JP3335194B2 - 植物の病害抵抗性特異的リポキシゲナ−ゼ遺伝子 - Google Patents
植物の病害抵抗性特異的リポキシゲナ−ゼ遺伝子Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、植物の病害抵抗性に関
与するリポキシゲナーゼ遺伝子及びその利用に関するも
のである。
与するリポキシゲナーゼ遺伝子及びその利用に関するも
のである。
【０００２】本発明の病害抵抗性特異的リポキシゲナー
ゼ遺伝子の塩基配列は、病害抵抗性を示す植物で有効に
発現し、病害菌の生育を抑制する物質の生産に関与する
ため、本発明は、植物における病害抵抗性機構を分子レ
ベルで解明するのに利用することができる。
ゼ遺伝子の塩基配列は、病害抵抗性を示す植物で有効に
発現し、病害菌の生育を抑制する物質の生産に関与する
ため、本発明は、植物における病害抵抗性機構を分子レ
ベルで解明するのに利用することができる。
【０００３】また、本発明によれば、トランジットペプ
チドをコードする遺伝子を含む配列が明らかになったの
で、これらを利用して葉緑体内での各種タンパク質の発
現が可能となり、新しい植物の育種にも本発明は利用で
きる。
チドをコードする遺伝子を含む配列が明らかになったの
で、これらを利用して葉緑体内での各種タンパク質の発
現が可能となり、新しい植物の育種にも本発明は利用で
きる。
【０００４】
【従来の技術】リポキシゲナーゼは、動植物に広く見い
だされる酵素であり、高級不飽和脂肪酸に分子状酸素を
導入する反応を触媒する。植物ではダイズ（Ｓｈｉｂａ
ｔａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６３，６８
１６−６８２１（１９８８），Ｓｈｉｂａｔａら、Ｊ．
Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６２，１００８０−１０
０８５．（１９８７））、エンドウ（Ｅａｌｉｎｇ ＆
Ｃａｓｅｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．， ２６４，９
２９−９３２（１９８９））、イネ（特許出願平２−２
１１４６９）でｃＤＮＡの単離が報告されている。しか
し、これらの遺伝子の生理的役割は不明であった。最近
になり、イネのリポキシゲナーゼが病害抵抗性に関わる
との報告（Ｏｈｔａら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ．， ９７，９４−９８，（１９９１））がなされ
た。しかしながら、植物の病害抵抗性に関わるリポキシ
ゲナーゼ遺伝子の単離に成功したとの報告はなされてい
ない。
だされる酵素であり、高級不飽和脂肪酸に分子状酸素を
導入する反応を触媒する。植物ではダイズ（Ｓｈｉｂａ
ｔａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６３，６８
１６−６８２１（１９８８），Ｓｈｉｂａｔａら、Ｊ．
Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６２，１００８０−１０
０８５．（１９８７））、エンドウ（Ｅａｌｉｎｇ ＆
Ｃａｓｅｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．， ２６４，９
２９−９３２（１９８９））、イネ（特許出願平２−２
１１４６９）でｃＤＮＡの単離が報告されている。しか
し、これらの遺伝子の生理的役割は不明であった。最近
になり、イネのリポキシゲナーゼが病害抵抗性に関わる
との報告（Ｏｈｔａら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ．， ９７，９４−９８，（１９９１））がなされ
た。しかしながら、植物の病害抵抗性に関わるリポキシ
ゲナーゼ遺伝子の単離に成功したとの報告はなされてい
ない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】農作物の収穫量に影響
を与える要因の中で病害による割合は極めて高く、病害
による損失は毎年生じている。しかし、植物の病害に対
する生体メカニズムがまだ充分に解明されていないため
に、それらの対策は不十分で未だに病害を克服するに至
っていない。
を与える要因の中で病害による割合は極めて高く、病害
による損失は毎年生じている。しかし、植物の病害に対
する生体メカニズムがまだ充分に解明されていないため
に、それらの対策は不十分で未だに病害を克服するに至
っていない。
【０００６】本発明は、分子レベルで病害抵抗性機構を
解明して、その知見に基づいて、病害抵抗性機構を付与
