CN109608527B - 用于检测人参不定根干细胞的特异性基因PgWOX11及其检测方法与应用 - Google Patents

用于检测人参不定根干细胞的特异性基因PgWOX11及其检测方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于检测人参不定根干细胞的特异性基因PgWOX11及其检测方法与应用。本发明公开的用于检测人参不定根干细胞的特异性基因PgWOX11可用于标记人参不定根干细胞。本发明还公开了一种检测人参不定根干细胞部位或位置的方法。本发明填补了非模式植物干细胞检测领域的空白，为非模式植物干细胞定位提供了一套可行的检测方案，具有非常好的研究潜能和应用前景。

Description

用于检测人参不定根干细胞的特异性基因PgWOX11及其检测 方法与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及用于检测人参不定根干细胞的特异性基因PgWOX11及其检测方法与应用。
背景技术
人参(Panax ginseng C.A.Mey.)为五加科多年生宿根草本植物，在我国已有5000多年的用药历史，具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生精养血、安神益智的功效，被列为《神农本草经》的“上品”，享有“百草之王”的美誉。自然条件下，野山参具有极强的修复能力，其芦头上的不定根(艼)具有极强的再生能力，可以抵御病原菌及食草动物的侵蚀。人参的“艼变”现象表明人参干细胞具有极强的恢复能力及再生潜力。人参不定根是组培体系下诱导的生物反应器材料，其生长发育直接决定了不定根生物量，而人参不定根干细胞的多少直接决定其生长的速度，然而如何检测人参不定根的干细胞尚未见报道。
通过原位杂交方法来观察植物干细胞标记基因的表达情况是一种常用的检测植物干细胞的方法。运用免疫组化法也可以对干细胞标记基因表达的蛋白进行定位，也是常用的检测植物干细胞的方法之一。EdU染色技术可以检测细胞增殖情况，同样也是检测植物干细胞的常用方法。但至今尚未见到采用干细胞标记基因的原位杂交、免疫组化及EdU染色方法检测人参干细胞的报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种蛋白质。
本发明提供的蛋白质是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：
a)氨基酸序列是序列2或序列4所示的蛋白质；
b)在序列2或序列4所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
c)将序列2或序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；
d)与序列2或序列4所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。
为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2或序列4所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1、标签的序列
上述c)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将序列1或序列3所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
上述d)中，“同源性”包括与本发明的序列2或序列4所示的氨基酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同源性的氨基酸序列。
本发明的另一个目的是提供与上述蛋白质相关的生物材料。
本发明提供的与上述蛋白质相关的生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：
A1)编码上述蛋白质的核酸分子；
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。
上述生物材料中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：
1)其编码序列是序列1或序列3所示的cDNA分子或基因组DNA分子；
2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码上述蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码上述蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码上述蛋白质且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2或序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述生物材料中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述生物材料中，A2)所述的含有编码上述蛋白质的核酸分子的表达盒是指能够在宿主细胞中表达上述蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动目的基因转录的启动子，还可包括终止目的基因转录的终止子。进一步的，所述表达盒还可包括增强子序列。
