JPH08140687A - Ｒｐｄｌ蛋白質およびそれをコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 新規転写制御蛋白質をコードする遺伝子、該
遺伝子がコードする蛋白質（ＲＰＤＬ蛋白質）、該蛋白
質を発現させるための発現ベクター、そのような発現ベ
クターで形質転換された細胞、または該蛋白質と結合す
る抗体等の提供。 【構成】 ヒト胎児肺のｃＤＮＡライブラリーから各ク
ローンの5'側の塩基配列を決定した。それらのクローン
の中から酵母の転写制御蛋白質に類似の配列を含む新規
な配列のクローンを選択し、構造決定した。該遺伝子が
コードする蛋白質が、新規なヒト転写制御蛋白質をコー
ドする事を確認した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規な転写制御蛋白質で
あるＲＰＤＬ蛋白質、本蛋白質を作成および使用する方
法、ならびに本蛋白質をコードする遺伝子ＤＮＡおよび
該ＤＮＡを用いる遺伝子解析法に関し、医薬の分野で利
用される。

【０００２】

【従来の技術】多くの遺伝子は、ある特定の時期や部位
あるいは何らかの刺激が加えられた時などに選択的に発
現する。遺伝子の発現には、ＤＮＡ配列情報をもとにｍ
−ＲＮＡが作られ（転写）、つぎにこのｍ−ＲＮＡから
蛋白質が作られる（翻訳）という２つの重要なステップ
が含まれる。近年、真核細胞における遺伝子の転写が、
転写制御蛋白質と呼ばれる複数の蛋白質によって巧妙に
制御されていることが明らかになりつつある。この転写
制御の仕組みを詳しく解明することは、遺伝子の選択的
発現制御機構すなわち細胞の分化や増殖、あるいは様々
な活動、ひいては生死などに関わる根本的な仕組みを知
る上で極めて重要な問題である。これによって癌をはじ
めとする多くの疾患や異常、あるいは老化、痴呆、肥満
などの困難な問題を解決する突破口が開かれることが期
待されている。転写制御機構の解明のためには「関与す
る因子（転写制御蛋白質など）の物質的基盤の理解」、
「それら因子間の相互作用の理解」、「複数の相互作用
を通してのプロセス全体の理解」および「共通性、多様
性を通しての統一的理解」が必要である（堀越正美ら、
蛋白質・核酸・酵素、38, 5, 831-841, 1993）。

【０００３】これまでに、いくつかの基本的な因子がＤ
ＮＡ上の特異的な配列を認識して結合するという構造的
な基礎についての研究が、ウィルス、細菌、酵母などを
利用して進められてきた。しかしながら、構成する因子
群が極めて多数であることなどから、因子間の相互作
用、ＲＮＡポリメラーゼなど転写開始複合体の構成成分
との相互作用、あるいはヒトでの制御機構との共通性な
ど、未解明な部分が多く、最近の遺伝子単離、特にヒト
の転写制御機構に関与する因子のｃＤＮＡクローニング
による著しい進展が期待されている。

【０００４】転写制御蛋白質には、ある遺伝子に特異的
なものと、多くの遺伝子にひろく共通して働くものがあ
る。またその機能として、転写を活性化するもの、不活
性化するもの、のほかにその両方の役割を持つものが知
られている（Ｍ．プタシン；サイエンス(Scientific Am
erican) 19, 3, 9-17, 1989 ）。これまでこの分野の真
核細胞における研究は、主に実用上の問題から酵母をモ
デル細胞として行われ、その基本的機構はヒトの細胞に
までおよぶことが示唆されてきている。しかし、多くの
遺伝子に共通して働き、しかも活性化、不活性化の両方
の役割を持つというような転写制御蛋白質は、特に重要
なものであると考えられ、その変異によってひきおこさ
れる影響についての研究は、酵母のみでは限界に達して
いることが明らかである。このため、このような重要な
転写制御蛋白質をコードするヒトの遺伝子を単離し、蛋
白質を同定することは、発生、分化あるいは組織といっ
た側面をもつ多細胞系、特にヒトそのもの、の細胞で直
接的にその転写制御機構を解明する上で著しい進展をも
たらすという意味で極めて重要な意義がある。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、多くのター
ゲット遺伝子に対して共通して働き、しかも活性化、不
活性化の両方の役割を持つというような重要な、ヒト
の、転写制御蛋白質と、それをコードする遺伝子を提供
する。さらにそれらを用いたヒト遺伝子転写制御機構の
解明研究、あるいはその変異によってひきおこされるヒ
ト細胞での影響についての研究のための遺伝子解析方法
をも提供する。