した作物を育種することを目的として研究を行い、植物
の病害抵抗性に関与する遺伝子をクローニングし、構造
を解明するためになされたものである。
解明して、その知見に基づいて、病害抵抗性機構を付与
した作物を育種することを目的として研究を行い、植物
の病害抵抗性に関与する遺伝子をクローニングし、構造
を解明するためになされたものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するために行なわれたものであって、本発明者らは植
物における病害抵抗性機構を解明するための手段とし
て、病害菌に対して抵抗性を示す植物から菌感染時に特
異的に発現するリポキシゲナーゼ遺伝子のクローニング
を計画し、非親和性病害菌を感染させた植物葉からｃＤ
ＮＡのクローニングに成功し、遂に本発明の完成に至っ
たものである。以下、本発明について詳細に説明する。
成するために行なわれたものであって、本発明者らは植
物における病害抵抗性機構を解明するための手段とし
て、病害菌に対して抵抗性を示す植物から菌感染時に特
異的に発現するリポキシゲナーゼ遺伝子のクローニング
を計画し、非親和性病害菌を感染させた植物葉からｃＤ
ＮＡのクローニングに成功し、遂に本発明の完成に至っ
たものである。以下、本発明について詳細に説明する。
【０００８】本発明を実施するには、先ず、非親和性い
もち病菌感染イネ葉からポリ（Ａ）ＲＮＡを調製して、
それを鋳型としてｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを
ラムダファージベクターλｇｔ１１に組み込み、ｃＤＮ
Ａライブラリーを得た。このライブラリーをさらに大腸
菌Ｙ１０８８株を用いて増幅させてから、スクリーニン
グを行なった。スクリーニングはすでに明らかとされて
いる植物リポキシゲナーゼ遺伝子全てに共通するアミノ
酸配列に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、プロー
ブとして用いた。このスクリーニングの結果、約１．３
ｋｂｐのリポキシゲナーゼ遺伝子のｃＤＮＡ断片を得
た。さらにこのｃＤＮＡをプローブとしてスクリーニン
グを繰り返し、リポキシゲナーゼの全領域をコードする
ｃＤＮＡの単離に成功した。これらのｃＤＮＡクローン
をプラスミドベクターにサブクローニングし、塩基配列
を決定した（配列表、配列番号１）。
もち病菌感染イネ葉からポリ（Ａ）ＲＮＡを調製して、
それを鋳型としてｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを
ラムダファージベクターλｇｔ１１に組み込み、ｃＤＮ
Ａライブラリーを得た。このライブラリーをさらに大腸
菌Ｙ１０８８株を用いて増幅させてから、スクリーニン
グを行なった。スクリーニングはすでに明らかとされて
いる植物リポキシゲナーゼ遺伝子全てに共通するアミノ
酸配列に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、プロー
ブとして用いた。このスクリーニングの結果、約１．３
ｋｂｐのリポキシゲナーゼ遺伝子のｃＤＮＡ断片を得
た。さらにこのｃＤＮＡをプローブとしてスクリーニン
グを繰り返し、リポキシゲナーゼの全領域をコードする
ｃＤＮＡの単離に成功した。これらのｃＤＮＡクローン
をプラスミドベクターにサブクローニングし、塩基配列
を決定した（配列表、配列番号１）。
【０００９】このリポキシゲナーゼ遺伝子の配列は，既
にダイズ、エンドウ、イネから単離されているリポキシ
ゲナーゼ遺伝子と相同性が認められるが、同一ではなか
った。また、Ｎ末端には葉緑体へ移行するためのアミノ
酸配列（トランジットペプチド）が付いており、このリ
ポキシゲナーゼは葉緑体で発現することが明らかとな
り、この配列をコードするＤＮＡ配列を利用すれば葉緑
体へ有用な蛋白質を運搬させることに利用することがで
きる。
にダイズ、エンドウ、イネから単離されているリポキシ
ゲナーゼ遺伝子と相同性が認められるが、同一ではなか
った。また、Ｎ末端には葉緑体へ移行するためのアミノ
酸配列（トランジットペプチド）が付いており、このリ
ポキシゲナーゼは葉緑体で発現することが明らかとな
り、この配列をコードするＤＮＡ配列を利用すれば葉緑
体へ有用な蛋白質を運搬させることに利用することがで
きる。
【００１０】以下に本発明を実施例に基づいて詳細に説
明する。操作の手順は特に記述しない限りＣｕｒｒｅｎ
ｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ． Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌら編集、
Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．， １９
８７）に記載されている方法に従った。
明する。操作の手順は特に記述しない限りＣｕｒｒｅｎ
ｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ． Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌら編集、
Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．， １９
８７）に記載されている方法に従った。
【００１１】
【実施例１】
【００１２】（１）非親和性いもち病菌感染イネ葉から
ポリ（Ａ）ＲＮＡの調製 第５葉期のイネに非親和性いもち病菌（レース１３１）
を接種後、３０時間おいて、その第５葉を液体窒素に投
入し凍結させた。この葉（５ｇ）を液体窒素の存在下で
乳鉢を用いて粉末状になるまで破砕した。これに２５ｍ
ｌの抽出緩衝液（２０ｍＭのバナジルコンプレックス、
２％ＳＤＳ、１００ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．０）を加
えて、すぐさま５００ｇで遠心してその上清を回収し
た。この上清に等量のフェノール・トリス（ｐＨ８．
０）を加えて攪拌し、蛋白質を変性させた（フェノール
抽出）。水層を回収し、フェノール抽出をさらに５回繰
り返した。水層にエタノールを加えてＲＮＡを沈澱さ
せ、沈澱を５ｍｌの１％ＳＤＳ、５０ｍＭトリス塩酸ｐ
Ｈ８．０に溶解して、さらにフェノール抽出を５回繰り
返した。水層からＲＮＡをエタノールで沈澱させ、１ｍ
ｌの蒸留水に溶解した。このＲＮＡからオリゴｄＴカラ
ムクロマトグラフィー法を用いてポリ（Ａ）ＲＮＡを調
製した。
ポリ（Ａ）ＲＮＡの調製 第５葉期のイネに非親和性いもち病菌（レース１３１）
を接種後、３０時間おいて、その第５葉を液体窒素に投
入し凍結させた。この葉（５ｇ）を液体窒素の存在下で
乳鉢を用いて粉末状になるまで破砕した。これに２５ｍ
ｌの抽出緩衝液（２０ｍＭのバナジルコンプレックス、
２％ＳＤＳ、１００ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．０）を加
えて、すぐさま５００ｇで遠心してその上清を回収し
た。この上清に等量のフェノール・トリス（ｐＨ８．
０）を加えて攪拌し、蛋白質を変性させた（フェノール
抽出）。水層を回収し、フェノール抽出をさらに５回繰
り返した。水層にエタノールを加えてＲＮＡを沈澱さ
せ、沈澱を５ｍｌの１％ＳＤＳ、５０ｍＭトリス塩酸ｐ
Ｈ８．０に溶解して、さらにフェノール抽出を５回繰り
返した。水層からＲＮＡをエタノールで沈澱させ、１ｍ
ｌの蒸留水に溶解した。このＲＮＡからオリゴｄＴカラ
ムクロマトグラフィー法を用いてポリ（Ａ）ＲＮＡを調
製した。
【００１３】（２）ｃＤＮＡライブラリーの作製 上記の方法で得たポリ（Ａ）ＲＮＡを５μｇ用い、ｃＤ
ＮＡ合成キット（ファルマシア社製）を用い、このキッ
トの説明書に従ってｃＤＮＡを合成した。合成されたｃ
ＤＮＡはその両末端にＥｃｏＲＩアダプターとライゲー
ションキット（宝酒造社製）を用いて、その説明書に従
って、連結反応を行なわせた。このようにして得られた
λＤＮＡをパッケージングキット（ストラタジーン社
製）を用いて、そのキットの説明書に従ってファジー粒
子を再構成させ、ｃＤＮＡライブラリーとした。このラ
イブラリーには約１００万の組換体が含まれていた。こ
のライブラリーをスクリーニングする前に、このライブ
ラリーに含まれる全てのファジーを大腸菌Ｙ１０８８株
に感染させ、これを４２℃寒天培地上で培養して、６時
間後に出現したファジープラークからファージをＳＭ溶
液を用いて回収した。この回収液にクロロフォルムを少
量加えて４℃で保存した。以下のスクリーニングではこ
のファージ液をｃＤＮＡライブラリーとして用いた。
ＮＡ合成キット（ファルマシア社製）を用い、このキッ
トの説明書に従ってｃＤＮＡを合成した。合成されたｃ
ＤＮＡはその両末端にＥｃｏＲＩアダプターとライゲー
ションキット（宝酒造社製）を用いて、その説明書に従
って、連結反応を行なわせた。このようにして得られた
λＤＮＡをパッケージングキット（ストラタジーン社
製）を用いて、そのキットの説明書に従ってファジー粒
子を再構成させ、ｃＤＮＡライブラリーとした。このラ
イブラリーには約１００万の組換体が含まれていた。こ
のライブラリーをスクリーニングする前に、このライブ
ラリーに含まれる全てのファジーを大腸菌Ｙ１０８８株
に感染させ、これを４２℃寒天培地上で培養して、６時
間後に出現したファジープラークからファージをＳＭ溶
