殖を減らし得ることを示す。実施例VII RIZ タンパク質が転写を抑制する本実施例は、RIZまたはRIZの活性なフラグメントが転写を抑制し得ることを証明する。 GAL4のDNA結合ドメインに融合したRIZまたはRIZの欠失変異体を含む融合タンパク質を、ラットRIZ cDNA（配列番号１）またはそれらの一部をプラスミドpSG4 24（SadowskiおよびPtashne、Nucl.Acids Res. 17:7359（1989）、これは本明細書中で参考として援用される）にサブクローニングすることにより産生した。RI Z／GAL4融合タンパク質をコードするプラスミドを、チミジンキナーゼプロモーターおよびGAL4プロモーターに結合したCATレポーター遺伝子を含有するプラスミド（Shiら、Cell 67：377〜388（1991）、これは本明細書中で参考として援用される）とともに、CV1細胞、COS細胞、またはC33A細胞（ATCC）にトランスフェクトした。レポーター遺伝子（CAT）の発現は、RIZ／GAL4（RIZアミノ酸17〜1706；配列番号２を含有する）でトランスフェクトされた細胞において、プラスミドpSG424 でトランスフェクトされているがRIZ配列を欠く細胞におけるCAT発現のレベルと比較して減少した。RIZのリプレッサー活性は、アミノ末端からアミノ酸17〜900 位に位置した（配列番号２）。PRドメインは転写抑制に必要とされるが、しかし単独では、完全なリプレッサー活性には十分でない；アミノ酸573〜900位の間の領域もまた必要とされる。これらの結果は、RIZまたはその活性なフラグメントが、転写調節因子として作用し得ることを示す。さらに、RIZの転写リプレッサーの役割は、Rbタンパク質とのその相互作用によりRIZが有する調節効果から独立している。なぜなら、RIZ／GAL4によって抑制されたC33A細胞はRbを発現しないからである。 CATレポーター活性は、アミノ酸71〜1706（配列番号２）を含有するRIZ／GAL4 のトランスフェクションによって減少した。しかし、リプレッサー活性の量は、 RIZアミノ酸17〜1706（配列番号２）を含有するRIZ／GAL4よりも少なかった。この結果は、PRドメインがRIZに媒介される転写調節に関与し、そしてPRドメインのブロックＡが存在しないことにより、RIZリプレッサー活性を減少させるが、除去しないことを示す。上記実施例を参考に本発明を説明したが、本発明の精神から離脱することなく様々な改変を行い得ることを理解するべきである。従って、本発明は、以下の請求の範囲によってのみ限定される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．実質的に精製された、哺乳動物RIZをコードする核酸分子。２．請求項１に記載の核酸分子を含有する、ベクター。３．請求項２に記載のベクターを含有する、宿主細胞。４．前記RIZが、図9A（配列番号３）に示されるヌクレオチド配列を実質的に有するヒトRIZである、請求項１に記載の核酸分子。５．ヌクレオチド969位でアデニンがチミンに置換されている、請求項４に記載の核酸分子。６．前記RIZが、図9B（配列番号95）に示されるヌクレオチド配列および図9A（配列番号３）に示されるヌクレオチド130〜5277位のヌクレオチド配列を実質的に有するヒトRIZである、請求項１に記載の核酸分子。７．前記RIZが、図9B（配列番号96）に示されるヌクレオチド配列および図9A（配列番号３）に示されるヌクレオチド130〜5277位のヌクレオチド配列を実質的に有するヒトRIZである、請求項１に記載の核酸分子。８．図9A（配列番号４）に示されるアミノ酸配列を実質的に有する、ヒトRIZをコードする核酸分子。９．比較的ストリンジェントな条件下で、請求項４に記載の核酸分子または請求項４に記載の前記核酸分子に相補的な核酸分子に特異的にハイブリダイズする少なくとも10個のヌクレオチドを含有する、ヌクレオチド配列。１０．前記RIZが、図1A（配列番号１）に示される核酸配列を実質的に有するラットRIZである、請求項１に記載の核酸分子。１１．図1A（配列番号２）に示されるアミノ酸配列を実質的に有する、ラットRI Zをコードする核酸。１２．比較的ストリンジェントな条件下で、請求項１１に記載の核酸分子または請求項１１に記載の前記核酸分子に相補的な核酸分子に特異的にハイブリダイズする少なくとも10個のヌクレオチドを含有する、ヌクレオチド配列。