【０００６】

【課題を解決するための手段】酵母ＲＰＤ３は、high-,
low-affinity potassium transporter gene ＴＲＫ２
遺伝子の転写を制御しているばかりでなく、ＰＨＯ５、
ＳＴＥ６、ＴＹ２を含む多くの遺伝子をターゲットとし
た転写制御を行っており、しかも活性化、不活性化の両
方の役割を持つことが知られている（M.Vidal and R.F.
Gaber, Mol. Cel. Biol.11, 6317-6327, 1991 ）。本発
明者らは、ヒト胎児肺より作成されたｃＤＮＡライブラ
リーより各クローンの5'側の塩基配列を決定し、酵母の
ＲＰＤ３遺伝子の配列に相同性を示すクローンを見出し
た。このクローンのＤＮＡ配列をさらに決定し、新規な
蛋白質をコードする全長ｃＤＮＡを得た。このｃＤＮＡ
がコードする蛋白質のアミノ酸配列は酵母のＲＰＤ３と
有意な類似性を示し、本蛋白質がこれまで報告のない新
規なヒト転写制御蛋白質であることを確認した。さらに
本発明者らは、該ｃＤＮＡをプローブとしたノーザンブ
ロット法による遺伝子解析によって、本蛋白質をコード
する遺伝子がヒトにおいて脳を除く調べたすべての組織
で発現している重要な遺伝子であることを確認した。ま
た本発明者らは、該ｃＤＮＡをプローブとしたＦＩＳＨ
（fluorescent in situ hybridization ）法による染色
体マッピングにより、本蛋白質をコードする遺伝子が、
乳癌および胃癌で欠失が認められている第１染色体短腕
１ｐ３４．１に位置付けられることを確認した。

【０００７】本発明は、本ヒト転写制御蛋白質をコード
するｃＤＮＡあるいはそれを人為的に変異させたＤＮＡ
を大腸菌・酵母・昆虫細胞・哺乳類細胞などの宿主に導
入した形質転換体、その形質転換体を用いた本蛋白質あ
るいはその変異体の生産、さらに本蛋白質あるいはその
変異体に結合する抗体を生産することを可能としたのみ
ならず、例えば本蛋白質が結合する他の因子との相互作
用、ターゲットとなって制御されているヒト遺伝子、転
写制御因子としての活性化・不活性化の機能などを解析
すること、さらにはその変異によってひきおこされる影
響についての研究をヒト細胞のレベルで行うことを可能
とした。

【０００８】すなわち本発明は、（１）配列番号１で表
される蛋白質の、全部または一部を含むものからなる蛋
白質あるいはその変異体、（２）配列番号２で表される
遺伝子ＤＮＡの全部または一部を含むものからなるＤＮ
Ａあるいはその変異体、（３）該ＤＮＡを含むプラスミ
ド、およびそれを保持する形質転換体、（４）該蛋白質
の製造方法、（５）該蛋白質に結合する抗体、（６）該
ＤＮＡ配列の一部を含むプローブまたはプライマー、お
よびそれを使用することを特徴とする遺伝子解析方法ま
たは遺伝子増幅方法、からなる。以下に本発明を詳細に
説明する。

【０００９】（１）ｃＤＮＡクローンの単離と塩基配
列、アミノ酸配列の確認 ヒト胎児肺ｍ−ＲＮＡをもとにｃＤＮＡを合成し、一定
方向にクローニングされたｃＤＮＡ挿入体を有するｃＤ
ＮＡライブラリーを作製した。このライブラリーの各ク
ローンを、5'側より塩基配列を決定し、酵母のＲＰＤ３
遺伝子と相同性を有する一つのクローンの断片配列を得
た。さらに当該クローンの塩基配列を決定した結果、目
的とする全長ｃＤＮＡ配列を得た。上記の方法により得
られるｃＤＮＡは、配列番号２の新規なＤＮＡ配列であ
ることが確認され、それがコードする新規な蛋白質のア
ミノ酸配列は配列番号１の如く演繹された。本発明者ら
は、配列番号１で示される配列の蛋白質をＲＰＤＬ蛋白
質と命名し、以下ＲＰＤＬ蛋白質と記載する。

【００１０】本発明のＤＮＡは、その一部をプライマー
またはプローブとして用いることにより、遺伝子解析や
遺伝子の発現の解析に利用することができる。「一部」
とは、プライマーまたはプローブとして使用するオリゴ
ヌクレオチドが本発明のＤＮＡ配列をもとに少なくとも
約６個の対応する塩基配列からなり、好ましくは少なく
とも約８個の塩基配列、さらに好ましくは約１０〜１２
個の、さらに好ましくは約１５〜２５個の塩基配列から
なる対応するポリヌクレオチドを意味する。本発明の蛋
白質は、その全部または一部をエピトープとして用い
て、抗体の作成およびその抗体を用いる研究用、診断用
試薬として利用することができる。「エピトープ」と
は、ポリペプチドの抗原決定基を意味し、一般に少なく
とも５個のアミノ酸で構成され、６個のアミノ酸で構成
されるポリペプチドが抗体と結合することは公知である
（公表特許公報昭60-500684 号）。「一部」とは、本発
明の蛋白質のアミノ酸配列に基づいて、連続してなる少
なくとも約３〜５個のアミノ酸、好ましくは少なくとも
約８〜１０個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも
約１１〜２０個のアミノ酸からなるポリペプチドを意味
する。また約２０個以上のアミノ酸からなるポリペプチ
ドであっても使用できることは言うまでもない。本発明
のＲＰＤＬ蛋白質において、それら配列が１つまたは複
数個のアミノ酸を変換されたり、欠失、挿入させたもの
であってもＲＰＤＬ蛋白質に関わる研究、診断等に同等
の効果を発揮するものについて、これら均等物も本発明
に含まれる。また本発明のＤＮＡの場合も、上記蛋白質
の場合と同様に、１つまたは複数個の塩基配列の置換、
欠失、挿入を伴うものについて、これら均等物も本発明
に含まれる。