液を用いて回収した。この回収液にクロロフォルムを少
量加えて４℃で保存した。以下のスクリーニングではこ
のファージ液をｃＤＮＡライブラリーとして用いた。
【００１４】（３）プローブの合成 既に明らかにされている植物リポキシゲナーゼ遺伝子の
全てに共通するアミノ酸配列（ＨＡＡＶＮＦＧＱＹ）に
対応するオリゴヌクレオチド配列（５′ＧＴＹＣＧＮＣ
ＧＮＣＡＮＴＴＹＡＡＹＣＣＮＧＴＲＡＴ３′：ここ
で、Ｙ，Ｒ，Ｎの部分はヌクレオチドの混合物を示し、
Ｙ＝Ａ，Ｇ； Ｒ＝Ｔ，Ｃ； Ｎ＝Ｇ，Ａ，Ｔ，Ｃであ
る）から、オリゴヌクレオチドを合成して、リポキシゲ
ナーゼ遺伝子のスクリーニングに用いるプローブとし
た。このプローブは、宝酒造のキット（ＭＥＧＡＬＡＢ
ＥＬ−ＴＭ）と〔γ−32Ｐ〕ＡＴＰを用いてＲＩ標識し
た。
全てに共通するアミノ酸配列（ＨＡＡＶＮＦＧＱＹ）に
対応するオリゴヌクレオチド配列（５′ＧＴＹＣＧＮＣ
ＧＮＣＡＮＴＴＹＡＡＹＣＣＮＧＴＲＡＴ３′：ここ
で、Ｙ，Ｒ，Ｎの部分はヌクレオチドの混合物を示し、
Ｙ＝Ａ，Ｇ； Ｒ＝Ｔ，Ｃ； Ｎ＝Ｇ，Ａ，Ｔ，Ｃであ
る）から、オリゴヌクレオチドを合成して、リポキシゲ
ナーゼ遺伝子のスクリーニングに用いるプローブとし
た。このプローブは、宝酒造のキット（ＭＥＧＡＬＡＢ
ＥＬ−ＴＭ）と〔γ−32Ｐ〕ＡＴＰを用いてＲＩ標識し
た。
【００１５】 （４）ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングは、ＲＩ標識し
た上記のプローブを用いて文献（渡辺 格 監修「クロ
ーニングとシークエンス、植物バイオテクノロジー実験
マニュアル」第１章ｐｐ．１０６−１７５、農村文化
社）で示される方法に従って行なった。ＤＮＡを転写し
たニトロセルロースフィルター上でのハイブリダイゼー
ションは６ｘＳＳＣ、１ｘＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ．
０．１％ＳＤＳ溶液を用いて３７℃で一晩行なった。ニ
トロセルロースフィルターの洗浄は６ｘＳＳＣ，０．１
％ＳＤＳ溶液を用いて３７℃で行なった。このフィルタ
ーをＸ線フィルムに露光させ目的とするクローンを同定
した。３０万の組換体ファージからプローブと相同性を
示す１つのクローン（ＲＬＬ１と命名した）を単離し
た。この様にして得られたｃＤＮＡクローンＲＬＬ１は
全長をコードしていなかったので、このｃＤＮＡ断片を
ＲＩ標識してプローブとしてｃＤＮＡライブラリーのス
クリーニングを行なった。このスクリーニングは上記の
オリゴヌクレオチドをプローブとした場合とほぼ同様で
あるが、ニトロセルロースフィルターの洗浄は０．１ｘ
ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ溶液を用いて６５℃で行なっ
た。得られた新たなクローンを解析してさらに３種のｃ
ＤＮＡクローン（ＲＬＬ２−ＲＬＬ４）を得た。これら
の制限酵素地図から相互の関係を明らかにし（図１）、
これらが全長ｃＤＮＡをコードすることを明らかにし
た。
た上記のプローブを用いて文献（渡辺 格 監修「クロ
ーニングとシークエンス、植物バイオテクノロジー実験
マニュアル」第１章ｐｐ．１０６−１７５、農村文化
社）で示される方法に従って行なった。ＤＮＡを転写し
たニトロセルロースフィルター上でのハイブリダイゼー
ションは６ｘＳＳＣ、１ｘＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ．
０．１％ＳＤＳ溶液を用いて３７℃で一晩行なった。ニ
トロセルロースフィルターの洗浄は６ｘＳＳＣ，０．１
％ＳＤＳ溶液を用いて３７℃で行なった。このフィルタ
ーをＸ線フィルムに露光させ目的とするクローンを同定
した。３０万の組換体ファージからプローブと相同性を
示す１つのクローン（ＲＬＬ１と命名した）を単離し
た。この様にして得られたｃＤＮＡクローンＲＬＬ１は
全長をコードしていなかったので、このｃＤＮＡ断片を
ＲＩ標識してプローブとしてｃＤＮＡライブラリーのス
クリーニングを行なった。このスクリーニングは上記の
オリゴヌクレオチドをプローブとした場合とほぼ同様で
あるが、ニトロセルロースフィルターの洗浄は０．１ｘ
ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ溶液を用いて６５℃で行なっ
た。得られた新たなクローンを解析してさらに３種のｃ
ＤＮＡクローン（ＲＬＬ２−ＲＬＬ４）を得た。これら
の制限酵素地図から相互の関係を明らかにし（図１）、
これらが全長ｃＤＮＡをコードすることを明らかにし
た。
【００１６】（５）塩基配列の決定 得られた４種のｃＤＮＡクローンを含むλファージから