可用于构建A3)所述的重组载体的表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。
上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。
本发明又有一个目的是提供上述蛋白质或上述生物材料的新用途。
本发明提供了上述蛋白质或上述生物材料在检测人参不定根干细胞部位或位置中的应用。
本发明还提供了上述蛋白质或上述生物材料在定位人参不定根干细胞中的应用。
本发明还提供了上述蛋白质或其编码基因在作为人参不定根干细胞标志物中的应用。
上述应用中，所述不定根干细胞为不定根根尖干细胞或不定根分支干细胞。
本发明还有一个目的是提供一种检测人参不定根干细胞部位或位置的方法。
本发明提供的检测人参不定根干细胞部位或位置的方法是通过检测待测人参样品中的上述蛋白质或其编码基因的表达部位或位置来实现的。所述蛋白质或其编码基因的表达部位或位置即为人参不定根干细胞部位或位置。
上述方法中，所述不定根干细胞为不定根根尖干细胞或不定根分支干细胞。
上述方法中，可通过整体原位杂交方法检测待测人参样品中的上述蛋白质的编码基因的表达部位或位置，也可通过免疫组化方法检测待测人参样品中的上述蛋白质的表达部位或位置。
进一步的，所述整体原位杂交方法中所用的RNA探针由序列7所示的单链RNA分子和序列8所示的单链RNA分子组成。
所述免疫组化方法中所用的抗体为抗上述蛋白质的抗体，具体可为抗上述蛋白质的多克隆抗体，
本发明的最后一个目的是提供上述RNA探针或抗上述蛋白质的抗体。
上述RNA探针和/或抗上述蛋白质的抗体在检测人参不定根干细胞部位或位置中的应用也属于本发明的保护范围。
上述RNA探针和/或抗上述蛋白质的抗体在定位人参不定根干细胞中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明提供了用于检测人参干细胞的特异性基因PgWOX11。本发明提供的用于检测人参干细胞的特异性基因PgWOX11可用于标记人参不定根根尖干细胞。本发明还提供了一种检测人参不定根根尖干细胞部位或位置的方法。本发明填补了非模式植物干细胞检测领域的空白，为非模式植物干细胞定位提供了一套可行的检测方案，具有非常好的研究潜能和应用前景。
附图说明
图1为PgWOX11基因序列。其中，WOX11-A和WOX11-B分别为人参PgWOX11最主要的两种基因型。
图2为人参PgWOX11蛋白的原核表达。其中，M为Protein Marker；C1为E.coli[pET32a]BL21(DE3)；C2为E.coli[pET32a]Transetta(DE3)；1为未诱导的E.coli BL21(DE3)[pET32a(+)-WOX11-2]全菌液；2为诱导后的E.coli BL21(DE3)[pET32a(+)-WOX11-2]全菌液；3为诱导后的E.coli BL21(DE3)[pET32a(+)-WOX11-2]上清液；4为诱导后的E.coliBL21(DE3)[pET32a(+)-WOX11-2]沉淀；5为未诱导的E.coli Transetta(DE3)[pET32a(+)-WOX11-2]全菌液；6为诱导后的E.coli Transetta(DE3)[pET32a(+)-WOX11-2]全菌液；7为诱导后的E.coli Transetta(DE3)[pET32a(+)-WOX11-2]上清液；8为诱导后的E.coliTransetta(DE3)[pET32a(+)-WOX11-2]沉淀。
图3为人参PgWOX11蛋白的多抗。其中，1为Marker；2为PgWOX11多抗。
图4为采用整体原位杂交方法检测人参不定根的根尖干细胞。
图5为采用EdU染色法检测人参不定根根尖干细胞的增殖。
图6为采用免疫组化的方法检测人参不定根的分支干细胞。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的4％PFA溶液的配制方法如下：将1×PBS(pH 7.4)65℃放置2-3小时，恢复室温后，加入10％DMSO，0.1％Tween 20，3％NP-40，现配现用。
下述实施例中的预杂交液1的配方如下：50％甲酰胺，5×SSC，3％SDS，0.1％DTT，0.1％Tween20。
下述实施例中的预杂交液2的配方如下：50％甲酰胺，5×SSC，0.1％Tween20，0.1mg/mL肝素。
实施例1、PgWOX11基因及其编码的蛋白的获得
1、RNA的提取
取人参须根及不定根的样品用液氮研磨粉碎，采用TRIzol Plant RNA Kit根据TRIzol Plant RNA Kit说明书提取总RNA，并用1％琼脂糖凝胶电泳确定RNA完整性，核酸/蛋白定量仪测定RNA含量。
2、cDNA的合成
采用M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit(Takara)按M-MLV RTase cDNASynthesis Kit(Takara)说明书合成cDNA。
3、PCR扩增
以步骤2获得的cDNA为模板，采用WOX11-F和WOX11-R进行PCR扩增，得到PCR产物。引物序列如下：
WOX11-F：5′-TCAAACCCAAGACTCTCTAAACAG-3′；
WOX11-R：5′-CGGTACAGCTTGATTCCACTT-3′。
4、克隆测序