【００１１】（２）組換え発現ベクターと形質転換体お
よび蛋白質の作成 本発明のＤＮＡあるいはその一部を適切なベクターに組
み込み、該ベクターを適切な宿主細胞に移入することに
より形質転換体を得ることができる。これを常法により
培養し培養物よりヒトＲＰＤＬ蛋白質またはその一部を
大量に生産することができる。さらに具体的には、該Ｄ
ＮＡまたはその断片を、その発現に適したベクターのプ
ロモーター下流に制限酵素とＤＮＡリガーゼを用いる公
知の方法により再結合して組換え発現ベクターを作成す
ることができる。使用できるベクターとしては、例えば
大腸菌由来のプラスミドｐＲＢ３２２，ｐＵＣ１８，枯
草菌由来のプラスミドｐＵＢ１１０，酵母菌由来のプラ
スミドｐＲＢ１５，バクテリオファージλｇｔ１０，λ
ｇｔ１１あるいはＳＶ４０などが挙げられるが宿主内で
複製、増幅可能なベクターであれば特に限定されない。
プロモーターおよびターミネーターに関しても該ＤＮＡ
塩基配列の発現に用いられる宿主に対応したものであれ
ば特に限定されず、宿主に応じて適切な組み合わせも可
能である。用いるＤＮＡは配列番号２記載の塩基配列に
限定されるものではなく、意図的であるか否かにかかわ
らず塩基配列の一部が置換、欠損、挿入、あるいはこれ
らが組み合わされた塩基配列を有するＤＮＡであっても
よい。また化学合成によって合成されたものでも良い。

【００１２】このようにして得られた組換え発現ベクタ
ーはコンピテント細胞法（J. Mol.Biol., 53, 154, 197
0）、プロトプラスト法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
75, 1929, 1978）、リン酸カルシウム法（Science, 22
1, 551, 1983)、インビトロパッケージング法（Proc. N
atl, Acad. Sci. USA, 72, 581, 1975)、ウイルスベク
ター法（Cell, 37, 1053, 1984）などにより宿主に導入
し、形質転換体が作製される。宿主としては大腸菌、枯
草菌、酵母、昆虫細胞および動物細胞などが用いられ、
得られた形質転換体はその宿主に応じた適切な培地中で
培養される。培養は通常20℃〜45℃、pH５〜８の範囲で
行われ、必要に応じて通気、撹拌が行われる。培養物か
らのＲＰＤＬ蛋白質の分離・精製は公知の分離・精製法
を適宜組み合わせて実施すれば良い。これらの公知の方
法としては塩析、溶媒沈殿法、透析ゲルろ過法、電気泳
動法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティク
ロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィーな
どが挙げられる。

【００１３】（３）抗体の作成 抗体は、ＲＰＤＬ蛋白質の全部あるいは一部分を抗原と
して、通常の方法で作成することができる。例えば、ポ
リクローナル抗体はマウス、モルモット、ウサギ等の動
物の皮下、筋肉内、腹腔内、静脈に複数回接種し十分に
免疫した後、斯かる動物から採血、血清分離して作製す
る。なお、市販のアジュバントも使用できる。モノクロ
ーナル抗体は、例えば、ＲＰＤＬ蛋白質で免疫したマウ
スの脾細胞と市販のマウスミエローマ細胞との細胞融合
により得られるハイブリドーマを作成後、該ハイブリド
ーマ培養上清、または該ハイブリドーマ投与マウス腹水
から調製することができる。抗原とするＲＰＤＬ蛋白質
は必ずしも全アミノ酸構造を有する必要はなく、部分構
造を有するペプチド、その変異体、誘導体、あるいは他
のペプチドとの融合ペプチドであってもよく、調製法は
生物学的手法、化学合成手法いずれでもよい。これら抗
体はヒト生体試料中のＲＰＤＬ蛋白質の同定や定量を可
能とし試薬などに使用できる。ＲＰＤＬ蛋白質の免疫学
的測定法は、公知の方法に準ずればよく、たとえば蛍光
抗体法、受身凝集反応法、酵素抗体法などいずれの方法
においても実施できる。

【００１４】（４）遺伝子の変異および異常の解析 本発明により提供されるＤＮＡの制限酵素断片をプロー
ブとして、または該遺伝子ＤＮＡの中から適切な位置の
塩基配列を適宜選択し、その合成オリゴヌクレオチドを
プライマーとして用いることにより該遺伝子の変異の有
無を解析することができる。また、試料中の該遺伝子に
おける挿入、欠失などの異常もこれらの解析により検知
することができる。