λＤＮＡをそれぞれ調製した。このＤＮＡを制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩで切断してｃＤＮＡ断片部分を回収して、これ
らをプラスミドベクタ−ｐＵＣ１１８にサブクローニン
グした。これらはプロメガ社のキット（Ｅｒａｓｅ−ａ
−Ｂａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いてデリーションクロ
ーンを作製し、これらから一本鎖ＤＮＡを調製して、宝
酒造のキット（７−ＤＥＡＺＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
Ｋｉｔ）を用いて塩基配列を決定した。これにより得
られた塩基配列を、下記の表１から表８で示される配列
表の配列番号１に示す。
λＤＮＡをそれぞれ調製した。このＤＮＡを制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩで切断してｃＤＮＡ断片部分を回収して、これ
らをプラスミドベクタ−ｐＵＣ１１８にサブクローニン
グした。これらはプロメガ社のキット（Ｅｒａｓｅ−ａ
−Ｂａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いてデリーションクロ
ーンを作製し、これらから一本鎖ＤＮＡを調製して、宝
酒造のキット（７−ＤＥＡＺＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
Ｋｉｔ）を用いて塩基配列を決定した。これにより得
られた塩基配列を、下記の表１から表８で示される配列
表の配列番号１に示す。
【００１７】
【表１】
【００１８】
【表２】
【００１９】
【表３】
【００２０】
【表４】
【００２１】
【表５】
【００２２】
【表６】
【００２３】
【表７】
【００２４】
【表８】
【００２５】（６）塩基配列の解析 得られた塩基配列を塩基配列解析用コンピュータプログ
ラム、ＧＥＮＥＴＹＸ（ＳＤＣソフトウエア開発社製）
で解析したところ、既に単離されている大豆やイネのリ
ポキシゲナーゼのアミノ酸配列と相同性が認められた
が、その程度は約４０％であり、進化的にはこれらと古
い時代に分化してきたことが判明した。蛋白質のＮ末端
部分の配列は他のリポキシゲナーゼとは相同性が認めら
れない。この部分のアミノ酸組成は特定のアミノ酸（セ
リン、スレオニン、ヴァリン、アラニン、リジン、アル
ギニン）に偏っており、葉緑体へ蛋白質が移行するため
のトランジットペプチドであることが判明した。このト
ランジットペプチドをコードする遺伝子は、配列表の配
列番号１に示す塩基配列において、１１９番から６０９
番までの塩基配列で示される。
ラム、ＧＥＮＥＴＹＸ（ＳＤＣソフトウエア開発社製）
で解析したところ、既に単離されている大豆やイネのリ
ポキシゲナーゼのアミノ酸配列と相同性が認められた
が、その程度は約４０％であり、進化的にはこれらと古
い時代に分化してきたことが判明した。蛋白質のＮ末端
部分の配列は他のリポキシゲナーゼとは相同性が認めら
れない。この部分のアミノ酸組成は特定のアミノ酸（セ
リン、スレオニン、ヴァリン、アラニン、リジン、アル
ギニン）に偏っており、葉緑体へ蛋白質が移行するため
のトランジットペプチドであることが判明した。このト
ランジットペプチドをコードする遺伝子は、配列表の配
列番号１に示す塩基配列において、１１９番から６０９
番までの塩基配列で示される。
【００２６】 （７）リポキシゲナーゼ遺伝子の発現の解析 単離したリポキシゲナーゼ遺伝子の発現を調べるため
に、非親和性いもち病菌を接種したイネ葉からポリ
（Ａ）ＲＮＡを調製した。このＲＮＡをアガロースゲル
電気泳動法によって分離した後にニトロセルロースフィ
ルターに転写した。このフィルターと32Ｐで標識したｃ
ＤＮＡ断片を用いてノーザン分析を行なったところ、い
もち病菌が感染していないイネ葉では発現が認められな
いが、感染１５時間後から発現量が増加し、少なくとも
３０時間まで発現が認められた。しかし、親和性いもち
病菌を感染させたイネ葉ではほとんど発現していなかっ
た。この結果は、この遺伝子の発現がイネ葉いもち病菌
に対して抵抗性を示すときに特異的に発現していること
を示している。
に、非親和性いもち病菌を接種したイネ葉からポリ
（Ａ）ＲＮＡを調製した。このＲＮＡをアガロースゲル
電気泳動法によって分離した後にニトロセルロースフィ
ルターに転写した。このフィルターと32Ｐで標識したｃ
ＤＮＡ断片を用いてノーザン分析を行なったところ、い
もち病菌が感染していないイネ葉では発現が認められな
いが、感染１５時間後から発現量が増加し、少なくとも
３０時間まで発現が認められた。しかし、親和性いもち