１３．図14（配列番号105）に示されるアミノ酸配列を実質的に有する、マウスR IZをコードする核酸分子。１４．実質的に精製された、RIZをコードする変異核酸分子。１５．比較的ストリンジェントな条件下で、請求項１４に記載の変異核酸分子または請求項１４に記載の前記変異核酸分子に相補的な核酸分子に特異的にハイブリダイズするが、請求項１に記載の核酸配列にハイブリダイズしない少なくとも 10個のヌクレオチドを含有する、ヌクレオチド配列。１６．実質的に精製された、哺乳動物の網膜芽細胞腫タンパク質相互作用性ジンクフィンガータンパク質（RIZ）。１７．実質的に精製された、哺乳動物RIZの活性フラグメント。１８．アミノ酸配列EIRCEEKPEDL（配列番号６）を実質的に含有する、請求項１７に記載の活性フラグメント。１９．アミノ酸配列EIRCDEKPEDL（配列番号91）を実質的に含有する、請求項１７に記載の活性フラグメント。２０．図9A（配列番号４）に示されるアミノ酸配列を実質的に有する、実質的に精製されたヒトRIZ。２１．アミノ酸283位でグルタミン酸がアスパラギン酸に置換されている、請求項２０に記載のヒトRIZ。２２．図1A（配列番号２）に示されるアミノ酸配列を実質的に有する、実質的に精製されたラットRIZ。２３．請求項１６に記載のRIZに特異的に結合する、抗体。２４．実質的に精製された変異ヒトRIZまたはその活性フラグメント。２５．請求項２４に記載の変異RIZに特異的に結合する、抗体。２６．アミノ酸配列：Y-A-X100-B-X101-C-Z、ここで、Yは、約８〜13個の独立して選択されるアミノ酸であり； X100は、約20〜35個の独立して選択されるアミノ酸であり； X101は、約20〜35個の独立して選択されるアミノ酸であり； Zは、約８個の独立して選択されるアミノ酸であり； Aは、Ile-X2-X3-Gly-X4-X5-X6-Gly-X7-X8-X9-X10であり、ここで、X6は、PheまたはIleであり、X7は、ProまたはValであり、X10は、Gly またはLysであり、そしてX2、X3、X4、X5、X8、およびX9は、各々１個の独立して選択されるアミノ酸であり； Bは、Ile-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21であり、ここで、X11は、AspまたはCysであり、X15は、ProまたはGluであり、X16は、G luまたはAspであり、X20は、TrpまたはPheであり、X21は、MetまたはLeuであり、そしてX12、X13、X14、X17、X18、およびX19は、各々１個の独立して選択されるアミノ酸であり；そして Cは、X22-X23-L-X24-X25-X26-X27-X28-X29-X30-Dであり、ここで、X22は、GluまたはGlnであり、X23は、GluまたはAsnであり、X24は、L euまたはIleであり、X25は、ValまたはLeuであり、X30は、ArgまたはGluであり、X27およびX29は、各々独立して選択されるアミノ酸であり、そしてX26およびX 28は、各々独立して存在しないか、または独立して選択されるアミノ酸である、を含有する、PRドメインペプチド。２７．請求項２６に記載のPRドメインペプチドであって、ここで Aにおいて、X3は、LysまたはValであり、X5は、ArgまたはLysであり、X6は、Phe であり、X7は、Proであり、X9は、IleまたはValであり、そしてX10は、Glyであり； Bにおいて、X11は、Aspであり、X12は、GlyまたはAlaであり、X17は、Lysまたは Valであり、X18は、SerまたはGlyであり、X19は、AsnまたはSerであり、そしてX 20は、Trpであり；そして Cにおいて、X23は、Gluであり、X24は、Leuであり、X26は、TrpまたはPheであり、X27は、TyrまたはMetであり、そしてX28は、存在する場合には、AsnまたはLys である、PRドメインペプチド。２８．前記アミノ酸配列が、配列番号99である、請求項２６に記載のPRドメインペプチド。２９．前記アミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸36〜151位として示される、請求項２６に記載のPRドメインペプチド。