【００１５】なお、このＲＰＤＬ蛋白質をコードする遺
伝子ＤＮＡを含むプラスミドを保有するEscherichia co
li L1-3977は通商産業省工業技術院生命工学工業技術研
究所に寄託番号 FERM BP-4805 として平成６年９月21日
に寄託された。

【００１６】

【発明の効果】本発明の、ヒトＲＰＤＬ蛋白質および該
蛋白質をコードする遺伝子ＤＮＡの、全部またはその一
部を含むものを用いて、本蛋白質の転写制御因子として
の機能や遺伝子そのものの解析、本蛋白質の変異による
影響の解析を、ヒト細胞レベルで行うことが可能となっ
た。本蛋白質は、そのアミノ酸配列の酵母ＲＰＤ３との
相同性から、多くのターゲット遺伝子に共通して働き、
しかも活性化、不活性化の両方の役割を持つという重要
な転写制御蛋白質であることが明らかであり、上記研究
が、ヒトの細胞の分化、増殖、活動、生死など、その基
本的な営みの解明に役立つことが期待される。また本遺
伝子の配列構造および染色体上の位置が明らかにされた
ことにより、癌をはじめとする多くの疾患や異常との関
連が解明され医薬の分野での応用が期待できる。

【００１７】

【実施例】以下の実施例により本発明を詳細に且つ具体
的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定される
ものではない。

【００１８】（実施例１）ヒト胎児肺ｃＤＮＡライブラ
リーの作製 ヒト胎児肺ｍＲＮＡ (Clontech社より購入) をもとにｃ
ＤＮＡを合成し、Uni-ZAPxR ベクターキット (Stratage
ne社より購入) を用いて一定方向にクローニングされた
ｃＤＮＡ挿入体を有するｃＤＮＡライブラリーを作製し
た。

【００１９】（実施例２）クローンの選択 実施例１によって作製されたｃＤＮＡライブラリーの２
０５８個のクローンにつき、5'側より塩基配列を決定し
た。これらの塩基配列をデータ・ベース中の既知の塩基
配列と比較することにより、酵母ＲＰＤ３と相同性を有
する一つのクローンＬ１−３９７７を見出した。Ｌ１−
３９７７の部分配列（２５６ｂｐ）は、酵母（S. cerev
isiae ）のＲＰＤ３遺伝子（Accession No.S66438 、１
６４５ｂｐ）と１７６ｂｐの範囲で６０．２％の相同性
を示した。

【００２０】（実施例３）全長ｃＤＮＡの配列決定と構
造の特徴 実施例２で得られたクローンＬ１−３９７７のＤＮＡ配
列を Dideoxy法（F. Sanger et al., Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 74, 5463-5467,1977 ）によって決定し
た。その結果、Ｌ１−３９７７は、配列番号２に示した
新規な配列の全長ｃＤＮＡを含んでいた。この塩基配列
の６４番から１５０９番までのオープンリーディングフ
レームから４８２アミノ酸よりなる新規な蛋白質（配列
番号１、ＲＰＤＬ蛋白質）のアミノ酸配列が演繹され
た。このアミノ酸配列は、酵母（S. cerevisiae ）のＲ
ＰＤ３蛋白質（AccessionNo.S22284 & P32561、４３３
アミノ酸）と４２２アミノ酸の範囲で６０．０％の相同
性を示した。配列番号２の塩基配列（２１１１ｂｐ）
は、酵母（S. cerevisiae ）のＲＰＤ３遺伝子（Access
ion No.S66438 、１６４５ｂｐ）と１１６８ｂｐの範囲
で６２．１％の相同性を示した。さらにアフリカ・ツメ
ガエルのＲＰＤ３ホモローグ遺伝子（Accession No.X78
454 、１０４０ｂｐ）とは、１０３４ｂｐの範囲で８
０．９％と更に高い相同性を示した。このアフリカ・ツ
メガエルのＲＰＤ３ホモローグ遺伝子（Accession No.X
78454 、１０４０ｂｐ）がコードする蛋白質（３４３ア
ミノ酸）と本ＲＰＤＬ蛋白質との間にも、３４３アミノ
酸の範囲で、９４．８％という高い相同性が認められ
た。以上の相同性から本ＲＰＤＬ蛋白質が、酵母のＲＰ
Ｄ３蛋白質と同様の機能を持つ重要なヒト転写制御蛋白
質であることは明白であるが、さらに配列番号２の塩基
配列（２１１１ｂｐ）が、原癌遺伝子ｃ−ｔｋｌ（Chic
ken tyrosine kinase proto-oncogene）の３’非翻訳領
域の塩基配列に対して、１５３４ｂｐの広範囲にわたっ
て７８．９％という高い相同性を示したことから、近年
の遺伝子３’非翻訳領域の転写・翻訳制御への関わりに
ついての知見からも、本ＲＰＤＬ蛋白質の転写制御機構
における重要性が支持されている。