病菌を感染させたイネ葉ではほとんど発現していなかっ
た。この結果は、この遺伝子の発現がイネ葉いもち病菌
に対して抵抗性を示すときに特異的に発現していること
を示している。
【００２７】（８）大腸菌でのｃＤＮＡの発現 ＲＬＬ２クローンの塩基配列決定を行なう際に作製した
デリーションクローンのなかで４８８番目から下流のＤ
ＮＡ配列を有するクローンを用いて、制限酵素Ｈｉｎｄ
ＩＩＩとＥｃｏＲＩを用いてｃＤＮＡ部分を切り出し
た。このＤＮＡを宝酒造のキット（ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔ
ｉｎｇ Ｋｉｔ）を用いて平滑末端とした後に、発現ベ
クターｐＫＫ２３３−２（ファルマシア社製）のＨｉｎ
ｄＩＩＩ部位に接触させた。この際、発現ベクターとｃ
ＤＮＡ部分はＮｃｏＩリンカーを用いて接続させた。こ
のようにして製作したプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１
０５株を形質転換させ、低温培養法（Ｓｈｉｒａｎｏ
＆ Ｓｈｉｂａｔａ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２７
１， １２８−１３０（１９９０））に従って０．４ｍ
Ｍ ＩＰＴＧの存在下で１５℃で大腸菌を１６時間培養
した。この大腸菌を回収して菌体を破砕した。この上清
のリポキシゲナーゼ活性をリノレン酸を基質として酸素
吸収を測定したところ、コントロールの大腸菌では酸素
吸収がほとんど起こらないのに対し、形質転換させた大
腸菌では有意の酸素吸収が生じた。この結果はこのｃＤ
ＮＡの遺伝子産物がリポキシゲナーゼ活性を有すること
を示している。次に、この形質転換大腸菌を３７℃で培
養したところ、菌体破砕上清にはリポキシゲナーゼ活性
が認められなかったが、ＳＤＳ電気泳動法で調べると沈
澱画分に多量のリポキシゲナーゼ蛋白質が検出された。
そこで菌体破砕物の沈澱を回収して洗浄溶液１（５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ／Ｃｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ｐＨ
８．０）で３回洗浄を繰り返した後に、洗浄溶液２
（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｃｌ、５Ｍ尿素、ｐＨ８．０）
で２回洗浄してリポキシゲナーゼ蛋白質を精製した。
デリーションクローンのなかで４８８番目から下流のＤ
ＮＡ配列を有するクローンを用いて、制限酵素Ｈｉｎｄ
ＩＩＩとＥｃｏＲＩを用いてｃＤＮＡ部分を切り出し
た。このＤＮＡを宝酒造のキット（ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔ
ｉｎｇ Ｋｉｔ）を用いて平滑末端とした後に、発現ベ
クターｐＫＫ２３３−２（ファルマシア社製）のＨｉｎ
ｄＩＩＩ部位に接触させた。この際、発現ベクターとｃ
ＤＮＡ部分はＮｃｏＩリンカーを用いて接続させた。こ
のようにして製作したプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１
０５株を形質転換させ、低温培養法（Ｓｈｉｒａｎｏ
＆ Ｓｈｉｂａｔａ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２７
１， １２８−１３０（１９９０））に従って０．４ｍ
Ｍ ＩＰＴＧの存在下で１５℃で大腸菌を１６時間培養
した。この大腸菌を回収して菌体を破砕した。この上清
のリポキシゲナーゼ活性をリノレン酸を基質として酸素
吸収を測定したところ、コントロールの大腸菌では酸素
吸収がほとんど起こらないのに対し、形質転換させた大
腸菌では有意の酸素吸収が生じた。この結果はこのｃＤ
ＮＡの遺伝子産物がリポキシゲナーゼ活性を有すること
を示している。次に、この形質転換大腸菌を３７℃で培
養したところ、菌体破砕上清にはリポキシゲナーゼ活性
が認められなかったが、ＳＤＳ電気泳動法で調べると沈
澱画分に多量のリポキシゲナーゼ蛋白質が検出された。
そこで菌体破砕物の沈澱を回収して洗浄溶液１（５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ／Ｃｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ｐＨ
８．０）で３回洗浄を繰り返した後に、洗浄溶液２
（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｃｌ、５Ｍ尿素、ｐＨ８．０）
で２回洗浄してリポキシゲナーゼ蛋白質を精製した。