对PCR产物胶回收后克隆进行测序，测序结果采用smartBLAST比对后确认为人参的WOX11基因。由于人参为四倍体且杂合度高，PgWOX11基因存在一些SNPs位点，常见的两种核苷酸序列分别为WOX11-A和WOX11-B(图1)，将图1所示的基因序列及相似度>95％以上的基因序列统一命名为PgWOX11。WOX11-A的核苷酸序列如序列1所示，WOX11-A编码的WOX11-A蛋白的氨基酸序列如序列2所示，WOX11-B的核苷酸序列如序列3所示，WOX11-B编码的WOX11-B蛋白的氨基酸序列如序列4所示。
实施例2、人参干细胞标记蛋白PgWOX11及人参干细胞标记蛋白PgWOX11多抗的制备
一、人参干细胞标记蛋白PgWOX11的制备
1、表达载体的构建
将序列1所示的DNA分子插入pET32a(+)载体(购于优宝生物，产品编号为VT1216)的BamHI和SacI酶切位点间，得到重组载体pET32a(+)-WOX11。
2、重组菌的构建及诱导表达
将步骤一构建的pET32a(+)-WOX11质粒分别转化至表达菌E.coli BL21(DE3)(购于北京全式金生物有限公司，产品编号为CD601-01)和E.coli Transetta(DE3)(购于北京全式金生物有限公司，产品编号为CD801-01)中，分别得到重组菌E.coli BL21(DE3)[pET32a(+)-WOX11]和E.coli Transetta(DE3)[pET32a(+)-WOX11]。
将pET32a(+)质粒分别转化至表达菌E.coli BL21(DE3)和E.coli Transetta(DE3)中，分别得到重组菌E.coli[pET32a(+)]BL21(DE3)和E.coli[pET32a(+)]Transetta(DE3)。
将含有重组质粒pET32a(+)-WOX11的E.coli BL21(DE3)及Transetta(DE3)阳性克隆振荡培养过夜，菌液以1:50比例稀释于含有Amp(80μg·mL-1)的LB液体培养基中，37℃培养至OD600≈0.6时，加入IPTG至终浓度为0.4mM，诱导6-8h，离心收集菌体，经1×PBS样品缓冲液重悬，反复冻融4-5次充分裂解菌体，沸水煮5min使蛋白变性后，超声破碎(超声条件为130W，超声3s停7s，3min)，10000g转速4℃冷冻离心30min，分为上清液和沉淀，分别进行10％SDS-PAGE蛋白电泳分析。
结果表明诱导后的E.coli BL21(DE3)[pET32a(+)-WOX11]全菌液、上清液和沉淀，诱导后的E.coli Transetta(DE3)[pET32a(+)-WOX11]全菌液、上清液和沉淀均在46.3kDa处出现目的蛋白条带(PgWOX11基因的cDNA由795个碱基组成，编码26.31kDa蛋白，原核表达载体pET32a上的His-Tag标签大小为20kDa，所以重组表达载体编码蛋白大约为50kDa)；而阴性对照E.coli[pET32a]及未诱导菌液在50kDa处没有条带出现，表明含有PgWOX11基因的重组质粒，在大肠杆菌BL21(DE3)和Transetta(DE3)中成功表达(图2)。
3、人参干细胞标记蛋白PgWOX11的纯化
收集上述诱导后的上清液，按照国家生化工程技术研究中心(北京)谷胱甘肽亲和介质(GST QZT 4FF)纯化程序，获得纯化后的人参干细胞标记蛋白PgWOX11。具体步骤如下：装柱：加入1-3mL GSH亲和介质，静置5-30min，待介质沉降完全后，加入5倍柱体积的平衡缓冲液(50mM Tris-HCl+0.15M NaCl，pH8.0)平衡层析柱，至流出液电导和pH不变；进料：将裂解上清液上柱；淋洗：上样完毕后，继续用平衡缓冲液淋洗至基线；洗脱：用洗脱缓冲液(50mM Tris-HCl+10mM GSH，pH8.0)洗脱，收集流出液，利用SDS-PAGE电泳及后续的Westernblotting确定蛋白的纯度符合后续实验要求。
二、人参干细胞标记蛋白PgWOX11的兔抗的制备及效价检测
1、人参干细胞标记蛋白PgWOX11的兔抗的制备
采用免疫法制备人参干细胞标记蛋白PgWOX11的兔抗。免疫用兔子为2.0kg左右的新西兰大白兔。具体制备步骤如下：免疫之前耳静脉取阴性血清作为检测抗体时的阴性对照。取400μg或200μg免疫原(步骤一制备的纯化后的人参干细胞标记蛋白PgWOX11)，用生理盐水稀释到200-500μL。然后加入等体积弗氏佐剂(初次免疫用弗氏完全佐剂，加强免疫用弗氏不完全佐剂)用混匀仪器将溶液和佐剂混匀，形成油包水。再将混匀好的免疫原进行背部皮下注射免疫，打8-10个点。初次免疫新西兰大白兔后(免疫量为400μg蛋白)，每隔两周加强免疫一次，免疫量为200μg蛋白，加强免疫3次后两周后，从颈动脉取阳性血(含有人参干细胞标记蛋白PgWOX11的兔抗)。运用SDS-PAGE法检测抗体纯度(图3)。
2、ELISA法测定抗体效价
ELISA法测定人参干细胞标记蛋白PgWOX11的兔抗的抗体效价，具体步骤如下：
(1)用包被液稀释抗原(Rabbit A anti-human IgG，Code No.A0423)至终浓度为2μg/mL，100μL/孔，4℃过夜；洗液洗涤2次。
(2)封闭液封闭，200μL/孔，37℃孵育2h；洗液洗涤1次。
(3)用PBS将步骤1获得的多抗血清从200倍开始2倍梯度稀释，空白对照(blank)为PBS，阴性对照(negative)为用PBS将阴性血清200倍稀释；均为100μL/孔，37℃孵育1h；洗液洗涤3次。
(4)加入PBS稀释20000倍的二抗山羊抗兔IgG/HRP(北京全式金生物有限公司，HS101-01)，100μL/孔，37℃孵育1h；取出后用洗液洗涤3次。