【００２１】（実施例４）各種ヒト組織での発現解析 実施例３で得られたｃＤＮＡをプローブとして、各種ヒ
ト組織ｍ−ＲＮＡに対するノーザンブロットシステム(C
lontech 社より購入) による発現解析を行った。ハイブ
リダイズと洗浄の条件はメーカーの推奨する条件に従
い、オートラジオグラフィーは−８０℃、１６時間で行
った。対照にはアクチンを用いた。その結果、脳を除
き、検討したすべての組織( 心臓、腎臓、肝臓、肺、膵
臓、胎盤、骨格筋、大腸、末梢血白血球、卵巣、前立
腺、小腸、脾臓、睾丸、胸腺) で約２．４Ｋｂｐのサイ
ズのｍ−ＲＮＡバンドとして発現が認められた。脳では
殆ど発現していないのに対して、心臓、膵臓、睾丸では
やや強く、腎臓ではやや弱かった。

【００２２】（実施例５）遺伝子の染色体マッピング 本ＲＰＤＬ蛋白質をコードする遺伝子の染色体上での存
在位置を調べるために、実施例３で得られたｃＤＮＡを
プローブとして、そのプローブがハイブリダイズする染
色体上の位置をＦＩＳＨ法(Inazawa et al., Genomics,
10, 1075-1078, 1991) によって決定した。その結果、
その位置は第１染色体短腕１ｐ３４．１と同定された。
この場所は乳癌（A.Borg et al., Genes Chromosome Ca
ncer 5,311-320, 1992 ）および胃癌（T.Sano et al.,
Cancer Res 51, 2926-2931,1991）で欠失が認められて
いる場所である。

【００２３】（実施例６）組換えＲＰＤＬ蛋白質発現ベ
クターの構築 実施例３で得られたｃＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲ法によ
って翻訳領域を含む部分配列を増幅した。片方のプライ
マーの5'端にBamHI 切断部位、もう一方のプライマーの
5'端にEcoRI 切断部位を付加しておき、得られた増幅産
物をBamHI およびEcoRI で切断した。予めBamHI とEcoR
I で切断した発現ベクターpGEX-2T (Pharmacia社より購
入) に、この断片を挿入し、発現プラスミドpGST-RPDL
を構築した。pGST-RPDL プラスミドを用いて、E.coli D
H5αを形質転換させアンピシリン耐性で選択することに
より、グルタチオン-S- トランスフェラーゼとＲＰＤＬ
蛋白質の融合蛋白を発現する形質転換体を得た。

【００２４】（実施例７）組換えＲＰＤＬ蛋白質の発現
と精製 実施例６で得られた形質転換体を培養し、培養物より、
組換えＲＰＤＬ融合蛋白質を抽出・精製した。すなわ
ち、形質転換体を100ml のLB培地(1% peptone, 0.5% ye
ast extract, 1%NaCl)で37℃一夜振とう培養した。培養
液を予め37℃に加温したLB培地で10倍に希釈した上、さ
らに30〜90分培養して対数増殖期の培養物を得た。培養
物1LにIsopropyl-β-D-thiogalactopyranosideを終濃度
1mM となるように添加して３〜４日間培養した。培養物
から遠心分離により菌体を集めた。発現ベクターpGST-R
PDL よる形質転換体は、菌体に10mlのカラム・バッファ
ー(150mM NaCl, 16mM Na₂HPO₄, 4mM NaH₂PO₄, pH7.3)を
加え超音波によって破砕した。菌体破砕上清可溶画分を
グルタチオン・セファロース4Bカラム(Pharmacia社より
購入) にかけ、カラムバッファーで洗浄後5mM の還元型
グルタチオンを含む溶出液で溶出した。溶出画分はSDS
ポリアクリルアミド電気泳動法で解析して分画した。こ
の結果、プラスミドpGST-RPDL による形質転換体から、
期待される約８０KDa のGST 融合蛋白質が主要バンドと
して検出される画分が得られた。