【００２８】（９）特異的抗体の作製 上記のようにして大腸菌で発現させ精製したリポキシゲ
ナーゼ蛋白質（４ｍｇ）を１％ＳＤＳに溶解してからウ
サギに注射して、さらに１ヵ月後に同量の抗原を注射し
た。８週間後に血液を採取して、その血清を抗体溶液と
した。
ナーゼ蛋白質（４ｍｇ）を１％ＳＤＳに溶解してからウ
サギに注射して、さらに１ヵ月後に同量の抗原を注射し
た。８週間後に血液を採取して、その血清を抗体溶液と
した。
【００２９】 （１０）特異的抗体を用いた遺伝子発現の解析 非親和性いもち病菌レース１３１を感染させたイネ葉を
経時的に採種し、その０．４ｇを２ｍｌの１％ＳＤＳ溶
液を用いて破砕した。この上清の１５μ１をＳＤＳ電気
泳動に供した。電気泳動したゲルから蛋白質をニトロセ
ルロース膜にメトラー社の転写装置を用いて転写した。
特異的リポキシゲナーゼ抗体との反応はストラタジーン
社のキット（ピコブルー）を用いて行なった。その結
果、この特異的抗体はいもち病菌を感染させなかったイ
ネ葉では反応する蛋白質は検出されず、感染葉において
は感染後１５時間から反応する蛋白質が検出された。こ
のようにして作製した特異的抗体は、イネが病害に抵抗
性を示す場合にのみ発現していることが確認された。
経時的に採種し、その０．４ｇを２ｍｌの１％ＳＤＳ溶
液を用いて破砕した。この上清の１５μ１をＳＤＳ電気
泳動に供した。電気泳動したゲルから蛋白質をニトロセ
ルロース膜にメトラー社の転写装置を用いて転写した。
特異的リポキシゲナーゼ抗体との反応はストラタジーン
社のキット（ピコブルー）を用いて行なった。その結
果、この特異的抗体はいもち病菌を感染させなかったイ
ネ葉では反応する蛋白質は検出されず、感染葉において
は感染後１５時間から反応する蛋白質が検出された。こ
のようにして作製した特異的抗体は、イネが病害に抵抗
性を示す場合にのみ発現していることが確認された。
【００３０】
【発明の効果】本発明によって初めて、植物が病害抵抗
性を示す場合に特異的に発現するリポキシゲナーゼ遺伝
子のクローニング及び構造の解析に成功しただけでな
く、この遺伝子産物に対する特異的な動物抗体を作成
し、これを用いて植物が通常の状態で有しているリポキ
シゲナーゼと区別することに成功した。従って、本発明
が各種の著効を奏することができ、以下にその一例を示
す。
性を示す場合に特異的に発現するリポキシゲナーゼ遺伝
子のクローニング及び構造の解析に成功しただけでな
く、この遺伝子産物に対する特異的な動物抗体を作成
し、これを用いて植物が通常の状態で有しているリポキ
シゲナーゼと区別することに成功した。従って、本発明
が各種の著効を奏することができ、以下にその一例を示
す。
【００３１】いもち病に対して抵抗性を示すイネではリ
ポキシゲナーゼ活性が増加するという観点から、病害抵
抗性を示す場合に特異的に発現するリポキシゲナーゼ遺
伝子の単離に成功し、その塩基配列を決定した。本発明
により植物が病害抵抗性を示すときに発現する遺伝子が
単離されたことにより、この遺伝子を利用することによ
って病害抵抗性のメカニズムを分子レベルで解明するこ
とが可能となり、病害抵抗性作物の育種が期待できる。
ポキシゲナーゼ活性が増加するという観点から、病害抵
抗性を示す場合に特異的に発現するリポキシゲナーゼ遺
伝子の単離に成功し、その塩基配列を決定した。本発明
により植物が病害抵抗性を示すときに発現する遺伝子が
単離されたことにより、この遺伝子を利用することによ
って病害抵抗性のメカニズムを分子レベルで解明するこ
とが可能となり、病害抵抗性作物の育種が期待できる。
【００３２】本発明の病害抵抗性特異的リポキシゲナー
ゼのｃＤＮＡにコードされているトランジットペプチド
は、植物において後続する蛋白を効率的に葉緑体に移行
させる能力を有する。したがって、トランジットペプチ
ドをコードする塩基配列の後に病害抵抗特異的リポキシ
ゲナーゼをコードする塩基配列に代えて、任意の蛋白を
コードする塩基配列を結合した場合、その蛋白を効率的
に葉緑体に移行させることができる。
ゼのｃＤＮＡにコードされているトランジットペプチド
は、植物において後続する蛋白を効率的に葉緑体に移行
させる能力を有する。したがって、トランジットペプチ
ドをコードする塩基配列の後に病害抵抗特異的リポキシ
ゲナーゼをコードする塩基配列に代えて、任意の蛋白を
コードする塩基配列を結合した場合、その蛋白を効率的
に葉緑体に移行させることができる。
【００３３】本発明のｃＤＮＡの塩基配列を用いて、部
位特異的置換あるいはＰＣＲ法などの手法を用いてこの
塩基配列の一部を特異的に変異しせめ、病害抵抗性特異
的リポキシゲナーゼの機能向上を求める研究に用いるこ
とができる。そのようにして改変したリポキシゲナーゼ
を含む植物では病害に対してより強くなることが期待で