３０．前記アミノ酸配列が、配列番号98、配列番号99、配列番号100、および配列番号101からなる群から選択される、請求項２６に記載のPRドメインペプチド。３１．請求項２６に記載のPRドメインペプチドであって、ここで Aが、PRDI-BF1（配列番号98）のアミノ酸71〜81位、RIZ（配列番号99）のアミノ酸50〜61位、EVI-1（配列番号100）のアミノ酸71〜82位、およびegl-43（配列番号101）のアミノ酸29〜40位からなる群から選択される、PRドメインペプチド。３２．請求項２６に記載のPRドメインペプチドであって、ここで Bが、PRDI-BF1（配列番号98）のアミノ酸112〜123位、RIZ（配列番号99）のアミノ酸88〜99位、EVI-1（配列番号100）のアミノ酸108〜119位、およびegl-43（配列番号101）のアミノ酸65〜76位からなる群から選択される、PRドメインペプチド。３３．請求項２６に記載のPRドメインペプチドであって、ここで Cが、PRDI-BF1（配列番号98）のアミノ酸158〜167位、RIZ（配列番号99）のアミノ酸134〜44位、EVI-1（配列番号100）のアミノ酸154〜164位、およびegl-43（配列番号101）のアミノ酸107〜116位からなる群から選択される、PRドメインペプチド。３４．以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する、PRドメインペプチド： Ile-X2-X3-Gly-X4-X5-X6-Gly-X7-X8-X9-X10、ここで、X6は、PheまたはIleであり、X7は、ProまたはValであり、X10は、Gly またはLysであり、そしてX2、X3、X4、X5、X8、およびX9は、各々１個の独立して選択されるアミノ酸である； Ile-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21、ここで、X11は、AspまたはCysであり、X15は、ProまたはGluであり、X16は、G luまたはAspであり、X20は、TrpまたはPheであり、X21は、MetまたはLeuであり、そしてX12、X13、X14、X17、X18、およびX19は、各々１個の独立して選択されるアミノ酸である、そして X22-X23-L-X24-X25 X26-X27-X28-X29-X30-D、ここで、X22は、GluまたはGlnであり、X23は、GluまたはAsnであり、X24は、L euまたはIleであり、X25は、ValまたはLeuであり、X30は、ArgまたはGluであり、X27およびX29は、各々独立して選択されるアミノ酸であり、そしてX26およびX 28は、各々独立して存在しないか、または独立して選択されるアミノ酸である。３５．前記アミノ酸配列が、RIZ（配列番号99）のアミノ酸50〜61位、RIZ（配列番号99）のアミノ酸88〜99位、RIZ（配列番号99）のアミノ酸134〜44位からなる群から選択される、請求項３４に記載のPRドメインペプチド。３６．前記アミノ酸配列が、PRDI-BF1（配列番号98）のアミノ酸71〜81位、EVI- 1（配列番号100）のアミノ酸71〜82位、egl-43（配列番号101）のアミノ酸29〜4 0位、PRDI-BF1（配列番号98）のアミノ酸112〜123位、EVI-1（配列番号100）のアミノ酸108〜119位、egl-43（配列番号101）のアミノ酸65〜76位、PRDI-BF1（配列番号98）のアミノ酸158〜167位、EVI-1（配列番号100）のアミノ酸154〜164 位、およびegl-43（配列番号101）のアミノ酸107〜116位からなる群から選択される、請求項３４に記載のPRドメインペプチド。３７．被検体における、変異RIZを有する腫瘍細胞の増殖を減少するための方法であって： a．該腫瘍細胞に、RIZをコードする核酸分子を導入する工程；および b．該腫瘍細胞において該RIZを発現させる工程であって、ここで該RIZは、該腫瘍細胞の増殖を減少させる、工程、を包含する、方法。３８．前記腫瘍細胞が、神経芽細胞腫腫瘍細胞および黒色腫腫瘍細胞からなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。