(5)显色，显色液100μL/孔，显色时间为5-15min。
(6)每孔加入50μL终止液终止。
(7)双波长(450，630)测吸光值，记录保存数据，并做图分析。效价为1/2最大OD值所对应的稀释倍数为102400。该抗体的效价符合后续免疫组化实验要求。
实施例3、整体原位杂交方法检测人参不定根根尖干细胞
一、PgWOX11探针的制备
1、探针模板的制备
以人参cDNA为模板对PgWOX11基因的开放阅读框进行PCR扩增，获得的PCR产物(此处PCR产物为序列1和序列3所示的基因片段的混合物，序列1和序列3所示的基因片段的比例约为1:1)为探针合成的模板DNA。
根据PgWOX11序列，设计如下引物：
正向引物：5′-TCAAACCCAAGACTCTCTAAACAG-3′；
反向引物：5′-CGGTACAGCTTGATTCCACTT-3′。
2、单链探针的合成
取1μg步骤1获得的模板DNA，加水补齐到11μL，65℃变性5分钟，迅速置于冰上。配制单链探针合成的体系：5×trans buffer 4μL，DIG Labelling NTP mix(购于Roche公司，货号11277073910)2μL，RNase inhibitor(购于TAKARA公司，货号2313A)1μL，探针引物1μL(对照组使用的正向探针引物，实验组使用的反向探针引物)，单链RNA合酶2μL(对照组使用的正向探针合成的RNA合酶为SP6RNA polymerase，实验组使用的反向探针合成的RNA合酶为T7RNA polymerase)。37℃保温2h。加入2μL RNase-free的DNaseI，37℃温育15min。温育结束后，加20μL去离子甲酰胺。取1-2μL的单链探针，电泳检测确定探针条带为单一条带。
正向探针引物：5′-ATTTAGGTGACACTATAGAATAGACTCCCAAACCAGAGCAAATCCT-3′；
反向探针引物：5′-AATTAATACGACTCACTATAGGGCCGAAGAACAACCGCCACCAA-3′。
正向RNA探针由序列5所示的单链RNA分子和序列6所示的单链RNA分子组成；
反向RNA探针由序列7所示的单链RNA分子和序列8所示的单链RNA分子组成。
二、整体原位杂交方法检测人参不定根根尖干细胞
将采集的新鲜完整的人参不定根作为样品材料，运用步骤一制备的PgWOX11基因的RNA探针对人参不定根根尖干细胞进行检测。具体步骤如下：
1、将样品材料放入固定液(4％PFA溶液)中进行固定，材料在固定液中真空抽气至无气泡产生为止。抽气完成后，材料均沉于底部，换新的4％PFA/PBST溶液(含0.1％Tween20)，抽真空后，4℃过夜。
2、完成步骤1后，采用PBST溶液与4％PFA溶液置换，使得材料悬浮于PBST溶液中。然后用乙醇与PBST溶液梯度置换(20％乙醇/PBST，20min；40％乙醇/PBST，20min；60％乙醇/PBST，20min；80％乙醇/PBST，20min；100％乙醇，20min，2次)。再用乙醇到二甲苯梯度置换(乙醇:二甲苯＝2:1，30min；乙醇:二甲苯＝1:1，30min；乙醇:二甲苯＝1:2，30min；纯二甲苯，1h)。最后再用二甲苯到乙醇梯度置换(二甲苯:乙醇＝2:1，30min；二甲苯:乙醇＝1:1，30min；二甲苯:乙醇＝1:2，30min；纯乙醇，30min，3次)。
3、完成步骤2后，将材料放于预杂交液1中，55℃孵育5-10小时，然后用蛋白酶K在37℃下消化30min，再用5％的甘氨酸/PBST处理5min以终止反应。最后将材料放于预杂交液2中，55℃杂交2-4小时。
4、完成步骤3后，向预杂交液2中加入1mg/mL的tRNA(购于Roche，货号为1093274910)及1μg的PgWOX11变性探针(步骤一中制备的正向探针和反向探针)，杂交24h。
5、完成步骤4后，洗掉未结合的探针，采用5％BSA/PBST在室温中封闭1小时。然后按1:2000的比例，在封闭液中加入DIG抗体(购于Roche，货号为1093274910)，室温反应16小时。再用NBT/BCIP进行显色反应，避光反应2-6小时，采用4％PFA终止反应。最后用PBST溶液洗后采用体式镜与显微镜检测人参不定根中的根尖干细胞。
结果如图4所示，从图中可以看出：蓝色标记的位置即为人参不定根根尖干细胞，PgWOX11基因的反向RNA探针(实验组)在人参不定根根尖干细胞中与PgWOX11基因的mRNA杂交，说明PgWOX11基因主要在人参不定根根尖干细胞中表达，而PgWOX11基因的正向RNA探针(对照组)不能发生杂交。上述结果表明：PgWOX11基因可作为人参不定根根尖干细胞的标记基因，且基于本发明的PgWOX11基因的反向RNA探针的整体原位杂交方法可有效的检测人参不定根根尖干细胞的位置，并可直观、清楚的观察到人参不定根根尖干细胞。
实施例4、EdU染色法检测人参不定根根尖干细胞的扩增
采用EdU染色法检测人参不定根根尖干细胞的扩增，具体步骤如下：
一、EdU标记
取长度约为2cm的人参不定根根尖，将其放入5mL的MS液体培养基中摇配48小时，然后使用EdU Imaging Kit(ThermoFisher)进行EdU标记。EdU染色法按照EdU Imaging Kit(ThermoFisher)中说明书的步骤进行。
二、人参不定根根尖干细胞的扩增情况