きる。また同時に酵素蛋白の機能発現に関する研究にも
用いることができる。
位特異的置換あるいはＰＣＲ法などの手法を用いてこの
塩基配列の一部を特異的に変異しせめ、病害抵抗性特異
的リポキシゲナーゼの機能向上を求める研究に用いるこ
とができる。そのようにして改変したリポキシゲナーゼ
を含む植物では病害に対してより強くなることが期待で
きる。また同時に酵素蛋白の機能発現に関する研究にも
用いることができる。
【図１】本発明に係るリポキシゲナーゼクロ−ンの制限
酵素地図を示す。
酵素地図を示す。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 平４−144687（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−94687（ＪＰ，Ａ) Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，Ｖｏ ｌ．211，ｐ．215−222（1988) Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，Ｖｏｌ．253, ｐ．915−918（1988) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 ＷＰＩ／Ｌ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ
Claims (4)
- 【請求項１】 配列表の配列番号１に示す塩基配列にお
いて示される病害抵抗性特異的リポキシゲナーゼ遺伝子
のｃＤＮＡ。 - 【請求項２】 配列表の配列番号１に示す塩基配列にお
いて示される病害抵抗性特異的リポキシゲナーゼ遺伝子
を用いて遺伝子産物を葉緑体に効率的に移行せしめる方
法。 - 【請求項３】 病害がいもち病であることを特徴とする
請求項１に記載の遺伝子のｃＤＮＡ。 - 【請求項４】 病害がいもち病であることを特徴とする
請求項２に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18055292A JP3335194B2 (ja) | 1992-06-16 | 1992-06-16 | 植物の病害抵抗性特異的リポキシゲナ−ゼ遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18055292A JP3335194B2 (ja) | 1992-06-16 | 1992-06-16 | 植物の病害抵抗性特異的リポキシゲナ−ゼ遺伝子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06225774A JPH06225774A (ja) | 1994-08-16 |
| JP3335194B2 true JP3335194B2 (ja) | 2002-10-15 |
Family
ID=16085275
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18055292A Expired - Fee Related JP3335194B2 (ja) | 1992-06-16 | 1992-06-16 | 植物の病害抵抗性特異的リポキシゲナ−ゼ遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3335194B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AR028977A1 (es) * | 2000-07-13 | 2003-05-28 | Syngenta Participations Ag | Genes de lipoxigenasa, promotores, peptidos de transito y proteinas de los mismos |
-
1992
- 1992-06-16 JP JP18055292A patent/JP3335194B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，Ｖｏｌ．２５３，ｐ．９１５−９１８（１９８８） |
| Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，Ｖｏｌ．２１１，ｐ．２１５−２２２（１９８８） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06225774A (ja) | 1994-08-16 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |