KR19990085356A

KR19990085356A - 레티노브라스토마 단백질 및 전사요소 ets1 또는 ets2을포함하는 전사요소 ets1 또는 ets2의 활성 조절물질의 검색 시약 및 검색 방법

Info

Publication number: KR19990085356A
Application number: KR1019980017730A
Authority: KR
Inventors: 양범석; 김동명; 손호선
Original assignee: 성재갑; 주식회사 엘지화학
Priority date: 1998-05-16
Filing date: 1998-05-16
Publication date: 1999-12-06

Abstract

본 발명은 레티노브라스토마(Rb) 단백질 및 전사요소 ets1 또는 ets2 을 포함하는 전사요소 ets1 또는 ets2 의 활성 조절물질의 검색 시약 및 이를 이용한 검색 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 ets1 또는 ets2 의 아미노말단과 결합하여 ets1 또는 ets2 의 발현유도 활성을 억제하는 Rb 의 카복시말단과 ets1 또는 ets2를 포함하는 전사요소 ets1 또는 ets2 의 활성 조절물질의 검색 시약 및 이를 이용한 검색 방법에 관한 것으로서, 본 발명에 의하여 검색된 물질은 전사요소 ets1 또는 ets2 에 의존하는 유전자 발현이 많아짐으로써 발생하는 병리현상, 예를 들어 류마티즘, 암세포 전이의 치료제 등으로 이용될 수 있다.

Description

레티노브라스토마 단백질 및 전사요소 ｅｔｓ1 또는 ｅｔｓ2 을 포함하는 전사요소 ｅｔｓ1 또는 ｅｔｓ2 의 활성 조절물질의 검색 시약 및 검색 방법

본 발명은 레티노브라스토마(Rb) 단백질 및 전사요소 ets1 또는 ets2 을 포함하는 전사요소 ets1 또는 ets2 의 활성 조절물질의 검색 시약 및 이를 이용한 검색 방법에 관한 것이다.

보다 상세하게는, ets1 또는 ets2 의 아미노말단과 결합하여 ets1 또는 ets2 의 발현유도 활성을 억제하는 Rb 의 카복시말단과 ets1 또는 ets2를 포함하는 전사요소 ets1 또는 ets2 의 활성 조절물질의 검색 시약 및 이를 이용한 검색 방법에 관한 것이다.

일반적으로 유전자는 크게 그 유전자의 단백질 서열을 결정하는 정보를 가진 부분과 이것 앞에 그 유전자의 발현을 조절하는 정보를 가진 프로모터로 구성되어 있다. 이 프로모터에는 특정 염기 서열을 가지는 여러 전사요소들의 부착부위가 있는데 이 전사요소의 작용이 다양한 세포환경에 반응하여 증폭되거나 감소함으로써 결국 관계된 유전자의 발현을 조절하게 된다(Science 245: 371-378, 1990). 이러한 전사작용의 조절을 통해 세포의 성장, 분화, 발생, 노화, 아폽토시스 등에 관계되는 유전자 발현을 조절함으로써 그 운명이 조절된다는 것이 일반적으로 받아들여지고 있다. 따라서 이 전사기작의 비 이상성은 여러 병리현상들을 일으키는 요인이 될 수 있으며 이의 연구는 병리현상을 정확히 이해하는데 큰 도움을 주고 있다. 또한 이러한 연구는 비이상적인 전사과정을 확인한 후 그의 교정을 통해 질병의 치료방법의 개발에 응용될 수 있다(Ptashne, Nature 335: 638-389).

전사요소 ets1 과 ets2 는 ets 전사요소 가족(transcription factor family)에 포함되는 전사요소로서 다른 ets 전사요소 가족과 같이 ets 도메인(domain)이라 부르는 유사한 아미노산 서열을 갖는 DNA 결합부위를 가지고 있다(Karim et al., Genes Dev 4, 1451-1453, 1990). ets1 과 ets2 는 카복시말단 DNA 결합부위외에 아미노말단의 트란스액티베이션 도메인(transactivation domain)의 중간에 서로간에 매우 유사한 아미노산 서열을 가진 소위 포인티드 도메인(pointed domain) 이 존재한다(Yang et al., MCB 16: 38-647, 1996). 이 포인티드 도메인은 MAP 키나제 인산화 부위가 있어서 ras 발암유전자(oncogene) 신호에 의하여 인산화되어 그 전사활성이 증가되며 또한 이 부분은 전형적인 헬릭스-루프-헬릭스(Helix-Loop-Helix) 구조를 가짐으로써 단백질-단백질 결합에 관여하는 것으로 추정된다.

한편, ets1 과 ets2 에 의하여 그 발현이 증가하는 유전자들은 대부분 세포성장과 밀접한 유전자들로서(Botner et al., Crit. Rev. Oncogenesis 4: 137-160, 1993), bFGF, EGF 등의 성장 인자나 사이클린 D1과 같은 세포성장효소, 또는 MMP-1, MMP-3, MMP-9, uPA 등의 세포성장시에 필요한 여분세포 복합체 재변형(extracellular matrix remolding)에 관여하는 유전자들이다. 이러한 유전자들의 프로모터에는 ets 결합부위가 존재하여 ets 가 결합하면 상기 유전자들의 발현이 유도된다. 상기 유전자들중 MMP-1, MMP-3, MMP-9 는 그 발현이 많아지면 류마티즘의 원인이 되고 또한 uPA, mt-MMP, MMP-1, MMP-3, MMP-9 등은 암세포 전이에 관여하는 것으로 알려져 있다. 따라서 상기 유전자들의 발현을 유도하는 ets1 또는 ets2 의 활성 저해제는 ets1 또는 ets2 에 의존하는 유전자 발현을 억제할 수 있으므로 ets1 또는 ets2 에 의존하는 유전자 발현이 많아짐으로써 발생하는 병리현상, 즉 류마티즘, 암세포 전이의 치료제 등으로 이용될 수 있다.

레티노브라스토마 유전자는 안구암인 레티노 브라스토마에서 비활성화되는 유전자로 처음 포지셔날 클로닝(positional cloning)에 의하여 일종의 종양 억제자(tumor suppressor)로서 클로닝되었다(Hamel et al., FASEB J. 7: 846-853, 1993). 그 후 안구암이외에도 골수종(osteosarcoma)에서도 그 유전자의 비활성화가 관찰되었다. 강력한 발암 유전자의 하나인 SV 40 대 T 항원(SV 40 large T antigen)이 실질적으로 Rb 단백질에 부착되어 그 기능을 저해한다는 것이 확인되었다. 계속적인 생화학적인 성질의 규명 연구에서 이 단백질은 매우 인산화되어 있으며 인산화의 정도가 세포주기의 진행에 따라 진동(fluctuation)함이 확인되었다. 세포주기 조절에 관한 자세한 생화학적 기전이 밝혀지면서 이 단백질은 100kd 이 넘는 큰 단백질로서 세포주기 전이의 촉진에 관련된 여러 단백질 즉, E2F, myc 등에 부착하여 이들을 비활성화시키고 있다가 CDK2 나 CDK4 에 의하여 자신이 인산화되면 이들을 방출함으로써 더 이상 세포분열을 억제하지 못하게 된다는 것이 알려졌다(Taya, TIBS 22: 14-17, 1997). 현재 레티노브라스토마에 결합하는 대표적인 단백질로서는 E2F, D형 사이클린, Myc, elf, abl 등이 있고, E2F, D형 사이클린, Myc, elf 는 Rb 단백질의 A/B 주머니(pocket)에 결합하고, abl 은 C-주머니에 결합하는 것으로 알려져 있다. 레티노브라스토마 단백질에는 최소한 10개의 CDK 에 의하여 인산화되는 부위가 있는데 이중 780번 아미노산은 CDK4 에 의해서만 인산화되는 것으로 알려져 있으며, 카복시말단의 4개의 인산화 부위가 생체 내에서 주요한 인산화 부위인 것으로 보고된 바 있다(Wang et al., J.B.C. 271: 8313-8320, 1996). 또한 Rb 단백질이 여러 유전자의 발현에도 관여함이 보고되었는데 구체적으로 sp-1 전사요소의 작용을 도와 이의 전사효과를 증진시키는 반면 DNA 상의 특정 염기서열에 부착하여 유전자 발현을 억제하기도 한다는 것이다(Weinberg, Cell 81: 323-330, 1995).

포유동물 세포에서 세포 주기를 조절하는 대표적인 키나제로는 3가지를 들 수 있다. 첫째는 세포 주기의 중간-G1 기 (mid-G1 phase)에서 활동적인 CDK4 (cell cycle dependent kinase 4) 이고, 둘째는 중간-G1 및 S 기에서 활동적인 CDK2 이며, 세째는 G2 및 M 기에서 활동적인 CDC2 이다. 이중 CDK4 와 CDK2 는 G1-S 세포주기 체크 사항 (check point)에 의하여 그 활성이 조절되며, CDC2 는 G2-M 세포주기 체크 사항에 의하여 조절되는 것으로 알려져 있다 (Morgan, Nature, 374: 131-134, 1995). 여러 암세포들에서 CDK4 와 CDK2 의 조절 기작이 비이상성을 나타내고, 실제로 변형동물에서 인위적으로 유도한 이들의 비이상성이 암을 유발하였다 (Wang, et al., Nature, 369: 669-671, 1994).

이들 조절 효소를 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.

CDK2 는 분자량이 약 34 kd 이며 CDK4 와 약 47% 의 구조적 유사성을 가지고 세포주기 조절 키나제에 공통적인 과정에 의하여 활성화되는 것으로 알려져 있다 (Morgan, Nature, 374: 131-134, 1995). CDK 가 활성화된 형태로 되려면 특정 세포주기에만 존재하는 특정 형태의 사이클린 (cyclin)과 복합체를 이루어야 하고, 특정 아미노산이 CAK (CDK activating kinase)에 의하여 인산화되어야 하며, N-말단 근처가 포스파타제 (phosphatase)에 의하여 탈인산화 (dephosphorylation)되어야 한다. CDK2 는 세포주기를 통하여 번갈아 가며 여러 사이클린과 교대로 결합하면서 활성화된다. G1-S 기 전이 과정 중에는 사이클린 E 와 결합하고 S 기 중에는 사이클린 A 와 결합하는 것으로 알려져 있는데, 이와 같이 CDK2 가 사이클린 파트너 (partner)를 세포주기 동안 바꾸는 것의 의미는 아직 잘 밝혀지지 않았다. CDK2 활성이 세포가 G1 기에서 S 기로 가는데 그리고 S 기를 완성하는데 꼭 필요하다는데 이의가 없지만 그에 대한 자세한 설명을 위해서는 진전된 연구가 필요하다.

CDK2 는 CDK4 와 마찬가지로 Rb 단백질을 시험관 내 (in vitro)에서 인산화하지만 히스톤 H1 을 인산화하는 면에서는 CDK4 와 다르다. 이것의 생체내 (in vivo) 중요성은 현재 잘 알려지지 않았다. CDK2 는 위에서 기술한 여러 사이클린에 의하여 시기 적절하게 활성화 (timely activation)되고, CDK4 와 마찬가지로 p21 형태의 CDK 저해제에 의하여 그 활성이 저해된다. 그러나 CDK4 와는 다르게 p16 형태는 전혀 저해제로서 작용하지 못하고, 세포 분화중 CDK2 활성이 줄어든다는 보고도 아직 없다. 한편, 이러한 CDK2 의 X-선 구조를 연구 분석한 결과는 CDK 효소의 활성화 과정 및 그 효소 작용 기작 등을 잘 이해하는데 큰 도움을 주었다 (Jefferey, et al., Nature, 376: 313-320, 1995). 또한, CDK2 - ATP 복합체와 CDK2 - 사이클린 A - ATP 복합체의 구조를 분석한 결과는 165번 아미노산의 인산화가 소위 T 루프 (loop)의 이동을 유발하여 활성 부위 포켓 (active site pocket)을 열리는 상태로 만들고 단백질 기질 (protein substrate)이 부착하는 환경을 조성한다는 것을 보여주며, 이 과정에 관계된 아미노산 부위들을 알려준다. 사이클린 A 는 CDK2 에 부착하여 역시 기질이 결합될 수 있는 열린 형태를 유도하며 부착된 ATP 가 반응에 적절한 방향성 (orientation)을 가지도록 해주는 것으로 밝혀졌다. 그러나 아직 기질 펩타이드가 CDK2 와 복합체를 만드는 과정에 대한 연구는 다음 과제로 남겨진 상태로, 기질의 결합에 대해서 아직 구조적인 설명이 되지 못하고 있다. 또한 일부 유방암에서 사이클린 E 의 과량 발현이 관찰되어 이들 과정이 유방암의 전이와 깊은 연관이 있으며, 사이클린 E 의 과량 발현이 저혈청 조건에서 세포의 아폽토시스 (apoptosis)를 저해하고 앵커리지 독립 성장 (anchorage independent growth)을 유도한다고 제안되었다 (Pardee, et al., Nature medicine, 2: 254, 1997). MMTV 프로모터를 이용한 CDK2 과량 발현 변형동물에서 가슴 상피 세포 (breast epithelial cell)의 과증식 (hyperploliferation), 네오플라지아 (neoplasia)가 관찰되었다. 이러한 사실은 CDK2 활성이 세포주기 변화 과정 또는 그것의 유지에 관여할 수 있음을 보여주는 것이라 하겠다.

CDK4 는 분자량이 약 34 kd 으로서 그 자체로는 키나제 활성을 가지지 않는다. CDK4 는 중간-G1 기에서 나타나는 D 타입 사이클린과 복합체를 만들고 아미노산 172번 위치가 인산화되면 활성화된 형태로 된다 (Morgan, Nature, 374: 131-134, 1995). 이 키나제의 알려진 생체내 (in vivo) 기질은 종양 억제자 (tumor suppressor)인 Rb 단백질로서 S(T)-P-X-K(R) 서열을 가지는 교감 펩타이드 (consensus peptide)의 S(T)를 인식하여 인산화한다. Rb 는 모두 10개의 인산화 가능 부위를 가지고 있는데, 이중 780번 아미노산이 CDK4 만의 선호 서열 (preferable sequence)로 알려져 있으며 그 외 부위는 여러 CDK 가 인산화할 수 있다. 이러한 효소 활성을 가지는 CDK4 는 CDK4 와 사이클린 D1 (CYC D1)을 배큘로바이러스 (baculovirus)에서 동시 발현시킴으로써 얻을 수 있다 (Yoichi, TIBS, 22: 14-17, 1997). CDK4 는 Rb 를 인산화함으로 Rb 의 G1-S 세포주기 진행의 억제작용을 저해하여 G1-S 세포주기 진행을 촉진한다고 알려져 있다 (Sherr, Cell, 73: 1059-1065, 1993). 실제로 Rb 단백질이 없는 세포는 CDK4 의 활성을 저해해도 G1-S 세포주기 진행을 막지 못하는 것으로 알려져 있다 (Lucas, et al., Nature, 375: 503-506, 1995). 이는 Rb 가 최소한 CDK4 의 세포내의 성장을 조절하는 과정에 중심적인 다운 스트림 표적 기질 (down stream target substrate)임을 나타내는 것이다. CDK4 활성가 여러 세포에서 세포 분화 과정 중에 줄어드는 것으로 보아 CDK4 는 세포 분화를 저해하는 것으로 추정되고 있다. 이 경우 다른 CDK 의 활성는 변하지 않는 것으로 보아 이것은 CDK4 의 중요한 세포내 기능임을 암시하고 있다 (Kranenburg, et al., Journal of Cell Biology, 131: 227-234, 1995). CDK4 단백질은 일반적으로 세포 내에서 세포주기 변화 동안 그 양이 변하지 않는 것으로 알려져 있지만, 간혹 몇몇 암세포에서 그 단백질 양이 증가되거나 그 유전자가 증폭되는 경우가 알려져 있다. 그러나 현재 CDK4 활성이 사이클린 D 양의 변화에 의한 포지티브 조절과 그것의 천연 억제자 (natural ingibitor) 단백질인 p16, p21, p27, p57 등에 의한 네가티브 조절에 의하여 조절된다고 알려져 있다 (Sherr, Cell, 73: 1059-1065, 1993). D 타입의 사이클린은 현재 D1, D2, D3 등 3가지가 밝혀져 있고, 이중 D1 타입이 가장 많이 연구되어 가장 중심적인 역할을 하는 사이클린인 것으로 보고되었다. 사이클린 D 는 G1 기에 나타나서 CDK4 를 활동하게 만드는 역할을 한다. 이러한 사이클린 D 의 전사 조절에 있어서 ras 또는 src 의 활성화에 의한 세포 내의 사이클린 D1 m-RNA 의 상향 조절 (up regulation)이 보고된 바 있다. 이 사이클린 D1 양의 증가는 곧 세포 내에서의 CDK4 활성의 증가를 가져다 주는 것으로 알려져 있고, 이러한 현상은 ras 또는 src 가 암유전자 활성을(oncogenic activity)을 나타내는 중요한 이유가 된다 (Peeper, et al., Nature, 386: 177-181, 1997).

CDK4 는 네가티브 조절도 받게 된다. 먼저 아직 알려지지 않은 키나제에 의하여 17번 타이로신이 인산화됨으로 CDK4 활성이 저해되는데, 이는 곧 세포주기의 G0/G1 어레스트 (arrest)의 직접적인 원인이 됨이 밝혀졌다 (Terade, et al., Nature, 376: 358-362, 1995). CDK 의 천연 단백질 억제자 (natural protein inhibitor)는 2가지 형태로 분류되는데 (Morgan, Nature, 374: 131-134, 1995), 구체적으로 p16 타입과 p21 타입이다. p16 타입에는 p15 및 p18 이 속하며 이들은 CDK4 에 직접 결합하여 CDK4 활성을 저해한다. 또한 이들은 모두 안킬린 반복 도메인 (ankylin repeat domain)으로 구성되어 있으며, CDK 들 중 CDK4 만을 저해하는 것으로 현재 알려져 있다. p21 타입에는 p27 및 p57 이 속하며 이들은 CDK4 외에도 CDK2 와 CDC2 를 저해하는데 CDK 가 사이클린과 복합체를 이룬 형태를 인지함으로 작용한다. p16 타입들 중 p16 및 p15 는 많은 암세포에서 그 유전자가 상실된 것이 관찰되고, 실제로 p16 녹-아웃 (knock-out) 변형동물은 많은 조직에서 암이 생성되므로 p16 기능의 상실이 암의 직접적인 원인이 됨을 알 수 있다. p16 의 발현 조절에 대해서 아직 정확하게 설명되지는 않았다. 한편, p21 은 암세포들에서 비이상성이 거의 발견되고 있지 않는데, 그 이유는 아직 분명치 않다. 또한, p21 은 환경 변화에 민감하게 반응하여 그 발현이 조절됨이 보고되었고, 실제로 p53 에 의하여 p21 이 유도되며 노화되는 세포에서 그 발현이 증가된다 (Harper, et al., Cell, 75: 805-816, 1993). p27 은 TGF-b 또는 세포-세포 접촉 신호에 의하여 발현이 유도된다 (Polyak, et al., Cell, 78: 66-69, 1994). CDK4 활성의 비이상적 조절과 암 발생과의 연관은 여러 암조직에서 잘 나타나고 있다 (Serrano, et al., Cell, 85: 27-37, 1996). 여러 암에서 p16, p15 유전자의 상실이 보고되었고 특히 사이클린 D1 의 과량 발현이 여러 암에서 보여지며 특히 유방암이 전이 성질을 띠는 것과 연관되어 있음이 보고되었다 (Pardee, et al., Nature medicine, 2: 254, 1996). 이는 비이상적인 CDK 활성이 암세포가 악성을 띠게 하는 요인이 될 가능성을 제시해 주고 있다. 또한, p16 녹-아웃 변형 쥐는 p53 녹-아웃 변형 쥐 만큼이나 암이 잘 발생한다고 보고된 것은 p16 가 CDK4 기능 조절을 상실하게 하여 암이 발생됨을 증명하였다 (Serrano, et al., Cell, 85: 27-37, 1996). ras 또는 src 유전자 등을 과량 발현시킨 NIH 3T3 세포에서 사이클린 D1 양이 높은 것은 CDK4 활성이 암 유전자들의 미토제닉 신호 (mitogenic signal)의 다운스트림 (downstream)에서 그 역할을 수행함을 보여준다고 하겠다 (Pardee et al., Nature, 386: 177-181, 1997). 역으로 밖에서 공급된 p16 이나 p21 이 암세포를 보통의 표현형 (normal phenotype)으로 바뀌게 하는 것이 관찰되었다 (Bonfanti, et al., Cancer Research, 57: 1442-1446, 1997). 위에 열거된 실험적 증거들은 CDK4 활성의 규제철폐 (deregulation)가 암을 유도하는 원인이 된다는 것이 분명함을 증명한 것으로, 따라서 CDK4 저해제는 항암 효과를 보일 가능성이 높다고 여겨진다. 지금까지 CDK 저해제로서 작은 분자량을 가지는 여러 화합물이 보고되었으며 이중 일부는 항암제로서 임상 실험 중에 있다 (Bible, et al., Cancer Research, 56: 4856-4861, 1996).

이에 본 발명자들은 ets1 또는 ets2 에 의존하는 유전자 발현이 많아짐으로써 발생하는 병리현상, 즉 류마티즘, 암세포 전이의 치료제 등으로 이용될 수 있는 ets1 또는 ets2 의 활성 조절제를 검색하던 중, Rb 단백질의 카복시말단이 ets1 또는 ets2 의 아미노말단과 결합하면 ets1 또는 ets2 의 발현유도 활성을 억제하고 반면 Rb 단백질 또는 ets1, ets2 의 결합부위가 인산화되어 이들의 결합이 억제되면 ets1 또는 ets2 에 의존하는 유전자의 발현이 유도되는 것을 발견하고, Rb 단백질 및 전사요소 ets1 또는 ets2 을 이용하여 전사요소 ets1 또는 ets2 의 활성 조절물질을 검색하는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 ets1 또는 ets2 에 의존하는 유전자 발현이 많아짐으로써 발생하는 병리현상, 즉 류마티즘, 암세포 전이 등의 치료제 등으로 이용될 수 있는 ets1 또는 ets2 의 활성 조절제를 검색하는 방법 및 검색 시약을 제공하는 데 그 목적이 있다.