运用双光子激光共聚焦显微镜(LSM880)检测人参不定根根尖干细胞的扩增，EdU荧光的激发光波长为590nm、发射光波长为615nm，采用层扫的方法，观察人参不定根根尖干细胞的扩增情况，干性强的细胞具有较强的分生能力。
结果如图5所示，从图中可以看出：根尖从表层到内部不同层细胞分裂的情况，EdU标记上的细胞核即是正在分裂的细胞，分裂能力强的部位即为人参不定根的根尖干细胞区域。
实施例5、人参不定根分支干细胞的检测
采用免疫组化法对人参不定根分支干细胞标记基因PgWOX11表达的蛋白进行定位。具体步骤如下：
一、人参不定根的石蜡切片的制作
1、固定：取人参不定根材料用100mL FAA固定液固定。
2、脱水与透明：将固定后的材料依次经过30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、85％乙醇、95％乙醇、100％乙醇(两次)进行脱水，每级乙醇梯度30min；脱水后的材料再依次进入二甲苯乙醇溶液(1:2)、二甲苯乙醇溶液(1:1)和二甲苯(两次)进行透明，每个梯度也是30min。
3、浸蜡：为材料更换二甲苯并加入等体积的碎石蜡(熔点为58-60℃)后置于37℃温箱中至少3h，使石蜡慢慢溶解，然后将材料和未溶解的石蜡转入42℃温箱中继续溶解，并打开瓶盖在42℃条件下过夜，使二甲苯尽量蒸发，最后材料转移至62℃温箱中使二甲苯完全蒸发，并更换数次纯蜡，每次间隔2-4h。
4、包埋、修块及切片：包埋时，迅速将材料在包埋用的小纸盒中摆好方向并静置数分钟，等石蜡表面凝固后轻轻地将小纸盒放入冷水中，使石蜡快速凝固；根据所观察的切面情况，对材料进行进一步修块，然后进行切片，切片厚度为8μm，将切片整齐地摆在涂有蛋白胶和蒸馏水(用作展片剂)的洁净载玻片上，在45℃左右的恒温台上展片后吸取多余的蒸馏水，将切片置于37℃温箱中干燥1-2天，放置-20℃冰箱待用。
二、脱蜡和水化
将人参不定根的石蜡切片置于67℃烘箱中，烘片2h，脱蜡至水，用pH7.4的PBS冲洗三次，每次3min。
三、热抗原修复
换新的切片架，放入水化后的切片，配置抗原修复液(pH＝6.0柠檬酸盐缓冲液)，用铁饭盒煮沸，温度控制在96-98℃，然后将切片放入15min，之后自然冷却到室温。PBS洗3次，每次5min。
四、免疫组织化学染色
经过免疫组化笔花圈、灭活内源酶活性后，进行封闭，之后吸干封闭液，滴加一抗(实施例2制备的人参干细胞标记蛋白PgWOX11的兔抗)盖住组织，放入湿盒内4℃过夜。复温后PBS洗涤三次，吸干水珠后，滴加二抗(碧云天生物技术，A0208)室温孵育10min，之后用DAB染色、苏木素复色后制片，显微镜下观察拍照。
结果如图6所示，从图中可以看出：人参PgWOX11蛋白表达在人参不定根的分支处幼根生长锥的细胞上，即人参不定根分支干细胞处。本发明的基于PgWOX11的多抗的免疫组化法可有效的检测人参不定根分支干细胞的位置，并可直观、清楚的观察到人参不定根分支干细胞。
序列表
<110>中国中医科学院中药研究所
<120>用于检测人参不定根干细胞的特异性基因PgWOX11及其检测方法与应用
<160>8
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>795
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>1
atggaagatg gtcatcaaac ccaagactct ctaaacagcc caaaccacgg cggttctggt 60
tctaactcct gttctgagag aaataacaat gaaccggtca gatcaaggtg gactcccaaa 120
ccagagcaaa tcctcatact agagtccatc ttcaatagtg gaatggtaaa tcctcctaaa 180
gatgaaactg tcaggatacg gaagcttcta gagaaattcg gttccgtcgg cgatgctaac 240
gtcttctact ggtttcaaaa ccgtcgctcc cgctcccgcc gccgccaacg ccaaattcaa 300
gccagcctaa ccggtgacca gctaggttct cagccgccgc gaagtggagg tagtgatggt 360
gcaattcagt ttgatactag tacagctgct tttgcgcaag ctgccggaca gtctttctat 420
tcatctccgt cttcgtgttt tggtggcggt tgttcttcgg ctggcggtgg tggaaatgag 480
ggtattgtgg atgatatgaa tatgtattca tattctggtc aaatgtgtgg cccgggaatt 540
gagcagaatt cgggcttgtc ttcttcaatt aacatgagcc ccacggatac atctaatttg 600
cattaccaat ctggatttat aacggtgttt ataaatgggg tagcaacaga cataccaagg 660
ggggcactag acatgaaagg gatgtttggt caacgggatt tagtgttggt ccattcttca 720
ggtgttcctg ttaacgacgt cagttgtccc ttgcagcatg gtgaaagcta tttcctggtt 780
tccagaccta cttaa 795
<210>2
<211>264
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>2
Met Glu Asp Gly His Gln Thr Gln Asp Ser Leu Asn Ser Pro Asn His
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly Ser Asn Ser Cys Ser Glu Arg Asn Asn Asn Glu Pro
20 25 30
Val Arg Ser Arg Trp Thr Pro Lys Pro Glu Gln Ile Leu Ile Leu Glu
35 40 45
Ser Ile Phe Asn Ser Gly Met Val Asn Pro Pro Lys Asp Glu Thr Val
50 55 60
Arg Ile Arg Lys Leu Leu Glu Lys Phe Gly Ser Val Gly Asp Ala Asn
65 70 75 80
Val Phe Tyr Trp Phe Gln Asn Arg Arg Ser Arg Ser Arg Arg Arg Gln
85 90 95
Arg Gln Ile Gln Ala Ser Leu Thr Gly Asp Gln Leu Gly Ser Gln Pro
100 105 110
Pro Arg Ser Gly Gly Ser Asp Gly Ala Ile Gln Phe Asp Thr Ser Thr
115 120 125
Ala Ala Phe Ala Gln Ala Ala Gly Gln Ser Phe Tyr Ser Ser Pro Ser
130 135 140
Ser Cys Phe Gly Gly Gly Cys Ser Ser Ala Gly Gly Gly Gly Asn Glu
145 150 155 160
Gly Ile Val Asp Asp Met Asn Met Tyr Ser Tyr Ser Gly Gln Met Cys
165 170 175
Gly Pro Gly Ile Glu Gln Asn Ser Gly Leu Ser Ser Ser Ile Asn Met
180 185 190
Ser Pro Thr Asp Thr Ser Asn Leu His Tyr Gln Ser Gly Phe Ile Thr
195 200 205
Val Phe Ile Asn Gly Val Ala Thr Asp Ile Pro Arg Gly Ala Leu Asp
210 215 220
Met Lys Gly Met Phe Gly Gln Arg Asp Leu Val Leu Val His Ser Ser
225 230 235 240
Gly Val Pro Val Asn Asp Val Ser Cys Pro Leu Gln His Gly Glu Ser
245 250 255
Tyr Phe Leu Val Ser Arg Pro Thr
260
<210>3
<211>795
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>3
atggaagatg gtcatcaaac ccaagactct ctaaacagcc caaaccatgg cggttctggt 60
tctaactcct gttctgagag aaataacaat gaaccagtca gatcaaggtg gactcccaaa 120
ccagagcaaa tcctcatact agagtccatc ttcaatagtg gaatggtaaa tcctcctaaa 180
gatgaaactg tcaggatacg gaagcttcta gagaaattcg gttccgtcgg cgatgctaac 240
gtcttctact ggtttcaaaa ccggcgctcc cgctcccgcc gccgccaacg ccaaattcaa 300
gccagcctaa ccggtgacca gctaggtggt cagccgccac gaagtggagg tagtgatggt 360
agaattcagt ttgatactag tacaggtggt tttgcgcaag ctgccggaca gtctttctat 420
tcatctccgt cttcgtgttt tggtggcggt tgttcttcgg ctggcggtgg tggaaatgag 480
ggtatcgtgg atgatatgaa tatgtattca tattcgggtc aaatgtgtgg tccgggaatt 540
gagcagaatt cgggcttgtc ttcttcaatt aacatgagcc ccacggatac atctaatttg 600
cattaccaat ctggatttat aacggtgttt ataaatgggg tagcaacaga gataccaaag 660
gggccagtag acatgaaagg gatgtttggt caacgggatt tagtgttggt ccattcttca 720
ggtgttcctg ttaacgactt cagttttccc ttgcagcatg gtgaaagcta tttcctggtt 780
tccagaccta cttaa 795
<210>4
<211>264
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>4
Met Glu Asp Gly His Gln Thr Gln Asp Ser Leu Asn Ser Pro Asn His
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly Ser Asn Ser Cys Ser Glu Arg Asn Asn Asn Glu Pro
20 25 30
Val Arg Ser Arg Trp Thr Pro Lys Pro Glu Gln Ile Leu Ile Leu Glu
35 40 45
Ser Ile Phe Asn Ser Gly Met Val Asn Pro Pro Lys Asp Glu Thr Val
50 55 60
Arg Ile Arg Lys Leu Leu Glu Lys Phe Gly Ser Val Gly Asp Ala Asn
65 70 75 80
Val Phe Tyr Trp Phe Gln Asn Arg Arg Ser Arg Ser Arg Arg Arg Gln
85 90 95
Arg Gln Ile Gln Ala Ser Leu Thr Gly Asp Gln Leu Gly Gly Gln Pro
100 105 110
Pro Arg Ser Gly Gly Ser Asp Gly Arg Ile Gln Phe Asp Thr Ser Thr
115 120 125
Gly Gly Phe Ala Gln Ala Ala Gly Gln Ser Phe Tyr Ser Ser Pro Ser
130 135 140
Ser Cys Phe Gly Gly Gly Cys Ser Ser Ala Gly Gly Gly Gly Asn Glu
145 150 155 160
Gly Ile Val Asp Asp Met Asn Met Tyr Ser Tyr Ser Gly Gln Met Cys
165 170 175
Gly Pro Gly Ile Glu Gln Asn Ser Gly Leu Ser Ser Ser Ile Asn Met
180 185 190
Ser Pro Thr Asp Thr Ser Asn Leu His Tyr Gln Ser Gly Phe Ile Thr
195 200 205
Val Phe Ile Asn Gly Val Ala Thr Glu Ile Pro Lys Gly Pro Val Asp
210 215 220
Met Lys Gly Met Phe Gly Gln Arg Asp Leu Val Leu Val His Ser Ser
225 230 235 240
Gly Val Pro Val Asn Asp Phe Ser Phe Pro Leu Gln His Gly Glu Ser
245 250 255
Tyr Phe Leu Val Ser Arg Pro Thr
260
<210>5
<211>350
<212>RNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>5
gacucccaaa ccagagcaaa uccucauacu agaguccauc uucaauagug gaaugguaaa 60
uccuccuaaa gaugaaacug ucaggauacg gaagcuucua gagaaauucg guuccgucgg 120
cgaugcuaac gucuucuacu gguuucaaaa ccgucgcucc cgcucccgcc gccgccaacg 180
ccaaauucaa gccagccuaa ccggugacca gcuagguucu cagccgccgc gaaguggagg 240
uagugauggu gcaauucagu uugauacuag uacagcugcu uuugcgcaag cugccggaca 300
gucuuucuau ucaucuccgu cuucguguuu ugguggcggu uguucuucgg 350
<210>6
<211>350
<212>RNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>6
gacucccaaa ccagagcaaa uccucauacu agaguccauc uucaauagug gaaugguaaa 60
uccuccuaaa gaugaaacug ucaggauacg gaagcuucua gagaaauucg guuccgucgg 120
cgaugcuaac gucuucuacu gguuucaaaa ccggcgcucc cgcucccgcc gccgccaacg 180
ccaaauucaa gccagccuaa ccggugacca gcuagguggu cagccgccac gaaguggagg 240
uagugauggu agaauucagu uugauacuag uacagguggu uuugcgcaag cugccggaca 300
gucuuucuau ucaucuccgu cuucguguuu ugguggcggu uguucuucgg 350
<210>7
<211>350
<212>RNA
<213>人工序列(Aruificial Sequence)
<400>7
ccgaagaaca accgccacca aaacacgaag acggagauga auagaaagac uguccggcag 60