【００２５】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：４８２ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：ホモサピエンス 直接の起源 ライブラリー名：ヒト胎児肺ｃＤＮＡライブラリー 配列 Met Ala Gln Thr Gln Gly Thr Arg Arg Lys Val Cys Tyr Tyr Tyr Asp 1 5 10 15 Gly Asp Val Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Gln Gly His Pro Met Lys Pro 20 25 30 His Arg Ile Arg Met Thr His Asn Leu Leu Leu Asn Tyr Gly Leu Tyr 35 40 45 Arg Lys Met Glu Ile Tyr Arg Pro His Lys Ala Asn Ala Glu Glu Met 50 55 60 Thr Lys Tyr His Ser Asp Asp Tyr Ile Lys Phe Leu Arg Ser Ile Arg 65 70 75 80 Pro Asp Asn Met Ser Glu Tyr Ser Lys Gln Met Gln Arg Phe Asn Val 85 90 95 Gly Glu Asp Cys Pro Val Phe Asp Gly Leu Phe Glu Phe Cys Gln Leu 100 105 110 Ser Thr Gly Gly Ser Val Ala Ser Ala Val Lys Leu Asn Lys Gln Gln 115 120 125 Thr Asp Ile Ala Val Asn Trp Ala Gly Gly Leu His His Ala Lys Lys 130 135 140 Ser Glu Ala Ser Gly Phe Cys Tyr Val Asn Asp Ile Val Leu Ala Ile 145 150 155 160 Leu Glu Leu Leu Lys Tyr His Gln Arg Val Leu Tyr Ile Asp Ile Asp 165 170 175 Ile His His Gly Asp Gly Val Glu Glu Ala Phe Tyr Thr Thr Asp Arg 180 185 190 Val Met Thr Val Ser Phe His Lys Tyr Gly Glu Tyr Phe Pro Gly Thr 195 200 205 Gly Asp Leu Arg Asp Ile Gly Ala Gly Lys Gly Lys Tyr Tyr Ala Val 210 215 220 Asn Tyr Pro Leu Arg Asp Gly Ile Asp Asp Glu Ser Tyr Glu Ala Ile 225 230 235 240 Phe Lys Pro Val Met Ser Lys Val Met Glu Met Phe Gln Pro Ser Ala 245 250 255 Val Val Leu Gln Cys Gly Ser Asp Ser Leu Ser Gly Asp Arg Leu Gly 260 265 270 Cys Phe Asn Leu Thr Ile Lys Gly His Ala Lys Cys Val Glu Phe Val 275 280 285 Lys Ser Phe Asn Leu Pro Met Leu Met Leu Gly Gly Gly Gly Tyr Thr 290 295 300 Ile Arg Asn Val Ala Arg Cys Arg Thr Tyr Glu Thr Ala Val Ala Leu 305 310 315 320 Asp Thr Glu Ile Pro Asn Glu Leu Pro Tyr Asn Asp Tyr Phe Glu Tyr 325 330 335 Phe Gly Pro Asp Phe Lys Leu His Ile Ser Pro Ser Asn Met Thr Asn 340 345 350 Gln Asn Thr Asn Glu Tyr Leu Glu Lys Ile Lys Gln Arg Leu Phe Glu 355 360 365 Asn Leu Arg Met Leu Pro His Ala Pro Gly Val Gln Met Gln Ala Ile 370 375 380 Pro Glu Asp Ala Ile Pro Glu Glu Ser Gly Asp Glu Asp Glu Asp Asp 385 390 395 400 Pro Asp Lys Arg Ile Ser Ile Cys Ser Ser Asp Lys Arg Ile Ala Cys 405 410 415 Glu Glu Glu Phe Ser Asp Ser Glu Glu Glu Gly Glu Gly Gly Arg Lys 420 425 430 Asn Ser Ser Asn Phe Lys Lys Ala Lys Arg Val Lys Thr Glu Asp Glu 435 440 445 Lys Glu Lys Asp Pro Glu Glu Lys Lys Glu Val Thr Glu Glu Glu Lys 450 455 460 Thr Lys Glu Glu Lys Pro Glu Ala Lys Gly Val Lys Glu Glu Val Lys 465 470 475 480 Leu Ala 482 。

【００２６】配列番号：２ 配列の長さ：２１１１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：ホモサピエンス 直接の起源 ライブラリー名：ヒト胎児肺ｃＤＮＡライブラリー 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：６４．．１５１２ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GAGCGGAGCC GCGGGCGGGA GGGCGGACGG ACCGACTGAC GGTAGGGACG GGAGGCGAGC 60 AAG ATG GCG CAG ACG CAG GGC ACC CGG AGG AAA GTC TGT TAC TAC TAC 108 Met Ala Gln Thr Gln Gly Thr Arg Arg Lys Val Cys Tyr Tyr Tyr 1 5 10 15 GAC GGG GAT GTT GGA AAT TAC TAT TAT GGA CAA GGC CAC CCA ATG AAG 156 Asp Gly Asp Val Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Gln Gly His Pro Met Lys 20 25 30 CCT CAC CGA ATC CGC ATG ACT CAT AAT TTG CTG CTC AAC TAT GGT CTC 204 Pro His Arg Ile Arg Met Thr His Asn Leu Leu Leu Asn Tyr Gly Leu 35 40 45 TAC CGA AAA ATG GAA ATC TAT CGC CCT CAC AAA GCC AAT GCT GAG GAG 252 Tyr Arg Lys Met Glu Ile Tyr Arg Pro His Lys Ala Asn Ala Glu Glu 50 55 60 ATG ACC AAG TAC CAC AGC GAT GAC TAC ATT AAA TTC TTG CGC TCC ATC 300 Met Thr Lys Tyr His Ser Asp Asp Tyr Ile Lys Phe Leu Arg Ser Ile 65 70 75 CGT CCA GAT AAC ATG TCG GAG TAC AGC AAG CAG ATG CAG AGA TTC AAC 348 Arg Pro Asp Asn Met Ser Glu Tyr Ser Lys Gln Met Gln Arg Phe Asn 80 85 90 95 GTT GGT GAG GAC TGT CCA GTA TTC GAT GGC CTG TTT GAG TTC TGT CAG 396 Val Gly Glu Asp Cys Pro Val Phe Asp Gly Leu Phe Glu Phe Cys Gln 100 105 110 TTG TCT ACT GGT GGT TCT GTG GCA AGT GCT GTG AAA CTT AAT AAG CAG 444 Leu Ser Thr Gly Gly Ser Val Ala Ser Ala Val Lys Leu Asn Lys Gln 115 120 125 CAG ACG GAC ATC GCT GTG AAT TGG GCT GGG GGC CTG CAC CAT GCA AAG 492 Gln Thr Asp Ile Ala Val Asn Trp Ala Gly Gly Leu His His Ala Lys 130 135 140 AAG TCC GAG GCA TCT GGC TTC TGT TAC GTC AAT GAT ATC GTC TTG GCC 540 Lys Ser Glu Ala Ser Gly Phe Cys Tyr Val Asn Asp Ile Val Leu Ala 145 150 155 ATC CTG GAA CTG CTA AAG TAT CAC CAG AGG GTG CTG TAC ATT GAC ATT 588 Ile Leu Glu Leu Leu Lys Tyr His Gln Arg Val Leu Tyr Ile Asp Ile 160 165 170 175 GAT ATT CAC CAT GGT GAC GGC GTG GAA GAG GCC TTC TAC ACC ACG GAC 636 Asp Ile His His Gly Asp Gly Val Glu Glu Ala Phe Tyr Thr Thr Asp 180 185 190 CGG GTC ATG ACT GTG TCC TTT CAT AAG TAT GGA GAG TAC TTC CCA GGA 684 Arg Val Met Thr Val Ser Phe His Lys Tyr Gly Glu Tyr Phe Pro Gly 195 200 205 ACT GGG GAC CTA CGG GAT ATC GGG GCT GGC AAA GGC AAG TAT TAT GCT 732 Thr Gly Asp Leu Arg Asp Ile Gly Ala Gly Lys Gly Lys Tyr Tyr Ala 210 215 220 GTT AAC TAC CCG CTC CGA GAC GGG ATT GAT GAC GAG TCC TAT GAG GCC 780 Val Asn Tyr Pro Leu Arg Asp Gly Ile Asp Asp Glu Ser Tyr Glu Ala 225 230 235 ATT TTC AAG CCG GTC ATG TCC AAA GTA ATG GAG ATG TTC CAG CCT AGT 828 Ile Phe Lys Pro Val Met Ser Lys Val Met Glu Met Phe Gln Pro Ser 240 245 250 255 GCG GTG GTC TTA CAG TGT GGC TCA GAC TCC CTA TCT GGG GAT CGG TTA 876 Ala Val Val Leu Gln Cys Gly Ser Asp Ser Leu Ser Gly Asp Arg Leu 260 265 270 GGT TGC TTC AAT CTA ACT ATC AAA GGA CAC GCC AAG TGT GTG GAA TTT 924 Gly Cys Phe Asn Leu Thr Ile Lys Gly His Ala Lys Cys Val Glu Phe 275 280 285 GTC AAG AGC TTT AAC CTG CCT ATG CTG ATG CTG GGA GGC GGT GGT TAC 972 Val Lys Ser Phe Asn Leu Pro Met Leu Met Leu Gly Gly Gly Gly Tyr 290 295 300 ACC ATT CGT AAC GTT GCC CGG TGC AGG ACA TAT GAG ACA GCT GTG GCC 1020 Thr Ile Arg Asn Val Ala Arg Cys Arg Thr Tyr Glu Thr Ala Val Ala 305 310 315 CTG GAT ACG GAG ATC CCT AAT GAG CTT CCA TAC AAT GAC TAC TTT GAA 1068 Leu Asp Thr Glu Ile Pro Asn Glu Leu Pro Tyr Asn Asp Tyr Phe Glu 320 325 330 335 TAC TTT GGA CCA GAT TTC AAG CTC CAC ATC AGT CCT TCC AAT ATG ACT 1116 Tyr Phe Gly Pro Asp Phe Lys Leu His Ile Ser Pro Ser Asn Met Thr 340 345 350 AAC CAG AAC ACG AAT GAG TAC CTG GAG AAG ATC AAA CAG CGA CTG TTT 1164 Asn Gln Asn Thr Asn Glu Tyr Leu Glu Lys Ile Lys Gln Arg Leu Phe 355 360 365 GAG AAC CTT AGA ATG CTG CCG CAC GCA CCT GGG GTC CAA ATG CAG GCG 1212 Glu Asn Leu Arg Met Leu Pro His Ala Pro Gly Val Gln Met Gln Ala 370 375 380 ATT CCT GAG GAC GCC ATC CCT GAG GAG AGT GGC GAT GAG GAC GAA GAC 1260 Ile Pro Glu Asp Ala Ile Pro Glu Glu Ser Gly Asp Glu Asp Glu Asp 385 390 395 GAC CCT GAC AAG CGC ATC TCG ATC TGC TCC TCT GAC AAA CGA ATT GCC 1308 Asp Pro Asp Lys Arg Ile Ser Ile Cys Ser Ser Asp Lys Arg Ile Ala 400 405 410 415 TGT GAG GAA GAG TTC TCC GAT TCT GAA GAG GAG GGA GAG GGG GGC CGC 1356 Cys Glu Glu Glu Phe Ser Asp Ser Glu Glu Glu Gly Glu Gly Gly Arg 420 425 430 AAG AAC TCT TCC AAC TTC AAA AAA GCC AAG AGA GTC AAA ACA GAG GAT 1404 Lys Asn Ser Ser Asn Phe Lys Lys Ala Lys Arg Val Lys Thr Glu Asp 435 440 445 GAA AAA GAG AAA GAC CCA GAG GAG AAG AAA GAA GTC ACC GAA GAG GAG 1452 Glu Lys Glu Lys Asp Pro Glu Glu Lys Lys Glu Val Thr Glu Glu Glu 450 455 460 AAA ACC AAG GAG GAG AAG CCA GAA GCC AAA GGG GTC AAG GAG GAG GTC 1500 Lys Thr Lys Glu Glu Lys Pro Glu Ala Lys Gly Val Lys Glu Glu Val 465 470 475 AAG TTG GCC TGAATGGACC TCTCCAGCTC TGGCTTCCTG CTGAGTCCCT 1549 Lys Leu Ala 480 482 CACGTTTCTT CCCCAACCCC TCAGATTTTA TATTTTCTAT TTCTCTGTGT ATTTATATAA 1609 AAATTTATTA AATATAAATA TCCCCAGGGA CAGAAACCAA GGCCCCGAGC TCAGGGCAGC 1669 TGTGCTGGGT GAGCTCTTCC AGGAGCCACC TTGCCACCCA TTCTTCCCGT TCTTAACTTT 1729 GAACCATAAA GGGTGCCAGG TCTGGGTGAA AGGGATACTT TTATGCAACC ATAAGACAAA 1789 CTCCTGAAAT GCCAAGTGCC TGCTTAGTAG CTTTGGAAAG GTGCCCTTAT TGAACATTCT 1849 AGAAGGGGTG GCTGGGTCTT CAAGGATCTC CTGTTTTTTT CAGGCTCCTA AAGTAACATC 1909 AGCCATTTTT AGATTGGTTC TGTTTTCGTA CCTTCCCACT GGCCTCAAGT GAGCCAAGAA 1969 ACACTGCCTG CCCTCTGTCT GTCTTCTCCT AATTCTGCAG GTGGAGGTTG CTAGTCTAGT 2029 TTCCTTTTTG AGATACTATT TTCATTTTTG TGAGCCTCTT TGTAATAAAA TGGTACATTT 2089 CTAAAAAAAA AAAAAAAAAA AA 2111

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/08 9358−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 9453−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１に記載のアミノ酸配列の全部
   または一部を含むＲＰＤＬ蛋白質。
2. 【請求項２】 配列番号１に記載のアミノ酸配列のう
   ち、１もしくは複数のアミノ酸が、付加、欠失もしくは
   置換されたアミノ酸配列の全部または一部を含むＲＰＤ
   Ｌ蛋白質。
3. 【請求項３】 配列番号１に記載のアミノ酸配列の全部
   または一部を含むＲＰＤＬ蛋白質をコードするＤＮＡ。
4. 【請求項４】 配列番号２に記載の塩基配列を有する、
   請求項３記載のＲＰＤＬ蛋白質をコードするＤＮＡ。
5. 【請求項５】 配列番号１に記載のアミノ酸配列のう
   ち、１もしくは複数のアミノ酸が、付加、欠失もしくは
   置換されたアミノ酸配列の全部または一部を含むＲＰＤ
   Ｌ蛋白質をコードするＤＮＡ。
6. 【請求項６】 請求項３、４または５記載のＤＮＡを含
   むベクター。
7. 【請求項７】 請求項６記載のベクターを保持する形質
   転換体。
8. 【請求項８】 請求項７記載の形質転換体を培養し、発
   現産物を回収することを含む請求項１または２に記載の
   蛋白質の製造方法。
9. 【請求項９】 請求項１または２に記載の蛋白質と結合
   するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体。
10. 【請求項１０】 配列番号２に記載の塩基配列の全部ま
    たは一部を含むものからなるＤＮＡプローブ。
11. 【請求項１１】 配列番号２に記載の塩基配列の一部を
    含むものからなるＤＮＡプライマー。
12. 【請求項１２】 塩基配列の一部が、連続してなる少な
    くとも１０個の塩基からなる、請求項１０または１１記
    載のプローブまたはプライマー。
13. 【請求項１３】 請求項１０または１１記載のプローブ
    またはプライマーを被検ＤＮＡとハイブリダイズさせる
    ことを特徴とするＲＰＤＬ蛋白質の遺伝子解析方法。