도 1 은 니트로셀룰로오스 필터 결합 분석의 결과를 나타낸 것이고,

A : BSA ; B : GST-p27 ;

C : His-p16 ; D : GST-Rb ;

도 2 는 Rb 단백질이 CDK2/CYC A로 인산화되면 ets2 과 결합하지 못하는 것을 보여주는 GST-비드 풀 다운 분석(GST-bead pull down assay) 결과를 나타내는 것이고,

A : 인산화되지 않은 Rb ; B : CDK2/CYC A 로 인산화시킨 Rb ;

C : CDK4/CYC A 로 인산화시킨 Rb ;

도 3 은 ets2 가 CDK4/CYC A 나 MAP 카이네이즈에 의해서 인산화되면 Rb 단백질과 결합하지 못하는 것을 보여주는 GST-비드 풀 다운 분석(GST-bead pull down assay) 결과를 나타내는 것이고,

A : 인산화되지 않은 ets2 ; B : MAP 카이네이즈로 인산화시킨 ets2 ;

C : CDK4/CYC D1 으로 인산화시킨 ets2 ;

D : CDK2/CYC A 로 인산화시킨 ets2 ;

도 4a 는 Rb 단백질이 ets 2 의존 프로모터인 E.18 으로부터의 루시퍼라제 유전자 발현을 저해하는 것을 나타낸 것이고,

도 4b 는 Rb 단백질이 ets 2 의존 프로모터인 uPA 로부터의 루시퍼라제 유전자 발현을 저해하는 것을 나타낸 것이고,

도 5 는 Rb 단백질과 ets1 또는 ets2 의 결합을 이용한 ets1 또는 ets2 의 활성화제나 활성억제제를 검색하는 방법의 일 예를 도식적으로 나타낸 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Rb 단백질 및 전사요소 ets1 또는 ets2 을 포함하는 전사요소 ets1 또는 ets2 의 활성 조절물질의 검색 시약을 제공한다. 구체적으로 본 발명의 검색 시약은 ets1 또는 ets2 의 아미노말단과 이에 결합하는 Rb 의 카복시말단을 포함한다.

또한, 본 발명은 상기 Rb 단백질 및 전사요소 ets1 또는 ets2 을 이용한 전사요소 ets1 또는 ets2 의 활성 조절물질의 검색 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 ets1 또는 ets2 의 아미노말단과 결합하여 ets1 또는 ets2 의 발현유도 활성을 억제하는 Rb 의 카복시말단 또는 이의 구조적 유사체를 포함하는 전사요소 ets1 또는 ets2 에 의존하는 유전자 발현이 많아짐으로써 발생하는 병리현상, 예를 들어 류마티즘, 암세포 전이 등의 치료제를 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 Rb 단백질 및 전사요소 ets1 또는 ets2 을 포함하는 전사요소 ets1 또는 ets2 의 활성 조절물질의 검색 시약을 제공한다.

구체적으로 본 발명의 검색 시약은 ets1 또는 ets2 와 이에 결합하는 Rb 의 카복시말단을 포함한다.

상기 검색 시약에서는 Rb 단백질 또는 이의 카복시말단 펩타이드가 ets1 또는 ets2 와 특이적으로 결합하는데, Rb 단백질을 인산화시키거나 ets1 또는 ets2 를 인산화시킴으로써 이들의 결합을 방해하는 물질이 첨가되면 ets1 또는 ets2 가 Rb 단백질로부터 자유롭게 되어 자신의 전사유도 활성을 복원하게 되고, ets1 또는 ets2의 인산화부위에 결합하는 물질이 첨가되면 ets1 또는 ets2 의 활성화가 억제된다.

본 발명의 검색 시약 중 Rb 단백질이 ets1 또는 ets2 와 특이적으로 결합하는지 여부를 확인하기 위하여, 시험관 내(in vitro) 니트로셀루로오스 막 결합 분석을 수행한다. 그 결과 ets1 또는 ets2 또는 이들의 1번부터 177번까지의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드와 Rb 단백질은 특이적으로 결합하는 것이 확인되었고, ets2 의 소위 포인티드 도메인을 포함하는 65번부터 177번까지의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드가 Rb 단백질의 801번 이후의 아미노산 서열을 포함하는 카복시말단과 결합함을 확인하였다. 또한 Rb 단백질의 카복시말단에는 4개의 CDK 에 의하여 인산화되는 부위가 존재하는데 이 부위가 CDK2 에 의해 인산화되면 ets 와의 결합을 방해하게 되나 CDK4 에 의해 인산화되는 것은 ets 와의 상기 결합을 방해하지 못한다.