cuugcgcaaa agcagcugua cuaguaucaa acugaauugc accaucacua ccuccacuuc 120
gcggcggcug agaaccuagc uggucaccgg uuaggcuggc uugaauuugg cguuggcggc 180
ggcgggagcg ggagcgacgg uuuugaaacc aguagaagac guuagcaucg ccgacggaac 240
cgaauuucuc uagaagcuuc cguauccuga caguuucauc uuuaggagga uuuaccauuc 300
cacuauugaa gauggacucu aguaugagga uuugcucugg uuugggaguc 350
<210>8
<211>350
<212>RNA
<213>人工序列(Aruificial Sequence)
<400>8
ccgaagaaca accgccacca aaacacgaag acggagauga auagaaagac uguccggcag 60
cuugcgcaaa accaccugua cuaguaucaa acugaauucu accaucacua ccuccacuuc 120
guggcggcug accaccuagc uggucaccgg uuaggcuggc uugaauuugg cguuggcggc 180
ggcgggagcg ggagcgccgg uuuugaaacc aguagaagac guuagcaucg ccgacggaac 240
cgaauuucuc uagaagcuuc cguauccuga caguuucauc uuuaggagga uuuaccauuc 300
cacuauugaa gauggacucu aguaugagga uuugcucugg uuugggaguc 350

Claims (9)

1.蛋白质，是如下a）或b）的蛋白质：
a）氨基酸序列是序列2或序列4所示的蛋白质；
b）在序列2或序列4所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质。
2.与权利要求1所述的蛋白质相关的生物材料，为下述A1）至A8）中的任一种：
A1）编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子；
A2）含有A1）所述核酸分子的表达盒；
A3）含有A1）所述核酸分子的重组载体；
A4）含有A2）所述表达盒的重组载体；
A5）含有A1）所述核酸分子的重组微生物；
A6）含有A2）所述表达盒的重组微生物；
A7）含有A3）所述重组载体的重组微生物；
A8）含有A4）所述重组载体的重组微生物。
3.根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于：A1）所述核酸分子为其编码序列是序列1或序列3所示的cDNA分子或基因组DNA分子。
4.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料在检测人参不定根干细胞部位或位置中的应用；
或，权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料在定位人参不定根干细胞中的应用；
或，权利要求1所述的蛋白质或其编码基因在作为人参不定根干细胞标志物中的应用；
所述不定根干细胞为不定根根尖干细胞或不定根分支干细胞。
5.一种检测人参不定根干细胞部位或位置的方法，是通过检测待测人参样品中的权利要求1所述的蛋白质或其编码基因的表达部位或位置来实现的；所述不定根干细胞为不定根根尖干细胞或不定根分支干细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
通过整体原位杂交方法检测待测人参样品中的权利要求1所述的蛋白质的编码基因的表达部位或位置；
或，通过免疫组化方法检测待测人参样品中的权利要求1所述的蛋白质的表达部位或位置。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述整体原位杂交方法中所用的RNA探针由序列7所示的单链RNA分子和序列8所示的单链RNA分子组成；
或，所述免疫组化方法中所用的抗体为抗权利要求1所述的蛋白质的抗体。
8.权利要求7中所述的RNA探针；
或，权利要求7中所述的抗权利要求1所述的蛋白质的多克隆抗体，所述多克隆抗体以权利要求1所述的蛋白质作为免疫原，免疫兔子得到。
9.权利要求8所述的RNA探针和/或权利要求8所述的多克隆抗体在检测人参不定根干细胞部位或位置中的应用；
或，权利要求8所述的RNA探针和/或权利要求8所述的多克隆抗体在定位人参不定根干细胞中的应用；
所述不定根干细胞为不定根根尖干细胞或不定根分支干细胞。
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CN102586273A (zh) * 2012-01-19 2012-07-18 南京林业大学 一种杨树不定根发育关键基因PeWOX11a及其应用
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植物不定根发生机理的研究进展;张焕欣;董春娟;李福凯;王红飞;尚庆茂;;西北植物学报(07);209-216 *

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