따라서 상기 분석 결과에 따라, 본 발명의 검색 시약 중의 ets1 또는 ets2 으로는 1번에서 177번까지의 아미노말단을 포함하는 것이 바람직하고, 65번에서 177번까지의 펩타이드를 포함하는 것은 더욱 바람직하다. 이 때 ets1 또는 ets2 는 하이포인산화된(hypophosporylated) 상태이다.

또한 Rb 의 카복시말단으로는 801번 이후의 펩타이드 단편을 포함하는 것이 바람직하고, 하이포인산화된 상태이거나 CDK4 에 의해 인산화된 상태이다.

Rb 단백질 또는 이의 카복시말단의 ets1 또는 ets2 와의 결합이 ets1 또는 ets2 의 전사유도 활성에 미치는 효과를 조사하기 위하여, 과도적 동시형질감염 실험을 수행하였다. 그 결과 Rb 단백질 또는 이의 카복시말단만으로도 ets1 또는 ets2 에 의한 전사유도가 저해되는 것을 확인하였다. 그러나 대조실험에서 사용한 p16은 전사유도 저해 효과를 나타내지 못하는 것이 확인되었고 이는 시험관 내에서 확인된 Rb 단백질과 ets1 또는 ets2 의 결합이 세포내(in vivo)에서 실지로 일어나며 그 기능상의 의미가 있음을 보여주는 것이다.

구체적으로 본 발명의 검색 방법은 Rb 단백질 및 전사요소 ets1 또는 ets2 을 포함하는 시약에 시험물질을 첨가하여 반응시키는 단계와 전사요소 ets1 또는 ets2 가 자유로운 상태로 존재하는지 여부를 확인하는 단계를 포함한다. 전사요소 ets1 또는 ets2 가 자유로운 상태로 존재한다는 것은 시험물질이 전사요소 ets1 또는 ets2 의 활성화제인 것을 의미하며, 전사요소 ets1 또는 ets2 가 자유로운 상태가 아닌 경우에는 시험물질이 ets1 또는 ets2 의 활성 억제제임을 의미하는 것이다.

본 발명의 검색 방법의 일 예로 도 5에 나타낸 바와 같이 GST-Rb-포켓을 GST-비드(GST-bead)에 부착하고 ets2 아미노말단과 퍼옥시다제(peroxidase)의 융합단백질을 연이어 부착한 시약에 시험물질을 첨가하여 반응시킨 후 시험물질에 의하여 해리되는 페옥시다제의 역가를 확인한다.

상기에서 확인한 바와 같이, Rb 단백질의 카복시말단이 ets1 또는 ets2 의 아미노말단과 결합하면 ets1 또는 ets2 의 발현유도 활성을 억제하게 되고 따라서 Rb 단백질의 카복시말단 또는 그의 구조적 유사체는 ets1 또는 ets2 에 의존하는 유전자 발현이 많아짐으로써 발생하는 병리현상, 즉 류마티즘(MMP-1, MMP-3, MMP-9), 암세포 전이(uPA, mt-MMP, MMP-1, MMP-3, MMP-9)의 치료제 등으로 이용될 수 있다.

이하 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다.

하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 니트로셀룰로오스 필터 결합 분석.

100ng 의 정제된 GST-p21, GST-Rb(378-928), His-p27, His-p16 단백질을 각각 니트로셀룰로오스 필터에 부착시켰다. ets2 의 1번부터 177번까지의 아미노말단 절편 앞에 3개의 PKA 인산화 부위를 도입한 단백질 절편을 PKA를 이용하여 p32 로 표지한 후 약 20ng 을 50mM 트리스(pH7.6), 0.15M 염화나트륨, 0.1% 트윈20, 0.1mg/ml BSA 를 포함하는 용액 10ml 에 희석한 다음 5% 저지방 용액에서 2시간 반응시킨 상기 필터와 반응시켰다. 1시간 후 상기 필터를 p32-ets2 탐침을 포함하지 않는 상기 반응 용액으로 여러번 세척하고 포스포이미저(phosphoimager)로 현상하였다. 그 결과를 도 1 에 나타내었다. 그 결과 p32-ets2 가 Rb 에만 선택적으로 결합함을 확인할 수 있었다.

<실시예 2> Rb 단백질과 ets2 의 인산화에 따른 결합상태 변화 측정.

Rb 의 카복시말단 펩타이드(801-928)를 GST 에 융합시켜 발현, 정제한 다음 CDK2/CYC A, CDK4/CYC D, MAP 키나제로 인산화시키고 Rb 의 카복시말단 펩타이드 자체와 인산화된 Rb 아미노말단 펩타이드를 GST-비드에 부착하였다. ets2 의 아미노말단 펩타이드도 상기의 키나제들로 인산화시켰다.

50mM 트리스(pH7.5), 0.15M 염화나트륨, 0.1% NP40, 0.1mg/ml BSA 용액에 상기 Rb 복합체와 인산화된 또는 인산화되지 않은 ets2 아미노말단 펩타이드를 첨가하여 1 시간동안 4℃에서 단백질 결합을 유도하였다. GST-비드를 BSA 를 포함하지 않는 상기 반응용액으로 세 번 씻어준 후 램리 용액에서 끓여 SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동하였다. 이를 니트로셀룰로오스 막에 옮기고 ets2 항체로 웨스턴 블라팅(western blotting) 한 다음 케미루미네센스(chemiluminesence)를 이용하여 ets2 항체의 비드에의 부착여부를 확인하였다. 그 결과를 도 2 및 도 3에 나타내었다.

<실시예 3> 과도적 동시 형질감염 분석.

Rb, Rb의 카복시말단 펩타이드, p16, ets2를 발현하는 포유동물 발현벡터를 uPA 또는 E.18-루시퍼라제(Luciferase)를 발현하는 플라스미드와 함께 리포펙타민(Lipofectamine)을 이용하여 NIH 3T3 세포에 과도적으로 형질감염시킨 다음 48시간 이 경과한 후 세포를 파쇄하여 루시퍼라제의 발현정도를 루미노미터(luminometer)를 이용하여 측정하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, Rb 단백질의 카복시말단이 ets1 또는 ets2 의 아미노말단과 결합하면 ets1 또는 ets2 의 발현유도 활성을 억제하고 반면 Rb 단백질 또는 ets1, ets2 의 결합부위가 인산화되어 이들의 결합이 억제되면 ets1 또는 ets2 에 의존하는 유전자의 발현이 유도되는 것을 알 수 있고, 이러한 성질을 이용하여 본 발명은 Rb 단백질 및 전사요소 ets1 또는 ets2 을 이용하여 전사요소 ets1 또는 ets2 의 활성 조절물질을 간편하게 검색하는 방법을 제공하고 있으며, 본 발명에 의하여 검색된 물질은 전사요소 ets1 또는 ets2 에 의존하는 유전자 발현이 많아짐으로써 발생하는 병리현상, 예를 들어 류마티즘, 암세포 전이의 치료제 등으로 유용하게 이용될 수 있다.

Claims

Rb 단백질 및 전사요소 ets1 또는 ets2 을 포함하는 전사요소 ets1 또는 ets2 의 활성 조절물질의 검색 시약.
제 1 항에 있어서, ets1 또는 ets2 는 1번에서 177번까지의 아미노말단 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 검색 시약.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, ets1 또는 ets2 는 65번에서 177번까지의 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 검색 시약.
제 1 항에 있어서, Rb 단백질은 하이포인산화된 상태이거나 CDK4 에 의해 인산화된 상태의 801번 이후의 카복시말단 펩타이드 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 검색 시약.
1) Rb 단백질 및 전사요소 ets1 또는 ets2 을 포함하는 시약에 시험물질을 첨가하여 반응시키는 단계 ;

2) 전사요소 ets1 또는 ets2 가 자유로운 상태로 존재하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 전사요소 ets1 또는 ets2 의 활성 조절물질의 검색 방법.
제 5 항에 있어서,

상기 1) 단계로 GST-Rb-포켓을 GST-비드(GST-bead)에 부착하고 ets2 아미노말단과 퍼옥시다제(peroxidase)의 융합단백질을 연이어 부착한 시약에 시험물질을 첨가하여 반응시키는 단계 ;

상기 2) 단계로 시험물질에 의하여 해리되는 페옥시다제의 역가를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 전사요소 ets1 또는 ets2 의 활성 조절물질의 검색 방법.
ets1 또는 ets2 의 아미노말단과 결합하여 ets1 또는 ets2 의 발현유도 활성을 억제하는 Rb 의 카복시말단 또는 이의 구조적 유사체를 포함하는,

전사요소 ets1 또는 ets2 에 의존하는 유전자 발현이 많아짐으로써 발생하는 병리현상, 예를 들어 류마티즘, 암세포 전이 등의 치료제.